專利名稱：激活酚氧化酶原系統(tǒng)的蛋白及其編碼基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及激活黃粉蟲酚氧化酶原(pro-PO)系統(tǒng)的新型蛋白及其 編碼基因，使用該蛋白檢測樣品中細(xì)菌感染的方法以及使用該蛋白檢 測樣品中細(xì)菌感染的試劑盒。本發(fā)明還涉及用作該試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)物的 可溶性線性化賴氨酸型肽聚糖(SLPG)的制備方法。
背景技術(shù)：
最近基因研究顯示黑腹果蠅(Z)mw/ Mame/朋ogos^)肽聚糖 (PG)識別蛋白果蠅PGRP-SA和果蠅PGRP-SD激活Toll途徑(Michel， T., Reichhart， J. M,, Hoffmann, J. A. & Royet, J. (2001)淑群414， 756-759;和Bischoff, V.， Vignal, C" Boneca, I. G., Michel, T., Hoffmann, J. A. & Royet， J. (2004) 7VW /wmw"o/ 5, 1175-1180),而果蠅 PGRP-LC和果娓PGRP-LE是Imd途徑的受體(Gottar, M.， Gobert, V,, Michel, T., Belvin, M.， Duyk， G., Hoffmann, J. A., Ferrandon， D. & Royet, J. (2002)淑臟416， 640-644; Choe, K. M., Werner, T.， Stoven, S" Hultmark, D. & Anderson, K. V. (2002) 296， 359-362;和
Takehana, A" Katsuyama, T.， Yano, T.， Oshima, Y., Takada, H.， Aigaki, T. & Kurata， S. (2002)尸rac iVW/ 99， 13705-13710)。果
蠅革蘭氏陰性菌結(jié)合蛋白l(果蠅GNBPl)的功能缺陷突變體的免疫 表現(xiàn)與果蠅PGRP-SA是難以區(qū)分的，表明這兩種蛋白是響應(yīng)革蘭氏 陰性菌感染的激活Toll途徑所必須的(Gobert, V., Gottar， M., Matskevich, A. A,， Rutschmann, S., Royet， J.， Belvin, M.， Hoffmann, J. A. & Fe腿don， D. (2003) 5W墜e 302， 2126-2130; Pili-Floury, S.， Leulier, F., Takahashi, K.， Saigo, K., Samain, E., Ueda, R. & Lemaitre, B. (2004) J A'o/ Ozew 279， 12848-12853;和Wang, L.， Weber, A. N.,
5Atilano, M. L., Filipe， S. R., Gay, N. J. & Ligoxygakis, P. (2006) ￡M5(9 725,5005-5014)。然而，革蘭氏陰性菌識別中Toll途徑上游部分的分 子機(jī)制仍有待澄清。
導(dǎo)致入侵微生物的黑化作用的酚氧化酶原(pro-PO)激活級聯(lián)反 應(yīng)，是無脊推動物的另一個主要先天免疫防御機(jī)制，由肽聚糖(PG) 和(3-l,3隱葡聚糖(Cerenius， L. & Soderhall， K. (2004) /wwwwo/Wev 198, 116-126;和Kanost, M. R.， Jiang, H. & Yu, X. Q. (2004) /扁畫/ifev 198, 97-105)引發(fā)。pro-PO級聯(lián)反應(yīng)，類似于脊推動物的補(bǔ)體系統(tǒng)， 是血漿中的蛋白水解級聯(lián)反應(yīng)。因此，pro-PO系統(tǒng)是在無細(xì)胞條件 下，PG和P-l,3-葡聚糖識別以及后續(xù)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的生化研究的理想工 具。我們先前鑒定的黃粉蟲(Tenebriomolitor) PGRP顯示出與果蠅 PGRP-SA最高的序列同源性。該P(yáng)GRP，我們命名為粉蟲PGRP-SA, 激活粉蟲的Lys-PG依賴性pro-PO系統(tǒng)。值得注意地，新型合成的 Lys-PG片段的功能是作為激活pro-PO系統(tǒng)的可溶性多聚線性Lys-PG 的競爭抑制劑。該合成的Lys-PG片段(以下指的是"合成的胞壁肽 二聚體")，具有下列化學(xué)式(1 )的化學(xué)結(jié)構(gòu)，由四糖 (GlcNAc-MurNAc-GlcNAc-MurNAc)組成，共價連接兩個拷貝的四肽 莖(L-Ala陽D-isoGln-L-Lys-D隱Ala) (Park, J. W., Je， B. R.， Piao, S.， Inamura, S.， Fujimoto， Y., Fukase, K,, Kusumoto, S., Soderhall, K.， Ha， N. C. & Lee， B. L. (2006) O/em 281， 7747-7755)。
化學(xué)式1
<formula>formula see original document page 6</formula>最近，不帶PG片段的PGRP蛋白或與PG片段復(fù)合的PGRP 蛋白復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)研究提供了對PG識別結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的重要深入地 了解(Lim， J. H.， Kim， M. S., Kim， H. E.， Yano， T., Oshima， Y.， Aggarwal， K" Goldman, W. E" Silverman, N.， Kurata, S. & Oh, B. H. (2006) J說o/ C&w 281, 8286-8295; Chang, C. I" Chelliah, Y.， Borek, D" Mengin-Lecreulx, D. & Deisenhofer, J. (2006) 5We聰311， 1761-1764; Chang, C. I.， Ihara, K.， Chelliah, Y.， Mengin-Lecreulx, D.， Wakatsuki, S. & Deisenhofer, J. (2005)尸rac iVW/t/S爿102, 10279-10284; Guan, R.， Roychowdhury, A.， Ember, B.， Kumar, S., Boons, G. J. & Mariuzza, R. A, (2004)尸rac淑/爿cad 6W t/ " 101, 17168-17173; Kim, M. S., Byun， M. & Oh， B. H. (2003)胸/畫歸/ 4, 787-793;和 Chang, C. I., Pili-Floury， S., Herve， M., Parquet, C.， Chelliah, Y.， Lemaitre， B.， Mengin-Lecreulx, D. & Deisenhofer, J. (2004)尸丄o51 B/o/ 2， E277)。胞壁肽由N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸糖組成，與短肽鏈 連接作為莖，被發(fā)現(xiàn)是PGRP-SA最小的結(jié)合單位。
然而，目前還不清楚Lys-PG識別信號如何通過PGRPs引發(fā)絲氨酸 蛋白酶(SP)級聯(lián)反應(yīng)從而導(dǎo)致pro-PO或Toll途徑的激活
發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題
本發(fā)明人進(jìn)行各種研究，采用果蠅體內(nèi)Toll途徑，體外pro-PO激 活系統(tǒng)和重組PGRP-SA蛋白，研究Lys-PG識別信號是如何通過生物化 學(xué)方法傳遞到下游。結(jié)果是，我們分離出包含在pro-PO系統(tǒng)中的蛋白 并發(fā)現(xiàn)這些蛋白可用于檢測樣品如血液中的細(xì)菌感染。此外，本發(fā)明 人開發(fā)了可溶性線性化賴氨酸型肽聚糖(SLPG)的制備方法，該方法可 用于檢測樣品中細(xì)菌感染的標(biāo)準(zhǔn)物。
因此，本發(fā)明提供了激活酚氧化酶原(pro-PO)系統(tǒng)的蛋白及其編 碼基因。本發(fā)明還提供使用該蛋白檢測樣品中細(xì)菌感染的方法。
本發(fā)明還提供使用該蛋白檢測樣品中細(xì)菌感染的試劑盒。
本發(fā)明還提供可溶性線性化賴氨酸型肽聚糖(SLPG)的制備方法。
技術(shù)方案
依據(jù)本發(fā)明的 一個方面，提供了來源于黃粉蟲的革蘭氏陰性菌結(jié)
合蛋白l(粉蟲GNBP1),其具有如SEQIDNO:2所示的氨基酸序列， 和編碼其的多核苷酸，例如，具有SEQIDNO:3所示的核苷酸序列的
多核苷酸。
依據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了來源于黃粉蟲的模式絲氨酸蛋 白酶-l(粉蟲MSP-l),其具有SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列，和編 碼其的多核苷酸，例如，具有SEQIDNO:5所示的核苷酸序列的多核
苷酸。.
還依據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了來源于黃粉蟲的模式絲氨酸 蛋白酶-2(粉蟲MSP-2),其具有SEQ ID NO: 6所示的氨基酸序列，和 編碼其的多核苷酸，例如，具有SEQIDNO:7所示的核苷酸序列的多
核苷酸。
還依據(jù)本發(fā)明的另 一個方面，提供了樣品中細(xì)菌感染的檢測方 法，該方法包括(a)向樣品中加入來源于黃粉蟲的肽聚糖識別蛋白(粉 蟲PGRP-SA)，其具有SEQIDNO: l所示的氨基酸序列，然后進(jìn)行孵 育；(b)向步驟(a)的孵育混合物中加入至少一種選自下組的蛋白具 有SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的粉蟲GNBP1 ，具有SEQ ID NO: 4 所示氨基酸序列的粉蟲MSP-1和具有SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的 粉蟲MSP-2，然后進(jìn)行孵育；以及(c)檢測步驟(b)的孵育混合物中蛋白 和樣品之間的反應(yīng)。
還依據(jù)本發(fā)明的另 一個方面，提供了用于檢測樣品中細(xì)菌感染的 試劑盒，包括具有SEQIDNO: l所示氨基酸序列的粉蟲PGRP-SA和至 少一種選自下組的蛋白具有SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的粉蟲GNBP 1,具有SEQ ID NO: 4所示氨基酸序列的粉蟲MSP-1和具有SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的粉蟲MSP-2。
還依據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了可溶性線性化賴氨酸型肽聚 糖(SLPG)的制備方法，該方法包括(a')將分離自細(xì)菌的不溶性肽聚 糖懸浮于約pH 8的緩沖液中;(b')用(3-蛋白水解酶(blp)處理步驟(a') 得到的懸浮液；(c')將步驟(b')得到的反應(yīng)混合物在約95 °C下加熱約10 分鐘，離心該反應(yīng)混合物，然后收集上清液；以及(d')采用尺寸排阻 柱分級步驟(c')得到的上清液，收集顯示酚氧化酶(PO)活性的級分。 有益效果
通過本發(fā)明，鑒定了激活pro-PO系統(tǒng)的新型因子(即，蛋白)。 該蛋白可用于檢測樣品如血液中的細(xì)菌感染，或生產(chǎn)檢測其的試劑 盒。此外，根據(jù)本發(fā)明當(dāng)使用blp和/或溶菌酶對樣品如血液進(jìn)行預(yù)處 理時，細(xì)菌感染可通過pro-PO系統(tǒng)中包含的因子更有效地檢測到。


圖l為線性化肽聚糖(PG)(a)以及合成的胞壁肽二聚體(b)的預(yù)測 結(jié)構(gòu)，其中白色大環(huán)、黑色大環(huán)、黑色小環(huán)和白色小環(huán)分別表示N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰胞壁酸、莖肽和金黃色葡萄球菌肽聚糖(PG) 的甘氨酸殘基。
圖2為在Toyopearl HW-55S尺寸排阻柱上分級的SLPG的UV吸光 度圖譜和各SLPG級分的PO活性。
圖3顯示在給野生型雌性成熟果蠅和PGRP-SAS^突變型果娓注 射水(白色塊)、合成的胞壁肽二聚體(條紋)或SLPG (黑色塊)后， 果蠅抗真菌肽(Drs)-Rp49報道基因的誘導(dǎo)。在攻擊18小時后收集的四 只果蠅中測量Drs表達(dá)，并標(biāo)準(zhǔn)化為注射水(設(shè)定為100%)后所得到 的值。條塊代表四個單獨(dú)實(shí)驗的平均值士s.d.。
圖4顯示了給粉蟲幼蟲注射100 ng合成的胞壁肽二聚體(a)或 SLPG(b)后，18小時內(nèi)檢測到的黑色素的外觀。圖5顯示以10 nM粉蟲PGRP-SA (0.2昭ml")和不同量的SLPG (方 塊)測量的Lys-PG依賴性PO活性。通過添加粉蟲PGRP-SA，鐘形的 劑量效應(yīng)曲線移至右側(cè)。通過將粉蟲PGRP-SA的濃度增加至120nM (2.5昭mr1),在100ng的SLPG(圓圈)處觀察到最高點(diǎn)。插圖表明推 測的粉蟲PGRP-SA和SLPG的復(fù)合結(jié)構(gòu)。
圖6顯示在SLPG存在的條件下，通過使用粉蟲PGRP-SA,果蠅 PGRP-SA和粉蟲PGRP-SA(-)溶液，進(jìn)行體外重構(gòu)實(shí)驗(分別為柱2和 3)。在SLPG存在的條件下，將粉蟲PGRP-SA和果蠅PGRP-SA共孵育 (柱4)
圖7顯示僅線性化PG (a)和經(jīng)溶菌酶部分消化的線性化PG(b),各 自通過Toyopearl HW-55S柱進(jìn)行分級，柱子用含l50 mM NaCl的 20mMTris緩沖液(pH8.0)進(jìn)行平衡。
圖8(a)顯示將粉蟲PGRP-SA和Fr.l4的混合物注射至相同柱子的 結(jié)果，圖8(b)顯示將粉蟲PGRP-SA和在37'C下孵育16小時被溶菌酶完 全消化的SLPG的混合物注射至相同柱子的結(jié)果。
圖9(A)顯示果蠅PGRP-SA與部分消化的不溶性Lys-PG的結(jié)合能 力。Lyso(-)和Lyso(+)分別表示完整的和部分消化的不溶性Lys-PG。 1 道僅表示果蠅PGRP-SA; 2道和4道表示當(dāng)Lyso (-)或Lyso (+) PG分別 與果娓PGRP-SA孵育時，未結(jié)合的果娓PGRP-SA的量。3道和5道分 別表示Lys (-)或Lys (+) PG上結(jié)合的Dm-PGRP-SA的量。圖9 (B)顯示粉 蟲PGRP-S A與部分消化的不溶性Lys-PG的結(jié)合能力。每道表示的含義 與(A)中的相同。
圖10顯示在與粉蟲PGRP-SA缺陷型血淋巴溶液孵育后分析的 SDS/PAGE的結(jié)果。在與粉蟲PGRP-SA缺陷型血淋巴溶液孵育后， 從完整的不溶性PG (l道)、粉蟲PGRP-SA結(jié)合的PG (2道)或果娓 PGRP-SA結(jié)合的PG (3道)中提取蛋白。處理未結(jié)合粉蟲PGRP-SA和 結(jié)合粉蟲PGRP-SA的藤黃微球菌(M.luteus)不溶性PG (4道和5道)
10以及合成的胞壁肽二聚體結(jié)合的樹脂(6道和7道)。值得注意地，結(jié)
合部分消化的PG的果蠅PGRP-SA不與該兩種粉蟲蛋白相互作用(3 道)。
圖11(A)顯示了條帶1 、 Tribolium castaneum GNBP類蛋白 (Tc-GNBP,XP_969449)、黃粉蟲葡聚糖識別蛋白(Tm-GRP)、岡比亞按 抆(Anopheles gambiae ) GNBPl (Ag-GNBPl, AAR13751)以及黑腹果 蜷GNBP1 (Dm-GNBP1)的N端序列比較。框中部分表示與條帶l序列 相同的殘基。圖11(B)顯示了條帶2、 Tribolium castaneum絲氨酸蛋白 酶(Tc-SP， XP一967486)、 M. sexta血淋巴蛋白酶14(Ms-HP14)、岡比亞 按紋絲氨酸蛋白酶(Ag-SP, XP—321263)和黑腹果蠅模式絲氨酸蛋白酶 (Dm-MSP, CG31217)之間的N端氨基酸序列比較。圖ll (C)顯示了條帶 2的兩個內(nèi)部序列(峰1和峰2)和Tc-SP的低密度脂蛋白受體A重復(fù)結(jié) 構(gòu)域序列之間的序列同一性。
圖12顯示了概括了在激發(fā)Toll和pro-PO途徑中的分子事件的模型。
圖13顯示了通過分別向Toyopearl HW-55S尺寸排阻柱注射僅粉 蟲PGRP-SA (A)、粉蟲PGRP-SA和線性化PG的混合物(B)、果蟲黽 PGRP-S A和線性化PG的混合物(C)或粉蟲PGRP-S A和線性化PG的混 合物(D)所得到的結(jié)果。
圖14顯示了溶菌酶抑制劑對賴氨酸型PG依賴性黑色素合成的影 響。(A)昆蟲鹽水；(B)不溶性Lys-PG; (C)部分消化的不溶性賴氨酸 型PG; (D)溶菌酶抑制劑和不溶性賴氨酸型PG的共注射；(E)僅溶菌 酶抑制劑。
圖15至17顯示了粉蟲GNBP1的氨基酸序列和核苷酸序列。 圖18至21顯示了粉蟲MSP的氨基酸序列和核苷酸序列。
最佳實(shí)施方式
本發(fā)明人揭示了黃粉蟲肽聚糖識別蛋白(粉蟲PGRP-SA)和肽聚糖(PG)的復(fù)合物，其通過吸收包含在將信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至下游中的蛋白來激
活pro-PO系統(tǒng)。我們還發(fā)現(xiàn)包含在將信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至下游中的蛋白為革蘭 氏陰性菌結(jié)合蛋白1(GNBP1)類似物(即，粉蟲GNBP1);以及含有模 式絲氨酸蛋白酶(即，粉蟲MSP)的粉蟲多結(jié)構(gòu)域，其具有低密度脂 蛋白類似結(jié)構(gòu)域和其N端的補(bǔ)體對照蛋白類似結(jié)構(gòu)域。我們還揭示了 粉蟲MSP存在的兩種形式，即，粉蟲MSP-l和粉蟲MSP-2。此外，我 們揭示了粉蟲GNBP1和粉蟲MSP的氨基酸序列及其編碼核苷酸序列。 粉蟲GNBP1和粉蟲MSP與粉蟲PGRP-SA和PG的復(fù)合物一起形成復(fù) 合物。
因此，本發(fā)明提供來源于黃粉蟲的革蘭氏陰性菌結(jié)合蛋白l(粉蟲 GNBP1)，其具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。
本發(fā)明還提供編碼粉蟲GNBPl的多核苷酸，其具有SEQIDNO:2 所示的氨基酸序列，優(yōu)選為具有SEQ ID NO: 3所示核苷酸序列的多核苷酸。
本發(fā)明還提供來源于黃粉蟲的模式絲氨酸蛋白酶l(粉蟲 MSP-1)，其具有SEQIDNO:4所示的氨基酸序列。
本發(fā)明還提供編碼粉蟲MSP-1的多核苷酸，其具有SEQIDNO: 4所示的氨基酸序列，優(yōu)選為具有SEQIDNO: 5所示核苷酸序列的多 核苷酸。
本發(fā)明還提供來源于黃粉蟲的模式絲氨酸蛋白酶2 (粉蟲 MSP-2),其具有SEQIDNO: 6所示的氨基酸序列。
本發(fā)明還提供編碼粉蟲MSP-2的多核苷酸，其具有SEQIDNO: 6 所示的氨基酸序列，優(yōu)選為具有SEQ ID NO: 7所示核苷酸序列的多核苷酸。
本發(fā)明的一個實(shí)施方案提供了檢測樣品中細(xì)菌感染的方法，該方 法包括(a)向樣品中加入來源于黃粉蟲的肽聚糖識別蛋白(粉蟲 PGRP-SA)，其具有SEQIDNO: l所示的氨基酸序列，然后進(jìn)行孵育；(b)向步驟(a)孵育混合物中加入至少一種選自下組的蛋白具有SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的粉蟲GNBPl ，具有SEQ ID NO: 4所示氨基 酸序列的粉蟲MSP-1以及具有如SEQ IDNO:6所示氨基酸序列的粉蟲 MSP-2，然后進(jìn)行孵育；以及(c)檢測步驟(b)孵育混合物中蛋白和樣品 之間的反應(yīng)。
在檢測樣品中細(xì)菌感染的方法中，該樣品可以是輸入型血液，哺
乳動物血液包括人類血液；食物，如蔬菜、肉、水果等；熟的或未經(jīng) 烹飪的食物；水，如自來水、地下水、雨水等；無菌制品等。樣品可 以是任何需要進(jìn)行微生物檢測的樣品。特別地，依據(jù)本發(fā)明檢測細(xì)菌 感染的方法適用于輸入型血液或哺乳動物包括人類血液的細(xì)菌感染 的檢測。
依據(jù)本發(fā)明檢測細(xì)菌感染的方法，孵育可在3(TC下進(jìn)行，時間為 使得樣品可以和蛋白充分發(fā)生反應(yīng)。如需要，孵育可以在各種含EDTA
作為鈣離子抑制劑的緩沖液中進(jìn)行。
此外，步驟(c)中的反應(yīng)檢測可以依據(jù)常規(guī)方法使用尺寸排阻柱進(jìn) 行，例如填充尺寸排阻Toyopearl HW55S樹脂的柱子。
如需要，本發(fā)明檢測細(xì)菌感染的方法可進(jìn)一步包括用P-蛋白水 解酶(blp)和/或溶菌酶對樣品進(jìn)行預(yù)處理。如下面實(shí)例所述，在大多 數(shù)完整的革蘭氏陽性細(xì)菌的肽聚糖中，聚糖鏈?zhǔn)歉叨冉诲e連接，其可 能限制識別蛋白(即，具有如SEQIDNO: l所示氨基酸序列的蛋白， 粉蟲PGRP-SA)向肽聚糖的靠近。然而，用(3-蛋白水解酶(blp)和/或 溶菌酶處理樣品促進(jìn)了與粉蟲PGRP-SA形成復(fù)合物。
blp可以從多種微生物中獲得，如土壤微生物。例如，blp可以從 無色桿菌屬的微生物獲得，優(yōu)選水解無色桿菌(A^ramo^"w 一z'cw)，更優(yōu)選水解無色桿菌ATCC 21456或水解無色桿菌ATCC 21457。另外，blp可以使用已知方法(Li， S., Norioka, S. & Sakiyama， R (1998) J祝oc/^w (Tokyo) 124， 332-339)，通過純化商業(yè)上可獲得的粗無色肽酶制劑(Wako Pure Chemical Institute, 014-09661 )來制備。
使用blp的預(yù)處理可通過用濃度為約l嗎/ml的blp處理樣品，然后 在約37'C下孵育約14小時。
本發(fā)明檢測細(xì)菌感染的方法使用的溶菌酶可以是商業(yè)上可獲得 的溶菌酶(例如，母雞蛋清溶菌酶)。使用溶菌酶預(yù)處理可通過用濃 度為約lmg/ml的溶菌酶處理樣品，然后在約37'C下孵育不同的反應(yīng)時間。
在另一個實(shí)施方案中，提供了用于檢測樣品中細(xì)菌感染的試劑 盒，包括具有SEQIDNO: 1所示氨基酸序列的粉蟲PGRP-SA和至少 一種選自下組的蛋白，包括具有SEQIDNO:2所示氨基酸的序列粉蟲 GNBP1，具有SEQ ID NO: 4所示氨基酸序列的粉蟲MSP-1和具有如 SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的粉蟲MSP-2。
在本發(fā)明的檢測試劑盒中，樣品可以是輸入型血液；哺乳動物血
液包括人類血液；食物，如蔬菜、肉、水果等；熟的或未經(jīng)烹飪的食 物；水，如自來水、地下水、雨水等；無菌制品等。樣品可以是任何 需要進(jìn)行微生物檢測的樣品。特別地，依據(jù)本發(fā)明的檢測試劑盒適用 于輸入型血液或哺乳動物包括人類血液的細(xì)菌感染檢測。
本發(fā)明的檢測試劑盒可包括用于檢測反應(yīng)的試劑，例如，結(jié)合p-
硝基苯胺的氨基酸或肽，激活pro-PO系統(tǒng)的蛋白和酚氧化酶原的生色
底物。檢測試劑盒可以為溶液、冷凍干燥粉、冷凍溶液或片劑的形式。 每種形式可以釆用本領(lǐng)域已知的任何常規(guī)方法進(jìn)行制備。例如，溶液 形式的檢測試劑盒的制備可通過將蛋白與緩沖液混合，如磷酸鈉緩沖
液、磷酸鉀緩沖液、Tris鹽酸緩沖液等，以混合緩沖液的形式或單獨(dú) 緩沖液的形式。如需要，溶液可為冷凍或冷凍干燥的。
本發(fā)明的檢測試劑盒可進(jìn)一步包括P-蛋白水解酶和/或溶菌酶。 blp可來源于各種微生物，如土壤微生物。例如，blp可以從無色桿菌 屬的微生物獲得，優(yōu)選水解無色桿菌，更優(yōu)選水解無色桿菌ATCC21456或水解無色桿菌ATCC 21457。另外，blp可以使用已知方法 (Li， S.， Norioka， S. & Sakiyama, R (1998) ■/ 5zWzem (Tokyo) 124， 332-339)，通過純化商業(yè)上可獲得的粗無色肽酶制劑(Wako Pure Chemical Institute, 014-09661)來制備。此外，溶菌酶可以是商業(yè)上可 獲得的溶菌酶。
本發(fā)明還提供了 一種制備可用作樣品中細(xì)菌感染檢測的Lys-PG 標(biāo)準(zhǔn)物的可溶性線性化賴氨酸型肽聚糖(SLPG)的方法。也就是，本發(fā) 明提供可溶性線性化賴氨酸型肽聚糖(SLPG)的制備方法，該方法包 括(a')懸浮分離自細(xì)菌的不溶性肽聚糖于pH 8緩沖液中；(b')以P-蛋白水解酶(blp)處理步驟(a')得到的懸浮液；(c')將步驟(b')得到的反應(yīng) 混合物在約95匸下加熱約10分鐘，離心，然后收集上清液；以及(d') 釆用尺寸排阻柱分離步驟(c')得到的上清液，收集顯示酚氧化酶(PO) 活性的部分。
在SLPG的制備方法中，可以釆用本領(lǐng)域任何已知的方法來制備 分離自細(xì)菌的不溶性肽聚糖(例如，BL de Jonge, YS Chang, D Gage,和 A Tomasz, Peptidoglycan composition of a highly methicillin-resistant Staphylococcus aureus strain. The role of penicillin binding protein 2A /
Chem., Jun 1992; 267: 11248 - 11254)。
步驟(a')的緩沖溶液可以是pH8.0的Tris緩沖液。此外，blp可來源 于各種微生物，如土壤微生物。例如，blp可以從無色桿菌屬的微生 物獲得，優(yōu)選水解無色桿菌，更優(yōu)選水解無色桿菌ATCC21456或水 解無色桿菌ATCC 21457。另外，blp可以使用已知方法(Li, S.， Norioka, S. & Sakiyama, F. (1998) J所oc/zem (Tokyo) 124, 332-339)，通過純化商 業(yè)上可獲得的粗無色肽酶制劑(Wako Pure Chemical Institute, 014-0966 l)來制備。
用blp處理可通過用濃度為約l嗎/ml的blp處理含有不溶性肽聚糖 的懸浮液來進(jìn)行，然后在約37X:下孵育約14小時。在步驟(c')中，可在約4。C下18,000 xg離心約10分鐘。如需要， 離心后得到的上清液可以冷凍干燥，然后fC儲藏。
在步驟(d，)中，尺寸排阻柱為填充ToyopearlHW55S樹脂的柱子。 特別地，使用前柱子用無菌蒸餾水平衡。可經(jīng)過柱洗脫由步驟(c')得 到的溶液(即，可溶性PG溶液)進(jìn)行分離。在分離物中，收集顯示 酚氧化酶(PO)活性的部分，如下所述對每部分進(jìn)行稀釋，然后向其 中加入黃粉蟲幼蟲的血淋巴。在30。C下孵育混合物5分鐘后，向其中 加入20mMTris緩沖液(pH8.0)。向其中加入CaCl2溶液，4-甲基兒茶酚 (4-MC)溶液和4-羥基脯氨酸脂(4-HP)溶液并混合。將該混合物置于30 。C恒溫洛中。當(dāng)顏色變化最大時，使用分光光度計在520nm波長下測 量吸收值，與僅含Ca^血淋巴的顏色變化相比較。
如需要，得到的顯示酚氧化酶(PO)活性的部分可進(jìn)一步通過濃縮 級分，經(jīng)過填充Toyopearl HW55S樹脂的柱子分級，然后分離出含 SLPG的部分。
此外，如需要，制備SLPG的方法可進(jìn)一步包括冷凍干燥由步驟 (d')得到的部分。
以下將結(jié)合下面的實(shí)施例更具體地描述本發(fā)明。下面的實(shí)施例僅 用于解釋發(fā)明目的，而并非用于限制發(fā)明范圍。
實(shí)施例 1、方法
(1)無色桿菌P-蛋白水解酶(blp)的純化和特性分析 依據(jù)已有報道的方法(Li， S.， Norioka, S. & Sakiyama, F. (1998) J 說'oc/2em (Tokyo) 124， 332-339),從商業(yè)上可獲得的粗無色肽酶制劑 (Wako Pure Chemical Institute)純化無色桿菌|3-蛋白水解酶(blp)至均 一。為了鑒定blp，釆用AppliedBiosystem精密自動化氣相氨基酸測序 儀測定純化blp的N端序列。通過Sakiyama(Li, S., Norioka, S. & Sakiyama， F, (1997) /祝oc/zem (Tokyo) 122, 772-778)的方法測定blp對藤黃微球菌的溶菌活性。
(2)可溶性線性化賴氨酸型肽聚糖(SLPG)的純化
(2-1)微生物的孵育
將金黃色葡萄球菌ATCC 12598 (Cowan血清型)接種于液體培養(yǎng) 基(100ml胰蛋白酶大豆肉湯培養(yǎng)基TSB)中，然后在37'C下孵育12小 時。將該液體培養(yǎng)基接種于2L(400mlX5瓶)TSB培養(yǎng)基中，每瓶接 種20ml。然后孵育12小時。在4。C下轉(zhuǎn)速6000rpm離心培養(yǎng)液30分鐘。 然后，收集細(xì)胞并懸浮細(xì)胞于200ml無菌蒸餾水中，再次收集細(xì)胞。 重復(fù)6次(即，收集和懸浮)。將得到的細(xì)胞懸浮于76.8ml50mMTris 緩沖液(pH7.0)中，得到的懸浮液以同樣的量加入到50ml的兩支試管 中。
(2-2)不溶性肽聚糖的分離和純化 依據(jù)已知方法進(jìn)行不溶性肽聚糖的分離和純化(BL de Jonge， YS Chang, D Gage，和A Tomasz Peptidoglycan composition of a highly methicillin-resistant Staphylococcus aureus strain. The role of penicillin binding protein 2AJ說W. O^m., Jun 1992; 267: 11248 - 11254)，將作 詳細(xì)描述。
將已在95'C下加熱的1.6ml 20。/。十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液加入 上述細(xì)胞懸浮液中，得到4%菌液，于95t:加熱45分鐘，然后在冰洛 上充分冷卻。離心得到的菌液(18，000 xg,4'C， IO分鐘)。棄掉上清， 收集細(xì)胞。向收集的細(xì)胞中加入40ml無菌蒸餾水。以上述條件離心， 收集細(xì)胞。重復(fù)6次。用40ml 1XPBS緩沖液懸浮收集到的細(xì)胞，然后 在37。C下與濃度為100昭/ml的DNase和RNase反應(yīng)18小時。在37。C下， 反應(yīng)混合物與200)ig/ml胰蛋白酶反應(yīng)18小時。向反應(yīng)混合物中加入95 °C 20y。SDS溶液，得到1%菌液，在95"C下加熱該溶液10分鐘以終止 酶促反應(yīng)。離心得到的反應(yīng)混合物(18，000 xg，4'C, IO分鐘)，收集沉 淀物。向沉淀物中加入40ml無菌蒸餾水，離心(18,000 xg, 4'C, 10分鐘)，收集沉淀物。重復(fù)3次。將得到的沉淀物懸浮于40 ml 8M LiCl 溶液中，然后向其中加入40ml無菌蒸餾水。離心得到的懸浮液(18，000 xg，4。C, IO分鐘)，收集沉淀物。將沉淀物懸浮于40ml 100mMEDTA (pH8.0)中，然后加入40ml無菌蒸餾水。離心(18，000xg,4。C， IO分鐘) 得到的懸浮液，收集沉淀物。將沉淀物懸浮于40 ml無菌蒸餾水中。 離心(18,000 xg，4'C， IO分鐘)得到的懸浮液，收集沉淀物。將沉淀物 懸浮于40ml丙酮中。離心(18，000xg,4。C， IO分鐘)得到的懸浮液，收 集沉淀物。將沉淀物冷凍干燥，得到380-400mg不溶性肽聚糖。
(2-3) SLPG的純化
用(3-蛋白水解酶(blp)處理得到的不溶性肽聚糖。即，將得到的 不溶性肽聚糖(20 mg)懸浮于20 mM Tris緩沖液(pH8.0)中，向懸浮液中 加入2iag/mlblp,然后在37。C下孵育14小時。在95'C下加熱反應(yīng)混合 物10分鐘，然后離心(18,000 xg, 4'C, IO分鐘)。收集懸浮液并冷凍干 燥。將該冷凍干燥產(chǎn)物放置于4r。
以60 ml Toyopearl HW55S樹脂填充柱子(2.6 x 15.5 cm),并用無 菌蒸餾水平衡，流速0.5 ml/min,然后向柱中加入l mg上述制備的可 溶性PG溶液，以預(yù)定的體積分級。用無菌蒸餾水稀釋每部分，得到 100倍溶液。用10nl各稀釋液測定PO活性。
PO活性的測定如下向10pl各稀釋液中加入3(Hil黃粉蟲幼蟲血淋 巴(約280嗎血淋巴蛋白)，然后在30。C下孵育5分鐘。向其中加入435jal 20mM Tris緩沖液(pH8.0)并立即加入5ial 1M CaCl2溶液(終濃度10 mM)。向其中加入4iil250mM4-甲基兒茶酚(4-MC)溶液和16fil 62.5 mM 4-羥基脯氨酸脂(4-HP)溶液，并混合。將該混合物置于3(TC恒溫 洛。當(dāng)顏色變化最大時，使用分光光度計在520 nm波長下測量吸收值， 與僅含有Ca^血淋巴的顏色變化進(jìn)行比較。
收集顯示酚氧化酶(PO)活性的級分，在4'C下用旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器濃 縮。將濃縮液再次加入到同樣用蒸餾水平衡過的柱子中，流速為0.2ml/min。收集含有SLPG的部分，使用前儲藏于4'C。為確定純化的 SLPG來源于金黃色葡萄球菌Lys-PG,我們分析了 SLPG的氨基酸組 成，其與報道的金黃色葡萄球菌Lys-PG具有相同的氨基酸組成 (D-Glu : L-Gly : D-Ala : L-Lys = 1:5:1:1) (Schleifer， K. H. & Kandler, 0. (1972) B""m'o/化v 36, 407-477)。
(3)血淋巴的收集，PO活性檢測及黑色素合成 將黃粉蟲幼蟲(甲蟲幼蟲)培養(yǎng)在含有麥麩的實(shí)驗室土壤中。如前 所述收集血淋巴(Zhang, R" Cho, H. Y,， Kim， H. S.， Ma, Y. G., Osaki， T., Kawabata， S., Soderhall， K. & Lee, B. L. (2003) /所o/ Ozem 278, 42072-42079)。通過前述公開的方法進(jìn)行PO檢測(Park, J. W., Je, B. R., Piao， S.， Inamura， S.， Fujimoto, Y" Fukase， K., Kusumoto， S., Soderhall, K., Ha， N. C. & Lee， B. L. (2006) J所o/ Ozem 281, 7747-7755)。為檢測 黑色素的合成，將2pl SLPG (50昭/ml)， lOial不溶性Lys-PG (5 mg/ml), 部分消化的不溶性Lys-PG (5 mg/ml)或5jLil化學(xué)式(1)的化合物(合成的 胞壁肽二聚體)(20(ig/ml)注射入活體幼蟲。注射6(xlN，N， ， N"-三乙 酰殼三糖，終濃度6mM。經(jīng)過24小時，測定產(chǎn)生的黑色素。
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(4)注射SLPG和式(I)化合物
將果娓OregonR作為野生型。PGRP-SAsmel是果繩PGRP-SA中攜 帶semmelweis突變(C54Y)的一個種系(Michel, T., Reichhart, J. M.， Hoffmann, J. A. & Royet， J. (2001) Atowe 414, 756-759)。用Nanojec儀器(Drummond),將10 nl水，SLPG (10 mg ml")或式(I)化合物(10 mg ml")注射入野生型或PGRP-SA，1雌性成蟲(2-4日齡)胸腔內(nèi)。注射 后，于25'C培養(yǎng)果鮑18小時。如前所述測定Drosomycin的表達(dá)水平 (Leulier， R, Parquet, C.， Pili畫Floury， S.， Ryu, J. H., Caroff， M.， Lee， W. J" Mengin-Lecreulx， D. & Lemaitre， B. (2003)胸/畫畫/ 4， 478-484)。
(5) PGRP/ SLPG復(fù)合物的生成
于3(TC將40嗎果蟲黽PGRP-SA或粉蟲PGRP-SA與400嗎SLPG孵育 30分鐘后，將混合物注射至用含150 mM NaCl的20 mM Tris緩沖液 (pH8.0)平衡過的Superdex S-200HR 10/30柱內(nèi)。收集含 PGRP-SA/SLPG復(fù)合物的級分。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測 PGRP隱SA。
(6) 溶菌酶對SLPG及不溶性Lys-PG的部分消化
為了獲得顯示PO活性的可溶性低聚Lys-PG片段，向100pl純化 SLPG (訓(xùn)(xg ml")中加入10(il母雞蛋清溶菌酶(1 mgmr1， Wako)，然 后于37'C孵育5分鐘。煮沸部分消化的SLPG IO分鐘，然后加入用20 mM Tris緩沖液(pH 8.0)平衡后的Toyopearl HW-55S柱子中，流速0.5 ml/min。收集顯示PO活性的級分。為了獲得部分消化的不溶性多聚 Lys-PG，將懸浮于PBS緩沖液(pH 7.2)中的金黃色葡萄球菌不溶性PG (40mg)與10[ig溶菌酶在37。C下孵育3小時。經(jīng)過10分鐘煮沸，于4。C, 20,000 xg離心10分鐘，用8M脲洗滌3次，并用蒸餾水洗滌3次。
(7) PGRPs與部分消化的不溶性Lys-PG的結(jié)合測定 依據(jù)先前報道的方法進(jìn)行結(jié)合測定(Park, J. W.， Je， B. R., Piao, S.,
Inamura, S.， Fujimoto， Y,， Fukase， K.， Kusumoto, S.， Soderhall， K., Ha, N. C. & Lee， B. L. (2006) J所o/281， 7747-7755)。簡單的說，將10昭 純化的粉蟲PGRP-SA或果蠅PGRP-SA與40(il懸浮于50 mM Tris-HCl 緩沖液(pH 7.0)中的50。/。(v/v)部分消化的金黃色葡萄球菌或藤黃微球菌PG(500iig)于4。C振蕩混合^小時。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分析上 清液中未結(jié)合的PGRP以及沉淀部分結(jié)合的PGRP。
(8) 粉蟲GNBP1及模式絲氨酸蛋白酶的鑒定
依據(jù)先前報道的方法用式(I)化合物配對親和柱層析，從黃粉蟲血 淋巴中制備粉蟲PGRP-SA (-)溶液(Park， J. W., Je， B. R., Piao, S., Inamura, S.， Fujimoto, Y" Fukase， K., Kusumoto, S" Soderhall, K., Ha， N. C. & Lee, B. L. (2006) J5"/ C7zem 281, 7747-7755)。該溶液含有除了 粉蟲PGRP-SA之外的全部必需成分，其對于靠Lys-PG激活pro-PO系統(tǒng) 是必須的。將粉蟲PGRP-SA(40昭)與部分消化的不溶性Lys-PG(8 mg) 在200[ilPBS緩沖液中于4。C孵育12小時。孵育后，于4。C, 20,000 x g 離心IO分鐘，復(fù)性粉蟲PGRP-SA結(jié)合的不溶性Lys-PG，用20 mM Tris (pH8.0)洗滌3次，接著用50mMTris-HCl緩沖液(pH6.0)洗滌3次。將 復(fù)性的結(jié)合粉蟲PGRP-SA的Lys-PG與2.5 ml粉蟲PGRP-SA(-)溶液(20 mg總蛋白)于4'C孵育3小時。經(jīng)過離心去掉不溶性殘渣，用50mM Tris-HCl緩沖液(pH6.0)洗滌該混合物2次。用100(^1 2x聚丙烯酰胺凝 膠電泳加樣緩沖液提取與不溶性Lys-PG結(jié)合的蛋白，然后通過聚丙烯 酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離。將聚丙烯酰胺凝膠上的蛋白條帶轉(zhuǎn)移至聚偏 氟乙烯膜上，然后在自動化氣相氨基酸測序儀(Applied Biosystem)上 測定50kDa(粉蟲GNBPl)和35kDa蛋白(粉蟲模式絲氨酸蛋白酶，粉蟲 MSP)的N端序列。
(9) cDNA克隆以及粉蟲GNBP1和粉蟲MSP的核苦酸測序 為進(jìn)行粉蟲GNBP1的cDNA克隆，依據(jù)已知方法，使用簡并正
義鏈引物5'-GARGCNTAYGARCCNAARGG-3' (SEQ ID NO: 8)和簡 并反義鏈引物5'-ATRTCYTCYTGRTTRTTNGC-3' (SEQ ID NO: 9) (R =A/G; Y = C/T; N = A/T/G/C)進(jìn)行PCR(Buck和Axel， Cell 65: 175-187, 1991; Riddle等.，Ce〃 75: 1401-1416, 1993; Krauss等，Ce〃 75:1431-1444， 1993)。我們采用SMART RACE cDNA擴(kuò)增方法(CLONTECH)用于5'-和3'-RACE。釆用TOPO TA克隆方法(Invitrogen), 將全部PCR產(chǎn)物克隆到pCR2.1-TOPO (Invitrogen)上。使用3130xl基 因分析測序方法(Applied Biosystems)進(jìn)行測序。
以相同方式進(jìn)行粉蟲MSP的cDNA克隆，使用5'-AARGAYAAYT GYGAYGARAT-3' (SEQ ID NO: 10)和5'隱GCYTGYTGCCANGGRT ARTC-3' (SEQ ID NO: ll)分別作為簡并正義鏈引物和簡并反義鏈
2.結(jié)果與討論
(1) SLPG激活Toll途徑以及pro-PO系統(tǒng)
無色桿菌blp是類溶葡萄球菌酶，它水解金黃色葡萄球菌PG五甘 氨酸橋的肽鍵(Li, S., Norioka， S. & Sakiyama， F. (1998) /說'oc/zem (Tokyo) 124, 332-339)。因此，期望通過blp使不溶性莖肽上連有甘氨 酸殘基的PG產(chǎn)生可溶性多聚PG片段(圖1)。通過使用blp,從金黃色葡 萄球菌PG中獲得可溶性多聚Lys-PG片段(SLPG)。預(yù)測SLPG為糖苷 之間通過P -1,4糖苷鍵連接的聚合胞壁肽，而不是通過莖肽之間的五 甘氨酸橋連接。因此，SLPG應(yīng)該具有PGRP-SA多結(jié)合位點(diǎn)，因為它 含有若干個胞壁肽模體。使用進(jìn)一步純化的SLPG,我們確定在桿狀 病毒昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)物系統(tǒng)中表達(dá)和純化的果蠅PGRP- SA和粉蟲 PGRP-SA蛋白重組體，使用尺寸排阻柱表明，二者都結(jié)合SLPG(圖13 (B)和(C))。然而，由粉蟲PGRP-SA以及式(I)的化合物組成的混合物顯 示出與單獨(dú)粉蟲PGRP-SA同樣的洗脫圖，表明式(I)化合物僅能結(jié)合一 分子粉蟲PGRP-SA。
我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)加入粉蟲血淋巴時，SLPG持續(xù)地誘導(dǎo)PO活性(圖2)。 接著，我們給野生型和PGRP-SAse"11突變型果蠅注射SLPG,然后監(jiān) 控drosomycin編碼基因表達(dá)，以檢驗SLPG是否能夠激活果蠅體內(nèi)Toll 途徑(圖3)。 SLPG注射的野生型果蠅一般誘導(dǎo)drosomycin表達(dá)，但 PGRP-SAseml突變型果鮑在抗菌肽的誘導(dǎo)下是缺陷的，表明SLPG激活Toll途徑是以果蠅PGRP-SA依賴的方式。作為顯著對照，式(I)化合 物不能誘導(dǎo)drosomycin在野生型和PGRP-SAse1111突變型果蠅中的表達(dá) (圖3)。同樣，當(dāng)注射粉蟲幼蟲時，SLPG強(qiáng)烈地誘導(dǎo)黑色素合成，最 可能通過激活pro-PO系統(tǒng)(圖4)。這些結(jié)果表明PG片段含有PGRP-SA 多結(jié)合位點(diǎn)能夠誘導(dǎo)Toll途徑和pro-PO途徑。近來，Ligoxygakis和同 事建議增力口PG還原端的數(shù)量以激活Toll信號途徑(Filipe， S. R.， Tomasz， A. & Ligoxygakis, R (2005) 6, 327-333)。因為SLPG和式(I)
化合物都各自含有一個還原端，但僅SLPG能夠誘導(dǎo)Toll和pro-PO級聯(lián) 反應(yīng)，這表明還原端可能并不重要。
(2 )激活pro-PO級聯(lián)反應(yīng)需要粉蟲PGRP-SA鄰近結(jié)合 我們確定激活PG依賴的pro-PO級聯(lián)反應(yīng)的SLPG最小濃度。PO活 性的測定是通過將粉蟲PGRP-SA (-)溶液中的粉蟲PGRP-SA蛋白和 不同量的SLPG共孵育。令人驚訝地，高濃度SLPG強(qiáng)烈抑制PO活性至 基線水平，顯示出標(biāo)準(zhǔn)的鐘形劑量效應(yīng)曲線(圖5)。此外，如果向反應(yīng) 混合物中加入外源的粉蟲PGRP-SA蛋白，產(chǎn)生最大PO活性的SLPG濃 度能夠顯著地提高PO活性(圖5)。這些觀測表明過量SLPG作為竟?fàn)幮?抑制劑分離PGRP-SA分子，削弱由粉蟲PGRP-SA和Lys-PG組成的復(fù) 合物的起始激活。同時還表明結(jié)合每單位Lys-PG的粉蟲PGRP-SA的量 在產(chǎn)生pro-PO級聯(lián)反應(yīng)的起始激活復(fù)合物中是重要的(圖5的插圖)。報 道鱟因子G在P -1，3葡聚糖識別中和螯蝦pro-PO系統(tǒng)中有相似的觀測 結(jié)果(Muta， T.， Seki, N., Takaki， Y" Hashimoto, R.， Oda， T.， Iwanaga, A., Tokunaga， F. & Iwanaga, S. (1995) J所o/ 270, 892-897;和
Soderhall， K. & Unestam， T. (1979) q/" JM/ctoWo/. 25, 406-414)。
我們用與粉蟲PGRP-SA(圖4)具有相似親和力的能夠結(jié)合SLPG 的果娓PGRP-SA重組體進(jìn)一步研究Lys-PG識別的起始激活步驟，但是 果蠅PGRP-SA不能誘導(dǎo)粉蟲pro-PO級聯(lián)反應(yīng)的激活(圖6第3欄)。通 過向粉蟲PGRP-SA (-)溶液中加入果蜆PGRP-SA，甚至在外源粉蟲PGRP-SA存在的條件下，SLPG誘導(dǎo)的PO活性被強(qiáng)烈抑制。這表明盡 管在粉蟲PGRP-SA和SLPG結(jié)合的條件下，通過取代粉蟲PGRP-SA位 點(diǎn)以果繩PGRP-SA，去除了pro-PO級聯(lián)反應(yīng)的起始激活復(fù)合物。這些 結(jié)果再次強(qiáng)烈表明PGRP-S A在Lys-PG上的聚集或PGRP-S A與Lys-PG
的鄰近結(jié)合是起始激活復(fù)合物所必需的。
(3 )調(diào)節(jié)至少兩個粉蟲PGRP-SA分子的Lys-PG片段激活pro-PO
系統(tǒng)
為測定組成pro-PO系統(tǒng)起始激活復(fù)合物的粉蟲PGRP-SA分子數(shù) 目，由部分消化的SLPG和溶菌酶產(chǎn)生不同長度的PG糖鏈，然后依據(jù) 它們的長度在尺寸排阻柱上進(jìn)行分離(圖7(a沐(b))。在粉蟲PGRP-SA 蛋白和Ca^條件下，每部分和粉蟲PGRP-SA(-)溶液孵育，三個級分(7、 10和14)顯示出PO活性。其中，14的PG片段應(yīng)為能誘導(dǎo)pro-PO級聯(lián) 反應(yīng)活性的最小單位。在加入過量的粉蟲PGRP-SA后，我們通過監(jiān)控 尺寸排阻柱的表觀分子量分析14中能夠結(jié)合PG片段的PGRP-SA分 子數(shù)目。與粉蟲PGRP-SA混合的部分中的PG片段間的復(fù)合物的表觀 分子量測定為約40kDa，其表明PG片段結(jié)合兩分子PGRP-SA。當(dāng)PG 片段/粉蟲PGRP-SA復(fù)合物與粉蟲PGRP-SA(-)溶液共孵育時，即使不 加入粉蟲PGRP-SA,它也能夠誘導(dǎo)PO活性，清楚地表明兩分子粉蟲 PGRP-SA足以誘導(dǎo)活性(圖9(B))。然而，通過延長SLPG和溶菌酶的
孵育時間產(chǎn)生的式(I)化合物和胞壁肽單體不改變尺寸排阻柱上粉蟲 PGRP-SA蛋白的分子量(圖9(B))。這些觀測表明式(I)化合物和胞壁肽 單體僅結(jié)合一個PGRP-SA分子。值得注意地，盡管式(I)化合物含有兩 個胞壁肽，它僅結(jié)合一個PGRP-SA分子。我們推測這是由第一個 PGRP-SA分子結(jié)合至式(I)化合物而形成空間位阻的結(jié)果，因為式(I) 化合物的兩個結(jié)合位點(diǎn)的位置距離太近。然而，胞壁肽二聚體由五甘 氨酸橋交聯(lián)，預(yù)測用于調(diào)節(jié)兩個PGRP-SA分子，因為五甘氨酸橋提供 充足的空間結(jié)合兩個PGRP-SA分子。 一般地，式(I)化合物不能激活上述Toll途徑和pro-PO途徑，然而有報道胞壁肽二聚體誘導(dǎo)激活Toll途徑 (Filipe， S. R.， Tomasz， A. & Ligoxygakis， P. (2005)~ 6, 327-333)。因此，可推斷調(diào)節(jié)兩個PGRP-SA分子的PG片段是誘導(dǎo)下游 事件和導(dǎo)致pro-PO系統(tǒng)激活的最小單位。
(4)溶菌酶代表PG識別信號的PG作用形式
大部分天然革蘭氏陽性細(xì)菌的PG是在聚糖鏈之間高度交聯(lián)的， 其不同于SLPG。 PGRP-SA由于其高度交聯(lián)的結(jié)構(gòu)，可能限制向天然 Lys-PGs靠近。此外，我們先前觀測到通過聲裂法斷裂的不溶性 Lys-PGs，誘導(dǎo)體外強(qiáng)PO活性，然而在特定時間，完整的不溶性Lys-PGs 不誘導(dǎo)pro畫PO激活(Park， J. W., Je， B. R,, Piao, S.， Inamura, S.， Fujimoto, Y" Fukase, K.， Kusumoto, S., Soderhall, K,， Ha， N. C. & Lee, B. L. (2006) JAo/ C7zem 281， 7747-7755)。為了通過存在于昆蟲血淋巴中的酶打開 PG結(jié)構(gòu)，我們選擇溶菌酶，因為它能夠水解幾乎所有類型的完整細(xì) 菌PG (Keep, N. H.， Ward, J. M.， Cohen-Gonsaud, M. & Henderson, B. (2006) T e"A Mz'cra&o/ 14， 271-276)。我們用溶菌酶對來自金黃色葡 萄球菌和藤黃微球菌的Lys-PG進(jìn)行體外部分消化。事實(shí)上，部分消化 的Lys-PG誘導(dǎo)體外粉蟲血淋巴中快速劇烈的PO活性(數(shù)據(jù)未顯示)。 此外，當(dāng)給粉蟲幼蟲注射部分消化的不溶性Lys-PG時，與注射完整的 不溶性Lys-PG相比，在所有被注射的幼蟲中觀察到更劇烈和迅速的黑 色素合成(圖14 (B)和(C))。然而，當(dāng)溶菌酶抑制劑，N, N，，N"-三氯 乙酰，與完整的Lys-PG共注射時，沒有觀察到黑色素的合成(圖14(D))， 表明沒有溶菌酶活性，沒有溶菌酶的在先部分消化，完整的Lys-PG 不能激活pro-PO級聯(lián)反應(yīng)。
為確定通過PGRP-SAs體外識別Lys-PG中溶菌酶的作用，我們用 果繩PGRP-SA和粉蟲PGRP-SA檢測PGRP-SAs與部分消化的Lys-PG 的結(jié)合。令人驚訝地，經(jīng)過溶菌酶部分消化的Lys-PG顯著地增強(qiáng)了果 繩PGRP-SA和粉蟲PGRP-SA與PG的結(jié)合(分別為圖9(A)和(B)中的5道和3道)。PGRP-SAs和PG之間增強(qiáng)的相互作用應(yīng)導(dǎo)致PG中PGRP-SAs 的鄰近結(jié)合，從而激活Toll途徑和pro-PO途徑。我們的研究提供了體 外生物化學(xué)證據(jù)，溶菌酶在Toll途徑和pro-PO途徑中，對增加果蠅 PGRP-SA或粉蟲PGRP-SA與不溶性Lys-PG的靠近起到?jīng)Q定性作用， 盡管不能排除其它顯示類溶菌酶活性的蛋白使得PGs與PGRP-SA結(jié)合。
最近，有報道顯示果蠅GNBP1具有水解松弛交聯(lián)的藤黃微球菌 Lys-PG的酶活性，但不水解高度交聯(lián)的金黃色葡萄球菌Lys-PG(Wang, L,, Weber， A. N.， Atilano， M. L， Filipe, S. R.， Gay, N. J. & Ligoxygakis， P. (2006) ￡MB(9 5005-5014)。由于發(fā)現(xiàn)GNBP1具有類似酶的活
性，他們提出果蠅GNBP1代表果蠅PGRP-SA的PG傳感時的形式?？?慮到該限制的類似酶活性的GNBP1以及血淋巴中溶菌酶對高度交聯(lián) 的PGs具有活性，GNBP1對于PG過程可能沒有血淋巴溶菌酶重要。然 而，該限制的類似酶活性的GNBP1可能在放大或清除識別信號中發(fā)揮 重要作用。
(5)粉蟲PGRP-SA/PG復(fù)合物結(jié)合粉蟲GNBP1和粉蟲多結(jié)構(gòu)域 模式絲氨酸(MSP)
為了確定識別聚集在部分消化的Lys-PGs上的粉蟲PGRP-SA分子 的直接下游效應(yīng)器，將粉蟲PGRP-SA重組體與部分消化的金黃色葡萄 球菌PG和藤黃微球菌PG共孵育，然后加入粉蟲PGRP-SA(-)溶液，隨 后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。結(jié)果是，如果粉蟲PGRP-SA與部分 消化的Lys-PG結(jié)合(圖10中2道和5道)，50kDa蛋白(圖10中條帶1) 和35kDa蛋白(圖10中條帶2)將顯著地增加。然而，在相同條件下， 與式(I)化合物配對的瓊脂糖樹脂結(jié)合的粉蟲PGRP-SA不能招募50 kDa和35kDa蛋白(圖10中條帶7),表明該兩個蛋白由Lys-PG上聚合的 PGRP-SA分子招募。此外，結(jié)合于部分消化的PG上的果蠅PGRP-SA 不與該兩個粉蟲蛋白發(fā)生相互作用(圖10中條帶3)。
2我們鑒定了 Lys-PG上聚集的粉蟲PGRP-SA上增加的兩種蛋白。50 kDa蛋白(條帶l)為粉蟲GNBPl(粉蟲GNBP1)。 50kDa蛋白(條帶l)的N 端30個氨基酸殘基分別表現(xiàn)出與赤擬谷盜(7H6o/^m costoweww ) GNBP和按紋GNBP1的86.7。/。和51.7%序列相似性(圖11 (A))。人們已 報道GNBP1與PGRP-SA發(fā)生物理上的相互作用，以激活果錄體內(nèi)的 Toll途徑(Gobert, V.， Gottar, M.， Matskevich, A. A., Rutschmann, S., Royet, J.， Belvin, M., Hoffmann, J. A. & Ferrandon, D. (2003) 5Wewce 302, 2126-2130),但先前沒有觀測到GNBP1與PGRP-SA任何牢固的 結(jié)合。我們的觀測支持PG上PGRP-SA分子的聚集增強(qiáng)了PGRP-SA 與GNBP1的相互作用，GNBPl同系物也可能包含在pro-PO途經(jīng)中。 此外，我們發(fā)現(xiàn)35 kDa蛋白(條帶2)通過其N端和內(nèi)部氨基酸序列是 多結(jié)構(gòu)域組合SP的活性形式。35 kDa蛋白(條帶2)的N端20個氨基酸 殘基顯示出與赤擬谷盜絲氨酸蛋白酶的絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域70.6%的 序列相似性(Tc-SP, accession number XP_967486;圖11 (B))。 SP含有低 密度脂蛋白受體A重復(fù)結(jié)構(gòu)域(LDLa)， 一個sushi結(jié)構(gòu)域， 一個補(bǔ)體調(diào) 控蛋白(CCP)結(jié)構(gòu)域和SP結(jié)構(gòu)域，但不含有普遍發(fā)現(xiàn)存在于Toll和 pro-PO級聯(lián)反應(yīng)成員中的發(fā)夾結(jié)構(gòu)域。通過在非還原條件下，在蛋白 帶中低密度脂蛋白受體A重復(fù)結(jié)構(gòu)域序列存在的條件下，進(jìn)一步證實(shí) 了35kDa蛋白的鑒定(圖11 (C))。我們命名該35kDa蛋白為粉蟲模式絲 氨酸蛋白酶。煙草天蛾(M朋t/wca ^jcto )血淋巴蛋白酶-14(Ms-HP-14), 顯示出和粉蟲模式絲氨酸蛋白酶相似的結(jié)構(gòu)域排列，近來報道作為煙 草天蛾中pro-PO激活系統(tǒng)的引發(fā)酶，其結(jié)合凝膠多糖、酵母多糖和酵 母菌，與肽聚糖發(fā)生相互作用(Ji， C., Wang, Y., Guo, X" Hartson， S. & Jiang， H. (2004) J歷o/ Oze淤279， 34101-34106;和Wang, Y. & Jiang， H. (2006) J萬/o/C7^/w 281, 9271-9278)。在本研究中，我們提供第一個證 據(jù)，在pro-PO途徑中，類Ms-HP-14絲氨酸蛋白酶結(jié)合于由GNBPl同 系物、PGRP-SA和PG組成的起始激活復(fù)合物。本發(fā)明人提出了概括在啟動Toll途徑和pro-PO途徑中的分子事件 的模型，如下所述(見圖12)。盡管少數(shù)幾個PGRP-SA (R)分子結(jié)合至 完整PG,但并不能激活免疫反應(yīng)(a)。革蘭氏陽性菌的PG被溶菌酶部 分消化(b)或完全消化(b')。然而部分消化的PG吸引了更多PGRP-SA分 子結(jié)合到細(xì)菌表面(b)上，完全消化的PG不能招募PGRP-SA到細(xì)菌表 面上，導(dǎo)致菌體裂解(b')。聚集的PGRP-SA分子招募GNBP1以及含有 低密度脂蛋白受體A重復(fù)結(jié)構(gòu)域(LDL)的模式絲氨酸蛋白酶(MSP)，導(dǎo) 致模式絲氨酸蛋白酶(c)的激活。然后，激活的絲氨酸蛋白酶引發(fā)蛋白 水解級聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致Toll途徑和酚氧化酶原(pro-PO)途徑的激活，在入 侵菌體周圍產(chǎn)生抗菌肽(AMP)和黑色素。
(6) cDNA克隆以及粉蟲GNBPl和粉蟲MSP測序
粉蟲GNBP1的cDNA克隆結(jié)果鑒定為粉蟲GNBPl的多核苷酸包 含1326個編碼甲硫氨酸至終止密碼子的核苷酸(SEQIDNO: 3)，其多 肽包含442個氨基酸(SEQ ID NO: 2)。
粉蟲MSP的cDNA克隆結(jié)果鑒定為有兩個包括1896個核苷酸和 632個氨基酸的變體其中一個含有如SEQIDNO:4所示氨基酸序列 /SEQIDNO: 5所示的核苷酸序列，另 一個含有SEQ ID NO: 6所示氨 基酸序列/SEQIDNO: 7所示的核苷酸序列。這種變體可能是由于獲 得的基因來自于不同種類的昆蟲，這樣由于多態(tài)性在個體間發(fā)生等位 基因的不同結(jié)合。
權(quán)利要求
1.來源于黃粉蟲的革蘭氏陰性菌結(jié)合蛋白1(粉蟲GNBP1)，其具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
2. 編碼具有SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的粉蟲GNBP1的多 核苷酸。
3. 如權(quán)利要求2所述的多核苷酸，其具有SEQIDNO:3所示的核苷酸序列。
4. 來源于黃粉蟲的模式絲氨酸蛋白酶-l(粉蟲MSP-1),其具有 SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列。
5. 編碼具有SEQ ID NO: 4所示氨基酸序列的粉蟲MSP-1的多核苷酸。
6. 如權(quán)利要求5所述的多核苷酸，其具有SEQIDNO:5所示的核苷酸序列。
7. 來源于黃粉蟲的模式絲氨酸蛋白酶-2(粉蟲MSP-2)，其具有 SEQ ID NO: 6所示的氨基酸序列。
8. 編碼具有SEQ ID NO: 6所示氨基酸序列的粉蟲MSP-2的多核苷酸。
9. 如權(quán)利要求8所述的多核苷酸，其具有SEQIDNO:7所示的核苷酸序列。
10. 檢測樣品中細(xì)菌感染的方法，該方法包括(a) 向樣品中加入來源于黃粉蟲的具有SEQIDNO: l所示的氨基 酸序列的肽聚糖識別蛋白(粉蟲PGRP-SA),然后進(jìn)行孵育；(b) 向步驟(a)孵育的混合物中加入至少一種選自下組的蛋白具 有SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的粉蟲GNBP1 ，具有SEQ ID NO: 4 所示氨基酸序列的粉蟲MSP-1和具有SEQ ID NO: 6所示的氨基酸序 列的粉蟲MSP-2，然后進(jìn)行孵育；以及(c) 檢測步驟(b)孵育的混合物中蛋白和樣品之間的反應(yīng)。
11. 如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述樣品是輸入型血液、哺 乳動物血液、蔬菜、肉、水果、熟的或未經(jīng)烹飪的食物、自來水、地 下水、雨水或無菌制品。
12. 如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述樣品是輸入型血液或哺 乳動物血液。
13. 如權(quán)利要求10至12任一項所述的方法，進(jìn)一步包括用(3-蛋白 水解酶(blp)和/或溶菌酶對樣品進(jìn)行預(yù)處理。
14. 如權(quán)利要求13所述的方法，其中blp來源于無色桿菌屬微生
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述無色桿菌屬微生物為水
16. 如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述無色桿菌屬微生物為水 解無色桿菌ATCC 21456或水解無色桿菌ATCC 21457。
17. 如權(quán)利要求13所述的方法，其中以blp進(jìn)行預(yù)處理是通過用濃 度為約l嗎/ml的blp處理樣品，然后在約37匸下孵育約14小時。
18. 如權(quán)利要求13所述的方法，其中用溶菌酶進(jìn)行預(yù)處理是通過 用濃度為約1 mg/m 1的溶菌酶處理樣品，然后在約3 7匸下孵育。
19. 用于檢測樣品中細(xì)菌感染的試劑盒，包括 具有SEQIDNO: l所示氨基酸序列的粉蟲PGRP-SA，以及 至少一種選自下組的蛋白具有SEQIDNO:2所示氨基酸序列的粉蟲GNBP1 ，具有SEQ ID NO: 4所示氨基酸序列的粉蟲MSP-1和具有 SEQ ID NO: 6所示氨基酸序列的粉蟲MSP-2。
20. 如權(quán)利要求19所述的試劑盒，其中所述樣品是輸入型血液、 哺乳動物血液、蔬菜、肉、水果、熟的或未經(jīng)烹飪的食物、自來水、 地下水、雨水或無菌制品。
21. 如權(quán)利要求19所述的試劑盒，其中所述樣品是輸入型血液或 哺乳動物血液。
22. 如權(quán)利要求19所述的試劑盒，其中所述試劑盒是以溶液、冷 凍干燥粉、冷凍溶液或片劑的形式存在。
23. 如權(quán)利要求19至22任一項所述的試劑盒，進(jìn)一步包括P -蛋白 水解酶(blp)和/或溶菌酶。
24. 可溶性線性化賴氨酸型肽聚糖(SLPG)的制備方法，該方法包括(a')將分離自細(xì)菌的不溶性肽聚糖懸浮于約pH8的緩沖溶液中；(b')用P-蛋白水解酶(blp)處理步驟(a')得到的懸浮液；(c')在約95匸下加熱步驟(b')的反應(yīng)混合物約10分鐘，離心該反應(yīng)混合物，然后收集上清液；以及(d')使用尺寸排阻柱分級步驟(c')得到的上清液，收集顯示酚氧化酶(PO)活性的級分。
25. 如權(quán)利要求24所述的方法，其中blp來源于無色桿菌屬微生
26. 如權(quán)利要求25所述的方法，其中所述的無色桿菌屬微生物是 水解無色桿菌(v4c/zrawo6acfer 一cws )。
27. 如權(quán)利要求25所述的方法，其中所述無色桿菌屬的微生物是 水解無色桿菌ATCC 21456或水解無色桿菌ATCC 21457。
28. 如權(quán)利要求24所述的方法，其中步驟(b，)是通過用濃度約為 l嗎/ml的blp處理步驟(a')得到的懸浮液，然后在約37。C下孵育約14小 時。
29. 如權(quán)利要求24所述的方法，其中在步驟(c')中，離心是在約4 °C的條件下以18,000 x g進(jìn)行約IO分鐘。
30. 如權(quán)利要求24所述的方法，其中在步驟(d')中，所述尺寸排阻 柱為填充Toyopearl HW55樹脂的柱子。
31. 如權(quán)利要求24所述的方法，進(jìn)一步包括冷凍干燥由步驟(d') 得到的級分。
全文摘要
本發(fā)明提供激活黃粉蟲酚氧化酶原(pro-PO)系統(tǒng)的新型蛋白及其編碼基因，使用該蛋白檢測樣品中細(xì)菌感染的方法以及使用該蛋白檢測樣品中細(xì)菌感染的試劑盒。本發(fā)明還提供了制備用作該試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)物的可溶性線性化賴氨酸型肽聚糖(SLPG)的方法。
文檔編號C07K14/435GK101627052SQ200880004609
公開日2010年1月13日 申請日期2008年2月4日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月8日
發(fā)明者盧京伯, 樸知遠(yuǎn), 李福律, 河南出, 金粲熙, 金茱眕 申請人:柳韓洋行