專利名稱：：?jiǎn)慰寺】筩xcl13抗體的制作方法單克隆抗CXCL13抗體本發(fā)明涉及CXCL13的結(jié)合成員，特別是抗體分子。所述結(jié)合成員可以用于治療與CXCL13相關(guān)的病癥，包括關(guān)節(jié)病癥，如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。CXCL13是有效的B細(xì)胞化學(xué)引誘物，其指導(dǎo)幼稚B細(xì)胞進(jìn)入二級(jí)淋巴器官的濾泡，并且由二級(jí)淋巴器官的富含B細(xì)胞的區(qū)域中的濾泡樹突細(xì)胞(FDCs)和基質(zhì)細(xì)胞組成型表達(dá)。CXCL13也稱作吸引B細(xì)胞的趨化因子1(BCA-1)。CXCL13通過其受體CXCR5傳遞信號(hào)。CXCR5是7次跨膜的G蛋白偶聯(lián)的受體，并且是1類GPCR家族的CXC趨化因子受體亞家族的成員。CXCR5以高水平在幼稚和激活的B細(xì)胞，包括外周血和扁桃體B細(xì)胞上表達(dá)。它也在激活的外周血CD4+T細(xì)胞的一個(gè)亞群和二級(jí)淋巴組織中的大多數(shù)CD4+細(xì)胞上表達(dá)。CXCL13是CXCR5的p舉一已知配體。CXCL13在外周淋巴器官的發(fā)育中起作用。例如，Ansel等人[]顯示了CXCL13缺陷的小鼠在外周淋巴結(jié)發(fā)育中具有嚴(yán)重缺陷。CXCL13誘導(dǎo)募集到濾泡中的幼稚B細(xì)胞上的膜淋巴毒素al|32的表達(dá)，其促進(jìn)FDCs的成熟，并且進(jìn)一步增強(qiáng)CXCL13產(chǎn)生[l]。用T細(xì)胞依賴性抗原免疫的CXCL13缺陷小鼠在淋巴結(jié)和脾中形成生發(fā)中心，但它們^艮小，并且具有不規(guī)則的構(gòu)造，提示CXCL13是濾泡內(nèi)B細(xì)胞的募集和正確定位所需要的[l]。CXCL13也在先天免疫中起作用。CXCL13缺陷小鼠缺乏腹膜腔和胸膜腔Bl細(xì)胞，并且缺乏針對(duì)體腔細(xì)菌抗原的天然抗體的產(chǎn)生(Ansel,KM.等Immunity,16:67-76,2002)。如本文其它地方所討i侖的，存在證據(jù)表明CXCL13參與多種病癥。本領(lǐng)域報(bào)道了CXCL13結(jié)合成員。例如，MAB801是可商購(gòu)的鼠抗人CXCL13單克隆抗體(R&DSystems:MAB801)。MAB470是大鼠抗小鼠CXCLB單克隆抗體。通過利用合適設(shè)計(jì)的選擇技術(shù)和測(cè)定，我們開發(fā)了CXCL13的結(jié)合成員，其抑制CXCL13與其革巴受體CXCR5的結(jié)合。本發(fā)明的結(jié)合成員抑制CXCL13與靶受體CXCR5的結(jié)合。結(jié)合的抑制可以是直接抑制。本文描述了CXCL13的結(jié)合成員，也稱作CXCL13結(jié)合成員。該結(jié)合成員結(jié)合并且可以中和人CXCL13和非人靈長(zhǎng)動(dòng)物CXCL13,如獼猴CXCL13。非人CXCL13表示在除人之外的物種中天然存在的CXCL13的直向同源物。本發(fā)明的結(jié)合成員正常情況下相對(duì)于CXC家族趨化因子的其他成員，包括例如CXCL3,CXCL5,CXCL6,CXCL8,CXCL10和/或CXCL12,對(duì)于CXCL13是特異性的，并且因此選擇性結(jié)合CXCL13。這例如可以在竟?fàn)帨y(cè)定中確定或證明。例如，合適的測(cè)定在本文的實(shí)施例2.5中描述。并且可以用于治療與CXCL13相關(guān)的病癥，例如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，如本文其它i也方的^M田描述。如下文更詳細(xì)描述的，已經(jīng)顯示了本發(fā)明的結(jié)合成員能夠以高效價(jià)中和CXCL13。中和表示抑制CXCL13的生物活性。本發(fā)明的結(jié)合成員可以中和CXCL13的一種或多種活性。受抑制的生物活性典型是CXCL13與結(jié)合配偶體的結(jié)合。例如，受抑制的生物活性可以是CXCL13與CXCR5的結(jié)合。根據(jù)本發(fā)明，可以抑制人或非人CXCL13與CXCR5的結(jié)合，例如，結(jié)合成員可以抑制非人靈長(zhǎng)動(dòng)物，如獼猴CXCL13與CXCR5的結(jié)合。CXCR5可以是人或非人的，如非人靈長(zhǎng)動(dòng)物，如獼猴或小鼠的CXCR5。一方面，CXCR5與CXCL13是同一物種的。典型地，CXCR5是人CXCR5。CXCL13與CXCR5的結(jié)合的中和例如可以測(cè)量為CXCR5信號(hào)傳遞介導(dǎo)的活性的函數(shù)，因?yàn)镃XCL13與CXCR5的結(jié)合刺激所述活性。由于CXCR5是G蛋白偶聯(lián)的受體，所述活性可以是與G蛋白偶聯(lián)的受體相關(guān)的活性。例如，CXCL13與CXCR5的結(jié)合可以通過G蛋白亞基Gai(其抑制腺苷酸環(huán)化酶)的釋放導(dǎo)致腺苷酸環(huán)化酶活性的下調(diào)和細(xì)胞cAMP水平的降低。因此，合適的測(cè)定可以包括檢測(cè)在缺乏結(jié)合成員的條件下發(fā)生的細(xì)月包c(diǎn)AMP水平的降^氐的抑制，即本文稱作cAMP的測(cè)定可以測(cè)量CXCL13介導(dǎo)的細(xì)胞cAMP水平的抑制(通過本文的結(jié)合成員)。典型地，用于cAMP測(cè)定中的細(xì)胞是用腺苷酸環(huán)化酶激活物如NKH477共刺激的。用于所述測(cè)定中的合適的細(xì)胞在本文中描述。合適的(細(xì)胞)CAMP測(cè)定包括以均相測(cè)定形式組合了熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)和時(shí)間分辨熒光(TRF)技術(shù)的那些測(cè)定(在本文中稱作TRF/FRETcAMP測(cè)定)。TRF/FRETcAMP測(cè)定的實(shí)例包括HTRF(均相時(shí)間分辨熒光)cAMP測(cè)定(CisBioInternational)(參見例如GabrielD等，(2003)AssayandDrugDevelopmentTechnologies1(2):291-303)禾口LANCEcAMP測(cè)定(PerkmElmer)(參見例如Hemmila等人(1999)JB讓olScreen4(6):303-308)。FRET是指供體熒光團(tuán)和合適的受體熒光團(tuán)(FRET供體-受體對(duì))之間的激發(fā)能量的非放射性能量轉(zhuǎn)移。典型地，該測(cè)定成分包括標(biāo)記的cAMP(示蹤劑cAMP)和標(biāo)記的cAMP特異性抗體。示蹤劑cAMP和抗體都用供體-受體對(duì)的一個(gè)成員標(biāo)記。當(dāng)抗體結(jié)合示蹤劑cAMP時(shí)，發(fā)生FRET,并且通過TRF確定受體發(fā)射的信號(hào)。樣品中的游離cAMP與示蹤劑cAMP竟?fàn)幗Y(jié)合抗體，并且減少FRET信號(hào)。該測(cè)定因此包含確定受體發(fā)射的信號(hào)。優(yōu)選地，該測(cè)定包括確定供體和受體的特異性信號(hào)作為內(nèi)部對(duì)照，以得到比值測(cè)量值，其補(bǔ)償測(cè)定中有色化合物的存在。在本測(cè)定中，供體受體對(duì)典型地使得供體受到約337-340nm的光的激發(fā)。典型地，在供體和受體之間的FRET之后，受體發(fā)射約665nm的信號(hào)(其可以是時(shí)間分辨的)。例如，XL665(HTRFcAMP測(cè)定中的受體)和AlexaFluor-647染料(LANCE⑧cAMP測(cè)定中的受體)都在665nm發(fā)射熒光信號(hào)。例如，供體可以在約615-620nm發(fā)射信號(hào)。受體可以是例如吸收紅色的熒光染料，特別是親水的吸收紅色的染料(Buschmann等，BioconjugateChem.2003,14:195-204)。吸收紅色的焚光染料可以是例如AlexaFluor-647(PerkmElmer),例如用于LANCEcAMP測(cè)定中。供體-受體對(duì)的實(shí)例包括例如用于HTRFcAMP測(cè)定中的銪穴狀4匕合物(供體)/XL665(受體)和例如用于LANCEcAMP測(cè)定中的銪螯合物(供體)/AlexaFluor-647染料(受體)。示蹤劑cAMP或抗體可以用供體或受體標(biāo)記。因此，測(cè)定可以包括使用(供體標(biāo)記-示蹤劑cAMP)和(受體標(biāo)記-cAMP特異性抗體)或使用(受體標(biāo)記-示蹤劑cAMP)和(供體標(biāo)記-cAMP特異性抗體)。例如，測(cè)定可以包括使用XL665-cAMP和銪穴狀化合物-抗-cAMP單克隆抗體，10如在HTRF⑧測(cè)定中。測(cè)定可以包括使用銪螯合物標(biāo)記的cAMP和AlexaFluor-647染料標(biāo)記的cAMP抗體，如在LANCE⑧測(cè)定中。通過TRF確定TRF/FRET測(cè)定中的熒光信號(hào)。TRF/FRETcAMP測(cè)定可以用于測(cè)定用腺苷酸環(huán)化酶激活物NKH477共刺激CH0qi5CXCR5細(xì)胞后細(xì)胞cAMP水平的CXCL13介導(dǎo)的降低的抑制。通常，在HTRF⑧測(cè)定中，對(duì)可以彼此結(jié)合的大分子進(jìn)行標(biāo)記，一個(gè)用銪(Eu3+)穴狀化合物(供體)標(biāo)記，另一個(gè)用第二熒光標(biāo)記XL665(或Xlent)(穩(wěn)定的交聯(lián)別藻藍(lán)蛋白)標(biāo)記。當(dāng)分子彼此結(jié)合時(shí)以及在激發(fā)后(在337nm),發(fā)生FRET,并且XL665在665nm重新發(fā)射特異性的長(zhǎng)期存在的熒光。在該測(cè)定中，供體(在620nm)和受體(在665nm)的特異性信號(hào)都測(cè)量為內(nèi)部對(duì)照，在測(cè)定中給出補(bǔ)償有色化合物的存在的比值測(cè)定值。HTRFcAMP測(cè)定典型地包括混合XL665-cAMP(示蹤劑cAMP)、銪穴狀化合物-抗cAMP單克隆抗體和含cAMP的樣品；施加337nm的光(從而激發(fā)銪穴狀化合物供體)；通過TRF確定620nm處(供體)和665nm處(受體)的熒光信號(hào)；和將信號(hào)665nm/620nm的比值確定為發(fā)生過的FRET的測(cè)量值。來自樣品的任〗可游離cAMP與XL665-cAMP(示蹤劑cAMP)竟?fàn)幗Y(jié)合銪穴狀化合物-抗cAMP單克隆抗體。當(dāng)樣品不含任何cAMP時(shí)發(fā)生最大FRET,并且FRET信號(hào)隨著樣品cAMP的增力口而減少。因此，HTRF(D技術(shù)利用了熒光提供的可能性，以便在發(fā)射的信號(hào)的光語特征(許可的比值校正)上和時(shí)間分辨的檢測(cè)模式下(例如消除自身熒光)工作。該技術(shù)是均相的，表示樣品和檢測(cè)試劑在平板中混合在一起，所述平板可以在合適的平板讀數(shù)器中讀數(shù)，即所謂的"混合和讀數(shù)"方案。LANCEcAMP測(cè)定合并了TRF和FRE以及紅色偏移的AlexaFluor染料(PerkmElmer)的利用，這使得能夠進(jìn)行FRET測(cè)定而無需與藍(lán)色染料相關(guān)的化合物干涉。LANCEcAMP測(cè)定典型地包括混合銪-銪的螯合物/鏈霉親和素-生物素/cAMP示蹤劑、AlexaFluor-647標(biāo)記的cAMP特異性抗體和含cAMP的樣品；施加340nm的光(從而激發(fā)銪供體)；通過TRF將665nm定為發(fā)生過的FRET的測(cè)量值。來自螯合物的殘余能量產(chǎn)生615nm處的光。來自樣品的任何游離cAMP與銪標(biāo)記的cAMP(示蹤劑cAMP)竟?fàn)幗Y(jié)合Alexa⑧標(biāo)記的抗cAMP單克隆抗體。當(dāng)樣品不含任何cAMP時(shí)發(fā)生最大FRET,并且FRET信號(hào)隨著樣品cAMP的增加而減少?？梢杂煤线m的標(biāo)準(zhǔn)來對(duì)測(cè)定進(jìn)朽寸吏準(zhǔn)。這些測(cè)定的測(cè)定方案和執(zhí)行的實(shí)例在本文的材津+和方法部分詳細(xì)描述?？梢赃M(jìn)4亍測(cè)定/人而確定CXCL13與CXCR5的結(jié)合的中和的另一CXCR5信號(hào)傳遞介導(dǎo)的活性是CXCL13誘導(dǎo)的鈣釋放。典型地，測(cè)定結(jié)合成員對(duì)表達(dá)CXCR5和G蛋白Gqi5的細(xì)胞中CXCL13誘導(dǎo)的鈣釋放的抑制作用。用CXCL13刺激這些細(xì)胞，通過誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存物的釋放和從細(xì)胞外介質(zhì)的流入，以濃度依賴性方式產(chǎn)生了細(xì)胞質(zhì)Ca2+的增加。這可以在焚光成像平板讀數(shù)器(FLIPR)中用鈣敏感性染料測(cè)量。例如，一個(gè)這樣的測(cè)定利用人CXCL13和用Gqi5和人CXCR5轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞系?？梢杂貌溉閯?dòng)物細(xì)胞系，如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞，如表達(dá)CXCR5和含有Goci亞基的G蛋白Gqi5的CHOKl細(xì)胞體外進(jìn)行cAMP測(cè)定和Ca2+釋放測(cè)定。可以通過用編碼CXCR5和Gqi5的核酸轉(zhuǎn)染細(xì)胞而產(chǎn)生合適的細(xì)胞系。CXCL13是有效的B細(xì)胞化學(xué)引誘物。CXCL13通過CXCR5受體傳遞信號(hào)，所述受體以高水平在幼稚和激活的B細(xì)l包上以及激活的T細(xì)胞的一個(gè)亞群上表達(dá)。因此，可以進(jìn)行測(cè)定從而確定CXCL13與CXCR5的結(jié)合的中和的另一活性是表達(dá)CXCR5的B細(xì)胞中CXCL13誘導(dǎo)的趨化性。測(cè)定中的B細(xì)胞可以是非原代B細(xì)胞。一種這樣的測(cè)定利用已經(jīng)用人重組CXCR5(B300.19hCXCR5細(xì)胞)轉(zhuǎn)染的鼠前B細(xì)胞系?；蛘?，可以使用原代B細(xì)胞。一個(gè)這樣的測(cè)定使用從鼠脾分離的混合淋巴細(xì)胞群。這樣，合適的測(cè)定，如cAMP、鈣釋放和B細(xì)胞趨化性測(cè)定可以用于計(jì)算成員抑制CXCL13與CXCR5結(jié)合的效價(jià)，如下文的描述。這些測(cè)定可以用于計(jì)算結(jié)合成員中和CXCL13與CXCR5的結(jié)合的效1介。中12和效價(jià)計(jì)算為CXCR5信號(hào)傳遞介導(dǎo)的活性的函數(shù)。該測(cè)定可以測(cè)量誘導(dǎo)的中和CXCL13的效價(jià)；細(xì)胞cAMP水平的降低；細(xì)胞鈣水平的升高；或B細(xì)力包趨化性。生物活性的抑制可以是部分或全部的。結(jié)合配偶體可以使CXCL13生物活性，即不存在結(jié)合成員情況下的活性的100%,或至少95%,至少90%,至少85%,至少80%,至少75%,至少70%,至少60%,或至少50%被抑制?？梢詼y(cè)定結(jié)合成員的中和效價(jià)。效價(jià)通常表示為IC50值，除非特別指出，是以nM表示。在功能測(cè)定中，ICso是使生物反應(yīng)減少其最大值的50%的結(jié)合成員的濃度。在配體結(jié)合研究中，ICso是使受體結(jié)合減少最大特異性結(jié)合水平的50%的濃度?？梢酝ㄟ^以下方法計(jì)算IC5o:將最大生物反應(yīng)的％作圖為結(jié)合成員濃度的對(duì)數(shù)的函數(shù)，并且用軟件程序，如Prism(GraphPad)將S形函數(shù)擬合于數(shù)據(jù)，從而產(chǎn)生ICsQ值?？梢杂眉夹g(shù)人員已知和/或本文描述或提到的一種或多種測(cè)定來確定或測(cè)量效價(jià)。在本文描述的測(cè)定，如cAMP、釣釋》文或B細(xì)l包趨化性測(cè)定中由結(jié)合成員對(duì)CXCL13活性的中和，表明結(jié)合成員結(jié)合CXCL13并且抑制CXCL13與CXCR5的結(jié)合。可以用于確定結(jié)合成員與CXCL13的結(jié)合的其他方法包括ELISA、蛋白印跡、免疫沉淀、親和層析和生物化學(xué)測(cè)定。利用來自第一物種(如人)的CXCL13在測(cè)定中計(jì)算的結(jié)合成員的中和效價(jià)可以與用來自第二物種(如非人靈長(zhǎng)動(dòng)物如獼猴)的CXCL13在同一測(cè)定中計(jì)算的結(jié)合成員的中和效價(jià)進(jìn)行比較，從而評(píng)估這兩個(gè)物種的CXCL13的結(jié)合成員的交叉反應(yīng)性程度?；蛘?，可以在本文其他地方更詳細(xì)描述的竟?fàn)幗Y(jié)合測(cè)定中評(píng)估交叉反應(yīng)性。本發(fā)明的結(jié)合成員具有的中和人CXCL13與CXCR5結(jié)合的效價(jià)可以是中和獼猴CXCL13與CXCR5結(jié)合的效1介的10倍以內(nèi)。例如，可以分別用人和獼猴CXCL13在cAMP測(cè)定(如TRF-FRET測(cè)定，如LANCEcAMP測(cè)定)或在B細(xì)胞趨化性測(cè)定中測(cè)量效價(jià)。用人CXCL13進(jìn)行的cAMP測(cè)定如LANCEcAMP測(cè)定中的效價(jià)與用獼猴CXCL13進(jìn)行的cAMP測(cè)定中的效^介的差別例如可以不超過10、5、4、3或24咅。對(duì)于人或獼猴CXCL13的2nM的終濃度，確定cAMP測(cè)定中的效價(jià)。用人CXCL13和獼猴進(jìn)行的LANCEcAMP測(cè)定中獲得的數(shù)據(jù)的實(shí)例示于表2和5。本發(fā)明的結(jié)合成員結(jié)合人CXCL13可以比結(jié)合獼猴CXCL13更強(qiáng)。如竟?fàn)幗Y(jié)合測(cè)定中所測(cè)量的，結(jié)合成員與人CXCL13結(jié)合的強(qiáng)度可以例如比結(jié)合獼猴CXCL13的強(qiáng)度高不超過10、9、8、7、6、5、4、3或2倍。例如，對(duì)人CXCL13的結(jié)合強(qiáng)度可以比對(duì)獼猴CXCL13的結(jié)合強(qiáng)度高不超過4倍。用人和獼猴CXCL13進(jìn)行的竟?fàn)帨y(cè)定中獲得的數(shù)據(jù)的實(shí)例示于表8中。如本文描述的，本發(fā)明的結(jié)合成員在人CXCL13cAMP測(cè)定中的中和效價(jià)或IC5o可以不超過12nM,其中CXCL13的終濃度是2nM。IC50可以例如不超過11,10,9,8,7，6,5，4,3,2或lnM,如不超過5nM。結(jié)合成員可以是本文描述的任何形式，例如，IgG或scF或任何其他合適的形式。如本文的描述，本發(fā)明的結(jié)合成員在獼猴CXCL13cAMP測(cè)定中的中和效價(jià)或IC5o可以不超過12nM,其中CXCL13的終濃度是2nM。IC50可以是例如不超過11,10,9,8,7,6,5,4,3,2或lnM，例如不超過3nM。結(jié)合成員可以是本文描述的任何形式，例如IgG或scFv或任何其他合適的形式。例如，本發(fā)明的結(jié)合成員在人CXCL13HTRFcAMP測(cè)定中的中和效價(jià)或ICso可以不超過12nM,其中CXCL13的終濃度是2nM。IC50可以是例如不超過11，10,9,8,7,6,5,4,3,2或lnM,例如不超過5nM。在人CXCL13HTRFcAMP測(cè)定中獲得的數(shù)據(jù)的實(shí)例示于表1。例如，本發(fā)明的結(jié)合成員在獼猴CXCL13HTRFcAMP測(cè)定中的中和效價(jià)或ICso可以不超過12nM，其中CXCL13的終濃度是2nM。IC50可以是例如不超過11,10,9,8,7,6,5,4,3,2或lnM，例如不超過3nM。在獼猴CXCL13HTRFcAMP測(cè)定中獲得的數(shù)據(jù)的實(shí)例示于表1。一方面，例如，當(dāng)測(cè)定的結(jié)合成員是IgG形式時(shí)，如本文的描述，結(jié)合成員在人CXCL13cAMP測(cè)定中的中和效-階或ICso可以是不超過5nM,其中CXCL13的終濃度是2nM。IC50可以是例如不超過4.5,4,3.5,3，2.5,2,1.9，1.7,1.5,1.3，1.1,1.0,0.9,0.7或0.5nM,例如不超過1.4或不超過1.6nM。一方面，例如，當(dāng)測(cè)定的結(jié)合成員是IgG形式時(shí)，如本文的描述，結(jié)合成員在獼猴CXCL13cAMP測(cè)定中的中和效價(jià)或IC50可以是不超過5nM,其中CXCL13的終濃度是2nM。IC50可以是例如不超過4.5,4，3.5,3，2.5，2,1.5,1,0.5,0.4或0.2nM,例如不超過0.3nM。例如，本發(fā)明的結(jié)合成員，如IgG,在人CXCL13LANCEcAMP測(cè)定中的中和效價(jià)或IC5o可以是不超過5nM,其中CXCL13的終濃度是2nM。IC5o可以是例如不超過4.5,4,3.5,3,2.5,2,1.9,1.7,1.5,1.3,1.1,1.00.9，0.7或0.5nM,例如不超過1.4或不超過1.6nM。人CXCL13LANCEcAMP測(cè)定中獲得的數(shù)據(jù)的實(shí)例示于表2和5中。例如，發(fā)明的結(jié)合成員，如IgG,在獼猴CXCL13LANCEcAMP測(cè)定中的中和效1介或IC5o可以是不超過5nM,其中CXCL13的終濃度是2nM。IC5o可以是例如不超過4.5,4，3.5,3,2.5,2,1.5,1,0.5,0.4或0.2nM,例如不超過0.3nM。獼猴CXCL13LANCEcAMP測(cè)定中獲得的數(shù)據(jù)的實(shí)例示于表2和5中。本發(fā)明的結(jié)合成員在人CXCL13鈣釋放測(cè)定中的中和效價(jià)或IC50可以是不超過40nM,其中CXCL13的終濃度是100nM。IC5q可以是例如不超過38,36,34,32，20,28,26,24,22,20,18，16,14，12,10,8,6,4或2nM。在人CXCL13鈣釋放測(cè)定中獲得的數(shù)據(jù)的實(shí)例示于表4和7中。本發(fā)明的結(jié)合成員在人CXCL13B細(xì)胞趨化性測(cè)定中的中和效價(jià)或IC5o可以是不超過12nM,其中人CXCL13的終濃度產(chǎn)生約ED80反應(yīng)，并且其中的非原代B細(xì)胞系已經(jīng)用人重組CXCR5轉(zhuǎn)染過。IC5o可以例如是不超過11,10,9,8,7,6,5,4，3,2,1或1.5nM。典型地，該測(cè)定4吏用B細(xì)胞系，如已經(jīng)用人重組CXCR5轉(zhuǎn)染的鼠前B細(xì)胞系，如表達(dá)人重組CXCR5的B300.19細(xì)胞。在使用人CXCL13的人CXCL13B細(xì)胞趨化性測(cè)定中獲得的數(shù)據(jù)的實(shí)例示于表3和6。本發(fā)明的結(jié)合成員在獼猴CXCL13B細(xì)胞趨化性測(cè)定中的中和效價(jià)或ICso可以是不超過10nM,其中獼猴CXCL13的終濃度產(chǎn)生約ED80反應(yīng)，并且其中的非原代B細(xì)胞系已經(jīng)用人重組CXCR5轉(zhuǎn)染。IC5o可以例如是不超過9,8，7,6,5,4，3,2或1nM。典型地，該測(cè)定使用B細(xì)胞系，如已經(jīng)用人重組CXCR5轉(zhuǎn)染的鼠前B細(xì)胞系，如表達(dá)人重組CXCR5的B300.19細(xì)胞。在獼猴CXCL13B細(xì)胞趨化性測(cè)定中獲得的數(shù)據(jù)的實(shí)例示于表6。本發(fā)明的結(jié)合成員在人CXCL13原代細(xì)胞趨化性測(cè)定中的中和效價(jià)或ICs?？梢允遣怀^40nM,其中人CXCL13的終濃度產(chǎn)生約ED80反應(yīng)，并且采用混合的淋巴細(xì)胞群。IC5o可以例如是不超過38,36,34,32,30,28，26,24,22,20,18,16,14,12,10,8,6,4或2nM。典型地，該測(cè)定使用從小鼠脾新鮮分離的原代淋巴細(xì)胞群。在采用人CXCU3和鼠原代淋巴細(xì)胞的人CXCL13B細(xì)胞趨化性測(cè)定中獲得的數(shù)據(jù)的實(shí)例示于表12?？梢岳缬帽砻娴入x子共振，如BIAcore確定CXCL13的CXCL13結(jié)合成員的結(jié)合動(dòng)力學(xué)和親和力(表示為平衡解離常數(shù)KD)。本發(fā)明的結(jié)合成員與人CXCL13的親和力通常小于400pM,例如小于380,360,340,320，300，290,280，270,260,250,240，230，220,210,200,190,180,170，160,150,140，130,120,110,100,90,80,70,60或50pM。對(duì)獼猴CXCL13的親和力通常類似于對(duì)人CXCL13的親和力。采用BIAcore對(duì)人CXCL13和獼猴CXCL13獲得的數(shù)據(jù)的實(shí)例示于表10和11。本發(fā)明的結(jié)合成員對(duì)人CXCL-13和獼猴CXCL-13的親和力可以小于150pM?？梢酝ㄟ^將人或獼猴CXCL-13流過包含結(jié)合成員的表面，用表面等離子共振測(cè)量結(jié)合動(dòng)力學(xué)和親和力。通常，除非特別指出，上述測(cè)定描述的中和效^介可以應(yīng)用于以本文描述的任何形式測(cè)定的結(jié)合成員。例如，效j介可以應(yīng)用于抗體分子，包括本文描述的任何抗體片段，例如IgG結(jié)合成員。當(dāng)CXCL13在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系(MEL細(xì)胞)中重組表達(dá)時(shí)，獲得人CXCL13的糖基化和非糖基化形式。產(chǎn)生的大部分人CXCL13是未糖基化的，但是當(dāng)按比例放大表達(dá)時(shí)，可以獲得含有糖基化形式的較小比例。在MEL細(xì)胞中表達(dá)的獼猴CXCL13是糖基化的。如在本文描述的B細(xì)胞趨化性測(cè)定中所測(cè)量的，糖基化和未糖基化的人CXCL13的抗體1的效價(jià)的差異在10倍以內(nèi)，并且可以認(rèn)為是等效的。未糖基化的人CXCL13、糖基4匕的人CXCL13和糖基化的獼猴CXCL13的示例性效^介數(shù)據(jù)示于實(shí)施例2.3中的表6。與糖基化的人CXCL13的結(jié)合可以代表本發(fā)明的結(jié)合成員的優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)閮?nèi)源CXCL13可以是糖基化的，因此糖基化的人CXCL13可以代表人類治療的治療靶抗原。在本文描述的測(cè)定中，重組CXCL13,例如，人CXCL13,可以未糖基化或糖基化的形式使用。我們的數(shù)據(jù)表明，本發(fā)明的結(jié)合成員可以16結(jié)合不受糖基化影響的CXCL13的區(qū)域中的表位(參見實(shí)施例2.3和表6)。因此，本文描述的測(cè)定中的結(jié)合成員對(duì)人CXCL13的效價(jià)可以應(yīng)用于未糖基化的人CXCL13和糖基化的人CXCL13。在本文描述的測(cè)定，如B細(xì)胞趨化性測(cè)定中，與糖基化的人CXCL13相比，本發(fā)明的結(jié)合成員對(duì)未糖基化的人CXCL13的效價(jià)可以高不超過10、5、4、3、2.5或2倍。當(dāng)然，對(duì)糖基化的人CXCL13的效^介可以高于對(duì)未糖基化的人CXCL13的效價(jià)。如在本文描述的竟?fàn)幗Y(jié)合測(cè)定、cAMP測(cè)定、鈣釋放測(cè)定或B細(xì)胞趨化測(cè)定中測(cè)量的，本發(fā)明的結(jié)合成員對(duì)糖基化的人CXCL13的效價(jià)可以與對(duì)未糖基化的人CXCL13的效價(jià)相似或相同，如差異可以是不超過10、5、4、3、2.5或24咅。本發(fā)明的結(jié)合成員可以包括抗體分子，例如人抗體分子。結(jié)合成員通常包含抗體VH和/或VL結(jié)構(gòu)域。結(jié)合成員的VH和VL結(jié)構(gòu)域也提供為本發(fā)明的一部分?；パa(bǔ)決定區(qū)("CDRs")和構(gòu)架區(qū)("FRs")位于VH和VL結(jié)構(gòu)域的每一個(gè)中。VH結(jié)構(gòu)域包含HDRs組，VL結(jié)構(gòu)》或包含LCDRs組。抗體分子可以包含抗體VH結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域包含VHCDR1、CDR2和CDR3以及構(gòu)架區(qū)。它可以替代地或還包含抗體VL結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域包含VLCDR1、CDR2和CDR3以及構(gòu)架區(qū)。本發(fā)明的抗體VH和VL結(jié)構(gòu)域以及CDRs的實(shí)例列于所附序列表中，所述序列表構(gòu)成本公開內(nèi)容的一部分。本文7>開的所有VH和VL序列、CDR序列、CDRs組和HCDRs組代表了本發(fā)明實(shí)施方案的各方面。如本文描述的，"CDRs組"包括CDR1、CDR2和CDR3。因此，HCDRs組是指HCDR1、HCDR2和HCDR3，LCDRs組是指LCDR1、LCDR2和LCDR3。除非特別之處，"CDRs組，，包括HCDRs和LCDRs。本發(fā)明的結(jié)合成員典型地是單克隆抗體。是由非抗體蛋白支架中的一個(gè)或多個(gè)CDRs,如CDRs組提供的，如下文進(jìn)一步的討論。如實(shí)施例中更詳細(xì)描述的，我們分離了抗體分子，編號(hào)為抗體1。如本文描述的，抗體1是指具有抗體1的CDRs組的抗體。抗體1的序列示于所附序列表中，其中按以下順序具有以下序列編碼VH結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列(SEQIDNO:1);VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列(SEQIDNO:2);17VHCDR1氨基酸序列(SEQIDNO:3);VHCDR2氨基酸序列(SEQIDNO:4);VHCDR3氨基酸序列(SEQIDNO:5);編碼VL結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列(SEQIDNO:6);VL結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列(SE1IDNO:7);VLCDR1氨基酸序列(SEQIDNO:8);VLCDR2氨基酸序列(SEQIDNO:9);VLCDR3氨基酸序列(SEQIDNO:10)。本發(fā)明的結(jié)合成員可以包含本文描述的一個(gè)或多個(gè)CDRs,如CDR3,并且任選還包含CDR1和CDR2，以形成CDRs組。如本文的描述，CDR或CDRs組可以是抗體1的CDR或CDRs組，或可以是其變體。本發(fā)明提供了包含抗體1的HCDR1、HCDR2和/或HCDR3和/或抗體1的LCDR1、LCDR2和/或LCDR3,如抗體1的CDRs組的結(jié)合成員。結(jié)合成員可以包含抗體1的VHCDRs組。任選地，它也可以包含抗體1的VLCDRs組，并且所述VLCDRs可以與VHCDRs來自相同或不同的抗體。本發(fā)明也提供了包含抗體1的HCDRs組的VH結(jié)構(gòu)域和/或包含抗體1的LCDRs組的VL結(jié)構(gòu)域。典型;也，VH結(jié)構(gòu)域與VL結(jié)構(gòu)域配對(duì)，以提供抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)，但如下文件進(jìn)一步討論的，可以用單獨(dú)的VH或VL來結(jié)合抗原?？贵w1VH結(jié)構(gòu)域可以與抗體1VL結(jié)構(gòu)域配對(duì)，4吏得形成包含抗體1VH和VL結(jié)構(gòu)域這兩者的抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)。在其他實(shí)施方案中，抗體IVH與抗體1VL之外的VL結(jié)構(gòu)域配對(duì)。本領(lǐng)域充分描述了輕鏈混雜。因此，抗體1的VH可以與抗體1或其他抗體的VL配對(duì)。結(jié)合成員可以包含抗休1的H和/或LCDRs組，其中具有^》開的H和/或LCDRs組內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸突變。突變可以是氨基酸取代、插入或缺失。因此，例如，在H和/或LCDRs組內(nèi)，可以存在最多10、9、8、7、6、5、4、3或2個(gè)突變，如取代。例如，HCDR3中可以存在1個(gè)或最多5、4、3或2個(gè)突變，如取代，和/或LCDR3中可以存在1個(gè)或最多5、4、3或2個(gè)突變，如取代。結(jié)合成員可以包括在抗體構(gòu)架區(qū)內(nèi)具有一個(gè)或多個(gè)CDRs,如CDRs組的抗體分子。例如，抗體的一個(gè)或多個(gè)CDRs或CDRs組可以移植到構(gòu)架區(qū)(如人構(gòu)架區(qū))中，以提供抗體分子。構(gòu)架區(qū)可以是人種系基因片,殳序列的構(gòu)架區(qū)。因此，構(gòu)架區(qū)可以種系化，從而改變構(gòu)架區(qū)內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)殘基，以匹配最相似的人種系構(gòu)架區(qū)中等同位置上的殘基。本發(fā)明的結(jié)合成員可以是分離的人抗體分子，其具有包含人種系構(gòu)架區(qū)中的HCDRs組的VH結(jié)構(gòu)域，如人種系構(gòu)架區(qū)，如人VH3-23。通常，結(jié)合成員也具有包含例如人種系構(gòu)架區(qū)中的LCDRs組的VL結(jié)構(gòu)域，如人VKlL12。種系化的VH或VL結(jié)構(gòu)i或可以在或不在一個(gè)或多個(gè)Vernier殘基上種系化。非種系化的抗體分子與種系化的抗體分析相比，具有相同的CDRs,但不同的構(gòu)架區(qū)。在本文所附序列表中顯示的抗體1的抗體序列是種系化的。如本文實(shí)施例中的描述，從分離的抗體lVH和VL結(jié)構(gòu)域種系化，包括在VH結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生以下突變Q1E,V5L,R16G,V23A,G24A,H39Q,G83R和R105Q;和在VL結(jié)構(gòu)域中產(chǎn)生以下突變I15V，A58V和D70E。因此，一方面，本發(fā)明的VH結(jié)構(gòu)域(包括含有所述VH結(jié)構(gòu)域的結(jié)合成員)可以包含SEQIDN0:2中的氨基酸序列，但是上述VH突變中的l個(gè)或多個(gè)，如2、3、4、5、6、7或全部8個(gè)一皮取消。在一個(gè)實(shí)施方案中，VH結(jié)構(gòu)域在SEQIDNO.2的第30、97和98位不被取代。類似地，本發(fā)明的VL結(jié)構(gòu)域可以包含SEQIDNO:7中的氨基酸序列，但是上述l、2或全部3個(gè)突變被取消。在一個(gè)實(shí)施方案中，VL在SEQIDNO.7的第2位不一皮取代。一方面，本發(fā)明的結(jié)合成員可以包含(i)在一個(gè)或多個(gè)構(gòu)架區(qū)中包含氨基酸序列SEQIDNO:2或具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸改變(如取代)(如1、2、3、4、5、6、7或8個(gè)取4戈)的氨基酸序列SEQIDNO:2的VH結(jié)構(gòu)域；和(ii)在一個(gè)或多個(gè)構(gòu)架區(qū)中包含SEQIDNO:7中的氨基酸序列或具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸改變(如取代)(如1、2或3個(gè)取代)的氨基酸序列SEQIDNO:2的VL結(jié)構(gòu)域。在這方面的一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合成員(如IgG)的VH結(jié)構(gòu)域在SEQIDNO.2的第30、97和98位中的一個(gè)或全部位置上不一皮取代，并且VL結(jié)構(gòu)域在SEQIDNO:7的第2位上不一皮取代。VH結(jié)構(gòu)域可以包含SEQIDNO:2中的氨基酸序列或可以包含具有以下氨基酸取代中的一個(gè)或多個(gè)取代(如1、2或全部)的SEQIDNO:2中的氨基酸序列G30S;T97A;R98K。VL結(jié)構(gòu)域可以包含SEQIDNO:7中的氨基酸序列或可以包含具有以下氨基酸取代中的SEQIDNO:2中的氨基酸序列T2Ile。本文提供的抗體1的數(shù)據(jù)是針對(duì)種系化的和/或非種化的形式顯示的，并且在合適的時(shí)候指出。對(duì)于以種系化的形式測(cè)試的抗體，與非種系化的形式相比，獲得了非常相似的數(shù)據(jù)。在抗體1的表達(dá)的scFv和IgG序列中包括了在該抗體的KVL結(jié)構(gòu)域的核苷酸和氨基酸序列中顯示的3，cgt密碼子和相應(yīng)精氨酸殘基。序列的C末端精氨酸殘基相應(yīng)于Kabat殘基108。下文解釋了該殘基及編碼它的三聯(lián)密碼子cgt的來源。為了表達(dá)IgG的輕鏈，提供了編碼抗體輕鏈的核苷酸序列，其中包含編碼VL結(jié)構(gòu)域的第一外顯子、編碼CL結(jié)構(gòu)域的第二外顯子、和分隔第一外顯子和第二外顯子的內(nèi)含子。在正常情況下，內(nèi)含子通過細(xì)胞mRNA加工機(jī)制剪切下來，使第一外顯子的3'末端與第二外顯子的5'末端連接起來。這樣，當(dāng)具有所述核苷酸序列的DNA表達(dá)為RNA時(shí)，第一和第二外顯子一起剪接。剪接過的RNA的翻譯產(chǎn)生了包含VL結(jié)構(gòu)域和CL結(jié)構(gòu)域的多肽。剪接后，Kabat殘基108處的Arg由VL結(jié)構(gòu)域構(gòu)架區(qū)4序列的最后一個(gè)堿基(c)和CL結(jié)構(gòu)域的前兩個(gè)堿基(gt)編碼。Kabat殘基108處的精氨酸殘基可以認(rèn)為是抗體分子的VL結(jié)構(gòu)域的C末端殘基。本發(fā)明的結(jié)合成員可以與任何具有以下性質(zhì)的結(jié)合成員竟?fàn)幗Y(jié)合CXCL13:(1)結(jié)合CXCL13和(ii)包含本文乂)開的結(jié)合成員、VH和/或VL結(jié)構(gòu)域、CDR如HCDR3,和/或CDRs組。一方面，本發(fā)明提供了結(jié)合成員，其竟?fàn)幗Y(jié)合具有SEQIDNO:11的scFv抗體分子。SEQIDNO:11中的序列相應(yīng)于通過接頭序歹'KGlyl20至Serl34)與SEQIDNO:7的VL結(jié)構(gòu)域連接的SEQIDNO:2的VH結(jié)構(gòu)域。結(jié)合成員可以包括本文其他地方描述的抗體1的CDR或CDRs組或其變體。結(jié)合成員可以是本文其他地方描述的抗體分子，如IgG(如IgGl)或scFv。結(jié)合成員在竟?fàn)帨y(cè)定中可以顯示完全或部分竟?fàn)?。例如，在竟?fàn)帨y(cè)定中結(jié)合成員可以顯示對(duì)結(jié)合CXCL13的至少50,55,60，65,70,75，80，85,90,95,97,99或100%竟?fàn)?，例如，與具有SEQIDNO:11的抗體scFv分子竟?fàn)??？梢匀菀椎卦隗w外測(cè)定結(jié)合成員之間的竟?fàn)?，例如，采用ELISA和/或通過標(biāo)記一個(gè)結(jié)合成員的特異性報(bào)道分子，所述結(jié)合成員可以在一個(gè)或多個(gè)其他未標(biāo)記的結(jié)合成員存在下被檢測(cè)到，從而使得能夠鑒定出結(jié)合相同表位或重疊表位的結(jié)合成員。所述方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的，并且在本文中更詳細(xì)描述。例如，可以使用本文中聯(lián)系CAMP測(cè)定描述的TRF-FRET技術(shù)的表位竟?fàn)帨y(cè)定(TRF-FRET表位竟?fàn)帨y(cè)定)，如HTRF表位竟?fàn)帨y(cè)定。本文聯(lián)系cAMP描述了HTRF⑧技術(shù)。HTRF⑧表位竟?fàn)帨y(cè)定典型地包括混合XL665標(biāo)記的CXCL13、銪穴狀化合物標(biāo)記的參照抗體(如具有SEQIDNO:11的scFv抗體分子)和測(cè)試結(jié)合成員；施加337nm處的光(從而激發(fā)銪穴狀化合物供體)；通過TRF確定620nm(供體)和665nm(受體)處的熒光信號(hào)；以及將信號(hào)665nm/620nm的比值確定為發(fā)生的FRET的測(cè)量值。與參照抗體竟?fàn)幗Y(jié)合CXCL13的受試結(jié)合成員，如IgG或scFv抗體分子，減少發(fā)生的FRET。該測(cè)定的詳細(xì)方法提供在實(shí)施例中。因此，本發(fā)明的另一方面提供了包含與抗體分子竟?fàn)幗Y(jié)合CXCL13的人抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合成員，所述抗體分子例如特別是包含抗體1的VH和/或VL結(jié)構(gòu)域、CDR如HCDR3或CDRs組的抗體分子。在本發(fā)明的另一方面，提供了包含人抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合成員，所述人抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)與抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)竟?fàn)幗Y(jié)合CXCL13的，其中后一抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)由VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域組成，并且其中所述VH和VL結(jié)構(gòu)域包含本文7>開的抗體1的CDRs組。本發(fā)明的結(jié)合成員可以結(jié)合人CXCL-13的表位，其中所述表位包括成熟的人IL-17A的31-42位上的序列Ile-Leu-Pro-Arg-Gly-Asn-Gly-Cys-Pro-Arg-Lys誦Glu(SEQIDNO:20)的至少一個(gè)殘基。它可以例如結(jié)合SEQIDNO:20的1、2、3、4、5或5個(gè)以上的殘基。除SEQIDNO:20夕卜，本發(fā)明的結(jié)合成員還可以結(jié)合人CXCL-13的其他區(qū)域。任何合適的方法可以用于確定由結(jié)合成員結(jié)合的殘基的序列，所述方法如氳-氘交換、定點(diǎn)誘變、質(zhì)譜、NMR和X線結(jié)晶學(xué)。肽酰胺氫交換是非常充分描述的用于研究蛋白的方法(Englander,S.W.等MethodsEnzymol.232:26-42,1994)。最近，進(jìn)一步開發(fā)了該方法，以便使用能夠交換質(zhì)子的氘標(biāo)記的蛋白，并且將該方法與質(zhì)譜法偶聯(lián)，以測(cè)量3爭(zhēng)整個(gè)蛋白的交換速度(Pantazatos,D.等Proc.Natl.Acad.Sci.101(3):751-756，2004)。通過對(duì)溶劑的可接近性，可以顯著改變氫/氘交換(H/D交換)的該速度，使得當(dāng)?shù)鞍椎囊徊糠謪⑴c結(jié)合另一分子時(shí)，交換的速度將顯著減慢。已經(jīng)用該方法對(duì)參與與抗體的相互作用的蛋白的區(qū)域作圖，并且用于研究參與本發(fā)明的結(jié)合抗體的CXCL-13的區(qū)域，如本文實(shí)施例7的詳細(xì)描述。聯(lián)合使用質(zhì)語和H/D交換，以鑒定與結(jié)合成員接觸的人CXCL-13的區(qū)域。例如，可以證明當(dāng)人CXCL-13與本發(fā)明的結(jié)合成員結(jié)合時(shí)，SEQIDNO:20內(nèi)的殘基的H/D交換會(huì)顯著減慢。在其他方面，本發(fā)明提供了包含編碼本發(fā)明的結(jié)合成員、VH結(jié)構(gòu)域和/或VL結(jié)構(gòu)域的序列的分離的核酸和制備本發(fā)明的結(jié)合成員、VH結(jié)構(gòu)域和/或VL結(jié)構(gòu)域的方法，所述方法包括在使得能夠產(chǎn)生所述結(jié)合成員、VH結(jié)構(gòu)域和/或VL結(jié)構(gòu)域的條件下表達(dá)所述核酸，并且回收所述結(jié)合成員、VH結(jié)構(gòu)域和/或VL結(jié)構(gòu)域。的核酸，通常是分離的。另一方面提供了含有本發(fā)明的核酸或用本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。們?cè)谝种坪?或中和CXCL13的方法，包括通過療法治療人體或動(dòng)物體的方法中的用途。本發(fā)明的結(jié)合成員可以用于治療或診斷方法中，例如治療人體或動(dòng)物體中(例如人患者中)的疾病或病癥的治療(其可以包括預(yù)防性處理)方法中，其包括給所述患者施用有效量的本發(fā)明的結(jié)合成員?？梢愿鶕?jù);也方i,細(xì)"i寸i侖的。本發(fā)明的這些和其他方面在下文進(jìn)一步詳細(xì)描述。可以在本文中方便地指出本文使用的"和/或"認(rèn)為是這兩種指定特征和/或組分中每一種(具有或不具有另一種)的具體公開。例如，"A和/或B，，認(rèn)為是以下每一種情況的具體公開(i)A,(ii)B以及(iii)A和B,正如本文中單獨(dú)闡述其中的每一種。CXCL13是趨化因子(C-X-C基序)配體13。全長(zhǎng)人CXCL13的序列以保藏號(hào)NP—006410SEQIDNO:12保藏。全長(zhǎng)氨基酸序列包括22個(gè)殘基的N末端肽，其體內(nèi)切割產(chǎn)生成熟形式。成熟CXCL13具有氨基酸序列SEQIDNO:13。成熟CXCL13是用于治療和診斷應(yīng)用的體內(nèi)靶抗原，本文提到人CXCL13時(shí)是指成熟CXCL13,除非特別指出。對(duì)于本文描述的某些測(cè)定和實(shí)-驗(yàn)，人CXCL13在MEL細(xì)胞系中表達(dá)。在C末端截短從MEL細(xì)胞表達(dá)的人CXCL13,并且其氨基酸序列是SEQIDNO:14。這樣，SEQIDNO:14是本文描述的測(cè)定中使用的MEL表達(dá)的人CXCL13。成熟、未截短的CXCL13(SEQIDNO:13)也將適用于測(cè)定中，并且不認(rèn)為截短會(huì)影響獲得的結(jié)果。在本文描述的一些測(cè)定中使用生物素化的人CXCL13。該CXCL13是合成產(chǎn)生的，并且具有成熟CXCL13序列SEQIDNO:13,其在最C末端的賴氨酸殘基攜帶生物素。在一些實(shí)施方案中，CXCL13可以是獼猴CXCL13。當(dāng)從MEL細(xì)胞表達(dá)用于本文的實(shí)馬全工作時(shí)，獼猴CXCL13從C末端截短5個(gè)氨基酸，并且具有氨基酸序列SEQIDNO:16。計(jì)劃的成熟的未截短獼猴CXCL13的序列是SEQIDNO15。如所示的，對(duì)于人和獼猴CXCL13,完全未截短的獼猴序列計(jì)劃在C末端包括KRKIP。這樣假定是因?yàn)橛糜诳寺〉墨J猴引物設(shè)計(jì)為與從成熟的人CXCL13去除(當(dāng)其截短時(shí))的區(qū)域退火。成熟的、未截短的CXCL13(SEQIDNO:15)也將適用于測(cè)定中，并且不認(rèn)為截短會(huì)影響獲得的結(jié)果。如本文其他地方描述的，CXCL13可以是重組的和/或可以是糖基4t或非糖基化的。糖基化和/或非糖基化的CXCL13可以在重組系統(tǒng)中表達(dá)，例如，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞如人細(xì)胞系、鼠細(xì)胞系如MEL細(xì)胞或中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞中。CXCR5是本文其他地方描述的CXCL13受體。人CXCR5以兩種同工型存在。CXCR5同工型1的氨基酸序列以保藏號(hào)NP一001707保藏，并且在本文表示為SEQIDNO:17。CXCR5同工型2的氨基酸序列以保藏號(hào)NP_116743保藏，并且在本文表示為SEQIDNO:18。同工型2在N末端截短45個(gè)氨基酸。因此，同工型2缺乏變體1的翻譯起始密碼23子和胞外域，并且不太可能結(jié)合配體，并且不太可能是功能性的。具有SEQIDNO:17的人CXCR5的同工型1用于本文的實(shí)驗(yàn)中。因此，本文提到的CXCR5是指人同工型1,除非特別指出。如上下文指出的，本文提到的CXCR5可以是人或非人的。例如，在使用人CXCL13或非人CXCL13的中和測(cè)定中，可以選擇來自合適物種的CXCR5。合適的物種可以是人或非人CXCR5，其中結(jié)合配偶體是來自相同物種的人或非人CXCL13?；蛘撸嘶蚍侨薈XCL13可以用于采用來自不同物種的人或非人CXCR5的測(cè)定中，其中已知人或非人CXCL13交叉反應(yīng)。結(jié)合成員這描述了彼此結(jié)合的一對(duì)分子的一個(gè)成員。結(jié)合對(duì)的成員可以是天然來源的或完全或部分合成產(chǎn)生的。這對(duì)分子的一個(gè)成員在其表面或腔特定空間和極性組構(gòu)。結(jié)合對(duì)的類型的實(shí)例是抗原-抗體、生物素-親和素、激素-激素受體、受體-配體和酶-底物。本發(fā)明涉及抗原-抗體型反應(yīng)。結(jié)合成員通常包括具有抗原結(jié)合位點(diǎn)的分子。例如，結(jié)合成員可以是包含抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體分子或非抗體蛋白?？梢酝ㄟ^在非抗體蛋白支架，如纖連蛋白或細(xì)胞色素B等[2,3,4]上排列CDRs或通過使蛋白支架內(nèi)的環(huán)的氨基酸殘基隨機(jī)化或突變以賦予對(duì)所需輩巴的結(jié)合特異性的方式，提供抗原結(jié)合位點(diǎn)。用于對(duì)蛋白中的新的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行工程化的支架由Nygren等詳細(xì)綜述[4]?？贵w才莫擬物的蛋白支架公開于WO/0034784,其在此全文引入作為參考，其中發(fā)明人描述了包括具有至少一個(gè)隨機(jī)化環(huán)的纖連蛋白III型結(jié)構(gòu)域的蛋白(抗體模擬物)?？梢杂擅庖咔虻鞍谆虺易宓娜魏谓Y(jié)構(gòu)域成員提供移植了一個(gè)或多個(gè)CDRs，如HCDRs組的合適支架。支架可以是人或非人蛋白。非抗體蛋白支架的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是它可以在比至少一些抗體分子更小和/或更容易制備的支架分子中提供抗原結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)合成員的小尺寸可以f武予有用的生理特性，如進(jìn)入細(xì)^^、深入穿透組織或到達(dá)其他結(jié)構(gòu)中的革巴，或在靼抗原的蛋白腔內(nèi)結(jié)合的能力。非抗體蛋白支架中的抗原結(jié)合位點(diǎn)的用途綜述于Wess,2004[5]。典型的是具有穩(wěn)定骨架和一個(gè)或多個(gè)可變環(huán)的蛋白，其中環(huán)的氨基酸序列是特異性或隨機(jī)突變的，以產(chǎn)生結(jié)合耙抗原的抗原結(jié)合位點(diǎn)。所述蛋白包括來自金黃色葡萄球菌的蛋白A的IgG結(jié)合域、轉(zhuǎn)鐵蛋白、四連蛋白、纖連蛋白(如第IO個(gè)纖連蛋白III型結(jié)構(gòu)域)、脂籠蛋白，以及y晶體和其他AffilmTM支架(ScilProtems)。其他方法的實(shí)例包括基于植物環(huán)蛋白(cyclotides)的合成"微體(Microbodies)",即具有分子內(nèi)二硫鍵的小蛋白、微蛋白(VersabodiesTM,Amunix)禾口4苗蛋白重復(fù)蛋白(DARPins,MolecularPartners)。除了抗體序列和/或抗原結(jié)合位點(diǎn)，本發(fā)明的結(jié)合成員可以包含其他氨基酸，例如，形成肽或多肽，如折疊結(jié)構(gòu)域，或給分子賦予除結(jié)合抗原的能力之外的其他功能特征。本發(fā)明的結(jié)合成員可以攜帶可檢測(cè)標(biāo)記，或可以與毒素或?qū)虿糠只蛎妇Y合(如通過肽鍵或接頭)。例如，結(jié)合成員可以包含催化位點(diǎn)(如在酶結(jié)構(gòu)域中)和抗原結(jié)合位點(diǎn)，其中抗原結(jié)合位點(diǎn)與抗原結(jié)合，由此將催化位點(diǎn)導(dǎo)向于抗原。催化位點(diǎn)可以抑制抗原的生物功能，如通過切割。盡管如指出的，CDRs可以由非抗體支架攜帶，本發(fā)明的攜帶CDR或CDRs組的結(jié)構(gòu)一般將是抗體重鏈或輕鏈序列或其主要部分，其中CDR或CDRs組位于相應(yīng)于由重排的免疫球蛋白基因編碼的天然存在的VH和VL抗體可變區(qū)的CDR或CDRs組的位置。免疫球蛋白可變區(qū)的結(jié)構(gòu)和位置可以參照Kabat,等，1987[6]及其中的更新內(nèi)容而確定。許多學(xué)術(shù)和商業(yè)在線資源可以用于查詢?cè)摂?shù)據(jù)庫。例如，參見參考文獻(xiàn)[7]及目前CDR區(qū)或CDR意欲表示Kabat爭(zhēng)1991[8]以及后期版本定義的免疫球蛋白的重鏈和輕鏈的高變區(qū)?？贵w典型地包含3個(gè)重鏈CDRs和3個(gè)輕鏈CDRs。術(shù)語CDR或CDRs在本文中用于根據(jù)情況表示這些區(qū)域中的一個(gè)，或這些區(qū)域中的一些，或甚至全部，其含有大多數(shù)負(fù)責(zé)通過抗體對(duì)抗原或其識(shí)別的表位的親和力而進(jìn)行的結(jié)合的氨基酸。在6個(gè)短的CDR序列中，重鏈的第三個(gè)CDR(HCDR3)具有更大的尺寸可變性(基本由于產(chǎn)生它的基因的排列機(jī)制而具有更大的多樣性)。它可以短至2個(gè)氨基酸，但已知最長(zhǎng)的尺寸是26。CDR長(zhǎng)度也可以根據(jù)能夠由特定的作為基礎(chǔ)的構(gòu)架區(qū)容納的長(zhǎng)度而改變。功能上，HCDR3硇宗抗汰的^尿村的決寧中扭部公作用「9,]0，11,12,13,14,15,16]?？贵w分子這描述了一種免疫球蛋白，無論是天然或部分或完全合成產(chǎn)生的。該術(shù)語也涵蓋了包含抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)的任何多肽或蛋白。此處必須理解，本發(fā)明不涉及天然形式的抗體，也就是說，它們不是在它們的天然環(huán)境中，而是它們能夠通過從天然來源純化而分離或純化，或通過基因重組獲得，或通過化學(xué)合成活動(dòng)，并且它們可以含有后文將描述的非天然氨基酸。包含抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體片段包括但不限于諸如Fab,Fab，，F(xiàn)ab，-SH,scFv,Fv,dAb和Fd的分子。已經(jīng)工程化了包含一個(gè)或多個(gè)抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)的許多其他抗體分子，包括例如Fab2,Fab3,雙抗體(diabodies),三i元體(triabodies),四#元體(tetrabodies)禾口樣吏4元體(mimbodies)?？贵w分子以及構(gòu)建和使用它們的方法描述于[17]中?？梢圆捎脝慰寺】贵w和其他抗體，并且采用重組DNA技術(shù)來生產(chǎn)結(jié)合靶抗原的其他抗體或嵌合分子。所述技術(shù)可以涉及將編碼抗體的免疫球蛋白可變區(qū)或CDRs的DNA導(dǎo)入不同免疫球蛋白的恒定區(qū)或恒定區(qū)加構(gòu)架區(qū)。參見例如EP-A-184187、GB2188638A或EP-A-239400,以及大量后續(xù)文獻(xiàn)。產(chǎn)生抗體的雜交瘤或其他細(xì)胞可以進(jìn)行基因突變或可以通過多種方式修飾抗體，術(shù)語"抗體分子"應(yīng)該解釋為涵蓋任何具有抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合成員或物質(zhì)，所述位點(diǎn)具有需要的對(duì)抗原的特異性和/或結(jié)合抗原。因此，該術(shù)語涵蓋抗體片段和衍生物，包括任何含有抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)的多肽，無論是天然或完全或部分合成的。因此，包括了嵌合分子，其包含與另一多肽(如來源于另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類型或亞類)融合的抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)或等同物。嵌合抗體的克隆和表達(dá)描述于EP-A-0120694和EP-A-0125023以及大量后續(xù)文獻(xiàn)中?？贵w工程化領(lǐng)域可以獲得的其他技術(shù)使得能夠分離人和人源化抗體。例如，可以按照Kontermann&Dubel[18]的描述制備人雜交瘤。噬菌體展示，即用于制備結(jié)合成員的另一確立的技術(shù)，已經(jīng)在很多公開文獻(xiàn)中描述，如Kontermann&Dubel[18]和WO92/01047(下文進(jìn)一步討i侖)和美國(guó)專利US5969108,US5565332,US5733743,US5858657,US5871907,US5872215,US5885793,US5962255,US6140471,US6172197,US6225447,US6291650,US6492160,US6521頓?？梢詫⑥D(zhuǎn)基因小鼠用于分離人抗體，其中小鼠抗體基因被滅活，并且用人抗體基因功能性取代，而留下小鼠免疫系統(tǒng)的完整的其他成分[19]?？梢杂帽绢I(lǐng)域已知的4支術(shù)制備人源化抗體，如7>開于例如WO91/09967，US5,585,089,EP592106,US565,332和WO93/17105中的那些技術(shù)。此外，WO2004/006955描述了用于對(duì)抗體進(jìn)4亍人源4^的方法，所述方法基于通過比較非人抗體可變區(qū)的CDR序列的規(guī)范CDR結(jié)構(gòu)類型與來自人抗體序列文庫的相應(yīng)CDRs的規(guī)范CDR結(jié)構(gòu)類型(如種系抗體基因片段)而從人抗體基因選擇可變區(qū)構(gòu)架區(qū)序列。與非人CDRs具有相似規(guī)范CDR結(jié)構(gòu)類型的人抗體可變區(qū)形成了一個(gè)亞群的成員人抗體序列，從其選才奪人構(gòu)架區(qū)序列。該亞群成員可以才艮據(jù)人和非人CDR序列之間的氨基酸相似性進(jìn)一步排序。在WO2004/006955的方法中，排序在前面的序列被選擇用于提供構(gòu)架區(qū)序列，其用于采用選擇的亞群成員人構(gòu)架區(qū)，構(gòu)建用非人CDR對(duì)應(yīng)物功能上替代人CDR序列的嵌合抗體，從而提供具有高親和力和低免疫原性的人源化抗體，而無需比較非人和人抗體之間的構(gòu)架區(qū)序列。也公開了根據(jù)該方法制備的嵌合抗體?？梢詮耐ㄟ^在合適的表達(dá)載體內(nèi)合成和組裝的寡核苷酸產(chǎn)生的基因進(jìn)行表達(dá)，建立合成的抗體分子，如Knappik等[20]或Krebs等[21]中的描述。已經(jīng)顯示了完整抗體的片段能夠行使結(jié)合抗原的功能。結(jié)合片段的實(shí)例是(i)由VL,VH,CL和CH1結(jié)構(gòu)域組成的Fab片段；(ii)由VH和CH1結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；(iii)由單個(gè)抗體的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段；(iv)由VH或VL結(jié)構(gòu)域組成的dAb片段[22,23，24];(v)分離的CDR區(qū)；(vi)F(ab')2片段，即一種包含兩個(gè)連接的Fab片段的二價(jià)片段；(vii)單鏈Fv分子(scFv),其中VH和VL結(jié)構(gòu)域由允許這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域締合形成抗原結(jié)合位點(diǎn)的肽接頭連接[25,26];(viii)雙特異性單鏈Fv二聚體(PCT/US92/09965)和(ix)"雙抗體",即通過基因融合構(gòu)建的多價(jià)或多特異性片段(WO94/13804;[27])?？梢酝ㄟ^4參入連"l妾VH和VL結(jié)構(gòu)域的二硫橋而穩(wěn)定Fv、scFv或雙抗體分子[28]。也可以制備包含與CH3結(jié)構(gòu)域連接的scFv的微抗體[29]。結(jié)合片段的其他實(shí)例是Fab',其與Fab片段的差異在于在重鏈CH1結(jié)構(gòu)域的羧基末端添加了幾個(gè)殘基，包括一個(gè)或多個(gè)來自抗體鉸鏈區(qū)的半胱氨酸和Fab，-SH,后者是一種Fab'片段，27其中恒定區(qū)的半胱氨酸殘基攜帶游離硫醇基團(tuán)?？梢酝ㄟ^諸如由酶，例如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化或/或通過化學(xué)還原裂解二硫鍵的方法從抗體分子1開始獲得本發(fā)明的抗體片段。以另因重組技術(shù)等或通過肽合成而獲得，所述肽合成是通過例如自動(dòng)化肽合成儀(例如AppliedBiosystems公司等提供的)，或通過核酸合成和表達(dá)。本發(fā)明的功能性抗體片段包含任何可以通過化學(xué)修飾而增加半衰期的功能性片段，所述化學(xué)修飾特別是通過聚乙二醇化或通過摻入到脂質(zhì)體中。dAb(結(jié)構(gòu)域抗體)是抗體的小單體抗原結(jié)合片段，即抗體重鏈或輕鏈的可變區(qū)[24]。VHdAbs天然存在于駱駝?lì)?如^4它、美洲駝)中，并且可以通過以下方法產(chǎn)生用靶抗原免疫駱駝?lì)?，分離抗原特異性B細(xì)胞，并且從單個(gè)B細(xì)胞直接克隆dAb基因。dAbs也可以在細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生。它們的小尺寸、良好的溶解度和溫度穩(wěn)定性使得它們?cè)谏韺W(xué)上特別有用，并且適用于選才奪和親和力成熟。正在開發(fā)駱駝?lì)怴Hdabs,用于在名稱"nanobodiesTM"下的使用。本發(fā)明的結(jié)合成員可以是dAb,其包含基本如本文所闡述的VH或VL結(jié)構(gòu)域，或包含基本如本文所闡述的CDRs組的VH或VL結(jié)構(gòu)域。雙特異性或雙功能抗體形成第二代單克隆抗體，其中兩個(gè)不同的可變區(qū)組合成同一分子[30]。已經(jīng)在診斷領(lǐng)域和治療領(lǐng)域證明了它們的用途，從它們募集新效應(yīng)物的能力到靶定腫瘤細(xì)胞表面上的一些分子的能力。當(dāng)要使用雙特異性抗體時(shí)，它們可以是常規(guī)的雙特異性抗體，其可以通過多種途徑制備[31],例如，化學(xué)制備或從雜交瘤制備，或可以是上文提到的任何雙特異性抗體片段?？梢酝ㄟ^化學(xué)方法[32，33]或體細(xì)胞方法[34,35]獲得這些方法，但是同樣地并且優(yōu)選地通過基因工程技術(shù)，其允許進(jìn)行異二聚化，并且由此促進(jìn)尋求的抗體的純化過程[36]。雙特異性抗體的實(shí)例包括BiTETM技術(shù)的抗體，其中可以使用具有不同特異性的兩個(gè)抗體的結(jié)合域，并且通過短的柔性肽直接連接。這在短的單多肽《連上組合了兩個(gè)抗體?？梢証叉僅用可變區(qū)而不《吏用Fc區(qū)構(gòu)建雙抗體和scFv，優(yōu)先降低抗獨(dú)特型反應(yīng)的效果。可以將雙特異性抗體構(gòu)建為完整IgG,構(gòu)建為雙特異性Fab'2，構(gòu)建28為Fab'PEG，構(gòu)建為雙抗體或構(gòu)建為雙特異性scFv。此外，可以用本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法連接雙特異性抗體，以形成四價(jià)抗體。雙特異性雙抗體(與雙特異性完整抗體相反)也可以是特別有用的，因?yàn)樗鼈兛梢匀菀椎卦诖竽c桿菌中構(gòu)建和表達(dá)。具有合適結(jié)合特異性的雙抗體(和很多其他多肽，如抗體片段)可以采用從文庫進(jìn)行噬菌體展示(WO94/13804)而容易地選擇。如果雙抗體的一個(gè)臂保持恒定，例如，具有針對(duì)CXCL13的特異性，則可以制備文庫，其中另一個(gè)臂改變，并且選擇具有合適特異性的抗體。雙特異性完整抗體可以通過Ridgeway等，1996[37]中描述的替代工程化方法制備。本領(lǐng)域有多種方法可以用于獲得抗CXCL13的抗體。所述抗體可以是單克隆抗體，特別是人、鼠、嵌合或人源化來源，其可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)方法獲得。通常，為了制備單克隆抗體或它們的功能性片段，特別是鼠來源的單克隆抗體或它們的功能性片段，可以參照特別是描述于手冊(cè)"抗體"[38]中的技術(shù)或K6hler和Milstem[39]描述的從雜交瘤制備的技術(shù)。可以例如從抗CXCL13或其含有由所述單克隆抗體識(shí)別的表位的片段之一免疫的動(dòng)物細(xì)胞獲得單克隆抗體。本文描述了包含它們的合適的片l殳和肽或多肽，并且可以用于免疫動(dòng)物，以產(chǎn)生抗CXCL13的抗體。可以特別才艮據(jù)通常的工作方法，通過以編碼CXCL13或其片|￡的cDNA序列中包含的核酸序列開始的基因重組，通過從包含在CXCL13和/或其片段的肽序列中的氨基酸序列開始的肽合成，生產(chǎn)所述CXCL13或其片段之一?？梢岳缭谟H和柱上純4匕單克隆抗體，在所述柱上以前已經(jīng)固定了CXCL13或其含有由所述單克隆抗體識(shí)別的表位的片段之一。更具體地，可以通過以下方法純化單克隆抗體在蛋白A和/或G上層析，然后進(jìn)行或不進(jìn)行目標(biāo)在于消除殘留蛋白污染物以及DNA和LPS自身的離子交換層析，然后進(jìn)行或不進(jìn)行在瓊脂糖凝膠上的排阻層析，以消除由于存在二聚體或其他多聚體而導(dǎo)致的可能聚集物。在一個(gè)實(shí)施方案中，這些技術(shù)的全部可以同時(shí)或連續(xù)使用?？乖Y(jié)合位點(diǎn)這描述了分子的部分，其結(jié)合并且互補(bǔ)于靶抗原的全部或部分。在抗體分子中，它稱作抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)，并且包含抗體的部分，所述部分結(jié)合并且互補(bǔ)于靶抗原的全部或部分。當(dāng)抗原是大抗原時(shí)，抗體可以^又僅結(jié)合抗原的特定部分，所述部分稱作表位。可以由一個(gè)或多個(gè)抗體可變區(qū)提供抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)?？贵w抗原結(jié)合位點(diǎn)可以包含抗體輕鏈可變區(qū)(VL)和抗體重鏈可變區(qū)(VH)。分離的這表示一種狀態(tài)，其中本發(fā)明的結(jié)合成員，或編碼所述結(jié)合成員的核酸通常是根據(jù)本發(fā)明的。因此，本發(fā)明的結(jié)合成員、VH和/或VL結(jié)構(gòu)域和編碼核酸分子和載體可以例如，以基本上純的或均相形式從其天然環(huán)境分離和/或純化提供，或在核酸的情況下，不含或基本不含除了編碼具有所需功能的多肽的序列之外的來源的核酸或基因。分離的成員和分離的核酸將不含或基本不含它們天然相關(guān)的材料，例如與它們一起在它們的天然環(huán)境或制備它們的環(huán)境(如細(xì)胞培養(yǎng)物)中存在的其他多肽或核酸(當(dāng)所述制備是通過體外或體內(nèi)實(shí)施的重組DNA技術(shù)時(shí))。可以用稀釋劑或佐劑配制成員和核酸，并且為了實(shí)施的目的仍然是分離的一例如，如果用于包被用于免疫測(cè)定中的微量滴定板，該成員通常將與明膠或其他載體混合，或當(dāng)用于診斷或治療中時(shí)，將與藥學(xué)可接受的載體或稀釋劑混合。結(jié)合成員可以天然或通過異源真核細(xì)胞(如CHO或NSO((ECACC85110503)細(xì)胞)的系統(tǒng)糖基化，或它們可以是(例如，如果通過在真核細(xì)^^中表達(dá)而生產(chǎn))非糖基化的。包含抗CXCL13抗體分子的異源制劑也形成本發(fā)明的一部分。例如，所述制劑可以是具有全長(zhǎng)重鏈和缺乏C末端賴氨酸的重鏈的抗體的混合物，所述重鏈具有各種程度的糖基化和/或具有衍生的氨基酸，例如，N末端谷氨酸的環(huán)化，以形成焦谷氨酸殘基。本文用到的短語"基本如所述的"是指本文描述的結(jié)合成員的VH或VL結(jié)構(gòu)域的相關(guān)CDRs的特征將與指定區(qū)域相同或高度相似，本文闡述了所述指定區(qū)域的序列。如本文所述的，針對(duì)一個(gè)或多個(gè)可變區(qū)的指定區(qū)域的術(shù)語"高度相似的"，意欲表示可以在CDR和/或VH或VL結(jié)構(gòu)域中進(jìn)行1-約5個(gè)，例如l-4個(gè)，包括l-3，或l-2或3或4個(gè)氨基酸取代。發(fā)明詳述如上文指出的，本發(fā)明的結(jié)合成員結(jié)合CXCL13并且可以中和CXCL13的生物活性。本發(fā)明的結(jié)合成員可以進(jìn)行效價(jià)優(yōu)化，以進(jìn)一步改進(jìn)其中和效價(jià)。通常，效價(jià)優(yōu)化涉及使選擇的結(jié)合成員的序列(通常是抗體可變區(qū)序列)突變，以產(chǎn)生結(jié)合成員的文庫，隨后測(cè)定效價(jià)，并且選擇更有效的結(jié)合成員。這樣，選擇的"效價(jià)優(yōu)化的"結(jié)合成員傾向于具有比來自產(chǎn)生文庫的結(jié)合成員更高的效價(jià)。然而，可以獲得高效價(jià)結(jié)合成員，而無需優(yōu)化。如本文所證明的，可以乂人最初的篩選，如生化中和測(cè)定直接獲得高效結(jié)合成員。"效價(jià)優(yōu)化的"結(jié)合成員是指具有中和CXCL13的特定活性或下游功能的優(yōu)化效^介的結(jié)合成員。在本文其他地方更詳細(xì)描述了測(cè)定和效價(jià)。效價(jià)優(yōu)化的和非優(yōu)化的結(jié)合成員以及用于從選定的結(jié)合成員進(jìn)行效價(jià)優(yōu)化的方法是本發(fā)明的方面。因此，本發(fā)明允許技術(shù)人員制備具有高效價(jià)的結(jié)合成員。另一方面，本發(fā)明提供了獲得能夠結(jié)合抗原的一個(gè)或多個(gè)結(jié)合成員選擇能夠結(jié)合所述抗原的文庫的一個(gè)或多個(gè)結(jié)合成員/、J該文庫可以展示在顆粒或分子復(fù)合物，例如，可復(fù)制的遺傳包裝，如酵母、細(xì)菌或噬菌體(如T7)顆粒、病毒、細(xì)胞或共價(jià)、核糖體或其它體外展示系統(tǒng)上，每個(gè)顆?；蚍肿訌?fù)合物含有編碼在其上展示的抗體VH可變區(qū)的核酸，并且如果存在，任選含有編碼展示的VL結(jié)構(gòu)域的核酸。噬菌體展示描述于WO92/01047和例如美國(guó)專利US5969108,US5565332,US5733743,US5858657,US5871907,US5872215,US5885793,US5962255,US6140471,US6172197,US6225447,US6291650,US6492160和US6521404，上述每篇文獻(xiàn)都通過全文引用的方式并入本文。在選擇能夠結(jié)合抗原并且在噬菌體或其他文庫顆?；蚍肿訌?fù)合物上展示的結(jié)合成員后，可以從展示所述選擇的結(jié)合成員的噬菌體或其他顆?；蚍肿訌?fù)合物取出核酸。所述核酸可以用于隨后通過從核酸表達(dá)而生產(chǎn)結(jié)合成員或抗體VH或VL可變區(qū)，所述核酸具有取自展示所述選擇的結(jié)合成員的噬菌體或其他顆?；蚍肿訌?fù)合物的核酸的序列。可以用分離的形式提供具有所述選擇的結(jié)合成員的抗體VH可變區(qū)的氨基酸序列的抗體VH可變區(qū)，也可以用包含所述VH結(jié)構(gòu)域的結(jié)合成員的形式提供?？梢赃M(jìn)一步測(cè)試結(jié)合CXCL13的能力，也可以確定與結(jié)合成員如抗體1(如scFv形式和/或IgG形式，如IgGl)竟?fàn)幗Y(jié)合CXCL13的能力。如本文其他地方進(jìn)一步討論的，可以測(cè)試中和CXCL13的能力。本發(fā)明的結(jié)合成員可以以抗體1如scFv或IgGl的親和力，或以更好的親和力結(jié)合CXCL13。本發(fā)明的結(jié)合成員可以以抗體1如scFv或IgGl的效1介，或以更好的效^介中和CXCL13的生物活性。可以在合適的條件下比較不同的結(jié)合成員的結(jié)合親和力和中和效價(jià)。可以通過序列改變或突變和篩選具有需要的特征的抗原結(jié)合成員的方法獲得本發(fā)明的VH和VL結(jié)構(gòu)域和CDRs的變體，包括氨基酸序列已經(jīng)在本文中闡明的那些，以及可以用于CXCL13的結(jié)合成員中的那些。需要的特征的實(shí)例包括但不限于相對(duì)于對(duì)抗原特異的已知抗體，對(duì)抗原的結(jié)合親和力的增加如果活性已知，相對(duì)于對(duì)抗原特異的已知抗體，抗原活性的中和增力口以特定摩爾比與抗原的已知抗體或配體的指定竟?fàn)幠芰γ庖叱恋韽?fù)合物的能力與指定表位結(jié)合的能力o線性表位，如用本文描述的肽結(jié)合掃描，如采用以線性和/或受限構(gòu)象篩選的肽鑒定的肽序列o由非連續(xù)殘基形成的構(gòu)象表位調(diào)節(jié)CXCLB或下游分子的新生物活性的能力所述方法也在本文中提供。變量數(shù)據(jù)分析技術(shù)應(yīng)用于結(jié)構(gòu)/特性-活性關(guān)系中的計(jì)算化學(xué)的引導(dǎo)后[40],可以用公知的lt學(xué)4支術(shù)，如統(tǒng)計(jì)回歸、才莫式識(shí)別和分類來推導(dǎo)抗體的定量活性-特性關(guān)系[41，42,43,44,45，46]。可以從抗體序列、功能和三維結(jié)構(gòu)的經(jīng)驗(yàn)和理論模型(例如，可能接觸的殘基的分析或計(jì)算的物理化學(xué)特性)推導(dǎo)抗體的特性，并且可以單獨(dú)和組合考慮這些特性。由VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域組成的抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)典型;也由多肽的6個(gè)環(huán)形成3個(gè)來自輕鏈可變區(qū)(VL)，3個(gè)來自重鏈可變區(qū)(VH)。具有已知原子結(jié)構(gòu)的抗體的分析在抗體組合位點(diǎn)的序列和三維結(jié)構(gòu)之間具有闡明的關(guān)系[47,48]。這些關(guān)系暗示，除了VH結(jié)構(gòu)域中的第三個(gè)區(qū)域(環(huán))，結(jié)合位點(diǎn)環(huán)具有小量主鏈構(gòu)象之一規(guī)范結(jié)構(gòu)。已經(jīng)顯示了在特定環(huán)中形成的規(guī)范結(jié)構(gòu)由其大小以及環(huán)和構(gòu)架區(qū)兩者中關(guān)鍵位點(diǎn)的某些殘基的存在決定[47,48]。這種序列-結(jié)構(gòu)關(guān)系的研究可以用于預(yù)測(cè)具有已知序列，但具有未知三維結(jié)構(gòu)的抗體中的那些殘基，所述殘基對(duì)于保持其CDR環(huán)的三維結(jié)構(gòu)，因此對(duì)于保持結(jié)合特異性是重要的。通過比較預(yù)測(cè)值與來自前導(dǎo)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的輸出值，可以支持這些預(yù)測(cè)。在結(jié)構(gòu)方法中，可以用自由獲得或商業(yè)軟件包如WAM[50]建立抗體分子的模型[49]。然后，可以用蛋白顯現(xiàn)和分一斤軟件包，如InsightII(Accelrys,Inc.)或DeepView[51]來評(píng)估CDR中每個(gè)位置上可能的取代。然后，可以用該信息來進(jìn)行可能對(duì)活性具有最小或有益效果的取代。在CDRs、抗體VH或VL結(jié)構(gòu)域和結(jié)合成員的氨基酸序列內(nèi)進(jìn)行取代所需的技術(shù)通常是本領(lǐng)域可獲得的?？梢杂萌〈苽渥凅w序列，所述取代可以或不可以預(yù)測(cè)對(duì)活性具有最小或有益效果，并且測(cè)試結(jié)合和/或中和CXCL13的能力和/或任何其他需要的特性。如討論的，序列在本文特別公開的任何VH和VL結(jié)構(gòu)域的可變區(qū)氨基酸序列變體可以根據(jù)本發(fā)明使用。本發(fā)明的另一方面是包含VH結(jié)構(gòu)域和/或包含VL結(jié)構(gòu)域的抗體分子，所述VH結(jié)構(gòu)域與所附序列表中所示抗體1的VH結(jié)構(gòu)域具有至少60、70、80、85、90、95、98或99%的氨基酸序列同一性，所述VL結(jié)構(gòu)域與所附序列表中所示抗體1的VL結(jié)構(gòu)域具有至少60、70、80、85、90、95、98或99%的氨基酸序列同一性。可以用于計(jì)算兩個(gè)氨基酸序列的同一性百分比的算法包括例如BLAST[52],FASTA[53]或Smith-Waterman算法[54],例如采用默認(rèn)參數(shù)。VH結(jié)構(gòu)域、VL結(jié)構(gòu)域和/或CDRs或CDRs組的特定變體可以包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列改變(氨基酸殘基的添加、缺失、取代和/或插入)。變體可以包括少于約20個(gè)改變，例如少于約15個(gè)，少于約10個(gè)，或少于約5個(gè)改變，如5、4、3、2或1個(gè)。可以在一個(gè)或多個(gè)構(gòu)架區(qū)和/或一個(gè)或多個(gè)CDRs中進(jìn)4亍改變。改變通常不導(dǎo)致功能喪失，所以包含由此改變的氨基酸序列的結(jié)合成員可以保留結(jié)合和/或中和CXCL13的能力。如本文描述的測(cè)定中所測(cè)量的，它可以保留與不進(jìn)行改變的結(jié)合成員相同的定量結(jié)合和/或中和能力。包含如此改變的氨基酸序列的結(jié)合成員可以具有改進(jìn)的結(jié)合和/或中和CXCL13的能力。改變可以包括用非天然存在的或非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸替代一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，將一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基修飾為非天然存在或非標(biāo)準(zhǔn)形式，或?qū)⒁粋€(gè)或多個(gè)非天然存在的或非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸插入序列中。本發(fā)明的序列中改變的數(shù)目和位置在本文其他地方描述。天然存在的氨基酸包括20個(gè)"標(biāo)準(zhǔn)"L氨基酸，其由它們的標(biāo)準(zhǔn)單字母代碼筌定為G,A,V,L,I,M,P,F,W,S，T,N，Q,Y，C,K,R,H,D,E。非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸包括任何可以摻入多肽主鏈或由存在的氨基酸殘基的修飾的得到的其他氨基酸。非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸可以是天然存在的或非天然存在的。一些天然存在的非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸是本領(lǐng)域已知的，如4-羥基脯氨酸、5-羥基賴氨酸、3-曱基組氨酸、N-乙酰絲氨酸等[55]。在N-a位置衍生化的氨基酸殘基將僅僅位于氨基酸序列的N末端。通常，在本發(fā)明中，氨基酸是L-氨基酸，但它也可以是D-氨基酸。因此，改變可以包括將L-氨基酸修飾為D-氨基酸，或用D-氨基酸取代L-氨基酸。氨基酸的曱基化、乙?；?或磷酸化形式也是已知的，并且本發(fā)明中的氨基酸可以進(jìn)行所述^奮飾。本發(fā)明的抗體結(jié)構(gòu)域和結(jié)合成員中的氨基酸序列可以包含上文描述的非天然或非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸。非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸(如D-氨基酸)可以在合成過程中摻入氨基酸序列中，或在氨基酸序列合成后修飾或取代"原始"標(biāo)準(zhǔn)氨基酸。非標(biāo)準(zhǔn)和/或非天然存在的氨基酸的使用增加了結(jié)構(gòu)和功能多樣性，并且因此能夠增加實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的結(jié)合成員中所需的CXCL13結(jié)合和中和特性的潛能。此外，已經(jīng)顯示了D-氨基酸及其類似物與標(biāo)準(zhǔn)L-氨基酸相比具有不同的藥代動(dòng)力學(xué)譜，這是由于在施用于動(dòng)物如人之后具有L-氨基酸的多肽的體內(nèi)降解，表明D-氨基酸對(duì)于一些體內(nèi)應(yīng)用是有利的?？梢圆捎靡粋€(gè)或多個(gè)選定的VH和/或VL基因的隨機(jī)誘變來制備攜帶本發(fā)明的CDR衍生的序列的新VH或VL區(qū)，從而在整個(gè)可變區(qū)內(nèi)產(chǎn)34生突變。所述技術(shù)描述于Gram等[56],其使用易錯(cuò)PCR。在一些實(shí)施方案中，在整個(gè)可變區(qū)或CDRs組內(nèi)進(jìn)行一個(gè)或兩個(gè)氨基酸取代?？梢允褂玫牧硪环椒ㄊ菍?duì)VH或VL基因的CDR區(qū)直接誘變。所述技術(shù)公開于Barbas等[57]和Schier等[58]。所有上述技術(shù)在本領(lǐng)域都是已知的，因此技術(shù)人員能夠利用所述技術(shù)，用本領(lǐng)域的常規(guī)方法提供本發(fā)明的結(jié)合成員。方法，所述方法包括通過在本文所述VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列中添加、缺失、取代或插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸而提供作為VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列變體的VH結(jié)構(gòu)域，任選組合由此提供的VH結(jié)構(gòu)域與一個(gè)或多個(gè)VL結(jié)構(gòu)域，并且測(cè)試VH結(jié)構(gòu)域或VH/VL組合，從而鑒定CXCL13的結(jié)合成員或抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)，其任選具有一種或多種需要的特性，如中和CXCL13的能力。所述VL結(jié)構(gòu)域可以具有基本如本文所述的氨基酸序列?？梢允褂妙愃品椒ǎ渲斜疚墓_的VL結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或多個(gè)序列變體與一個(gè)或多個(gè)VH結(jié)構(gòu)域組合。如上文指出的，基本如本文所述的CDR氨基酸序列可以攜帶為人抗體可變區(qū)或其主要部分中的CDR。基本如本文所述的HCDR3序列代^表了本發(fā)明的實(shí)施方案，并且其中的每一種都可以攜帶為人重鏈可變區(qū)或其主要部分中的HCDR3?？勺儏^(qū)可以來源于非人抗體。可以用重組DNA技術(shù)將本發(fā)明的CDR序列(如CDR3)導(dǎo)入缺乏CDR(如CDR3)的可變區(qū)的所有組成成分。例如，Marks等[59]描述了制備抗體可變區(qū)所有組成成分的方法，其中針對(duì)或鄰近可變區(qū)5，末端的共有引物與人VH基因的笫三構(gòu)架區(qū)的共有引物結(jié)合使用，從而提供缺乏CDR3的VH可變區(qū)的所有組成成分。Marks等進(jìn)一步描述了這種所有組成成分如何能夠與特定抗體的CDR3組合。采用類似技術(shù)，本發(fā)明的CDR3衍生的序列可以用缺乏CDR3的VH或VL結(jié)構(gòu)域的所有組成成分進(jìn)4亍改組，并且將改組的完整VH或VL結(jié)構(gòu)域與相關(guān)VL或VH結(jié)構(gòu)域組合，從而提供本發(fā)明的結(jié)合成員。然后所述所有組成成分可以在合適的宿主系統(tǒng)，如WO92/01047(在此通過全文引用而并入本文)或任何后續(xù)的大量文獻(xiàn)(包括Kay，Wmter&McCafferty[60])中的噬菌體展示系統(tǒng)中展示，從而可以選才奪合適的結(jié)合成員。所有組成成分可以由從104個(gè)單個(gè)成員直到例如至少105,至少106,至少107,至少108,至少109或至少101Q個(gè)成員或更多。其他合適的宿主系統(tǒng)包括但不限于酵母展示，細(xì)菌展示，T7展示，病毒展示，細(xì)胞展示，核糖體展示和共價(jià)展示。提供了制備CXCL13抗原的結(jié)合成員的方法，所述方法包括(a)提供編碼VH結(jié)構(gòu)域的核酸的起始所有組成成分，所述VH結(jié)構(gòu)域包括要一皮取代的CDR3或缺乏CDR3編碼區(qū)；(b)將所述所有組成成分與編碼基本如本文所述的VHCDR3的氨基酸序列的供體核酸組合，使得所述供體核酸插入該所有組成成分的CDR3區(qū)中，從而提供編碼VH結(jié)構(gòu)域的核酸的產(chǎn)物所有組成成分；(c)表達(dá)所迷產(chǎn)物所有組成成分的核酸；(d)選擇CXCL13的結(jié)合成員；和(e)回收所述結(jié)合成員或編碼它的核酸。也可以采用類似的方法，其中本發(fā)明的VLCDR3與編碼VL結(jié)構(gòu)域的核酸的所有組成成分組合，所述VL結(jié)構(gòu)域包含要一皮取代的CDR3或缺乏CDR3編碼區(qū)。類似地，一個(gè)或多個(gè)或所有三個(gè)CDRs可以移植到VL或VH結(jié)構(gòu)域的所有組成成分中，隨后對(duì)其篩選，得到CXCL13的結(jié)合成員。例如，可以采用抗體1HCDR1、HCDR2和HCDR3的一個(gè)或多個(gè)，或抗體1的HCDRs組，和/或抗體1LCDR1、LCDR2和LCDR3的一個(gè)或多個(gè)，或抗體1的LCDRs組。類似地，可以采用本文7>開的其他VH和VL結(jié)構(gòu)域、CDRs組和HCDRs組和/或LCDRs組。免疫球蛋白可變區(qū)的主要部分可以至少包含所述3個(gè)CDRs區(qū)，以及它們的間插構(gòu)架區(qū)。該部分也可以包含第l和第4構(gòu)架區(qū)中任一個(gè)或全部?jī)蓚€(gè)的至少約50%,所述50%是第1構(gòu)架區(qū)的C末端的50%和第4構(gòu)架區(qū)的N末端的50%?？勺儏^(qū)主要部分的N末端或C末端上的額外的殘基可以是通常不與天然存在的可變區(qū)相關(guān)的那些。例如，通過重組DNA技術(shù)制備的本發(fā)明的結(jié)合成員的構(gòu)建，可以導(dǎo)致由導(dǎo)入用于促進(jìn)克隆或其他操作步驟的接頭編碼的N或C末端殘基的導(dǎo)入。其他操作步驟包括導(dǎo)入接頭，以連接本發(fā)明的可變區(qū)與其他蛋白序列，包括本文其他地方更詳細(xì)討-淪的抗體恒定區(qū)、其他可變區(qū)(例如在雙抗體的制備中)或可一全測(cè)的/功能性標(biāo)記。盡管在本發(fā)明的一些方面，結(jié)合成員包含一對(duì)VH和VL結(jié)構(gòu)域，但基于VH或VL結(jié)構(gòu)域序列的單個(gè)結(jié)合域形成本發(fā)明的其他方面。已知單個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，特別是VH結(jié)構(gòu)域，能夠以特異性方式結(jié)合革巴4元原。例^t口，參見上文dAbs的i寸i侖。在單個(gè)結(jié)合域的任何一個(gè)的情況下，這些結(jié)構(gòu)域可以用于篩選能夠形成由兩個(gè)結(jié)合域組成的結(jié)合成員的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域，所述結(jié)合成員能夠結(jié)合CXCL13。這可以通過4吏用WO92/01047中公開的所謂等級(jí)雙組合方法，通過噬菌體展示篩選方法實(shí)現(xiàn)，所述文獻(xiàn)通過全文引用并入本文，其中用含有H或L鏈克隆的單個(gè)菌落感染編碼另一條鏈(L或H)的克隆的完整文庫，并且根據(jù)噬菌體展示技術(shù)(如該文獻(xiàn)中描述的那些)選擇得到的兩鏈結(jié)合成員。這一技術(shù)也公開于Marks等，同上。本發(fā)明的結(jié)合成員可以進(jìn)一步包括抗體恒定區(qū)或其部分，如人抗體恒定區(qū)或其部分。例如，VL結(jié)構(gòu)域可以在其C末端與抗體輕鏈恒定區(qū)，包括人CK或C入鏈連接。類似地，基于VH結(jié)構(gòu)域的結(jié)合成員可以在其C末端與來源于抗體同種型，如IgG,IgA,IgE和IgM以及任何同種型亞類，特別是IgGl和IgG4的免疫球蛋白重鏈的全部或部分(如CH1結(jié)構(gòu)域)連接。由于其效應(yīng)物功能和易于制造，IgGl是有利的。具有這些特明:。'、。、"。、、-本發(fā)明的結(jié)合成員可以用可才企測(cè)或功能性標(biāo)記進(jìn)^亍標(biāo)記。因此，結(jié)合成員或抗體分子可以以免疫綴合物的形式存在，從而獲得可斥僉測(cè)和/或可定量的信號(hào)。免疫綴合物可以包含與可檢測(cè)標(biāo)記或功能性標(biāo)記綴合的本發(fā)明的抗體分子。標(biāo)記可以是任何產(chǎn)生信號(hào)或可被誘導(dǎo)產(chǎn)生信號(hào)的分子，包括但不限于熒光劑、放射性標(biāo)記、酶、化學(xué)發(fā)光劑或光敏劑。因此，可以通過檢測(cè)焚光或發(fā)光、放射性、酶活性或光吸收來檢測(cè)和/或測(cè)量結(jié)合。舉例說明但不限制，合適的標(biāo)記包括陽酶，如堿性磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶("G6PDH")、a-D畫半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖淀粉酶、碳酸酐酶、乙酰膽堿酯酶、溶菌酶、蘋果酸脫氫酶和過氧化物酶，如辣4艮過氧化物酶；37-染料；-熒光標(biāo)記物或熒光劑，如熒光素及其衍生物、熒光染料、羅丹明化合物及衍生物、GFP(GFP代表"綠色熒光蛋白")、丹酰、傘形酮、藻紅蛋白、藻藍(lán)蛋白、別藻藍(lán)蛋白、鄰苯二醛和熒光胺；熒光團(tuán)如鑭系元素穴狀化合物和螯合物，如銪等(PerkmElmerandCisBiointernational)，-化學(xué)發(fā)光標(biāo)記或化學(xué)發(fā)光劑，如異魯米諾、魯米諾和二氧雜環(huán)丁烷；-生物發(fā)光標(biāo)記，如熒光素酶和熒光素；-感光劑；-輔酶5-酶底物5-放射性標(biāo)記，包括但不限于溴77,碳14,鈷57,氟8,鎵67,鎵68,氫3(氚)，銦lll,銦113m,橫123m,橫125,硤126,碘131,碘133,汞107,汞203,磷32,錸99m,錸IOI,4來105,釕95,釕97,釕103,釕105,鈧47，硒75,硫35,锝99,锝99m,碲121m,碲122m,碲125m,銩165,銩167,銩168，釔199和本文提到的其他放射性標(biāo)記物；-顆粒，例如乳膠或碳顆粒；金屬溶膠；微晶；脂質(zhì)體；細(xì)胞等，其可以進(jìn)一步用染料、催化劑或其他可檢測(cè)基團(tuán)進(jìn)一步標(biāo)記；-諸如生物素、洋地黃毒苷或5-溴脫氧尿苷的分子；—毒素部分，如選自下組的毒素部分假單胞菌外毒素(PE或其細(xì)胞毒性片段或突變體)、白喉毒素或其細(xì)胞毒性片段或突變體、肉毒桿菌毒素A,B,C，D，E或F、蓖麻毒蛋白或其細(xì)胞毒性片段，如蓖麻毒蛋白A、相思豆毒蛋白或其細(xì)胞毒性片段、皂草毒蛋白或其細(xì)胞毒性片段、美洲商陸抗病毒毒素或其細(xì)胞毒性片段，以及異抹瀉根毒蛋白l或其細(xì)胞毒性蛋白。合適的酶和輔酶公開于Litman,等，US4275149和Boguslaski,等,US4318980,所述文獻(xiàn)的每一篇都在此通過全文引用而并入本文。合適的熒光劑和化學(xué)發(fā)光劑公開于Litman,等，US4275149,所述文獻(xiàn)在此通過全文引用而并入本文。標(biāo)記進(jìn)一步包括化學(xué)部分，如可以通過與特異性相關(guān)可^f企測(cè)部分如標(biāo)記的親和素或鏈霉親和素結(jié)合而^^測(cè)的生物素。可檢測(cè)的標(biāo)記可以用本領(lǐng)域已知的常規(guī)化學(xué)連接于本發(fā)明的抗體?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法制備免疫綴合物或其功能性片段。它們可以直接與酶或熒光標(biāo)記偶聯(lián)，或通過間隔基或連接基團(tuán)(例如聚醛，如戊二醛、乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙烯-三胺五乙酸)的媒介進(jìn)行連接，或在偶聯(lián)劑存在下進(jìn)行偶聯(lián)，所述偶聯(lián)劑如上文對(duì)治療性綴合物所提到的那些。含有熒光素類型的標(biāo)記的綴合物可以通過與異碌u氰酸酯的反應(yīng)而制備。可以將本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的、用于直接或通過螯合劑如上述EDTA、DTPA將治療性放射性同位素偶聯(lián)于抗體的方法用于放射性元素，所述放射性元素可以用于it斷中。同樣，可以通過氯胺T方法[61]用鈉25進(jìn)4亍標(biāo)記，或通過Crockford等，(US4424200,通過全文引用而并入本文)的技術(shù)，用锝99m標(biāo)記，或按照Hnatowich(US4479930,通過全文引用并入本文)的描述，通過DTPA連接。存在許多方法，可以通過這些方法產(chǎn)生可通過外部手段4企測(cè)的信號(hào)，所述手l爻例如肉眼才企查、電；茲輻射、熱和化學(xué)試劑。標(biāo)記也可以與結(jié)合本發(fā)明的抗體的另一結(jié)合成員或與支持物結(jié)合。標(biāo)記可以直接產(chǎn)生信號(hào)，因此，不需要額外的成分來產(chǎn)生信號(hào)。許多有機(jī)分子，例如熒光劑，可以吸收紫外線和可見光，其中所述光吸收可以將能量轉(zhuǎn)移到這些分子，并且將它們升高到激發(fā)的能量狀態(tài)。這種吸收的能量隨后通過發(fā)射第二波長(zhǎng)的光而消散。這種第二波長(zhǎng)發(fā)射也可以將能量轉(zhuǎn)移到標(biāo)記的受體分子，并且得到的能量通過發(fā)射光，例如熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)從受體分子消散。其他直接產(chǎn)生信號(hào)的標(biāo)記包括放射性同位素和染料?；蛘撸瑯?biāo)記可能需要其他成分來產(chǎn)生信號(hào)，并且隨后信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)包括產(chǎn)生可測(cè)量信號(hào)所需的成分，可以包括底物、輔酶、增強(qiáng)劑、其他酶、與酶產(chǎn)物反應(yīng)的物質(zhì)、催化劑、激活劑、輔因子、抑制劑、清除劑、金屬離子和結(jié)合信號(hào)產(chǎn)生物質(zhì)所需的特異性結(jié)合物質(zhì)。合適的信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)的詳細(xì)討論可以參見Ullman,等US5185243,所述文獻(xiàn)在此通過全文引用而并入本文。本發(fā)明提供了一種方法，包括導(dǎo)致或允許本文提供的結(jié)合成員與CXCL13結(jié)合。如所指出的，所述結(jié)合可以體內(nèi)發(fā)生，例如，在施用結(jié)合成員或編碼結(jié)合成員的核酸之后，或它可以體外發(fā)生，例如在ELISA、蛋白印記、免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫沉淀、親和層析和生物化學(xué)或基于細(xì)胞的測(cè)定，如CAMP、釣釋放或B細(xì)胞趨化性測(cè)定中。本發(fā)明也提供了例如在生物傳感器系統(tǒng)中通過采用本發(fā)明的結(jié)合成員，直接測(cè)量抗原水平。例如，本發(fā)明包括檢測(cè)和/或測(cè)量與CXCL13的結(jié)合的方法，包括，(i)將所述結(jié)合成員暴露于CXCL13,和(ii)檢測(cè)所述結(jié)合成員與CXCL13的結(jié)合，其中所述結(jié)合是采用本文描述的任何方法或可檢測(cè)標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)的。本文描述的這種和任何其他結(jié)合檢測(cè)方法可以由進(jìn)行該方法的人直接解釋，例如，通過肉眼觀察可檢測(cè)標(biāo)記?；蛘?，本文描述的這種和任何其他結(jié)合;f企測(cè)方法可以產(chǎn)生以下形式的凈艮道放射自顯影照片、照片、計(jì)算機(jī)打印輸出、流式細(xì)胞術(shù)報(bào)道、圖、表、含有結(jié)果的試管或容器或孔，或該方法的結(jié)果的其他視覺或物理表現(xiàn)?？梢源_定結(jié)合成員與CXCL13的結(jié)合量。定量可以與測(cè)試樣品中抗原的量相關(guān)，其可以具有診斷意義。對(duì)CXCL13結(jié)合的篩選和/或其定量，可以用于例如篩選患者中的本文提到的疾病或病癥和/或其他涉及異常CXCL13表達(dá)和/或活性的疾病或病癥。i午多疾病與水平增加的CXCL13相關(guān)。CXCL13水平是用于許多病癥的有用診斷和/或預(yù)后指標(biāo)，例如，本文其他地方描述的炎癥和/或自身免疫疾病。例如，CXCL13的升高的水平，例如在血清或滑液樣品中的升高的水平，可以用作類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的預(yù)測(cè)指標(biāo)。本發(fā)明的診斷方法可以包括(i)從受試者獲得組織或液體樣品，(ii)將所述組織或液體樣品暴露于一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的結(jié)合成員；和(iii)檢測(cè)與對(duì)照樣品相比的結(jié)合的CXCL13,其中與對(duì)照相比，CXCL13結(jié)合量的增加，可以表示CXCL13表達(dá)或活性的異常水平。要測(cè)試的組織或液體樣品包括血液、血清、尿、活檢材料、腫瘤或任何懷疑含有異常CXCL13水平的組織。測(cè)試為異常CXCL13水平或活性陽性的受試者也可以從下文公開的治療方法中獲益。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠根據(jù)他們的偏好和一般知識(shí)，根據(jù)本文公開的方法，選擇用于確定結(jié)合成員與抗原的結(jié)合的合適模式?？梢酝ㄟ^任何合適的方法確定樣品中結(jié)合成員的反應(yīng)性。放射免疫測(cè)定(RIA)是一種可能性。放射性標(biāo)記的抗原與未標(biāo)記的抗原(測(cè)試樣品)混合，并且使其與結(jié)合成員結(jié)合。結(jié)合的抗原是與未結(jié)合的抗原物理上分開的，并且確定與結(jié)合成員結(jié)合的放射性抗原的量。測(cè)試樣品中的抗原越多，與結(jié)合成員結(jié)合的放射性抗原就越少。采用與々艮道分子連接的抗原或類似物，竟?fàn)幮越Y(jié)合測(cè)定也可以與非放射性抗原一起使用。報(bào)道分子可以是具有光語上分離的吸收或發(fā)射的熒光染料、磷或激光染料。合適的熒光染料包括熒光素、羅丹明、藻紅蛋白和得克薩斯紅，以及鑭系元素螯合物或穴狀化合物。合適的發(fā)色染料包括二氨基聯(lián)苯胺。其他報(bào)道物包括大分子膠體顆粒或顆粒狀材料，例如有色的、磁性或順磁乳膠珠，和能夠直接或間接導(dǎo)致可檢測(cè)的信號(hào)能夠被肉眼觀察、電子;^測(cè)或以其他方式記錄的生物或化學(xué)活性試劑。這些分子可以是酶，其催化例如顯色或改變顏色或?qū)е码娞匦愿淖兊姆磻?yīng)。它們可以是分子可激發(fā)的，使得能量狀態(tài)之間的電轉(zhuǎn)變能夠?qū)е绿卣餍怨庾V吸收或發(fā)射。它們可以包括與生物傳感器一起使用的化學(xué)實(shí)體?？梢?吏用生物素/親和素或生物素/鏈霉親和素和堿性磷酸酶檢測(cè)系統(tǒng)。由單個(gè)結(jié)合成員-報(bào)道物綴合物產(chǎn)生的信號(hào)可以用于得到樣品(正常和測(cè)試樣品)中相關(guān)結(jié)合成員的可定量絕對(duì)或相對(duì)數(shù)據(jù)。包含本發(fā)明的任何方面或?qū)嵤┓桨傅慕Y(jié)合成員的試劑盒也可以提供為本發(fā)明的一方面。在試劑盒中，結(jié)合成員可以進(jìn)行標(biāo)記，使得能夠確定其在樣品中的反應(yīng)性，如下文進(jìn)一步的描述。進(jìn)一步，結(jié)合成員可以與固體支持物連接，或不與其連接。試劑盒的成分通常是無菌的，并且在密封的管型瓶或其他容器中，試劑盒可以用于診斷分析或其他方法(結(jié)合成員對(duì)于所述方法有用)。試劑盒可以含有在方法(例如本發(fā)明的方法)中使用各成分的說明書。本發(fā)明的試劑盒中可以包含輔助材料，用于輔助進(jìn)行所述方法，或使得能夠進(jìn)行所述方法。輔助材料包括第二種不同的結(jié)合成員，其結(jié)合于第一結(jié)合成員，并且綴合于可檢測(cè)的標(biāo)記(如熒光標(biāo)記、放射性同位素或酶)?；诳贵w的試劑盒也可以包含用于進(jìn)行免疫沉淀的珠。試劑盒的每種成分通常在其自身的合適容器中。因此，這些試劑盒通常包含適用于每個(gè)結(jié)合成員的不同容器。此外，試劑盒可以包含進(jìn)行所述測(cè)定的試劑盒和用于解釋和分析進(jìn)行測(cè)定所得到的數(shù)據(jù)的方法。法，也就是說，提供了在竟?fàn)帨y(cè)定中通過使用本發(fā)明提供的結(jié)合成員而測(cè)量樣品中的抗原水平的方法。這可以是其中不需要結(jié)合與未結(jié)合抗原的物理分離。將報(bào)道分子與結(jié)合成員連接，使得結(jié)合而發(fā)生的物理或光學(xué)改變是一種可能性。報(bào)道分子可以直接或間接產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)，所述信號(hào)是可以定量的。報(bào)道分子的連接可以是直接或間接的、共價(jià)的(例如通過肽鍵)或非共價(jià)的。通過肽鍵的連接可以是編碼抗體和報(bào)道分子的基因融合物重組表達(dá)的結(jié)果。在多個(gè)方面和實(shí)施方案中，本發(fā)明延伸到與本文定義的任何結(jié)合成員如抗體l(如IgGl形式)竟?fàn)幗Y(jié)合CXCL13(如人CXCL13)的結(jié)合成員?？梢栽隗w外容易地測(cè)定結(jié)合成員之間的竟?fàn)帲?，通過將特異性報(bào)道分子加標(biāo)簽(tagged)于一個(gè)結(jié)合成員，使其可以在其他未加標(biāo)簽的結(jié)合成員存在下被檢測(cè)到，使得能夠鑒定結(jié)合相同表位或重疊表位的結(jié)合成員?？梢岳缬肊LISA確定竟?fàn)帲渲袑XCL13固定于平板，并且將加標(biāo)簽的或標(biāo)記的第一結(jié)合成員與一個(gè)或多個(gè)其他未加標(biāo)簽的或未標(biāo)記的結(jié)合成員一起添加到平板中。通過加標(biāo)簽的結(jié)合成員發(fā)射的信號(hào)的減少，觀察到與加標(biāo)簽的結(jié)合成員竟?fàn)幍?、未加?biāo)簽的結(jié)合成員的存在。在一個(gè)實(shí)例中，可以使用HTRF⑧表位竟?fàn)帨y(cè)定。例如，本發(fā)明包括鑒定CXCL13結(jié)合化合物的方法，包括(i)將CXCL13固定于支持物，(iiM吏所述固定的CXCL13同時(shí)或以逐步方式與至少一個(gè)本發(fā)明的加標(biāo)簽的或標(biāo)記的結(jié)合成員和一個(gè)或多個(gè)未加標(biāo)簽的或未標(biāo)記的測(cè)試結(jié)合化合物接觸，和(iii)通過觀察結(jié)合的標(biāo)簽從加標(biāo)簽的結(jié)合成員減少的量，鑒定新的CXCL13結(jié)合化合物。所述方法可以用多孔或陣列形式以高通量方式進(jìn)行。所述測(cè)定也可以在溶液中進(jìn)行。參見例如U.S.5,814,468,該文獻(xiàn)在此通過引用而并入本文。如上文所描述的，例如通過肉眼觀察可檢測(cè)的標(biāo)記或其存在下的減少，可以由執(zhí)行該方法的人直接解釋結(jié)合的檢測(cè)?；蛘撸景l(fā)明的結(jié)合方法可以產(chǎn)生以下形式的報(bào)道放射自顯影照片、照片、計(jì)算機(jī)打印輸出、流式細(xì)胞術(shù)報(bào)道、圖、表、含有結(jié)果的試管或容器或孔，或該方法的結(jié)果的其他視覺或物理表現(xiàn)。竟?fàn)帨y(cè)定也可以用于表位作圖中。在一種情況下，表位作圖可以用于鑒定由CXCL13結(jié)合成員結(jié)合的表位，所迷結(jié)合成員任選可以具有優(yōu)化的中和和/或調(diào)節(jié)特征。所述表位可以是線性或構(gòu)象的。構(gòu)象表位可以包含CXCL13的至少兩個(gè)不同的片段，其中當(dāng)CXCL13折疊為其三級(jí)或四級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)，所述片段彼此鄰近，以形成構(gòu)象表位，所迷構(gòu)象表位由CXCL13的抑制劑，如CXCL13結(jié)合成員識(shí)別。在測(cè)試竟?fàn)帟r(shí)，可以使用抗原的肽片段，特別是包括感興趣的表位或基本由感興趣的表位組成的肽。可以使用在任一末端具有表位序列加上一個(gè)或多個(gè)氨基酸的肽。本發(fā)明的結(jié)合成員可以是這樣的，即它們對(duì)抗原的結(jié)合受到具有或包括給定序列的肽的抑制。本發(fā)明進(jìn)一步提供了編碼本發(fā)明的結(jié)合成員的分離的核酸。核酸可以包括DNA和/或RNA。一方面，本發(fā)明提供了核酸，其編碼上文定義的本發(fā)明的CDR或CDRs組或VH結(jié)構(gòu)域或VL結(jié)構(gòu)域或抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)或抗體分子，如scFv或IgGl。本發(fā)明也提供了質(zhì)粒、載體、轉(zhuǎn)錄或表達(dá)盒形式的構(gòu)建體，其包含至少一種上文所述的多核普酸。本發(fā)明也提供了重組宿主細(xì)胞，其包含一個(gè)或多個(gè)上文所述的構(gòu)建體。編碼提供的任何CDR或CDRs組或VH結(jié)構(gòu)域或VL結(jié)構(gòu)域或抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)或抗體分子，如scFv或IgGl的核酸自身形成了本發(fā)明的一個(gè)方面，制備所編碼的產(chǎn)物的方法也形成了本發(fā)明的一個(gè)方面，因此所述方法包括從編碼核酸表達(dá)。可以通過在合適的條件下培養(yǎng)舍核酸的重組宿主細(xì)胞而方便地實(shí)現(xiàn)表達(dá)。在通過表達(dá)VH或VL結(jié)構(gòu)域而產(chǎn)生后，可以用任何合適的技術(shù)分離和/或純化結(jié)合成員，然后合適地使用。本發(fā)明的核酸可以包括DNA或RNA,并且可以是完全或部分合成的。本文提到的核苷酸序列包括具有指定序列的DNA分子，并且包括具有指定序列的RNA分子，其中U代替T，除非上下文有其他要求。另一方面提供了制備抗體VH可變區(qū)的方法，該方法包括導(dǎo)致從編碼核酸表達(dá)。所述方法可以包括在用于生產(chǎn)所述抗體VH可變區(qū)的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)月包。提供了用于生產(chǎn)VL可變區(qū)和包含VH和/或VL結(jié)構(gòu)域的結(jié)合成員的類似方法，作為本發(fā)明的其他方面。生產(chǎn)方法可以包括分離和/或純化產(chǎn)物的步驟。生產(chǎn)方法可以包括將產(chǎn)物配制為組合物，所述組合物包含至少一種額外的成分，如藥學(xué)可4妾受的賦形劑。用于在多種不同的宿主細(xì)胞中克隆和表達(dá)多肽的系統(tǒng)是公知的。合適的宿主細(xì)胞包括細(xì)菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、絲狀真菌、酵母和桿狀病毒系統(tǒng)和轉(zhuǎn)基因植物和動(dòng)物。在原核細(xì)胞中表達(dá)抗體和抗體片段43是本領(lǐng)域公知的。綜述參加例如Pliickthun[62]。共同的細(xì)菌宿主是大腸桿菌。在培養(yǎng)中的真核細(xì)胞中表達(dá)，也可以被本領(lǐng)域技術(shù)人員用作生產(chǎn)結(jié)合成員的選項(xiàng)[63,64,65]。本領(lǐng)域中可以用于表達(dá)異源多肽的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系包括中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、Hela細(xì)胞、幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞、NSO小鼠黑素瘤細(xì)胞、YB2/0大鼠骨髓瘤細(xì)胞、人胚腎細(xì)胞、人胚視網(wǎng)膜細(xì)胞和4艮多其他細(xì)胞?？梢赃x擇或構(gòu)建合適的載體，其中含有合適的調(diào)節(jié)序列，包括啟動(dòng)子序列、終止子序列、聚腺苷酸化序列、增強(qiáng)子序列、標(biāo)記基因和其他合適的序列。載體可以是質(zhì)粒，如噬菌粒，或病毒，如合適的噬菌體[66]。很多例如在制備核酸構(gòu)建體、誘變、測(cè)序、將DNA導(dǎo)入細(xì)胞和基因表達(dá)以及蛋白分析中用于才喿作核酸的已知技術(shù)和方案詳細(xì)描述于Ausubel等[67〗。本發(fā)明的另一方面提供了包含本文公開的核酸的宿主細(xì)胞。所述宿主細(xì)胞可以是體外的，并且可以是培養(yǎng)中的。所述宿主細(xì)胞可以是體內(nèi)的。宿主細(xì)胞的體內(nèi)存在可以允許本發(fā)明的結(jié)合成員在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)為"胞內(nèi)抗體，，或細(xì)胞內(nèi)抗體。胞內(nèi)抗體可以用于基因治療。另一方面提供了一種方法，包括將本發(fā)明的核酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞。所述導(dǎo)入可以采用任何可利用的技術(shù)。對(duì)于真核細(xì)胞，合適的技術(shù)可以包括磷酸4丐轉(zhuǎn)染、DEAE-右旋糖酐、電穿孔、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染和用逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他病毒如痘苗病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)，或?qū)τ诶ハx細(xì)胞，用桿狀病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)。將核酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞，特別是真核細(xì)胞，可以使用基于病毒或質(zhì)粒的系統(tǒng)。質(zhì)粒系統(tǒng)可以附加i呆持或可以4參入宿主細(xì)月包或纟參入人工染色體?？梢酝ㄟ^在單個(gè)或多個(gè)基因座隨機(jī)或?qū)蛘弦粋€(gè)或多個(gè)拷貝而進(jìn)行摻入。對(duì)于細(xì)菌細(xì)胞，合適的一支術(shù)可以包4舌氯化鈣轉(zhuǎn)化、電穿孔和用噬菌體轉(zhuǎn)染。導(dǎo)入可以通過導(dǎo)致或允許從核酸表達(dá)而進(jìn)行，例如，通過在用于表達(dá)基因的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法實(shí)現(xiàn)表達(dá)的產(chǎn)物的純化。本發(fā)明的核酸可以整合到宿主細(xì)胞的基因組(如染色體)中。可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，通過引入促進(jìn)與基因組重組的序列而促進(jìn)整合。本發(fā)明也提供了一種方法，包括在表達(dá)系統(tǒng)中使用上文所述的構(gòu)建44體，以便表達(dá)上文所述的結(jié)合成員或多肽。本發(fā)明的結(jié)合成員可以用于診斷或治療人或動(dòng)物受試者如人的方法中。CXCL13的結(jié)合成員可以用于治療與CXCL13相關(guān)，如與異常CXCL13表達(dá)和/或活性相關(guān)的病癥。如本文其他地方所討論的；存在CXCL13參與多種病癥的證據(jù)。本發(fā)明的結(jié)合成員可以用于抑制CXCL13結(jié)合CXCR5,從而用于治療由CXCL13結(jié)合CXCR5所介導(dǎo)的疾病或病癥。與CXCL13相關(guān)的病癥包括由CXCL13結(jié)合于其受體CXCR5導(dǎo)致和/或加重的病癥。本發(fā)明的方面涉及通過纟爰解或改善一種或多種癥狀和/或病癥的原因而治療所述病癥。CXCL13的結(jié)合成員可以用于抑制或減少、淋巴濾泡，如異位、淋巴濾泡，如關(guān)節(jié)滑膜中存在的異位淋巴濾泡的異常形成和/或發(fā)展。結(jié)合成員可以抑制或減少CXCL13-CXCR5信號(hào)傳導(dǎo)介導(dǎo)的B細(xì)胞和/或初t突細(xì)胞和/或?yàn)V泡B輔助T細(xì)胞募集到濾泡；和/或減少由濾泡B細(xì)胞產(chǎn)生免疫球蛋白；和/或抑制或減少濾泡B細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子和/或激活T細(xì)胞。結(jié)合成員也可以用于抑制或減少異常骨和/或軟骨破壞。因此，結(jié)合成員可以用于治療與異?；虍愇涣馨蜑V泡相關(guān)的疾病或病癥。與異位淋巴濾泡相關(guān)的病癥包括類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、干燥綜合征、多發(fā)性硬化、重癥肌無力、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、自身免疫性甲狀腺疾病(如格雷夫斯病，橋本氏曱狀腺炎)、慢性感染，如萊姆神經(jīng)疏螺3走體病(LymeNeuroborreliosis)和以Qmlty效應(yīng)為特4正的急性心臟排斥。例如，發(fā)炎的關(guān)節(jié)滑膜通常特征在于:含有生發(fā)中心的異位淋巴濾泡；炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；B細(xì)I包產(chǎn)生自身抗體和細(xì)J包因子；T細(xì)胞的B細(xì)胞激活；和/或骨和軟骨破壞。結(jié)合成員可以破壞如本文描述的異位濾泡的形式，由此抑制B細(xì)胞自身抗體生成和/或滑膜炎癥。因此，結(jié)合成員可以用于治療關(guān)節(jié)炎病癥，如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)和/或骨關(guān)節(jié)炎。本發(fā)明的結(jié)合成員可以用于治療骨和/或關(guān)節(jié)疾病或病癥，特別是與骨和/或軟骨的破壞和/或重塑相關(guān)的疾病或病癥，如骨和軟骨的異常更新。例如，結(jié)合成員可以用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和/或骨關(guān)節(jié)炎。本發(fā)明的結(jié)合成員可以用于抑制淋巴細(xì)胞(如B和/或T細(xì)胞)趨化性，并且因此可以用于治療與淋巴細(xì)胞趨化性相關(guān)的病癥，如病毒感染(如HIV感染)和白血病(如T細(xì)胞系急性淋巴細(xì)胞白血病和B細(xì)胞系急性和慢性淋巴細(xì)胞白血病)。本發(fā)明的結(jié)合成員可以用于抑制淋巴瘤的增殖，因此可以用于治療與淋巴瘤增殖相關(guān)的病癥，如白血病(如T細(xì)胞系急性'淋巴細(xì)胞白血病和B細(xì)胞系急性和慢性淋巴細(xì)胞白血病)。如本文所述的，CXCL13的結(jié)合成員可以用于抑制淋巴濾泡，如異位淋巴濾泡的異常形成和/或發(fā)展，抑制異常骨和/或軟骨破壞和/或重塑，和/或抑制淋巴細(xì)胞的趨化性和/或淋巴瘤的增殖。因此，本發(fā)明提供了抑制淋巴濾泡，如異位淋巴濾泡的異常形成和/或發(fā)展，抑制異常骨和/或軟骨破壞和/或重塑，和/或抑制淋巴細(xì)胞的趨化性和/或淋巴瘤的增殖的方法，包括給需要其的患者施用有效量的、單獨(dú)或在與另一種本領(lǐng)域已知的或本文描述的合適藥物的組合治療方案中的一種或多種本發(fā)明的結(jié)合成員，使得淋巴濾泡，如異位淋巴濾泡的異常形成和/或發(fā)展，異常骨和/或軟骨破壞和/或重塑，和/或淋巴細(xì)胞的趨化性和/或淋巴瘤的增殖一皮抑制。本發(fā)明的結(jié)合成員可以用于診斷與CXCL13相關(guān)的疾病或病癥，例如，其中CXCL13的水平改變，例如相對(duì)于正常水平升高。結(jié)合成員可以用于i貪斷本文描述的一種或多種疾病或病癥，包括例如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、干燥綜合征、HIV、重癥肌無力、血管免疫母細(xì)胞性T細(xì)胞'淋巴瘤(angioimmunoblasticT隱celllymphoma)禾口可"f專^番由々海纟帛^l大月畝病(TSE)。下文和本文其他地方描述了CXCL13參與某些病癥的證據(jù)。此外，本文提供的數(shù)據(jù)進(jìn)一步表明本發(fā)明的結(jié)合成員可以用于治療所述病癥，包括預(yù)防性處理病癥和降低病癥的嚴(yán)重程度。因此，本發(fā)明提供了治療本文所述任何病癥的至少一種癥狀或減輕其嚴(yán)重程度的方法，包括給需要其的患者施用有效量的、單獨(dú)的或在與另一種本領(lǐng)域已知或本文描述的合適藥物的組合治療方案中的一種或多種本發(fā)明的結(jié)合成員，使得任何上述病癥的至少一種癥狀的嚴(yán)重程度減輕。CXCL13在外周淋巴器官和先天免疫的發(fā)育中的作用的證據(jù)部分描述于本文其〗也地方。除此之外，一系列證據(jù)表明了CXCL13在男性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)的致病中的作用。例如，CXCL13mRNA和蛋白的表達(dá)在RA滑膜中升高[68],在RA滑膜中的CXCL13蛋白水平和疾病嚴(yán)重程度之間存在正相關(guān)[69]。我們也發(fā)現(xiàn)了，在RA患者的血清和滑膜液中測(cè)量到了升高水平的CXCL13,表明本發(fā)明的結(jié)合成員可以用于本文描述的i貪斷RA的方法中。發(fā)炎的滑膜的特征在于炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和類似淋巴組織的有組織的淋巴細(xì)胞聚集物的存在。這些異位淋巴結(jié)構(gòu)含有生發(fā)中心的特征，包括FDCs的存在和高內(nèi)皮小靜脈(HEVs)的存在。生發(fā)中心提供了支持B細(xì)胞分化為漿細(xì)胞和高親和力抗體如類風(fēng)濕因子產(chǎn)生的微環(huán)境[70]。RA滑膜中的CXCL13蛋白已經(jīng)免疫定位于生發(fā)中心內(nèi)的FDCs[69]和細(xì)胞浸潤(rùn)物中的巨噬細(xì)胞[71]。在RA病變中，CXCL13強(qiáng)烈預(yù)測(cè)異位'淋巴濾泡形成和生發(fā)中心反應(yīng)的發(fā)展(Takemura,S.等J.Immunol.167:1072-1080,2001)。通過來自疾病的動(dòng)物才莫型的體內(nèi)證據(jù)，進(jìn)一步支持了CXCL13在RA中的作用。CXCL13中和抗體的預(yù)防性給藥減少了小鼠中膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(CIA)的疾病嚴(yán)重程度，伴隨向關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)中的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少和軟骨和骨^f曼蝕程度的降低[72]。在CIA才莫型中，用抗CXCL13抗體治療的小鼠的脾和關(guān)節(jié)與對(duì)照小鼠相比，含有較少的生發(fā)中心，并且生發(fā)中心的大小更小[72]。其他研究顯示了CXCR5缺陷的小鼠在佐劑誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(AIA)模型中發(fā)生較不嚴(yán)重的癥狀，伴有滑膜炎癥和關(guān)節(jié)破壞減少(Hartmann,S.等，EuropeanCongressonImmunology,abstract2672,2006)。在該研咒中，有組織的生發(fā)中心、抗-抗原抗體和抗原i秀導(dǎo)的T細(xì)胞增殖反應(yīng)的水平也降低。也通過來自培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的體外證據(jù)證明了CXCL13在骨和軟骨更新中的作用。CXCR5在分離自骨關(guān)節(jié)炎(OA)患者的關(guān)節(jié)軟骨的軟骨細(xì)胞上表達(dá)。在含有CXCL13的培養(yǎng)條件中處理這些軟骨細(xì)胞，誘導(dǎo)了基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)和組織蛋白酶B的釋放，并且誘導(dǎo)了增殖[73]。CXCL13也誘導(dǎo)來源于OA患者的培養(yǎng)的成骨細(xì)胞的增殖和白介素-l(IL-l)mRNA的表達(dá)[74]。也可以通過IL-l處理增強(qiáng)/人培養(yǎng)的成骨細(xì)胞的基本CXCL13分泌[75]。在,人進(jìn)行關(guān)節(jié)手術(shù)的RA患者取出的骨樣品中，將CXCL13蛋白免疫定位于含淋巴新生特征的骨髓中的單核細(xì)胞聚集物[76]。CXCR5受體在具有B細(xì)胞輔助功能的一個(gè)亞群的記憶T細(xì)l包上表達(dá)，所述T細(xì)胞是指定的濾泡B輔助T細(xì)胞(TFH)。CXCL13誘導(dǎo)從人扁桃體分離的表達(dá)CXCR5的Tfh細(xì)胞的趁化性[77],而在二級(jí)淋巴器47官中，CXCR5陽性Tfh細(xì)胞定位于B細(xì)月包濾泡和生發(fā)中心，在此處它們支持免疫球蛋白產(chǎn)生[78]。新鮮分離自生發(fā)中心的Tfh細(xì)胞分泌低水平的CXCL13,4旦是該水平在通過TCR和CD28刺激后顯著升高(Kim,CH.等Blood，104:1952-1960,2004)。已經(jīng)筌定了一個(gè)亞群的樹突細(xì)胞，它們表達(dá)CXCR5并且反應(yīng)于CXCL13而定位于淋巴濾泡[79]。這種反應(yīng)依賴于B細(xì)胞來源的膜結(jié)合的淋巴毒素，所述淋巴毒素刺激由濾泡基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)CXCL13,并且確立了將CXCR5陽性細(xì)胞募集到濾泡中必須的趨化成分。盡管B細(xì)胞運(yùn)輸?shù)囊种圃谂R床上沒有先例，但是存在關(guān)于RA患者中B細(xì)胞清除治療的效力的臨床先例[80]。用嵌合的抗CD20單克隆抗體進(jìn)行的B細(xì)胞清除是有效的，并且在經(jīng)歷單療程治療后數(shù)月到數(shù)年的持續(xù)疾病緩解期的患者中是耐受良好的。減少自身抗體水平是B細(xì)胞清除成功的關(guān)鍵機(jī)理，因?yàn)榕R床復(fù)發(fā)與血清自身抗體恢復(fù)到治療前水平相關(guān)[Sl]。除了自身抗體產(chǎn)生，認(rèn)為B細(xì)胞通過抗原呈遞引起的細(xì)胞因子產(chǎn)生和T細(xì)胞激活而導(dǎo)致RA進(jìn)展。CXCL13中和作用對(duì)B細(xì)胞運(yùn)輸?shù)囊种?，代表了治療RA的新方法。CXCL13中和作用通過石皮壞RA滑膜中的異位濾泡和生發(fā)中心反應(yīng)，對(duì)抑制自身抗體產(chǎn)生和滑膜炎癥都具有作用。CXCL13中和作用通過防止由直接和間接機(jī)理引起的骨和軟骨破壞，可以提供額外的益處。已經(jīng)在HIV中描述了升高水平的CXCL13(Widney,DP.等J.Int.Cyt.Res.25:702-706,2005)。也已經(jīng)報(bào)道了將CXCL13用作可傳播的海綿狀腦病(TSE)的替代標(biāo)記物(EP1703282A1)。本發(fā)明的結(jié)合成員可以用于治療以下任何疾病l.呼吸道氣道的阻塞性疾病，包括間歇性和持續(xù)性并且具有所有嚴(yán)重程度的哞喘，包括支氣管性、過敏性、內(nèi)源性、外源性、運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的、藥物誘導(dǎo)的(包括阿斯匹林和NSAID誘導(dǎo)的)和灰塵誘導(dǎo)的哞喘，以及其他原因的氣道高反應(yīng)性；慢性阻塞性肺疾病(COPD);支氣管炎，包括感染性和嗜酸性細(xì)胞支氣管炎；肺氣腫；支氣管擴(kuò)張；嚢性纖維化；肉狀瘤??；農(nóng)民肺和相關(guān)疾?。贿^敏性肺炎；肺纖維化，包括隱發(fā)性纖維化肺泡炎，特發(fā)性間質(zhì)性肺炎，合并抗腫瘤治療和慢性感染，包括肺結(jié)核和曲霉病和其他真菌感染的纖維化；肺移植的合并癥；肺月承管系統(tǒng)的脈管炎和血^全形成病癥，和肺高壓；抗組織活性，包括治療與氣道的炎癥和分泌狀況相關(guān)的慢性咳嗽，和醫(yī)源性咳嗽；急性和慢性鼻炎，包括藥物性鼻炎和血管運(yùn)動(dòng)性鼻炎；終年性和季節(jié)性過敏性鼻炎，包括神經(jīng)性鼻炎(枯草熱)；鼻息肉；急性病毒感染，包括普通感冒，和呼吸道合胞病毒，流感病毒，冠狀病毒(包括SARS)和腺病毒引起的感染；2.骨和關(guān)節(jié)原發(fā)的和繼發(fā)于例如先天性髖骨發(fā)育不良的、與骨關(guān)節(jié)炎/骨關(guān)節(jié)病相關(guān)或包括骨關(guān)節(jié)炎/骨關(guān)節(jié)病的關(guān)節(jié)炎滲；頸推和腰推脊柱炎，以及下背部和頸部疼痛；類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和斯蒂爾?。谎尻幮约怪P(guān)節(jié)病，包括強(qiáng)直性脊柱炎、牛皮痺關(guān)節(jié)炎、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎和未分化的脊柱關(guān)節(jié)??；膿毒癥關(guān)節(jié)炎和其他感染相關(guān)的關(guān)節(jié)病和骨病癥，如結(jié)核，包括Pott病和Poncet綜合征；急性和慢性晶體誘導(dǎo)的滑膜炎，包括急性痛風(fēng)、磷酸鈣沉積疾病和鈣磷灰石相關(guān)的腱、嚢和滑膜炎癥；貝切特??；原發(fā)和繼發(fā)性干燥綜合征；系統(tǒng)性硬化和局限性硬皮病；系統(tǒng)性紅斑狼癡、混合結(jié)締組織病和未分化的結(jié)締組織?。谎仔?幾病，包括皮肌炎和多肌炎；風(fēng)濕性多肌痛；幼年關(guān)節(jié)炎，包括任何關(guān)節(jié)分布的特發(fā)性炎性關(guān)節(jié)炎滲和相關(guān)綜合征，和風(fēng)濕熱及其系統(tǒng)合并癥；脈管炎(vasculitides),包括巨細(xì)胞關(guān)節(jié)炎、高安動(dòng)脈炎、丘-施綜合征、結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎、顯微多動(dòng)脈炎和與病毒感染、過敏反應(yīng)、冷球蛋白和副蛋白相關(guān)的脈管炎；下背痛；家族性地中海熱、Muckle-Wells綜合征和家族性愛爾蘭熱、Kikuchi病；藥物誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)痛、腱炎和肌?。?.由于損傷(例如運(yùn)動(dòng)損傷)或疾病導(dǎo)致的肌肉骨駱病癥的疼痛和結(jié)締組織重塑關(guān)節(jié)炎(例如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)或晶體關(guān)節(jié)病)、其他關(guān)節(jié)疾病(例如推間盤變性或顳下頜關(guān)節(jié)變性)、骨重塑疾病(例如骨質(zhì)疏+>、佩吉特病或骨壞死)、多軟骨炎、硬皮病、混合結(jié)締組織病癥、脊柱關(guān)節(jié)病或牙周病(如牙周炎)；4.皮膚牛皮痺、特應(yīng)性皮炎、接觸性皮炎或其他濕滲性皮膚病，和延遲型過敏反應(yīng)；植物性皮炎和光皮炎；脂溢性皮炎、皰滲樣皮炎、扁平苔蘚、硬化萎縮性苔蘚、壞疽性膿皮病(pyodermagangrenosum)、皮膚結(jié)節(jié)病、盤狀紅斑纟良瘡、天皰瘡、類天皰瘡、大皰性表皮爭(zhēng)^解、蕁麻滲、血管性水肺、脈管炎、毒性紅斑、皮膚嗜酸性細(xì)胞增多、斑禿、男型先、斯威特綜合征、韋-克綜合征、多形性紅斑、感染性和非感染性蜂窩織炎、脂膜炎；皮膚淋巴瘤、非黑素瘤皮膚癌和其他發(fā)育異常病變；藥物誘導(dǎo)的病癥，包括固定的藥滲；5.眼瞼炎；結(jié)膜炎，包括終年性和春季過敏性結(jié)膜炎；虹膜炎；前和后葡萄膜炎；脈絡(luò)膜炎；影響視網(wǎng)膜的自身免疫、退化性或炎性病癥；眼炎，包括交感神經(jīng)性眼炎；結(jié)節(jié)??；感染，包括病毒、真菌和細(xì)菌感染；6.胃腸道舌炎、齒齦炎、牙周炎；食管炎，包括反流；嗜酸性細(xì)胞胃腸炎、肥大細(xì)胞增多癥、克隆氏病、結(jié)腸炎，包括潰瘍性結(jié)腸炎、直腸炎、肛門瘙癢；腹部疾病、腸激惹綜合征和可能具有遠(yuǎn)離腸道的影響(例如偏頭痛、鼻炎或濕滲)的食物相關(guān)過敏；7.腹部肝炎，包括自身免疫性、酒精性和病毒性肝炎；肝纖維化和硬化；膽嚢炎；急性和慢性胰腺炎；8.泌尿生殖腎炎，包括間質(zhì)性腎炎和腎小球腎炎；腎病綜合征；膀胱炎，包括急性和慢性(間質(zhì)性)膀胱炎和杭那潰瘍；急性和慢性尿道炎、前列腺炎、附睪炎、卵巢炎和輸卵管炎；外陰-陰道炎；佩羅尼??；勃起功能障礙(男性和女性)；9.同種異體移植排斥在例如腎、心臟、肝、肺、骨髓、皮膚或角膜移植后或輸血后的急性和慢性移植排斥；或慢性移植物抗宿主疾?。?0.CNS:阿爾茨海默病和其他癡呆病癥，包括CJD和nvCJD;淀粉樣變；多發(fā)性硬化和其他脫髓鞘綜合征；腦動(dòng)脈粥樣硬化和脈管炎；顳動(dòng)脈炎；重癥肌無力；急性和慢性疼痛(急性、間歇性或持續(xù)性，無論是中樞還是外周來源)，包括內(nèi)臟痛、頭痛、偏頭痛、三叉神經(jīng)痛、非典型面部痛、關(guān)節(jié)和骨痛、由癌癥和肺瘤4曼入導(dǎo)致的疼痛、神經(jīng)病疼痛綜合征，包括糖尿病、皰滲后和HIV相關(guān)神經(jīng)?。簧窠?jīng)結(jié)節(jié)病；惡性、感染性或自身免疫過程的外周神經(jīng)系統(tǒng)合并癥；11.其他自身免疫和過敏性病癥，包括橋本氏曱狀腺炎、格雷夫斯病、阿迪森病、糖尿病、特發(fā)性血小板減少性紫癜、嗜酸性細(xì)胞筋膜炎、高IgE綜合征、抗磷脂綜合征；12.其他具有炎性和免疫成分的病癥；包括獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)、麻風(fēng)病、賽扎里綜合征；和副肺瘤綜合征；13.心血管影響冠狀動(dòng)脈和周圍循環(huán)的動(dòng)脈粥樣石更化；心包炎；心肌炎；炎性和自身免疫性心肌病，包括心肌類肉瘤；缺血再灌注損傷；心內(nèi)膜炎、心瓣膜炎和主動(dòng)脈炎，包括感染性(例如梅毒性)主動(dòng)脈炎；脈管炎(vasculitides);近端和外周靜脈的病癥，包括靜脈炎和血栓形成，包括深靜脈血栓形成和靜力永曲張的合并癥；M.腫瘤治療常見的癌癥，包括前列腺、乳腺、肺、卵巢、胰腺、腸和結(jié)腸、胃、皮膚和腦肺瘤和影響骨髓(包括白血病)和淋巴增殖系統(tǒng)的惡性胂瘤，如何杰金和非何杰金淋巴瘤；包括預(yù)防和治療轉(zhuǎn)移性疾病和腫瘤復(fù)發(fā)，以及副腫瘤綜合征；和15.胃腸道腹部疾病、直腸炎、嗜酸性細(xì)胞胃腸炎、肥大細(xì)胞增多癥、克隆氏病、潰瘍性結(jié)腸炎、顯微結(jié)腸炎、不定位的結(jié)腸炎(indetermmantcolitis)、腸激惹病癥、腸激惹綜合4正、非炎性腹瀉、具有遠(yuǎn)離腸道的影響的食物相關(guān)的過敏，例如偏頭痛、鼻炎和濕滲。鼠、兔、豚鼠、猴、魚、狗、牛、羊、馬，等等。涉及CXCL13/CXCR5信號(hào)傳遞系統(tǒng)的動(dòng)物模型是本領(lǐng)域已知的。例如，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的動(dòng)物模型是已知的，例如CIA、AIA和鏈球菌細(xì)胞壁(SCW)模型。MS的動(dòng)物模型是實(shí)驗(yàn)性自身免疫腦脊髓炎(EAE)小鼠模型。SLE的小鼠模型包括MRL/lpr小鼠模型和NZBxNZWF！(BWF^小鼠模型。表達(dá)和/或活性，特別是異常表達(dá)/活性的疾病或病癥的治療劑。治療方法可以包括給有需要的患者施用有效量的本發(fā)明的結(jié)合成員，其中CXCL13的異常表達(dá)和/或活性降低。治療方法可以包括(i)例如用上文描述的診斷方法鑒定表現(xiàn)異常CXCL13水平或活性的患者，并且，(ii)給患者施用有效量的本發(fā)明的結(jié)合成員，其中CXCL13的異常表達(dá)和/或活性降低。根據(jù)本發(fā)明的有效量是降低CXCL13的異常表達(dá)和/或活性的量，從而降低或減輕受治療的特定疾病或病癥的至少一種癥狀的嚴(yán)重程度，f旦不一定治愈該疾病或病癥。本發(fā)明也提供了拮抗CXCL13的至少一種作用的方法，包括接觸或施用有效量的一種或多種本發(fā)明的結(jié)合成員，使得CXCL13的所述至少一種作用被拮抗?？梢砸黄け景l(fā)明的方法拮抗的CXCL13的作用包括與CXCR5的結(jié)合，和由這些結(jié)合反應(yīng)的結(jié)果產(chǎn)生的任何下游作用。因此，本發(fā)明的結(jié)合成員可以用作治療劑，用于涉及CXCL13-CXCR5，特別是異常CXCL13-CXCR5信號(hào)傳遞的疾病或病癥的治療。因此，本發(fā)明的進(jìn)一步的方面提供了治療方法，包括施用所提供的51結(jié)合成員、包含所述結(jié)合成員的藥物組合，并且將所述結(jié)合成員用于制備要施用的藥物中，例如，用于制備藥物或藥物組合物的方法中，包括用藥學(xué)可接受的賦形劑配制結(jié)合成員。藥學(xué)可接受的賦形劑可以是化合物或化合物的組合，其進(jìn)入藥物組合物并且不激發(fā)繼發(fā)反應(yīng)，并且允許例如促進(jìn)活性化合物的施用、其在體內(nèi)的壽命和/或效價(jià)的增加，其在溶液中的溶解度的增加，或其保存的改進(jìn)。這些藥學(xué)可接受的載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且可以根據(jù)選擇的活性化合物的性質(zhì)和施用方式而進(jìn)行調(diào)整。本發(fā)明的結(jié)合成員通常將以藥物組合物形似施用，所述藥物組合物除結(jié)合成員外還包含至少一種成分。因此，根據(jù)本發(fā)明的、并且用于本發(fā)明的用途中的藥物組合物除活性成分外還包含藥學(xué)可接受的賦形劑、載體、緩沖劑、穩(wěn)定劑或本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的其他材料。所述材料應(yīng)該是無毒的，并且不應(yīng)該干擾活性成分的效力。載體或其他材料的精確性質(zhì)將依賴于施用的途徑，如下文所討i侖的，所述途徑可以是口月l、吸入、氣管內(nèi)、局部、血管內(nèi)或通過注射。本發(fā)明也考慮用于口服施用的藥物組合物，如單結(jié)構(gòu)域抗體分子(如"nanobodiesTM")等。所述口服制劑可以是片劑、膠嚢、粉末、液體或半固體形式。片劑可以包含固體載體，如明膠或佐劑。液體藥物組合物通常包含液體載體，如水、石油、動(dòng)物或植物油、礦物油或合成油。可以包括生理鹽水、葡萄糖或其他糖類溶液或二醇類，如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。對(duì)于靜脈內(nèi)注射，或在受損部位注射，活性成分將是腸胃外可接受的含水溶液形式，其是無熱原的，并且具有合適的pH、等滲性和穩(wěn)定性。本領(lǐng)域技術(shù)人員完全能夠用例如等滲載體，如氯化鈉注射液、林招，氏注射液、乳酸化林格氏注射液等制備合適的溶液?？梢愿鶕?jù)需要使用防腐劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑、抗氧化劑和/或其他添加劑，包括緩沖劑，如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其他有機(jī)酸；抗氧化劑，如抗壞血酸和曱石危氨酸；防腐劑(如十八烷基二曱基芐基氯化銨；氯化己烷雙胺；苯扎氯銨；苯索氯銨;苯酚、丁醇或苯甲醇；對(duì)氨基苯甲酸烷酯，如對(duì)氨基酸苯甲酸甲酯或?qū)Π被綍跛岜ィ粌翰璺?；雷瑣酚；環(huán)己烷；3，-戊醇；和間甲酚)；低分子量多肽；蛋白，如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、組氨酸、52精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，如EDTA;糖類，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽抗衡離子，如鈉；金屬?gòu)?fù)合物(如Zn-蛋白復(fù)合物)；和/或非離子表面活性劑，如TWEENTM,PLURONICS或聚乙二醇(PEG)。根據(jù)分子的生理化學(xué)特性和送遞途徑，本發(fā)明的結(jié)合成員可以配制為液體、半固態(tài)或固體形式。制劑可以包括賦形劑或賦形劑的組合，例如糖、氨基酸和表面活性劑。液體制劑可以包括寬范圍的抗體濃度和pH。例如可以通過凍干、噴霧干燥或超臨界流體技術(shù)干燥而生產(chǎn)固體制劑?？笴XCL13的制劑將依賴于預(yù)期的送遞途徑例如，用于肺送遞的制劑可以由具有確保吸入后穿透進(jìn)入深肺部的物理性質(zhì)的顆粒組成；局部制劑(例如用于治療疤痕如皮膚疤痕)可以包括粘度調(diào)節(jié)劑，其延長(zhǎng)藥物保留在作用部位的時(shí)間。可以用保護(hù)結(jié)合成員抗迅速釋放的載體制備結(jié)合成員，例如控釋制劑，包括植入物、透皮貼劑和微膠嚢包被的送遞系統(tǒng)?？梢允褂蒙锟山到獾?、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。很多用于制備所述制劑的方法都是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的[82]?？笴XCL13治療可以口月良纟會(huì)予(例如單結(jié)構(gòu)域抗體分子(如"nanobodies"))、通過注射給予(例如皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)或肌內(nèi))、通過吸入給予、氣管內(nèi)給予、通過嚢內(nèi)途徑給予(滴注到膀胱內(nèi))、或局部給予(例如眼內(nèi)、鼻內(nèi)、直腸、傷口內(nèi)、皮膚上)?？梢酝ㄟ^脈沖輸注，特別是用劑量逐漸減少的結(jié)合成員施用治療?？梢酝ㄟ^治療的物理化學(xué)特征、通過疾病的特殊考慮、或通過對(duì)優(yōu)化效力或減少副作用的考慮而確定施用途徑。一種特定的施用途徑是靜脈內(nèi)。另一種施用本發(fā)明的藥物組合物的途徑是皮下。預(yù)期抗CXCL13治療不限于臨床使用。因此，用無針頭裝置皮下注射也是有利的。依賴于要治療的狀況，可以同時(shí)或順序、單獨(dú)或與其#/治療組合施用組合物。CXCL13的結(jié)合成員可以用作與另外的藥物成分組合的組合治療的一部分。組合治療可以用于提供顯著的協(xié)同效應(yīng)，特別是抗CXCL13結(jié)合成員與一種或多種其他藥物的組合。CXCL13的結(jié)合成員可以與另外于治療一種或多種本文列出的狀況。本發(fā)明的結(jié)合成員可以與一種或多種以下試劑組合或疊加提供-細(xì)胞因子或細(xì)胞因子的激動(dòng)劑或拮抗劑(如作用于細(xì)胞因子信號(hào)傳遞途徑的試劑，如socs系統(tǒng)的調(diào)節(jié)劑)，如cu卩和/或Y-干護(hù)^素；i型胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-1)、其受體和相關(guān)的結(jié)合蛋白；白介素(IL)，如IL-1至IL-33的一種或多種，和/或白介素拮抗劑或抑制劑，如阿那白滯素(anakinra);白介素家族成員受體的抑制劑或所述受體的特定亞基的抑制劑、肺瘤壞死因子a(TNF-a)抑制劑，如抗TNF單克隆抗體(例如英夫單抗、阿達(dá)木單抗(adalimumab)和/或CDP-870)和/或TNF受體拮抗劑，例如免疫球蛋白分子(如依那西普(etanercept))和/或<氐分子量試劑，如己酮可可;咸；畫B細(xì)胞的調(diào)節(jié)劑，例如導(dǎo)向于B淋巴細(xì)胞的單克隆抗體(如CD20(利妥?，敗RA-alL16R或Belimumab))或?qū)蛴赥淋巴細(xì)胞的單克隆抗體(如CTLA4-Ig(Abatacept)、HuMax11-15);-B細(xì)胞激活、成熟或存活的調(diào)節(jié)劑(如Atacicept);-免疫功能的調(diào)節(jié)劑，如淋巴毒素LIGHT途徑的拮抗劑(如LTBR-Fc)-抑制;皮骨細(xì)胞活性的調(diào)節(jié)劑，例如RANKL的抗體；-趨化因子或趨化因子受體功能的調(diào)節(jié)劑，例如CCR1,CCR2,CCR2A,CCR2B,CCR3，CCR4,CCR5,CCR6，CCR7,CCR8,CCR9,CCR10和CCR11(用于C-C家族)；CXCR1,CXCR2，CXCR3,CXCR4和CXCR5和CXCR6(用于C-X-C家族)和CX3CR1(用于C-X3-C家族)的拮抗劑；-基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的抑制劑，即以下一種或多種溶基質(zhì)蛋白酶、膠原酶和明膠酶以及可聚蛋白聚糖，特別是膠原酶-l(MMP-l),膠原酶-2(MMP-8),月交原酶-3(MMP-13),溶基質(zhì)蛋白酶-1(MMP-3),溶基質(zhì)蛋白酶-2(MMP-10)和/或溶基質(zhì)蛋白酶-3(MMP-ll)和/或MMP-9和/或MMP-12,例如，諸如多西環(huán)素的藥劑；-白三烯生物合成抑制劑、5-脂加氧酶(5-LO)抑制劑或5-脂加氧酶激活蛋白(FLAP)拮抗劑，如棄白通；ABT-761;芬留頓(fenleuton);太波沙林；Abbott-79175;Abbott-85761;N-(5-取代的)-噻吩-2-烷基磺胺;2,6-二-叔丁基苯酚腙；甲氧基四氫吡喃，如ZenecaZD-2138;化合物SB-210661;吡啶基取代的2-氰基萘化合物，如L-739,010;2-氰基喹啉化合物，如L-746，530;口引咮和/奮啉化合物，如MK-591,MK-886和/或BAYx1005;-白三烯(LT)B4、LTC4、LTD4和LTE4的受體拮抗劑，選自酚噻口秦-3-ls，如L-651,392;脒基化合物，如CGS-25019c;benzoxalamines,例^口昂口坐司凈爭(zhēng)(ontazolast);benzenecarboximidamides,^口BIIL284/260;和化合物，如扎魯司特、阿魯司特(ablukast)、孟魯司特、普侖司特、維卡斯特(MK-679)、RG-12525、245913、iralukast(CGP45715A)和BAYx7195;-石岸酸二酯酶(PDE)抑制劑，如methylxanthanine,如茶石咸和氨茶堿；和/或選4奪性PDE同工酶抑制劑，如PDE4抑制劑和/或同工型PDE4D的抑制劑和/或PDE5的抑制劑；國(guó)組胺I型受體拮抗劑，如西殺齊利口秦、氯雷4也定、desloratadine、曱鎂芳銨、阿伐司丁、特非那定、阿司咪唑、氮卓司丁、左卡巴司丁、chlorphemramme、異丙漆、苯甲療和/或咪唑斯汀(通常口服、局部或腸胃外施用)；-質(zhì)子泵抑制劑(如奧美拉唑)或保護(hù)胃的組胺2型受體拮抗劑；-組胺4型受體的拮抗劑；-a-l/a-2腎上腺素受體激動(dòng)劑血管收縮劑擬交感神經(jīng)劑，如丙己君、苯腎上腺素、苯丙醇胺、腎上腺素、麻黃堿、偽麻黃堿、鹽酸萘?xí)踹蛄帧Ⅺ}酸氧曱唑林、鹽酸四氳唑林、鹽酸賽洛唑林、鹽酸曲馬唑林和鹽酸乙基去曱腎上腺素；誦抗膽堿劑，如毒蕈堿受體(Ml、M2和M3)拮抗劑，如阿托品、東t菪堿、4各隆溴銨、異丙托品、噻托溴胺(tiotropmmbromide)、溴乙東茛菪堿、哌倫西平和替?zhèn)愇髌剑?卩腎上腺素受體激動(dòng)劑(包括卩受體亞型1-4),如異丙腎上腺素、舒喘寧、氟莫特羅、沙美特羅、特步他林、奧西那林、甲磧酸比托特羅和/或吡布特羅，如其手性對(duì)應(yīng)異構(gòu)體；-色酮，如色甘酸鈉和/或奈多羅米鈉；-糖皮質(zhì)激素，如氟尼縮松、醋酸去炎松、二丙酸培氯米松、布地奈德、丙酸氟地+》、環(huán)縮+》和/或糠酸毛他+>;陽調(diào)節(jié)細(xì)月包核激素受體的試劑，如PPAR;-免疫球蛋白(Ig)或Ig制劑或調(diào)節(jié)Ig功能的拮抗劑或抗體，如抗55IgE(如omalizumab);-其他全身或局部施用的抗炎劑，如沙利度胺或其衍生物、類維生素A、地蒽酚和/或釣泊三醇；-氨基水楊酸酯和磺胺吡啶，如柳氮磺吡啶、美沙拉秦、巴柳氮和奧沙拉。秦與免疫調(diào)節(jié)劑，如硫。票呤；和皮質(zhì)類固醇如布地奈德的組合；畫抗細(xì)菌劑，如青霉素衍生物、四環(huán)素、大環(huán)內(nèi)酯、(3-內(nèi)酰胺、氟喹諾酮、曱硝唑和/或吸入的氨基糖苷；和/或抗病毒劑，如阿昔洛韋、法昔洛韋、伐昔洛韋、更昔洛韋、西多福韋；金剛烷胺、金剛乙胺；利巴韋林；扎那米韋和/或奧塞米韋；蛋白酶抑制劑，如吲哚那韋、奈非那韋、利托那韋/或沙查那韋；核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，如地達(dá)諾新、拉米夫定、司他夫定、扎西胞苷、齊多夫定；非核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，如奈韋拉平、依非韋侖；-心血管藥劑，如釣通道阻斷劑、P-腎上腺素受體阻斷劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制劑、血管緊張素-2受體拮抗劑；降脂劑，如抑制素和/或fibrate;血細(xì)胞形態(tài)調(diào)節(jié)劑，如己酮可可堿；溶栓劑和/或抗凝劑，如血小板聚集抑制劑；-CNS藥劑，如抗抑郁劑(如舍曲林)、抗帕金森藥物(如鹽酸司來吉蘭、L-多巴、累匹利洛、派拉米蘇；MAOB抑制劑，如司來吉蘭和rasagilme;comP抑制劑，如托卡朋；A-2抑制劑、多巴胺再攝取抑制劑、NMDA拮抗劑、煙;成激動(dòng)劑、多巴胺激動(dòng)劑和/或神經(jīng)元一氧化氮合酶抑制劑)和抗阿爾茨海默病藥物，如杜尼匹次、雷司替明、他克林、COX-2抑制劑、丙戊茶》咸或敵百蟲；-用于治療急性和慢性疼痛的藥劑，例如作用于中樞或外周的止痛劑，如阿片樣物質(zhì)類似物或衍生物、卡巴咪。秦、苯妥英、丙戊酸鈉、阿米替林或其他抗抑郁劑、對(duì)乙酰氨基酚或非甾體類抗炎劑；-腸胃外或局部施用的(包括吸入的)局部麻醉劑，如利諾卡因或其類似物；-抗骨質(zhì)疏松劑，如激素制劑，如雷洛昔芬或雙磷酸酯，如阿侖特羅；-(i)類胰蛋白酶抑制劑；(ii)血小板激活因子(PAF)拮抗劑；(iii)白介素轉(zhuǎn)化酶(ICE)抑制劑；(iv)IMPDH抑制劑；(v)粘附分子抑制劑，包括VLA-4拮抗劑；(vi)組織蛋白酶；(vii)激酶抑制劑，如酪氨酸激酶(如Btk,Itk,Jak3MAP)的抑制劑(抑制劑的實(shí)例可以包括吉非替尼(Gefitimb)、甲磺酸伊馬替尼(Imatmibmesylate))、絲氨酸/蘇氨酸激酶的抑制劑(如MAP激酶，如p38,JNK,蛋白激酶A、B和C以及IKK的抑制劑)或參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的激酶(如細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶)的抑制劑；(viii)葡萄糖-6磷酸脫氫酶抑制劑；(ix)激肽-Bi和/或激肽-B2受體拮抗劑；(x)抗痛風(fēng)劑，如秋水仙堿；(xi)黃噤呤氧化酶抑制劑，如別。票呤醇；(xh)排尿酸劑，如丙磺舒、磺吡酮和/或苯溴馬??；(Xlll)生長(zhǎng)素促分泌劑；(xiv)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGFJ3);(xv)血小板衍生的生長(zhǎng)因子(PDGF);(xvi)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，如堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF);(xvii)粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF);(xviii)辣椒素膏；(xix)速激肽NId和/或NK3受體拮抗劑，如NKP-608C,SB-233412(talnetant)和/或D-4418;(xx)彈性蛋白酶抑制劑，如UT-77和/或ZD-0892;(xxi)TNF-a轉(zhuǎn)化酶抑制劑(TACE);(xxii)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)抑制劑或(xxiii)TH2細(xì)胞上表達(dá)的化學(xué)引誘物受體-同源分子(如CRTH2拮抗劑)；(xxiv)P38抑制劑；(xxv)調(diào)節(jié)Toll樣受體(TLR)功能的試劑；和(xxvi)調(diào)節(jié)嘌呤能受體的試劑，如P2X7;(xxvii)轉(zhuǎn)錄因子激活抑制劑，如NFkB,API和/或STATS。抑制劑可以是特異性的或可以是混合抑制劑，例如，靶定上文所述一種以上的分子(如受體)或分子類型的抑制劑。結(jié)合成員也可以與化療劑或另一種酪氨酸激酶抑制劑聯(lián)合，用于共同施用或免疫綴合物形式。所述抗體的片段也可以用于通過重組機(jī)理或生物化學(xué)偶聯(lián)獲得的雙特異性抗體中，然后將上文描述的抗體的特異性與其他抗體的特異性關(guān)聯(lián)，所述其他抗體能夠識(shí)別參與CXCL13相關(guān)活性的其他分子。對(duì)于治療炎性疾病，例如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、哮喘、過敏性鼻炎、慢性阻塞性肺疾病(COPD)或牛皮癬，本發(fā)明的結(jié)合成員可以與一種或多種試劑組合，所述試劑如非甾體類抗炎劑(下文稱作NSAIDS),包括局部或全身施用的非選擇性環(huán)加氧酶(COX)-l/COX-2抑制劑，如吡羅昔康，雙氯酚酸，丙酸，如萘普生，氟比洛芬，苯氧苯丙酸釣，酮基布洛芬和布洛芬，安芬鈉，如曱芬那酸，吲哚美辛，舒林酸，阿扎丙宗，吡唑啉酮，如保泰松、水楊酸鹽，如阿斯匹林);選擇性COX-2抑制劑(如美洛昔康、塞來昔布、洛芬昔布、valdecoxib、lumarocoxib、parecoxib詳口etoricoxib);4中制環(huán)力口氧酵的——氧4匕氣供體(CINODs);糖皮質(zhì)激素(無論是通過局部、口服、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)或關(guān)節(jié)內(nèi)途徑)；甲氨喋呤、來氟洛米、羥基氯喹、d-青霉胺、金諾芬或其他腸胃外或口服金制劑；鎮(zhèn)痛劑；達(dá)賽瑞英；關(guān)節(jié)內(nèi)治療，如透明質(zhì)酸衍生物；和營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充物，如葡糖胺。本發(fā)明的結(jié)合成員也可以與現(xiàn)有的用于治療癌癥的治療劑組合。組合使用的合適試劑包括(i)用于藥物肺瘤學(xué)中的抗增殖/抗胂瘤藥物及其組合，如Gleevec(甲磺酸伊馬替尼)、烷化劑(例如順鉑、卡鉑、環(huán)磷酰胺、氮芥、美法侖、苯丁酸氮芥、白消安和硝基脲)；抗代謝藥(例如抗葉酸藥，如氟嘧啶，例如5-氟尿嘧啶和喃氟啶、雷替曲塞、曱氨喋呤、胞嘧啶阿拉伯糖苷、羥基脲、吉西他濱和紫杉醇)；抗肺瘤抗生素(例如亞德里亞霉素、博萊霉素、阿霉素、道諾霉素、表阿霉素、去甲柔毛霉素、絲裂霉素-C、放線菌素和光神霉素)；抗有絲分裂劑(例如長(zhǎng)春堿類，如長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春花堿、長(zhǎng)春地辛和長(zhǎng)春烯堿，以及紫杉?jí)A類，如紫杉醇和多西他賽)；以及拓樸異構(gòu)酶抑制劑(例如表鬼臼毒素類，如依托泊苷和替尼泊苷、安吖啶、托泊替堪和喜樹堿)；(ii)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑，如抗雌激素藥物(例如他莫昔芬、托瑞米酚、雷洛昔芬、屈洛昔芬和iodoxyfene)、雌激素受體下調(diào)劑(例如氟維司群(fulvestrant))、抗雄激素藥物(例如比卡魯胺、氟利坦、尼魯米特和環(huán)丙孕酮)、LHRH拮抗劑或LHRH激動(dòng)劑(例如性瑞林、亮丙瑞林和布舍瑞林)、孕激素(例如醋酸甲地孕酮)、芳化酶抑制劑(例如阿鈉曲哇、來曲唑、伏氯唑(vorazole)和依西美坦)和5a-還原酶抑制劑，例如非那雄胺；(iii)抑制癌細(xì)胞侵入的試劑(例如金屬蛋白酶抑制劑，如馬馬司他和尿激酶纖溶酶原激活物受體功能的抑制劑)；(iv)生長(zhǎng)因子功能的抑制劑，例如包括以下的抑制劑生長(zhǎng)因子抗體、生長(zhǎng)因子受體抗體(例如抗erbb2抗體tmstuzumab和抗erbbl抗體cetuximab[C225])、法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑、酪氨酸激酶抑制劑和絲氨酸/蘇氨酸激酶抑制劑，例如表皮生長(zhǎng)因子家族的抑制劑(例如EGFR家族酪氨酸激酶抑制劑，例如N-(3-氯-4-氟苯基)-7-曱氧基-6-(3-嗎啉代丙氧基)喹唑啉_4-胺(吉非替尼，AZD1839),N-(3-乙炔基苯基)-6,7-二(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉一4-胺(erlotmib,OSI-774)和6-芳基酰氨基-N-(3-氯-4-氟苯基)-7-(3-嗎啉代丙氧基)喹唑啉-4-胺(CI1033)),例如血小板衍生的生長(zhǎng)因子家族的抑制劑和例如肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族的抑制劑；(v)抗血管發(fā)生劑，例如抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的作用的那些(例如抗血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子抗體bevacizumab、化合物，例如國(guó)際專利申請(qǐng)WO97/22596，WO97/30035,WO97/32856和WO98/13354公開的那些，上述每篇申請(qǐng)都通過全文引用而并入本文)和通過其他機(jī)理起作用的化合物(例如羅喹美克，即整聯(lián)蛋白o(hù)tvp3功能的抑制劑和制管張素)；(vi)血管石皮壞劑，如combretastatinA4和國(guó)際專利申請(qǐng)WO99/02166,WO00/40529,WO00/41669,WO01/92224，WO02/04434和WO02/08213中7>開的化合物(上述每篇申請(qǐng)都通過全文引用而并入本文)；(vii)反義治療，例如針對(duì)上文列出的粑的那些，例如ISIS2503、抗ras反義治療；(viii)基因治療方法，包括例如替代異?；?，例如異常p53或異常BRCA1或BRCA2的方法、GDEPT(針對(duì)基因的酶藥物前體治療)方法，例如使用胞嘧咬脫氨酶、胸苦激酶或細(xì)菌硝基還原酶的方法和增加患者對(duì)化療或》文療的耐受性的方法，如多藥物抗性基因治療；和(ix)免疫治療方法，包括例如增加患者腫瘤細(xì)胞的免疫原性的離體和體外方法，例如用細(xì)胞因子(如白介素2、白介素4或粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子)轉(zhuǎn)染；減少T細(xì)胞無反應(yīng)性的方法；采用轉(zhuǎn)染的免疫細(xì)胞，如細(xì)胞因子轉(zhuǎn)染的樹突細(xì)胞的方法；采用細(xì)胞因子轉(zhuǎn)染的肺瘤細(xì)胞系的方法；和采用抗獨(dú)特型抗體的方法。本發(fā)明的結(jié)合成員和一種或多種上述另外的藥物成分可以用于制備藥物。所述藥物可以用于分開或組合施用給個(gè)體，因此，可以包含作為組合制劑或分開制劑的結(jié)合成員和另外的成分。分開的制劑可以用于促進(jìn)分開的和序貫或同時(shí)施用，并且使得能夠通過不同的途徑，例如口服和腸胃外施用方式而施用各成分。根據(jù)本發(fā)明，可以給哺乳動(dòng)物施用提供的組合物。施用通常是以"治療有效量，，，這足以對(duì)患者顯示益處。所述益處可以是至少改善至少一種癥狀。施用的實(shí)際量和施用的速度和時(shí)程，將依賴于治療的疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重程度、要治療的特定哺乳動(dòng)物、個(gè)體患者的臨床狀況、病癥的原因、送遞組合物的部位、結(jié)合成員的類型、施用的方法、施用的方案和醫(yī)學(xué)從業(yè)者已知的其他因素。治療的處方，例如對(duì)劑量等的判斷，是59通常的從業(yè)者和其他醫(yī)生的職責(zé)范圍內(nèi)的，并且可以依賴于癥狀的嚴(yán)重程度和/或治療的疾病的進(jìn)展。抗體的合適劑量是本領(lǐng)域公知的[83,84]?？梢圆捎脤?duì)于要施用的藥物類型合適的、本文或醫(yī)生手冊(cè)(2003)中指出的具體劑量?？梢酝ㄟ^比較本發(fā)明的結(jié)合成員體外活性和在動(dòng)物中的體內(nèi)活性，而確定其治療有效量或合適劑量。將小鼠和其他測(cè)試動(dòng)物中的有效劑量外推到人的方法是已知的。精確劑量將依賴于許多因素，包括抗體是用于診斷、預(yù)防還是治療，要治療的部位大小和定位，抗體的精確性質(zhì)(例如完整抗體、片段或雙抗體)和連接于抗體的任何可檢測(cè)標(biāo)記或其他分子的性質(zhì)。對(duì)于全身應(yīng)用，典型的抗體劑量將在100pg-lg的范圍，對(duì)于局部應(yīng)用，典型的抗體劑量將在1ng-lmg的范圍。可以施用最初較高的加載劑量，然后是一個(gè)或多個(gè)更低的劑量。典型地，抗體將是完整抗體，如IgGl同種型。這是用于單次治療成年患者的劑量，其可以按比例調(diào)整，用于兒童和嬰兒，并且也可以按照分子量比例，調(diào)整用于其他抗體形式。治療可以根據(jù)醫(yī)生的判斷，以每日、每周兩次、每周或每月的間隔重復(fù)。治療可以每?jī)芍艿?周用于皮下施用，每4周-8周用于靜脈內(nèi)施用。治療可以是周期性的，并且施用之間的階段是約2周或更多，如約3周或更多、約4周或更多，或約每月1次。可以在手術(shù)前和/或手術(shù)后給予治療，和/或可以在手術(shù)治療的解剖部位直接施用或涂li。按照本文的描述，本發(fā)明的結(jié)合成員可以離體使用，用于確定樣品中CXCL13的水平。所述方法通常包括在允許結(jié)合成員與CXCL13結(jié)合的條件下使樣品與本發(fā)明的結(jié)合成員接觸，并且測(cè)量樣品中結(jié)合的CXCL13的水平?？梢詫XCL13的水平與合適的標(biāo)準(zhǔn)或?qū)φ者M(jìn)行比較。獲得樣品，并且預(yù)測(cè)所述個(gè)體的CXCL13水平。例如，該方法可以用于診斷或預(yù)后類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的疾病嚴(yán)重程度，所述方法包括確定獲自患有或懷疑患有類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的個(gè)體的合適樣品，如血清或滑液樣品中的CXCL13水平。與對(duì)照樣品相比，升高的CXCL13水平表示存在疾病，并且CXCL13水平和疾病嚴(yán)重程度之間存在正相關(guān)。實(shí)施例測(cè)定材^f和方法60材料C//(9G^5細(xì)胞表達(dá)G蛋白Gqi5(SEQIDNO:19)的CHOKl細(xì)胞。07(9Ggz5/2CYO5細(xì)胞或C//(9Gz5/zCXCA5c咲4細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)人CXCR5(SEQIDNO:17)的CHOGqi5細(xì)胞。差本必i^舉^差卩GAco3/095」/%#必資瘋差^(^/&07/7^PCv4MP都定^《/定凝秦差基本必須培養(yǎng)基(Gibco31095),其中含有0.5mM3-異丁基-l-甲基黃噤呤(Sigma17018)P/o非必須氨基酸(Gibco11140)0.1%BSAZ/77^都;t^a4MP-ZL665溶濕包含XL665(—種別藻藍(lán)蛋白染料，80kD大小，直接偶聯(lián)于cAMP)的溶液,亍//77^"^尸#定^凝合參凝？一濕//ZRi7^V定^在-cJA/尸^f力炎必合參溶濕,于Z^4M:鵬c贏尸*定*縱潛#差Hanks平衡鹽溶液(SigmaH8264),其中含有5mMHEPESpH7.40.5mM3-異丁基-l-曱基黃。票呤(Sigma17018)0.1%BSA^于Z^A^C五⑧c」M尸X/""F/wor-戎cJMP用染料AlexaFluor-647標(biāo)記的cAMP特異性抗體，配制在50mMTrisHC1(pH7.8)鹽溶液，0.9%氯化鈉，0.1。/oBSA,0.05%疊氮化鈉(防腐劑)中。丄v4AC五⑧yivJ^濕合參Dw/Z)ecco政處^五ag/e潛#差(1)爐歸f7謂.加，」各瘋應(yīng)麼^A^A/-率必資減差^(7m^roge"JCZC丄"謬爭(zhēng)^C"2屮^^^^V定潛券差含有10%(v/v)熱滅活的胎牛血清(FBS)的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)(I麵trogen)不含L-谷氨酰胺的1%(v/v)MEM-非必須氨基酸(Invitrogen)CXCZJ3滲爭(zhēng)^0^+/^^灣定#襲^^^4'溶濕y^7fCTCX"謬##C"2+^"i豸定WF/wo"AW襲Yf濕合參125mMNaCl5mMKC11mMMgCl21.5mMCaCl230mMHepes2JmM丙磺舒(4-(二丙基氨磺酰)苯曱酸)5mM葡萄糖P/o(v/v)熱滅活的FBS,于^j/2CXO5勿/《^趟必^^/定的乂并^差.'(RPMI-1640Sigma,Cat#R0883),含有10%胎牛血清(FCS);1%青霉素,鏈霉素和谷氨酰胺(PSG);1%丙酮酸鈉；1.5昭/ml噤呤霉素和0.1%2-卩-巰基乙醇。方法CXCL13受體-配體結(jié)合測(cè)定(FMAT)CXCL13受體配體結(jié)合測(cè)定用熒光微體積測(cè)定技術(shù)(FMAT)(Dietz等人1996,Miraglm等人1999,Mellentm-Michelotti等1999)測(cè)量生物素化的人CXCL13(Almac)和B300.19細(xì)胞(Almac)上超量表達(dá)的CXCR5之間的相互作用。該測(cè)定可以用于篩選抑制CXCL13:CXCR5相互作用的scFV周質(zhì)粗提物或純化的scFv。選捧輸出物篩選為200mMTris緩沖液pH7.4,0.5M蔗糖中制備的含scFV的稀釋的周質(zhì)粗提物。在含有0.025。/o牛血清白蛋白(BSA)和0.01%疊氮化鈉的Hanks平衡鹽溶液(SigmaH8264)中進(jìn)行樣品和試劑的所有稀釋。在384孔透明底非結(jié)合表面板(Costar3655)中，以50|uL的總測(cè)定體積，室溫下將稀釋的樣品(20iliL)與1nM生物素化的人CXCL1325ng/mL鏈霉親和素FMAT-Blue(AppliedBiosystems4362492)和B300.19CXCR5細(xì)胞(4000個(gè)細(xì)胞/孔)一起溫育2小時(shí)。分別用測(cè)定緩沖液或3nM最終測(cè)定濃度的抗人CXCL13單克隆抗體(R&DSystemsMAB801)設(shè)定總的結(jié)合和非特異性結(jié)合(NSB)對(duì)照。采用FL1門控<1600大小<15和色比<0.4的WangGoldman算法，在AppliedBiosystems纟田62胞才全測(cè)系統(tǒng)8200上對(duì)板讀數(shù)，并且分析數(shù)據(jù)。采用公式l，從FL1總數(shù)據(jù)確定％特異性結(jié)合，其中總的NSBFL1是非特異性結(jié)合對(duì)照孔的平均值，總的結(jié)合FL1是總的結(jié)合對(duì)照孔的平均值。公式1:%特異性結(jié)合=(總的樣品FLl-總的NSBFL1)X100(總的結(jié)合FL1-總的NSBFL1)HTRFcAMP測(cè)定通過激活腺苷酸環(huán)化酶家族，增加細(xì)胞中的3，,5，環(huán)腺苷酸(cAMP)水平，所述酶催化三磷酸腺苷(ATP)轉(zhuǎn)化為cAMP和焦磷酸。CXCL13與其G蛋白偶聯(lián)的受體CXCR5的結(jié)合可以導(dǎo)致腺苷酸環(huán)化酶的下調(diào)，因此通過釋放抑制腺苷酸環(huán)化酶的G-蛋白亞基Gai的釋放，降低細(xì)胞cAMP水平。我們4吏用了HTRF(均相時(shí)間釋;改分辨的)cAMP測(cè)定試劑盒(CisBioInternational62AM4PEC)來測(cè)定細(xì)胞cAMP水平。在CXCL13HTRFcAMP測(cè)定中，測(cè)量了穩(wěn)定表達(dá)CXCR5的CHOGqi5細(xì)胞中CXCL13介導(dǎo)的cAMP水平的降低。用腺苦酸環(huán)化酶激活物NKH477(TocrisCookson1603),即一種7片溶性毛喉素衍生物共刺激細(xì)胞，確保CXCL13反應(yīng)位于HTRFcAMP測(cè)定試劑盒的檢測(cè)線性范圍內(nèi)?？梢杂迷摐y(cè)定來確定scFVs用于抑制CHOGqi5hCXCR5細(xì)月包中細(xì)胞cAMP水平的CXCL13介導(dǎo)的調(diào)節(jié)作用的效價(jià)。除非特別指出，在測(cè)定培養(yǎng)基(含有0.5mM3-異丁基-l-甲基黃嘌呤(Sigma17018),1%非必須氨基酸(Gibco11140)和0.1%BSA的基本必須培養(yǎng)基(Gibco31095))中制備scFv樣品、試劑和CHOGqi5hCXCR5細(xì)胞。從組織培養(yǎng)燒瓶收獲CHOGqi5hCXCR5細(xì)胞，以1.2乂106個(gè)細(xì)胞/ml重懸于測(cè)定培養(yǎng)基中。根據(jù)制造商的說明書(CisBioInternational),將cAMP-XL665和抗-cAMP銪穴狀化合物在蒸餾水中重配。在384孔低體積板(Costar3676)中，室溫下將scFVs與4nM人(SEQIDNO:14)或獼猴(SEQIDNO:16)CXCL13(MEL細(xì)胞來源的)一起溫育30分鐘。將5iul預(yù)先溫育的樣品轉(zhuǎn)移到測(cè)定板(Costar3676)中，然后加入2.5piNKH477和2.5|aLCHOGqi5hCXCR5細(xì)胞懸浮液，得到含有0.5NKH477和3000個(gè)細(xì)胞/孔的10jal的最終反應(yīng)體積。采用以下對(duì)照_沒置每個(gè)板NKH477對(duì)照(CHOGqi5hCXCR5細(xì)胞和0.5|uMNKH477),CXCL13對(duì)照(2nMCXCL13,0.5NKH477和CHOGqi5hCXCR5纟田胞)，基本cAMP對(duì)照(僅有CHOGqi5hCXCR5細(xì)胞)和陰性對(duì)照(僅有測(cè)定培養(yǎng)基)。也在每個(gè)實(shí)'瞼中進(jìn)行CXCL13和NKH477滴定，以確保用于測(cè)定中的濃度在EC50-EC85范圍內(nèi)，因此在HTRFcAMP測(cè)定試劑盒的檢測(cè)線性范圍內(nèi)。添加細(xì)胞后，將板在室溫下溫育30分鐘，然后通過加入5jalcAMP-XL665溶液終止反應(yīng)。此后在陰性對(duì)照孔中加入5)ul綴合物裂解^爰沖液，或在所有其他孔中加入5pi抗cAMP銪穴狀化合物溶液。將測(cè)定板在室溫下溫育2小時(shí)，然后用EnVision平板讀數(shù)器(PerkinElmer)讀出620nm和665nm發(fā)射波長(zhǎng)處的時(shí)間分辨的熒光。通過計(jì)算每個(gè)樣品的AP/。值分析數(shù)據(jù)。根據(jù)公式2計(jì)算AF。/。，其中CXCL13對(duì)照△F。/。是CXCL13對(duì)照孔的平均值，NKH477對(duì)照△F%是NKH477對(duì)照孔的平均值。公式2:△F。/oK樣品665nm/620nm比值V(陰性對(duì)照665nm/620nm比值)X100(陰性對(duì)照665nm/620nm比值)隨后用AF。/。值計(jì)算如公式3描述的％抑制。公式3:%才卬制=(樣品△F%-CXCL13對(duì)照△F%)_X100(NKH477對(duì)照△F%-CXCL13對(duì)照△F%)采用scFV濃度滴定來確立通過測(cè)定中的IC5o值測(cè)量的克隆凌支價(jià)。用GraphPadPrism軟件，通過采用4參數(shù)對(duì)數(shù)公式(公式4)的曲線擬合來確定ICs。值。公式4:丫=底部+(頂部-底部)/(l+l(KX(LogEC50-X"斜率)X是濃度的對(duì)數(shù)。Y是％抑制。CXCL13LANCEcAMP測(cè)定CXCL13LANCEcAMP測(cè)定的原理與對(duì)CXCL13HTRFcAMP測(cè)定概括的原理類似，但是用LANCEcAMP測(cè)定試劑盒(PerkinElmerAD0263)測(cè)量細(xì)胞cAMP水平。可以用CXCL13LANCEcAMP測(cè)定來確定用NKH477共刺激后對(duì)于CHOGqi5hCXCR5細(xì)胞中cAMP水平的CXCL13介導(dǎo)的降低的抑制的IgGs效價(jià)。除非特別指出，所有的稀釋都在測(cè)定培養(yǎng)基(含5mMHEPESpH7.4,0.5mM3-異丁基-l-甲氧基黃嘌呤(Sigma17018)和0.1%BSA的Hanks平衡鹽溶液(SigmaH8264))中進(jìn)行。從組織培養(yǎng)燒瓶收獲CHOGqi5hCXCR5細(xì)胞，以1.2X1()6個(gè)細(xì)胞/ml重懸于測(cè)定培養(yǎng)基中。以1:100的稀釋度將AlexaFluor-647抗-cAMP抗體加入細(xì)胞懸浮液中。在使用前至少15分鐘，根據(jù)制造商的說明書制備含有1:2250稀釋的銪-W8044鏈霉素和1:750倍稀釋的生物素-cAMP的LANCE⑧檢測(cè)混合物。銪-W8044是具有DCA(二氯三。秦基)反應(yīng)臂的銪螯合物。在384孔低體積板(Costar3676)中，室溫下將IgG樣品與4nM人(SEQIDNO:14)或獼猴(SEQIDNO:16)CXCL13(MEL細(xì)胞來源的)一起溫育1小時(shí)。將5iul預(yù)先溫育的樣品轉(zhuǎn)移到白色ProxiplatePlus384孑L測(cè)板(PerkmElmerCatno.6008280)中。AlexaFluor-647抗-cAMP抗體/CHOGqi5hCXCR5細(xì)胞懸浮液(5|uL),得到含有1|uMNKH477和3000個(gè)CHOGqi5hCXCR5細(xì)胞/孔和1:200稀釋的AlexaFluor-647抗-cAMP抗體的10|ul的最終反應(yīng)體積。采用以下對(duì)照設(shè)置每個(gè)板NKH477對(duì)照(CHOGqi5hCXCR5細(xì)胞/AlexaFluor-647抗-cAMP抗體和1j^MNKH477)和CXCL13對(duì)照(2nMCXCL13,1|uMNKH477和CHOGqi5hCXCR5細(xì)胞/AlexaFluor-647抗-cAMP抗體)。也在每個(gè)實(shí)-驗(yàn)中進(jìn)4亍CXCL13和NKH477滴定，以確保用于測(cè)定中的濃度在EC5o-EC85范圍內(nèi)，因此在LANCEcAMP測(cè)定試劑盒的檢測(cè)線性范圍內(nèi)。添加細(xì)胞懸浮液后，將板在室溫下溫育30分鐘，然后通過加入10|ul65LANCE⑧檢測(cè)混合物到所有孔中而終止反應(yīng)。詞匯在陰性對(duì)照孔中加入5pl綴合物裂解緩沖液，或在所有其他孔中加入5iul抗cAMP銪穴狀化合物溶液。將板在室溫下溫育3小時(shí)，然后用EnVision平一反讀數(shù)器(PerkinElmer)確定665nm波長(zhǎng)處的發(fā)射。用665nm發(fā)射數(shù)據(jù)計(jì)算公式7中描述的％抑制，其中CXCL13對(duì)照665nm發(fā)射是CXCL13對(duì)照孔的平均值，NKH477對(duì)照665nm發(fā)射是NKH477對(duì)照孔的平均值。公式7:%抑制=(樣品665nm發(fā)射-CXCL13對(duì)照665nm發(fā)射)X100(NKH477對(duì)照665nm發(fā)射-CXCL13對(duì)照665nm發(fā)射)用GraphPadPnsm軟件，通過采用4參數(shù)對(duì)數(shù)公式(參見公式4)的曲線擬合來確定ICso值。CHOGqi5hCXCR5c4.4CXCL13誘導(dǎo)的Ca2+釋放測(cè)定以lx105個(gè)細(xì)胞/孔將CHOGqi5hCXCR5c4.4細(xì)胞接種在96孔黑壁聚-D-賴氨酸處理的組織培養(yǎng)測(cè)定板(BD)中。然后將細(xì)胞在100|uL測(cè)定培養(yǎng)基(Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)(Invitrogen)，10%(v/v)熱滅活的胎牛血清(FBS)(Invitrogen),不含L-谷氨酰胺的1%(v/v)MEM-非必須氨基酸(Invitrogen))中，在潮濕的氣氛中，在37°C和5%C02中培養(yǎng)過夜。采用商購(gòu)試劑盒(Fluo-4免洗鈣測(cè)定試劑盒F36206,MolecularProbes),如下采用免洗FLIPR方案。通過將10mis測(cè)定緩沖液(1XHanks平衡鹽溶液中的20mMHEPES)和100)ul4-(二丙基氨磺?；?苯曱酸儲(chǔ)液(測(cè)定緩沖液中的250mM)力口入單個(gè)管型瓶的Fluo-4NW染一?；旌衔镏校苽淙玖霞虞d溶液。從細(xì)胞吸出培養(yǎng)基，加入70iul/孔的染沖牛加載溶液，37。C下溫育30分鐘，然后室溫下溫育30分鐘。在此溫育階,殳后，在FLIPR緩沖液(125mMNaCl,5mMKC1,1mMMgCl2,1.5mMCaCl2,30mMHepes,2.5mM4-(二丙基氨磺酰基)苯曱酸，5mM葡萄糖和1%(v/v)熱滅活的FBS)中制備純化的IgGs的滴定液，并且也在FLIPR緩沖液中與CXCL13(100nM終濃度)一起在37°C下溫育30分鐘。溫育后，在萸光計(jì)成像平板讀數(shù)器系統(tǒng)(FLIPR)中測(cè)量標(biāo)記的細(xì)胞對(duì)CXCL13/IgG滴定液的反應(yīng)。用470-495nm激發(fā)濾光器和515-575nm發(fā)射濾光器在x120秒的讀數(shù)階段測(cè)定細(xì)胞內(nèi)鈣敏感性染料的熒光。通過將每個(gè)孔的最大峰值高度輸出到Excel(Microsoft)，分析數(shù)據(jù)。用缺乏抑制劑的情況下對(duì)CXCL13的反應(yīng)，將抑制劑數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化為CXCL13誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)Ca"的百分比，并且將反應(yīng)扣除到單獨(dú)的測(cè)定緩沖液。在Prism(GraphPad)中進(jìn)行進(jìn)一步的分析，其中將數(shù)據(jù)作為對(duì)照反應(yīng)的百分比對(duì)IgG濃度的對(duì)數(shù)作圖。用Prism曲線擬合軟件(Graphpad)計(jì)算IC50值。CXCL13熒光連接的免疫吸附測(cè)定(FLISA)CXCL13FLISA測(cè)量采用熒光微體積測(cè)定技術(shù)(Dietz等人1996,Swartzman等人1999)測(cè)量與鏈霉親和素珠偶聯(lián)的生物素化的人CXCL13(Almac)與IgG形式的CXCL13結(jié)合成員之間的相互作用。該測(cè)定可以用于確定與竟?fàn)帨y(cè)定形式中的相關(guān)趨化因子家族成員相比，生物素化的人CXCL13的IgGs的特異性。樣品和試劑在測(cè)定緩沖液(含有0.1%BSA,0.1%Tween-20和0.01%疊氮化鈉的磷酸緩沖液)中稀釋。室溫下將0.25nM生物素化的CXCL13(Almac)與0.004%w/v6-8|um4連霉親和素包#皮的聚苯乙烯顆粒(SpherotecSVP^0-》一起預(yù)先溫育1小時(shí)。然后將珠子在3000rpm離心5分鐘，棄去上清液，將沉淀物重新懸浮于原始體積的測(cè)定緩沖液中，得到0.004%w/v珠/生物素化的人CXCL13混合物。將10iuL竟?fàn)幬?、測(cè)定緩沖液(總結(jié)合對(duì)照)或過量的人CXCL13(非特異性結(jié)合(NSB)對(duì)照)加入384孔的透明底非結(jié)合表面測(cè)定板(Costar3655)中。然后加入10luL5nM山羊抗人(H+L)AlexaFluor-647(InvitrogenA21445)、10)uL0.31nM抗體1(種系化的IgG)和20pL珠/生物素化的CXCL13混合物，室溫下將板溫育4小時(shí)。在AppliedBiosystems細(xì)胞檢測(cè)系統(tǒng)8200上讀出FL1信號(hào)。采用大小門控3-12,色比<0.4,最小計(jì)數(shù)20的WangGoldman算法分析數(shù)據(jù)。采用公式8從FL1數(shù)據(jù)確定％特異性結(jié)合，其中NSBFL1是非特異性結(jié)合對(duì)照孔的平均值，并且總結(jié)合FL1是總結(jié)合對(duì)照孔的平均值。67公式8:%特異性結(jié)合=(樣品FLl-NSBFL1)X100(總結(jié)合FL1-NSBFL1)用GmphPadPrism軟件，通過采用4參數(shù)對(duì)數(shù)公式(參見公式4)的曲線擬合來確定IC5o值?？贵w1(種系化的IgG)與人和獼猴CXCL13的相互作用的BIAcore評(píng)估試,CXCIJ3人CXCL13(MEL細(xì)胞表達(dá)的)0.1mgmL-l，預(yù)期的平均質(zhì)量9,694.53Da,10.31|uM。稀釋到6nM,是6,869jliLHBS-EP中的4|uL。獼猴CXCL13(MEL細(xì)胞表達(dá)的)0.6mgmL-l,稀釋到0.3mgmL-l，預(yù)期平均質(zhì)量9,670Da,31.02pM)。稀釋到6nM,是20,678HBS-EP中的4)liL。免疫球蛋白抗體1(種系化的)4.42mgmL-l(例如3a);1.06mgmL-l(例如3b)l亍^滋辨h^j法芯片制備參見實(shí)施例32對(duì)于每個(gè)實(shí)—瞼周期(方向1)，通過以5pL/mm滴定抗體1(種系化的IgG!)的0.5|uL/mLHBS-EP溶液，用Fc2蛋白G的表面捕獲240-385Rus抗體l(種系化的IgG!)。然后以100(aL/min的流速，使HBS-EP緩沖液中的人或獼猴CXCL13的指定稀釋液(對(duì)于人CXCL13是0.25,0.3125,0.50,0.625,1.0,1.25,2.55.0,10.0和20.0nM或?qū)τ讷J猴是0.125,0.25,0.50,1.0,2.0,5.0,10.0,20.0和40.0nM)流過芯片表面(締合時(shí)間2.5分鐘，解離IO分鐘，用20|iL10mM甘氨酸pH1.75的脈沖然后20|uL10mM甘氨酸pH1.50的脈沖進(jìn)行再生)。用單獨(dú)的HBS-EP制備空白注射液。制備所有的溶液，在聚丙二醇中儲(chǔ)存。^于多滋,/W^i法在10mM醋酸緩沖液pH4.5中將抗體稀釋到1.0|Lig/mL。用標(biāo)準(zhǔn)的胺連接化學(xué)(用胺偶聯(lián)試劑盒BR-1000-50)在CM3芯片(BIAcore,BR-1005-41,批號(hào)1160100有效期至07年4月)上建立空白(Fcl)和IgG的500RU表面。采用的洗滌溶液是甘氨酸pH2.0。使人和獼猴CXCL13流過芯片表面。在HBS-EP》爰沖液中建立每種CXCL12的系列稀釋液(0.10,0.20,0.30,0.40,0.50和0.60nM)，以30pL/mm流過所有流動(dòng)室(締合時(shí)間4分鐘，解離IO分鐘，用20fiL10mM甘氨酸pH2.0的^K沖兩次進(jìn)4亍再生)。用相同的緩沖液制備空白注射液。所有溶液都在丙二醇中制備和+者存。scFv重新定為IgGl形式通近將Vh和VL結(jié)構(gòu)域分別亞克隆到表達(dá)完整抗體重鏈和輕鏈的載體中，將克隆從scFV轉(zhuǎn)化到IgG形式。將VH結(jié)構(gòu)域克隆到含有人重鏈恒定區(qū)和調(diào)節(jié)元件的載體(pEU15.1)中，以便在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)完整的IgGi重鏈。類似地，將Vt結(jié)構(gòu)域克隆到用于表達(dá)人輕鏈恒定區(qū)和調(diào)節(jié)元件的載體中，以便在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)完整的IgG輕鏈(pEU3.4用于k輕鏈，pEU4.4用于入)。用于表達(dá)重鏈和輕鏈的載體最初在Persic等，1997中描述。對(duì)載體進(jìn)行了工程化，從而允許載體的附加型復(fù)制。為了獲得IgGs,將表達(dá)重鏈和輕鏈IgG的載體轉(zhuǎn)染到EBNA-HEK293哺乳動(dòng)物細(xì)胞中。將IgGs表達(dá)并分泌到無血清的培養(yǎng)基中。合并收獲物，過濾，然后純化。用蛋白A層析來純化IgG。將培養(yǎng)上清液加樣到合適大小的陶瓷蛋白A(BioSepra)柱上，用50mMTns-HClpH8.0,250mMNaCl洗滌。用O.IM一寧檬酸鈉(pH3.0)/人柱上洗脫結(jié)合的IgG,通過加入Tns-HCl(pH9.0)進(jìn)行中和。用NaplO柱(Amersham,#17-0854-02)將洗脫的材料緩沖液交換到PBS中，基于IgG的氨基酸序列(Machl992),用消光系數(shù)分光光度確定IgG的濃度。用SEC-HPLC和通過SDS-PAGE分析純化的IgGs的聚集或降解。HTRF⑧表位竟?fàn)帨y(cè)定可以用HTRJXg)表位竟?fàn)帨y(cè)定來確定結(jié)合成員結(jié)合生物素化的CXCL13之間的竟?fàn)?。該測(cè)定中測(cè)試的抗體分子可以例如是scFv或IgG形式。HTRF⑧技術(shù)的原理如本文所描述。在用于確定結(jié)合成員與具有氨基酸序列SEQIDNO:11的抗體scFv分子竟?fàn)幗Y(jié)合CXCL13的能力時(shí)，在穴狀化合物標(biāo)記的ScFv(SEQIDNO:11)、生物素化的人CXCL13和鏈霉親和素XLent(與XL665交聯(lián)的鏈霉親和素，在優(yōu)化的條件下偶聯(lián))之間形成FRET復(fù)合物。與穴狀化合物標(biāo)記的scFv識(shí)別相同(或可能重疊)的表位的scFV或IgG將竟?fàn)幣c生物素化的CXCL13的結(jié)合，因此減少測(cè)定信號(hào)。在測(cè)定緩沖液(磷酸緩沖液，0.1%BSA,0.4M氟化鉀)中進(jìn)行樣品和試劑的所有稀釋。將生物素化的人CXCL13(AlmacAlmac)和鏈霉親和素-XLent(CisBioInternational611SAXLB)在室溫下預(yù)溫育30分鐘。將10pL樣品(scFv或IgG)、測(cè)定緩沖液(總結(jié)合對(duì)照)或50X最終測(cè)定濃度的未標(biāo)記的IgG(以確定非特異性結(jié)合(NSB))加入384孔低體積板(Costar3676)，然后加入5|uL預(yù)先溫育的生物素化的CXCL13/鏈霉親和素Xlent混合物。將板室溫下溫育l小時(shí)，然后加入5iliL穴狀化合物標(biāo)記的ScFv。室溫下將板溫育3小時(shí)，然后用EnVision平板讀數(shù)器(PerkmElmer)確定620nm和665nm發(fā)射波長(zhǎng)處的時(shí)間分辨的熒光。CXCL13、鏈霉親和素-XLent和穴狀化合物標(biāo)記的IgG的光濃度可以進(jìn)行滴定，以確定產(chǎn)生合適的測(cè)定信號(hào)的每種試劑的濃度。通過計(jì)算每個(gè)樣品的AF。/。值，分析數(shù)據(jù)(參見公式5)。公式5:AFo/。二〖樣品665nm/620nm比)—(NSB665nm/620nm比)X100(NSB665nm/620nm比)隨后用AF。/。值計(jì)算公式6中描述的。/。特異性結(jié)合，其中NSBAF。/。是非特異性結(jié)合對(duì)照孔的平均值，總結(jié)合AF。/。是總結(jié)合對(duì)照孔的平均值。公式6:%特異性結(jié)合=(樣品AFo/。-NSBAF%)X100(總結(jié)合AFQ/。—NSBAF%)用GraphPadPrism軟件，通過采用4參數(shù)對(duì)數(shù)公式(參見公式4)的曲線擬合來確定IC50值。公式4:Y二底部+(頂部-底部)/(l+10八((LogEC50-Xf斜率))X是濃度的對(duì)數(shù)。Y是y。抑制。B300.19hCXCR5細(xì)胞CXCL13驅(qū)動(dòng)的趨化性測(cè)定在進(jìn)行測(cè)定前至少兩天，用培養(yǎng)基(含10。/。胎牛血清(FCS);1%青霉素、鏈霉素和谷氨酰胺(PSG);1%丙酮酸鈉；1.5|ig/ml嘌呤霉素和0.1%2匿卩-巰基乙醇的RPMI-1640Sigma，Cat#R0883)在37。C,5%C02的潮濕的氣氛下將B300.19hCXCR5細(xì)胞調(diào)節(jié)到5xl05個(gè)細(xì)l包/ml。測(cè)定當(dāng)天，對(duì)B300.19hCXCR5細(xì)胞計(jì)數(shù)，在離心和在緩沖液(RPMI-1640(SigmaCat#R0883)+0.35%BSA(SigmaCat#A2153))中洗滌一次后調(diào)節(jié)到6xl()6個(gè)細(xì)胞/ml。在測(cè)定緩沖液中進(jìn)行IgGs的滴定。在37°C，5%C02的潮濕氣氛下，將IgGs與ED80濃度的CXCL13—起預(yù)先溫育30分鐘。該溫育階—險(xiǎn)后，將31)nl/孔的預(yù)先溫育的CXCL13和IgG轉(zhuǎn)移到趨化性板(ReceptorTechnologies,Cat#106-5)的下室中，其中采用反向滴定以避免氣泡。然后在孔上加上濾膜，固定每個(gè)角。然后將B300.19hCXCR5細(xì)胞(6xl06個(gè)細(xì)胞/ml)分散到趨化性濾器上室的圈出的區(qū)域中。將趨化性板上蓋上蓋子，在潮濕的氣氛(37。C，5。/oC02)中溫育2小時(shí)。溫育2小時(shí)后，從溫育箱取出板，洗滌，以便從濾器表面除去過量細(xì)胞。這是通過將PBS灌注在膜表面并且用細(xì)胞刮刀(Corning,Cat#3011)除去所有過量細(xì)胞/PBS而實(shí)現(xiàn)的。然后將趨化性板在1500rpm離心10分鐘，留下濾器。旋轉(zhuǎn)后，取下濾膜，將趨化性板的下室的內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到含有8(Hi1/孔的測(cè)定緩沖液和15pl/孔的裂解緩沖液(H20+9%Tnton-X)的96孔聚苯乙烯平底板(Cornmg,Cat#3598)(酶促板)。將板在潮濕的氣氛下(37。C，5%002)溫育1小時(shí)。然后使每個(gè)板進(jìn)行非放射性細(xì)胞毒性測(cè)定，其測(cè)量細(xì)胞裂解時(shí)釋放的乳酸脫氬酶(LDH),即一種穩(wěn)定的胞質(zhì)溶膠酶。該測(cè)定提供了細(xì)胞數(shù)目的定量測(cè)量值。CytoTox96非放射性細(xì)胞毒性測(cè)定(PromegaCat#G1780)由以下試劑組成5個(gè)管型弁瓦的底物混合物；60ml測(cè)定纟爰沖液;25plLDH陽性對(duì)照(未使用過)；3ml裂解溶液(10X)(未使用過)；65ml終止溶液(1M乙酸)；1方案。對(duì)于LDH測(cè)量，使測(cè)定緩沖液解凍；取出12ml,將未^f吏用的部分迅速儲(chǔ)存在-20。C。37°C水浴可以用于l吏測(cè)定緩沖液解凍。將12ml的測(cè)定緩沖液溫?zé)岬绞覝?避光)。將12ml室溫的測(cè)定緩沖液加入一瓶底物混合物中。倒置，輕柔振蕩，以使底物混合物溶解。一瓶將提供足夠的用于兩個(gè)％孔板的底物。一旦重懸，底物應(yīng)該避免強(qiáng)的直接光照，并且立即使用。將50pl重配的底物混合物加入酶測(cè)定板的每個(gè)孔中，所述板含有從趨化性測(cè)定板轉(zhuǎn)移的裂解的樣品。用金屬箔或不透明盒覆蓋板，使其避光，并且在室溫下溫育30分鐘。在每個(gè)孔中加入5o^a終止溶液。用注射器針頭使大氣泡破裂，記錄加入終止溶液后1小時(shí)內(nèi)490或492nm處的吸光度。將數(shù)據(jù)輸入GraphPadPnsm4,該軟件基于產(chǎn)生的劑量反應(yīng)曲線產(chǎn)生IC50值。人扁桃體B細(xì)胞CXCL13驅(qū)動(dòng)的趨化因子測(cè)定在地區(qū)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)下在扁桃體切除手術(shù)后從患者獲得人扁桃體。將樣品加入含10%胎牛血清，1%青霉素(10,000單位/ml)+鏈霉素(10mg/ml)+谷氨酰胺(200mM)溶液(Sigma:G1146)的RPMI-1640(Sigma:R0883)培養(yǎng)基中，得到100單位/ml青霉素+0.1mg/ml鏈霉素+2mM谷氨酰胺溶液，100)ug/ml慶大霉素(Sigma:G1522)，0.1%卩-巰基乙醇(Gibco:31350-010),1%丙酮酸鈉(Sigma:S8636),1%非必須氨基酸(Gibco:11140-035)的終濃度。用細(xì)胞分離篩(60目大小)(Sigma:CD1)從扁桃體組織分離原代扁桃體B細(xì)胞。然后通過300g(1500rpm)下離心，洗滌細(xì)胞懸浮液5分鐘。棄去上清液，將細(xì)胞沉淀重懸于總共20ml冷的組織培養(yǎng)基中。將細(xì)胞懸浮液鋪在20mlFicollhypaque(Lymphoprep)(AxisShields:1114544)上，以2000rpm離心15分鐘，以除去死細(xì)胞、細(xì)胞碎屑和紅細(xì)胞。用塑料巴斯德移液管取出位于淋巴細(xì)胞制備物和組織培養(yǎng)基的界面上的細(xì)胞，并且轉(zhuǎn)移到15ml離心管中。用冷的組織培養(yǎng)基將細(xì)胞懸浮液制成15ml的體積，并且在1500rpm下離心5分鐘。棄去上清液，并且將細(xì)胞沉淀重新懸浮于10ml冷的組織培養(yǎng)基中。用coulter計(jì)數(shù)器進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)。將細(xì)胞調(diào)節(jié)到5xl()S個(gè)細(xì)胞/ml的濃度，并且用l|ug/mlLPS培養(yǎng)過夜(大約20小時(shí))。溫育后，離心并在緩沖液(RPMI-1640(SigmaCat#R0883)+0.35%BSA(SigmaCat#A2153))中洗滌一次后將扁桃體細(xì)胞調(diào)節(jié)到lxl()7個(gè)細(xì)胞/ml。然后纟姿照前面對(duì)B300.19hCXCR5細(xì)胞的描述，進(jìn)4亍趨化性測(cè)定。ELISA中天然hCXCL13與抗體1(種系化的IgGl)的結(jié)合在地區(qū)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)下，將全血采集到肝素化的容器中。將血液緩慢鋪于等體積的淋巴細(xì)胞制備物上，用stnpette移入50mlFalcon管中。室溫下關(guān)掉制動(dòng)，以2000rpm將管離心25分鐘。用巴斯德移液管除去淋巴細(xì)胞層，轉(zhuǎn)移到新的Fisher50ml管中。然后用預(yù)熱的RPMI-1640(Sigma:R0883)培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞。然后通過在打開制動(dòng)的條件下以1500rpm離心10分鐘而洗滌細(xì)胞。棄去上清液，然后通過在打開制動(dòng)的條件下以1500rpm離心10分鐘而將細(xì)胞再洗滌兩次。對(duì)于最終的洗滌，將沉淀重新懸浮于50mlRPMI中，取出200)^1樣品，用于采用Coulter計(jì)數(shù)器進(jìn)行計(jì)數(shù)。最終洗滌后，將細(xì)胞重新懸浮于適量培養(yǎng)基(含10%胎牛血清，1%青霉素(10，000單位/ml)+鏈霉素(10mg/ml)+谷氨酰胺(200mM)溶液(Sigma:G1146)的RPMI-1640(Sigma:R0883))中,得到100單位/ml青霉素+0.111^/1111鏈霉素+2mM谷氨酰胺的終濃度，以獲得3.3乂106個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞濃度。然后將細(xì)胞分散到6孔聚苯乙烯組織培養(yǎng)板中，每孔3ml。這得到了大約lxlO"個(gè)細(xì)胞/孔的最終細(xì)胞數(shù)目。設(shè)置盡可能多的板，用于6天的刺激。73%002溫育3-4小時(shí)。在此溫育期間，應(yīng)該將單核細(xì)胞粘附于孔的底部，留下其他細(xì)胞群在懸浮液中。溫育后，將含有非貼壁細(xì)胞的3ml培養(yǎng)基輕柔吸出每個(gè)孔，棄去，僅僅留下每個(gè)孔底部的貼壁單核細(xì)胞。在每個(gè)板的每個(gè)孔中，加入3ml,新鮮培養(yǎng)基。加入以下刺激物人M-CSF(R&DSystems:216-MC-025),獲得50ng/ml的終濃度，+人IL-4(R&DSystems:204-MC-025),獲得25ng/ml的終濃度。l個(gè)孔不受刺激，作為對(duì)照，其中含有單獨(dú)的培養(yǎng)基。刺激6天后，在37。C,5%C02,在所有受刺激的孔中加入LPS過夜，達(dá)到l|iig/ml的終濃度。用LPS過夜刺激后，用stripette從每個(gè)孔取出上清液。合并所有上清液，然后分配到15ml試管(每管10ml)中。將約500W收集到eppendorff管中，用于通過ELISA進(jìn)行定量。根據(jù)制造商的說明書，進(jìn)行通過ELISA的CXCL13定量。(R&Dsystems:Quantikme人CXCL13/BLC/BCA-1免疫測(cè)定Cat.N。DCX130)然后在陽離子交換樹脂上純化含有天然CXCL13的上清液，滲析到PBS中，用ELISA重新定量。為了顯示天然CXCL13與抗體1(種系化的IgGj的結(jié)合，用CAZ-1040(5|ug/ml200jal/孔)包被maxi-sorp高結(jié)合96孔板。同樣，在ELISA試劑盒中，提供用非特異性抗CXCL-13抗體包一皮的板。然后將純化的天然CXCL13加入抗體1包一皮的和試劑盒提供的板中。然后根據(jù)制造商的i兌明書(R&Dsystems:QuantikineHumanCXCL13/BLC/BCA-1Immunoassay.Cat.N。DCX130)進(jìn)行ELISA?？贵w1以相等的配體濃度結(jié)合天然CXCL13和重組CXCL13(試劑盒中提供的標(biāo)準(zhǔn)物)，在測(cè)定中得到相等的信號(hào)。結(jié)合成員干擾CXCL-13的H/D交換速度在50mMTris.HClpH7.4,150mMNaCl中以0.5mg/ml使用CXCL13。在PBS(1.54mMKH2P04,2.71mMNa2HP04,155mMNaClpH7.2)中以10.6mg/ml使用抗體。根據(jù)制造商的說明書將抗體偶聯(lián)于POROSAL樹脂(AppliedBiosystems)，制備100(il柱，保持在1°C。用在75%D20中制備的50mMTris.HClpH7.5，150mMNaCl洗滌74200880005506.4說明書第68/85頁柱子。在用75%D20制備的緩沖液中將CXCL13稀釋到0.125mg/ml,并且溫育150,500,1500和5000秒，然后注射到抗體柱上。迅速用H20中的0.2ml緩沖液洗滌柱，然后溫育相同的時(shí)間段，即，交換到D20中150s的樣品交換回到H20中150秒，在500,1500和5000秒，對(duì)于樣品也是類似的。通過注射前面的80pl和隨后40^il0.8%甲酸，洗脫不同的時(shí)間點(diǎn)。收集后40pl，加入1。C的2M脲，1MTCEPpH3。將全部混合物注射到10(Hil含有胃蛋白酶的柱上，以便將蛋白消化為能通過采用12-28.5%乙腈梯度的rpHPLC分離的肽，在ThermoFinniganLCQ電噴射質(zhì)譜M義和MicromassQ-TOF質(zhì)i普4義上測(cè)定質(zhì)量。用SEQUEST軟件程序(ThermoFinniganSanJose,CA)筌定親本肽離子的序列。基本按照上文描述的步驟確定抗體對(duì)CXCL13的不同部分的交換速度的影響，具有以下例外首先在含有H20的緩沖液中將CXCL13稀釋到0.125mg/m,然后注射到用H20中制備的50mMTris.HClpH7.5,150mMNaCl預(yù)先洗滌的柱上。結(jié)合后，用H20中制備的50mMTris.HClpH7.5,150mMNaCl洗滌柱子，然后用75%D20中制備的50mMTris.HClpH7.5,150mMNaCl溫育150,500,1500和5000秒，然后交換回到H20中，并且如上文所述進(jìn)行處理。實(shí)施例1:抗體前導(dǎo)分離人脾cDNA用作對(duì)人CXCL13的可讀框進(jìn)行PCR的才莫板。將其克隆到哺乳動(dòng)物表達(dá)載體(pEV3)中，用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MEL細(xì)月包。通過用可商購(gòu)的抗CXCL13抗體的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液的蛋白印跡鑒定最高表達(dá)CXCL13的克隆MEL細(xì)胞系。通過將pH調(diào)節(jié)到6，從表達(dá)蛋白的MEL細(xì)胞的培養(yǎng)基純化重組的CXCL13,然后將其加入陽離子交換柱。在含有1MNaCl的pH6的MES緩沖液中洗脫CXCL13。將樣品直接加入Resourcerpc柱，用0.1%TFA中最高達(dá)90%的乙腈梯度洗脫。合并含CXCL13的級(jí)份，濃縮，并且通過在Superdex75柱上層析而純化，產(chǎn)生〉95%純度的材料。通過SDS-PAGE和LCMS分析純化的蛋白，顯示具有9690Da的質(zhì)量。1.1/人scFv噬菌體展示文庫選擇將克隆到基于絲狀噬菌體M13的噬菌粒載體中的大單鏈Fv(scFv)人抗體文庫用于選擇(Vaughan1996,Hutchmgs2001)?；景凑找郧暗拿枋?Vaughan1996),用化學(xué)合成的生物素化人CXCL13(Almac)上的一系列選"^循環(huán)，,人噬菌體展示文庫分離抗CXCL13特異性scFV抗體。簡(jiǎn)言之，使PBS-Marvel中的純化的噬菌體(3%w/v)在溶液中與生物素化的人CXCL13結(jié)合1小時(shí)。然后按照制造商的推薦，將與抗原結(jié)合的scFv噬菌體捕獲在鏈霉親和素包,皮的順磁珠(Dynabeads⑧M-280)上。通過采用PBS-Tween(0.1%v/v)和PBS的一系列洗滌循環(huán)，除去未結(jié)合的噬菌體顆粒。洗脫結(jié)合的噬菌體顆粒，感染到細(xì)菌中，挽救用于下一輪選擇(Vaughan1996)。使來自第二輪選擇的代表性數(shù)目的單個(gè)克隆在96孔板中生長(zhǎng)。ScFV在細(xì)菌周質(zhì)中表達(dá)，并且用熒光微體積測(cè)定技術(shù)(FMAT),根據(jù)它們抑制生物素化的人CXCL13(Almac)與B300.19hCXCR5細(xì)胞上表達(dá)的其受體CXCR5結(jié)合的能力進(jìn)行篩選。對(duì)測(cè)定中作為粗制樣品對(duì)CXCL13:CXCR5相互作用顯示顯著抑制作用的ScFvs進(jìn)行DNA測(cè)序(Vaughan1996,Osbourn1996)。再次在細(xì)菌中表達(dá)獨(dú)特的scFvs,并且通過親和層析純化(如Banmster2006中的描述)。通過在4十對(duì)人和獼賓吳(cyno)非人靈長(zhǎng)動(dòng)物CXCL13(都來源于MEL細(xì)胞)的scFvHTRFcAMP(3，，5，環(huán)腺苷酸)測(cè)定中測(cè)試系列稀#奪的純化scFvs,確定IC50值。1.2確定功能活性.抑制CXCL13刺激的環(huán)AMP形成在CXCL13HTRFcAMP測(cè)定中，測(cè)量了用腺苦酸環(huán)化酶激活物NKH477(0.5iuM)共刺激CHOGqi5hCXCR5細(xì)胞后，CXCL13的前導(dǎo)scFvs介導(dǎo)的cAMP水平降低的抑制。針對(duì)2nM人CXCL13(MEL細(xì)胞來源的)或2nM獼猴CXCL13(MEL細(xì)胞來源的)的最終濃度確定1(:50值(參見表l)。關(guān)于測(cè)定方法的細(xì)節(jié)，參見"測(cè)定材料和方法，，部分。<table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table>表1.//77^@CXCZJ3,/定哞我人CZCZJ3卩-f坊/C50±i，"炎《」4;錄撥CYC丄"^炎游」scFv(^A種系化^」1.3LANCECXCL13cAMP測(cè)定中IgGs的效價(jià)在LANCEcAMP測(cè)定中確定重新定為IgG!的克隆的活性(參見材料和方法)。該測(cè)定的原理與HTRFcAMP測(cè)定相似，但是采用LANCEcAMP測(cè)定試劑盒(PerkinElmer)來確定細(xì)胞cAMP水平。關(guān)于測(cè)定方法的細(xì)節(jié)，參見"測(cè)定材料和方法"部分。在CXCL13LANCEcAMP測(cè)定中，確定用&泉苷酸環(huán)^:酶激活物NKH477(1)liM)共刺激CHOGqi5hCXCR5細(xì)胞后，MEL細(xì)胞來源的CXCL13(2nM人CXCL13或2nM獼猴CXCL13)介導(dǎo)的cAMP水平降低的IgG抑制的ICso值(例如，數(shù)據(jù)參見表2)。<table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table>表2./^4ACEGTCZJ3c」A/尸#/定f我7kffiX勿應(yīng)^源^乂CYC"3游/G。i77炎^^戈錄凝CTCX"=6#炎蕃」^我#//gG(^A并屑必^」妓,^^辨1.4表達(dá)重組CXCR5的B300.19細(xì)胞中CXCL13請(qǐng)導(dǎo)的趨化性的抑制用人重組CXCR5轉(zhuǎn)染的B300.19hCXCR5細(xì)胞(一種鼠前B細(xì)胞系)在趨化性測(cè)定中檢測(cè)IgGs。針對(duì)產(chǎn)生大約ED80反應(yīng)的非糖基化的人CXCL13的濃度(12.32nM)滴定IgGs。下表顯示了抗體1IgG(非種系化的)的IC50值(nM)士SEM。每種IgG測(cè)試至少3次。<table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table>表3./zCXCW5老必嫂豸定^在#//gG#值A(chǔ)^±S￡A/^,辨1.5CXCL13誘導(dǎo)的釣釋放的抑制用G蛋白Gqi5和人CXCR5轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞系評(píng)估對(duì)CXCL13誘導(dǎo)的釣釋方文的IgG活性。用人CXCL13刺激這些細(xì)月包，通過誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存物的釋放和從細(xì)胞外介質(zhì)流入，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)Ca"以濃度依賴性方式增加。這可以用鈣敏感性染料在熒光成像平板讀數(shù)器(FLIPR)中測(cè)量。在該測(cè)定中，針對(duì)100nM人CXCL13(MEL細(xì)胞來源的)確定通過IC5o值確定的抗CXCL13IgG的抑制活性。對(duì)抗體1(非種系化的)獲得的IgG效價(jià)示于表4中。所有測(cè)定中都包括了陽性測(cè)定對(duì)照。關(guān)于測(cè)定方法的完整細(xì)節(jié)，參見"測(cè)定材料和方法"?？寺∶QIgGIC50nM(n喝抗體1(非種系化的)17.1±11.2表4.介爭(zhēng)^C//(9G^'5/zCXC尺5Q^釋放測(cè)定^我沐//gGf必#,放#卩i^夕/c5fl土恭,4j實(shí)施例2:抗體種系化i2.1抗體種系化將抗CXCL13抗體的VH和VL結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列與VBASE數(shù)據(jù)庫(Tomlmson1997)中的已知人種系序列進(jìn)行比對(duì)，通過序列相似性鑒定最近的種系。對(duì)于抗體1的VH結(jié)構(gòu)域，這是VH3-23。對(duì)于VL結(jié)構(gòu)域，它是VK1L12。無須考慮保持不變的Vernier殘基(Foote1992),VH結(jié)構(gòu)域的構(gòu)架區(qū)中有8個(gè)改變，VL結(jié)構(gòu)域中有3個(gè)改變，通過采用合適i秀變引物(VH中的Q1E,V5L,R16G,V23A,G24A,H39Q,G83R和R105Q,VL中的I15V,A58V和D70E)的標(biāo)準(zhǔn)定點(diǎn)i秀變技術(shù)，它們都回復(fù)為指出的種系序列，以形成種系化的IgG^2.2種系化的抗體1IgG在LANCEcAMP測(cè)定中的效價(jià)用1.3部分概括的LANCECXCL13cAMP測(cè)定，比較種系化的和78親本(非種系化的)抗體1IgG抑制人或獼猴CXCL13(MEL細(xì)胞來源)對(duì)CHOGqi5hCXCR5細(xì)胞中cAMP水平的調(diào)節(jié)的效價(jià)。1。50值示于表5中?？寺∪薈XCL13獼猴CXCL13IC50nM(n數(shù)目)IC5。nM(n數(shù)目)抗體1(親本)1.4±0.5(n=10)0.3±0.1(n=6)抗體1(種系化的)1.6±0.3(n=4)0.3±0.1(n=4)表5.Z^VC￡CZC丄/3cJM尸都定^#屑必^和#本戎#//gG/在乂成,拔CXCZ"^放,^f衫/C50±^^,i,"炎《」親本和種系化的抗體1IgG在該測(cè)定中顯示相似的活性。2.3種系化的抗體1IgG在采用B300.19hCXCR5細(xì)胞的趨化性測(cè)定中的效價(jià)在采用B300.19hCXCR5細(xì)胞的趨化性測(cè)定中測(cè)試完全種系化的抗體1IgGl。針對(duì)非糖基化和糖基化的人CXCL13以及糖基化的獼猴CXCL13的ED80濃度滴定IgGs。結(jié)果作為IC5o值(nM)±SEM示于下表6。IgGs至少測(cè)定3次。<table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table>歸士5"五A/^^辨2.4種系化的抗體1IgG對(duì)CXCL13誘導(dǎo)的鈣釋放的抑制在1.5部分一既況的FLIPR測(cè)定中比4支種系^i的和親本(非種系化的)抗體1IgG的效價(jià)。<table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table>2.5種系化的抗體1IgG對(duì)人CXCL13的特異性用CXCL13FLISA(熒光連接的免疫吸附測(cè)定)測(cè)定種系化的抗體1IgG!相對(duì)于趨化因子的CXC家族的其他成員，對(duì)人CXCL13(MEL細(xì)胞來源的)的特異性。在該測(cè)定中，測(cè)試趨化因子CXCL3(R&DSystems),CXCL5(R&DSystems),CXCL6(R&DSystems),CXCL8(R&DSystems),CXCLIO(R&DSystems)和CXCL12(Peprotech)與固定在鏈霉親和素珠上的生物素化人CXCL13(Almac)對(duì)種系化的抗體1IgG!的結(jié)合的竟?fàn)?。采用熒光微體積測(cè)定技術(shù)(細(xì)節(jié)參見"測(cè)定材料和方法")，用熒光標(biāo)記的抗人IgG抗體檢測(cè)生物素化的人CXCL13抗體結(jié)合相互作用。結(jié)果示于表8。標(biāo)準(zhǔn)趨化因子名稱(ZlotmkandYoshie,2000)與它們最常用的同義詞一起給出。<table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table>表8.^必^子"/伊#^參#^#乂CYCL"與種,必#在#//gGW潛合W^辨r農(nóng)i^W^的^幾J人CXCL13和獼猴CXCL13與生物素化的人CXCL13竟?fàn)幗Y(jié)合種系化的抗體lIgGi。其他測(cè)試的趨化因子最高達(dá)1)LiM濃度時(shí)都沒有顯示對(duì)生物素化的人CXCL13抗體1IgG的抑制。實(shí)施例3a:抗體對(duì)人和獼猴CXCL13的親和力3.1通過BIAcore測(cè)量而確定抗體親和力基本如Karlsson等，1991的描述，用BIAcore2000光學(xué)生物傳感器(BIAcoreAB,Upsalla,Sweden)通過表面等離子共振(SPR)進(jìn)行動(dòng)力學(xué)結(jié)合參數(shù)的確定。也參見測(cè)定材料和方法部分。方向1.分別在標(biāo)準(zhǔn)化的CM5芯片(BIAcore,BR-1000-14)的流動(dòng)室(Fc)1和2上用標(biāo)準(zhǔn)胺連接化學(xué)建立空白和蛋白G，(SigmaP4689)的265RU表面。用這種Fc2蛋白G，表面捕獲240-385Rus抗體l(種系化的IgG!)。流動(dòng)室(Fc)配體反應(yīng)1(結(jié)合的RU)1空白(HBS-EP)n/a2蛋白G，(在lOmM醋酸緩沖液pH4.5中稀釋到20|ug/mL)265表9.然后使人和獼猴CXCL13的稀釋液(在HBS-EP緩沖液中)以100juL/min的流速流過芯片。擬合fFc2-7凝蕃^^C^##脊移艱#好L"wgmw,>漠剪擬合條件(在BIAevaluation3.2上進(jìn)行)扣除雙空白(乂人IgG流動(dòng)室數(shù)據(jù)扣除空白流動(dòng)室，,人數(shù)據(jù)集的其余部分扣除空白注射液(0.01MHEPESpH7.4,0.15MNaCl,3mMEDTA，0.005%v/v表面活性劑P20,HBS-EP))。局部將空白R(shí)I貢獻(xiàn)都設(shè)置為0。采用具有質(zhì)量轉(zhuǎn)移限制的1:1Langmmr才莫型，將HBS-EP扣除和RI設(shè)置為0,基于0.25-20nM人CXCL13曲線(IO種濃度)，獲得以下參數(shù)。<table>tableseeoriginaldocumentpage82</column></row><table>表10a.<table>tableseeoriginaldocumentpage82</column></row><table>表10b.采用具有質(zhì)量轉(zhuǎn)移限制的1:1Langmmr模型，將HBS-EP扣除和RI設(shè)置為0，基于0.125-40nM獼猴CXCL13曲線(12種和9種濃度)，獲得以下參數(shù)。<table>tableseeoriginaldocumentpage82</column></row><table>表11.<table>tableseeoriginaldocumentpage83</column></row><table>表lib.適于抗體l(種系化的)的獼猴CXCL13與人CXCL13產(chǎn)生了非常相似的Ko值，表明對(duì)每種變體的親和力非常相似。方向2.分別在標(biāo)準(zhǔn)化的CM5芯片(BIAcore,BR-1000-14)的流動(dòng)室(Fc)2和3上用標(biāo)準(zhǔn)胺連接化學(xué)建立空白(Fc1)和鏈霉親和素(Perbio/Pierce2U25)的228和303RU表面。用這種Fc3鏈霉親和素表面捕獲在C末端附近生物素化的28Rus人CXCL13(Almaccustomsynthesis)。然后使大小排阻層析層析單體化的抗體1的Fab片段的稀釋液(在HBS-EP緩沖液中稀釋)以30juL/mm的流速流過芯片表面。炎凝^Z^mgwwzr^f曹擬合條件(在BIAevaluation3.2上進(jìn)行)扣除雙空白(從IgG流動(dòng)室數(shù)據(jù)扣除空白流動(dòng)室，從數(shù)據(jù)集的其余部分扣除空白注射液(0.01MHEPESpH7.4,0.15MNaCl,3mMEDTA,0.005%v/v表面活性劑P20,HBS-EP))。局部將空白R(shí)I貢獻(xiàn)都設(shè)置為0。采用具有質(zhì)量轉(zhuǎn)移限制的1:1Langmmr模型，將HBS-EP扣除和RI設(shè)置為0,基于0.065-2.105nM抗體1(種系化的IgGjFab曲線，獲得以下參數(shù)。ka(M-ls-l)kd(s-l)RmaxKDChi228RUs人CXCU38.98e61.66e隱341.61.85e-100.394表1383實(shí)施例3b:抗體對(duì)人CXCL13的親和力在實(shí)施例3a闡述的更全面數(shù)據(jù)之前，按照下文的描述用較低的CXCL-13濃度分布確定最初親和力數(shù)據(jù)0=1)。也參見材料和方法部分。3.1b通過BIAcore測(cè)量而確定抗體親和力基本如Karlsson等，1991的描述，用BIAcore2000光學(xué)生物傳感器(BIAcoreAB,Upsalla,Sweden)通過表面等離子共振(SPR)進(jìn)行動(dòng)力學(xué)結(jié)合參數(shù)的確定。在CH3芯片(BIAcore,BR-1000-41)上用標(biāo)準(zhǔn)胺連接化學(xué)建立空白(Fc1)和稀釋在10mM醋酸緩沖液pH4.5中的抗體l(種系化的IgG!)的500RU表面。流動(dòng)室CFc)配體反應(yīng)1目標(biāo)(結(jié)合的RU)(RU)1空白(HBS-EP)n/a—2抗體1(種系化的)579.9500表14.然后使人和獼猴CXCL13的稀釋液流過芯片表面。擬合f/炎蕃的丄""gmz^漠f擬合條件(在BIAevaluation3.2上進(jìn)4亍)扣除雙空白(從IgG流動(dòng)室數(shù)據(jù)扣除空白流動(dòng)室，從數(shù)據(jù)集的其余部分扣除空白注射液(0.01MHEPESpH7.4,0.15MNaCl,3mMEDTA,0.005%v/v表面活性劑P20,HBS-EP))。局部將空白R(shí)I貢獻(xiàn)都設(shè)置為0。采用1:1Langmmr模型，將HBS-EP扣除和RI設(shè)置為0,基于0.10-0.60nM人CXCL13曲線，獲得了以下參數(shù)。ka(M陽ls-l)kd(s-l)Rmax(RU)KDChi2579RUs抗體1(種系化的)2.02e65.24e畫454.22.59e-100.183表15.84采用1:1Langmmr模型，將HBS-EP扣除和RI設(shè)置為0，基于O.IO-0.60nM獼猴CXCL13曲線，對(duì)于每種IgG,獲得了以下參數(shù)。<table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table>表16.實(shí)施例4:抑制原代B細(xì)胞的CXCL13誘導(dǎo)的趨化性4.1抑制從小鼠脾分離的原代淋巴細(xì)胞的CXCL13誘導(dǎo)的趨化作用從小鼠脾新鮮分離原代淋巴細(xì)胞，用LPS培養(yǎng)過夜。然后將細(xì)胞用于通過可商購(gòu)的鼠CXCL13(R&DSystems)或人CXCL13(MEL細(xì)胞來源的)刺激的趨化性測(cè)定中?？贵w1IgG(非種系化的)的IC5o數(shù)據(jù)(nM)示于下表12中(僅顯示n=l和n=2的數(shù)據(jù))。<table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table>實(shí)施例5:人扁桃體B細(xì)胞CXCL13驅(qū)動(dòng)的趨化性測(cè)定1.4抑制人扁桃體B細(xì)胞中CXCL13誘導(dǎo)的趨化性從人扁4兆體新鮮分離原代扁桃體B細(xì)胞，用LPS培養(yǎng)過4復(fù)。然后用ED80濃度(100nM)的人非糖基化CXCL13(ABL-MEL細(xì)胞來源的)將細(xì)胞用于趨化性測(cè)定中。關(guān)于測(cè)定方法的細(xì)節(jié)，參見"測(cè)定材料和方法"部分?？贵w1(種系化的IgG!)的IC50數(shù)據(jù)(nM)示于表17中0=4的數(shù)據(jù))。IgG抗體1(種系化的IgG!)IC50(nM)9.59+/-1.6表17實(shí)施例6:ELISA中天然hCXCL13與抗體1(種系化的IgG，)的結(jié)合如"測(cè)定材料和方法"部分所述，在測(cè)定中，抗體l(種系化的IgGl)以相同的配體濃度結(jié)合天然CXCL13和重組CXCL13,得到相同的信號(hào)。實(shí)施例7:抗體l(種系化的IgG0干擾CXCL-13的H/D交換速度在第一個(gè)實(shí)-驗(yàn)中，CXCL13交換溶液中的D20,然后結(jié)合固定于柱上的抗體l(IgGl)。然后，它反向交換到H20中，同時(shí)仍然與抗體柱結(jié)合，導(dǎo)致在反向交換反應(yīng)中表位受到保護(hù)，并且隨后用氘標(biāo)記。在第二個(gè)實(shí)-驗(yàn)中，CXCL13首先與柱上的抗體1結(jié)合，然后用D20標(biāo)記，最后交換回到H20中，同時(shí)仍然與柱結(jié)合，使得CXCL13的部分都不,皮氖標(biāo)記。然后確定兩個(gè)實(shí)驗(yàn)之間肽質(zhì)量的差異。兩個(gè)實(shí)驗(yàn)之間氘化水平的差異是與抗體結(jié)合時(shí)交換延遲的度量。該方案的詳細(xì)方法提供在材料和方法部分。具有SEQIDNO14所示序列的、在MEL細(xì)胞中表達(dá)的人CXCL13用于此研究中。顯示對(duì)H/D交換速度具有最大干擾的區(qū)域是在人CXCL-13的氨基酸31-42之間(SEQIDNo.20)。在pH7，在缺乏抗體的條件下，跨幾乎整個(gè)分子的交換速度都非?？欤崾痉浅＞哂腥嵝缘慕Y(jié)構(gòu)。當(dāng)結(jié)合于抗體時(shí)，跨分子中心的交換減緩。這表明除了31-42的主要結(jié)合，可能具有其他相互作用部位，其具有較弱的結(jié)合。表18顯示了氖化水平的百分比差異，其中比較了當(dāng)結(jié)合于抗體1時(shí)的氣化和交換回到質(zhì)子與結(jié)合于抗體時(shí)溶液中的氚化和交換回到質(zhì)子。當(dāng)對(duì)四個(gè)時(shí)間點(diǎn)取平均值時(shí)超過10%的差異認(rèn)為是顯著的。殘基計(jì)數(shù)是4十對(duì)SEQIDNO.14所示序列。<table>tableseeoriginaldocumentpage87</column></row><table>表18參考文獻(xiàn)本說明書中任何位置引用的所有參考文獻(xiàn)，包括上文任何位置引用的參考文獻(xiàn)，都在此通過全文引用并入本文，并且用于所有目的。1Ansel,KM.etal.Nature,406:309—314,20002Haan&Maggos(2004)BioCentury,12(5):A1-A63Koideetal.(1998)JournalofMolecularBiology,284:1141—1151.4Nygrenetal.(1997)CurrentOpinioninStructuralBiology,7:463-4695Wess,L.In:BioCentury,TheBernsteinReportonBioBusiness,12(42),A1-A7,20046Kabat,E.A.etal,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest.4thEdition.USDepartmentofHealthandHuraanServices.19877Martin,A.C.R.AccessingtheKabatAntibodySequenceDatabasebyComputerPROTEINS:Structure,FunctionandGenetics,25(1996),130-1338Kabat,E.A.etal.(1991)SequencesofProteinsofImnvunologicalInterest,5thEdition.USDepartmentofHealthandHumanServices,PublicService,N工H,Washington9Segaletal.,PNAS,71:4298-4302,197410Amitetal.,Science,233:747—753,198611Chothiaetal.,J.Mol.Biol.,196:901-917,198712Chothiaetal.,Nature,342:877—883,198913Catonetal.,J.Immunol.,144:1965—1968,199014Sharonetal.,PNAS,87:4814-4817,199015Sharonetal.,J.Immunol.,144:4863-4869,199016Kabatetal.,J.Immunol.,147:1709-1719,199117Holliger&Hudson,船t;zreBiote由cdogj/23(9):1126-1136200518Konteriaann,R&Dubel,S,加tijbodygrineering,Springer—VerlagNewYork,LLC;2001,ISBN:354041354519Mendez,M.etal.(1997)NatureGenet,15(2):146-15620Knappiketal.J.Mol.Biol.(2000)296,57-8621Krebsetal.JournalofImmunologicalMethods254200167—8422Ward,E.S.etal.,Nature341,544—546(1989)23McCaffertyetal(1990)Nature,348,552-55424Holtetal(2003)TrendsinBiotechnology21,484—49025Birdetal,Science,242,423—426,198826Hustonetal,PNASUSA,85,5879-5883,198827Holliger,P.etal,Proc.Natl.Acad.Sci.USA906444-6448,199328Reiter,Y.etal,NatureBiotech,14,1239-1245,199629Hu,S.etal,CancerRes.,56,3055-3061,199630Holl丄gerandBohlen1999Cance:randmetastasisrev.18:411—41931Holliger,P.andWinterG.CurrentOpinionBiotechnol4,446—449199332GlennieMJetal.,1987J.Inununol.139,2367-237533ReppR.etal.,1995J.Hemat.377-38234StaerzU,D.andBevanM.J.1986PNAS8335SureshR.etal.,1986MethodEnzymol.121:210-22836Merchandetal.,1998NatureBiotech.16:677—68137Ridgeway,J.B.B.etal,ProteinEng.,9,616-621,199638HarlowandLane,Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborN丄,pp.726,198839K6hlerandMilstein,Nature,256:495-497,197540Wold,eta丄，Multivariatedataanalysisincheraistry.Chieiaoraetrics—MathematicsandStatisticsinChemistry(Ed.:B.Kowalslci),D,ReidelPublishingCompany,Dordrecht,Holland,1984(ISBN90—277—1846-6)41Normanetal.AppliedRegressionAnalysis.Wiley-工nterscience/3rdedition(April1998)工SBN:04711TD82842Kandel,Abraham&Backer,Eric,Computer-AssistedReasoninginClusterAnalysis.PrenticeHallPTR,(May11,1995〉,ISBN:013341884743Krzanowski,Wojtek.PrinciplesofMultivariateAnalysis:AUser'sPerspective(OxfordStatisticalScienceSeries,No22(Paper)),OxfordUniversityPress/(December2000),ISBN:019850708944Witten,IanH.&Frank,Eibe.DataMining:PracticalMachineLearningToolsandTechniqueswithJavaIiaplementat土ons.MorganKaufma國(guó)(October11,1999),ISBN:155860552545DenisonDavidG,T.(Editor),ChristopherC.Holmes,BaniK.Mallick,AdrianF.M.Smith.BayesianMethodsforNonlinearClassificationandRegression(WileySeriesinProbabilityandStatistics).JohnWiley&Sons,-(July2002),ISBN:047149036946Ghose,ArupK.&Viswanadhan,VellarkadN,.CombinatorialLibraryDesignandEvaluationPrinciples,Software,Tools,andApplicationsinDrugDiscovery.ISBN:0—8247-0487-847ChothiaC,etal,JournalMolecularBiology(1992)227,799—81748Al-Lazikani,etal.JournalMolecularBiology(1997〉273(4),927-94849Chothia,eta丄，Science,223,755-758(1986)50Whitelegg,N.R.u.andRees,A.R(2000).Prot.Eng.,12,815—82451Guex,N.andPeitsch,M,C.Electrophoresis(1997)18,2714-272352Altschuletal.(1990>J.Mol.Biol.215:405-41053PearsonandLipraan(1988)PNASUSA85:2444-244854SmithandWaterman(1981)J.MolB土ol.147:195-19755Voet&Voet,Biocheinistiry,2ndEdition,(Wiley)1995.56Grameta2,,1992,Proc.MatJ.Acad.89c3576-358057Barbaseta』.,1994,Proc.TVa亡J.Acac.Sci,,ITSA,且3809-381358Schiera丄，,1996,J.Mol.Sio_t,263.'551-56759MarksetBio/reciincaogy,1992,10:779—78360Kay,B.K.,Winter,J.,andMcCafferty,J.(1996)PhageDisplayofPeptidesandProteins:ALaboratoryManual,SanDiego:AcademicPress61HunterW.M.andGreenwoodF.C.(1962)Nature194:49562Pliickthun,A.Bio/Technology9:545-551(1991)63ChaddHEandChamowSM(2001)CurrentOpinioninBiotechnology12:188-19464AndersenDCandKru雄enL(2002)CurrentOpinioninBiotechnology13:1179065La:r:rickJWandThomasDW(2001)CurrentOpinioninBiotechnology12:411-41866SambrookandRussell,付clecu丄arCMon丄ngr--aiajboratoryi^anual:3rdedition,2001,ColdSpringHarborLaboratQiryPress67Ausubeletal.eds,,ShortProtocolsinMo丄ecu丄arBiologry;ACompendiumof"MethodsfromCurrentProtocolsinAf。_lecularBio_Zogy,JohnWiley&Sons,4thedition199968Sh丄，K.etal.J.Immunol,166:650-655,200169Manzo,A.etal.Eur.J.工艦uno1,35:1347—1359,200570Kim,H—J.eta丄.J.I腿unol,162:3053-3062,199971Carlson,HS.etBlood,104:3021-3027,200472Zheng,B.etArthritis&Rheumatism,52(2):620—626,200573Mazezetti,I.etal.Arthritis&Rheumatism,50(1):112-122,200474Lisignoli,G.eta丄.J.Cell.Physiol,206:78-85,200675Lisignoli,G.ets_Z.ExperimentalGerontology,39:659—665,200476Bugatt丄,S.etArthritis&Rheumatism,52(11):3448—3459,200577Schaerli,P.etJ,Exp.Med,192(11):1553-1562,200078Breitfeld,D.etal.J,Exp.Med,192(11):1545-1551,200079Yu,P.etal.J.Immunol,168:5117-5123,200280Edwards,JCW.etal.Rheum.Dis.Clin.N.Am,30:393—403,200481Edwards,JCW,Cambridge,G.Nature.Rev.Immunol,6:394-403,200682Robinson,J.R.ed，,SustainedandControlledReleaseDrugDeliverySystems,MarcelDekker,Inc.,MewYork,197883LedermannJ.A.etal.(1991)Int.J.Cancer47:659—66484BagshaweK.D.etal.<1991)Antibody,I讓unoconjugatesandRadiopharmaceuticals4:915—92285BannisterD.,WilsonA.,ProwseL.,WalshM.,HolgateR.,JermutusJ.andWilkinsonT.BiotechnologyandBibengineering,94(5):931—93786DietzL,J.,DubrowR.S.,ManianB.S.andSizto.N.L,,Cytometry23:177-186,199687Foote,JandWinterG.J.Mol.Biol,224(2):487-499,199288KarlssonR,,MichaelssonA.andMattssonL.J.Immunol,Methods,145(102):229-240,199189Hutchings,C.GenerationofNaiveHumanAntibodyLibraries,inAntibodyEngineering,R.KonterraannandS.Dubel,Editors.2001,SpringerLaboratoryManuals,Berlin,p.9390Machetal.Anal.Biochera,200(1):20-26,1992100Mellentin-MichelottiJ.,Evangelista,L,,SwartzmanE.E.,Miraglia,S.J,,WernerW,andYuanP.-MAnal.Biochem272:182-190,1999101MiragliaS.,SwartzmanE.E.,Mellentin-MichelottiJ.,Evangelista,L.,SmithC.,Gunawan工.,LohmanK.,GoldbergE.M.,ManianB.andYuanP.-M.JBiomol.Screening4:193-204,1999102Osbourn,JK.etal-工簡(jiǎn)unotechnology,2(3):181-96,1996103Persic,L.etal.Gene.187(1):9—18,1997104SwartzmanE.E.,MiragliaS.J.,Mellentin—MichelottiJ.,EvangelistaL,andYuanP-M.Anal.Biochem271:143-151,1999105Tomlinson,I.,VBASE.MRCCentreofProteinEngineering,Cambridge,UK,1997106Vaughan,TJ.etal.NatureBiotechnology14(3):309-14,1996107Zlotnik,A.andYoshie,O.Immunity12:121-7,20009權(quán)利要求1.CXCL13的分離的結(jié)合成員，其中所述結(jié)合成員抑制CXCL13與CXCR5的結(jié)合，并且其中所述結(jié)合成員與具有氨基酸序列SEQIDNO11的抗體scFv分子競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合CXCL13。2.權(quán)利要求l的結(jié)合成員，其中所述結(jié)合成員包含HCDR3氨基酸序列SEQIDNO:5。3.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的分離的結(jié)合成員，包含抗體1CDRs組HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3,定義為其中HCDR1具有氨基酸序列SEQIDNO:3;HCDR2具有氨基酸序列SEQIDNO:4;HCDR3具有氨基酸序列SEQIDNO:5;LCDR1具有氨基酸序列SEQIDNO:8;LCDR2具有氨基酸序列SEQIDNO:9;并且LCDR3具有氨基酸序列SEQIDNO:10;或包含具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、缺失或插入的抗體1CDRs組。4.CXCL13的分離的結(jié)合成員，其中所述結(jié)合成員抑制CXCL13與CXCR5的結(jié)合，并且其中所述結(jié)合成員包含抗體1CDRs組HCDRl、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，定義為其中HCDR1具有氨基酸序列SEQIDN〇3;HCDR2具有氨基酸序列SEQIDNO:4;HCDR3具有氨基酸序列SEQIDNO:5;LCDR1具有氨基酸序列SEQIDNO:8;LCDR2具有氨基酸序列SEQIDNO:9;并且LCDR3具有氨基酸序列SEQIDNO:10;或包含具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、缺失或插入的抗體1CDRs組。5.權(quán)利要求3或權(quán)利要求4的結(jié)合成員，包含抗體1CDRS組，或包含具有1個(gè)或兩個(gè)取代的抗體1CDRs組。6.權(quán)利要求3或4的結(jié)合成員，包含抗體1CDRS組。7.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的結(jié)合成員，其中所述結(jié)合成員包括抗體分子，所述抗體分子包含抗體VH結(jié)構(gòu)域和抗體VL結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體分子包含CDRs組HCDRl、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3,其中所述VH結(jié)構(gòu)域包含HCDR1、HCDR2、HCDR3和構(gòu)架區(qū)，所述VL結(jié)構(gòu)域包含LCDR1、LCDR2、LCDR3和構(gòu)架區(qū)。8.權(quán)利要求7的結(jié)合成員，其中所述抗體分子是scFv。9.權(quán)利要求7的結(jié)合成員，其中所述抗體分子包含抗體恒定區(qū)。10.權(quán)利要求9的結(jié)合成員，其中所述抗體分子是IgGl。11.權(quán)利要求7-10的任一項(xiàng)的結(jié)合成員，其中所述抗體分子包含人種系基因片段序列的構(gòu)架區(qū)。12.權(quán)利要求7-11的任一項(xiàng)的結(jié)合成員，其中所述抗體VH結(jié)構(gòu)域包含人種系構(gòu)架區(qū)VH3-23。13.權(quán)利要求7-12的任一項(xiàng)的結(jié)合成員，其中所述抗體VH結(jié)構(gòu)域具有一種氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:2具有至少90%序列同一性。14.權(quán)利要求7-11的任一項(xiàng)的結(jié)合成員，其中所述抗體VH結(jié)構(gòu)域氨基酸序列是SEQIDNO:2。15.權(quán)利要求11-14的任一項(xiàng)的結(jié)合成員，其中所述抗體VL結(jié)構(gòu)域包含人種系構(gòu)架區(qū)VK1L12。16.權(quán)利要求11-15的任一項(xiàng)的結(jié)合成員，其中所述抗體分子包含VL結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域具有一種氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:7具有至少90%序列同一性。17.權(quán)利要求11-14的任一項(xiàng)的結(jié)合成員，其中所述VL結(jié)構(gòu)域氨基酸是SEQIDNO:7。18.權(quán)利要求7-10的任一項(xiàng)的結(jié)合成員，其中所述抗體VH結(jié)構(gòu)域氨基酸序列是SEQIDNO:2;并且所述抗體VL結(jié)構(gòu)域氨基酸序列是SEQIDNO:7。19.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的結(jié)合成員，其中所述結(jié)合成員中和人CXCL13與CXCR5的結(jié)合的效價(jià)與所述結(jié)合成員中和獼猴CXCL13與CXCR5的結(jié)合的效價(jià)的差異不超過10倍，其中所述結(jié)合成員中和人CXCL13與CXCR5的結(jié)合的效價(jià)由cAMP測(cè)定中測(cè)量的ICsq表示，所述cAMP測(cè)定采用不超過2nM的人CXCL13濃度，并且其中所述結(jié)合成員中和獼猴CXCL13與CXCR5的結(jié)合的效價(jià)由cAMP測(cè)定中測(cè)量的IC5o表示，所述cAMP測(cè)定采用終濃度為2nM的獼猴CXCL13。20.權(quán)利要求19的結(jié)合成員，其中中和人CXCL13與CXCR5的結(jié)合的效價(jià)與中和獼猴CXCL13與CXCR5的結(jié)合的效價(jià)的差異不超過5倍。21.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的結(jié)合成員，其中在采用終濃度為2nM的CXCL13的人CXCL13cAMP測(cè)定中，測(cè)量出所述結(jié)合成員具有不超過12nM的IC50。22.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的結(jié)合成員，其中在采用終濃度為100nM的CXCL13的人CXCL13釣釋放測(cè)定中，測(cè)量出所述結(jié)合成員具有不超過40nM的IC50。23.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的結(jié)合成員，其中在采用給出大約ED80反應(yīng)的終濃度的人CXCL13和非原代B細(xì)胞系的人CXCL13B細(xì)胞趨化性測(cè)定中，所述結(jié)合成員具有不超過12nM的IC50。24.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的結(jié)合成員，其中采用表面等離子共振，測(cè)量出所述結(jié)合成員以小于400pM的親和力結(jié)合人CXCL13。25.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的結(jié)合成員，其中用表面等離子共振，測(cè)量出所述結(jié)合成員以小于400pM的親和力結(jié)合獼猴CXCL13。26.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的結(jié)合成員，其中所述結(jié)合成員結(jié)合人CXCL-13的表位，并且其中所述表位包括位于成熟的人IL-17A的31-42位的序列Ile-Leu-Pro-Arg-Gly-Asn-Gly-Cys-Pro畫Arg-Lys畫Glu(SEQIDNO:20)的至少一個(gè)殘基。27.權(quán)利要求7-26的任一項(xiàng)的抗體分子的分離的VH結(jié)構(gòu)域。28.權(quán)利要求7-26的任一項(xiàng)的抗體分子的分離的VL結(jié)構(gòu)域。29.組合物，包含權(quán)利要求1-26的任一項(xiàng)的分離的結(jié)合成員和藥學(xué)可4妄受的賦形劑。30.用于通過手術(shù)或療法治療人體或動(dòng)物體的方法中的組合物，包含權(quán)利要求1-26的任一項(xiàng)的分離的結(jié)合成員。31.權(quán)利要求30的組合，用于抑制CXCL13與CXCR5的結(jié)合。32.權(quán)利要求1-26的任一項(xiàng)的分離的結(jié)合成員在制備用于抑制CXCL13與CXCR5結(jié)合的藥物中的用途。33.權(quán)利要求31的組合物或權(quán)利要求32的用途，用于抑制淋巴濾泡的異常形成和/或發(fā)展。34.權(quán)利要求31的組合物或權(quán)利要求32的用途，用于抑制骨和/或軟骨的破壞和/或重塑。35.權(quán)利要求31的組合物或權(quán)利要求32的用途，用于抑制淋巴細(xì)胞的趨化性和/或淋巴瘤的增殖。36.權(quán)利要求31的組合物或權(quán)利要求32的用途，用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、干燥綜合征、多發(fā)性硬化、重癥肌無力、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、自身免疫性曱狀腺疾病、萊姆神經(jīng)疏螺旋體病、HIV感染和/或白血病。37.權(quán)利要求31的組合物或權(quán)利要求32的用途，用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。38.用于治療個(gè)體中與異常CXCL13表達(dá)和/或CXCL13活性相關(guān)的病癥的方法，包括給個(gè)體施用權(quán)利要求1-26的任一項(xiàng)的結(jié)合成員。39.權(quán)利要求38的方法，其中所述CXCL13活性是與CXCR5的結(jié)合。40.權(quán)利要求39的方法，包括抑制個(gè)體中淋巴濾泡的異常形成和/或發(fā)展。41.權(quán)利要求39的方法，包括抑制個(gè)體中骨和/或軟骨的破壞和/或重塑。42.權(quán)利要求39的方法，包括抑制個(gè)體中淋巴細(xì)胞的趨化性和/或、淋巴瘤的增殖。43.權(quán)利要求38-39的任一項(xiàng)的方法，其中所述病癥是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、干燥綜合征、多發(fā)性硬化、重癥肌無力、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、自身免疫性甲狀腺疾病、萊姆神經(jīng)疏螺旋體病、HIV感染和/或白血病。44.權(quán)利要求43的方法，其中所述病癥是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。45.分離的核酸分子，包含編碼權(quán)利要求1-28的任一項(xiàng)的結(jié)合成員或結(jié)合成員的分離的VH或VL結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列。46.用權(quán)利要求45的核酸體外轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。47.生產(chǎn)結(jié)合成員或抗體VH或VL結(jié)構(gòu)域的方法，包括在用于生產(chǎn)結(jié)合成員或抗體VH或VL結(jié)構(gòu)域的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求46的宿主細(xì)胞。48.權(quán)利要求47的方法，進(jìn)一步包括分離和/或純化所述結(jié)合成員、VH結(jié)構(gòu)域或VL結(jié)構(gòu)域。49.權(quán)利要求47或權(quán)利要求48的方法，進(jìn)一步包括將結(jié)合成員、VH結(jié)構(gòu)域或VL結(jié)構(gòu)域配制在包含至少一種另外的成分的組合物中。50.生產(chǎn)CXCL13的抗體抗原結(jié)合域的方法，該方法包括通過在包含HCDRl、HCDR2和HCDR3的親本VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列中添加、缺失、取代或插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸，提供作為親本VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列變體的VH結(jié)構(gòu)域，并且任選將由此提供的VH結(jié)構(gòu)域與一個(gè)或多個(gè)VL結(jié)構(gòu)域組合，以提供一個(gè)或多個(gè)VH/VL組合，所述親本VH結(jié)構(gòu)域HCDR1、HCDR2和HCDR3是抗體1HCDRs組；并且測(cè)試所述作為親本VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列變體的VH結(jié)構(gòu)域或所述VH/VL組合，以鑒定CXCL13的抗體抗原結(jié)合域。51.權(quán)利要求50的方法，其中所述親本VH結(jié)構(gòu)域是權(quán)利要求27的VH結(jié)構(gòu)域。52.權(quán)利要求50或權(quán)利要求51的方法，其中所述一個(gè)或多個(gè)VL結(jié)構(gòu)域是通過在包含LCDR1、LCDR2和LCDR3的親本VL結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列中添加、缺失、取代或插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸而提供的，產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)各自作為親本VL結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列變體的VL結(jié)構(gòu)域，其中所述親本VL結(jié)構(gòu)域LCDR1、LCDR2和LCDR3是抗體1CDRs的VL組。53.權(quán)利要求52的方法，其中所述親本VL結(jié)構(gòu)域是權(quán)利要求28的VL結(jié)構(gòu)域。54.權(quán)利要求50-53的任一項(xiàng)的方法，其中作為親本VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列變體的所述VH結(jié)構(gòu)域是通過CDR誘變提供的。55.權(quán)利要求50-53的任一項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包括生產(chǎn)作為IgG、scFv或Fab抗體分子的成分的抗體抗原結(jié)合域。56.用于生產(chǎn)結(jié)合于CXCL13的結(jié)合成員的方法，該方法包4舌提供編碼VH結(jié)構(gòu)域的起始核酸或各自編碼VH結(jié)構(gòu)域的核酸的起始所有組成成分，其中所述VH結(jié)構(gòu)域包括要被取代的HCDR1、HCDR2和/或HCDR3或缺乏HCDR1、HCDR2和/或HCDR3編碼區(qū)；將所述起始核酸或起始所有組成成分與編碼抗體1的HCDR1、HCDR2和/或HCDR3的氨基酸序列的供體核酸或通過抗體1的HCDR1、HCDR2和/或HCDR3的氨基酸序列突變產(chǎn)生的供體核酸組合，使得所述供體核酸插入起始核酸或起始所有組成成分中的CDR1、CDR2和/或CDR3區(qū)中，從而提供編碼VH結(jié)構(gòu)域的核酸的產(chǎn)物所有組成成分；表達(dá)所述產(chǎn)物所有組成成分的核酸，以產(chǎn)生產(chǎn)物VH結(jié)構(gòu)域；任選將所述產(chǎn)物VH結(jié)構(gòu)域與一個(gè)或多個(gè)VL結(jié)構(gòu)域組合；選擇CXCL13的結(jié)合成員，所述結(jié)合成員包含VH結(jié)構(gòu)域，任選包含VL結(jié)構(gòu)域；并且回收所述結(jié)合成員或編碼它的核酸。57.權(quán)利要求56的方法，其中所述供體核酸是通過所述HCDR1和/或HCDR2的突變產(chǎn)生的。58.權(quán)利要求56的方法，其中所述供體核酸是通過HCDR3的突變產(chǎn)生的。59.權(quán)利要求56的方法，包括通過核酸的隨才幾突變提供供體核酸。60.權(quán)利要求56-59的任一項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包括將回收的結(jié)合成員內(nèi)包含的產(chǎn)物VH結(jié)構(gòu)域連接于抗體恒定區(qū)。61.權(quán)利要求56-60的任一項(xiàng)的方法，包括提供包含產(chǎn)物VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域的IgG、scFv或Fab抗體分子。62.權(quán)利要求50-61的任一項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包括測(cè)試結(jié)合于CXCL13的抗體抗原結(jié)合域或結(jié)合成員中和CXCL13的能力。63.權(quán)利要求62的方法，其中獲得了包括結(jié)合并中和CXCL13的抗體分子的結(jié)合成員。64.權(quán)利要求63的方法，其中所述抗體分子是scFv。65.權(quán)利要求63的方法，其中所述抗體分子是IgG。66.產(chǎn)抗體分子組合物的方法，包括用權(quán)利要求50-65的任一項(xiàng)的方法獲得抗體分子，并且將所述抗體配制于包含至少一種另外的成分的組合物中。全文摘要本發(fā)明涉及CXCL13的結(jié)合成員，特別是抗體分子。所述結(jié)合成員可以用于治療與CXCL13相關(guān)的病癥，包括關(guān)節(jié)炎病癥，如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。文檔編號(hào)C07K16/24GK101636413SQ200880005506公開日2010年1月27日申請(qǐng)日期2008年2月20日優(yōu)先權(quán)日2007年2月21日發(fā)明者F·A·凱斯,W·巴克申請(qǐng)人:阿斯利康(瑞典)有限公司;免疫醫(yī)療有限公司