專利名稱：：蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的表達(dá)的制作方法蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的表達(dá)
背景技術(shù)：
：重組蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)便于蛋白質(zhì)、多肽和肽的生產(chǎn)，所述蛋白質(zhì)、多肽和肽被用作生物藥物或作為多種應(yīng)用的藥物篩選中的靶。細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)成為優(yōu)選的備選方法，主要是由于在細(xì)菌中有效的和經(jīng)濟(jì)的生產(chǎn)，而酵母和桿狀病毒提供了可靠的可選擇的表達(dá)系統(tǒng)。盡管重組表達(dá)系統(tǒng)用于異源蛋白質(zhì)生產(chǎn)用途廣泛，不能依靠現(xiàn)有的方法來(lái)以足夠的數(shù)量生產(chǎn)任何給定的蛋白質(zhì)并具有足夠的同質(zhì)性以滿足下游需求。許多哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)在細(xì)菌中以低產(chǎn)量表達(dá)并具有相當(dāng)差的溶解度。同時(shí)，它們對(duì)于細(xì)菌細(xì)胞是有毒的，特別是如果它們是部分可溶的。許多載體系統(tǒng)被設(shè)計(jì)來(lái)表達(dá)目標(biāo)重組蛋白質(zhì)，所述目標(biāo)重組蛋白質(zhì)作為與短的或更長(zhǎng)的N-末端肽標(biāo)簽的融合蛋白。這些標(biāo)簽的實(shí)例有組氨酸標(biāo)簽或麥芽糖結(jié)合標(biāo)簽，其對(duì)于隨后重組蛋白質(zhì)的純化是特別有用的。然而仍然存在著對(duì)有效的表達(dá)系統(tǒng)的需求，特別是對(duì)于治療性蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)是潛在毒性的并且難以表達(dá)。由于蛋白質(zhì)產(chǎn)量很大程度依賴于轉(zhuǎn)錄和翻譯起始，這樣的系統(tǒng)應(yīng)當(dāng)具有N-末端標(biāo)簽，其賦予高產(chǎn)量并賦予具有低溶解性的融合蛋白，因?yàn)榘w一般被宿主好得多地耐受。并且，對(duì)于天然蛋白質(zhì)的生產(chǎn)，導(dǎo)入的標(biāo)簽應(yīng)當(dāng)是容易切割的。發(fā)明概述本發(fā)明提供了自我復(fù)制的DNA質(zhì)粒，用于在微生物宿主細(xì)胞中N-末端標(biāo)簽化的蛋白質(zhì)的重組表達(dá)，包含DNA標(biāo)簽，所述DNA標(biāo)簽具有編碼式[I]的肽標(biāo)簽的核普酸序列MX!(X2X3)n其中代表K或R;X2代表M、S或T;X3代表K或R;n代表1或更大的整數(shù)；以及其中所述DNA可操作性地連接到啟動(dòng)子序列。根據(jù)本發(fā)明的質(zhì)?？梢赃M(jìn)一步包含核酸序列，所述核酸序列編碼按照閱讀框與所述DNA標(biāo)簽融合的蛋白質(zhì)，用于由融合到所述DNA標(biāo)簽的所述核酸所編碼的N-末端標(biāo)簽化的蛋白質(zhì)的重組表達(dá)。本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的DNA質(zhì)粒的微生物宿主細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了標(biāo)簽化的蛋白質(zhì)，其包含與蛋白質(zhì)融合的N-末端肽標(biāo)簽，其中所述標(biāo)簽具有根據(jù)式I的序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了在微生物宿主細(xì)胞中重組表達(dá)N-末端標(biāo)簽化的蛋白質(zhì)的方法，包括構(gòu)建重組質(zhì)粒的步驟，包括將編碼蛋白質(zhì)的DNA序列按閱讀框插入根據(jù)本發(fā)明的質(zhì)粒的DNA標(biāo)簽的3，，以及將所述重組質(zhì)粒導(dǎo)入宿主孩i生物細(xì)胞，并誘導(dǎo)所述N-末端標(biāo)簽化的蛋白質(zhì)在微生物宿主細(xì)胞中表達(dá)。附圖的說(shuō)明附圖1:標(biāo)簽去除以產(chǎn)生成熟的hIL-21的效力和完成通過(guò)質(zhì)譜法確定，如附圖1,A和B所示。A欄顯示了在標(biāo)簽去除之前的級(jí)分的Maldi譜。B欄顯示了在標(biāo)簽去除之后的相同級(jí)分。附圖2:2A:在MKMK-IL21的DAP/Q-環(huán)化酶處理之前的Maldi質(zhì)譜。具有15948Da的值的單電荷的分子離子，與完整的MKMK-IL21相應(yīng)。2B:在MKMK-IL21的DAP/Q-環(huán)化酶處理之后的Maldi質(zhì)譜。具有15423Da的值的單電荷的分子離子，與具有N-末端焦谷氨酸殘基的IL21相應(yīng)。沒(méi)有觀察到相應(yīng)于完整MKMK-IL21的信號(hào)。附圖3:3A:在MKSK-IL21的DAP/Q-環(huán)化酶處理之前的Maldi質(zhì)譜。具有15911.6Da的值的單電荷的分子離子，與完整的MKSK-IL21相應(yīng)。3B:在MKSK-IL21的DAP/Q-環(huán)化酶處理之后的Maldi質(zhì)譜。具有15429Da的值的單電荷的分子離子，與具有N-末端焦谷氨酸殘基的IL21相應(yīng)。沒(méi)有觀察到相應(yīng)于完整MKSK-IL21的信號(hào)。附圖4:4A:在MKTK-IL21的DAP/Q-環(huán)化酶處理之前的Maldi質(zhì)譜。具有15933.6Da的值的單電荷的分子離子，與完整的MKTK-IL21相應(yīng)。4B:在MKTK-IL21的DAP/Q-環(huán)化酶處理之后的Maldi質(zhì)譜。具有15430.9Da的值的單電荷的分子離子，與具有N-末端焦谷氨酸殘基的IL21相應(yīng)。沒(méi)有觀察到相應(yīng)于完整MKTK-IL21的信號(hào)?？s寫氨基酸丙氨酸(A);精氨酸(R);天冬酰胺(N);天冬氨酸(D);半胱氨酸(C);甘氨酸(G);谷氨酰胺(Q);谷氨酸(E);組氨酸(H);異亮氨酸(I);亮氨酸(L);賴氨酸(K);曱硫氨酸(M);苯丙氨酸(F);脯氨酸(P);絲氨酸(S);蘇氨酸(T);色氨酸(W),酪氨酸(Y);纈氨酸(V).C-末端包含一個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基的、蛋白質(zhì)的羧基(C)-末端部分。hlL-21:人類白細(xì)胞介素-21N-末端包含一個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基的、蛋白質(zhì)的氨基(N)-末端部分。SDSPAGE:十二烷基(月桂基)硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠發(fā)明描述本發(fā)明提供了適合于異源蛋白質(zhì)的重組表達(dá)的DNA標(biāo)簽、表達(dá)載體或質(zhì)粒，以及用于重組蛋白質(zhì)表達(dá)的方法，其與隨后的重組蛋白質(zhì)的純化、重組蛋白質(zhì)的最后加工以按它的天然和活性形式回收蛋白質(zhì)是相容的。根據(jù)本發(fā)明表達(dá)的具有N-末端標(biāo)簽的蛋白質(zhì)具有低溶解度，并將優(yōu)選地表達(dá)到包涵體內(nèi)，其一般^皮宿主好得多地耐受。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了自我復(fù)制的DNA質(zhì)粒，用于在微生物宿主細(xì)胞中N-末端標(biāo)簽化的蛋白質(zhì)的重組表達(dá)，所述質(zhì)粒包含DNA標(biāo)簽，所述DNA標(biāo)簽具有編碼式[I]的肽標(biāo)簽的核苷酸序列MX!(X2X3)n[I]其中代表K或R;X2代表M、S或T;X3代表K或R;n代表1或更大的整數(shù)；術(shù)語(yǔ)"蛋白質(zhì)"、"多肽"和"肽"在此可互換地使用，應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是指由通過(guò)肽鍵連接的至少五個(gè)組成氨基酸組成的化合物。組成氨基酸可以來(lái)自由遺傳密碼編碼的氨基酸的組，它們可以是不由遺傳密碼編碼的天然氨基酸，以及合成氨基酸。不由遺傳密碼編碼的天然氨基酸有例如羥脯氨酸、y-羧基谷氨酸、鳥(niǎo)氨酸、磷酸絲氨酸、D-丙氨酸和D-谷氨酰胺。合成的氨基酸包括通過(guò)化學(xué)合成制造的氨基酸，即，由遺傳密碼編碼的氨基酸的D-同分異構(gòu)體，例如D-丙氨酸和D-亮氨酸、Aib(a-氨基異丁酸)、Abu(a-氨基丁酸)、Tie(叔-丁基甘氨酸)、卩-丙氨酸、3-氨基曱基苯曱酸和鄰氨基苯曱酸。如在此^f吏用的，術(shù)語(yǔ)"DNA標(biāo)簽，^皮定義為編碼N-末端蛋白質(zhì)標(biāo)簽的DNA分子，其^皮添加到編碼異源蛋白質(zhì)的DNA序列上，它在孩吏生物中按閱讀框表達(dá)產(chǎn)生標(biāo)簽化的蛋白質(zhì)或融合蛋白質(zhì)。本發(fā)明的DNA標(biāo)簽編碼具有至少四個(gè)氨基酸并包含如式I定義的氨基酸序列的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，Xi代表K。在一個(gè)實(shí)施方式中，Xi代表R。在一個(gè)實(shí)施方式中，X2代表M或S。在一個(gè)實(shí)施方式中，乂2代表M或T。在一個(gè)實(shí)施方式中，X2代表S或T。在一個(gè)實(shí)施方式中，X2代表M。在一個(gè)實(shí)施方式中，X2代表S。在一個(gè)實(shí)施方式中，X2代表T。在一個(gè)實(shí)施方式中，X3代表K。在一個(gè)實(shí)施方式中，X3代表R。在一個(gè)實(shí)施方式中，n是l到10的整數(shù)。在一個(gè)實(shí)施方式中，n是1到9的整數(shù)。在一個(gè)實(shí)施方式中，n是l到8的整數(shù)。在一個(gè)實(shí)施方式中，n是l到7的整數(shù)。在一個(gè)實(shí)施方式中，n是l到6的整數(shù)。在一個(gè)實(shí)施方式中，n是1到5的整數(shù)。在一個(gè)實(shí)施方式中，n是1到4的整數(shù)。在一個(gè)實(shí)施方式中，n是l到3的整數(shù)。在一個(gè)實(shí)施方式中，n是l到2的整數(shù)。在一個(gè)實(shí)施方式中，n是l。在一個(gè)實(shí)施方式中，n是2。在一個(gè)實(shí)施方式中，n是3。如在實(shí)施例中說(shuō)明的，與編碼融合到N-末端曱硫氨酸的蛋白質(zhì)的對(duì)照序列相比，包含按閱讀框融合到蛋白質(zhì)的編碼序列的、本發(fā)明的DNA標(biāo)簽的DNA序列的表達(dá)，促成了顯著更高水平的蛋白質(zhì)表達(dá)。雖然不希望受理論的限制，相信的是，如果表達(dá)的蛋白質(zhì)以對(duì)宿主細(xì)胞新陳代謝或生長(zhǎng)無(wú)毒的形式積累，例如在包涵體中，宿主微生物細(xì)胞特別是大腸桿菌(五.co")細(xì)胞中重組蛋白質(zhì)表達(dá)被增強(qiáng)。因而，融合到重組蛋白質(zhì)的選定的N-末端蛋白質(zhì)標(biāo)簽可以通過(guò)促進(jìn)它們?cè)诎w中的積累來(lái)增強(qiáng)它們的表達(dá)。許多感興趣的哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)在它們的天然宿主中被分泌，并伴有信號(hào)肽地被合成，信號(hào)肽在分泌期間被切除。因而分泌的成熟蛋白質(zhì)的N-末端在大多數(shù)情況下以不同于曱硫氨酸的氨基酸開(kāi)始，曱硫氨酸是大腸桿菌中所有從頭合成的蛋白質(zhì)，包括異源的、細(xì)胞內(nèi)積累的蛋白質(zhì)的天然的N-末端。為了避免關(guān)于N-末端曱硫氨酸的切割的不確定性，添加如所描述的、具有已知的體外切割性質(zhì)的小的肽標(biāo)簽，在獲得感興趣的成熟蛋白質(zhì)方面是高度有益的。本發(fā)明4是供的DNA標(biāo)簽可以添加到編碼蛋白質(zhì)的DNA序列上，為了它在宿主微生物細(xì)胞特別是細(xì)菌細(xì)胞中的重組表達(dá)。DNA標(biāo)簽在很大數(shù)量的有用蛋白質(zhì)在宿主微生物細(xì)胞中的重組表達(dá)方面具有應(yīng)用，特別是對(duì)于治療性蛋白質(zhì)，例如人生長(zhǎng)激素、IL-20、IL-21和GLP-1的表達(dá)。編碼N-末端肽標(biāo)簽的DNA標(biāo)簽按閱讀框與編碼要表的蛋白質(zhì)的DNA序列融合，從而在宿主細(xì)胞中可獲得的表達(dá)產(chǎn)物是標(biāo)簽化的或融合蛋白質(zhì)。如果DNA標(biāo)簽編碼超過(guò)四個(gè)氨基酸的N-末端肽標(biāo)簽，所述肽標(biāo)簽可以通過(guò)添加二肽來(lái)延長(zhǎng)，它的氨基酸組成適合于通過(guò)二氨基肽酶，例如，二肽基氨肽酶I來(lái)切割它們。表達(dá)的標(biāo)簽化的或融合蛋白質(zhì)可以包含直接融合到要表達(dá)的成熟蛋白質(zhì)的第一氨基酸的肽標(biāo)簽，從而所述肽標(biāo)簽的切割以及二肽的去除將所表達(dá)的蛋白質(zhì)以它的成熟形式釋放。如果表達(dá)的標(biāo)簽化的或融合蛋白質(zhì)的肽標(biāo)簽通過(guò)氨肽酶被除去，希望的是確保表達(dá)的蛋白質(zhì)的成熟形式的氨基酸序列以一殘基開(kāi)始或前面是所述殘基，所述殘基可以作為終止點(diǎn)起作用，超過(guò)該終止點(diǎn)氨肽酶不能繼續(xù)。這樣，表達(dá)的蛋白質(zhì)的成熟形式被保護(hù)免于N-末端蛋白水解切割?？梢宰鳛槎被拿傅慕K止點(diǎn)的適合的氨基酸殘基可以選自Q、P、R、K。氨基酸殘基Q可以用作終止點(diǎn)，憑借它在存在谷氨酸環(huán)轉(zhuǎn)移酶的情況下形成焦谷氨酸的能力。如果成熟蛋白質(zhì)的N-末端氨基酸本身不是可以作為終止點(diǎn)起作用的殘基，希望的是通過(guò)編碼適合的終止殘基的密碼子延伸DNA標(biāo)簽，其然后融合到編碼期望的成熟蛋白質(zhì)的DNA序列上。要添加到肽標(biāo)簽的末端的優(yōu)選的終止殘基是Q，因?yàn)檫@個(gè)殘基可以在肽標(biāo)簽的二肽基氨肽酶切割之后用焦谷氨酰氨肽酶從表達(dá)的蛋白質(zhì)的N-末端除去。當(dāng)按閱讀框融合到要重組表達(dá)的蛋白質(zhì)的編碼序列時(shí)本發(fā)明的DNA標(biāo)簽提供了標(biāo)簽化的蛋白質(zhì)，其肽標(biāo)簽具有帶電極性側(cè)鏈的優(yōu)勢(shì)。在標(biāo)簽化蛋白質(zhì)中額外的帶電殘基的存在在隨后的純化步驟中是特別有用的，所述純化步驟在蛋白質(zhì)質(zhì)量電荷的基礎(chǔ)上進(jìn)行區(qū)分。根據(jù)本發(fā)明的DNA標(biāo)簽可以按閱讀框融合到編碼hlL-21的DNA序列。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例中，根據(jù)本發(fā)明的DNA標(biāo)簽按閱讀框融合到編碼hIL-21、具有SEQIDNO:4的核苦酸序列的DNA分子?？梢赃x擇其他限制性位點(diǎn)，相應(yīng)地調(diào)整序列處于本領(lǐng)域的技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含編碼本發(fā)明的肽標(biāo)簽的DNA標(biāo)簽的表達(dá)載體或表達(dá)質(zhì)粒。所述DNA標(biāo)簽可以插入載體或質(zhì)粒的適合的克隆位點(diǎn)的鄰近或其中，從而所述標(biāo)簽位于啟動(dòng)子序列的下游并與之可操作地連接。優(yōu)選的，所述DNA標(biāo)簽側(cè)翼是限制性酶切割位點(diǎn)，其促進(jìn)編碼要重組表達(dá)的蛋白質(zhì)的DNA序列的下游地按閱讀框地插入。本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易識(shí)別適合的優(yōu)選側(cè)翼序列，以促進(jìn)期望的蛋白質(zhì)的編碼序列的下游按閱讀框克隆。與本發(fā)明的DNA標(biāo)簽可操作地連接的，本發(fā)明的質(zhì)?；蜉d體中的啟動(dòng)子序列具有能夠指導(dǎo)編碼標(biāo)簽化蛋白質(zhì)的DNA分子在選定的宿主微生物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列。適合于在細(xì)菌中特別是在大腸桿菌中重組蛋白質(zhì)表達(dá)的啟動(dòng)子序列是本領(lǐng)域:忮術(shù)人員7>知的，4旦包括T7、trc、lac和tac啟動(dòng)子的任一種。包含了表達(dá)盒的優(yōu)選的載體是自我復(fù)制性的，并具有可選擇標(biāo)記物，例如氨千西林，所述表達(dá)盒包含與本發(fā)明的DNA標(biāo)簽可操作地連接的啟動(dòng)子。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的表達(dá)載體或表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)一步包含編碼要重組表達(dá)的蛋白質(zhì)的DNA序列，其中所述DNA序列克隆到所述DNA標(biāo)簽下游并與所述DNA標(biāo)簽按閱讀框地克隆。在一個(gè)實(shí)例中，克隆到表達(dá)質(zhì)粒中的DNA序列是編碼hIL-21的序列，當(dāng)所述表達(dá)質(zhì)粒被導(dǎo)入適合的宿主細(xì)胞中時(shí)其能夠表達(dá)為標(biāo)簽化的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的表達(dá)載體或表達(dá)質(zhì)粒中編碼hIL-21的DNA序列可以包含SEQIDNO:4的核苷酸序列。適合于標(biāo)簽化蛋白質(zhì)的表達(dá)的、要用本發(fā)明的表達(dá)質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。優(yōu)選的細(xì)菌宿主菌林是大腸桿菌B的衍生菌林，例如，蛋白酶缺陷的菌林大腸桿菌BL21(DE3),其在染色體上帶有T7聚合酶基因。本發(fā)明提供了標(biāo)簽化的蛋白質(zhì)，其包含與蛋白質(zhì)融合的N-末端肽標(biāo)簽，其中所述標(biāo)簽包含式[I]的氨基酸序列MX!(X2X3)n[I]其中代表K或R;X2代表M、S或T;X3代表K或R;以及n代表1或更大的整數(shù)。在一個(gè)實(shí)施方式中，X!代表K。在一個(gè)實(shí)施方式中，Xi代表R。在一個(gè)實(shí)施方式中，X2代表M或S。在一個(gè)實(shí)施方式中，X2代表M或T。在一個(gè)實(shí)施方式中，X2代表S或T。在一個(gè)實(shí)施方式中，X2代表M。在一個(gè)實(shí)施方式中，X2代表S。在一個(gè)實(shí)施方式中，X2代表T。在一個(gè)實(shí)施方式中，X3代表K。在一個(gè)實(shí)施方式中，X3代表R。在一個(gè)實(shí)施方式中，n是l到10的整數(shù)。在一個(gè)實(shí)施方式中，n是1到9的整數(shù)。在一個(gè)實(shí)施方式中，n是l到8的整數(shù)。在一個(gè)實(shí)施方式中，n是l到7的整數(shù)。在一個(gè)實(shí)施方式中，n是l到6的整數(shù)。在一個(gè)實(shí)施方式中，n是1到5的整數(shù)。在一個(gè)實(shí)施方式中，n是1到4的整數(shù)。在一個(gè)實(shí)施方式中，n是l到3的整數(shù)。在一個(gè)實(shí)施方式中，n是l到2的整數(shù)。在一個(gè)實(shí)施方式中，n是l。在一個(gè)實(shí)施方式中，n是2。在一個(gè)實(shí)施方式中，n是3。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述蛋白質(zhì)包含SEQIDNO:2的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述肽標(biāo)簽不是MKMK、MKTK或MKSK。根據(jù)本發(fā)明的標(biāo)簽化蛋白質(zhì)可以通過(guò)本發(fā)明的表達(dá)質(zhì)?；虮磉_(dá)載體的重組表達(dá)來(lái)獲得。標(biāo)簽化蛋白質(zhì)可以經(jīng)歷在此描述的純化步驟，和/或一個(gè)或更多個(gè)蛋白水解加工步驟，用于從標(biāo)簽化蛋白質(zhì)上除去肽標(biāo)簽以提供具有一種或更多種應(yīng)用的成熟蛋白質(zhì)。本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于在宿主微生物細(xì)胞中標(biāo)簽化蛋白質(zhì)的重組表達(dá)的方法，所述標(biāo)簽化蛋白質(zhì)由按閱讀框融合到編碼序列的本發(fā)明的DNA標(biāo)簽所編碼，從而所述融合的DNA序列編碼所述標(biāo)簽化蛋白質(zhì)，以改善表達(dá)的目標(biāo)蛋白質(zhì)的產(chǎn)率。因此，所述方法包括構(gòu)建編碼融合蛋白的表達(dá)質(zhì)?；虮磉_(dá)載體的步驟，所述融合蛋白包含融合到蛋白質(zhì)的N-末端肽，從而所述編碼序列由終止密碼子來(lái)終止。標(biāo)簽化蛋白質(zhì)的表達(dá)由與標(biāo)簽化蛋白質(zhì)的編碼序列可操作地連接的啟動(dòng)子來(lái)指導(dǎo)，由此所述啟動(dòng)子是所述宿主細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)所識(shí)別的啟動(dòng)子。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，用于hlL-21的表達(dá)的表達(dá)載體的構(gòu)建在實(shí)施例1中描述。本發(fā)明的表達(dá)載體或表達(dá)質(zhì)粒被轉(zhuǎn)染到宿主微生物細(xì)胞、優(yōu)選的細(xì)菌大腸桿菌中，被載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞在與宿主細(xì)胞的增殖和標(biāo)簽化蛋白質(zhì)的表達(dá)相容的條件下鑒定、分離和培養(yǎng)。本發(fā)明的標(biāo)簽化蛋白質(zhì)在宿主微生物細(xì)胞中的表達(dá)優(yōu)選的是可誘導(dǎo)的。例如，當(dāng)宿主細(xì)胞是大腸桿菌菌抹時(shí)，表達(dá)被lac操縱子調(diào)節(jié)，表達(dá)可以通過(guò)添加解除lac啟動(dòng)子抑制的約0.5-lmM的異丙基p-D-硫代吡喃半乳糖苦(IPTG)來(lái)誘導(dǎo)。在通過(guò)IPTG適合的誘導(dǎo)之后，例如3-4小時(shí)，宿主細(xì)胞可以被裂解，例如通過(guò)超聲處理或凍融操作，通過(guò)離心將細(xì)胞溶胞產(chǎn)物分離成可溶的和不溶的級(jí)分。標(biāo)簽化蛋白質(zhì)，取決于它的溶解度，可以位于可溶級(jí)分中，或更優(yōu)選的位于與細(xì)胞團(tuán)粒一起分級(jí)分離的包涵體中。當(dāng)標(biāo)簽化蛋白質(zhì)位于包涵體中時(shí)，在它的進(jìn)一步純化之前，溶解和重折疊步驟可能是需要的，采用根據(jù)本領(lǐng)域公知的方案為標(biāo)簽化蛋白質(zhì)優(yōu)化的條件。可以采用各種各樣的蛋白質(zhì)分離和純化方案來(lái)實(shí)現(xiàn)需要的純化程度。測(cè)定本發(fā)明的純化的標(biāo)簽化蛋白質(zhì)和隨后衍生的成熟蛋白質(zhì)的純度的方法是本領(lǐng)域公知的，在實(shí)施例2中進(jìn)行了例示。從本發(fā)明的標(biāo)簽化蛋白質(zhì)上除去肽標(biāo)簽可以采用二肽基氨肽酶，如果終止殘基是Q,其可以與谷氨酰胺環(huán)轉(zhuǎn)移酶組合。標(biāo)簽的除去可以在本發(fā)明的重組表達(dá)的蛋白質(zhì)的純化之前或之后進(jìn)行。以下是本發(fā)明的實(shí)施方式的列表，其不應(yīng)被看作是限制性的。實(shí)施方式1:自我復(fù)制的DNA質(zhì)粒，用于在微生物宿主細(xì)胞中N-末端標(biāo)簽化的蛋白質(zhì)的重組表達(dá)，所述質(zhì)粒包含DNA標(biāo)簽，所述DNA標(biāo)簽具有編碼式[I]的肽標(biāo)簽的核苦酸序列MXt(X2X3)n[I]其中代表K或R;X2代表M、S或T;X3代表K或R;n代表1或更大的整數(shù)；以及其中所述DNA標(biāo)簽可操作地連接到啟動(dòng)子序列。實(shí)施方式2:根據(jù)實(shí)施方式1的DNA質(zhì)粒，其中X!代表K。實(shí)施方式3:根據(jù)實(shí)施方式1的DNA質(zhì)粒，其中Xi代表R。實(shí)施方式4:根據(jù)實(shí)施方式1到3的任一項(xiàng)的DNA質(zhì)粒，其中X2代表M或S。實(shí)施方式5:根據(jù)實(shí)施方式1到3的任一項(xiàng)的DNA質(zhì)粒，其中X2代表M或T。實(shí)施方式6:才艮據(jù)實(shí)施方式1到3的任一項(xiàng)的DNA質(zhì)粒，其中X2代表S或T。實(shí)施方式7:根據(jù)實(shí)施方式1到3的任一項(xiàng)的DNA質(zhì)粒，其中乂2代表M。實(shí)施方式8:才艮據(jù)實(shí)施方式1到3的任一項(xiàng)的DNA質(zhì)粒，其中X2代表S。實(shí)施方式9:根據(jù)實(shí)施方式1到3的任一項(xiàng)的DNA質(zhì)粒，其中X2代表T。實(shí)施方式10:才艮據(jù)實(shí)施方式1到9的任一項(xiàng)的DNA質(zhì)粒，其中X3代表K。實(shí)施方式ll:4艮據(jù)實(shí)施方式1到9的任一項(xiàng)的DNA質(zhì)粒，其中X3代表R。實(shí)施方式12:根據(jù)實(shí)施方式1到11的任一項(xiàng)的DNA質(zhì)粒，其中n是1。實(shí)施方式13:根據(jù)實(shí)施方式1到11的任一項(xiàng)的DNA質(zhì)粒，其中n是2。實(shí)施方式14:根據(jù)實(shí)施方式1到11的任一項(xiàng)的DNA質(zhì)粒，其中n是3。實(shí)施方式15:根據(jù)實(shí)施方式1到14的任一項(xiàng)的質(zhì)粒，進(jìn)一步包含核酸序列，所述核酸序列編碼按閱讀框與所述DNA標(biāo)簽融合的蛋白質(zhì)，用于由融合到所述DNA標(biāo)簽的所述核酸序列編碼的N-末端標(biāo)簽化的蛋白質(zhì)的重組表達(dá)。實(shí)施方式16:根據(jù)實(shí)施方式15的質(zhì)粒，其中與沒(méi)有所述肽標(biāo)簽的蛋白質(zhì)的表達(dá)相比，通過(guò)使用所述質(zhì)粒的蛋白質(zhì)的表達(dá)被提高。實(shí)施方式17:根據(jù)實(shí)施方式15或16的質(zhì)粒，其中與沒(méi)有所述肽標(biāo)簽的表達(dá)的蛋白質(zhì)的溶解度相比，通過(guò)使用所述質(zhì)粒表達(dá)的蛋白質(zhì)的溶解度被降低。實(shí)施方式18:根據(jù)實(shí)施方式15到17的任一項(xiàng)的質(zhì)粒，其中所述蛋白質(zhì)包含SEQIDNO:2的氨基酸序列。實(shí)施方式19:根據(jù)實(shí)施方式15到18的任一項(xiàng)的質(zhì)粒，其中所述編碼蛋白質(zhì)的核酸序列由SEQIDNO:1的核苷酸序列組成。實(shí)施方式20:根據(jù)實(shí)施方式1到19的任一項(xiàng)的DNA質(zhì)粒，條件是所述由DNA標(biāo)簽編碼的肽標(biāo)簽不是MKMK、MKTK或MKSK。實(shí)施方式21:包含根據(jù)實(shí)施方式1到20的任一項(xiàng)的質(zhì)粒的微生物宿主細(xì)胞。實(shí)施方式22:根據(jù)實(shí)施方式21的微生物宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是大腸桿菌。實(shí)施方式23:標(biāo)簽化的蛋白質(zhì)，其包含與蛋白質(zhì)融合的N-末端肽標(biāo)簽，其中所述標(biāo)簽包含式[I]的氨基酸序列MX!(X2X3)n[I]其中代表K或R;X2代表M、S或T;X3代表K或R;以及n代表1或更大的整數(shù)。R。實(shí)施方式24:根據(jù)實(shí)施方式23的標(biāo)簽化的蛋白質(zhì)，其中Xi代表實(shí)施方式25:根據(jù)實(shí)施方式23的標(biāo)簽化的蛋白質(zhì)，其中X!代表實(shí)施方式26:根據(jù)實(shí)施方式23至其中X2代表M或S。實(shí)施方式27:才艮據(jù)實(shí)施方式23至其中X2代表M或T。實(shí)施方式28:才艮據(jù)實(shí)施方式23至其中X2代表S或T。實(shí)施方式29:根據(jù)實(shí)施方式23至'其中X2代表M。實(shí)施方式30:其中X2代表S。實(shí)施方式31:其中X2代表T。實(shí)施方式32:其中Xs代表K。實(shí)施方式33:其中X3代表R。實(shí)施方式34:其中n是1。實(shí)施方式35:其中n是2。實(shí)施方式36:其中n是3。實(shí)施方式37:根據(jù)實(shí)施方式23至#4居實(shí)施方式23至#4居實(shí)施方式23至#4居實(shí)施方式23至才艮據(jù)實(shí)施方式23至根據(jù)實(shí)施方式23至#4居實(shí)施方式23至25的任一項(xiàng)的標(biāo)簽化的蛋白質(zhì)，25的任一項(xiàng)的標(biāo)簽化的蛋白質(zhì)，25的任一項(xiàng)的標(biāo)簽化的蛋白質(zhì)，25的任一項(xiàng)的標(biāo)簽化的蛋白質(zhì)，25的任一項(xiàng)的標(biāo)簽化的蛋白質(zhì)，25的任一項(xiàng)的標(biāo)簽化的蛋白質(zhì)，31的任一項(xiàng)的標(biāo)簽化的蛋白質(zhì)，31的任一項(xiàng)的標(biāo)簽化的蛋白質(zhì)，33的任一項(xiàng)的標(biāo)簽化的蛋白質(zhì)，33的任一項(xiàng)的標(biāo)簽化的蛋白質(zhì)，33的任一項(xiàng)的標(biāo)簽化的蛋白質(zhì)，36的任一項(xiàng)的標(biāo)簽化的蛋白質(zhì)，的氨基酸序列。37的任一項(xiàng)的標(biāo)簽化的蛋白質(zhì)，才艮據(jù)實(shí)施方式23到其中所述蛋白質(zhì)包含SEQIDNO:2實(shí)施方式38:才艮椐實(shí)施方式23到條件是所述肽標(biāo)簽不是MKMK、MKTK或MKSK。實(shí)施方式39:在微生物宿主細(xì)胞中重組表達(dá)N-末端標(biāo)簽化的蛋白質(zhì)的方法，包括步驟(a)構(gòu)建重組質(zhì)粒，包括將編碼蛋白質(zhì)的DNA序列按閱讀框插入到^4居實(shí)施方式1到14的任一項(xiàng)的質(zhì)粒的DNA標(biāo)簽的3'，和(b)將所述重組質(zhì)粒導(dǎo)入宿主微生物細(xì)胞中，和(c)誘導(dǎo)所述N-末端標(biāo)簽化的蛋白質(zhì)在微生物宿主細(xì)胞中的表達(dá)。實(shí)施方式40:提高蛋白質(zhì)在微生物宿主細(xì)胞中的重組表達(dá)的方法，所述方法包括「(a)構(gòu)建重組質(zhì)粒，包括將編碼蛋白質(zhì)的DNA序列按閱讀框插入到根據(jù)實(shí)施方式1到14的任一項(xiàng)的質(zhì)粒的DNA標(biāo)簽的3',和(b)將所述重組質(zhì)粒導(dǎo)入宿主微生物細(xì)胞中，和(c)誘導(dǎo)所述N-末端標(biāo)簽化的蛋白質(zhì)在微生物宿主細(xì)胞中的表達(dá)。實(shí)施方式41:降低微生物宿主細(xì)胞中重組表達(dá)的蛋白質(zhì)的溶解度的方法，所述方法包括-(a)構(gòu)建重組質(zhì)粒，包括將編碼蛋白質(zhì)的DNA序列^I安閱讀框插入到才艮據(jù)實(shí)施方式1到14的任一項(xiàng)的質(zhì)粒的DNA標(biāo)簽的3',和(b)將所述重組質(zhì)粒導(dǎo)入宿主微生物細(xì)胞中，和(c)誘導(dǎo)所述N-末端標(biāo)簽化的蛋白質(zhì)在微生物宿主細(xì)胞中的表達(dá)。實(shí)施方式42:根據(jù)實(shí)施方式39到41的任一項(xiàng)的方法，其中所述蛋白質(zhì)包含SEQIDNO:2的氨基酸序列。實(shí)施方式43:根據(jù)實(shí)施方式39到42的任一項(xiàng)的方法，其中編碼蛋白質(zhì)的DNA序列由SEQIDNO:1的核苷酸序列組成。實(shí)施方式44:根據(jù)實(shí)施方式39到43的任一項(xiàng)的方法，條件是所述由質(zhì)粒的DNA標(biāo)簽編碼的肽標(biāo)簽不是MKMK、MKTK或MKSK。所有在此引用的參考文獻(xiàn)，包括公開(kāi)物、專利申請(qǐng)和專利，通過(guò)完全引用合并在此，并且達(dá)到如同每個(gè)參考文獻(xiàn)被單獨(dú)地和特意地指明通過(guò)引用來(lái)合并、以及在此完全闡述的程度(法律所允許的最大程度)，不管在本文其他地方作出的、特定文件的任何單獨(dú)提供的合并。在描述本發(fā)明的上下文中術(shù)語(yǔ)"一"以及"該"和類似對(duì)象的使用被認(rèn)為是覆蓋了單數(shù)和復(fù)數(shù)，除非在此另有陳述或上下文明顯抵觸。例如，用語(yǔ)"該化合物"被理解為是指本發(fā)明或特別描述的方面的各種"化合物"，除非另有陳述。除非另有陳述，在此提供的所有確切數(shù)值是相應(yīng)的近似值的表示(例如，對(duì)于特定因素或度量來(lái)說(shuō)提供的所有的確切示范性數(shù)值被認(rèn)為還提供了相應(yīng)的大略的度量，在合適時(shí)由"約"來(lái)修飾)。對(duì)于一個(gè)元素或復(fù)數(shù)個(gè)元素使用術(shù)語(yǔ)如"包含"、"具有"、"包括"或"含有"的本發(fā)明任一方面或方面的在此的描述，是意圖提供對(duì)"由......組成"、"基本上由......組成"或"基本上包含"所述特定元素或復(fù)數(shù)個(gè)元素的本發(fā)明的類似方面的支持，除非另有說(shuō)明或上下文明顯地抵觸(例如，在此描述的組合物包含特定元素應(yīng)當(dāng)被理解為還描述了組合物由該元素組成，除非另有說(shuō)明或上下文明顯地抵觸)?？傊景l(fā)明提供了包含編碼肽標(biāo)簽的DNA標(biāo)簽的表達(dá)載體或表達(dá)質(zhì)粒，所述DNA標(biāo)簽與啟動(dòng)子可操作地連接，所述啟動(dòng)子能夠指導(dǎo)所述DNA標(biāo)簽以及與所述DNA標(biāo)簽按閱讀框融合的任何蛋白質(zhì)編碼序列在宿主微生物細(xì)胞中的表達(dá)。采用本發(fā)明的表達(dá)載體或表達(dá)質(zhì)粒用于按閱讀框融合到所述DNA標(biāo)簽的蛋白質(zhì)編碼序列的重組蛋白質(zhì)表達(dá)的特別的優(yōu)點(diǎn)是，在宿主細(xì)胞中的表達(dá)水平被顯著地增強(qiáng)了。因而，當(dāng)具有融合在N-末端的本發(fā)明的肽標(biāo)簽的蛋白質(zhì)在微生物宿主細(xì)胞例如大腸桿菌中重組表達(dá)時(shí)，這種標(biāo)簽的存在大多數(shù)情況下增強(qiáng)表達(dá)，這是由于所述蛋白質(zhì)的降低的溶解度和對(duì)宿主細(xì)胞的降低的毒性，并且它進(jìn)一步滿足了有效的重組蛋白質(zhì)表達(dá)所需的許多其他重要的指標(biāo)。特別是，它容許在標(biāo)簽的適當(dāng)?shù)那懈钪蟮鞍踪|(zhì)以它的成熟形式獲得。此外，帶電的標(biāo)簽所帶來(lái)的總蛋白質(zhì)電荷的改變幫助了蛋白質(zhì)的純化。實(shí)施例實(shí)施例1標(biāo)簽化的人類白細(xì)胞介素-21的表達(dá)對(duì)于表達(dá)和下游加工，為了比較各種小的N-末端標(biāo)簽，選擇人類白細(xì)胞介素hIL-21作為目標(biāo)蛋白質(zhì)。編碼蛋白質(zhì)hIL-21的核酸分子是SEQIDNO:1(MethIL-21AWel-5amHl核普酸序列)，其中分子的5'末端和3'末端分別具有AWel-5amHl的限制性酶位點(diǎn)。MethIL-21M/el-5flmHl核苷酸序列編碼SEQIDNO:2所示的hlL-21蛋白質(zhì)序列。當(dāng)在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，這個(gè)蛋白質(zhì)在N-末端具有額外的甲硫氨酸。hlL21的這個(gè)形式被稱為Met-hlL21。一系列構(gòu)建體根據(jù)以下方案來(lái)制成410石威基對(duì)DNA分子，編碼hlL-21的成熟形式，相應(yīng)于Met-hlL-21的氨基酸殘基1-133,具有5'和3'末端的《S(y/^amHl位點(diǎn)，在SEQIDNO:3中示出(hIL-21砂1-5證H1核普酸序列)。hlL畫21,-S應(yīng)Hl核普酸序列，從核普酸2開(kāi)始，包含SEQIDNO:4所示的核普酸序列，其編碼具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的成熟的hIL-21蛋白質(zhì)序列。hIL-21S(yl-5flwHl分子連接到A^el-5amHl消化的T7表達(dá)載體，5.6kb的pET-llc，與一系列連4矣物的任一種一起，每一個(gè)側(cè)翼是5'M/el位點(diǎn)和3'6V少1相容位點(diǎn)，在表1中列出。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>包含含有DNA標(biāo)簽的連接物、所述DNA標(biāo)簽按閱讀框連接到DNA分子hIL-21S^l-萬(wàn)"mHl的T7表達(dá)載體pET-llc轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞大腸桿菌BBL21(DE3)中。用每種T7表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞菌抹在37。C補(bǔ)充有氨節(jié)西林0.2mg/l的LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，來(lái)自T7表達(dá)載體的重組蛋白質(zhì)表達(dá)用0.5mMIPTG誘導(dǎo)3-4小時(shí)。宿主細(xì)胞通過(guò)離心來(lái)收獲，裂解，然后離心樣品來(lái)提供可溶級(jí)分和團(tuán)粒化的包涵體級(jí)分。來(lái)自每個(gè)宿主細(xì)胞樣品的總細(xì)胞提取物、包涵體和可溶細(xì)胞級(jí)分然后通過(guò)SDSPAGE分離，凝膠用Comassie藍(lán)染色來(lái)測(cè)定標(biāo)簽化hlL-21蛋白質(zhì)表達(dá)的水平，與未標(biāo)簽化的蛋白質(zhì)MethIL-21比較。hIL-21的各種標(biāo)簽化形式的表達(dá)水平取決于標(biāo)簽的氨基酸序列，如表l所示，但是在某些情況下它還取決于核苦酸序列，即，mRNA中的二級(jí)結(jié)構(gòu)。對(duì)密碼子進(jìn)行調(diào)整以避免可能遭遇的二級(jí)結(jié)構(gòu)難題是本領(lǐng)域的技術(shù)人員能力之內(nèi)的。表l說(shuō)明了兩點(diǎn)表達(dá)水平一般通過(guò)添加特定的肽標(biāo)簽來(lái)提高，hIL-21的溶解度被降低，從而保護(hù)了大腸桿菌宿主細(xì)胞免于hIL-21的毒性影響。并且，溶解度降低幫助了hIL-21分配到包涵體中，從而便于它隨后的純化。實(shí)施例2重組表達(dá)的標(biāo)簽化人類白細(xì)胞介素-21被加工成它的成熟和活性形式。利用構(gòu)建體DAP17表達(dá)的MKHK-hIL-21如WO04/55168中公開(kāi)的從包涵體中重折疊，隨后采用SepharoseSP柱層析純化到大約90-95%純度。相應(yīng)于MKHK-hIL-21的單個(gè)主要多肽條帶通過(guò)從SepharoseSP柱獲得的級(jí)分的SDS-PAGE分析檢測(cè)到，級(jí)分的庫(kù)，如泳道4-10中所示，隨后進(jìn)行二肽基氨肽酶(DAPase)和谷氨酰胺環(huán)轉(zhuǎn)移酶(Q環(huán)化酶)處理以進(jìn)行四個(gè)氨基酸的N-末端肽標(biāo)簽的受控的去除。肽標(biāo)簽切割的條件是27.5pMMKHK-IL21、67.5mUDAPase、5.5UQ環(huán)化酶、25mMTris、0.15MNaCl、pH7.0的水溶液，在環(huán)境溫度(20-25°C)孵育90分鐘，采用Qiagen.com提供的酶。標(biāo)簽去除以產(chǎn)生成熟的hIL-21的效力和完成通過(guò)質(zhì)譜法確定，如附圖1，A和B所示。A欄顯示了在標(biāo)簽去除之前的級(jí)分的Maldi光譜。B欄顯示了在標(biāo)簽去除之后的相同級(jí)分。天然hlL21具有15433Da的分子量，而MKHK-IL21具有15975Da的分子量。如在B欄中觀察到的，切割和標(biāo)簽去除是大約90%完成的。實(shí)施例3重組表達(dá)的MKMK標(biāo)簽化的人類白細(xì)胞介素-21被加工成它的成熟和活性形式。利用構(gòu)建體DAP21表達(dá)的MKMK-hIL-21如WO200455168中公開(kāi)的從包涵體中重折疊，隨后采用TosoHaassp550c柱層析純化到大約90-95%純度。相應(yīng)于MKMK-hIL-21的單個(gè)主要多肽條帶通過(guò)從TosoHaassp550c柱獲得的級(jí)分的SDS-PAGE分析一企測(cè)到，級(jí)分的庫(kù)隨后進(jìn)行二肽基氨肽酶(DAPase)和谷氨酰胺環(huán)轉(zhuǎn)移酶(Q環(huán)化酶)處理以進(jìn)行四個(gè)氨基酸的N-末端肽標(biāo)簽的受控的去除。肽標(biāo)簽切割的條件是2mg/mlMKMK-IL21、在25mMTris、0.15MNaCl、pH7.0中800:1:32摩爾比的MKMK-IL21:DAPase:Q環(huán)化酶的水溶液，在環(huán)境溫度(20-25°C)孵育30分鐘，采用Qiagen.com提供的酶。標(biāo)簽去除以產(chǎn)生成熟的hIL-21的效力和完成通過(guò)質(zhì)譜法確定，如附圖2，A和B所示。A欄顯示了在標(biāo)簽去除之前的級(jí)分的Maldi光譜。B欄顯示了在標(biāo)簽去除之后的相同級(jí)分。具有N-末端焦谷氨酸的天然WL21具有15442Da的分子量，而MKMK-IL21具有15978Da的分子量。如在B欄中》見(jiàn)察到的，切割和標(biāo)簽去除是完全的。實(shí)施例4重組表達(dá)的MKSK標(biāo)簽化的人類白細(xì)胞介素-21被加工成它的成熟和活性形式。利用構(gòu)建體DAP23表達(dá)的MKSK-hIL-21如WO200455168中公開(kāi)的從包涵體中重折疊，隨后采用TosoHaassp550c柱層析純化到大約90-95%純度。相應(yīng)于MKSK-hIL-21的單個(gè)主要多肽條帶通過(guò)從TosoHaassp550c柱獲得的級(jí)分的SDS-PAGE分析4全測(cè)到，級(jí)分的庫(kù)隨后進(jìn)行二肽基氨肽酶(DAPase)和谷氨酰胺環(huán)轉(zhuǎn)移酶(Q環(huán)化酶)處理以進(jìn)行四個(gè)氨基酸的N-末端肽標(biāo)簽的受控的去除。肽標(biāo)簽切割的條件是2mg/mlMKSK-IL21、在25mMTris、0.15MNaCl、pH7.0中800:1:32摩爾比的MKSK-IL21:DAPase:Q環(huán)化酶的水溶液，在環(huán)境溫度(20-25°C)孵育30分鐘，采用Qiagen.com提供的酶。標(biāo)簽去除以產(chǎn)生成熟的hIL-21的效力和完成通過(guò)質(zhì)譜法確定，如附圖3,A和B所示。A欄顯示了在標(biāo)簽去除之前的級(jí)分的Maldi光譜。B欄顯示了在標(biāo)簽去除之后的相同級(jí)分。具有N-末端焦谷氨酸的天然hIL21具有15442Da的分子量，而MKSK-IL21具有15934Da的分子量。如在B欄中》見(jiàn)察到的，切割和標(biāo)簽去除是完全的。實(shí)施例5重組表達(dá)的MKTK標(biāo)簽化的人類白細(xì)胞介素-21被加工成它的成熟和活性形式。利用構(gòu)建體DAP24表達(dá)的MKTK-hIL-21如WO04/55168中公開(kāi)的從包涵體中重折疊，隨后采用TosoHaassp550c柱層析純化到大約90-95%純度。相應(yīng)于MKTK-hIL-21的單個(gè)主要多肽條帶通過(guò)從TosoHaassp550c柱獲得的級(jí)分的SDS-PAGE分析#企測(cè)到，級(jí)分的庫(kù)隨后進(jìn)行二肽基氨肽酶(DAPase)和谷氨酰胺環(huán)轉(zhuǎn)移酶(Q環(huán)化酶)處理以進(jìn)行四個(gè)氨基酸的N-末端肽標(biāo)簽的受控的去除。肽標(biāo)簽切割的條件是2mg/mlMKTK-IL21、在25mMTris、0.15MNaCl、pH7.0中800:1:32摩爾比的MKTK-IL21:DAPase:Q環(huán)化酶的水溶液，在環(huán)境溫度(20-25°C)孵育30分鐘，采用Qiagen.com提供的酶。標(biāo)簽去除以產(chǎn)生成熟的WL-21的效力和完成通過(guò)質(zhì)譜法確定，如附圖4,A和B所示。A欄顯示了在標(biāo)簽去除之前的級(jí)分的Maldi光譜。B欄顯示了在標(biāo)簽去除之后的相同級(jí)分。具有N-末端焦谷氨酸的天然hlL21具有15442Da的分子量，而MKTK-IL21具有15948Da的分子量。如在B欄中，見(jiàn)察到的，切割和標(biāo)簽去除是完全的。藥理學(xué)方法分析(I)BAF-3分析來(lái)測(cè)定IL-21活性BAF-3細(xì)胞(來(lái)自骨髓的鼠前B淋巴樣細(xì)胞系)的生長(zhǎng)和存活原始是IL-3依賴性的。IL-3活化JAK-2和STAT,其是在刺激時(shí)IL-21活化的相同的介體。在人類IL-21受體的轉(zhuǎn)染之后，細(xì)胞系被轉(zhuǎn)變成IL-21依賴性細(xì)胞系。這個(gè)克隆可以用于評(píng)估IL-21樣品對(duì)BAF-3細(xì)胞的存活的影響。BAF-3細(xì)胞在饑餓培養(yǎng)基(沒(méi)有IL-21的培養(yǎng)基)中在37°C、5%C02中生長(zhǎng)24小時(shí)。洗滌細(xì)胞并重懸浮在饑餓培養(yǎng)基中，并接種到平板上。10pl的IL-21化合物、不同濃度的人IL-21作為對(duì)照添加給細(xì)胞，平并反在37。C、5%002孵育68小時(shí)。AlamarBlue⑧添加到每個(gè)反應(yīng)孔，然后孵育細(xì)胞另外4小時(shí)。AlamarBlue⑧是氧化還原指示劑，被細(xì)胞代謝的天然反應(yīng)還原，因而提供了活細(xì)胞數(shù)量的間接的度量。最后，細(xì)胞的代謝活性在焚光平板讀取器中測(cè)量。樣品中的吸光度表示為未用生長(zhǎng)激素化合物刺激的細(xì)胞或?qū)φ盏模?從濃度-反應(yīng)曲線可以計(jì)算活性(以50%刺激細(xì)胞的化合物的數(shù)量)。在利用IL-21受體的這種分析中測(cè)試的，本發(fā)明的構(gòu)建體的生物學(xué)活性顯示了，來(lái)自所有構(gòu)建體的切割的天然IL-21的效力等同于通過(guò)WO200455168中描述的方法產(chǎn)生的Met-IL21。權(quán)利要求1.自我復(fù)制的DNA質(zhì)粒，用于在微生物宿主細(xì)胞中N-末端標(biāo)簽化的蛋白質(zhì)的重組表達(dá)，所述質(zhì)粒包含DNA標(biāo)簽，所述DNA標(biāo)簽具有編碼式[I]的肽標(biāo)簽的核苷酸序列MX1(X2X3)n[I]其中X1代表K或R；X2代表M、S或T；X3代表K或R；n代表1或更大的整數(shù)；以及其中所述DNA標(biāo)簽可操作性地連接到啟動(dòng)子序列。2.根據(jù)權(quán)利要求1的DNA質(zhì)粒，其中n是l、2或3。3.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的質(zhì)粒，進(jìn)一步包含核酸序列，所述核酸序列編碼4安閱讀框與所述DNA標(biāo)簽融合的蛋白質(zhì)，用于由融合到所述DNA標(biāo)簽的所述核酸序列編碼的N-末端標(biāo)簽化的蛋白質(zhì)的重組表達(dá)。4.根據(jù)權(quán)利要求3的質(zhì)粒，其中所述蛋白質(zhì)包含SEQIDNO:2的氨基酸序列。5.根據(jù)權(quán)利要求3或權(quán)利要求4的質(zhì)粒，其中所述編碼蛋白質(zhì)的核酸序列由SEQIDNO:l的核苷酸序列組成。6.根據(jù)權(quán)利要求1到5的任一項(xiàng)的DNA質(zhì)粒，條件是所述由DNA標(biāo)簽編碼的肽標(biāo)簽不是MKMK、MKTK或MKSK。7.包含根據(jù)權(quán)利要求1到6的任一項(xiàng)的質(zhì)粒的微生物宿主細(xì)胞。8.標(biāo)簽化的蛋白質(zhì)，其包含與蛋白質(zhì)融合的N-末端肽標(biāo)簽，其中所述標(biāo)簽包含式[I]的氨基酸序列<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>其中Xj代表K或R;X2代表M、S或T;X3代表K或R;以及n代表1或更大的整數(shù)。9.根據(jù)權(quán)利要求8的標(biāo)簽化的蛋白質(zhì)，其中n是l、2或3。10.根據(jù)權(quán)利要求8或權(quán)利要求9的標(biāo)簽化的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)包含SEQIDNO:2的氨基酸序列。11.根據(jù)權(quán)利要求8到10的任一項(xiàng)的標(biāo)簽化的蛋白質(zhì)，條件是所述肽標(biāo)簽不是MKMK、MKTK或MKSK。12.在微生物宿主細(xì)胞中重組表達(dá)N-末端標(biāo)簽化的蛋白質(zhì)的方法，包括步驟(a)構(gòu)建重組質(zhì)粒，包括將編碼蛋白質(zhì)的DNA序列按閱讀框插入到根據(jù)權(quán)利要求1到2的任一項(xiàng)的質(zhì)粒的DNA標(biāo)簽的3'，以及(b)將所述重組質(zhì)粒導(dǎo)入宿主^L生物細(xì)胞中，和(c)誘導(dǎo)所述N-末端標(biāo)簽化的蛋白質(zhì)在微生物宿主細(xì)胞中的表達(dá)。13.提高蛋白質(zhì)在微生物宿主細(xì)胞中的重組表達(dá)的方法，所述方法包括(a)構(gòu)建重組質(zhì)粒，包括將編碼蛋白質(zhì)的DNA序列按閱讀框插入到根據(jù)權(quán)利要求1到2的任一項(xiàng)的質(zhì)粒的DNA標(biāo)簽的3'，和(b)將所述重組質(zhì)粒導(dǎo)入宿主微生物細(xì)胞中，和(c)誘導(dǎo)所述N-末端標(biāo)簽化的蛋白質(zhì)在微生物宿主細(xì)胞中的表達(dá)。14.降低微生物宿主細(xì)胞中重組表達(dá)的蛋白質(zhì)的溶解度的方法，所述方法包括「(a)構(gòu)建重組質(zhì)粒，包括將編碼蛋白質(zhì)的DNA序列按閱讀框插入到根據(jù)權(quán)利要求1到2的任一項(xiàng)的質(zhì)粒的DNA標(biāo)簽的3'，和(b)將所述重組質(zhì)粒導(dǎo)入宿主微生物細(xì)胞中，和(c)誘導(dǎo)所述N-末端標(biāo)簽化的蛋白質(zhì)在微生物宿主細(xì)胞中的表達(dá)。15.根據(jù)權(quán)利要求12到14的任一項(xiàng)的方法，其中所述蛋白質(zhì)包含SEQIDNO:2的氨基酸序列。16.根據(jù)權(quán)利要求12到15的任一項(xiàng)的方法，其中編碼蛋白質(zhì)的DNA序列由SEQIDNO:1的核苦酸序列組成。17.根據(jù)權(quán)利要求12到16的任一項(xiàng)的方法，條件是所述由質(zhì)粒的DNA標(biāo)簽編碼的肽標(biāo)簽不是MKMK、MKTK或MKSK。全文摘要提供了質(zhì)粒，包含編碼序列MX₁(X₂X₃)_n的肽標(biāo)簽的DNA標(biāo)簽，X₁代表K或R；X₂代表M、S或T；X₃代表K或R；n代表1或更大的整數(shù)；以及其中所述DNA可操作性地連接到啟動(dòng)子序列。文檔編號(hào)C07K1/107GK101622269SQ200880006757公開(kāi)日2010年1月6日申請(qǐng)日期2008年2月22日優(yōu)先權(quán)日2007年3月1日發(fā)明者C·B·希奧特,H·沃爾迪克申請(qǐng)人:諾沃-諾迪斯克有限公司