專利名稱：：可修復肌纖維膜中的神經元型一氧化氮合酶的合成小/微-抗肌萎縮蛋白基因的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及新的抗肌萎縮蛋白小/微-基因，其保留有全長抗肌萎縮蛋白基因的基本生物功能。尤其是，本發(fā)明提供了一系列合成小/微-抗肌萎縮蛋白基因，其可修復肌纖維膜中的神經元型一氧化氮合酶(nN0S)。
背景技術：
：抗肌萎縮蛋白缺陷性疾病包括杜興氏肌肉萎縮癥(Duchennemusculardystrophy,DMD)，貝克爾肌肉萎縮癥(BeckerMuscularDystrophy,BMD)和X染色體關聯(lián)的擴張型心肌病(X-linkedDilatedCardiomyopathy,XLDC)。它們都是非常常見的遺傳疾病，在每3，000個新生兒中就有不止一名男嬰患病。進行性肌肉退化及衰弱通常使病人在十幾歲出頭時就坐上輪椅，二十歲出頭時就過世。女性攜帶者通常在四五十歲時也會患病。以上提到的肌肉疾病都是由于抗肌萎縮蛋白基因突變引起，特別是由于x染色體關聯(lián)的隱性突變引起?？辜∥s蛋白基因是至今所知的最大基因，在x染色體上有近240萬個堿基對，79個外顯子，約11.5kb長的編碼序列，并且具有很高的自發(fā)性突變率。目前對于抗肌萎縮蛋白缺陷性疾病并無有效的治療方法。已經開發(fā)出包括細胞治療與基因治療在內的新的遺傳學方法。但是，抗肌萎縮蛋白基因的龐大體積與mRNA(14個千堿基；kb)是基因治療發(fā)展上難以克服的障礙。因此，研究的焦點集中在開發(fā)簡縮版的小-抗肌萎縮蛋白基因或微-抗肌萎縮蛋白基因?？梢酝ㄟ^病毒載體(例如腺相關病毒載體(AAV載體)和慢病毒載體)或通過干細胞(例如與血管生成相關的干細胞(mesoangioblasts)，CD133+干細胞和側群細胞)導入這些縮短的基因(Yuasaetal.，1998;Wangetal.，2000;Ferreretal.，2000;Harperetal.，2002;Fabbetal.，2002;Sakamotoetal.，2002;Bachrachetal.，2004;S咖paolesietal.，2006;Benchaouiretal2007，CellStemCell1:646-657)。微基因一般是指自然產生的以及合成的抗肌萎縮蛋白基因，其具有等于或小于5kb長的編碼序列并可被包裝至一個單腺相關病毒載體(AAV)內。小基因是指合成抗肌萎縮蛋白基因，其具有等于或小于10kb，但大于5kb長的編碼序列。小基因不能被包裝至一個單AAV載體內，但可以通過變異的雙載體進行傳遞，例如重疊載體(overlappingvector)，反式剪接載體及雜交載體。野生型抗肌萎縮蛋白基因具有兩個主要的生物功能。一是可提供細胞骨架與細胞外基質之間的機械連接，以使肌膜在收縮時保持穩(wěn)定。另一個是可為許多重要的細胞活動提供信號傳導功能?？辜∥s蛋白的信號傳導功能主要通過被稱為神經元型一氧化氮合酶(nN0S)(Rando，2001)的伴侶(partner)蛋白而完成。多項研究顯示，可通過全長抗肌萎縮蛋白可將nNOS招募至肌纖維膜中(Brenmanetal.，1995;Brenmanetal.，1996)。最近的研究進一步顯示，在匿D的動物模型和人類病人中，抗肌萎縮蛋白缺陷的肌肉中nNOS的喪失顯著促成了疾病的發(fā)展(Bre麗netal.，1995;Changetal.，1996;Thomasetal.，1998;Sanderetal.，2000)。此外，nNOS的轉基因過表達在DMDmdx小鼠模型中可改善肌肉病理(Wehlingetal.，2001;TidballandWehling-Henricks，2004;Shiaoetal.，2004;Wehling-Henricksetal.，2005)。對生成抗肌萎縮蛋白小基因與微基因的嘗試已有記載。例如，AR4-R23/AC微抗肌萎縮蛋白可減少匿D小鼠模型的組織病理。但是，此微-蛋白不能將肌肉比力(specificforce)恢復到正常水平(Harperetal，2002;Gregorevicetal.，2004;Liuetal.，2005;Yueetal.，2006;Gregorevicetal.，2006)。AH2-R19小-抗肌萎縮蛋白基因來自于一個病情非常輕微的病人(Englandetal.，1990;Harperetal.，2002)。這個小基因優(yōu)于AR4-R23微基因或AR4-R23/AC微基因，因為它可以將肌肉比力恢復到與全長抗肌萎縮蛋白基因相同的水平(Harperetal.，2002;Laietal.，2005)。但是，該小基因不能修復nNOS。事實上，現(xiàn)有的小-或微-抗肌萎縮蛋白基因均不能在肌纖維膜中招募nNOS(表一)(Chaoetal.，1996;Crawfordetal.，2000;War證etal.，2002;Wellsetal.，2003;Torellietal.，2004;Laietal.，2005;Yueetal.，2006;Lietal.，2006;Judgeetal.，2006)。無法修復肌纖維膜中的nNOS將顯著降低縮小的抗肌萎縮蛋白基因的療效。以前人們認為可通過抗肌萎縮蛋白的C端結構域將nNOS招募至肌纖維膜中(Bre麗netal.，1995;Brenmanetal.，1996)。全長抗肌萎縮蛋白有四個結構域，包括N端結構域，中部桿狀(mid-rod)結構域，富含半胱氨酸的結構域以及C端結構域。N端結構域和部分中部桿狀結構域與細胞骨架F肌動蛋白相互作用。中部桿狀結構域含有24個類血影蛋白重復單位及4個鉸鏈。富含半胱氨酸的結構域與跨膜肌營養(yǎng)不良蛋白聚糖(dystroglycan)有相互作用，將抗肌萎縮蛋白與細胞外基質連接。C端結構域含有兩個互生蛋白(syntrophin)結合位點與一個異連蛋白(dystrobrevin)結合位點。多項研究顯示，通過nNOS與a-互生蛋白間的PDZ/PDZ結構域的相互作用，可將nNOS被招募至肌纖維膜中(Bre麗netal.，1996;Hillieretal.，1999;Kameyaetal.，1999;Tochioetal.，1999;Adamsetal.，2001;Miyagoe-SuzukiandTakeda，2001)。這似乎顯示了一個具有C端結構域的小_或微_基因應該能夠在肌纖維膜中招募nN0S。但是，研究已重復顯示，雖然在這些情況下互生蛋白很好地集中在肌纖維膜內，但現(xiàn)有的含有C端結構域的小/微_抗肌萎縮蛋白仍無法將nNOS帶入肌纖維膜中(Chaoetal.，1996;Laietal.，2005)。此外，研究已顯示C端截斷的全長抗肌萎縮蛋白可將nNOS招募至肌纖維膜(Crawfordetal.，2000)。表一評價并總結了幾個自然產生的抗肌萎縮蛋白基因和幾個代表性的合成抗肌萎縮蛋白小基因及微基因的結構與功能。在所有被測試的基因中，只有天然亞型Dp427(全長抗肌萎縮蛋白基因)、Dp26Q(全長基因的視網膜亞型)以及一個C端截斷的全長基因(A71-78)被確定可在肌纖維膜中修復nNOS。但是，如前所述，這些基因由于體積過大而不適合AAV或慢病毒載體包裝。因此，有必要開發(fā)出一種或一系列小/微-抗肌萎縮蛋白基因，其有能力在肌纖維膜中修復nN0S，并可用于DMD，BMD與XLDC的基因治療。
發(fā)明內容本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了新的抗肌萎縮蛋白小-基因和微-基因，其與全長抗肌萎縮蛋白基因相比體積顯著縮小，并可修復例如神經元型一氧化氮合酶(nN0S)與肌纖維膜之間的機械連接功能與信號傳導功能。在一方面，本發(fā)明涉及一種核酸分子(在本申請中也稱為小基因或微基因)，其含有一個核苷酸序列，編碼一個修飾的或非全長抗肌萎縮蛋白多肽，該多肽保留有全長抗肌萎縮蛋白的N端結構域、富含半胱氨酸的結構域、兩個或多個中部桿狀結構域的重復單位以及兩個或多個中部桿狀結構域的鉸鏈。優(yōu)選地，該核酸分子在被保留的中部桿狀結構域重復單位中至少保留有R16和R17。優(yōu)選保留的中部桿狀結構域鉸鏈中含有H1和H4。在另一方面，本發(fā)明的小基因或微基因編碼的修飾的或非全長抗肌萎縮蛋白多肽進一步保留了全長抗肌萎縮蛋白的C端結構域。在另一特定的方面，本發(fā)明提供了修飾的或非全長抗肌萎縮蛋白多肽分子，其含有如SEQIDNO:l所示的氨基酸序列，該序列可分別由以下小/微-抗肌萎縮蛋白基因或其修飾體或變體編碼AH2-R15(SEQIDNO:7)，AH2-R15/AC(SEQIDNO:10)，AH2-R15/AR18-19(SEQIDNO:8)，AR3-15/AR18-23/AC(SEQIDNO:12)，AR2-15/AR18-23/AC(SEQIDNO:13)以及AR2-15/AH3-R23/AC(SEQIDNO:11)。參見圖IB和IC。另一方面，本發(fā)明涉及重組腺相關病毒載體(AAVs)，可傳遞本發(fā)明中的核酸分子(小_和/或微_抗肌萎縮蛋白基因)，其能夠在肌纖維膜中修復神經元型一氧化氮合酶(nNOS)。本發(fā)明所指的重組AAV載體(單載體或雙載體)包含本發(fā)明中的任一可在肌纖維膜中修復nNOS的核酸分子(小-和/或微-抗肌萎縮蛋白基因)，表達框(e鄧ressioncassette)(啟動子與polyA)以及病毒性反向末端重復單位(ITRs)。本發(fā)明的一個特別方面是提供了示例的AAV載體，包括但不限于AV.CMV.AR2-15/AR18-23/AC，AV.miniCMV.AR3-15/AR18-23/AC，AV.miniCMV.AR2-15/AH3-R23/AC，AV.AH2-R15供體/AV.AH2-R15接受體，AV.AH2-R15/AR18-19.頭/AV.AH2-R15/AR18-19.尾以及對它們進行的修改與變化。本發(fā)明還提供了示例的慢病毒載體，包括但不限于Lenti.CK6.AR2-15/AR18-23/AC，Lenti.CK6.AR3-15/AR18-23/AC，以及Lenti.CK6.AH2_R15。參見圖2。根據本發(fā)明，一個雙重組的AAV載體系統(tǒng)含有兩個AVV載體，其中兩個AAV載體中的一個包括本發(fā)明的核酸分子、小基因或微基因的一部分，另一個載體包括核酸分子、小基因或微基因的剩余部分，這兩個載體進一步包括了可允許雙方重組從而形成全長核酸分子、小基因或微基因的序列。在另一方面，本發(fā)明涉及一個在某對象中治療匿D，BMD和/或XLDC的方法，通過對該對象給藥治療有效劑量的本發(fā)明的核酸分子(小和/或微-抗肌萎縮蛋白基因)，伴有或不伴有藥用可接受的運載物。在一特別方面，適用于本發(fā)明方法的給藥方式包括但不限于，為改善患者的局部肌肉功能而進行局部或區(qū)域性肌肉注射，對患者的身體某區(qū)域的全部肌肉或全身的全部肌肉進行系統(tǒng)給藥(例如靜脈內給藥、動脈內給藥、腹腔內給藥及心臟內給藥)，在局部和/或系統(tǒng)給藥后用AAV或慢病毒載體在體外感染肌原性干細胞。在另一方面，本發(fā)明涉及一個藥物組合物，其包含一個或多個本發(fā)明的AAV載體和慢病毒載體以及一個藥用可接受的運載物。本專利或本專利申請含有至少一個彩色附圖。專利局在收到請求以及必要的費用時，可提供本專利或專利申請的帶有彩圖的公開文本。圖1A為全長抗肌萎縮蛋白基因與一系列小/微_抗肌萎縮蛋白基因及其相應的nN0S修復能力。圖IB為R16和R17的DNA序列及氨基酸序列，其來自人類抗肌萎縮蛋白基因與蛋白。在豎線前的序列是R16，豎線后的序列是R17。圖1C為來自不同物種的抗肌萎縮蛋白基因R16和R17的DNA序列比，這些物種包括人類、獼猴(macacamulatta)、豬(susscrofa)、狗(canisf咖illiaris)、鼠(musmusculus)和雞(gallusgallus)。星號表示在不同物種中相同的氨基酸。兩個點表示在不同物種中具有高度同源性的氨基酸。一個點表示在不同物種中具有中度同源性的氨基酸。圖2為帶有本發(fā)明的抗肌萎縮蛋白小/微_基因的AAV載體與慢病毒載體的構建圖。圖3為全長抗肌萎縮蛋白基因以及幾個由發(fā)明人開發(fā)的合成小-抗肌萎縮蛋白基因的鑒定酶切點(diagnosticcut)。這些小基因的結構概括在圖1中。這些小基因在nNOS修復方面的生物功能在圖4中詳細討論。圖4為兩月齡抗肌萎縮蛋白缺陷mdx小鼠的骨骼肌中nN0S的修復與抗肌萎縮蛋白表達的免疫熒光(IF)分析，mdx小鼠用帶有全長或某些合成小-抗肌萎縮蛋白基因的質粒進行治療，這些基因包括AH2-R15,AH2-R16,AH2-R17或AH2_R19。同時顯示了在未治療的md肌肉中的回復突變(revertant)纖維的克隆體。注射后2到3個星期時進行檢圖5為在抗肌萎縮蛋白缺陷的mdx小鼠的骨骼肌中nN0S的修復與抗肌萎縮蛋白表達的另一組免疫熒光(IF)分析和nNOS活性的組織-酶學染色。Mdx小鼠用帶有另一組小/微-基因(AH2-R15/AR18-19，AH2—R15/AC禾PAR3—15/AR18—23/AC)的質粒進行治療，這些質粒在發(fā)明人實驗室里合成。同時顯示了在未治療(無質粒)的mdx肌肉中發(fā)現(xiàn)的回復突變纖維。圖6A比較了發(fā)明人開發(fā)的帶有微基因AR2-15/AR18-23/AC的AAV載體的結構與另一研究者(Wangetal.，2000)開發(fā)的A3849微基因表達框的結構。圖6B為正常小鼠肌肉中nN0S、人抗肌萎縮蛋白和nNOS活性的免疫熒光染色與組織-酶染色。圖6C為mdx小鼠肌肉中nNOS、人抗肌萎縮蛋白和nNOS活性的免疫熒光染色與組織-酶染色。圖6D為帶有A3849微基因的轉基因mdx小鼠肌肉中，nNOS、人抗肌萎縮蛋白和nNOS活性的免疫熒光染色與組織_酶染色。6圖6E為用帶有本發(fā)明的AR2-15/AR18-23/AC微基因的AVV-6載體治療過的mdx小鼠肌肉中，nN0S、人抗肌萎縮蛋白和nNOS活性的免疫熒光染色與組織_酶染色。圖7A為用帶有本發(fā)明的AR2-15/AR18-23/AC微基因的AVV-9載體治療過的mdx小鼠肌肉中，nNOS、人類抗肌萎縮蛋白(分別對N端結構域，R16、R17和H3)，以及nNOS活性的免疫熒光染色與組織-酶染色。同時還顯示了AAV載體的結構圖。圖7B為用帶有本發(fā)明的AR3-15/AR17-23/AC微基因的AVV-9載體治療過的mdx小鼠肌肉中，nNOS、人類抗肌萎縮蛋白(分別對N端結構域，R16、R17和H3)，以及nNOS活性的免疫熒光染色與組織-酶染色。同時還顯示了AAV載體的結構圖。圖8A-8C描述了酵母雙雜交試驗，顯示出nN0SPDZ結構域與R16-17之間，而并非與R16或R17之間的正向相互作用。圖8A是在酵母雙雜交實驗中所用構建子(construct)的簡圖。nNOSPDZ結構域插入到含有DNA結合結構域的構建子中。此構建子還可表達色氨酸(Trp)。它可在缺乏Trp的培養(yǎng)基(Trp-)中生長。R16、R17、R16-17或互生蛋白PDZ結構域插入到在含有DNA激活結構域的構建子中。這些構建子可表達亮氨酸(Leu)，它們可在缺乏亮氨酸的培養(yǎng)基(Leu-)中生長。R16-17的結構不同于R16或R17的結構。DNA結合結構域與DNA激活結構域之間的相互作用引發(fā)了組氨酸(His)的生成。因此，這些細胞可以在Leu-/Trp-/His-三重缺乏培養(yǎng)基中生長。圖8B是在Leu-/Trp-/His-三重缺乏培養(yǎng)基中的一次代表性酵母雙雜交試驗。圖8C是在1^11-/1卬-/附8-三重缺乏培養(yǎng)基中的一次代表性點稀釋試驗。互生蛋白PDZ結構域DNA激活構建子或R16-17DNA激活構建子的共轉化使酵母得以生長。與R16或R17DNA激活構建子的共轉化并不能促成生長。V表示酵母細胞在三重缺乏培養(yǎng)基中生長；X表示酵母細胞未在三重缺乏培養(yǎng)基中生長。圖9A-9B顯示為AR2-15/AR18-23/AC微基因增強了mdx骨骼肌中的肌纖維膜完整性。AV.CMV.AR2-15/AR18-23/AC被包裝在AAV-6載體內。將6X10elOvg的載體顆粒傳遞至兩月齡的mdx小鼠的腓腸肌(N=4)。AAV感染后40天時進行了伊文氏藍染料(Evansbluedye，EBD)攝取實驗。對感染AAV的肌肉的系列肌肉切片拍攝了具有代表性的低倍(圖9A)與高倍(圖9B)免疫熒光染色顯微照片。在每張照片中標出了由各抗體識別的抗原表位。微-抗肌萎縮蛋白沿肌纖維膜表達。在受損的肌纖維中聚集了伊文氏藍染料。圖10A-10B顯示AR2-15/AR18-23/AC與AR4-23/AC微基因在mdx小鼠內導致了相似程度的肌肉力量改善。將AV.CMV.AR2-15/AR18-23/AC和AV.CMV.AR4-23/AC包裝到AAV血清型-9(AAV-9)中。將AAV-9載體通過面部靜脈注射傳遞至新生的雄性mdx小鼠體內(1X10el2vg顆粒/載體/鼠)。在AAV注射后三個月時測定伸趾長肌(EDL)肌肉的比力(specificforce)。使用年齡與性別相符的BL10與mdx小鼠作為肌肉力量測試的對照。星號表示BL10EDL肌肉的比力顯著高于其它組。十字表示感染AAV的小鼠的比力顯著高于mdx組，但低于BL10組。在感染AV.CMV.AR2-15/AR18-23/AC與AV.CMV.AR4-23/AC的小鼠之間并無統(tǒng)計學差異。樣本大小，BL10為N二4，mdx為N二5，AV.CMV.AR4-23/AC感染的mdx小鼠為N二6，AV.CMV.AR2-15/AR18-23/AC感染的mdx小鼠為N=5。圖11A-llB顯示在新生mdx4cv小鼠中系統(tǒng)傳遞AAV-9AV.CMV.AR2-15/AR18-23/AC，提高了骨骼肌的比力并降低了血清肌酸激酶(CK)水平。將1X10el2vg的AAV-9AV.CMV.AR2-15/AR18-23/AC顆粒通過面部靜脈注射傳遞至新生的雄性mdx4cv小鼠體內。7在AAV感染后三個月時測試伸趾長肌(EDL)肌肉的比力(圖11A)以及血清肌酸激酶水平(圖11B)。使用年齡與性別相符的BL6與mdx4cv小鼠作為對照。星號表示BL6小鼠的測試結果顯著優(yōu)于其它組。十字表示感染AAV的小鼠的測試結果顯著優(yōu)于mdx4cv組，但低于BL6組。樣本大小，BL6為N=7，mdx4cv為N=6，AV.CMV.AR2-15/AR18-23/AC感染的mdx4cv小鼠為N=6。圖12A-12D顯示在成年myoD/抗肌萎縮蛋白雙敲除小鼠(m-dko)中系統(tǒng)傳遞AAV-9AV.CMV.AR2-15/AR18-23/AC，提高了骨骼肌功能并降低了血清肌酸激酶(CK)水平。將5.5X10el2vg的AAV-9AV.CMV.AR2-15/AR18-23/AC的顆粒通過尾部靜脈注射傳遞到兩月齡的雄性m-dko小鼠體內。在AAV注射后三個月測試伸趾長肌(EDL)功能(圖12A-12C)以及血清肌酸激酶水平(圖12D)。使用年齡與性別相符的未被注射的同窩出生的小鼠作為對照。圖12A為比抽搐力(在單次剌激下)；圖12B為在不同頻率的強直剌激下的比強直力；圖12C為IO周期的離心收縮期間的力量衰退圖。星號表示感染AAV的小鼠的測試結果顯著優(yōu)于未感染的對照組。肌肉功能測試的樣本大小，未被感染的同窩出生小鼠對照組為N=4，感染AV.CMV.AR2-15/AR18-23/AC的m-dko小鼠為N=14。CK測試的樣本大小，未被感染的同窩出生小鼠對照組為N=3，感染AV.CMV.AR2-15/AR18-23/AC的m-dko小鼠為N=6。圖13為反式剪接AAV(tsAAV)載體和重疊AAV載體的轉基因重建的簡圖。在tsAAV載體中，ITR依賴性重組重建了全長表達框。通過改造過的剪接供體(SD)與剪接接受體(SA)序列去除了雙-DITR的連接。在重疊AAV載體中，共享區(qū)域通過同源重組方式進行重組。病毒性ITRs在此過程中被去除。圖14為雜交AAV載體的轉基因重建的簡圖。AV.CMV.LacZ.雜交5'載體包含CMV啟動子、5'端的半截的LacZ基因、剪接供體(SD)以及872bp堿性磷酸酶(AP)序列。AV.CMV.LacZ.雜交3'載體包含872bpAP序列、其后的剪接受體(SA)、3'端的半截LacZ基因以及SV40多聚腺苷酸化信號(polyA)。載體基因組的兩側是AAV-2ITR。共感染時，可通過AP序列-介導的同源重組來重建完整的LacZ表達框。或者也可通過病毒性ITR-介導的頭對尾重組來獲得。在用細胞剪接設備(cellularsplicingmachinery)(虛線)去除連接序列后可實現(xiàn)LacZ的表達。發(fā)明具體說明在此所提及的所有公開文本、專利申請和專利，以及其他參考文獻都是以全文引用的方式并入。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一個全新系列的抗肌萎縮蛋白小基因和微基因，其小到足以包裝到AAV或慢病毒載體中，并且仍然保留有全長野生型抗肌萎縮蛋白基因的基本功能，包括但不限于，機械連接功能和信號傳導功能(例如肌纖維膜與nNOS相關的功能)，保護肌肉避免不因營養(yǎng)不良而受到損傷。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，在合成小/微-抗肌萎縮蛋白基因中包括入抗肌萎縮蛋白的中部桿狀結構域的R16和R17重復單位對于nNOS的修復來說至關重要。換句話說，保留有R16和R17的小/微-抗肌萎縮蛋白基因可以修復肌纖維膜中的nNOS，其修復方式與全長抗肌萎縮蛋白相似。本發(fā)明進一步發(fā)現(xiàn)，通過使用本發(fā)明的小/微-基因進行治療而修復的nNOS蛋白保留了它的生物功能(酶活性)。"抗肌萎縮蛋白基因"是指具有核苷酸序列的核酸分子，其編碼全長抗肌萎縮蛋白。本發(fā)明包括使用來源于任何哺乳類物種的抗肌萎縮蛋白基因，包括但不限于人類、鼠和狗，特別是人類。某特定的全長抗肌萎縮蛋白基因具有如SEQIDN0:2所示的DNA序列，其編碼具有如SEQIDN0:1所示的氨基酸序列的全長抗肌萎縮蛋白。"結構域"是指蛋白結構的一部分。例如，在此所述的人類的抗肌萎縮蛋白基因的"N端結構域"包括從約1至約252的氨基酸殘基，特別是SEQIDNO:1中第1個氨基酸殘基蛋氨酸至第252個氨基酸殘基谷氨酸，更特別的是被如SEQIDN0:17所示的核苷酸編碼的氨基酸序列。類似地，在此所述的抗肌萎縮蛋白的"中部桿狀結構域"或"桿狀結構域"，包括SEQIDN0:1中約第253位至約第3112位的氨基酸殘基，特別是SEQIDNO:l中第253個氨基酸殘基蛋氨酸至第3112個氨基酸殘基亮氨酸。在此所述的抗肌萎縮蛋白的"富含半胱氨酸的結構域"包括SEQIDNO:1中約第3113位至約第3408位的氨基酸殘基，特別是SEQIDNO:1中第3113個氨基酸殘基精氨酸至第3048個氨基酸殘基蘇氨酸，更特別的是由如SEQIDN0:46所示的核苷酸編碼的氨基酸序列。在此所述的抗肌萎縮蛋白的"C端結構域"包括SEQIDNO:1中約第3409位至約第3685位的氨基酸殘基，特別是SEQIDNO:47中第3409個氨基酸殘基脯氨酸至第3685個氨基酸殘基蛋氨酸。"抗肌萎縮蛋白微基因"或"微-抗肌萎縮蛋白基因"或"微基因"是指等于或小于5kb長的核酸分子，其編碼一個修飾的或非全長抗肌萎縮蛋白多肽(在本申請中也被稱為微-抗肌萎縮蛋白)，并保留有全長抗肌萎縮蛋白的N端結構域、富含半胱氨酸的結構域、兩個或多個中部桿狀結構域的重復單位以及中部桿狀結構域的兩個或多個鉸鏈。"微抗肌萎縮蛋白"是指一個修飾的或非全長抗肌萎縮蛋白分子，其保留有一個全長抗肌萎縮蛋白的生物功能，編碼序列的長度等于或小于5kb。圖1中為微抗肌萎縮蛋白的實例。"抗肌萎縮蛋白小基因"，"小抗肌萎縮蛋白基因"或"小基因"是指長度超過5kb但小于全長抗肌萎縮蛋白編碼序列的核酸分子，優(yōu)選地，長度在5kb至lOkb左右，更優(yōu)選地，長度在約5kb至8kb左右，甚至更優(yōu)選地，長度在7kb左右，其編碼一個修飾的或非全長抗肌萎縮蛋白多肽(在本申請中也被稱為小-抗肌萎縮蛋白)，其保留有全長抗肌萎縮蛋白的N端結構域、富含半胱氨酸的結構域、兩個或多個中部桿狀結構域的重復單位(也用R與一個數字表示，例如，R16指的是第16個重復單位)以及中部桿狀結構域的兩個或多個鉸鏈。"小抗肌萎縮蛋白"是指一個修飾的或非全長抗肌萎縮蛋白分子，其保留有全長抗肌萎縮蛋白的生物功能，編碼序列的長度大于5kb但小于全長抗肌萎縮蛋白的編碼序列?？辜∥s蛋白的"生物功能"指某些功能，其包括但不限于在細胞骨架與細胞外基質之間提供機械連接，以及信號傳導等功能，例如修復肌纖維膜中的nNOS。用"修飾的"連接抗肌萎縮蛋白基因或抗肌萎縮蛋白，是指野生型(或自然產產生型)全長抗肌萎縮蛋白基因或抗肌萎縮蛋白分子被改變，致使修飾的抗肌萎縮蛋白基因或抗肌萎縮蛋白分子不再包括抗肌萎縮蛋白基因的全長編碼序列或抗肌萎縮蛋白的全長氨基酸序列，但仍然保留或實質上保留有全長基因或蛋白的生物功能。"修飾的N端結構域"是指在結構和/或序列上不同于野生型或自然產生型的N端結構域，但其保留有野生型或自然產生型N端結構域的功能。用"修飾或變化"是指對核酸分子或多肽進行的任何改變，例如突變，其仍保留有核酸分子或多肽的基本功能，并且/或者與該核酸分子或多肽實質上同源，或相似/等同于該核酸分子或多肽。在一種實施方式中，本發(fā)明涉及一種核酸分子(在本發(fā)明中也稱為小基因或微基因)，其含有編碼修飾的或非全長的抗肌萎縮蛋白多肽，保留了N端結構域、中部桿狀結構域(mid-roddomain)的兩個或三個類血影蛋白重復單位，中部桿狀結構域的兩個或多個鉸鏈區(qū)，以及全長抗肌萎縮蛋白多肽的富含半胱氨酸的結構域。在一特定實施方式中，本發(fā)明的小基因或微基因進一步包括編碼抗肌萎縮蛋白C端結構域的核苷酸序列。已證明，C端結構域的突變與匿D病人的認知表型相關(Tuffery等，1995;Kerr等，2001)。而且，C端結構域突變也已被證明在一類病人中導致了DMD(McCabe等，1989;Prior等，1995;Suminaga等，2004)。我們無意于用任何特定理論作限定，有人認為小_或微_抗肌萎縮蛋白基因在進一步包括編碼抗肌萎縮蛋白C端結構域的DNA序列時，可為匿D提供更好的治療或保護。在一具體實施方式中，中部桿狀結構域的重復單位可來自任何物種，包括，但不限于，人類，犬類、鼠類、豬類、豬、兔、雞。優(yōu)選地，本發(fā)明的小基因或微基因的兩個或多個類血影蛋白重復單位包括中部桿狀結構域的R16和R17。但是，本發(fā)明還包括其他小基因和微基因，其除了含有編碼R16和R17的序列以外，還含有其他類血影蛋白重復單位的序列，包括一種或多種選自R1-15和R18-R24。例如，如圖1所示，微基因可包括R1，R16，R17和R24(如，圖1的AR2-15/AR18-23/AC)，或Rl-R2，R16，R17和R24(如，圖1的AR3-15/AR18-23/AC)，或Rl，R16-R19，和R24(如，圖1的AR2-15/AH3-23/AC)，以上都是本發(fā)明的具體實施方式。在本發(fā)明中用到的符號"A"是指在核苷酸或氨基酸序列的某特定序列或區(qū)域的刪除或缺失。例如，AR2-15/AR18-23/AC代表一種微基因，其中重復單位2-15，18-23和C端結構域被刪除或缺失。在另一特定實施方式中，本發(fā)明包括小基因，其含有重復單位R1-R3，R16，R17和R20-R24(如，圖1的AR2-15/AR18-19)，或R1-R3和R16-R24(如，圖1的AH2-R15)。本發(fā)明的小基因或微基因的鉸鏈區(qū)優(yōu)選地包括，但不限于，H1和H4鉸鏈區(qū)。但是，本發(fā)明還包括其他小基因或微基因，其除了含有H1和H4以外，還含有其他鉸鏈區(qū)。例如，圖1所示H3也可包括在某小基因中，如AR2-15/AR18-19和AH2-R15，這些都是本發(fā)明的具體實施方式。在一種實施方式中，本發(fā)明涉及一種小基因或微基因，其包括一核苷酸序列，或與編碼修飾的或非全長抗肌萎縮蛋白多肽的核苷酸序列高度同源(substantialhomology)、高度相似或高度等同的核苷酸序列，所述修飾或非全長抗肌萎縮蛋白多肽保留了如SEQIDN0:17所示的N端結構域，兩個或多個如SEQIDNO:19-44所示的中部桿狀結構域的類血影蛋白重復單位，兩個或多個如SEQIDNO:18-45及SEQIDNO:1所示的中部桿狀結構域的鉸鏈區(qū)，以及全長抗肌萎縮蛋白的如SEQIDN0:46所示的富含半胱氨酸的結構域。"高度同源"、"高度相似"或"高度等同"是指核酸序列或氨基酸序列在序列上至少有70%，優(yōu)選地，至少80%，更優(yōu)選地，至少90%，再優(yōu)選地，至少95%的同源、相似或等同。在另一種實施方式中，小基因或微基因是那些可以在高、中、或低嚴格條件(stringentconditions)下與所選序列雜交的序列。這里提到的在37-42。C低嚴格條件包括和包含在雜交條件中至少約1%v/v到至少約15%v/v的甲酰胺以及至少約1M到至少約2M的鹽，以及在洗脫條件中至少約1M到至少約2M的鹽。其他的嚴格條件可在必要時使用，例如中度嚴格，其包括和包含在雜交條件中至少約16%v/v到至少約30%v/v甲酰胺以及從至少約0.5M到至少約0.9M的鹽，以及在洗脫條件中至少約0.5M到至少約0.9M鹽，10或高度嚴格，其包括和包含在雜交條件中至少約31%v/v到至少約50%v/v甲酰胺以及從至少約0.OIM到至少約0.15M鹽，以及在洗脫條件中至少約0.OIM到至少約0.15M鹽。雜交可以在不同的溫度下進行，當這發(fā)生時，其他條件可相應調整。具體雜交條件的實例包括在65t:雜交，然后用2XSSC，0.1%SDS進行一次或多次洗脫，最后用0.2XSSC，更優(yōu)選地，用0.1XSSC和0.1%SDS進行最后一次洗脫，在室溫或最高65t:或68t:的溫度下進行。在另一種實施方式中，修飾的抗肌萎縮蛋白包括，但不限于，中部桿狀結構域的如SEQIDNO:所示的R16和如SEQIDNO:所示的R17。但是，本發(fā)明也包括其他修飾的抗肌萎縮蛋白，其含有R16和R17以及其他類血影蛋白重復單位，選自如SEQIDNO:19-34分別所示的R1-R15和如SEQIDNO:37-44分別所示的R18_R24。例如，如圖1所示，修飾的抗肌萎縮蛋白可包括R1、R16、R17和R24(如圖1的AR2-15/AR18-23/AC)，或Rl-R2，R16，R17和R24(如，圖1的AR3-15/AR18-23/AC)，或Rl，R16-R19，和R24(如，圖1的AR2-15/AH3-23/AC)，這些都是本發(fā)明的特定實施方式。在另一種特定實施方式中，本發(fā)明包括修飾的抗肌萎縮蛋白，其含有重復單位R1-R3、R16、R17、R20-R24(如，圖1的AR2-15/AR18-19)，或R1-R3、R16-R24(如，圖1的AH2-R15)。類似地，本發(fā)明的小基因或微基因優(yōu)選地包括，但不限于，如SEQIDN0:18所示的鉸鏈區(qū)Hl和SEQIDN0:45所示的鉸鏈區(qū)H4。但是，本發(fā)明還包括其他小基因和微基因，其包括H1和H4以及其他鉸鏈區(qū)。例如，圖1所示H3也可包含在小基因中，例如，AR2-15/AR18-19和AH2-R15，這些都是本發(fā)明特定的實施方式。更加優(yōu)選的是，本發(fā)明涉及修飾的抗肌萎縮蛋白AR2-15/AR18-23/AC(如SEQIDN0:13所示)，AR3-15/AR18-23/AC(如SEQIDN0:12所示)，AR2-15/AH3-23/AC(如SEQIDNO:ll所示)，以及修飾的抗肌萎縮蛋白AR2-15/AR18-19(如SEQIDNO:8所示)以及AH2-15(如SEQIDNO:7所示)。本發(fā)明的微基因和小基因的任何修飾和變動也被本發(fā)明包括在內。本發(fā)明特別包括編碼前述小基因或微基因表達產物的兼并(degenerate)核酸分子。根據本發(fā)明，微_/小_抗肌萎縮蛋白基因可以通過本領域技術人員所知的常規(guī)技術合成、生成、獲得或組裝，在本發(fā)明下面提供的實施例中也有說明。例如，本發(fā)明的小基因和微基因可通過分子生物學技術合成，在實施例2和圖3中有說明。由本發(fā)明中的小基因和/或微基因編碼的多肽也包括在本發(fā)明中。在另一種實施方式中，本發(fā)明提供了可傳遞(deliver)本發(fā)明中的核酸分子的載體(vector)。任何適用于該目的的載體都包括在本發(fā)明中。特別是，本發(fā)明提供了一系列重組腺相關病毒載體(AAV)和慢病毒載體，用于傳遞本發(fā)明中的可修復肌纖維膜nNOS的核酸分子(小/微_抗肌萎縮蛋白基因)。本發(fā)明的重組AAV載體(單載體或雙載體)包括本發(fā)明中任一核酸分子(小/微_抗肌萎縮蛋白基因)，其可修復肌纖維膜nNOS，操作性連接于表達框(啟動子和polyA)以及病毒反向末端重復單位(ITR)。優(yōu)選地，本發(fā)明包括的載體包括，但不限于，AAV載體例如AV.CMV.AR2-15/A18—23/AC,AV.,J、CMV.AR3—15/A18—23/AC，AV.,J、CMV.AR2—15/AH3—R23/AC，AV.AH2-R15供體/AV.AH2-R15接受體，AV.AH2-R15/AR18-19.頭/AV.AH2-R15/AR18-19.尾。這些載體的修飾和改動也包括在本發(fā)明中。可根據以上說明以及下面實施例2中的描述，通過常規(guī)技術生成編碼小_或微-抗肌萎縮蛋白多肽分子的小基因或微基因。然后可使用適當的限制性內切酶將小基因或微基因切除并剪接入某選擇的表達框，該表達框優(yōu)選地適用于AAV載體。另外，可使用已知方法將純化的小基因或微基因核酸分子全部測序，然后制備任意多種翻譯等同的(translationallyequivalent)合成DNA序列，其編碼氨基酸序列，這種合成序列可被插入適當的表達框，該表達框優(yōu)選地適用于AAV載體。本領域已知多種表達框和載體。"表達框"(expressioncassette)是指一套完整的調控序列(controlsequence)包括起始序列、啟動子序列和終止序列，當它們位于適當閱讀框中的結構基因兩側時，在細胞中可發(fā)揮功能。表達框經常以及優(yōu)選地含有多種限制性酶切位點，其適用于剪切和插入任何想要的結構基因，如本發(fā)明中的微基因或小基因。很重要的一點是，克隆的基因在結構序列中有一個在正確的閱讀框中的起始密碼子。另外，本發(fā)明的表達框優(yōu)選地包括一個強組成性啟動子序列，如，CMV啟動子，位于基因的一端從而導致基因以高頻率被轉錄，以及包括一個polyA識別序列在基因的另一端從而保證對信使RNA的處理和轉運?？刹迦氡景l(fā)明中的微基因的優(yōu)選(空)表達框的例子有，由Yue等(Yue&Duan2002Biotechniques33③672-678)描述的pcis.RSVmcs，pcis.CMVmcs，pcis.CMVmcs-內含子，pcis.SV40mcs，pcis.SV40mcs-內含子，pcis.CK6mcs，以及pcis.CAGmcs。可插入本發(fā)明小基因的優(yōu)選(空)表達框的例子有，由Duan等(Duan，YueandEngelhardt2003MethodsinMolecularBioloev219:29-51)描述的pDD188，pDD293和pDD295，以及由Ghosh等(Ghosh，Yue，LaiandDuan2008MolecularTher即y16:124-130)描述的pAG15，pAG21。高度優(yōu)選的表達框可被設計為包括一種或多種選擇性標記基因，例如卡那霉素抗性基因。"載體"是指可在宿主細胞中復制和表達外來基因的DNA序列。一般來說，載體有一種或多種內切酶識別位點，可用適當的酶以可預測的方式剪切。這樣的載體在構建時可優(yōu)選地包括其他的結構基因序列，使之具有可識別和分離轉化細胞的標記。優(yōu)選的標記/選擇物包括卡那霉素、氯磺隆、膦絲菌素(phosphonothricin)、潮霉素和甲氨蝶呤。載體中的外來遺傳物質在細胞中得到功能性表達，這樣的細胞被載體"轉化"并被稱為"轉化子"。特別優(yōu)選的載體是AAV載體，是單鏈DNA分子，衍生自腺相關病毒的基因組且無致病性?？捎迷诒磉_框中的啟動子包括，但不限于，nos、ocs、菜豆蛋白(phaseolin)、CaMV、RSV、CMV、SV40、CAG、CK6、和MCK啟動子。表達框含有小基因或微基因，其操作性連接于理想的調控序列，表達框可連接入適當的載體用于傳遞?？傮w來說，可使用AAV載體和慢病毒載體，其含有復制和調控序列，可與宿主細胞兼容。一種適當的載體，例如單個AAV載體一般在末端帶有病毒反向末端重復單位(ITR)、啟動子，和微基因和多聚腺苷酸。"雙載體系統(tǒng)"是指由兩個載體例如，AAV載體組成的載體系統(tǒng)，在系統(tǒng)中兩個載體攜帶需要傳遞的基因或序列的一部分，通過兩個載體之間的相互作用重組得到完整的基因。在一種實施方式中，本發(fā)明中的雙載體系統(tǒng)中，如AAV雙載體系統(tǒng)中的兩個載體，是反剪接載體(ts載體，例如，tsAAV載體)。在另一種實施方式中，本發(fā)明中的雙載體系統(tǒng)中的兩個載體，如AAV雙載體系統(tǒng)，是雜交載體(hybridvectors)(例如，雜交AAV載體)。反剪接AAV載體一般帶有(除在單AAV載體中已有的以外)剪接供體信號和剪接接受體信號。雜交AAV載體一般帶有(除在單AAV載體和反剪接載體中已有的以外)同源重疊序列，優(yōu)選地來自于人胎盤堿性磷酸酶基因的中部三分之一。慢病毒載體一般帶有5'長末端重復單位(LTR)，3'LTR和包裝信號W，如圖2所示。"操作性連接"是指，一個核酸分子與另一個核酸分子處于功能性相關的位置。例如，如果表達框(啟動子和polyA)可影響小/微-抗肌萎縮蛋白基因的轉錄，則該表達框是操作性連接于該序列。AAV和慢病毒載體的結構、功能和使用方面的信息在本領域為公知且可獲得。本發(fā)明中的雙AAV載體的包裝容量大，例如至少10kb。三種經典的雙載體為，順式激活、反式剪接(ts)禾口重疊載體(綜述請見Duan，D.，Z.Yan，andJ.F.Engelhardt.2006.ExpandingthecapacityofAAVvectors,p.pp525_32.InM.E.Bloom，S.F.Cotmore，R.M.Linden,C.R.Parrish，andJ.R.Kerr(ed.)，Parvoviruses.HodderArnold;DistributedintheU.S.A.byOxfordUniversityPress,London,NewYork.Ghosh，A.，andD.Duan.2007.ExpendingAdeno—associatedViralVectorCapacity:ATaleofTwoVectors.BiotechnologyandGeneticEngineeringReviews24:165-177,2007.)。只有ts和重疊載體可以傳遞6kb的小基因。在tsAAV中，大的治療基因被分割成供體載體和接受體載體。供體載體帶有基因的5'端部分以及剪接供體信號。接受體載體帶有剪接接受體信號以及基因的3'端部分。通過AAV反向末端重復單位(ITR)介導的分子內重組和重組基因組隨后的剪接(圖13)實現(xiàn)表達，見Duan，D.，Y.Yue，andJ.F.Engelhardt.2001.ExpandingAAVPackagingCapacityWithTranssplicingOrOverlappingVectors:AQuantitativeComparison.MolTher4:383—91，S皿，L，J丄i，andX.Xiao.2000.Overcomingadeno—associatedvirusvectorsizelimitationthroughviralDNAheterodimerization.Nat.Med.6:599-602，andYan，Z.，Y.Zhang，D.Duan，andJ.F.Engelhardt.2000.FromtheCover:Trans_splicingvectorsexpandtheutilityofadeno—associatedvirusforgenether即y.Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:6716-6721。在重疊載體中，大的治療基因被分割成上游載體和下游載體。上游載體和下游載體共用一個同源區(qū)(Duan，D.，Y.Yue，andJ.F.Engelhardt.2001.，Halbert，C.L.，J.M.Alien,andA.D.Miller.2002.EfficientmouseairwaytransductionfollowingrecombinationbetweenAAVvectorscarryingpartsofalargergene.NatBiotechnol20:697-701)。通過同源重組實現(xiàn)轉基因重組(圖13)。通過理性載體設計，例如優(yōu)化基因的分割位點，可使tsAAV載體的轉化效率達到單個AAV載體的轉化效率(Laietal2005NatureBiotechnique:Laietal2006HumanGeneTherapy)。而且，tsAAV載體的系統(tǒng)傳遞已被證明可有效在嚙齒動物的全身肌肉中進行轉導(Ghosh，Yue，Long,BosticandDuan2007MolecularTherapy16:124-130)。TsAAV介導的小基因治療已被證明在單mdx肌肉中可減少肌肉病征，改善肌肉力量以及阻止收縮導致的受傷(Lai，Y.，D.Li，Y.Yue，andD.Duan.2007.Designoftrans—splicingadeno—associatedviralvectorsforDuche皿emusculardystrophygenetherapy.MethodinMolecularMedicine:In_ptess.，Lai，Y.，Y.Yue，M.Liu，andD.Duan.2006.Syntheticintronimprovestransductionefficiencyoftranssplicingadeno-associatedviralvectors.HumGeneTher17:1036-42，andLai，Y.，Y.Yue，M丄iu，A.Ghosh，J.F.Engelhardt，J.S.Chamberlain,andD.Duan.2005.Efficientinvivogeneexpressionbytrans-splicingadeno-associatedviralvectors.NatBiotechnol23:1435-9.))。除經典的雙AAV載體以外，雜交的AAV雙載體系統(tǒng)近來已被開發(fā)(Ghosh，Yue，LaiandDuan2008MolecularTher即y16:124-130)。TsAAV高度依賴于最佳基因分割位點。這個缺陷可通過雜交載體系統(tǒng)克服。在雜交AAV載體中，可通過如tsAAV載體中描述過的傳統(tǒng)的反剪接通路，或者通過高度重組性外來DNA序列進行同源重組，從而實現(xiàn)轉基因重組。圖1顯示了其他研究者發(fā)表/研究的全長抗肌萎縮蛋白基因、小/微_抗肌萎縮蛋白基因，以及本發(fā)明人合成的代表性的小/微_抗肌萎縮蛋白基因的結構及其各自在修復肌纖維膜上nN0S的功能。在圖1中，N代表抗肌萎縮蛋白的N端結構域；Hl-4代表抗肌萎縮蛋白的桿狀結構域的鉸鏈區(qū)1-4;數字代表在抗肌萎縮蛋白桿狀結構域中的類血影蛋白重復單位(帶正電荷的重復單位以白色數字顯示)；CR代表抗肌萎縮蛋白的富含半胱氨酸的結構域；C代表抗肌萎縮蛋白的C端結構域；帶點的格子表示在每個構建子中被刪除的區(qū)域。如圖1所示，在本發(fā)明以前，小基因A17-48，小基因AH2-R19，微基因AR4-R23/AC，和微基因A3849(AR3-21/AC)已有發(fā)現(xiàn)和研究。雖然具有其他優(yōu)點，但這些小/微基因都不具有修復肌纖維膜上nNOS的功能，其他已發(fā)表的小/微抗肌萎縮蛋白也不具有這樣的功能(未列在圖l中)。在導致本發(fā)明的工作中，合成了新的小/微基因。還發(fā)現(xiàn)這些小/微基因含有R16-17重復單位，例如AH2-R15，AH2-R15/AR18-19,AH2-R15/AC，AR3-15/AR18-23/AC，以及AR2-15/AR18-23/AC，都被證明可修復nN0S，而沒有R16或R17重復單位的小/微基因，例如，AH2-R17，AH2-R16，AH2-R15/AR17-19,和AR3-15/AR17-23，則缺乏這種能力。見本發(fā)明中的圖l和下面提供的實施例。圖l進一步說明了微結構域的nNOS招募功能與其天然環(huán)境/位置無關。在野生型的抗肌萎縮蛋白中，R16-17被R15和R18包圍。在發(fā)明的小/微-抗肌萎縮蛋白基因中，當R16-17舭鄰于其他重復單位或鉸鏈區(qū)時，如Rl(例如在AR2-15/AR18-23/AC中)，R2(例如在AR3-15/AR18-23/AC中)，R3(例如在AH2-R15及其衍生物中)，H3(例如在AH2-R15/AR18-19中)，和R24(例如在AR2-R15/AR18-23/AC及其衍生物中)，nN0S蛋白及其功能在肌纖維膜上也可得到恢復。相應地，在另一種實施方式中，本發(fā)明涉及一種用于在某對象中治療DMD，BMD，和/或XLDC的方法，通過對所述對象給藥治療有效劑量的本發(fā)明中的小基因和/或微基因，優(yōu)選地，通過給藥帶有所述小基因和/或微基因的載體，更優(yōu)選地，通過對所述對象給藥治療有效劑量的含有本發(fā)明所述小基因和/或微基因的AAV載體。"對象"是指任何哺乳動物對象，優(yōu)選地，人類。與本發(fā)明方法相一致的給藥途徑包括局部或區(qū)域性肌肉注射用于提高病人的局部肌肉功能，對某個區(qū)域的所有肌肉或對病人全身系統(tǒng)給藥(例如靜脈內給藥、動脈內給藥、腹腔內給藥)，在局部和/或系統(tǒng)給藥后用AAV或慢病毒載體對肌原性干細胞進行體外感染。"治療有效劑量"是指某劑量，在正確的醫(yī)療鑒定(soundmedicaljudgment)范圍內，其足夠高以至于可顯著正向改善需治療的狀態(tài)，但又足夠低以至于可避免嚴重的副作用(在合理的受益/風險比情況下)。治療有效劑量會隨著治療的特定狀況，或被治療的對14象的狀況以及他/她的身體狀況，以及使用的制備方法、載體或組合物的種類而有所不同。在特定的實施方式中，本發(fā)明包括靜脈內給藥。例如，在用含R16和R17的微-抗肌萎縮蛋白基因進行AAV-9基因治療時，對新生小鼠(l周齡或更小)的劑量為約0.5到約1.5X10ellvg顆粒/克體重或約50到約75iil/克體重；對年輕小鼠(l周齡到l月齡)的劑量為約0.5到約1.5X10ellvg顆粒/克體重或約75到約200y1/克體重；對成年小鼠(l到20月大)的劑量為約O.5到約1.5X10ellvg顆粒/克體重或約200到約400iil/克體重；對新生狗(三天齡或更小)的劑量為約O.5到約2X10ellvg顆粒/克體重或約10到約25ii1/克體重；對年輕狗(3天齡到3月齡)的劑量為約0.5到約2X10ellvg顆粒/克體重或約10到約25ii1/克體重；對成年狗(3月大或更大)的劑量為約1到約3X10ellvg顆粒/克體重或約15到約30ii1/克體重。根據本發(fā)明，在發(fā)現(xiàn)抗肌萎縮蛋白中可招募nNOS的R16-17微結構域后，該微結構域可被整合入非病毒和/或病毒基因治療載體，和/或細胞治療中，用于治療抗肌萎縮蛋白缺乏疾病如DMD、BMD、和XLDC。本發(fā)明提供了一系列AAV小/微抗肌萎縮蛋白載體，其可在抗肌萎縮蛋白缺乏的肌肉中修復nNOS。重組AAV載體包括可修復nNOS的抗肌萎縮蛋白的小基因/微基因，表達框(啟動子和polyA)，和病毒反向末端重復單位(ITR)。圖2列舉了帶有本發(fā)明中的小/微抗肌萎縮蛋白基因的AAV載體的構建子。在另一種實施方式中，本發(fā)明涉及一種藥物組合物，其含有一種或多種本發(fā)明的AAV載體和慢病毒載體和未修飾的質粒DNA分子以及一種藥用可接受運載物(carrier)。核酸的藥物制劑，劑型以及給藥方式已經基本上公開，例如，在Feigner等的美國專利5580859中。局部給藥和系統(tǒng)給藥都應包括在本發(fā)明中。當本發(fā)明的分子用于預防用途時，本發(fā)明的物質可作為長期使用，優(yōu)選通過系統(tǒng)給藥。含有本發(fā)明的治療物質的一種或多種合適的單位劑型可選擇性地制成緩釋制劑，可通過多種途徑給藥，包括口服，或非腸道給藥(non-parental)，包括直腸給藥、透皮給藥、皮下給藥、靜脈內給藥、肌內給藥、腹腔內給藥、胸內給藥、肺內給藥以及鼻腔內給藥等。在適當的時候，所述制劑可以以分散的單位制劑形式方便的提供，并可以通過藥學領域公知的任何方法制備。這些方法可包括，將治療物質與液體運載物、固體基質、半固體運載物、精細篩分的(finelydivided)固體運載物或以上的組合，混合，然后，如有有必要的話，將產品加入理想的傳遞系統(tǒng)或將產品定型為理想的傳遞系統(tǒng)。當為口服給藥而制備本發(fā)明的治療物質時，可優(yōu)選地將其與藥用可接受的運載物、稀釋劑或輔料相結合形成藥物制劑，或單位劑型。"藥用可接受"是指，所述運載物、稀釋劑、輔料、和/或鹽必須與該制劑的其他成分相兼容，且對接受者無害。口服制劑的活性成分可以是粉末或顆粒形式；可以是溶液、混懸液或乳液形式；或者可以是在可實現(xiàn)的基質(achievablebase)中，如合成樹脂可用于從咀嚼膠中攝入活性成分。所述活性成分也可以是大藥丸、煎膏劑或糊劑形式。含有本發(fā)明的藥物組合物的藥物制劑可通過本領域公知的方法使用公知的可獲得的成分進行制備。例如，所述物質可以與常見輔料、稀釋劑、或運載物進行制劑，可形成片劑、膠囊劑、混懸劑、粉末劑，以及類似劑型。適用于這樣制劑的輔料、稀釋劑和運載物的實例包括以下填充劑和補充劑例如，淀粉、糖類、甘露醇，和硅酸衍生物；粘合劑例如羧甲基纖維素，HPMC和其他纖維素衍生物，海藻酸鹽、明膠，和聚乙烯吡咯烷酮；潤濕劑例如甘油；崩解劑例如碳酸鈣和碳酸氫鈉；溶解阻滯劑例如石蠟；再吸收增速劑例如季銨類化合物；表面活性劑例如十六烷醇，單硬脂酸甘油；吸附運載物例如高嶺土和膨潤土；以及潤滑劑例如滑石粉、硬脂酸鈣和硬脂酸鎂，以及固體聚乙二醇。本發(fā)明的治療物質還可被制成便于口服的酏劑或溶液劑或適用于非腸道給藥的溶液劑，例如通過肌肉內給藥、皮下給藥或靜脈給藥途徑。本發(fā)明的治療物質的藥物制劑還可以是水相或非水相溶液或分散劑的形式，或者是乳劑或混懸劑的形式。因此，所述治療物質可以制成非腸道給藥制劑(例如，注射制劑，例如，單次濃注射(bolusinjection)或連續(xù)滴注)，可以是在安瓿中、預填充的針管中、小體積滴注容器中的單位劑型或者是在添加有防腐劑的多劑量容器中的單位劑型?；钚猿煞挚梢允腔鞈覄?、溶液劑或油相載體或水相載體的乳劑，以及可以含有助制劑(formulatory)物質例如助懸劑、穩(wěn)定劑、和/或分散劑。另外，活性物質可以是粉末形式，通過無菌分離無菌固體或從溶液中凍干獲得，用于在使用前與適當的溶媒重組，即，與無菌、無熱原水重組。這些制劑含有藥用可接受的溶媒和佐劑，其都為本領域公知的現(xiàn)有技術。本發(fā)明的組合物還可含有增稠劑例如纖維素和/或纖維素衍生物。他們還可含有樹膠(g咖)例如黃原膠、瓜爾膠、卡波膠(carbogum)、阿拉伯膠，或其他聚乙二醇類，陶土類(bentones)以及高嶺石類，以及其類似物。如果必要的話，還可添加佐劑，佐劑可選自抗氧劑、表面活性劑、其他防腐劑、薄膜形成劑、角質溶解劑、或抗粉剌劑(comedolyticagents)、香味劑和著色劑。另外，還可加入其他活性成分，不管是針對所述狀態(tài)的或是針對某些其他狀態(tài)的。本發(fā)明的藥物組合物的局部傳遞也可通過多種技術，將所述物質給藥至病灶(diseasesite)或接近病灶。定點的(sitespecific)或耙向局部給藥技術的實例不意在限制但作為可用技術的舉例描述。實例包括局部給藥導管，例如滴注導管或留置導管，例如，滴注導管針、分流器和支架或其他可植入器械，定點運載物，直接注射，或直接應用方式。特別地，為了將本發(fā)明的載體傳遞至某組織如肌肉，可使用任何物理或生物方法將所述載體導入某宿主動物的肌肉組織中。載體是指裸露的重組載體以及包裝在病毒包膜蛋白中的載體DNA，這是AAV給藥中所公知的。實驗已經證明，僅需將AAV載體溶于磷酸鹽緩沖溶液(PBS)或溶于N-2-羥乙基哌嗪-N'-2-乙基磺酸(HEPES)緩沖溶液中就足夠提供可用于肌肉組織表達的載體，而且在與該載體共同給藥的運載物或其他組分上沒有已知的限制(雖然對載體的常規(guī)操作中應避免降解DNA的組分)。藥物組合物可制成可注射的制劑或可通過透皮運輸傳遞至肌肉的外用制劑。前人已經開發(fā)了無數的可用于肌肉注射和透皮運輸的制劑，這些在本發(fā)明中都可應用。為方便給藥和方便使用，載體可以與任何藥用可接受的運載物一起使用。為肌肉注射的目的，可在佐劑例如芝麻油或花生油或水相丙二醇中使用溶液，以及無菌水相溶液。這樣的水相溶液可以是緩沖體系，如果希望的話，可以首先用鹽或葡萄糖將液體稀釋劑做到等滲?？梢酝ㄟ^在水中適當混合表面活性劑例如羥丙基纖維素，來制備AAV載體作為游離酸(DNA含有酸性磷酸鹽基團)的溶液或AAV載體作為藥用可接受鹽的溶液。還可在甘油、液體聚乙二醇以及其混合物中或在油中制備AAV病毒顆粒。在普通的儲存和使用條件下，這些制劑含有防腐劑，以阻止微生物的生長。在這一點上，本領域技術人16員通過公知的標準技術即可得到無菌水相溶媒。適用于注射用途的藥物劑型包括無菌水相溶液劑或分散劑和無菌粉末用于臨用時制備無菌可注射溶液劑或分散劑。在所有的情況下，這些劑型必須是無菌的且必須在某種程度上為流體以保證可注射性(syringability)。其必須在生產和儲存條件下穩(wěn)定，且必須防止被微生物例如細菌和真菌污染。所述運載物可以是溶劑或分散媒介，其含有，例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液體聚乙二醇以及類似物)，以上的適當的混合物、以及植物油。應保持適當的流動性，例如，可通過使用包衣例如卵磷脂，在分散劑的情況下可通過保持所需的粒徑，以及可通過使用表面活性劑的方法?？赏ㄟ^多種抗細菌劑和抗真菌劑，例如，苯甲酸酯類、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞以及其類似物等，防止微生物的作用。在許多情況下，可優(yōu)選包括等滲劑，例如，糖類或氯化鈉。可通過使用吸收延遲劑，例如，硬脂酸鎂和明膠，從而延長可注射組合物的吸收。無菌可注射溶液劑的制備可通過將需要量的所述AAV載體，與多種前述的所需的其他成分共同加入適當的溶劑，再進行過濾除菌。一般來說，分散劑的制備可通過將無菌的活性成分加入無菌溶媒，其含有基本分散溶媒以及上述所需的其他成分。在用無菌粉末制備無菌注射用溶液劑的情況下，優(yōu)選的制備方法是真空干燥以及冷凍干燥，從先前過濾除菌的溶液中得到活性成分加上其他附加理想成分的粉末。本發(fā)明的治療化合物可單獨給藥或與藥用可接受的運載物聯(lián)合給藥于哺乳動物。活性成分和運載物的相對比例可根據化合物的溶解度和化學性質、選擇的給藥途徑和標準的藥學慣例來決定。本發(fā)明中治療成分的最適合預防或治療的劑量根據給藥形式、選擇的特定化合物以及接受治療的特定病人的生理情況會有所不同。一般來說，最初會使用小劑量，如果必要的話，可以小幅度遞增直到在一定條件下達到最佳效果。劑量的實例在下面的實施例中有描述。由于AAV已被證明適用于廣泛的宿主范圍(用于肺部表達)且在肌肉中可持續(xù)存在(persist)，因此本發(fā)明的載體可應用于在任何動物中表達某基因，特別是在哺乳動物、鳥類、魚類、和爬行動物中，尤其是在家養(yǎng)哺乳動物和鳥類中例如牛、羊、豬、馬、狗、貓、雞、和火雞。特別優(yōu)選的用途是對人和獸醫(yī)方面的應用。被表達的基因既可以是編碼某蛋白的DNA片段，和使用者想要的任何調控序列(如啟動子、操縱子)，也可以是非編碼的DNA片段，其轉錄可產生完整的或部分的某些含RNA的分子(如轉錄調控序列，+RNA，或反義分子)。腺相關病毒載體與上述載體系統(tǒng)相比有特定的優(yōu)勢。首先，像腺病毒一樣，AAV可有效感染不分裂細胞。第二，在載體中所有AAV病毒基因都已被除去。由于病毒基因表達導致的免疫反應已不成問題，因此AAV載體比腺病毒載體更安全。第三，野生型AAV天然就是整合型病毒，因此其可整合到宿主染色體且會在細胞中穩(wěn)定保持轉基因。第四，重組AAV載體可在哺乳動物組織如肌肉中作為附加體(印isomal)穩(wěn)定存在多年，特別是在嚙齒類動物、狗和人中。附加體的形式被認為是AAV在體內組織中介導的轉化中占主導地位的形式。第五，AAV是極其穩(wěn)定的病毒，其可抵抗多種去污劑，pH變化和熱(在56t:可穩(wěn)定超過l小時)。它可被凍干并重溶且不失活。因此它是基因治療中非常具有前景的傳遞載體。本發(fā)明進一步提供了實施例，包括發(fā)明的小/微基因的制備，nNOS修復的檢測、nN0S蛋白活性的檢測、發(fā)明的AAV載體的表達。以下提供的實施例僅旨在例舉一些實施方式，而不應以任何方式理解為限制權利要求的范圍，其范圍僅被說明書所界定。實施例1:實驗方法動物模型和體內基因傳遞。本發(fā)明中描述的所有動物實驗都已獲得密蘇里大學動物管理和使用委員會的批準，并遵守國立衛(wèi)生院的指導原則。正常實驗小鼠(BL10小鼠)和抗肌萎縮蛋白缺陷的實驗小鼠(mdx和mdx4cv小鼠)最初購自杰克遜實驗室(BarHarbor，Maine)。myoD/抗肌萎縮蛋白雙敲除(m-dko)的小鼠最初從渥太華研究所的麥克羅德尼克博士處獲得。隨后在密蘇里大學通過內部繁育建立克隆種系(colonies)，小鼠(包括實驗小鼠和繁育配對)在特定的無病原體動物房中飼養(yǎng)，溫度20-23t:，光照-黑暗循環(huán)為12小時-12小時。將兩塊肌肉(脛骨前肌(TA)和腓腸肌)用于評價抗肌萎縮蛋白的表達，nNOS的表達以及nNOS活性，通過體內局部轉染非病毒質?；蛳俨《窘閷У木植炕騻鬟f。在腺病毒介導的基因傳遞(局部和系統(tǒng)傳遞)后，將伸趾長肌(EDL)肌肉用于評價抗肌萎縮蛋白的表達、nN0S的表達、nN0S活性和肌肉力量的改善。在靜脈系統(tǒng)基因傳遞后，對全身肌肉(包括骨骼肌和心肌)都進行分析，測定抗肌萎縮蛋白的表達，nN0S的表達以及nN0S活性和肌肉病理的改善。為將質粒或腺病毒傳遞至這些肌肉，肌肉的近端首先開一條2-3毫米的口。將33G漢密爾頓針插入肌肉的中間腹部(belly)。將載體(質?；蛳俨《?注射入肌肉，同時緩慢退出注射針。縫合傷口，監(jiān)測動物直到其蘇醒。人抗肌萎縮蛋白和nN0S的雙免疫熒光染色。所有報道過的小/微_抗肌萎縮蛋白基因以及發(fā)明出的小/微_抗肌萎縮蛋白基因都是根據人抗肌萎縮蛋白的cDNA建立模型的。為評價合成小/微-基因的表達，使用了一種單克隆抗體，其可特異性地與人抗肌萎縮蛋白的鉸鏈1區(qū)反應，而不與小鼠的抗肌萎縮蛋白反應(Dys-3，克隆DylO/12B2，IgG2a;1:20稀釋；Novocastra公司，紐卡斯爾，英國)。為評價nN0S的表達，使用一種抗nN0S的C端的多克隆抗體(l:2000稀釋；圣克魯茲，圣克魯茲，加利福利亞州)。該多克隆抗體在小鼠肌肉中的背景信號非常低。以下為雙免疫染色法的操作步驟說明。簡要地說，用KPBS(365iiMKH2P04，1.64mMK2HP04，160mMNaCl)沖洗8ym空氣干燥的冷凍切片。用1%山羊血清KPBS溶液室溫封閉15分鐘。用O.2%明膠(Sigma，圣路易，密蘇里州)的KPBS溶液洗。加入抗nNOS抗體4t:過夜。用0.2%明膠的KPBS溶液洗。加入Alex488綴合的羊抗兔抗體(1:100稀釋；MolecularProbe，Eugene，俄勒岡州)顯示nNOS的蛋白表達。第二步需要使用在小鼠肌肉中使用鼠單克隆抗體。首先，封閉以阻止二抗與內源小鼠免疫球蛋白(Ig)的結合。用木瓜蛋白酶消化的兔抗鼠IgG(包括Fab和Fc片段)進行封閉。簡要的說，兔抗鼠IgG(Sigma，圣路易，密蘇里州)用木瓜蛋白酶(Sigma，圣路易，密蘇里州)在lmMEDTA和22mML-半胱氨酸(Sigma，圣路易，密蘇里州)存在的條件下，在37t:消化16小時。消化反應用碘乙酸(Sigma，圣路易，密蘇里州)終止。雙免疫染色中，用nNOS抗體染過色的冰凍切片用抗鼠IgG封閉溶液在室溫封閉60分鐘。冰凍切片用PBS洗后，再用20%兔血清(杰克遜免疫研究實驗室，WestGrove，賓夕法尼亞州)在室溫封閉30分鐘。用PBS洗后，加入Dys-3單克隆抗體(用1X兔血清稀釋)4。C過夜。用PBS洗后，用Alex594綴合的羊抗鼠抗體(MolecularProbe，Eugene,俄勒岡州)顯示人抗肌萎縮蛋白抗原表位。為細胞核成像以及減少光漂白(photobleaching)，用抗光衰退試劑盒(SlowFadeLightAntifadeKit)將切片用DAPI(MolecularProbe，Eugene，俄勒岡州)染色(mounted)。用尼康E800熒光顯微鏡的QimageRetiga1300照相機拍下顯微照片(photomicrographs)。組織-酶染色檢測nNOS活性。根據煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸鹽(NADPH)黃遞酶(diaphorase)活性的減弱，對nN0S活性進行組織化學監(jiān)測(Hope等，1991;Bredt等，1991;Dawson等，1991)。nN0S是一種NDAm黃遞酶(Hope等，1991)。本質上說，nNOS將NADPH作為一個電子供體，把無色可溶的四唑硝基藍(NBT)鹽轉化成為藍色不溶的甲臜(formazan)。為檢測肌肉中的nN0S活性，將16m空氣干燥的冰凍切片首先用4%多聚甲醛在4°C固定2小時。這個步驟使其他細胞酶如脫氫酶和P450的非特異性NADra黃遞酶活性失活。而來自nN0S的NADPH黃遞酶活性則可抵抗多聚甲醛的固定(Mats咖oto等，1993;SpessertandClaassen，1998)。用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)簡單沖洗后，將組織切片用0.2%TritonX-100在37°C浸潤20分鐘。然后用含有0.2%TritonX_100，0.2mMNADPH，和0.16mg/mlNBT的溶液在37t:染色4小時，顯示NADra黃遞酶的活性。功能性的nN0S酶在顯微鏡的亮區(qū)顯示藍色染色。用尼康E800熒光顯微鏡的QimageRetiga1300照相機拍下顯微照片。重組AAV-6的生成。用于AAV包裝的順式質粒帶有本發(fā)明中的小/微基因如AR2-15/R18-23/AC微基因。我們無意于被任何機制限制，R16-17微結構域被認為是在這些小/微基因中起nNOS修復作用。為得到AAV載體，包裝細胞系(293細胞)在質粒轉染前48小時以1:6的比例分到150mm的培養(yǎng)盤中。為獲得AAV-6載體，共同轉染一共四種質粒。這些包括順式質粒，pMT-R印2，pCMVCap6和pHelper。每次載體準備(15X150mm培養(yǎng)盤)使用187.5iig順式質粒，187.5iigpMT-R印2，562.5iigpCMVC即6和562.5iigpHelper(比例為l:1:3:3)。所有質粒在15.2ml水中完全混合后，加入1.68mlCaCl2使終濃度成250mM。將DNA/CaCl2混合液緩慢滴加至16.8ml2XHBS中，以形成DNA-磷酸鹽沉淀。然后將DNA-磷酸鹽沉淀逐滴加入293細胞中，同時搖晃培養(yǎng)盤。轉染后72小時，用細胞收集器(celllifer)(CorningIncorporated,Corning,紐約)收集細胞裂解液。在臺式離心機中離心(3000rpm，4。C)20分鐘后，將細胞沉淀(cellpellet)重懸于9ml10mM的Tris-HCl(pH8.0)中。細胞沉淀用干冰/乙醇和4(TC水浴凍融8到10次。細胞沉淀在功率輸出為5.5的條件下超聲10分鐘(冰上)(MisonicCellDisruptorS3000;Misonix，紐約)。細胞沉淀在37t:用DNA酶I消化45分鐘。再次在功率輸出為5.5的條件下超聲7分鐘(冰上)。裂解液用1/10體積的0.25%胰蛋白酶和10%脫氧膽酸鈉在37t:消化30分鐘。在4t:以4000rpm離心30分鐘得到澄清的細胞裂解液。將上清液轉移至一個新管中。用10mM的Tris(pH8)將體積調整至29ml，并加入18.2g的CsCl2(終濃度，O.613gCsCl2/ml)。溶液在37。C培養(yǎng)30分鐘以溶解CsCl2，然后在4。C以4000rpm離心30分鐘。將上清液加入至6支5ml貝克曼超離心管中，放入SW55Ti轉頭中，在4°C以46，OOOrpm離心40hr。用20號(Gauge)針從管底收集層分(fraction)。用放射性標記的人抗肌萎縮蛋白基因特異性探針通過狹縫轉印(slotblot)識別含有病毒的層分(fraction)。含有最高病毒滴度的層分(fraction)合并在一起并在4°C以46，OOOrpm離心40hr。收集層分(fraction)并通過狹縫轉印(slotblot)識別含有最高病毒的層分(fraction)。病毒儲存液在HEPES緩沖液(20mMHEPES，150mMNaCl，pH7.8)中在4。C透析2X24小時。重組AAV-9的生成。用于AAV-6包裝的同樣的順式質粒也用于AAV-9的包裝。除了包裝質粒以外，轉染和純化操作基本上與AAV-6制備中的相同。未使用四質粒共轉染方法，而是使用一種三質粒轉染方法，使用順式質粒，pR印2/C即9和pHelper，比例為1:1:3(187.5iig順式質粒，187.5iigpR印2/Cap9禾口562.5iigpHelper)(Bosticketa1，2007;Ghosheta1，2007)。實施例2:小/微-抗肌萎縮蛋白基因抗肌萎縮蛋白小基因的一個例子，AH2-R15，可通過使用AH2-R19小基因作為模板得到。圖3顯示，原型構建子的鑒定酶切包括全長基因，AH2-R19小基因以及三個新合成的小基因。AH2-R19小基因不能在肌纖維膜中修復nNOS，但正在進行DMD基因治療的研究(Harperetal，2002;Laieta1，2005)。AH2-R17，AH2-R16和AH2-R15三個小基因與AH2-R19小基因相比，分別另含有兩個(R18和R19)、三個(R17、R18和R19)、和四個(R16、R17、R18和R19)額外的重復單位。額外的重復單位可通過鑒定條帶的分子量逐漸增加而顯現(xiàn)。特別是，每個構建子用NsiI/SalI雙酶切后可從轉基因中釋放出鑒定片段。酶切后的DNA片段在瓊脂糖凝膠上進行電泳。鑒定條帶的大小用分子量標記(lkb梯度)確定。星號表示AH2-R19構建子由于不完全酶切造成的殘留質粒。與合成的小-抗肌萎縮蛋白基因相似，合成的微-抗肌萎縮蛋白基因也可通過標準的分子生物學克隆過程得到。過程基本如下，將相關的DNA序列(如重復單位，鉸鏈區(qū)等)通過高保真PCR反應擴增，然后用T4DNA連接酶通過酶連接重新組裝。然后將重組的合成DNA分子用標準DNA重組技術轉化至感受態(tài)大腸桿菌中。通過限制性酶切鑒定正確的克隆。這些克隆進一步通過DNA測序確證。實施例3:nN0S修復圖4為免疫熒光分析結果，顯示在兩月齡的mdx小鼠中，用全長或某些合成小_抗肌萎縮蛋白基因，AH2-R15，AH2-R16，AH2-R17，或AH2-R19治療后，骨骼肌中nNOS的修復以及抗肌萎縮蛋白的表達。同時還顯示了未治療的mdx小鼠肌肉的回復突變纖維克隆。實驗中，在兩月齡的mdx小鼠的脛骨前肌(TA)和腓腸肌中注射入帶有全長人抗肌萎縮蛋白cDNA，AH2-R19，AH2-R17，AH2-R16，或發(fā)明的AH2-R15小基因的質粒。所有小基因都衍生自人抗肌萎縮蛋白基因，并可被一種單克隆抗體(Dys-3)識別，該單克隆抗體可特異性識別僅存在于人抗肌萎縮蛋白的某個抗原表位(這個抗體在本申請中被稱為HumDys抗體)。在所有這些構建子中，轉基因在CMV啟動子和SV40polyA的轉錄調控下表達。在注射時，在mdx肌肉中除少數回復突變纖維外沒有抗肌萎縮蛋白表達。mdx肌肉中抗肌萎縮蛋白表達的缺失是因為在這種模型中小鼠抗肌萎縮蛋白基因的外含子23位有一個點突變。這個突變導致了翻譯的提早終止以及抗肌萎縮蛋白表達丟失。偶爾地，突變外顯子被跳過從而會產生RNA轉錄子。這就使得抗肌萎縮蛋白使在含有跳過轉錄子(skippedtranscripts)的肌纖維中表達。這些肌纖維被稱為回復突變?；貜屯蛔兗±w維的出現(xiàn)頻率通常<1%。由于回復突變肌纖維帶有小鼠抗肌萎縮蛋白，因此它不能被人抗肌萎縮蛋白特異性的抗體識別。為了得到抗肌萎縮蛋白表達與小抗肌萎縮蛋白基因(AH2-R15)中nNOS表達的關聯(lián)，以及與人全長抗肌萎縮蛋白基因對照和其他對照小基因(AH2-R19，AH2-R17，AH2-R16)中nNOS表達之間的關聯(lián)，在免疫染色中使用兩種不同的抗體，HumDys抗體和nNOS抗體。如圖4所示，HumDys抗體(圖4，頂行)僅與人抗肌萎縮蛋白反應而不識別回復突變肌纖維中的鼠抗肌萎縮蛋白。nNOS抗體(圖4，中間行)可識別肌纖維膜中存在的20nN0S。在轉染了全長抗肌萎縮蛋白質粒的細胞和轉染了AH2-R15小基因的細胞中，以及在回復突變肌纖維中都有正染色，但在轉染了AH2-R19，AH2-R17，AH2-R16小基因的肌纖維中沒有正染色。在合并后的圖像中(圖4，底行)，可修復nN0S蛋白的構建子顯示為黃色(全長和AH2-R15)，而不可修復nN0S蛋白的構建子顯示為紅色(AH2-R16，AH2-R17，AH2-R19)。在回復突變肌纖維中的鼠抗肌萎縮蛋白不能被Dys-3抗體識別，在合并后的圖像中顯示為綠色。標度尺為50iim。表2為圖4中顯示的免疫染色結果的量化。表2提供了總結性的證據證明發(fā)明的AH2-R15小基因可修復肌纖維膜中的nNOS。圖5為另外的免疫熒光分析結果，顯示在肌萎縮蛋白缺陷的mdx小鼠中，用三種另外的合成小/微基因AH2-R15/AH18-19，AH2-R15/AC，或AR3-15/AR18-23/AC治療后，骨骼肌中nNOS的修復以及抗肌萎縮蛋白的表達。同時還顯示了未治療的mdx小鼠肌肉的回復突變纖維。同樣地，所述的另外的小/微基因也是在CMV啟動子和SV40polyA的轉錄調控下表達。將帶有這些發(fā)明的基因的質粒注射入兩月齡mdx小鼠的TA或腓腸肌中。一到兩周后測定抗肌萎縮蛋白的表達和nNOS的修復。這些發(fā)明的小/微基因的表達通過特異性識別人抗肌萎縮蛋白抗原表位的抗體(紅色)檢測。nNOS的表達通過nNOS特異性抗體(綠色)顯示。合并的圖像顯示，發(fā)明的小/微-抗肌萎縮蛋白和nNOS蛋白有共定位(黃色)。在這些顯微照片中，帶有發(fā)明的小/微基因的纖維用星號標記。在未處理的肌肉(無質粒)中，僅檢測到回復突變肌纖維(十字)。標度尺為50ym。實施例4:nNOS活性測試通過嚴格的(stringent)組織-酶實驗確定招募的nNOS蛋白的生物化學功能。nNOS-活性結果包括在圖5，6B-6E和7A-7B中，nNOS活性染色在亮區(qū)圖像中顯示為藍色。一個重要的關注點是，在用發(fā)明的小/微基因進行治療后，通過免疫熒光檢測到的nNOS蛋白是否確實是一個功能性蛋白。nNOS具有NADra黃遞酶活性(Hopeetal，1991;Bredtetal，1991;Dawsonetal，1991)。本質上，這種酶活性使電子從NADPH轉移至一種無色可溶的四唑硝基藍鹽，并最終生成一種無色不可溶的甲臜衍生物(Beesley，1995;Rotheetal，2005)。nNOS活性實驗，即發(fā)明人使用的組織_酶實驗，之前已被其他研究者用于證明nNOS和a-互生蛋白(Kameyaetal，1999)之間的功能性相互作用。免疫熒光染色中顯示n-NOS蛋白正染色的肌纖維在原位酶實驗中也顯示出了nNOS活性實驗結果。表3顯示了圖5中免疫染色的量化和nNOS活性實驗的結果。表3提供了清楚的證據證明有R16-17微-結構域的小/微基因可在肌纖維膜中修復功能性nNOS蛋白。R16-17微-結構域對nNOS的招募活性與其在全長蛋白中的天然位置無關。表3的結果進一步證明了這一結論，即發(fā)明的小/微基因對nNOS的修復與抗肌萎縮蛋白的C端結構域無關。實施例5:含有小/微基因的AAV載體圖6A顯示了AAV載體的一個例子，即，含有AR2-15/AR18-23/AC微基因的AAV載體，并與全長蛋白和現(xiàn)有的A3849微基因表達框(cassette)(Wangetal，2000)作比較。AAV載體的表達框含有CMV啟動子，AR2-15/AR18-23/AC微基因，和SV40polyA。整個表達框兩端連接有AAV的ITR。AAV載體的獲得是通過將整個構建子(AV.CMV.AR2-15/AR18-23/AC)包裝至具有所選擇的AAV血清型(serotype)的衣殼(capsid)中，血清型例如AAV-6，AAV-8，和AAV-9。圖6A還顯示了另一個微抗肌萎縮蛋白表達框(MCK.AR3-22/△C)的結構。這個微基因最初被其作者稱為"A3849小基因"(Wangeta1，2000)。為方便比較，將其重命名為AR3-22/AC微基因以便反映出其分子結構。圖6B到6E顯示了免疫熒光染色和nNOS活性染色的結果。在圖6B到6E中，微基因的表達(來自轉基因mdx小鼠，如6D所示；或來自發(fā)明的AAV-6載體，如6E所示)通過特異性識別人抗肌萎縮蛋白抗原表位的單克隆抗體以紅色顯示。nNOS蛋白使用nNOS特異性的多克隆抗體以綠色顯示。細胞核用DAPI染色以藍色顯示。nNOS的酶活性在亮區(qū)顯微鏡下在肌纖維膜上用藍色顯示。在這些欄中，頂行的顯微照片為低倍圖像(標度尺，500iim)。底行的顯微照片分別為頂行顯微照片中的帶框區(qū)域的放大圖像(標度尺，100iim)。在這些實驗中，AV.CMV.AR2-15/AR18-23/AC使用已知的實驗方法包裝成AAV-6，然后將包裝好的AAV載體傳遞至兩月齡mdx小鼠的TA肌肉中(Laietal，2005;Ghoshetal，2006;Yueetal，2006;Laietal，2006)。三周后收集AAV感染的肌肉。圖6B顯示了在正常小鼠TA肌肉中肌纖維膜nN0S的位置。在正常小鼠肌肉中，用特異性識別人抗肌萎縮蛋白抗原表位的抗體(Dys-3)檢測不到人抗肌萎縮蛋白。在正常小鼠肌肉中檢測到大量nNOS蛋白和nNOS活性。已證明nNOS傾向于表達在II類纖維中。在小鼠的TA肌肉中，99X的纖維都是II類纖維。星號顯示了少數的nNOS蛋白和nNOS活性顯陰性的肌纖維(<1%)。這些是I類纖維。圖6C顯示了在mdx肌肉中肌纖維膜上缺少nNOS蛋白和nNOS活性。在mdx小鼠肌肉中，用特異性識別人抗肌萎縮蛋白抗原表位的抗體(HumDys)檢測不到人抗肌萎縮蛋白。箭頭指示少見的具有nNOS蛋白和nNOS活性的回復突變纖維。圖6D證明了已發(fā)表的AR3-21/AC微基因無法修復肌纖維膜的nN0S。#號表示一個具有代表型的肌纖維，其表達AR3-21/AC微基因但nNOS蛋白和nNOS活性呈陰性。圖6E顯示了發(fā)明的AR2-15/AR18-23/AC微基因AAV載體對nNOS蛋白和nNOS活性的成功修復。AAV-6(AV.CMV.AR2-15/AR18-23/AC)有效感染了mdxTA肌肉的大部分肌纖維。十字表示一個具有代表性的肌纖維，其表達了AR2-15/AR18-23/AC微基因且呈nNOS陽性。雙十字表示一具有代表性的肌纖維，其未被AAV感染故沒有AR2-15/AR18-23/AC微基因的表達或nN0S蛋白/活性。與表達AR3_21/AC微基因的肌肉不同的是，所有的△R2-15/AR18-23/AC微基因陽性的纖維還表現(xiàn)出對nNOS蛋白和nNOS活性的陽性染色。而AR2-15/AR18-23/AC微基因陰性的纖維對nNOS蛋白和nNOS活性基本上也呈陰性。實施例6:R16和R17重復單位在發(fā)明的微_基因AAV載體對nNOS的修復中都為必需。圖7A和7B顯示免疫熒光染色和nN0S活性染色結果。在這些實驗中，通過已知的實驗方法將AV.CMV.AR2-15/AR18—23/AC(圖7A)禾PAV.CMV.AR3—15/AR17—23/AC(圖7B)包裝入AAV-9中，然后將包裝后的AAV載體傳遞至50天齡的mdx小鼠的TA肌肉中(Bostick等，2007;Ghosh等，2007)。30天后收集被AAV感染的肌肉。圖7A顯示，發(fā)明的AR2-15/R18-23/AC微基因AAV-9載體成功修復了nN0S蛋白和nNOS活性。為檢測AR2-15/R18-23/AC微基因的表達，使用了四種不同的抗肌萎縮蛋白的抗體。鉸鏈1抗體(也稱作Dys3)僅識別人抗肌萎縮蛋白的鉸鏈1。R16抗體(也稱22作Mandys106)識別抗肌萎縮蛋白重復單位16。R17抗體(也稱作Manex44A)識別抗肌萎縮蛋白重復單位17。鉸鏈3抗體(也稱作Manex50)識別抗肌萎縮蛋白鉸鏈3。發(fā)明的AR2-15/R18-23/AC微基因不含H3。因此，鉸鏈3抗體僅檢測到少量的回復突變纖維。鉸鏈1、R16和R17抗體顯示，AV.CMV.AR2-15/R18-23/AC載體得到大量轉化。這些轉入AAV的肌纖維還表達了nNOS蛋白并顯示了nNOS活性(標度尺，500ym)。圖7B顯示在感染了AV.CMV.AR3_15/R17_23/ACAAV-9載體的mdx肌肉的肌纖維膜中缺乏nNOS蛋白和nNOS活性。這個微基因不含R17。因此，用R17抗體僅檢測到少量的回復突變纖維。雖然本發(fā)明的描述與具體實施方法相關，但是應理解，發(fā)明的方法可進行進一步的改進。本專利申請意在包括大體上根據本發(fā)明的原則而作出的對本發(fā)明的任何變動、使用、或改動，以及包括對本發(fā)明的改換，這種改換在本發(fā)明相關領域的已知或常用技術范圍內，且可適用于前述的基本特征以及下面的權利要求的范圍內。實施例7:酵母雙雜交研究結果顯示R16-17和nNOS的PDZ結構域之間存在相互作用。我們在mdx小鼠的體內研究表明，僅有R16(例如在AR3_15/R17_23/AC微基因中)或僅有R17(例如在AH2-R16微基因中)都不能修復肌纖維膜中nNOS的表達。但是，當R16和R17兩者都存在時(例如在AR2-15/R18-23/AC微基因中)，nNOS可被招募到肌纖維膜。為確定R16-17和nNOS的PDZ結構域之間是否存在直接的相互作用，我們進行了酵母雙雜交試驗(圖8)。結合構建子表達DNA結合域，色氨酸(Trp)和nNOS的PDZ結構域(圖8A)。激活構建子表達DNA激活域，亮氨酸(Leu)和抗肌萎縮蛋白類血影蛋白重復單位(僅R16，僅R17或R16和R17兩者都有)(圖8A)。帶有互生蛋白PDZ結構域的激活構建子在實驗中作為陽性對照。DNA結合結構域和DNA激活結構域之間的相互作用可開啟組氨酸(His)的生成(圖8A)。轉入單個構建子的酵母細胞不能在1^1!-/111)-雙缺乏的培養(yǎng)盤上生長。共同轉入結合和激活構建子的酵母細胞可以在1^1!-/111)-培養(yǎng)盤上生長。在陽性對照中，互生蛋白的PDZ結構域和nNOS的PDZ結構域之間的相互作用導致組氨酸的生成。這使得酵母細胞可以在Leu-/Trp-/His-三缺乏的培養(yǎng)盤上生長(圖8B和圖8C)。我們觀察到共同轉染入R16-17激活構建子的酵母細胞的生長，但未觀察到共轉染入R16或R17激活構建子的酵母細胞的生長(圖8B和8C)。綜上，我們的酵母雙雜交實驗結果表明，在R16-17和nN0S的PDZ結構域之間存在直接的相互作用。但是，僅R16或僅R17都不能與nNOS的PDZ結構域產生相互作用。含有R16-17的微-抗肌萎縮蛋白基因可增強肌纖維膜。抗肌萎縮蛋白為肌纖維膜提供了力學支持。在抗肌萎縮蛋白缺失的情況下，肌肉收縮導致肌纖維膜損傷。這可以通過受傷肌纖維中伊文氏藍染料的聚集來測定。將AV.CMV.AR2-15/AR18-23/AC傳遞至兩月齡的成年mdx小鼠的腓腸肌中，40天后進行EBD攝入實驗。用特異性識別N端、R16和R17的抗體進行系列免疫熒光染色，結果顯示微基因表達(圖9)。R6-8和C端在AR2-15/AR18-23/AC微基因中被刪除。特異性識別這些區(qū)域的抗體不能得到陽性染色。僅在未被AV.CMV.AR2-15/AR18-23/AC載體轉染的肌纖維中觀察到EBD。含有R16-17的微-抗肌萎縮蛋白基因可在杜興氏肌肉萎縮癥(匿D)的小鼠模型中改善肌肉力量。AR4-23微基因是已報道的最佳的微基因之一(Abmayr等，2005;Gregorevic等，2006;Gregorevic等，2004;Harper等，2002;Liu等，2005;Yue等，2003;Yue等，2006)。在mdx小鼠、肌營養(yǎng)相關蛋白/抗肌萎縮蛋白雙敲除小鼠、和營養(yǎng)不良狗的實驗中都表現(xiàn)出具有前景的結果。比較感染了AV.CMV.AR4-23/AC或AV.CMV.AR2-15/AR18-23/AC的mdx小鼠伸趾長肌(EDL)的肌肉力量。除了在桿狀結構域的結構有區(qū)別之外(圖IOA)，兩種微基因都導致了相同水平的力量改善(圖IOB)。實驗測試了AR2-15/AR18-23/AC微基因是否可在mdx4cv小鼠中改善肌肉力量。這些小鼠的遺傳背景為BL6，在抗肌萎縮蛋白基因中攜帶不同的突變。在新生的mdx4cv小鼠中進行系統(tǒng)基因傳遞后，觀察到EDL肌肉比力得到顯著提高(圖11A)。在DMD病人和DMD動物模型中血清肌酸激酶(CK)的水平升高。用AR2-15/AR18-23/AC微基因進行AAV治療顯著降低了mdx4cv小鼠中的血清CK水平(圖IIB)。為進一步評價AR2-15/AR18-23/AC微基因的治療效果，在成年myoD/抗肌萎縮蛋白雙敲除(m-dko)小鼠中進行了更加嚴格的實驗。Mdx小鼠表現(xiàn)出輕微的表型。這個有部分是因為在小鼠骨骼肌中有強健的肌肉新生。在m-dko小鼠中，骨骼肌特異性的轉錄因子myoD失活導致肌肉新生的阻斷。m-dko小鼠表現(xiàn)出與人類病人相似的嚴重的肌肉疾病(Duan，2006;Megeney等，1996;Megeney等，1999)。在兩月齡的雄性m-dko小鼠中進行AAV-9的系統(tǒng)傳遞。AAV治療后三個月，在單次(抽搐)和強直剌激下測試EDL肌肉力量。與未治療小鼠相比，AV.CMV.AR2-15/AR18-23/AC感染顯著增強了肌肉力量(圖12A和12B)。匿D肌肉對離心收縮引起的受傷尤其敏感。在未治療的m-dko小鼠中，離心收縮導致肌肉力量的快速削弱。AV.CMV.AR2-15/AR18-23/AC治療顯著保護了離心受傷后的肌肉力量(圖12C)。除了肌肉力量的改善以外，在成年m-dko小鼠中的AAV治療還導致了血清CK水平的顯著降低(圖12D)。[OH7]參考文獻Adams，M.E.，Mueller,H.A.，andFroehner，S.C.(2001).Invivorequirementofthealpha_syntrophinPDZdomainforthesarcolemmallocalizationofnNOSandaq卿orin-4.JCellBiol155，113-122.Bachrach，E.，Li，S.，Perez，A.L，Schienda，J.，Liadaki，K.，Volinski，J.，F(xiàn)lint,A.，Chamberlain,J.，andK皿kel，L.M.(2004).Systemicdeliveryofhumanmicrodystrophintoregeneratingmousedystrophicmusclebymuscleprogenitorcells.ProcNatlAcadSciUSA707，3581-3586.Beesley，J.E.(1995).Histochemicalmethodsfordetectingnitricoxidesynthase.HistochemJ27,757—769.Bostick，B.，Ghosh，A.，Yue，Y.，Long,C，andDuan，D.(2007).SystemicAAV—9transductioninmiceisinfluencedbyanimalagebutnotbytherouteofadministration.GeneTherIn-press(onlin印ublication9/27/07.doi:10.1038/sj.gt.3303029).Bredt，D.S.，Glatt，C.E.，Hwang，P.M.，F(xiàn)otuhi，M.，Dawson，T.M.，andSnyder，S.H.(1991).NitricoxidesynthaseproteinandmRNAarediscretelylocalizedinneuronalpopulationsofthemammalianCNStogetherwithNADPHdiaphorase.Neuron7,615-624.Brenman，J.E.，Chao，D.S.，Gee，S.H.，McGee，A.W.，Craven,S.E.，Santillano，D.R.，Wu，Z.，Huang，F(xiàn).，Xia，H.，Peters,M.F.，etal.(1996).Interactionofnitricoxidesynthasewithth印ostsyn即ticdensityproteinPSD_95andalphal一syntrophinmediatedbyPDZdomains.Cell84，757_767.Bre麗n，J.E.，Chao，D.S.，Xia，H.，Aldape，K.，andBredt，D.S.(1995).NitricoxidesynthasecomplexedwithdystrophinandabsentfromskeletalmusclesarcolemmainDuche皿emusculardystrophy.Cell82，743_752.Chang，W.J.，Ia麗ccone，S.T.，Lau，K.S.，Masters,B.S.，McCabe，T.J.，McMillan,K.，Padre，R.C，Spencer，M.J.，Tidball，J.G.，andStull，J.T.(1996)Neuronalnitricoxidesynthaseanddystrophin_deficientmusculardystrophy.ProcNatlAcadSciUSA93,9142-9147.Chao，D.S.，Gorospe，J.R.，Brenman，J.E.，Rafael,J.A.，Peters,M.F.，F(xiàn)roehner，S.C，Hoffman,E.P.，Chamberlain,J.S.，andBredt，D.S.(1996).SelectivelossofsarcolemmalnitricoxidesynthaseinBeckermusculardystrophy.JExpMed184，609-618.Crawford,G.E.，F(xiàn)aulkner,J.A.，Crosbie，R.H.，Campbell,K.P.，F(xiàn)roehner，S.C，andChamberlain,J.S.(2000).Assemblyofthedystrophin-associatedproteincomplexdoesnotrequirethedystrophinCOOH—terminaldomain.JCellBiol150，1399-1410.Dawson，T.M.，Bredt，D.S.，F(xiàn)otuhi，M.，Hwang，P.M.，andSnyder，S.H.(1991).NitricoxidesynthaseandneuronalNADPHdiaphoraseareidenticalinbrainandperipheraltissues.ProcNatlAcadSciUSA88，7797-7801.England,S.B.，Nicholson,L.V.，Johnson,M.A.，F(xiàn)orrest,S.M.，Love，D.R.，Zubrzycka-Gaarn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