專利名稱：：拮抗劑ox40抗體及其在炎性和自身免疫疾病的治療中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明提供了免疫特異性結(jié)合人OX40多肽、OX40多肽片段或OX40表位的抗體。本發(fā)明還涉及免疫特異性結(jié)合人OX40多肽、OX40多肽片段或OX40表位的人源化抗體。本發(fā)明還提供了編碼免疫特異性結(jié)合OX40多肽、OX40多肽片段或OX40表位的抗體的分離核酸。本發(fā)明進(jìn)一步提供了包含編碼免疫特異性結(jié)合人OX40多肽、OX40多肽片段或OX40表位的抗體的核酸的載體和宿主細(xì)胞，以及制備該抗體的方法。還提供了使用本發(fā)明提供的抗-OX40抗體抑制OX40生物活性和/或治療或預(yù)防OX-40介導(dǎo)的疾病的方法。2.
背景技術(shù)：
：我們的免疫系統(tǒng)幫助我們的身體防御外來(lái)病原體，這是一項(xiàng)需要對(duì)外源物質(zhì)的免疫激活和對(duì)自身組織的耐受之間進(jìn)行平衡的功能。由病毒性病原體等引起的急性感染可導(dǎo)致兩種類型的長(zhǎng)期記憶體液免疫，其中B-淋巴細(xì)胞(B-細(xì)胞)生成抗體以預(yù)防這些外來(lái)病原體引起的感染；以及細(xì)胞免疫，其中由特定抗原激活的T-淋巴細(xì)胞(T-細(xì)胞)殺死被感染的細(xì)胞，還可生成細(xì)胞因子。T-細(xì)胞主要在細(xì)胞-介導(dǎo)的免疫中發(fā)揮作用，并包含了約70%的淋巴細(xì)胞。T-細(xì)胞中大部分為CD4+"協(xié)助者"T-細(xì)胞，并主要參與B-細(xì)胞核巨噬細(xì)胞的激活。CD8+T-細(xì)胞或細(xì)胞毒性T-淋巴細(xì)胞(CTL)參與細(xì)胞-介導(dǎo)的細(xì)胞毒性反應(yīng)，并包含了約35%的T-細(xì)胞群。T-細(xì)胞可凈皮分為三個(gè)不同的群初始細(xì)胞、效應(yīng)細(xì)胞和記憶細(xì)胞。初始T-細(xì)胞在抗原存在下被激活并成為效應(yīng)細(xì)胞。主要組織相容性復(fù)合體I類(I類MHC)分子通過(guò)將入侵病原體的抗原"呈遞"給T-細(xì)胞受體而在該效應(yīng)應(yīng)答中發(fā)揮主要的作用，該T-細(xì)胞受體進(jìn)而識(shí)別并攻擊所述病原體。許多受體-配體相互作用參與到針對(duì)外來(lái)抗原的免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)、建立和調(diào)節(jié)中。至少兩種信號(hào)是激活。04+或。08+T細(xì)胞對(duì)抗原的應(yīng)答所必需的。第一種信號(hào)通過(guò)與抗原呈遞細(xì)胞(APC)表面上的主要組織相容性復(fù)合體(MHC)I類或II類分子結(jié)合的抗原經(jīng)由T-細(xì)胞受體(TCR)傳遞。第二種信號(hào)涉及該APC表面上存在的配體與該T-細(xì)胞表面上的第二受體分子的結(jié)合。該第二信號(hào)被稱為共刺激，且該APC配體常被稱為共刺激分子(Lenschow等人，爿"m//附mw"o/14:233(1996))。共刺激信號(hào)分子包括免疫球蛋白超家族成員、腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族成員以及細(xì)胞因子受體(參見(jiàn)綜述Croft，C_ytoA:/"eGV,AFactoriev14:265(2003);Kroczek等人，Jj〃ergyC7/w/mmw"o/116:906(2005))。這兩種信號(hào)的組合激活T-細(xì)胞，該T-細(xì)胞隨后分泌細(xì)胞因子并增殖。共刺激分子的一個(gè)例子是OX40受體(CD134),它是TNFR超家族的一個(gè)成員，其與細(xì)胞膜結(jié)合并主要在激活的CD4+T-細(xì)胞上(即，在發(fā)炎位點(diǎn))表達(dá)(Paterson等人，Mo//附mw"o/24:1281(1987))。OX40的配體(OX40L)是屬于TNF家族的II型膜蛋白，并在抗原-呈遞細(xì)胞(例如激活的B細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞)上表達(dá)(Stuber等人，/附m朋/(y2:507(1995);Weinberg等人，//附附朋o/162:1818(1999);Nohara等人，J/附wwwo/166:2108(2001);Malmstrom等人，J7mmmo/166:6972(2001))。通過(guò)OX40受體(以下稱為"OX40)進(jìn)行的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是對(duì)效應(yīng)T-細(xì)胞的共刺激，并引起了T-細(xì)胞的增殖(Weinberg，J/附附柳o/152:4712(1994);參見(jiàn)綜述Watts,J"做iev7m/mwo/23:23(2005))。對(duì)OX40的研究暗示其主要的作用在于決定初次免疫反應(yīng)中積累的效應(yīng)T-細(xì)胞的數(shù)量，進(jìn)而決定隨后發(fā)育和存活的記憶T-細(xì)胞的數(shù)量(參見(jiàn)綜述Croft，Cy油weG腳AFactoriev14:265(2003))。若千體外研究顯示OX40提供了可導(dǎo)致增加的T-細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子生成的共刺激信號(hào)(BaumPR等人，EMBOJ,1994;AkibaH等人，Biochem.BiophysicRes，1998)。已經(jīng)提示，在某些情況下，OX40/OX40L相互作用可在Th2細(xì)胞發(fā)育中具有優(yōu)先作用(Ohshima等人，S/ood92:3338(1998);Flynn等人，/￡x/M^/188:297(1998))。當(dāng)免疫激活過(guò)量或不受控制時(shí)，可發(fā)生病理性過(guò)敏、哮喘、炎癥、自身免疫以及其它相關(guān)的疾病。在這些情況中，T-細(xì)胞的激活和分化具有重要的作用。由于OX40可增強(qiáng)免疫應(yīng)答，它可力。劇自身免疫和炎性疾病。OX40-OX40L相互作用已經(jīng)與多種疾病模型的發(fā)病機(jī)理相關(guān)聯(lián)。大量的證據(jù)暗示OX40-OX40L相互作用在過(guò)敏、哮喘以及與自身免疫和炎癥相關(guān)的疾病中具有重要作用，該疾病包括多發(fā)性硬化癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎性腸道疾病、移植物抗宿主病、實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)、實(shí)驗(yàn)性利什曼病、膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎、結(jié)腸炎(例如潰瘍性結(jié)腸炎)、4妄觸超萄文反應(yīng)、糖尿病、克隆氏病和Grave病(Arestides等人，EurJImmunol32:2874(2002);Jember等人，J^x;MW193:387(2001);Kroczek等人，JJ〃ergyC/Zw/扁薩/116:906(2005);Pakala等人，"聽(tīng),/34:3039(200化Xiaoyan等人,Ex/7m應(yīng)wo/143:110(2006);Weinberg等人，//m謹(jǐn)wo/152:4712(1994);Weinberg等人，Med2:183(1996);Malstrom等人，《//附ww"o/166:6972(2001);Higgins等人，J/附ww"o/162:486(1999);Akiba等人，Jfic/Med191:375(2000);Stuber等人，GWrae"te廠o/ogy115:1205(1998);Tsukada等人，S/ood95:2434(2000);Yoshioka等人，￡wJV附/mmo/30:2815(2000);Stuber等人，五^JCV/w/m^W30:594(2000);Bossowski等人，J尸eA"/r五油ct7'wo/MetoZ)18:1365(2005);參見(jiàn)綜述Watts，j薩細(xì)/麵,/23:23(2005))。目前針對(duì)自身免疫和炎性疾病的療法包括長(zhǎng)期單獨(dú)施用類固醇或?qū)㈩惞檀寂c細(xì)胞毒性藥物和/或生物藥物聯(lián)用。針對(duì)TNF-a的抗體目前已被用于多種疾病，包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、克隆氏病和炎性腸道疾病。此外，在臨床評(píng)估中采用的一種新型實(shí)驗(yàn)療法是針對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的融合蛋白CTLA4-Ig(可溶形式的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的抗原-4)。盡管具有這些選擇，多數(shù)免疫抑制性療法會(huì)引起嚴(yán)重的副作用，包括患者的免疫低下(immunocompromised)狀態(tài)。理想情況下，對(duì)T-細(xì)胞-介導(dǎo)的疾病的治療將靶向引起疾病的[抗原特異性]細(xì)胞，但不傷害其余T-細(xì)胞群體(Weinberg,7>e"A/mw朋o/23:102(2002))。因此，對(duì)于自身免疫和炎性疾病的替代性療法存在著強(qiáng)烈的需求。除了這些方法外，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了多種激動(dòng)劑抗-OX40抗體，其可刺激受體以增加T-細(xì)胞群體。最先公開(kāi)的抗-OX40單克隆抗體(mAb)，MRCOX-40，是一種小鼠抗體，其將受體識(shí)別為激活的大鼠CD4+T-細(xì)胞上的細(xì)胞表面抗原(Paterson等人，M9/7附w朋o/24:1281(1987))。該抗體在刺激T-細(xì)胞增殖的測(cè)定具有最輕微的作用。自此以后，已經(jīng)生成了多種激動(dòng)劑抗-OX40mAb,并將其用于增強(qiáng)免疫應(yīng)答(Weatherill等人，Ce〃/附附朋o/209:63(2001);Banal-Pakala等人，AtoMW7:907(2001);DeSmedt等人，J7wmw"o/168:661(2002);Pan等人，7kfo/r&r6:528(2002);Curti等人，Blood101:568(2003);Nakae等人，ProcNatlAcadSciUSA100:5986(2003);Lustgarten等人，五wr//mww"o/34:752(2004);So等人，JVm附柳o/172:4292(2004);Koga等人，Qmcer95:411(2004);Lanthrop等人，J/附m""o/172:6735(2004);Polymenidou等人，Prac胸"cad5W園101Suppl2:14670(2004);Lustgarten等人，J/畫(huà)國(guó)/173:4510(2004);Valzasina等人，腸od105:2845(2005);Cuadros等人，/"〃C騰w116:934(2005);Sharma等人,~Ge謂to/41:78(2006))。然而，在前述的自身免疫和炎性疾病中，刺激T-細(xì)胞群體并非所希望的結(jié)果。一種療法是通過(guò)使用抗-OX40L抗體阻斷OX40-OX40L信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。已生成一系列耙向OX40L的mAb,并進(jìn)行測(cè)試以闡釋OX40信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、它對(duì)其它途徑的作用以及OX40在各種疾病中的作用(例如參見(jiàn)，Blazar等人，歷o^/101:3741(2003);Ukyo等人，/附mw"o/ogy109:226(2003);Wang等人，77Mwe64:566(2004);Chou等人，J7附w柳o/174:436(2005))。其它抑制OX40信號(hào)的方法包括抗-OX40免疫毒素、OX40-IgG融合蛋白以及OX40脂質(zhì)體的使用(Weinberg等人，A^Med2:193(1996);Higgins等人，J/附www/162:486(1999);Satake等人，Roc/zem歷op/"iesCommww270:1041(2000);Taylor等人乂丄ewybc72:522(2002);Boot等人，^W/^/他7esT7zer7:R604(2005))。靶向該配體的替代方法是開(kāi)發(fā)針對(duì)OX40受體(CD134)的療法。人們已經(jīng)嘗試生成拮抗劑抗-OX40抗體。Stuber及其同事使用了多克隆兔抗-小鼠OX40抗體來(lái)抑制OX40和OX40L之間的相互作用C/Ex/Me"183:979(1996))。Imura等人生成了抗-小鼠OX40抗體131和315，其抑制CD4+T-細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附以及T-細(xì)胞的增殖(OX40途徑介導(dǎo)的過(guò)程)。由Weinberg披露的抗-人OX40抗體顯示了耗盡激活CD4+T-細(xì)胞的能力；然而，它依賴于抗體與毒性分子(例如蓖麻毒素-A鏈)的偶聯(lián)(美國(guó)專利5,759,546)。披露的其它抗-OX抗體不具有功能活性，例如市售的L106。因此，對(duì)于能夠干擾OX40途徑的靶向人OX40的真正功能性的拮抗劑抗體存在著需求。該種抗體將會(huì)有潛力治療許多目前存在大量未滿足的需求的疾病。本發(fā)明解決了這些未滿足的醫(yī)學(xué)需求。3.發(fā)明綜述一方面，本發(fā)明涉及針對(duì)人OX40受體(CD134)的拮抗劑抗體及其片段。另一個(gè)實(shí)施方案包括了拮抗劑抗體的氨基酸序列以及編碼該抗體的核酸。本發(fā)明還包括由所述抗體的輕鏈和/或重鏈可變區(qū)衍生的抗原結(jié)合區(qū)(CDR)。本發(fā)明的抗體可以是重組抗體。本發(fā)明的抗體可以是單克隆抗體，而單克隆抗體可以是人抗體、嵌合抗體或人源化抗體。本發(fā)明包括了包含重鏈可變區(qū)(VH)和/或輕鏈可變區(qū)(VL)的抗體，該VH包含具有SEQIDNO:17的氨基酸序列的VHCDR1、具有SEQIDNO:18的氨基酸序列的VHCDR2、和/或具有SEQIDNO:19的氨基酸序列的VHCDR3;該VL包含具有SEQIDNO:12、15或61的氨基酸序列的VLCDRl、具有SEQIDNO:13的氨基酸序列的VLCDR2、和/或具有SEQIDNO:14或16的氨基酸序列的VLCDR3。在實(shí)施方案中，該抗體包含了具有選自SEQIDNO:17、18或19的氨基酸序列的兩個(gè)VHCDR和/或具有選自SEQIDNO:12、13、14、15、16或61的氨基酸序列的兩個(gè)VLCDR。本發(fā)明包括了包含重鏈可變區(qū)(VH)和/或輕鏈可變區(qū)(VL)的抗體，該VH包含具有SEQIDNO:17的氨基酸序列的VHCDR1、具有SEQIDNO:18的氨基酸序列的VHCDR2、和具有SEQIDNO:19的氨基酸序列的VHCDR3;該VL包含具有SEQIDNO:12的氨基酸序列的VLCDR1、具有SEQIDNO:13的氨基酸序列的VLCDR2、和具有SEQIDNO:14的氨基酸序列的VLCDR3。本發(fā)明包括了包含重鏈可變區(qū)(VH)和/或輕鏈可變區(qū)(VL)的抗體，該VH包含具有SEQIDNO:17的氨基酸序列的VHCDR1、具有SEQIDNO:18的氨基酸序列的VHCDR2、和具有SEQIDNO:19的氨基酸序列的VHCDR3;該VL包含具有SEQIDNO:12的氨基酸序列的VLCDR1、具有SEQIDNO:13的氨基酸序列的VLCDR2、和具有SEQIDNO:16的氨基酸序列的VLCDR3。本發(fā)明包括了包含重鏈可變區(qū)(VH)和/或輕鏈可變區(qū)(VL)的抗體，該VH包含具有SEQIDNO:17的氨基酸序列的VHCDR1、具有SEQIDNO:18的氨基酸序列的VHCDR2、和具有SEQIDNO:19的氨基酸序列的VHCDR3;該VL包含具有SEQIDNO:15的氨基酸序列的VLCDR1、具有SEQIDNO:13的氨基酸序列的VLCDR2、和具有SEQIDNO:14的氨基酸序列的VLCDR3。本發(fā)明包括了包含重鏈可變區(qū)(VH)和/或輕鏈可變區(qū)(VL)的抗體，該VH包含具有SEQIDNO:17的氨基酸序列的VHCDRl、具有SEQIDNO:18的氨基酸序列的VHCDR2、和具有SEQIDNO:19的氨基酸序列的VHCDR3;該VL包含具有SEQIDNO:15的氨基酸序列的VLCDR1、具有SEQIDNO:13的氨基酸序列的VLCDR2;和具有SEQIDNO:16的氨基酸序列的VLCDR3。本發(fā)明包括了抗體，該抗體包含具有SEQIDNO:10或11任意一個(gè)所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)(VH)和/或SEQIDNO:7、8或9任意一個(gè)所示氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)(VL)。本發(fā)明包括了抗體，該抗體包含了由SEQIDNO:25、26或27任意一個(gè)核酸序列編碼的重鏈可變區(qū)(VH);和/或由SEQIDNO:20、21、22、23或24任意一個(gè)核酸序列編碼的輕鏈可變區(qū)(VL)。本發(fā)明包括了抗體，該抗體包含了具有SEQIDNO:10所示氨基酸序列的VH和具有SEQIDNO:7或8任意一個(gè)所示氨基酸序列的VL;具有SEQIDNO:11所示氨基酸序列的VH和具有SEQIDNO:9所示的VL;由SEQIDNO:25的核酸序列編碼的VH和由SEQIDNO:20或21的核酸序列編碼的VL;由SEQIDNO:26的核酸序列編碼的VH和由SEQIDNO:22、23或24的核酸序列編碼的VL;或者由SEQIDNO:27的核酸序列編碼的VH和由SEQIDNO:22、23或24的核酸序列編碼的VL。本發(fā)明包括了抗體，其中該VH包含SEQIDNO:10所示的氨基酸序列，且該VL包含SEQIDNO:7所示的氨基酸序列。本發(fā)明包括了抗體，其中該VH包含SEQIDNO:10所示的氨基酸序列，且該VL包含SEQIDNO:8所示的氨基酸序列。本發(fā)明包括了抗體，其中該VH包含SEQIDNO:11所示的氨基酸序列，且該VL包含SEQIDNO:9所示的氨基酸序列。本發(fā)明包括了抗體，其中該VH由在嚴(yán)格條件下與編碼SEQIDNO:10、11、17、18或19的氨基酸序列的核苷酸序列的補(bǔ)體雜交的核苷酸序列所編碼；和/或VL由在嚴(yán)格條件下與編碼SEQIDNO:7、8、9、12、13、14、15、16或61的氨基酸序列的核苷酸序列的補(bǔ)體雜交的核苷酸序列所編碼。本發(fā)明包括了抗體，其中該VH由在嚴(yán)格條件下與SEQIDNO:25、26或27任意一個(gè)所示的核苷酸序列的補(bǔ)體雜交的核苦酸序列所編碼；和/或VL由在嚴(yán)格條件下與SEQIDNO:20、21、22、23或24任意一個(gè)所示的核脊酸序列的補(bǔ)體雜交的核香酸序列所編碼。本發(fā)明包括了分離的拮抗劑抗體，該抗體以介于約1x10—12至約1x10—11M、1x10-11至約1x1(T10M、1x10-10至約1xl(T9M、1x10-9至約1xl(T8M、1x10"至約1x1(T7M的解離常數(shù)與人OX40表位特異性地結(jié)合。本發(fā)明包括了與SEQIDNO:7所示序列具有至少95%序列一致性的VL序列，以及與SEQIDNO:10所示序列具有至少95%序列一致性的VH序列。本發(fā)明包括了與SEQIDNO:8所示序列具有至少95%序列一致性的VL序列，以及與SEQIDNO:10所示序列具有至少95%序列一致性的VH序列。本發(fā)明包括了與SEQIDNO:9所示序列具有至少95%序列一致性的VL序列，以及與SEQIDNO:11所示序列具有至少95%序列一致性的VH序列。本發(fā)明還包括了抗體分子，其包含了包含SEQIDNO:17(CDR-H1)、SEQIDNO:18(CDR-H2)和SEQIDNO:19(CDR-H3)的重鏈可變區(qū)和/或包含SEQIDNO:12、SEQIDNO:15或SEQIDNO:61(CDR誦Ll);SEQIDNO:13(CDR-L2);和SEQIDNO:14或SEQIDNO:16(CDR-L3)的輕鏈可變區(qū)。本發(fā)明包括了本發(fā)明抗體的人抗原-結(jié)合抗體片段，包括，但不限于，F(xiàn)ab、Fab'和F(ab')2、Fd、單鏈Fvs(scFv)、單鏈抗體、二疏鍵連接的Fvs(sdFv)、雙鏈抗體(diabody)、三鏈抗體(triabody)或微抗體。本發(fā)明還包括了包含VL或VH結(jié)構(gòu)域的單結(jié)構(gòu)域抗體。本發(fā)明包括了單克隆抗體A10(TH)hu336F及其變體的人源化序列。編碼這些變體的核酸包括SEQIDNO20-27。A10(TH)hu336F包含了包含SEQIDNO:9的輕鏈可變區(qū)和包含SEQIDNO:11的重鏈可變區(qū)。該重鏈可變區(qū)可進(jìn)一步包含恒定區(qū)的CH1、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域中的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域。該重鏈恒定區(qū)可以是IgG抗體，其中該IgG抗體為IgGl抗體、IgG2抗體、IgG3抗體或IgG4抗體。只要基本保持對(duì)OX40的結(jié)合活性，本發(fā)明的抗體可包含任意合適的框架可變結(jié)構(gòu)域序列。例如，在部分實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含了人亞組III重鏈框架共有序列。在這些抗體的一個(gè)實(shí)施方案中，該框架共有序列包含了在位置71、73和/78上的取代。在這些抗體的部分實(shí)施方案中，位置71為A、73為T(mén)和/或78為A。在一個(gè)實(shí)施方案中，這些抗體包含了huMAb4D5-8的重鏈可變結(jié)構(gòu)域框架序歹ij(HERCEPTIN⑧，Genentech，Inc.,SouthSanFrancisco,CA,USA)(還可參見(jiàn)美國(guó)專利6,407,213和5,821,337，以及Lee等人，《/Mo/.AW.(2004)，340(5):1073-93)。在一個(gè)實(shí)施方案中，這些抗體進(jìn)一步包含了人Kl輕鏈框架共有序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體包含了圖12B(IGHVl隱46序歹iJ)中所示的亞組Vl的IGHVl-46(GeneBank錄入號(hào)X92343)以及胚系IGHJ4(GeneBank錄入號(hào)J00256)的組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，該框架序列包含了在位置69的取代。在部分實(shí)施方案中，該位置69為L(zhǎng)。為VL鏈選擇的人模板為圖12A(IGKV4-1序列)中所示的IGKV4-1(GeneBank錄入號(hào)Z00023)以及胚系J模板IGHJ1(GeneBank錄入號(hào)J00242)的組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含了重鏈可變結(jié)構(gòu)域，其中框架序列包含了SEQIDNO:30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47和/或48的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含了輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，其中框架序列包含了SEQIDNO:49、50、51和/或52的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含了重鏈可變結(jié)構(gòu)域，其中框架序列包含了SEQIDNO:57、58、59和/或60的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含了輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，其中框架序列包含了SEQIDNO:53、54、55和/或60的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含了重鏈可變結(jié)構(gòu)域，其中框架序列包含了SEQIDNO:30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47和/或48的序列，且HVRH1、H2和H3序列分別為SEQIDNO:17、18和/或19。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含了輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，其中框架序列包含了SEQIDNO:49、50、51和/或52的序列，且HVRL1、L2和L3序列分別為SEQIDNO:12、13和/或16。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含了重鏈可變結(jié)構(gòu)域，其中框架序列包含了SEQIDNO:57、58、59和/或60的序列，且HVRHI、H2和H3序列分別為SEQIDNO:17、18和/或19。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含了輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，其中框架序列包含了SEQIDNO:53、54、55和/或56的序列，且HVRL1、L2和L3序列分別為SEQIDNO:12、13和/或16。本發(fā)明包括了進(jìn)一步包含了可檢測(cè)標(biāo)簽的抗-OX40抗體。本發(fā)明進(jìn)一步包括了在體內(nèi)或樣本中檢測(cè)OX40的方法。該方法包括了將OX40抗體與個(gè)體或與從該個(gè)體獲得的樣本相接觸。本發(fā)明包括了進(jìn)一步包含標(biāo)記物的抗體。本發(fā)明包括了進(jìn)一步包含了細(xì)胞毒素或免疫毒素的上述抗-OX40抗體及其在治療下述疾病或病癥中的用途。本發(fā)明還包括了與抗體A10(TH)hu336F結(jié)合相同表位的抗體。本發(fā)明包括了分離的核酸分子，其包含了編碼本發(fā)明的抗體的核苷酸序列。本發(fā)明包括了包含本發(fā)明的核酸分子的載體。本發(fā)明包括了包含本發(fā)明的載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明包括了生成本發(fā)明的抗體的雜交瘤。本發(fā)明包括了編碼本發(fā)明的抗體的分離的核酸分子，其中核苷酸序列包含了SEQIDNO:20、21、22、23或24中的任意一個(gè)。本發(fā)明包括了編碼本發(fā)明的抗體的分離的核酸分子，該抗體包含SEQIDNO:7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19的氨基酸序列。本發(fā)明包括了分離的核酸分子，其包含了編碼如下區(qū)域的核酸序列具有SEQIDNO:IO、11、17、18或19中任意一個(gè)所示的氨基酸序列或由SEQIDNO:25、26或27的核酸序列編碼的重鏈可變區(qū)(VH);或具有SEQIDNO:7、8、9、12、13、14、15或16中任意一個(gè)所示的氨基酸序列或由SEQIDNO:20、21、22、23或24的核酸序列編碼的輕鏈可變區(qū)(VL)。本發(fā)明包括了組合物，其包含了本發(fā)明所主張的抗體，以及生理學(xué)可接受的載體、稀釋劑、賦形劑或穩(wěn)定劑。本發(fā)明包括了生產(chǎn)本發(fā)明主張的抗體的方法，該方法包括在適于該抗體生成的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的細(xì)胞，并分離該抗體。本發(fā)明的另一方面是抗-OX40拮抗劑抗體在治療炎性和自身免疫疾病中的用途。本發(fā)明包括了通過(guò)抑制患者體內(nèi)IgE抗體生成來(lái)預(yù)防病癥的方法，該方法包括向該患者施用有效量的本發(fā)明所述的抗體。該病癥包括但不限于，哮喘(例如過(guò)敏性哮喘)、過(guò)敏性鼻炎、異位性皮炎、移植排斥以及動(dòng)脈粥樣硬化。本發(fā)明包括了在患者體內(nèi)抑制IgE抗體生成的方法，該方法包括向該患者施用本發(fā)明主張的拮抗劑抗-OX40抗體。對(duì)IgE抗體生成的抑制可預(yù)防支氣管哮喘、過(guò)敏性鼻炎、過(guò)敏性皮炎、過(guò)敏性反應(yīng)、蕁麻滲以及異位性皮炎。本發(fā)明包括了在患者體內(nèi)治療OX-40-介導(dǎo)的病癥的方法，該方法包括向該患者施用有效量的本發(fā)明主張的抗體或抗原-結(jié)合片段，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段阻斷OX40L與OX40結(jié)合和/或抑制一種或多種與OX40L和OX40的結(jié)合相關(guān)的功能。本發(fā)明包括了治療患有哮喘癥狀的個(gè)體的方法，該方法包括向該個(gè)體(例如，有此需求的個(gè)體)施用減輕該哮喘癥狀的量的本發(fā)明主張的抗體。本發(fā)明的抗體可通過(guò)一種或多種途徑施用，包括靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、吸入、肌肉內(nèi)、皮下和口服途徑。本發(fā)明包括向患者遞送治療有效量的本發(fā)明主張的抗體的吸入裝置。本發(fā)明包括了減輕哺乳動(dòng)物中哮喘的嚴(yán)重性的方法，該方法包括向該哺乳動(dòng)物施用治療有效量的具有至少一個(gè)如下特征的抗-OX40抗體以介于約1x101()至約1x1012M之間的Kd結(jié)合人OX40的能力；抑制一種或多種與結(jié)合OX40受體相關(guān)的功能以及抑制OX40L與所述受體結(jié)合的能力。在某些實(shí)施方案中，該抗體以介于約1x10"2至約1xio"1M、1xio"1至約1x10-1()M、1x10-1()至約1x10-9M、1x10-9至約1x1(T8M、1xi(T8至約1x1(T7M的解離常數(shù)結(jié)合人OX40。本發(fā)明包括了減輕哺乳動(dòng)物中哮喘的嚴(yán)重性的方法，該方法包括向該哺乳動(dòng)物施用有效量的抗體，其中該抗體具有至少一個(gè)如下性質(zhì)(a)以介于約1x10"2至約1x10-8M之間的K。結(jié)合人OX40;(b)抑制一種或多種與結(jié)合OX40相關(guān)的功能；以及(c)抑制OX40L與OX40的結(jié)合。本發(fā)明的抗體還可用于治療(但不限于)過(guò)敏、哮喘、異位性皮炎、多發(fā)性石更化癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、炎性腸道疾病、移植物抗宿主病、實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)、自身免疫性神經(jīng)疾病(例如Guillain-Barre)、自身免疫性葡萄膜炎、自身免疫性溶血性貧血、自身免疫性血小板減少、重癥肌無(wú)力、膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎、結(jié)腸炎(例如潰瘍性結(jié)腸炎)、接觸超敏反應(yīng)、糖尿病、克隆氏病禾oGrave病。本發(fā)明的抗體還可用于治療肉狀瘤病、實(shí)驗(yàn)性利什曼病、惡性貧血、顳動(dòng)脈炎、抗磷脂綜合癥、血管炎(例如Wegener肉芽腫病)、白塞氏病、皰疹樣皮炎、尋常天皰瘡、白斑病、原發(fā)性膽汁性肝硬變、自身免疫性肝炎、橋本氏甲狀腺炎、自身免疫性卵巢炎和睪丸炎、腎上腺的自身免疫性疾病、系統(tǒng)性紅斑狼疾、石更皮病、皮膚肌炎、多發(fā)性肌炎、皮膚肌炎、脊推關(guān)節(jié)病(例如強(qiáng)直性脊柱炎)、Reiter綜合癥、Sjogren綜合癥等。本發(fā)明包括了本發(fā)明的抗體在藥物制備中的用途。本發(fā)明包括了本發(fā)明的抗體在治療OX40相關(guān)的疾病或病癥中的用途。本發(fā)明包括了本發(fā)明的抗體在檢測(cè)OX40中的用途。本發(fā)明包括了試劑盒，其在容器中包含了預(yù)定量的本發(fā)明的抗體，并在單獨(dú)的容器中包含了緩沖液。本發(fā)明包括了試劑盒，其在一個(gè)容器中包含了預(yù)定量的本發(fā)明的組合物，并在單獨(dú)的容器中包含了緩沖液。本發(fā)明包括了包含本發(fā)明的抗體的醫(yī)學(xué)裝置。本發(fā)明包括了包含本發(fā)明的組合物的醫(yī)學(xué)裝置。4.圖1A顯示了人OX40cDNA(錄入號(hào)NM004295)的核酸序列。圖1B顯示了人OX40蛋白(錄入號(hào)NMJ)03318)的氨基酸序列。圖2顯示了小鼠抗-OX40mAbB66對(duì)體外激活的初始人CD4+T-細(xì)胞生成IL-2(2A)和IL-13(2B)的抑制作用。圖3顯示了小鼠抗-OX40mAbB66對(duì)體外激活的初始人CD4+T-細(xì)胞的增殖的抑制作用。圖4顯示了嵌合抗-OX40mAbA10和B66對(duì)體外致敏(primed)的人Th2細(xì)胞的細(xì)胞凋亡作用。圖5顯示了嵌合抗-OX40mAbA10和B66對(duì)體外致敏的人Th2細(xì)胞的增殖的抑制作用?？招姆娇虼沓跏糃D4;空心三角代表初始CD4+與對(duì)照L-細(xì)胞；實(shí)心三角代表B66與初始CD4+和OX40LL-細(xì)胞；實(shí)心方框代表2C4(IC)與初始CD4+和OX40LL-細(xì)胞；實(shí)心圓圈代表A10與初始CD4+和OX40L-L-多田月包。圖6顯示了嵌合抗-OX40mAbA10和B66對(duì)體外致敏人Th2細(xì)胞生成IL2(6A)和IL-13(6B)的抑制作用?？招姆娇虼沓跏糃D4;空心三角代表初始CD4+與對(duì)照L-細(xì)胞；實(shí)心三角代表B66與初始CD4+和OX40LL-細(xì)胞；實(shí)心方框代表2C4(IC)與初始CD4+和OX40LL-細(xì)胞；實(shí)心圓圈代表A10與初始CD4+和OX40L-L-細(xì)胞。圖7:該表顯示了嵌合抗-OX40mAbB66和商業(yè)抗-OX40mAbL106對(duì)體外激活的初始人CD4+T-細(xì)胞生成IL-2和IL-13的抑制作用的比較。圖8:該表顯示了人源化、嵌合和小鼠抗-OX40mAbA10對(duì)體外激活的初始人CD4+T-細(xì)胞的增殖的抑制作用以及對(duì)它們生成IL-2、IL-5和IL-13的抑制作用。圖9:該表顯示了人源化、嵌合和小鼠抗-OX40mAbA10對(duì)體外致敏的人TM細(xì)胞的增殖的抑制作用以及對(duì)它們生成IL-2、IL-5和IL-13的抑制作用。圖10:該表顯示了人源化、嵌合和小鼠抗-OX40mAbA10對(duì)體外致敏的人Th2細(xì)胞的增殖的抑制作用以及對(duì)它們生成IL-2、IL-5和IL-13的抑制作用。圖11:該表顯示了人源化、嵌合和小鼠抗-OX40mAbA10對(duì)體外致敏的人Th2細(xì)胞的增殖的抑制作用以及對(duì)它們?cè)谑褂猛N異體TSLP激活的骨髓樹(shù)突細(xì)胞時(shí)生成IL-2、IL-5和IL-13的抑制作用。圖12A顯示了鼠抗體A10和B66的輕鏈可變氨基酸序列與人模板IGKV4-1/IGKJ1的比較，以及所得的人源化序列A10(TH)hu336F。上標(biāo)的數(shù)值表示根據(jù)Kabat的氨基酸位置。圖12B顯示了鼠抗體A10的重鏈可變氨基酸序列與人模板IGHV1-46/IGHJ4的比較，以及所得的人源化序列A10(TH)hu336F。上標(biāo)的數(shù)值表示根據(jù)Kabat的氨基酸位置。圖13顯示了人源化克隆A10(TH)hu336F(國(guó))相比親代鼠抗體A10()及其嵌合形式(A)具有更高的結(jié)合活性。圖14顯示了抗-OX40的鼠和人源化可變區(qū)的核酸序列A)輕鏈k可變252-A10;B)輕鏈k可變252-B66;C)人源化輕鏈可變A10(SN)，全抗體B和E;D)人源化輕鏈可變A10(SH)，全抗體A和D;E)人源化輕鏈可變A10(TH)hu336，全抗體C和F;F)重鏈可變252-A10;G)重鏈可變A10(TH)hu336，全抗體D-F;H)重鏈可變A10L70，全抗體A-C。圖15顯示了人源化克隆A10(TH)hu336F(■)、鼠A10O)及其嵌合形式(▲)對(duì)OX40的竟?fàn)幭喈?dāng)。圖16A，B和17A，B顯示了用于實(shí)施本發(fā)明的示例性接收者人共有框架序列，具有如下序列標(biāo)識(shí)符可變重(VH)共有框架(圖16A,B)人VH亞組I共有框架減去KabatCDR(SEQIDNO:30);人VH亞組I共有框架減去延伸的超變區(qū)(SEQIDNO:31-33);人VH亞組II共有框架減去KabatCDR(SEQIDNO:34);人VH亞組II共有框架減去延伸的超變區(qū)(SEQIDNO:35-37);人VH亞組II共有框架減去延伸的人VH亞組III共有框架減去KabatCDR(SEQIDNO:38);人VH亞組III共有框架減去延伸的超變區(qū)(SEQIDNO:39-41);人VH接收者框架減去KabatCDR(SEQIDNO:42);人VH接收者框架減去延伸的超變區(qū)(SEQIDNO:43-44);人VH接收者2框架減去KabatCDR(SEQIDNO:45);人VH接收者2框架減去延伸的超變區(qū)(SEQIDNOs:46-48);可變輕(VL)共有框架(圖17A,B);人VLk亞組I共有框架(SEQIDNO:49);人VLk亞組II共有框架(SEQidno:50);人vlk亞組iii共有框架(seqidno:51);人vlk亞組iv共有框架(SEQIDNO:52)。圖18顯示了huMAb4D5-8輕鏈和重鏈的框架區(qū)序列。上標(biāo)/粗體的數(shù)值表示根據(jù)Kabat的氨基酸位置。圖19顯示了huMAb4D5-8輕鏈和重鏈的修飾/變體柩架區(qū)序列。上標(biāo)/粗體的數(shù)值表示根據(jù)Kabat的氨基酸位置。5.發(fā)明詳述本發(fā)明不限于本文所述的特定的方法、方案、細(xì)胞系、載體或試劑，因?yàn)樗鼈兛梢宰兓?。此外，本文所用的術(shù)語(yǔ)僅為了描述特定的實(shí)施方案，并非意在限制本發(fā)明的范圍。本文和權(quán)利要求中所用的單數(shù)形式的"一個(gè)"、"一種"和"該"包括復(fù)數(shù)含義，除非上下文另行指明，例如，"一個(gè)宿主細(xì)胞"包括多個(gè)該種宿主細(xì)胞。除非另行說(shuō)明，本文所用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)以及任何縮寫(xiě)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員的普遍理解相同的含義。盡管可以使用與本文所述方法和材料類似或等同的任何方法和材料實(shí)施本發(fā)明，本文表述了示例性的方法、設(shè)備和材料。本文提及的所有專利和公開(kāi)物均以法律允許的程度在此？I入作為參考，其目的在于描述和披露其中報(bào)道的可能用于本發(fā)明的蛋白、酶、載體、宿主細(xì)胞和方法。然而，本發(fā)明的任何內(nèi)容均不應(yīng)被解釋為承認(rèn)由于在先的發(fā)明而使本發(fā)明的發(fā)明日不早于該披露。5.1定義在整個(gè)本申請(qǐng)中所用的術(shù)語(yǔ)應(yīng)被解釋為對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言的一般和通常含義。然而，申請(qǐng)人希望賦予下文的術(shù)語(yǔ)如下特定的含義。關(guān)于抗體鏈多肽序列的短語(yǔ)"基本一致"可被解釋為抗體鏈顯示了與參考多肽序列至少70%、或80%、或90%、或95%的序列一致性。關(guān)于核酸序列的該術(shù)語(yǔ)可被解釋為核普酸序列顯示了與參考核酸序列至少約85%、或90%、或95%、或97%的序列一致性。術(shù)語(yǔ)"一致性"或"同源性"應(yīng)被解釋為表示在對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)和(根據(jù)達(dá)到整個(gè)序列的最大百分比一致性的需要)引入間隙后，候選序列中的氨基酸殘基和與之比較的相應(yīng)序列的殘基的一致性百分比，不將任意保守替換視作該序列一致性的一部分。N-或C-末端的延伸或者插入均不應(yīng)被視作減少了一致性或同源性。進(jìn)行比對(duì)的方法和計(jì)算機(jī)程序已為本領(lǐng)域公知。序列一致性可通過(guò)序列分析軟件進(jìn)行測(cè)算。術(shù)語(yǔ)"抗體"以其廣泛的含義被使用，其包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分(即，包含了免疫特異性結(jié)合抗原的抗原結(jié)合位點(diǎn)的分子)，并特別涵蓋了單克隆抗體(包括全長(zhǎng)單克隆抗體)、多克隆抗體和多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)。抗體(Ab)和免疫球蛋白(Ig)為具有相同結(jié)構(gòu)特征的糖蛋白。盡管抗體顯示了對(duì)特定靶標(biāo)的結(jié)合特異性，免疫球蛋白包括了抗體和其它缺乏耙標(biāo)特異性的抗體樣分子。天然抗體和免疫球蛋白通常為由兩個(gè)相同輕(L)鏈和兩個(gè)相同重(H)鏈組成的約150,000道爾頓的異四聚體糖蛋白。每條重鏈在一端具有可變結(jié)構(gòu)域(VH),隨后為教個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域。每條輕鏈在一端具有可變結(jié)構(gòu)域(vo,在其另一端具有恒定結(jié)構(gòu)域。此外，術(shù)語(yǔ)"抗體"(Ab)或"單克隆抗體"(mAb)意在包括完整的分子以及能夠特異性結(jié)合蛋白的抗體片段(例如，F(xiàn)ab和F(ab')2片段)。Fab和F(ab')2片段缺乏完整抗體的Fc片段，從動(dòng)物或植物的循環(huán)中被更快地清除，與完整抗體相比，非特異性組織結(jié)合較少(Wahl等人，JWwc/AfeJ24:316(1983))。本文所用的"抗-OX40抗體"表示結(jié)合人OX40的抗體，其結(jié)合的方式能夠抑制或大大減少該OX40與其配體(OX40配體)的結(jié)合。本文所用的術(shù)語(yǔ)"OX40-介導(dǎo)的病癥"包括與過(guò)敏、哮喘以及與自身免疫和炎癥相關(guān)的疾病，所述疾病包括多發(fā)性硬化癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎性腸道疾病、移植物抗宿主病、實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)、實(shí)驗(yàn)性利什曼病、膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎、結(jié)腸炎(例如潰瘍性結(jié)腸炎)、接觸超敏反應(yīng)、糖尿病、克隆氏病和Grave病。其它的病癥如肉狀瘤病、自身免疫眼部疾病、自身免疫葡萄膜炎、異位性皮炎、重癥肌無(wú)力、自身免疫性神經(jīng)疾病(例如Guillain-Barre)、自身免疫性葡萄膜炎、自身免疫性溶血性貧血、惡性貧血、自身免疫性血小板減少、顳動(dòng)月永炎、抗磷脂綜合癥、血管炎(例如Wegener肉芽胂病)、白塞氏病、牛皮褲、皰滲樣皮炎、尋常天皰瘡、白斑病、原發(fā)性膽汁性肝硬變、自身免疫性肝炎、橋本氏甲狀腺炎、自身免疫性卵巢炎和睪丸炎、腎上腺的自身免疫性疾病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、硬皮病、皮膚肌炎、多發(fā)性肌炎、皮膚肌炎、脊推關(guān)節(jié)病(例如強(qiáng)直性脊柱炎)、Reiter綜合癥以及Sjogren綜合癥同樣被包括在該術(shù)語(yǔ)的范圍之內(nèi)。在關(guān)于抗體可變結(jié)構(gòu)域中使用的術(shù)語(yǔ)"可變"指如下事實(shí)該可變結(jié)構(gòu)域的某些部分可在不同抗體之間存在廣泛的差異，并用于每個(gè)特定抗體對(duì)其特定耙標(biāo)的結(jié)合和特異性。然而，該種可變性并不在抗體的可變結(jié)構(gòu)域中均勻分布。它集中在輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域中三個(gè)被稱為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的片段(也被稱為超變區(qū))中?？勺兘Y(jié)構(gòu)域中更為保守的部分被稱為框架(FR)。如本領(lǐng)域所知，限定抗體超變區(qū)的氨基酸位置/邊界可根據(jù)背景和本領(lǐng)域已知的各種定義而變化?？勺兘Y(jié)構(gòu)域內(nèi)的一些位置可被視作混合超變位置，因?yàn)檫@些位置在一種標(biāo)準(zhǔn)下可被看作超變區(qū)內(nèi)的位置，而在一套不同的標(biāo)準(zhǔn)下則被看作是超變區(qū)以外的位置。這些位置中的一個(gè)或多個(gè)還可存在于延伸的超變區(qū)中。本發(fā)明提供了在這些混合超變位置具有修飾的抗體。天然重鏈和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域各自包含了四個(gè)FR區(qū)，大致呈P-折疊構(gòu)型，由三個(gè)CDR連接，其形成環(huán)狀連接，并在部分情況下形成(3-折疊結(jié)構(gòu)的一部分。每個(gè)鏈中的CDR通過(guò)FR區(qū)相鄰地保持在一起，并與另一條鏈上的CDR—起形成抗體的把標(biāo)結(jié)合位點(diǎn)(參見(jiàn)Kabat等人SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,NationalInstituteofHealth,Bethesda，Md.(1987))。除非另行指明，本文所用的對(duì)免疫球蛋白氨基酸殘基的編號(hào)可參照Kabat等人的免疫球蛋白氨基酸殘基編號(hào)系纟充進(jìn)4亍。術(shù)語(yǔ)"抗體片段"指全長(zhǎng)抗體的一部分，通常指靶標(biāo)結(jié)合或可變區(qū)。抗體片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段。短語(yǔ)抗體的"抗原結(jié)合片段"指與全長(zhǎng)抗體具有相同的定性生物活性的化合物。例如，抗-OX40抗體的抗原結(jié)合片段是可以以下述方式結(jié)合OX40受體的化合物，所述結(jié)合方式可以防止或大大減少該種分子結(jié)合OX40配體的能力。本文關(guān)于抗體所用的"功能性片段"指Fv、F(ab)和F(ab')2片段。"Fv"片段是包含完整靶標(biāo)識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)的最小抗體片段。該區(qū)由緊密、非共價(jià)連接的一個(gè)重鏈可變結(jié)構(gòu)域和一個(gè)輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的二聚體(VH-VL二聚體)組成。它呈這樣的構(gòu)型每個(gè)可變結(jié)構(gòu)域中的三個(gè)CDR相互作用，從而在VH-VL二聚體的表面限定靶標(biāo)結(jié)合位點(diǎn)。這六個(gè)CDR共同賦予了該抗體結(jié)合耙標(biāo)的特異性。然而，即使單個(gè)的可變結(jié)構(gòu)域(或僅包含三個(gè)對(duì)靶標(biāo)具有特異性的CDR的半個(gè)Fv)也有識(shí)別和結(jié)合靶標(biāo)的能力，盡管其親和力低于完整結(jié)合位點(diǎn)。"單鏈Fv"或"sFv"抗體片段包含了抗體的VH和VL結(jié)構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu)域存在于單條多肽鏈中。一般而言，該Fv多肽進(jìn)一步包含該Vh和VL結(jié)構(gòu)域之間的多肽接頭，該接頭使得該sFv形成用于靶標(biāo)結(jié)合的所需結(jié)構(gòu)。Fab片段包含了輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域和重鏈的第一恒定結(jié)構(gòu)域(CH1)。Fab'片段與Fab片段的不同之處在于在重鏈CH1結(jié)構(gòu)域的羧基末端添加了幾個(gè)殘基，包括來(lái)自抗體鉸鏈區(qū)的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸。F(ab')片段可通過(guò)對(duì)F(ab')2胃蛋白酶消化產(chǎn)物的鉸鏈半胱氨酸的二疏鍵裂解后生成?？贵w片段的其它化學(xué)偶聯(lián)已為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知。本文所用的術(shù)語(yǔ)"單克隆抗體"指從基本同種的抗體群(即，組成該群的單個(gè)抗體除了極少量的可能的天然發(fā)生的突變外是相同的)獲得的抗體。單克隆抗體具有高度特異性，其針對(duì)單個(gè)靶標(biāo)位點(diǎn)。此外，與通常包含針對(duì)不同決定簇(表位)的不同抗體的傳統(tǒng)(多克隆)抗體制備物不同，每個(gè)單克隆抗體針對(duì)耙標(biāo)上的單個(gè)決定簇。除了其特異性外，單克隆抗體的優(yōu)點(diǎn)在于它們可通過(guò)雜交瘤培養(yǎng)合成，不受其它免疫球蛋白所污染。修飾語(yǔ)"單克隆"指抗體源于基本同種抗體群的特征，不應(yīng)解釋為需要通過(guò)任何特定的方法生成該抗體。例如，用于本發(fā)明的該單克隆抗體可通過(guò)公知技術(shù)從噬菌體抗體庫(kù)分離。用于本發(fā)明的親代單克隆抗體可通過(guò)首先由Kohler等人，7V^we256:495(1975)描述的雜交瘤方法生成，或可通過(guò)重組方法生成。本文所用的術(shù)語(yǔ)"嵌合"抗體指具有來(lái)自于非人免疫球蛋白(例如大鼠或小鼠抗體)的可變序列和人免疫球蛋白恒定區(qū)(通常選自人免疫球蛋白模板)的抗體。非人(例如，鼠)抗體的"人源化"形式為包含了來(lái)自于非人免疫球蛋白最小序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(例如抗體的Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或其它靶標(biāo)-結(jié)合序列)。一般而言，人源化抗體將基本包含至少一個(gè)、通常為兩個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的全部，其中全部或基本全部CDR區(qū)對(duì)應(yīng)于非人免疫球蛋白的CDR區(qū)，而全部或基本全部FR區(qū)為人免疫球蛋白的共有序列。該人源化抗體還可包含至少一部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)，通常為所選的人免疫球蛋白模板的一部分免疫球蛋白恒定區(qū)。本文所述的"人抗體"包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗體，以及包括從人免疫球蛋白庫(kù)或從表達(dá)一種或多種人免疫球蛋白且不表達(dá)內(nèi)源免疫球蛋白的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物分離的抗體，如下文描述，并可參見(jiàn)Kucherlapati等人的美國(guó)專利5,939,598。術(shù)語(yǔ)"細(xì)胞"、"細(xì)胞系"和"細(xì)胞培養(yǎng)物"包括后代。還應(yīng)當(dāng)理解由于有意的或無(wú)意的突變，并非所有的后代具有完全相同的DNA成分。其還包括從最初轉(zhuǎn)化細(xì)胞中篩選的具有相同功能或生物屬性的變體后代。在本發(fā)明中所用的"宿主細(xì)胞"通常為原核或真核宿主。用DNA"轉(zhuǎn)化"細(xì)胞有機(jī)體的指向有機(jī)體《1入DNA，從而使該DNA作為染色體外元件或通過(guò)染色體整合可進(jìn)行復(fù)制。用DNA"轉(zhuǎn)染"細(xì)胞有機(jī)體指由細(xì)胞或有機(jī)體攝入DNA(例如，表達(dá)載體)，不管事實(shí)上是否有任何編碼序列被表達(dá)。術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞"和"轉(zhuǎn)化的"指導(dǎo)入了DNA的細(xì)胞。該細(xì)胞被稱為"宿主細(xì)胞"，它可以是原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。典型的原核宿主細(xì)胞包括各種大腸桿菌菌株。典型的真核宿主細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢與宿主細(xì)胞不同的物種，或者它可以是雜交DNA序列，包含了部分外源和部分同源的DNA。術(shù)語(yǔ)"載體"指DNA構(gòu)建體，其包含了與能夠使該DNA在合適宿主中表達(dá)的合適控制序列可操作地連接的DNA序列。該控制序列包含了實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子、任選的控制該種轉(zhuǎn)錄的操作子序列、編碼合適的mRNA核糖體結(jié)合位點(diǎn)的序列以及控制轉(zhuǎn)錄和翻譯終止的序列。該載體可以是質(zhì)粒、噬菌體顆?；騼H僅為潛在的基因組插入物。一旦轉(zhuǎn)化進(jìn)入合適的宿主，該載體可獨(dú)立于宿主基因組復(fù)制和行使功能，或者在一些情況下，整合進(jìn)入基因組本身。在本說(shuō)明書(shū)中，"質(zhì)粒"和"栽體"有時(shí)可進(jìn)行互換，因?yàn)橘|(zhì)粒是載體的最常用形式。然而，本發(fā)明意在包括具有同等功能并且已為或正為本領(lǐng)域所知的載體的其它形式。用于治療的"哺乳動(dòng)物"指被歸類為哺乳動(dòng)物的任意動(dòng)物，包括人，家養(yǎng)或農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物，非人靈長(zhǎng)動(dòng)物，以及動(dòng)物園、運(yùn)動(dòng)或?qū)櫸镱悇?dòng)物，例如狗、馬、貓、牛等。本文所用的詞語(yǔ)"標(biāo)記物"指可檢測(cè)的化合物或組合物，其可直接或間接地與分子或蛋白(例如，抗體)偶聯(lián)。該標(biāo)記物可以是本身可檢測(cè)的(例如，放射性同位素標(biāo)記物或熒光標(biāo)記物)，或者在作為酶標(biāo)記物時(shí)，可催化底物化合物或組合物的可檢測(cè)的化學(xué)變化。本文所用的"固相"指本發(fā)明的抗體可以附著的非水性基質(zhì)。本文涵蓋的固相的例子包括部分或完全由玻璃(例如，可控孔度玻璃)、多糖(例如，瓊脂糖)、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇以及硅酮形成的固相。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)上下文，該固相可包含測(cè)定平板的微孔；在其它情況下，它可以是純化柱(例如，親和純化柱)。5.2免疫原OX40受體的兩種形式可用作生成本發(fā)明的抗-OX40抗體的免疫原(1)一種是作為融合蛋白表達(dá)的人OX40受體的可溶形式，該融合蛋白包含了人Fcyl和核香酸殘基105至627編碼的胞外結(jié)構(gòu)域；和(2)另一種是基于細(xì)胞的免疫原，其包含了在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的小鼠纖維原細(xì)胞L-細(xì)胞表面表達(dá)的全長(zhǎng)所得拮抗劑抗體針對(duì)OX40，并能夠抑制OX40L與OX40的相互作用，從而35中和受體活性。優(yōu)選地，該免疫原為多肽，并可以是跨膜分子。該免疫原可重組生成，或通過(guò)合成方法制備。該免疫原還可從天然來(lái)源分離。免疫原可包含OX40的胞外結(jié)構(gòu)域?？商娲?，表達(dá)包含胞外結(jié)構(gòu)域的跨膜蛋白的細(xì)胞可被用作免疫原。該種細(xì)胞可來(lái)自于天然來(lái)源(例如，T-細(xì)胞系)或可以是通過(guò)重組技術(shù)轉(zhuǎn)化的在其表面表達(dá)受體的細(xì)胞?？捎糜谏煽贵w的其它免疫原及其形式將對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)。用全細(xì)胞免疫原免疫宿主動(dòng)物(例如嚙齒動(dòng)物)是本領(lǐng)域公知的?？商娲?，根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法將編碼OX40的基因或cDNA克隆進(jìn)入質(zhì)?；蚱渌d體，并在多種表達(dá)系統(tǒng)中的任意一種中表達(dá)。克隆和表達(dá)OX40的方法以及OX40的核酸序列是眾所周知的(例如，參見(jiàn)美國(guó)專利5,821,332和5,759,546)。由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，可生成編碼OX40多肽的多種核脊酸序列。人們可基于可能的密碼子選擇來(lái)選擇組合從而改變核苷酸序列。這些組合可根據(jù)用于編碼天然存在的OX40多肽的核苷酸序列的標(biāo)準(zhǔn)三聯(lián)體遺傳密碼制備，且所有這樣的變體均應(yīng)考慮。這些多肽中的任意一種可用于免疫動(dòng)物，以生成結(jié)合OX40的抗體。免疫原OX40多肽可以(當(dāng)有益時(shí))表達(dá)為融合蛋白，該融合蛋白具有融合至另一多肽(例如免疫球蛋白Fc區(qū))的OX40多肽。該融合的多肽通常幫助蛋白純化，例如，通過(guò)允許該融合蛋白被分離和經(jīng)親和層析純化。融合蛋白可通過(guò)培養(yǎng)由融合核酸序列轉(zhuǎn)化的重組細(xì)胞生成，該融合核酸序列編碼包含了連接至蛋白質(zhì)羧基和/或氨基末端的融合片段的蛋白。融合片段可包括但不限于，免疫球蛋白Fc區(qū)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、P-半乳糖苷酶、能夠結(jié)合二價(jià)金屬離子的多聚組氨酸片段以及麥芽糖結(jié)合蛋白。在本發(fā)明中，重組OX40被用于免疫小鼠，以生成該拮抗劑抗體。重組OX40可從多個(gè)來(lái)源商業(yè)購(gòu)得(參見(jiàn)，例如，R&DSystems，Minneapolis,MN.，PeproTech,Inc.,NJ，和SanofiBio-Industries，Inc.,Tervose，PA.)。示例性多肽包含SEQIDNO:1及其變體的全部或部分。.5.3抗體生成本發(fā)明的抗體可通過(guò)本領(lǐng)域已知的任意合適的方法生成。本發(fā)明的抗體可包括多克隆抗體。制備多克隆抗體的方法已為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知(Harlow等人，Antibodies:aLaboratoryManual,ColdspringHarborLaboratoryPress,第二版(1988)),其全文在此引入作為參考)。例如，上述的免疫原可被施用至各種宿主動(dòng)物(包括但不限于，兔、小鼠、大鼠等)，以誘導(dǎo)含有特異性針對(duì)該抗原的多克隆抗體的血清的生成。該免疫原的施用可通過(guò)一次或多次注射免疫劑和(如果需要)佐劑來(lái)進(jìn)行。依據(jù)宿主種類不同，各種佐劑可用于提高免疫應(yīng)答，其包括但不限于，弗氏試劑(完全或不完全)、礦物凝l吏(如氫氧化鋁)、表面活性物質(zhì)如溶血卵磷脂、復(fù)合多元醇、聚陰離子、肽、油乳劑、匙孔血藍(lán)蛋白、二硝基酚以及潛在有用的人佐劑如BCG(卡介苗)和短小棒狀桿菌。其它的可供使用的佐劑的例子包括MPL-TDM佐劑(單磷酸類脂A，合成的海藻糖二霉菌酸脂)。免疫方案已為本領(lǐng)域公知，并可通過(guò)能誘發(fā)所選動(dòng)物宿主的免疫應(yīng)答的任意方法進(jìn)行。佐劑已為本領(lǐng)域熟知。典型地，通過(guò)多次皮下或腹膜內(nèi)注射、或肌肉內(nèi)或通過(guò)IV將免疫原(具有或不具有佐劑)注射至哺乳動(dòng)物。該免疫原可包括OX40多肽、融合蛋白或其變體。根據(jù)多肽的性質(zhì)(即，疏水性比例、親水性比例、穩(wěn)定性、凈電荷、等電點(diǎn)等)，將免疫原與已知在該被免疫的哺乳動(dòng)物中具有免疫原性的蛋白偶聯(lián)可能是有用的。該種偶聯(lián)包括通過(guò)將待偶聯(lián)的免疫原和免疫原性蛋白活性衍化出化學(xué)官能團(tuán)以形成共價(jià)鍵的化學(xué)偶聯(lián)，或通過(guò)基于融合蛋白的方法、或其它本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它方法。這些免疫原性蛋白的例子包括但不限于，匙孔血藍(lán)蛋白、卯白蛋白、血清白蛋白、牛甲狀腺蛋白、大豆胰蛋白抑制劑和混雜T輔助肽。各種佐劑可用于增加上述的免疫應(yīng)答。本發(fā)明的抗體可包括單克隆抗體。單克隆抗體為識(shí)別單個(gè)抗原性位點(diǎn)的抗體。單克隆抗體的均一的特異性使得其比通常包含了識(shí)別多種不同抗原性位點(diǎn)的多克隆抗體更為有用得多。單克隆抗體可通過(guò)雜交瘤技術(shù)(例如參見(jiàn)Kohler等人，Ato匿256:495(1975);美國(guó)專利4,376,110;Harlow等人，Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress，第二版(1988)以及Hammerling等人，MonoclonalAntibodiesandT-CellHybridomas,Elsevier(1981))、重組DNA方法或技術(shù)人員已知的其它方法進(jìn)行制備?？捎糜谥苽鋯慰寺】贵w的方法的其它例子包括但不限于，人B-細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kosbor等人，/w附w"o/ogvToday4:72(1983);Cole等人，iVocTVa//Jc^/80:2026(1983))、以及EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole等人，MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,第77-96頁(yè)，AlanR.Liss(1985))。這些抗體可以是任意免疫球蛋白類別，包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD及其任意亞類。生成本發(fā)明的mAb的雜交瘤可在體外或體內(nèi)培養(yǎng)。在雜交瘤模型中，宿主(例如小鼠、人源化小鼠、具有人免疫系統(tǒng)的小鼠、倉(cāng)鼠、兔、駱駝或任意其它合適的宿主動(dòng)物)被免疫以誘發(fā)淋巴細(xì)胞，該淋巴細(xì)胞生成或能夠生成特異性結(jié)合用于免疫的蛋白的抗體?？商娲?，淋巴細(xì)胞可被體外免疫。然后，可通過(guò)使用合適的融合劑(例如聚乙二醇)將淋巴細(xì)胞38與骨髓瘤細(xì)胞融合,以形成雜交瘤(Goding,MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice，AcademicPress，第59-103頁(yè)(1986))。一般而言，在制備抗體生成雜交瘤時(shí)，如需要人源細(xì)胞，則使用外周血淋巴細(xì)胞("PBL")，或如需要非人哺乳動(dòng)物源細(xì)胞，則可^f吏用脾細(xì)胞或淋巴結(jié)細(xì)胞。然后，可通過(guò)使用合適的融合劑(例如聚乙二醇)將淋巴細(xì)胞與永生化細(xì)月包系相融合，以形成雜交瘤(Goding,MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice,AcademicPress，第59-103頁(yè)(1986))。永生化細(xì)胞系通常為轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，特別是嚙齒動(dòng)物、?；蛉嗽垂撬枇黾?xì)胞。典型地，采用大鼠或小鼠骨髓瘤細(xì)胞系。將該雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)于適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中，該培養(yǎng)基優(yōu)選包含一種或多種抑制未融合的永生化細(xì)胞生長(zhǎng)或存活的物質(zhì)。例如，如果該親代細(xì)胞缺乏次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)，用于該雜交瘤的培養(yǎng)基通常會(huì)包含次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷("HAT培養(yǎng)基")，它們是阻止HGPRT-缺陷型細(xì)胞生長(zhǎng)的物質(zhì)。優(yōu)選的永生化細(xì)胞系為可有效融合、支持所選抗體生成細(xì)胞穩(wěn)定高水平生成抗體、并對(duì)培養(yǎng)基(例如HAT培養(yǎng)基)敏感的細(xì)胞系。這些骨髓瘤細(xì)胞系包括鼠骨髓瘤細(xì)胞系，例如可由從美國(guó)加利福尼亞州SanDiego的SalkInstituteCellDistributionCenter獲得的MOPC-21和MPC-11小鼠腫瘤和從美國(guó)馬薩諸塞州Rockvilk的美囯典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)獲得的SP2/0或X63-Ag8-653細(xì)胞衍生的細(xì)胞系。人骨髓瘤和鼠-人異源骨髓瘤細(xì)胞系也被描述用于生成人單克隆抗體(Kozbor，//附w柳o/133:3001■(1984);Brodeur等人，MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications,MarcelDekker，Inc,第51-63頁(yè)(1987))。還可使用小鼠雜交瘤細(xì)胞系NSO(EuropeanCollectionofCellCultures,Salisbury,Wilshire,UK)?？蓪?duì)生長(zhǎng)雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)基中針對(duì)OX40的單克隆抗體的生成進(jìn)行分析。由雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)的單克隆抗體的結(jié)合特異性可通過(guò)免疫沉淀或通過(guò)如放射性免疫測(cè)定(RIA)或酶聯(lián)免疫吸收分析(ELISA)等體外結(jié)合試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)。這些技術(shù)已為本領(lǐng)域所知，并在技術(shù)人員的技能范圍之內(nèi)。單克隆抗體與OX40的結(jié)合親和性可以通過(guò)例如Scatchard分析(Munson等人，^"a/別oc/em107:220(1980))進(jìn)行測(cè)定。當(dāng)鑒定出生成具有所需特異性、親和性和/或活性的抗體的雜交瘤后，將該克隆通過(guò)有限稀釋法進(jìn)行亞克隆并以標(biāo)準(zhǔn)方法培養(yǎng)(Goding,Afo"oc/o"a/Jw/Z)6^//e$v/V/wcii//es/Vac/ice,AcademicPress,第59-103頁(yè)(1986))。用于該目的的合適的培養(yǎng)基包括，例如，Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)或RPMI-1640培養(yǎng)基。此外，該雜交瘤細(xì)胞可作為腹水肺瘤在動(dòng)物體內(nèi)生長(zhǎng)。由該亞克隆分泌的單克隆抗體可通過(guò)常規(guī)的免疫球蛋白純化技術(shù)(例如，蛋白A-瓊脂糖、羥基磷灰石層析、凝膠排阻層析、凝膠電泳、透析或親和層析)從該培養(yǎng)基、腹水液體或血清適當(dāng)?shù)胤蛛x。在本領(lǐng)域中存在各種生成單克隆抗體的方法，因此，本發(fā)明不限于單一地通過(guò)雜交瘤生成。例如，單克隆抗體可通過(guò)重組DNA方法(例如描述于美國(guó)專利4,816，567)生成。雜交瘤細(xì)胞作為這些DNA的來(lái)源。一旦分離后，DNA可被放入表達(dá)載體，后者隨后被轉(zhuǎn)染進(jìn)入宿主細(xì)胞，例如大腸桿菌細(xì)胞、NSO細(xì)胞、猿COS細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或者其它情況下不會(huì)生成免疫球蛋白的骨髓瘤細(xì)胞，從而在該重組宿主細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)單克隆抗體的合成。DNA還可通過(guò)例如用人重鏈和輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域的編碼序列取代同源鼠序列來(lái)進(jìn)行修飾(美國(guó)專利4,816,567;Morrison等人,/Voc麵爿c""c/81:6851(1984))，或者通過(guò)將免疫球蛋白編碼序列共價(jià)連接到非免疫球蛋白多肽的全40部或部分編碼序列來(lái)進(jìn)行修飾。這些非免疫球蛋白多肽可替換本發(fā)明抗體的恒定結(jié)構(gòu)域，或可替換本發(fā)明抗體的一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的可變結(jié)構(gòu)域，從而生成嵌合雙鏈^元4本。抗體可以是單價(jià)抗體。制備單價(jià)抗體的方法已為本領(lǐng)域公知。例如，一種方法涉及免疫球蛋白輕鏈和修飾重鏈的重組表達(dá)。該重鏈通常在FC區(qū)的任意點(diǎn)上被截短，以防止重鏈交聯(lián)?？商娲?，相關(guān)的半胱氨酸殘基被另一氨基酸殘基替換或被刪除，從而防止交聯(lián)。識(shí)別特定表位的抗體片段可通過(guò)已知技術(shù)生成。傳統(tǒng)上，這些片段可通過(guò)完整抗體的蛋白水解消化得到(例如參見(jiàn)，Morimoto等人，J歷oc/zew祝o//z，MeAoA24:107(1992);Brennan等人，5Wewce229:81(1985))。例如，可采用木瓜蛋白酶(生產(chǎn)Fab片段)或胃蛋白酶(生產(chǎn)F(ab')2片段)等酶通過(guò)蛋白水解裂解免疫球蛋白分子獲得本發(fā)明的Fab和F(ab')2片段。F(ab')2片段包含了可變區(qū)、輕鏈恒定區(qū)和重鏈CH1結(jié)構(gòu)域。然而，這些片段現(xiàn)在可通過(guò)重組宿主細(xì)胞直接生成。例如，該抗體片段可從抗體噬菌體庫(kù)分離?？商娲?，F(xiàn)(ab')2-SH片段可直接從大腸桿菌回收，并化學(xué)偶聯(lián)形成F(ab')2片段(Carter等人，Ao/Tec/z"o/ogy10:163(1992)。根據(jù)另一方法，可從重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中直接分離F(ab')2片段。生成抗體片段的其它技術(shù)將對(duì)技術(shù)人員顯而易見(jiàn)。在其它實(shí)施方案中，所選的抗體為單鏈Fv片段(Fv)(PCT專利申請(qǐng)WO93/16185)。對(duì)于某些用途，包括抗體在人體的體內(nèi)應(yīng)用和體外檢測(cè)分析，優(yōu)選使用嵌合、人源化或人抗體。嵌合抗體是一種分子，其中抗體的不同部分來(lái)自不同動(dòng)物種類，例如包含了鼠單克隆抗體可變區(qū)和人免疫球蛋白恒定區(qū)的抗體。生產(chǎn)嵌合抗體的方法在已為本領(lǐng)域所知。例如，參見(jiàn)Morrison，&/ewce229:1202(1985);Oi等人，5iorec/z"/^^4:214(1986);Gillies等人,J/畫(huà)腳/M"/zoA125:191(1989);美國(guó)專利5,807,715、4,816,567和4,816397，其全文在此引用作為參考。人源化抗體經(jīng)設(shè)計(jì)后比來(lái)自動(dòng)物的單克隆抗體對(duì)人免疫球蛋白具有更高的同源性。人源化是一種制備嵌合抗體的技術(shù)，其中遠(yuǎn)小于完整人可變結(jié)構(gòu)域的序列被來(lái)自于非人物種的相應(yīng)序列所替換。人源化抗體是在非人物種中生成的結(jié)合所需抗原的抗體分子，該抗體分子具有一個(gè)或多個(gè)來(lái)自非人類物種的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)和來(lái)自于人免疫球蛋白分子的框架區(qū)(FR)。人框架區(qū)的框架殘基通常可被來(lái)自CDR供體抗體的相應(yīng)殘基所替代從而改變，優(yōu)選提高抗原結(jié)合。這些框架替換通過(guò)本領(lǐng)域公知的方法進(jìn)行鑒定，例如，可通過(guò)對(duì)CDR和框架殘基的相互作用建模以鑒定對(duì)抗原結(jié)合重要的框架殘基，可通過(guò)序列比較鑒定在特定位點(diǎn)的不尋常框架殘基。例如參見(jiàn)，美國(guó)專利5,585,089;Riechmann等人，A^we332:323(1988)，其全文在此引入作為參考?？贵w可通過(guò)本領(lǐng)域已知的各種技術(shù)進(jìn)行人源化，該技術(shù)包括，例如，CDR-嫁接(EP239，400;PCT公開(kāi)WO91/09967;美國(guó)專利5,225,539、5,530,101和5,585,089)、鑲飾或重塑(EP592,106;EP519,596;Padlan，Mo/ecw/ar/wm""o/ogy28:489(1991);Studnicka等人，Prate/"五"g/"eeh"g7:805(1994);Roguska等人，尸rac7Va//爿cad5W91:969(1994))、以及鏈改組(美國(guó)專利5,565,332)。一般而言，人源化抗體具有從非人來(lái)源導(dǎo)入其中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基通常被稱為"輸入"殘基，其通常取自"輸入"可變結(jié)構(gòu)域。人源化可基本上參照Winter及其合作者(Jones等人，7V"Zww321:522(1986);Riechmann等人，7Vaft^e332:323(1988);Verhoeyen等人，5Wewce239:1534(1988))的方法，通過(guò)以非人CDR或CDR序列替換人抗體的相應(yīng)序列后生成。相應(yīng)地，該種"人源化"抗體為嵌合抗體(美國(guó)專利4,816,567),其中遠(yuǎn)小于完整的人可變結(jié)構(gòu)域的序列被來(lái)自于非人物種的相應(yīng)序列所替換。在實(shí)踐中，人源化抗體通常為人抗體，其中一些CDR殘基和可能部分FR殘基被來(lái)自于嚙齒動(dòng)物抗體的類似位點(diǎn)所替換。此外，重要的是人源化抗體保留更高的對(duì)抗原的親和性以及其它有利的生物屬性。為了實(shí)現(xiàn)該目標(biāo)，根據(jù)優(yōu)選的方法，人源化抗體可通過(guò)使用親代和人源化序列的三維模型對(duì)該親代序列和各種理論人源化產(chǎn)物的分析過(guò)程進(jìn)行制備。三維免疫球蛋白模型已可商購(gòu)獲得，并為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉。已有計(jì)算機(jī)程序能夠描繪和顯示選定的候選免疫球蛋白序列的可能三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)。對(duì)這些顯示的考察可允許對(duì)特定殘基在該候選免疫球蛋白序列的功能中的作用進(jìn)行分析，即，對(duì)影響該候選免疫球蛋白序列的能力的殘基的分析，即，對(duì)影響該候選免疫球蛋白結(jié)合其抗原的能力的殘基的分析。通過(guò)該方法，可選擇FR殘基并由接收序列和輸入序列組合，從而將所需的抗體特征最大化，例如提高的對(duì)靶抗原的親和性，盡管CDR殘基才直接和最實(shí)質(zhì)性地影響抗原結(jié)合。選擇用于制備人源化抗體的人(輕鏈和重鏈)可變結(jié)構(gòu)域?qū)τ跍p少抗原性非常重要。根據(jù)所謂的"最適合(best-fit)"方法，可對(duì)整個(gè)已知的人可變結(jié)構(gòu)域序列庫(kù)篩選非人抗體的可變結(jié)構(gòu)域的序列。然后，將最接近非人親代抗體序列的人序列選為人源化抗體的人FR(Sims等人，//附ww"o/151:2296(1993);Chothia等人，JMo/Ao/196:901(1987))。另一種方法采用了來(lái)自于特定輕鏈或重鏈亞組的所有人抗體的共有序列的特定框架。相同的框架可用于多個(gè)不同的人源化抗體(Carter等人，PracAto/^c"^SWC/5L489:4285(1992);Presta等人，151:2623(1993))。只要本發(fā)明的抗體顯示所需的生物特征(例如，所需的結(jié)合親和性)，該抗體可包含任意合適的人或人共有輕鏈或重鏈框架序列。在一些實(shí)施方案中，在該人和/或人共有非超變區(qū)序列中可存在一個(gè)或多個(gè)(例如2、3、4、5、6、7、8、9或更多個(gè))額外的修飾。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含了人輕鏈的框架序列的至少一部分(或全部)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含了人重鏈的框架序列的至少一部分(或全部)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含了人亞組I框架共有序列的至少一部分(或全部)。在部分實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含了人亞組III重鏈框架共有序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體的框架共有序列包含了在位置71、73和/或78上的替換。在這些抗體的部分實(shí)施方案中，位置71為A，73為T(mén)和/或78為A。完全的人抗體特別適用于治療人類患者。人抗體可通過(guò)本領(lǐng)域已知的多種方法制備，包括采用來(lái)自人免疫球蛋白序列的抗體庫(kù)進(jìn)行上述的噬菌體展示方法。還可參見(jiàn)美國(guó)專利4,444,887和4,716,111;以及PCT公開(kāi)WO98/46645、WO98/50433、WO98/24893、WO98/16654、WO96/34096、WO96/3373和WO91/10741;分別全文引入作為參考。Cole等人和Boemer等人的技術(shù)同樣可用于制備人單克隆抗體(Cole等人，MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,AlanR.Riss(1985);和Boemer等人，//w/w膨/147:86(1991))。人抗體還可采用不能表達(dá)功能性內(nèi)源免疫球蛋白，但能表達(dá)人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行制備。例如，人重鏈和輕鏈免疫球蛋白基因復(fù)合物可隨機(jī)導(dǎo)入或通過(guò)同源重組進(jìn)入小鼠胚胎干細(xì)胞?？商娲?，除人重鏈和輕鏈基因外，還可將人可變區(qū)、恒定區(qū)和多樣區(qū)導(dǎo)入鼠胚胎干細(xì)胞。通過(guò)同源重組導(dǎo)入的人免疫球蛋白基因座可單獨(dú)或同時(shí)使小鼠重鏈和輕鏈免疫球蛋白基因成為非功能性的。特別地，JH區(qū)的純合刪除防止了內(nèi)源抗體的產(chǎn)生。擴(kuò)增該修飾后的胚胎干細(xì)胞并將其微注射進(jìn)入嚢胚以生成嵌合小鼠。飼養(yǎng)該嵌合小鼠以生成表達(dá)人抗體的純合后代。例如參見(jiàn)，Jakobovitis等人，尸racAto/y4cad"&490:2551(1993);Jakobovitis等人，Atowe362:255(1993);Bmggermann等人，/w/附附wwo/7:33(1993);Duchosal等人,Atowe355:258(1992》。轉(zhuǎn)基因小鼠以選擇的抗原(例如，本發(fā)明的多肽的全部或部分)通過(guò)常規(guī)方式進(jìn)行免疫。針對(duì)該抗原的單克隆抗體可采用常規(guī)雜交瘤技術(shù)從免疫后的轉(zhuǎn)基因小鼠獲取。轉(zhuǎn)基因小鼠包含的人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因在B細(xì)胞分化時(shí)重排，隨后進(jìn)行類型轉(zhuǎn)換和體細(xì)胞突變。因此，通過(guò)該種技術(shù)可生產(chǎn)治療有效的IgG、IgA、IgM和IgE抗體。制備人抗體的該種技術(shù)的綜述可參見(jiàn)Lonberg等人，/"ZAev/www"o/13:65-93(1995)。對(duì)用于生產(chǎn)人抗體和人單克隆抗體的該種技術(shù)以及生產(chǎn)這些抗體的方案的具體討論可參見(jiàn)例如，PCT公開(kāi)WO98/24893;WO92/01047;WO96/34096;WO96/33735;歐洲專利號(hào)0598877;美國(guó)專利號(hào)5,413,923;5,625,126;5,633,425;5,569,825;5,661,016;5,545,806;5,814,318;5,885,793;5,916,771;以及5,939,598，其全文在此引入作為參考。此夕卜,可委托Abgenix,Inc.(Freemont，Calif.)、Genpharm(SanJose，Calif.)和Medarex，Inc.(Princeton，NJ.)等公司通過(guò)與上述類似的技術(shù)提供針對(duì)選定抗原的人抗體。此外，人mAb還可通過(guò)對(duì)移植了人外周血白細(xì)胞、脾細(xì)胞或骨髓(例如，XTL的三源雜交瘤技術(shù))的小鼠進(jìn)行免疫后進(jìn)行制備。識(shí)別選定表位的完全人抗體可通過(guò)稱為"定向選擇(guidedselection)"的技術(shù)進(jìn)行制備。在該方法中，采用選定的非人單克隆抗體(例如，小鼠抗體)引導(dǎo)識(shí)別相同表位的完全人抗體的選擇(Jespers等人，S/o/rec/^o/ogv12:899(1988))。此外，通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)可將針對(duì)本發(fā)明多肽的抗體隨后用于生成"模擬"本發(fā)明多肽的抗獨(dú)特型抗體(例如參見(jiàn)，Greenspan等人，F(xiàn)ASEBJ7:437(1989);Nissinoff，J/扁畫(huà)/147:2429(1991))。例如，結(jié)合和竟?fàn)幮砸种贫嚯亩嗑刍?或本發(fā)明多肽與配體結(jié)合的抗體可用于生成抗獨(dú)特型抗體，其"模擬，，多肽多聚化和/或結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并因此結(jié)合和中和多肽和/或其配體。這些中和性抗獨(dú)特型抗體或這些抗獨(dú)特型抗體的Fab片段可用于在治療方案中中和多肽配體。例如，這些抗獨(dú)特型抗體可被用于結(jié)合本發(fā)明多肽和/或結(jié)合其配體/受體，從而阻斷其生物活性。本發(fā)明的抗體可以是雙特異性抗體。雙特異性抗體為對(duì)至少兩種不同的抗原具有結(jié)合特異性的單克隆抗體，優(yōu)選人或人源化抗體。在本發(fā)明中，其中一種結(jié)合特異性可針對(duì)OX40，另一種可針對(duì)任意其它抗原，并優(yōu)選針對(duì)細(xì)胞表面蛋白、受體、受體亞基、組織特異性抗原、病毒衍生蛋白、病毒編碼的包膜蛋白、細(xì)菌衍生的蛋白、或細(xì)菌表面蛋白等。制備雙特異性抗體的方法已經(jīng)眾所周知。傳統(tǒng)上，雙特異性抗體的重組制備基于兩個(gè)免疫球蛋白重鏈/輕鏈對(duì)的共表達(dá)，其中兩條重鏈具有不同的特異性(Milstein等人，A^w;^305:537(1983))。由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機(jī)分配，這些雜交瘤(四源雜交瘤)生成了十種不同抗體分子的潛在混合物，其中僅有一種具有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。該正確分子的純化通?？赏ㄟ^(guò)親和層析步驟實(shí)現(xiàn)。類似的步驟披露于WO93/08829和Traunecker等人，五Afl(9/10:3655(1991)。具有所需結(jié)合特異性的抗體可變結(jié)構(gòu)域(抗體-抗原結(jié)合位點(diǎn))可融合至免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域序列。優(yōu)選與免疫球蛋白重鏈恒定結(jié)構(gòu)域(包含了至少部分鉸鏈、CH2和CH3區(qū))進(jìn)行所述融合。它可具有至少一個(gè)融合中存在的輕鏈結(jié)合所必需的第一重鏈恒定區(qū)(CH1)。編碼該免疫球蛋白重鏈融合物和(如果需要)該免疫球蛋白輕鏈的DNA被插入單獨(dú)的表達(dá)載體，并共轉(zhuǎn)化進(jìn)入合適的宿主有機(jī)體。有關(guān)生成雙特異性抗體的進(jìn)一步細(xì)節(jié)可參見(jiàn)，例如Suresh等人，她A五"z戸121:210(1986)。本發(fā)明還涵蓋了異源偶聯(lián)(heteroconjugate)抗體。異源偶聯(lián)抗體由兩個(gè)共價(jià)結(jié)合的抗體構(gòu)成。該種抗體曾經(jīng)被提出用于，例如，將免疫系統(tǒng)細(xì)胞靶向不想要的細(xì)胞(美國(guó)專利4,676,980)。據(jù)預(yù)期，該抗體可通過(guò)合成蛋白化學(xué)中已知的方法(包括涉及交聯(lián)劑的方法)體外制備得到。例如，可通過(guò)二疏鍵交換反應(yīng)或通過(guò)形成硫酯鍵構(gòu)建免疫毒素。用于該目的的合適的試劑的例子包括亞胺石克醇鹽和甲基-4-辟l醇酪酸亞氨酸酯(methyl-4-mercaptobutyrimidate)以及披露于例如美國(guó)專利4,676,980的試劑。此外，可生成針對(duì)OX40的單結(jié)構(gòu)域抗體。這種技術(shù)的例子描述于W09425591(描述了來(lái)自于駱駝科重鏈Ig的抗體)以及US20030130496(描述了單結(jié)構(gòu)域完全人抗體從噬菌體庫(kù)的分離)。還可生成單肽鏈結(jié)合分子，其中重鏈和輕鏈Fv區(qū)連接。單鏈抗體("scFv")及其構(gòu)建方法描述于美囯專利號(hào)4,946,778?？商娲?，F(xiàn)ab可通過(guò)類似的手段構(gòu)建和表達(dá)。完全人抗體和部分人抗體的免疫原性全部均小于完全鼠mAb，且片段和單鏈抗體同樣具有較低的免疫原性。抗體或抗體片段可從以McCafferty等人，Atow^348:552(1990)所述的技術(shù)生成的抗體噬菌體庫(kù)中分離得到。Clarkson等人，7Va/wre352:624(1991)和Marks等人，《/Wo/5/o/222:581(1991)分別描述了通過(guò)噬菌體庫(kù)分離鼠和人抗體。后續(xù)的出版文獻(xiàn)描述了通過(guò)鏈改組進(jìn)行的高親和性(nM范圍)人抗體的制備(Marks等人，10:779(1992)),以及作為構(gòu)建極大型噬菌體庫(kù)的策略的組合感染和體內(nèi)重組(Waterhouse等人，2VwcJc/AWes21:2265(1993))。因此，這些技術(shù)可作為傳統(tǒng)的分離單克隆抗體的單克隆抗體雜交瘤技術(shù)的可行替代。該DNA還可通過(guò)，例如，以人重-鏈和輕-鏈恒定結(jié)構(gòu)域的編碼序列替換同源鼠序列進(jìn)行修飾(美國(guó)專利4,816,567;Morrison等人，/VocWa/Jcac/,81:6851(1984》。另一種替代方法使用電融合而非化學(xué)融合來(lái)形成雜交瘤。該技術(shù)已經(jīng)非常完善。除了融合外，還可使用，例如，EpsteinBarr病毒或轉(zhuǎn)化基因轉(zhuǎn)化B細(xì)月包以斗吏其7Jc生。例詿口參見(jiàn)，"ContinuouslyProliferating人CellLinesSynthesizingAntibodyofPredeterminedSpecificity,"Zurawaki等人，收錄于由Kennett等人所編的MonoclonalAntibodies中，PlenumPress,第19-33頁(yè)(1980))?？?OX40mAb可通過(guò)具有由真核或原核系統(tǒng)表達(dá)的OX40蛋白、融合蛋白或其片段免疫嚙齒類動(dòng)物(例如，小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠和豚鼠)來(lái)形成。其它的動(dòng)物也可被用于進(jìn)行免疫，例如，非人靈長(zhǎng)動(dòng)物、表達(dá)免疫球蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠、以及移植了人B淋巴細(xì)胞的嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷型(SCID)小鼠。如更早的描述(Kohler等人，Atowre256:495(1975))，雜交瘤可通過(guò)常規(guī)步驟將自經(jīng)免疫的動(dòng)物的B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞(例如，Sp2/0和NSO)融合來(lái)生成。此外，抗-OX40抗體可通過(guò)對(duì)來(lái)自于噬菌體展示系統(tǒng)中的人B淋巴細(xì)胞的重組單鏈Fv或Fab庫(kù)的篩選得到。mAb對(duì)OX40的特異性可通過(guò)ELISA、Western免疫印跡或其它免疫化學(xué)技術(shù)測(cè)試?？贵w對(duì)CD4+T細(xì)胞激活的抑制活性可通過(guò)增殖、細(xì)胞因子釋放和凋亡測(cè)定進(jìn)行評(píng)估。陽(yáng)性孔中的雜交瘤可通過(guò)有限稀釋進(jìn)行克隆。對(duì)抗體進(jìn)行純化以通過(guò)上述測(cè)定來(lái)表征其對(duì)人OX40的特異性。5.4拮抗劑抗-OX40抗體的鑒定本發(fā)明提供了抑制和中和OX40的作用的拮抗劑單克隆抗體。特別地，本發(fā)明的抗體結(jié)合OX40并抑制OX40的活化。本發(fā)明的抗體包括命名為A10和B66的抗體，并披露了這些鼠抗體的人源化抗體。本發(fā)明還包括了與這些抗體之一結(jié)合相同表位(例如單克隆抗體A10(TH)hu336F的表位)的抗體。候選抗-OX40抗體可通過(guò)如下方法篩選(l)熒光微體積測(cè)定技術(shù)(FMAT)(AppliedBiosystem,CA),(2)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA),以及(3)流式細(xì)胞計(jì)數(shù)免疫測(cè)定。用于表征所選的抗體的測(cè)定包括(1)Hut-78測(cè)定；(2)初始CD4+T-細(xì)胞測(cè)定；(3)TH1、TH2和TH17條件；(4)TCR-活化的初始CD4+T-細(xì)胞方案；(5)凋亡測(cè)定，以及(6)交叉反應(yīng)性測(cè)試。實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)描述于實(shí)施例中。本發(fā)明的抗體包括但不限于，多克隆抗體、單克隆抗體、單價(jià)抗體、雙特異性抗體、異源偶聯(lián)抗體、多特異性抗體、人抗體、人源化抗體或嵌合抗體、單鏈抗體、單結(jié)構(gòu)域抗體、Fab片段、F(ab')片段、由Fab表達(dá)庫(kù)生成的片段、抗獨(dú)特型(抗-Id)抗體(包括例如針對(duì)本發(fā)明抗體的抗-Id抗體)、以及任意上述抗體的表位-結(jié)合片段。本發(fā)明的免疫球蛋白分子可以是任何型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、類(例如，IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2)或任何亞類的免疫球蛋白分子。該抗體可以是本發(fā)明的抗原-結(jié)合抗體片段，并包括但不限于，F(xiàn)ab、Fab'和F(ab')2、Fd、單鏈Fv(scFv)、單鏈抗體、二硫鍵連接的Fv(sdFv)以及包含VL或VH結(jié)構(gòu)域的單結(jié)構(gòu)域抗體。包括單鏈抗體在內(nèi)的抗原-結(jié)合抗體片段可以僅單獨(dú)包含可變區(qū)，或是同時(shí)包含4吏鏈區(qū)、CH1、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域的全部或部分。本發(fā)明還包括了包含可變區(qū)與鉸鏈區(qū)、CH1、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域的任意組合的抗原結(jié)合片段。本發(fā)明的抗體可來(lái)自任意的動(dòng)物來(lái)源，包括鳥(niǎo)類和哺乳動(dòng)物。優(yōu)選地，抗體來(lái)自于人、非人靈長(zhǎng)動(dòng)物、嚙齒動(dòng)物(例如，小鼠和大鼠)、驢、綿羊、兔、山羊、豚鼠、駱駝、馬或雞。本發(fā)明的抗體可具有單特異性、雙特異性、三特異性或更大的多特異性。多特異性抗體可對(duì)OX40的不同表位具有特異性，或可能對(duì)OX40和異源表位(如異源多肽或固相支持材料)具有特異性。例如參見(jiàn)，PCT公開(kāi)WO93/17715;WO92/08802;WO91/00360;WO92/05793;Tutt等人，J/附ww"o/147:60(1991);美國(guó)專利4,474,893;4,714,681;4,925,648;5,573,920;5,601,819;Kostelny等人，J/ww朋o/148:1547(1992)。本發(fā)明的抗體可通過(guò)它們識(shí)別或特異性結(jié)合的OX40的表位或部分進(jìn)行描述或"^兌明。該表位或多肽部分可通過(guò)本文所述的內(nèi)容進(jìn)行i^明，例如，通過(guò)N-末端和C-末端的位置、連續(xù)氨基酸殘基的大小，或列舉于表和圖中。本發(fā)明的抗體還可通過(guò)它們的交叉反應(yīng)性進(jìn)行描述和說(shuō)明?？山Y(jié)合與OX40具有至少95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少65%、至少60%、至少55%、至少50%—致性(采用本領(lǐng)域已知的并在本文描述的方法計(jì)算)的OX40多肽的抗體同樣包括在本發(fā)明內(nèi)?？?OX40抗體還可以以小于約10々M、小于約10'64、小于約10—5M的Kd結(jié)合其它蛋白，例如來(lái)自于該抗-OX40抗體所針對(duì)的物種以外的物種的抗-OX40抗體。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體可與人OX40的其它哺乳動(dòng)物同源物及其相應(yīng)的表位交叉反應(yīng)。在具4本實(shí)施方案中，上述交叉反應(yīng)針對(duì)本文所述的任意單特異性抗原性或免疫原性多肽，或本文所述的特異性抗原性和/或免疫原性多肽的組合。50本發(fā)明還包括了結(jié)合多肽的抗體，所述多肽由在嚴(yán)格雜交條件下與編碼OX40的多聚核苷酸雜交的多聚核苷酸編碼。本發(fā)明的抗體還可通過(guò)其與本發(fā)明的多肽的結(jié)合親和性進(jìn)行描述或說(shuō)明。優(yōu)選的結(jié)合親和性包括平衡解離常數(shù)或Ko為10-8至10"5m、10-8至10"2m、10-8至10-1qm或10-1()至10-12m的結(jié)合親和性。本發(fā)明還提供了下述抗體，通過(guò)本領(lǐng)域已知的測(cè)定竟?fàn)幮越Y(jié)合的任何方法(例如，本文所述的免疫測(cè)定)測(cè)定，該抗體竟?fàn)幮砸种瓶贵w與本發(fā)明的表位結(jié)合。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該抗體竟?fàn)幮砸种浦辽?5%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少60%或至少50%的與該表位的結(jié)合。5.5載體和宿主細(xì)胞另一方面，本發(fā)明提供了編碼本文所述抗體的分離的核酸序列、包含編碼本發(fā)明抗體的核苷酸序列的載體構(gòu)建體、包含該種載體的宿主細(xì)胞，以及制備該抗體的重組技術(shù)。為了重組制備抗體，編碼該抗體的核酸被分離并插入可復(fù)制栽體，以進(jìn)行進(jìn)一步克隆(dna的擴(kuò)增)或表達(dá)。編碼該抗體的dna可采用常規(guī)方法簡(jiǎn)單分離和測(cè)序(例如，可采用能夠特異性結(jié)合編碼該抗體重鏈和輕鏈基因的寡核苷酸探針)?？寺『娃D(zhuǎn)化的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可用于制備表達(dá)本發(fā)明抗體的細(xì)胞系。5.5.1載體有多種載體可供使用。栽體的組分通常包括但不限于如下成分中的一種或多種信號(hào)序列、復(fù)制起始點(diǎn)、一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記基因、增強(qiáng)子元件、啟動(dòng)子以及轉(zhuǎn)錄終止序列?？赏ㄟ^(guò)公知技術(shù)制備包含了編碼本發(fā)明抗體的核苷酸序列的重組表達(dá)載體。表達(dá)載體可包含與合適的轉(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)節(jié)核苷酸序列(例如來(lái)自于哺乳動(dòng)物、微生物、病毒或昆蟲(chóng)基因的序列)可操作地連接的核苷酸序列。調(diào)節(jié)序列的例子包括轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、操縱子、增強(qiáng)子、mRNA核糖體結(jié)合位點(diǎn)、和/或控制轉(zhuǎn)錄和翻譯的啟動(dòng)和終止的其它合適序列。當(dāng)調(diào)節(jié)序列與合適多肽的核苷酸序列功能性相關(guān)時(shí)，該核苷酸序列被"可操作地連接"。因此，如果啟動(dòng)子序列控制合適的核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄，則該啟動(dòng)子核苷酸序列被可操作地連接至例如抗體重鏈序列。用于表達(dá)本發(fā)明的抗體的有用表達(dá)載體的例子可參見(jiàn)申請(qǐng)WO04/070011，其內(nèi)容在此S1入作為參考。此外，編碼與抗體重鏈和/或輕鏈序列并非天然相關(guān)聯(lián)的合適的信號(hào)肽的序列可被引入表達(dá)載體。例如，信號(hào)肽(分泌型前導(dǎo)肽)的核苷酸序列可被同框融合至多肽序列，由此抗體被分泌進(jìn)入周質(zhì)空間或進(jìn)入培養(yǎng)基。能在目標(biāo)宿主細(xì)胞中發(fā)揮作用的信號(hào)肽可增強(qiáng)合適抗體的胞外分泌。信號(hào)肽可在抗體從細(xì)胞分泌后從該多肽裂解。這些分泌型信號(hào)的例子是本領(lǐng)域公知的，并包括例如描述于美國(guó)專利號(hào)5,698,435、5,698,417和6,204,023的那些分泌型信號(hào)。5.5.2宿主細(xì)胞可用于本發(fā)明的宿主細(xì)胞為原核細(xì)胞、酵母或更高級(jí)的真核細(xì)胞，并包括但不限于微生物，例如用包含了抗體編碼序列的重組噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA或粘粒DNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌(例如，大腸桿菌、枯草芽孢桿菌)；用包含抗體編碼序列的重組酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的酵母(例如，畢赤酵母)；用包含抗體編碼序列的重組病毒表達(dá)載體(例如桿狀病毒)感染的昆蟲(chóng)細(xì)胞系統(tǒng)；用包含抗體編碼序列的重組病毒表達(dá)載體(例如，花椰菜花葉病毒，CaMV;煙草花葉病毒，TMV)感染的或用含抗體編碼序列的重組質(zhì)粒表達(dá)載體(例如，Ti質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞系統(tǒng)；或包含了帶有來(lái)自哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組的啟動(dòng)子(例如，金屬疏蛋白啟動(dòng)子)或來(lái)自哺乳動(dòng)物病毒的啟動(dòng)子(例如，腺病毒晚期啟動(dòng)子；牛痘病毒7.5k啟動(dòng)子)的重組表達(dá)構(gòu)建體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)(例如，COS、CHO、BHK、293和3T3細(xì)胞)。物，例如大腸桿菌(五.co//)、枯草芽孢桿菌做to'/的、腸桿菌Aacte。、歐文氏菌(五nWw'a)、克雷伯桿菌(A7&wWto)、變形桿菌CPratew力、鼠傷寒沙門(mén)氏菌(S"/mo恥/A2)、沙雷氏菌、志賀氏菌(57z/ge//)以及桿狀菌、假單胞菌和鏈霉菌。一種優(yōu)選的大腸桿菌克隆宿主為E.coli294(ATCC31,446)，盡管其它的菌抹如E.coliB、E.coliX1776(ATCC31,537)和E.coliW3110(ATCC27,325)同樣適用。這些例子僅用于闡述，并非限制。用于原核宿主細(xì)胞中的表達(dá)載體通常包含了一種或多種表型選擇性標(biāo)記基因。表型選擇性標(biāo)記基因?yàn)?，例如，編碼提供抗生素抗性或提供自養(yǎng)需求的蛋白質(zhì)的基因?？捎糜谠怂拗骷?xì)胞的表達(dá)載體的例子包括由市售質(zhì)粒如pKK223-3(PharmaciaFineChemicals,Uppsala,Sweden)、pGEMl(PromegaBiotec，Madison,Wisconsin.,USA)以及pET(Novagen,Madison,Wisconsin,USA)和pRSET(InvitrogenCorporation,Carlsbad,California,USA)系列載體(Studier,/她/腸/219:37(1991);Schoepfer,Gene124:83(1993))衍生的載體。常用于重組原核宿主細(xì)胞表達(dá)載體的啟動(dòng)子序列包括T7(Rosenberg等人，Gene56:125(1987))、P-內(nèi)酰胺酶(青霉素酶)、乳糖啟動(dòng)子系統(tǒng)(Chang等人，iVa^re275:615(1978);Goeddel等人，Atowre281:544(1979))、色氨酸(trp)啟動(dòng)子系統(tǒng)(Goeddel等人，NuclAcidsRes8:4057(1980))以及tac啟動(dòng)子(Sambrook等人,MolecularCloning,ALaboratoryManual,第二版，ColdSpringHarborLaboratory(1990))?？捎糜诒景l(fā)明的酵母或絲狀真菌包括來(lái)自酵母菌屬(&cc/wfram;;c")、畢赤酵母屬(尸ic/2ia)、》l線菌屬04c"womycefes)、克魯維酵母屬(A7wyvercwy;ces)、人4本酵母菌屬(ScA/zoracc/^ramyces)、{艮絲酵母屬(Ca"6feia)、木霉菌屬(7Wc/ofifenwa)、鏈孢霉屬(A^wnw;ora)的酵母，以及絲狀真菌如鏈孢霉屬(iVewros/oraf)、青霉菌屬(Pem'c/〃/w附)、彎頸霉屬(Tb/j^oc/^Z/ww)禾口曲霉屬(^^wgz7/w力。酵母載體通常包含來(lái)自于酵母質(zhì)粒的復(fù)制序列起始點(diǎn)，自主復(fù)制序列(ARS)、啟動(dòng)子區(qū)、聚腺苷酸化序列、轉(zhuǎn)錄終止序列以及選擇性標(biāo)記基因。用于酵母載體的合適的啟動(dòng)子包括但不限于，金屬疏蛋白、3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman等人，J歷o/C/zew255:2073(1980))或其它糖分解酶(Holland等人，5/oc/2em17:4900(1978))的啟動(dòng)子，其它糖分解酶例如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脫氮酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶、3-磷酸甘油酸變旋酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、磷酸葡糖異構(gòu)酶以及葡糖激酶。其它可用于酵母表達(dá)的合適栽體和啟動(dòng)子進(jìn)一步描述于Fleer等人，107:285(1991)中。用于酵母和酵母轉(zhuǎn)化方案的其它合適啟動(dòng)子和載體已為本領(lǐng)域公知。酵母轉(zhuǎn)化方案為本領(lǐng)域公知。一種這樣的方案描述于Hi皿en等人，尸rocAto/」cw/5W75:1929(1978)。Hinnen方案在選擇性培養(yǎng)基中選擇Trp+轉(zhuǎn)化體。哺乳動(dòng)物或昆蟲(chóng)宿主細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)也可被用于表達(dá)重組抗體。原則上，可使用任意更高級(jí)的真核細(xì)胞培養(yǎng)，而不管其為脊推動(dòng)物或無(wú)脊推動(dòng)物培養(yǎng)。無(wú)脊推動(dòng)物細(xì)胞的例子包括植物和昆蟲(chóng)細(xì)胞(Luckow等人，歷o/rec/2"o/ogy6:47(1988);Miller等人，五wg/"簡(jiǎn)"g，Setlow等人編，第8巻，第277-9頁(yè),PlenamPublishing(1986);Mseda等人，胸,315:592(1985))。例如，桿狀病毒系統(tǒng)可被用于生產(chǎn)異源蛋白。在昆蟲(chóng)系統(tǒng)中，可使用苜蓿尺蠖G4wtogra//Mfca/z/orm'ca)核多角體病毒(AcNPV)作為載體以表達(dá)外源基因。該病毒生長(zhǎng)在草地夜蛾(S/ocfcptera/wg^erafa)細(xì)胞中。該抗體編碼序列可被單獨(dú)克隆到該病毒的非必需區(qū)(例如多角體蛋白基因)中并位于AcNPV啟動(dòng)子(例如該多角體蛋白啟動(dòng)子)的控制下。其它已被鑒定的宿主包括伊蚊屬C4efife力、黑腹果繩(ZVosop/n7awe/"wogcwfer)和家蚤CSo附ty:cwon')。各種用于轉(zhuǎn)染的病毒菌林可以公開(kāi)獲得，例如，AcNPV的L-l變體和家蠶NPV的Bm-5抹，且這些病毒可根據(jù)本發(fā)明被用作本文所述的病毒，特別是用于草地夜蛾細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。此外，棉花、玉米、土豆、大豆、牽?；?、西紅柿和煙草等植物細(xì)胞培養(yǎng)物也可被用作宿主。參見(jiàn)TissueCulture,Kruse等人編，AcademicPress(1973)。有用的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系的例子是猴腎細(xì)胞系；人胚胎腎細(xì)胞系；幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞；中國(guó)倉(cāng)鼠卯巢細(xì)胞ADHFR(CHO,Urlaub等人，iVocAto/Jcad77:4216(1980));小鼠Sertoli細(xì)胞；人宮頸癌細(xì)胞(HELA);犬腎細(xì)胞；人肺細(xì)胞；人肝細(xì)胞；小鼠乳房肺瘤以及NSO細(xì)胞。為制備抗體，用上述載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并將所述細(xì)胞培養(yǎng)在常規(guī)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基經(jīng)改良后適于誘導(dǎo)啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列；選擇轉(zhuǎn)化體；或擴(kuò)增編碼所需序列的基因。常用的啟動(dòng)子序列和增強(qiáng)子序列來(lái)自于多瘤病毒、腺病毒2、猿病毒40(SV40)和人細(xì)胞巨化病毒(CMV)。來(lái)自于SV40病毒基因組的DNA序列可用于為結(jié)構(gòu)基因序列在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中的表達(dá)l是供其它的遺傳元件，例如，SV40起始區(qū)、早期和晚期啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、剪接以及聚腺苷酸化位點(diǎn)。病毒早期和晚期啟動(dòng)子特別有用，因?yàn)樗鼈兌家子谧鳛槠螐牟《净蚪M中獲得，所述片段還可包含病毒復(fù)制起始點(diǎn)。用于制備本發(fā)明的抗體的宿主細(xì)胞可在各種培養(yǎng)基中培養(yǎng)。市售的培養(yǎng)基，如Ham'sF10(Sigma)、最低必須培養(yǎng)基(MEM，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM，Sigma),適合培養(yǎng)宿主細(xì)胞。此外，在Ham等人，A/eA五"2yw0/58:44(1979);Barnes等人，Jw"/102:255(1980);和美國(guó)專利4,767,704、4,657,866、4,560,655、5,122,469、5,712,163或6,048,728中所述的任意培養(yǎng)基可用作宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基。任意這些培養(yǎng)基可根據(jù)需要添加激素和/或其它生長(zhǎng)因子(例如胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白或者表皮生長(zhǎng)因子)、鹽類(例如氯化-X,其中X為鈉、鈣、鎂和磷)、緩沖液(例如HEPES)、核苷酸(例如腺苷酸和胸苷)、抗生素(例如GENTAMYCINTM藥物)、痕量元素(定義為通常以微摩爾范圍的最終濃度存在的無(wú)機(jī)化合物)、以及葡萄糖或等量的能源。也可以以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的合適濃度包含任何其它必要的添加劑。培養(yǎng)的條件(例如溫度、pH等)為之前選擇用于表達(dá)的宿主細(xì)胞所用的條件，該條件對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。5.6編碼抗體的多聚核脊酸本發(fā)明進(jìn)一步提供了包含編碼本發(fā)明抗體及其片段的核苷酸序列的多聚核苷酸或核酸，例如DNA。示例性的多聚核苷酸包括編碼抗體鏈的多聚核苷酸，所述抗體鏈包含一個(gè)或多個(gè)本文所述的氨基酸序列。本發(fā)明還包括了在嚴(yán)格或較低嚴(yán)格雜交條件下與編碼本發(fā)明的抗體的多聚核苷酸雜交的多聚核苷酸。該多聚核苷酸可通過(guò)任何本領(lǐng)域已知的方法獲得，且該多聚核苷酸的核普酸序列可通過(guò)任何本領(lǐng)域已知的方法測(cè)定。例如，如果已知該抗^本的核苷酸序列，編碼該抗體的多聚核苷酸可通過(guò)化學(xué)合成的寡聚核苷酸進(jìn)行裝配(例如，如Kutmeier等人，所o/Tec/2m'，w17:242(1994)所述)，其主要包括包含編碼該抗體的部分序列的重疊寡聚核苷酸的合成，這些寡聚核苷酸的退火和連接，以及通過(guò)PCR對(duì)連接的寡聚核普酸進(jìn)行擴(kuò)增?？商娲?，編碼抗體的多聚核苷酸可由適當(dāng)來(lái)源的核酸生成。如果沒(méi)有包含編碼特定抗體的核酸的克隆，但已知抗體分子的序列，編碼該免疫球蛋白的核酸可通過(guò)化學(xué)合成，或采用可與序列的3'和5'端雜交的合成引物通過(guò)PCR擴(kuò)增從適當(dāng)來(lái)源(例如，抗體cDNA庫(kù)，或從任何表達(dá)該抗體的組織或細(xì)胞(例如經(jīng)選定用于表達(dá)本發(fā)明的抗體的雜交瘤細(xì)胞)產(chǎn)生的cDNA庫(kù)或分離得到的核酸，優(yōu)選polyA+RNA)獲取，或通過(guò)使用對(duì)特定基因序列具有特異性的寡聚核苷酸探針識(shí)別例如來(lái)自編碼該抗體的cDNA庫(kù)的cDNA從而進(jìn)行克隆。然后可用本領(lǐng)域公知的任何技術(shù)將PCR生成的擴(kuò)增核酸克隆進(jìn)可復(fù)制的克隆載體。當(dāng)核苷酸序列和抗體的相應(yīng)氨基酸被確定后，可采用本領(lǐng)域公知的處理核苷酸序列的方法(如重組DNA技術(shù)、定點(diǎn)突變、PCR等(例如，參見(jiàn)Sambrook等人,Mo/ecw/arC7簡(jiǎn)'"g,爿丄a6orato7Ma聽(tīng)a/,第二版,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.(1990)以及Ausubel等人編，Cw廳eW尸ratoco/s/"7Wo/ecw/"rJohnWiley&Sons,NY(1998)所述的技術(shù)，其全文在此引用作為參考))對(duì)該抗體的核普酸序列進(jìn)行操作，以生成具有不同氨基酸序列的抗體，例如形成氨基酸替換、刪除、和/或插入。57在具體實(shí)施方案中，重鏈和/或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列可通過(guò)公知的方法檢查以確定CDR的序列，例如，可通過(guò)與其它重鏈和輕鏈可變區(qū)的已知氨基酸序列進(jìn)行比較，以確定高可變序列區(qū)。可采用常規(guī)重組DNA技術(shù)將一個(gè)或多個(gè)CDR插入框架區(qū)，例如，插入人框架區(qū)以將非人類抗體人源化，如前所述。該框架區(qū)可以是天然存在的或共有框架區(qū)，并優(yōu)選人框架區(qū)(例如，人框架區(qū)的列表可參見(jiàn)Chothia等人，《/Wo/所o/278:457(1998))。優(yōu)選地，由該框架區(qū)和CDR的組合生成的多聚核苷酸編碼能與本發(fā)明的多肽特異性結(jié)合的抗體。優(yōu)選地，如前所述，在框架區(qū)內(nèi)可進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)氨基酸替換，且優(yōu)選地，該氨基酸替換能夠提高抗體與其抗原的結(jié)合。此外，該類方法可用于對(duì)參與鏈間二疏鍵的一個(gè)或多個(gè)可變區(qū)半胱氨酸殘基進(jìn)行氨基酸替換或刪除，從而生成缺失一個(gè)或多個(gè)鏈間二硫鍵的抗體分子。其它對(duì)多聚核苷酸的改變?cè)诒景l(fā)明和本領(lǐng)域的現(xiàn)有技術(shù)范圍內(nèi)。此外，可采用通過(guò)拼接來(lái)自具有適當(dāng)抗原特異性的小鼠抗體分子基因和來(lái)自具有適當(dāng)生物活性的人抗體分子基因生產(chǎn)"嵌合抗體"的技術(shù)(Morrison等人，Ato/,爿cad81:851851(1984);Neuberger等人，312:604-608(1984);Takeda等人,Ato"re314:452-454(1985))。如前所述，嵌合抗體是其中抗體的不同部分來(lái)自不同動(dòng)物種類的分子，例如包含了來(lái)自鼠mAb的可變區(qū)和人免疫球蛋白恒定區(qū)的抗體，如人源化抗體?？商娲兀幻枋鲇糜谏a(chǎn)單克隆抗體的技術(shù)(美國(guó)專利4,946,778;Bird,Sc/e"ce242:423(1988);Huston等人，A^/^c^/Sc/85:5879(1988);以及Ward等人，Atow^334:544(1989))可也被調(diào)整用于生產(chǎn)單鏈抗體?？赏ㄟ^(guò)氨基酸橋連接Fv區(qū)的重鏈和輕鏈片段生成單鏈多肽來(lái)形成單鏈抗體。也可采用在大腸桿菌內(nèi)組裝功能性Fv片段的技術(shù)(Skerra等人，&Ze"ce242:1038(1988))。5.7制備抗-OX40抗體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明的抗體可通過(guò)任何本領(lǐng)域已知的用于抗體合成的方法制備，特別地，可通過(guò)化學(xué)合成制備，或者優(yōu)選地，通過(guò)重組表達(dá)技術(shù)制備。本發(fā)明的抗體或其片段、衍生物或類似物(例如，本發(fā)明抗體的重鏈或輕鏈或本發(fā)明的單鏈抗體)的重組表達(dá)需要構(gòu)建表達(dá)載體，該表達(dá)載體包含編碼該抗體或該抗體的片段的多聚核苷酸。一旦得到編碼抗體分子的多聚核苷酸，可通過(guò)重組DNA技術(shù)制備用于生成該抗體的載體。構(gòu)建的表達(dá)載體包含抗體編碼序列以及合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制信號(hào)。這些方法包括，例如體外重組DNA技術(shù)、合成技術(shù)、以及體內(nèi)遺傳重組。將表達(dá)載體通過(guò)常規(guī)技術(shù)轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，然后以常規(guī)技術(shù)培養(yǎng)該轉(zhuǎn)染細(xì)胞以制備本發(fā)明的抗體。在本發(fā)明的一個(gè)方面，如下文詳述，同時(shí)編碼重鏈和輕鏈的載體可在宿主細(xì)胞中共表達(dá)以表達(dá)完整免疫球蛋白分子。如上所述，各種宿主表達(dá)載體系統(tǒng)可被用于表達(dá)本發(fā)明的抗體分子。這些宿主表達(dá)系統(tǒng)代表了可制備和后續(xù)純化目標(biāo)編碼序列的運(yùn)載體，還代表了在以適當(dāng)核苷酸編碼序列進(jìn)行轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染后原位表達(dá)本發(fā)明抗體分子的細(xì)胞。細(xì)菌細(xì)胞如大腸桿菌以及真核細(xì)胞常用于重組抗體分子的表達(dá)，特別是用于完全重組抗體分子的表達(dá)。例如，結(jié)合來(lái)自人細(xì)胞巨化病毒的中間早期基因啟動(dòng)子元件等載體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞如CHO是一種有效的抗體表達(dá)系統(tǒng)(Foecking等人，45:101(1986);Cockett等人,5/o/rec/"o/c^y8:2(19卯))。此外，還可選擇以所希望的特定形式調(diào)節(jié)插入序列的表達(dá)，或修飾和處理基因產(chǎn)物的宿主細(xì)胞抹。對(duì)蛋白產(chǎn)物的這些修飾(例如，糖基化)和處理(例如，裂解)可對(duì)該蛋白的功能非常重要。不同的宿主細(xì)胞對(duì)蛋白和基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)譯后處理和修飾有不同的特性和特定的機(jī)制?？蛇x擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞系或宿主系統(tǒng)以確保表達(dá)的外源蛋白的正確修飾和處理。為此，可使用具有正確處理基因產(chǎn)物的初級(jí)轉(zhuǎn)錄、糖基化和磷酸化的細(xì)胞機(jī)制的真核宿主細(xì)胞。該種哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞包括，但不限于CHO、COS、293、3T3或骨髓瘤細(xì)胞。為了重組蛋白的長(zhǎng)期高產(chǎn)量生成，穩(wěn)定表達(dá)是優(yōu)選的。例如，可通過(guò)工程改造得到穩(wěn)定表達(dá)抗體分子的細(xì)胞系。宿主細(xì)胞可通過(guò)由適當(dāng)表達(dá)控制元件(例如，啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、序列、轉(zhuǎn)錄終止子、聚腺苷酸化位點(diǎn)等)和選擇性標(biāo)記控制的DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)化，而非使用包含病毒復(fù)制起始點(diǎn)的表達(dá)載體。在引入外源DNA后，允許工程改造后的細(xì)胞在富集培養(yǎng)基中生長(zhǎng)1-2天，然后轉(zhuǎn)質(zhì)粒穩(wěn)定整合進(jìn)入其染色體，并生長(zhǎng)形成灶(foci),所述灶隨后被克隆并擴(kuò)展程改造細(xì)胞系對(duì)篩選和評(píng)估直接或間接與抗體分子相互作用的化合物特別有用。多種選擇系統(tǒng)可供使用，包括但不限于可分別應(yīng)用于tk-、hgprt-或aprt-細(xì)胞的單純皰珍病毒胸苷激酶(Wigler等人，Ce〃11:223(1977))、次黃嘌呤-鳥(niǎo)噤呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Szybalska等人，尸roc.Ato/.^c"d5W.WSL448:202(1992))、以及腺噤呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Lowy等人，Ce〃22:817-17(1980))基因。同樣，抗代謝物抗性可用作選擇下列基因的基礎(chǔ)產(chǎn)生對(duì)氨甲喋呤的抗性的dhfr(Wigler等人，iVocAto"cat/Sc/77:357(1980);O'Hare等人，尸racAto/^c^/S"'園78:1527(1981));產(chǎn)生對(duì)麥考酚酸的抗性的gpt(Mulligan等人，/VociVw/Am/78:2072(1981));產(chǎn)生對(duì)氨基糖苷G-418的抗性的neo(Wu等人，5io/zera/^3:87(1991));以及產(chǎn)生對(duì)潮霉素的抗性的hygro(Santerre等人，30:147(1984))?？蓪⒅亟MDNA
技術(shù)領(lǐng)域：
中公知的方法常規(guī)用于選擇所需的重組克隆，且這些方法描述于，例如，Ausubel等人編，CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons(1993);Kriegler，GeneTransferandExpression,ALaboratoryManual，StocktonPress(1990);以及在Dracopoli等人編，CurrentProtocolsinhumanGenetics，JohnWiley&Sons(1994)的第12和13章；Colberre-Garapin等人，J楊/倫/150:1(1981),分別在此全文引入作為參考?？贵w分子的表達(dá)水平可通過(guò)載體擴(kuò)增得到提高(其綜述參見(jiàn)Bebbington等人，"Theuseofvectorsbasedongeneamplificationfortheexpressionofclonedgenesinmammaliancells,"DNACloning,第3巻,AcademicPress(1987))。當(dāng)表達(dá)抗體的載體系統(tǒng)中的標(biāo)記物可擴(kuò)增時(shí)，宿主細(xì)胞培養(yǎng)中抑制劑水平的提升可提高標(biāo)記物基因拷貝數(shù)。由于擴(kuò)增區(qū)與抗體基因關(guān)聯(lián)，因而抗體的產(chǎn)量也會(huì)得到提高(Crouse等人，MolCellBiol3:257(1983))。宿主細(xì)胞可被兩個(gè)本發(fā)明的表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染，第一載體編碼重鏈衍生的多肽，第二載體編碼輕鏈衍生的多肽。這兩種載體可包含相同的可選擇標(biāo)記物，其能使重鏈和輕鏈多肽同等表達(dá)。可替代地，可使用單個(gè)載體，該載體同時(shí)編碼并能夠表達(dá)重鏈和輕鏈多肽。在該種情況下，輕鏈應(yīng)被放置在重鏈之前以防止過(guò)量的有毒游離重鏈(Proudfoot,淑匿322:52(1986);Kohler，/VociVW/Jcat/5W77:2197(1980))。重鏈和輕鏈的編碼序列可包含cDNA或基因組DNA。61當(dāng)本發(fā)明的抗體分子通過(guò)動(dòng)物、化學(xué)合成或重組表達(dá)生成后，可通過(guò)本領(lǐng)域已知的任意免疫球蛋白分子純化方法對(duì)其進(jìn)行純化，例如通過(guò)層析(例如，離子交換層析、親和層析、特別是蛋白A后的特定抗原的親和層析、分子排阻層析)、離心、微分溶出率，或通過(guò)任何其它蛋白純化標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。此外，本發(fā)明的抗體或其片段可被融合至本文所述的或是本領(lǐng)域已知的其它異源多肽，以幫助純化。本發(fā)明包括了重組融合或化學(xué)偶聯(lián)(包括共價(jià)和非共價(jià)偶聯(lián))至多肽的抗體。可使用本發(fā)明的融合或結(jié)合抗體以易于純化。例如，參見(jiàn)PCT公開(kāi)WO93/21232;EP439,095;Naramura等人，/附mw朋/丄e"39:91(1994);美國(guó)專利5,474,981;Gillies等人，Ato/Jc^/5WU&489:1428(1992);Fell等人，//附m朋o/146:2446(1991)，其全文在此引入作為參考。此外，本發(fā)明的抗體或其片段可被融合至標(biāo)記序列，例如可連接至肽以促進(jìn)純化。在優(yōu)選實(shí)施方案中，標(biāo)記氨基酸序列為六組氨酸肽，例如在pQE栽體中提供的標(biāo)簽(QIAGEN，Inc.,9259EtonAvenue,Chatsworth，Calif"91311)，這些標(biāo)記氨基酸序列中的多數(shù)已上市銷(xiāo)售。如Gentz等人，尸racAto/JcadSc/86:821(1989)所述，例如，提供六組氨酸用于融和蛋白的快速純化。其它可用于純化的肽標(biāo)簽包括但不限于，對(duì)應(yīng)于來(lái)自流感血紅球凝集素蛋白的表位的"HA"標(biāo)簽(Wilson等人，Ce〃31:161(1984))以及"flag"標(biāo)簽。5.8抗體純化在使用重組技術(shù)時(shí)，該抗體可在胞內(nèi)、周質(zhì)空間生成，或直接分泌進(jìn)入培養(yǎng)基。如果抗體在胞內(nèi)生成，作為第一步，可通過(guò)例如離心或超濾去除顆粒碎片(宿主細(xì)胞或溶解片段)。Carter等人，別o/Tec/;"o/ogv10:163(1992)描述了分泌進(jìn)入大腸桿菌周質(zhì)空間的抗體的分離步驟。簡(jiǎn)單而言，在醋酸鈉(pH3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)的存在下經(jīng)過(guò)約30分鐘融化細(xì)胞糊(cellpaste)。離心去除細(xì)胞碎片。當(dāng)抗體分泌進(jìn)入培養(yǎng)基時(shí)，通常使用市售蛋白濃縮過(guò)濾器(例如，Amicon或MilliporePellicon超濾單元)濃縮來(lái)自這些表達(dá)系統(tǒng)的上清液。可在任意前述步驟中包含蛋白酶抑制劑如PMSF以抑制蛋白水解，且可包含抗生素以防止偶然污染物的生長(zhǎng)?？梢圆捎美缧谆沂瘜游?、凝膠電泳、透析和親和層析來(lái)純化從細(xì)胞制備的抗體組合物，其中親和層析是優(yōu)選的純化技術(shù)。蛋白A作為親和配體的適用性依賴于抗體中存在的任意免疫球蛋白Fc結(jié)構(gòu)域的種類和同種型。蛋白A可用于純化基于人IgGl、IgG2或IgG4重鏈的抗體(Lindmark等人，//mmw"o/MeA62:1(1983))。對(duì)于所有的小鼠同種型和人IgG3推薦蛋白G(Guss等人，ffikffi(9J5:1561(1986))。親和配體連接的基質(zhì)最通常為瓊脂糖，但也可使用其它基質(zhì)。機(jī)械穩(wěn)定的基質(zhì)如可控孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯可實(shí)現(xiàn)比瓊脂糖更快的流速和更短的處理時(shí)間。當(dāng)抗體包含CH3結(jié)構(gòu)域時(shí)，BakerbondABXTM樹(shù)脂(J.T.Baker;Phillipsburg，N丄)可用于純化。根據(jù)待回收的抗體，也可使用其它的蛋白純化技術(shù)，例如在離子交換柱上分級(jí)分離、乙醇沉淀、反相HPLC、在硅膠上的層析、在肝磷酯SEPHAROSETM上的層析、在陰離子或陽(yáng)離子交換樹(shù)脂(例如聚天冬氨酸柱)上的層析、層析聚焦、SDS-PAGE以及疏酸銨沉淀。在任意初步純化步驟后，可使用pH介于約2.5-4.5的洗脫緩沖液對(duì)包含感興趣的抗體和污染物的混合物進(jìn)行低pH疏水相互作用層析，優(yōu)選地在低鹽濃度(例如，約0-0.25M鹽)下進(jìn)行。5.9藥物制劑可通過(guò)將具有所需純度的多肽與任選的本領(lǐng)域常用的"藥學(xué)可接受的"載體、賦形劑或穩(wěn)定劑(其均被稱為"賦形劑")，即緩沖劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、等張劑、非離子型清潔劑、抗氧化劑以及其它各種添加劑混合將該多肽或抗體的治療性制劑制備為凍干制劑或水溶液進(jìn)行貯存。參見(jiàn)Remington'sPharmaceuticalSciences，第16版，Osol編(1980)。這些添加劑必須在所用的劑型和濃度下對(duì)接受者沒(méi)有毒性。緩沖劑有助于將pH維持在接近生理?xiàng)l件的范圍內(nèi)。它們優(yōu)選地以約2mM至約50mM的濃度范圍存在。用于本發(fā)明的合適的緩沖劑包括有機(jī)和無(wú)機(jī)酸及其鹽，例如檸檬酸鹽緩沖劑(例如，檸檬酸單鈉-檸檬酸二鈉混合物、檸檬酸-檸檬酸三鈉混合物、檸檬酸-檸檬酸單鈉混合物等)、琥珀酸鹽緩沖劑(例如，琥珀酸-琥珀酸單鈉混合物，琥珀酸-氫氧化鈉混合物、琥珀酸-琥珀酸二鈉混合物等)、酒石酸鹽緩沖劑(例如，酒石酸-酒石酸鈉混合物、酒石酸-酒石酸鉀混合物、酒石酸-氫氧化鈉混合物等)、延胡索酸鹽緩沖劑(例如，延胡索酸-延胡索酸單鈉混合物等)、延胡索酸鹽緩沖劑(例如，延胡索酸-延胡索酸單鈉混合物、延胡索酸-延胡索酸二鈉混合物、延胡索酸單鈉-延胡索酸二鈉混合物等)、葡萄糖酸鹽緩沖劑(例如，葡萄糖酸-葡萄糖酸鈉混合物、葡萄糖酸-氫氧化鈉混合物、葡萄糖酸-葡萄糖酸鉀混合物等)、草酸鹽緩沖劑(例如，草酸-草酸鈉混合物、草酸-氫氧化鈉混合物、草酸-草酸鉀混合物等)、乳酸鹽緩沖劑(例如，乳酸-乳酸鈉混合物、乳酸-氫氧化鈉混合物、乳酸-乳酸鉀混合物等)以及醋酸鹽緩沖劑(例如，醋酸-醋酸鈉混合物、醋酸-氫氧化鈉混合物等)。此外，還可涉及磷酸鹽緩沖劑、組氨酸緩沖劑和三甲胺鹽如Tris?？商砑臃栏瘎┮匝泳徫⑸锷L(zhǎng)，并可以0.2%-1%(w/v)范圍內(nèi)的量添加。用于本發(fā)明的合適的防腐劑包括苯酚、T醇、間甲酚、羥苯甲酸甲酯、羥苯64甲酸丙酯、十八烷基二甲基千基氯化銨、千烷銨卣化物(例如，氯化物、溴化物和碘化物)、氯化六甲季銨以及羥苯甲酸烷基酯如羥苯甲酸甲酯或羥苯甲酸丙酯、兒茶酚、間苯二酚、環(huán)己醇和3-戊醇?？商砑佑袝r(shí)^^皮作為"穩(wěn)定劑"的等張劑以確保本發(fā)明的液體組合物的等張性，其包括多氫糖醇，優(yōu)選三氫或更高的糖醇，例如丙三醇、赤藻糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇以及甘露糖醇。穩(wěn)定劑指一大類賦形劑，其從功能上可包括膨脹劑直至穩(wěn)定治療劑或幫助防止變性或祐附至容器壁的添加劑。典型的穩(wěn)定劑可以是多氫糖醇(上述列舉)；氨基酸，如精氨酸、賴氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、丙氨酸、鳥(niǎo)氨酸、L-亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、蘇氨酸等；有機(jī)糖或糖醇，例如乳糖、海藻糖、水蘇糖、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、肌醇、半乳糖醇、丙三醇等，包括環(huán)多醇如環(huán)己六醇；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含辟u(mài)還原劑，例如尿素、谷胱甘肽、疏辛酸、巰基乙酸鈉、硫代丙三醇、a-單石克代丙三醇和>晚代>晚酸鈉；低分子量多肽(即，<10殘基)；蛋白，例如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、凝膠或免疫球蛋白；親水聚合物，例如聚乙雄吡咯烷酮；單糖，例如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；二糖，例如乳糖、麥芽糖、蔗糖；和三糖，例如蜜三糖；以及多糖，例如葡萄聚糖。穩(wěn)定劑可以活性蛋白重量的0.1-10000重量份數(shù)存在?？商砑臃请x子型表面活性劑或清潔劑(也稱為"潤(rùn)濕劑")以幫助溶解該治療劑，同時(shí)保護(hù)治療性蛋白避免攪拌誘發(fā)的聚集，這也允許該制劑暴露在剪切表面應(yīng)力下而不引起蛋白變性。合適的非離子型表面活性劑包括多山醇酯(20、80等)、聚羥體(184、188等)、復(fù)合多元醇、聚氧乙烯山梨坦單醚65(TWEEN-20、TWEEN⑧-80等)。非離子型表面活性劑可以約0.05mg/ml至約1.0mg/ml、優(yōu)選約0.07mg/ml至約0.2mg/ml的范圍存在。其它的各種賦形劑包括膨脹劑(例如，淀粉)、螯合劑(例如，EDTA)、抗氧化劑(例如，抗壞血酸、蛋氨酸、維生素E)以及助溶劑。本文的制劑可針對(duì)待治療的特定適應(yīng)癥的需要包含一種以上的活性化合物，優(yōu)選彼此沒(méi)有不良影響的具有互補(bǔ)活性的化合物。例如，可能需要進(jìn)一步提供免疫抑制劑。這些分子可適當(dāng)?shù)匾詫?duì)預(yù)期目的有效的量組合存在?；钚猿煞诌€可以被包埋在通過(guò)例如凝聚技術(shù)或界面聚合制備的微膠嚢中，分別例如羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠嚢，用于膠體藥物遞送系統(tǒng)(例如，脂質(zhì)體、白蛋白微球、微乳液、納米顆粒以及納米膠嚢)或巨乳液中。該類技術(shù)披露于Remington'sPharmaceuticalSciences,第16版，Osol編(1980)。用于體內(nèi)施用的制劑必須是無(wú)菌的。這可通過(guò)例如無(wú)菌過(guò)濾膜進(jìn)行過(guò)濾得以容易地實(shí)現(xiàn)?？芍苽渚忈屩苿?。緩釋制劑的合適例子包括，含有抗體的固體疏水聚合物的半透基質(zhì)，該基質(zhì)呈現(xiàn)有形物體的形式，例如，膜或微膠嚢。緩釋基質(zhì)的例子包括水凝膠(例如，聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸甲酯)、或聚(乙烯醇))、聚乳酸(美國(guó)專利3773919)、L-谷氨酸和乙基-L-谷氨酸鹽的共聚物、非降解乙烯-醋酸乙烯酯、可降解乳酸-羥基乙酸共聚物，如LUPRONDEPOT(由乳酸-羥基乙酸共聚物和醋酸亮丙瑞林組成的可注射微球)和多聚-D-(-)-3-羥丁酸。乙烯-醋酸乙烯酯和乳酸-羥基乙酸等聚合物能夠在100天中釋放分子，某些水凝膠在較短的時(shí)間內(nèi)釋放蛋白。當(dāng)包于膠嚢內(nèi)的抗體在身體內(nèi)存留較長(zhǎng)時(shí)間時(shí)，它們可能由于暴露在37t:的潮濕環(huán)境下而變性或聚集，從而導(dǎo)致生物活性的喪失以及可能的免疫原性改變?？筛鶕?jù)所涉及的機(jī)制設(shè)計(jì)合理的穩(wěn)定化策略。例如，如果發(fā)現(xiàn)聚集機(jī)制是通過(guò)硫-二疏化物交換形成分子間S-S鍵，則可通過(guò)修飾硫氫基殘基、從酸性溶液凍干、控制含水量、使用適當(dāng)?shù)奶砑觿?、和形成特定的聚合物基質(zhì)組合物來(lái)實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定化。在具體疾病或病癥的治療中有效的治療性多肽、抗體或其片段的量將依賴于該疾病或病癥的性質(zhì)，并可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)臨床技術(shù)測(cè)定?？赡軙r(shí)，希望在進(jìn)行人體測(cè)試之前先在體外、然后在有用的動(dòng)物模型中測(cè)定本發(fā)明的藥物組合物的劑量應(yīng)答曲線。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可通過(guò)皮下注射施用治療性的多肽、抗體或其片段的水溶液。每個(gè)劑量可在約0.5嗎至約50昭每公斤體重范圍內(nèi)，或者更優(yōu)選地，在約3昭至約30嗎每公斤體重范圍內(nèi)。進(jìn)行皮下施用的給藥方案可根據(jù)多種臨床因素從每月一次到每天一次，所述臨床因素包括疾病類型、疾病的嚴(yán)重性以及個(gè)體對(duì)治療劑的敏感性。5.10抗-OX40抗體的診斷用途本發(fā)明的抗體包括通過(guò)向抗體共價(jià)連接任意類型的分子而經(jīng)修飾的衍生物，只要該種共價(jià)連接不影響與OX40的結(jié)合。例如但不限于，該抗體衍生物包括例如通過(guò)生物素化、HRP或任何其它可測(cè)部分修飾的抗體。本發(fā)明的抗體可用于，例如但不限于，在體外和體內(nèi)診斷方法中純化或檢測(cè)0X40。例如，該抗體在免疫測(cè)定中用于定性和定量測(cè)定生物樣本中的OX40水平。例如，參見(jiàn)Harlow等人，Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress，第二版(1988)，在此全文引用作為參考。如下文更為具體的討論，本發(fā)明的抗體可單獨(dú)使用或與其它組合物組合使用。抗體可被進(jìn)一步重組融合至異源多肽的N或C末端，或者化學(xué)偶聯(lián)(包括共價(jià)或非共價(jià)偶聯(lián))至多肽或其它組合物。例如，本發(fā)明的抗體可重組融合或偶聯(lián)可在檢測(cè)測(cè)定中用作標(biāo)記物的分子。本發(fā)明進(jìn)一步包括偶聯(lián)了診斷劑的抗體或其片段。該抗體可在診斷中用于，例如，檢測(cè)感興趣的靶標(biāo)在特定細(xì)胞、組織或血清中的表達(dá)；或者監(jiān)測(cè)免疫應(yīng)答的形成或進(jìn)展，作為臨床測(cè)試步驟的一部分以例如檢測(cè)給定治療方案的效力?？赏ㄟ^(guò)將抗體結(jié)合至可測(cè)物質(zhì)幫助檢測(cè)?？蓹z測(cè)物質(zhì)的例子包括各種酶、輔基、焚光材料、發(fā)光材料、生物發(fā)光材料、放射性材料、使用各種正電子發(fā)射斷層的正電子發(fā)射金屬、以及非放射性順磁性金屬離子。該可測(cè)物質(zhì)可通過(guò)本領(lǐng)域已知的技術(shù)直接或通過(guò)中間體(例如，本領(lǐng)域已知的接頭)間接結(jié)合或偶聯(lián)至抗體(或其片段)。酶標(biāo)記的例子包括螢光素酶(例如，螢火蟲(chóng)螢光素酶和細(xì)菌螢光素酶；美國(guó)專利4,737,456)、熒光素、2，3-二氫酞嗪二酮、蘋(píng)果酸脫氫酶、脲酶、過(guò)氧化物酶如辣根過(guò)氧化物酶(HRPO)、堿性磷酸酶、(3-半乳糖普酶、葡萄糖淀粉酶、溶菌酶、糖類氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶以及葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)、雜環(huán)氧化酶(例如尿酸酶和黃嘌呤氧化酶)、乳過(guò)氧化物酶、微過(guò)氧化物酶等。將酶偶聯(lián)至抗體的技術(shù)描述于O'Sullivan等人，"MethodsforthePreparationofEnzyme-AntibodyConjugatesforUseinEnzymeImmunoassay",收錄于MethodsinEnzymology中,Langone等人編，第147-66頁(yè)，AcademicPress(1981)。例如，可偶聯(lián)至抗體并用作本發(fā)明所述診斷劑的金屬離子可參見(jiàn)美國(guó)專利4,741,900。合適的酶的例子包括辣根過(guò)氧化酶、堿性磷酸酶、(3-半乳糖苷酶、或是乙酰膽堿酯酶；合適的輔基復(fù)合物的例子包括鏈霉親和素/生物素和親和素/生物素；合適的熒光材料的例子包括傘形酮、熒光素、異硫氰酸螢光素、羅丹明、二氯三嗪基氨基熒光素、丹磺酰氯或藻紅素；發(fā)光材料的例子包括魯米諾；生物發(fā)光材料的例子包括熒光素酶、蟲(chóng)熒光素和發(fā)光蛋白質(zhì)；合適的放射性材料的例子包括1251、13'1、"'In或"Tc。有時(shí)，標(biāo)記物可與該抗體間接偶聯(lián)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解實(shí)現(xiàn)該目的的各種技術(shù)。例如，抗體可與生物素偶聯(lián)，且上文所述的三大類標(biāo)記物中的任意一種均可與親和素偶聯(lián)，反之亦然。生物素選擇性結(jié)合親和素，因此，該標(biāo)記物可通過(guò)該間接方式偶聯(lián)該抗體?？商娲?，為了實(shí)現(xiàn)標(biāo)記物與抗體的間接偶聯(lián)，該抗體與小的半抗原(例如digloxin)偶聯(lián)，而上述不同類型的標(biāo)記物之一與抗-半抗原抗體(例如，抗digloxin抗體)偶聯(lián)。因此，可以實(shí)現(xiàn)標(biāo)記物與抗體的間接偶聯(lián)。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，該抗體不需要被標(biāo)記，且其存在可采用結(jié)合抗體的標(biāo)記抗體進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明的抗體可用于任何已知的測(cè)定方法，例如竟?fàn)幮越Y(jié)合測(cè)定、直接和間接夾心測(cè)定以及免疫沉淀測(cè)定。參見(jiàn)Zola,MonoclonalAntibodies:AManualofTechniques,第147-158頁(yè)，CRCPress(1987)。竟?fàn)幮越Y(jié)合測(cè)定依賴于標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)物與測(cè)試樣本竟?fàn)幮越Y(jié)合有限量的抗體的能力。測(cè)試樣本中靶標(biāo)的量與結(jié)合該抗體的標(biāo)準(zhǔn)物的量成反比例。為了幫助確定結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)物的量，抗體通常在竟?fàn)幹盎蛑笫遣豢扇艿?。因此，與該抗體結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)物和測(cè)試樣本可與未結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)物和測(cè)試樣本中方便地分離出來(lái)。夾心測(cè)定涉及兩種抗體的使用，每種抗體能夠結(jié)合不同的待檢測(cè)的免疫原性部分、或表位、或蛋白。在夾心測(cè)定中，待分析的該測(cè)試樣本首先被固定在固體支持物上的第一抗體結(jié)合，然后第二抗體結(jié)合該測(cè)試樣本，從而形成不溶的三部分復(fù)合物。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利4,376,110。第二抗體本身可以用可測(cè)部分標(biāo)記(直接夾心測(cè)定)，或可通過(guò)以可測(cè)部分標(biāo)記的抗免疫球蛋白抗體進(jìn)行測(cè)定(間接夾心測(cè)定)。例如，一種夾心測(cè)定的類型為ELISA測(cè)定，該測(cè)定中的可測(cè)部分為酶。抗體可連接至固體支持物，這對(duì)于感興趣的抗原的免疫測(cè)定或純化特別有用。該種固體支持物包括但不限于，玻璃、纖維素、聚丙烯酰胺、尼龍、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。在本方法中，抗體通過(guò)本領(lǐng)域公知的方法被固定化在固體支持物如SEPHADEXTM樹(shù)脂或?yàn)V紙上。固定后的抗體與含有待純化耙標(biāo)的樣本相接觸，然后用合適的溶劑洗滌該支持物，該溶劑能夠基本去除樣本中除了結(jié)合至該固定的抗體的待純化靶標(biāo)之外的所有物質(zhì)。最后，用另一種合適的溶劑(例如甘氨酸緩沖液)洗滌該支持物，該溶劑將從該抗體上釋放耙標(biāo)。特異性結(jié)合OX40的經(jīng)標(biāo)記的抗體及其衍生物和類似物可在診斷中用于檢測(cè)、診斷或監(jiān)測(cè)與OX40的異常表達(dá)和/或活性相關(guān)的疾病、紊亂和/或病癥。本發(fā)明拔:供了對(duì)OX40的異常表達(dá)的檢測(cè)，其包括(a)使用一種或多種本發(fā)明的特異性針對(duì)OX40的抗體測(cè)定個(gè)體的細(xì)胞或體液中的OX40表達(dá)；和(b)將該基因表達(dá)水平與標(biāo)準(zhǔn)基因表達(dá)水平相比較，由此，測(cè)得的OX40表達(dá)水平相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)表達(dá)水平的增加或減少表示有異常表達(dá)?？贵w可被用于檢測(cè)樣本(例如，體液或組織樣本)中OX40的存在和/或水平。檢測(cè)方法可包括將樣本與OX40抗體相接觸，并測(cè)量與該樣本結(jié)合的抗體的量。對(duì)于免疫組織化學(xué)，樣本可以是新鮮的或是冷凍的，或者可以包埋在石i#中并以防腐劑如福爾馬林進(jìn)行固定。70本發(fā)明提供了用于診斷病癥的診斷性測(cè)定，其包括(a)使用一種或多種本發(fā)明的抗體測(cè)定個(gè)體的細(xì)胞或體液中的OX40表達(dá)；和(b)將該基因表達(dá)水平與標(biāo)準(zhǔn)基因表達(dá)水平相比較，由此，測(cè)得的基因表達(dá)水平相對(duì)于該標(biāo)準(zhǔn)表達(dá)水平的增加或減少表示有特定的病癥。本發(fā)明的抗體可被用于采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的經(jīng)典免疫組織學(xué)方法測(cè)定生物樣本中的蛋白質(zhì)水平(例如，參見(jiàn)Jalkanen等人，JCe〃別o/101:976(1985);Jalkanen等人，《/CW/Ao/105:3087(1987))。其它可用于檢測(cè)蛋白基因表達(dá)的基于抗體的方法包括免疫測(cè)定，例如酶聯(lián)免疫吸收分析(ELISA)和放射性免疫測(cè)定(RIA)。適用的抗體測(cè)定標(biāo)記已為本領(lǐng)域所知并包括酶標(biāo)記，例如，葡萄糖氧化酶；放射性同位素，例如碘(1311，1251，1211)、碳("C)、硫("S)、氖pH)、銦(1211！1，mIn)、和锝("Tc);發(fā)光標(biāo)記，例如魯米諾；以及熒光標(biāo)記，例如熒光素和羅丹明，以及生物素。放射性同位素結(jié)合的同位素可通過(guò)免疫閃爍成4象法進(jìn)行定4立。本發(fā)明的一個(gè)方面是檢測(cè)和診斷動(dòng)物(優(yōu)選哺乳動(dòng)物，最優(yōu)選人)中與OX40異常表達(dá)相關(guān)的疾病或病癥。在一個(gè)實(shí)施方案中，診斷包括a)向個(gè)體施用(例如，腸胃外、皮下或腹膜施用)有效量的特異性結(jié)合OX40的經(jīng)標(biāo)記的分子；b)在施用后等待一段時(shí)間，以允許該經(jīng)標(biāo)記的分子在個(gè)體中表達(dá)該多肽的位點(diǎn)優(yōu)先濃縮(并將未結(jié)合標(biāo)記分子清除至背景水平)；c)測(cè)定背景水平；和d)測(cè)定個(gè)體中的經(jīng)標(biāo)記的分子，由此，測(cè)得經(jīng)標(biāo)記的分子在背景水平以上表明該個(gè)體患有與OX40異常表達(dá)相關(guān)的特定疾病或病癥。背景水平可通過(guò)各種方法測(cè)定，包括，將測(cè)得的經(jīng)標(biāo)記的分子的量與之前測(cè)定的特定系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)<直相比專交。本領(lǐng)域中應(yīng)能理解個(gè)體的大小和所用的成像系統(tǒng)將決定用于生成診斷性影像所需的成像部分的數(shù)量。對(duì)于放射性同位素部分，用于人類個(gè)體時(shí)，注射的放射活性的量通常在約5至20毫居里"Tc的范圍內(nèi)。然后該標(biāo)記的抗體或抗體片段將優(yōu)先聚集在細(xì)胞中包含特定蛋白的位置。體內(nèi)成像描述于Burchiel等人,"ImmunopharmacokineticsofRadiolabeledAntibodiesandTheirFragments."，收錄于TumorImaging:TheRadiochemicalDetectionofCancer中第13章，Burchiel等人編，MassonPublishing(1982)。根據(jù)多種變量(包括所用標(biāo)記物的類型和施用的模式)，在施用后允許經(jīng)標(biāo)記的分子優(yōu)先濃縮于個(gè)體內(nèi)的位點(diǎn)以及未結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記的分子被清除至背景水平的時(shí)間間隔為6至48小時(shí)、6至24小時(shí)、或6至12小時(shí)。在另一實(shí)施方案中，施用后的時(shí)間間隔為5至20天或5至10天。在實(shí)施方案中，可通過(guò)重復(fù)診斷疾病或病癥的方法來(lái)監(jiān)測(cè)疾病或病癥，例如在初次診斷一個(gè)月后、初次診斷六個(gè)月后、初次診斷一年后進(jìn)行重復(fù)診斷。可通過(guò)本領(lǐng)域已知的體內(nèi)掃描的方法檢測(cè)經(jīng)標(biāo)記的分子在患者體內(nèi)的存在。該方法依賴于所用的標(biāo)記物類型。技術(shù)人員將能夠確定用于測(cè)定具體標(biāo)記物的適當(dāng)方法?？捎糜诒景l(fā)明的診斷方法的方法和儀器包括但不限于，計(jì)算機(jī)X射線斷層成像(CT)、全身掃描例如正電子發(fā)射體層攝影(PET)、磁共振成像(MRI)和超聲檢查。在具體實(shí)施方案中，分子通過(guò)放射性同位素標(biāo)記，并通過(guò)放射應(yīng)答手術(shù)儀器(美國(guó)專利5,441，050)在患者體內(nèi)檢測(cè)。在另一實(shí)施方案中，分子以熒光化合物標(biāo)記，并通過(guò)熒光應(yīng)答掃描儀器在患者體內(nèi)檢測(cè)。在另一實(shí)施方案中，分子以正電子發(fā)射金屬標(biāo)記，并通過(guò)正電子發(fā)射斷層顯像在患者體內(nèi)檢測(cè)。72在另一實(shí)施方案中，分子通過(guò)順磁標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記，并通過(guò)磁共4展成像(MRI)在患者體內(nèi)檢測(cè)。另一方面，本發(fā)明提供了對(duì)患者形成由細(xì)胞因子的非調(diào)節(jié)表達(dá)引起的疾病的傾向的診斷方法。在某些患者細(xì)胞、組織或體液中OX40上升的量表示該患者易患某種疾病。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括從已知具有較低或正常OX40水平的患者采集細(xì)胞、組織或體液樣本，分析該組織或體液中OX40的存在，并根據(jù)組織或體液中OX40的表達(dá)水平預(yù)測(cè)該患者罹患某種疾病的傾向。在另一實(shí)施方案中，方法包括從患者采集已知含有確定OX40水平的細(xì)胞、組織或體液樣本，分析該組織或體液的OX40數(shù)量，并根據(jù)該OX40量相對(duì)于由正常細(xì)胞、組織或體液確定的或測(cè)得的水平的變化預(yù)測(cè)該患者罹患某種疾病的傾向。該確定的OX40水平可以是基于文獻(xiàn)值的已知量，或者可通過(guò)測(cè)量正常細(xì)胞、組織或體液中的數(shù)量而實(shí)現(xiàn)測(cè)定。特別地，測(cè)定OX40在某些組織或體液中的水平可允許特異性地和早期地、優(yōu)選在疾病發(fā)生之前對(duì)患者的疾病進(jìn)行檢測(cè)。可通過(guò)本發(fā)明進(jìn)行診斷的疾病包括但不限于本文所述的疾病。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，組織或體液為外周血、外周血白血球、活檢組織如肺或皮月夫活體切片、以及組織。本發(fā)明的抗體可在試劑盒中提供，即，將預(yù)定量的試劑與進(jìn)行診斷測(cè)定的說(shuō)明組合包裝。當(dāng)抗體以酶標(biāo)記時(shí)，該試劑盒可包含底物和該酶所需的輔因子(例如，拔—供可測(cè)生色團(tuán)或熒光團(tuán)的底物前體)。此外，還可包含其它的添加劑，例如穩(wěn)定劑、緩沖劑(例如封閉緩沖劑或溶解緩沖劑)等。各種試劑的相對(duì)量可大范圍變化，以在溶液中提供試劑濃度，其將對(duì)測(cè)定的敏感性充分優(yōu)化。特別地，試劑可作為干粉提供，其通常是凍干的，包含賦形劑，該賦形劑在溶解時(shí)將4是4共具有合適濃度的試劑溶液。5.11抗-OX40抗體的治療用途預(yù)期本發(fā)明的抗體可用于治療哺乳動(dòng)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，例如，該抗體被施用至非人哺乳動(dòng)物，以獲得臨床前數(shù)據(jù)。示例性的待治療的非人哺乳動(dòng)物包括非人靈長(zhǎng)動(dòng)物、狗、貓、嚙齒動(dòng)物和其它可進(jìn)行臨床前研究的哺乳動(dòng)物。這些哺乳動(dòng)物可以是為待用抗體進(jìn)行治療的疾病而建立的動(dòng)物模型，或者可用于研究感興趣的抗體的毒性。在這些實(shí)施方案的每一個(gè)中，可對(duì)哺乳動(dòng)物進(jìn)行劑量遞增研究。單獨(dú)使用或與細(xì)胞毒性因子聯(lián)合施用的抗體(其與治療性部分偶聯(lián)或未與之偶聯(lián))可被用作治療劑。本發(fā)明涉及基于抗體的療法，其涉及將本發(fā)明的抗體施用至動(dòng)物、哺乳動(dòng)物或人類用于治療OX-40介導(dǎo)的疾病、紊亂或病癥。動(dòng)物或個(gè)體可以是需要特定治療的動(dòng)物，例如被診斷患有特定病癥(例如，與OX40相關(guān)的病癥)的動(dòng)物。針對(duì)OX40的抗體可用于在哺乳動(dòng)物中(包括但不限于牛、豬、馬、雞、貓、狗、非人靈長(zhǎng)動(dòng)物等，以及人)對(duì)抗過(guò)敏、哮喘、自身免疫性或炎性疾病。例如，通過(guò)使用治療可接受的劑量的本發(fā)明的抗體，或者這些抗體的混合物，或者聯(lián)合其它不同來(lái)源的抗體，可以減少或消除待治療哺乳動(dòng)物中的自身免疫或炎性疾病癥狀。本發(fā)明的治療性化合物包括但不限于，本發(fā)明的抗體(包括本文所述的它的片段、類似物和衍生物)和如下所述編碼本發(fā)明抗體的核酸(包括本文所述的抗體的片段、類似物和衍生物以及抗獨(dú)特型抗體)。本發(fā)明的抗體可用于治療、抑制或預(yù)防與OX40的異常表達(dá)和/或活性相關(guān)的疾病、紊亂或病癥，包括但不限于本文所述的疾病、紊亂或病癥的任意一種或多種。與OX40的異常表達(dá)和/或活性相關(guān)的疾病、紊亂或病癥的治療和/或預(yù)防包括但不限于，減輕與該疾病、紊亂或病癥相關(guān)的至少一種癥狀。本發(fā)明的抗體可提供在本領(lǐng)域已知的或是本文所述的藥學(xué)可接受組合物中。本發(fā)明的抗-OX40抗體可用于多種疾病的治療。本發(fā)明4是供了預(yù)防或治療哺乳動(dòng)物中OX40-介導(dǎo)的疾病的方法。該方法包括向該哺乳動(dòng)物施用疾病預(yù)防或治療量的抗-OX40抗體。該抗-OX40抗體結(jié)合OX40并調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和細(xì)胞受體表達(dá)，從而導(dǎo)致非疾病狀態(tài)的特征性細(xì)胞因子水平。OX40信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)已與多種疾病產(chǎn)生聯(lián)系，例如過(guò)敏、哮喘和與自身免疫和炎癥相關(guān)的疾病，其包括多發(fā)性硬化癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎性腸道疾病、移植物抗宿主病、實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)、實(shí)驗(yàn)性利什曼病、膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎、結(jié)腸炎(例如潰瘍性結(jié)腸炎)、接觸超l丈反應(yīng)、糖尿病、克隆氏病和Grave病。本發(fā)明的抗體還可用于預(yù)防或治療其它疾病，包括肉狀瘤病、自身免疫眼部疾病、自身免疫葡萄膜炎、異位性皮炎、重癥肌無(wú)力、自身免疫性神經(jīng)疾病(例如Gumain-Barre)、自身免疫性葡萄膜炎、自身免疫性溶血性貧血、惡性貧血、自身免疫性血小板減少、顳動(dòng)"永炎、抗磷脂綜合癥、血管炎(例如Wegener肉芽腫病)、白塞氏病、牛皮癬、皰滲樣皮炎、尋常天皰瘡、白斑病、原發(fā)性膽汁性肝硬變、自身免疫性肝炎、橋本氏甲狀腺炎、自身免疫性卵巢炎和睪丸炎、腎上腺的自身免疫性疾病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、硬皮病、皮膚肌炎、多發(fā)性肌炎、皮膚肌炎、脊推關(guān)節(jié)病(例如強(qiáng)直性脊柱炎)、Reiter綜合癥、Sjogren綜合癥等。該治療劑的免疫原性應(yīng)答。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了這樣的藥劑。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，和包含重鏈和輕鏈可變區(qū)的抗體相比，本發(fā)明提供了能夠和/或預(yù)期能夠在宿主個(gè)體中以顯著降低的水平引發(fā)人抗-小鼠抗體75應(yīng)答(HAMA)的人源化抗體。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明提供了引發(fā)和/或預(yù)期引發(fā)最小量或不引發(fā)人抗-小鼠抗體應(yīng)答(HAMA)的人源化抗體。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的抗體引發(fā)了相當(dāng)于或小于臨床可接受水平的抗-小鼠抗體應(yīng)答。能夠有效治療、抑制和預(yù)防與OX40的異常表達(dá)和/或活性相關(guān)的疾病或病癥的抗體的量可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)臨床技術(shù)測(cè)定。該劑量將取決于待治療疾病的類型、該疾病的嚴(yán)重性和病程、抗體是否為預(yù)防或治療目的施用、之前的療法、患者的臨床史以及對(duì)抗體的應(yīng)答，以及主治醫(yī)生的判斷?？贵w可以以與該疾病一致的治療方案施用，例如，可在一至數(shù)天內(nèi)單次或數(shù)次給藥以改善疾病狀態(tài)，或者在延長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)周期給藥以預(yù)防過(guò)敏或哮喘。此外，可以可選地采用體外測(cè)定來(lái)幫助鑒定最佳劑量范圍。制劑中采用的確切的劑量將取決于施用的途徑，以及疾病或病癥的嚴(yán)重性，并且應(yīng)當(dāng)根據(jù)醫(yī)生的判斷和每位患者的情況決定。有效劑量可從來(lái)自體外或動(dòng)物模型測(cè)試系統(tǒng)獲得的劑量-應(yīng)答曲線外推得到。對(duì)于抗體，向患者施用的劑量相對(duì)患者體重通常為0.1mg/kg至150mg/kg。優(yōu)選地，向患者施用的劑量相對(duì)患者體重介于0.1mg/kg至20mg/kg,更優(yōu)選介于1mg/kg至10mg/kg。一般而言，由于對(duì)外源多肽的免疫應(yīng)答，人抗體在人體內(nèi)的半衰期長(zhǎng)于來(lái)自其它物種的抗體。因此，采用更低劑量的人抗體和更小的施用頻率是可能的。此外，可通過(guò)修飾(例如，脂化)增加抗體攝耳又和組織穿透力(例如，進(jìn)入腦中)來(lái)減少本發(fā)明的抗體的施用劑量和頻率。對(duì)于歷經(jīng)數(shù)天或更長(zhǎng)時(shí)間的重復(fù)施用，根據(jù)病癥，治療可持續(xù)至對(duì)疾病癥狀達(dá)到所需的抑制。然而，也可使用其它的給藥方案。該療法的進(jìn)程可通過(guò)常規(guī)的技術(shù)和測(cè)定容易地監(jiān)測(cè)。對(duì)于抗-LFA-l或抗-ICAM-l抗體的示例性的給藥方案披露于WO94/04188?？沙式M合物形式的本發(fā)明的抗體應(yīng)當(dāng)以與良好醫(yī)療實(shí)踐(goodmedicalpractice)—致的方式進(jìn)行配制、給藥和施用。在該種背景下考慮的因素包括被治療的具體病癥、被治療的具體哺乳動(dòng)物、個(gè)體患者的臨床狀態(tài)、病癥的誘因、藥劑的遞送位點(diǎn)、施用方法、施用方案以及醫(yī)療工作者已知的其它因素。待施用的抗體組合物的"治療有效量"將由這些考量所決定，并且是預(yù)防、改善或治療疾病或病癥所需的最小量。該抗體無(wú)需、但可任選地與一種或多種目前用于預(yù)防或治療有關(guān)病癥的藥劑配制。這些其它藥劑的有效量取決于抗體在制劑中存在的量、病癥或治療的類型以及上文討論的其它因素。它們通常以上文所用的相同的劑量和施用途徑使用，或者約為上文采用劑量的1-99%。本發(fā)明的抗體可以有利地與其它單克隆或嵌合抗體聯(lián)用，或與淋巴因子或造血生長(zhǎng)因子(例如，IL-2、IL-3、IL-7和IFN-力聯(lián)用，這些因子例如可增加與該抗體相互作用的效應(yīng)細(xì)胞的數(shù)量或活性。本發(fā)明的抗體可單獨(dú)施用，或與其它類型的治療聯(lián)合施用，例如與抗炎癥療法、免疫抑制藥物、免疫療法、化學(xué)療法、支氣管擴(kuò)張劑、抗IgE分子、抗組胺或抗白細(xì)胞三烯聯(lián)用。在優(yōu)選的方面，該抗體被基本純化(例如，基本不含有限制其作用或產(chǎn)生不想要的副作用的物質(zhì))。已知各種遞送系統(tǒng)，并可將它們用于施用本發(fā)明的抗體，包括注射，例如封裝在脂質(zhì)體中、微顆粒、微膠囊、能夠表達(dá)該化合物的重組細(xì)胞、受體介導(dǎo)的胞吞作用(例如，參見(jiàn)Wu等人，《/說(shuō)o/C/zew262:4429(1987))、構(gòu)建作為逆轉(zhuǎn)錄病毒或其它載體一部分的核酸等。抗-OX40抗體可以任意可接受的方式被施用至哺乳動(dòng)物。遞送的方法包括但不限于，腸胃外、皮下、腹腔內(nèi)、肺內(nèi)、鼻內(nèi)、硬腦膜上和口服途徑，且如果免疫抑制治療需要，可進(jìn)行病灶內(nèi)施用。腸胃外灌輸包括肌肉內(nèi)、皮膚內(nèi)、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)或腹膜內(nèi)施用?？贵w或組合物可通過(guò)任何便捷的途徑施用，例如灌輸或大丸注射，經(jīng)過(guò)上皮或皮膚粘膜(例如，口腔粘膜、直腸和腸粘膜等)吸收，并可與其它生物活性劑一起施用。施用可以是全身或局部施用。此外，還希望將本發(fā)明的治療性抗體或組合物通過(guò)任意合適的途徑(包括室內(nèi)注射和囊內(nèi)注射)導(dǎo)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，室內(nèi)注射可通過(guò)例如與貯器(例如Ommaya貝i器)連接的室內(nèi)導(dǎo)管進(jìn)行輔助。此外，抗體適于通過(guò)脈沖灌輸(pulseinfusion)施用，特別是伴隨著抗體的下降劑量。優(yōu)選地，劑量可通過(guò)注射給用，最優(yōu)選通過(guò)靜脈內(nèi)或皮下注射給用，這部分取決于施用是短時(shí)的還是長(zhǎng)期的。也可通過(guò)，例如，吸入器或噴霧器的使用，并與煙霧化劑配制進(jìn)行肺部施用?？贵w還可以干粉組合物的形式施用至患者的肺中(參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利6,514,496)。在具體實(shí)施方案中，可能希望向需要治療的區(qū)域局部施用本發(fā)明的治療性抗體或組合物；這可通過(guò)(例如但非限制性的)局部灌輸、局部應(yīng)用、通過(guò)注射、通過(guò)導(dǎo)管方式、通過(guò)栓劑的方式、或通過(guò)植入物得以實(shí)現(xiàn)，所述植入物為多孔的、非多孔的或是凝膠狀的材料，其包含膜，例如硅膠?；蚶w維。優(yōu)選地，當(dāng)施用本發(fā)明的抗體時(shí)，應(yīng)注意使用不吸收蛋白的材料。在另一實(shí)施方案中，抗體可在小嚢中遞送，特別是在脂質(zhì)體中遞送(參見(jiàn)，Langer，5Wewce249:1527(1990);Treat等人，^R錄于LiposomesintheTherapyofInfectiousDiseaseandCancer中，Lopez-Berestein等人編，第353-365頁(yè)(1989);Lopez-Berestein,同上，第317-27頁(yè)；一般性地參見(jiàn)如上文獻(xiàn))。在另一實(shí)施方案中，抗體可在控釋系統(tǒng)中遞送。在一個(gè)實(shí)施方案中，可使用泵(參見(jiàn)Langer，&/ewce249:1527(1990);Sefton，O,YWe/5/owed五"g14:201(1987);Buchwald等人，Swrge/:v88:507(1980);Saudek等人，78MW321:574(1989))。在另一實(shí)施方案中，可使用聚合材料(參見(jiàn)MedicalApplicationsofControlledRelease，Langer等人編,CRCPress(1974);ControlledDrugBioavailability,DrugProductDesignandPerformance,Smolen等人編，Wiley(1984);Ranger等人，/Afacrawo/ievAfocrawo/C/zem23:61(1983);還可參見(jiàn)Levy等人，Sc/e置228:190(1985);During等人，J朋7Ve腳/25:351(1989);Howard等人，JWewmswg71:105(1989))。在另一實(shí)施方案中，控釋系統(tǒng)可被置于治療耙標(biāo)附近。本發(fā)明還提供了藥物組合物。這些組合物包含治療有效量的該抗體和生理可接受的載體。在具體實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)"生理可接受的"指被聯(lián)邦或州政府的管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)或者被美國(guó)藥典或其它被普遍認(rèn)可的藥典中收錄可用于動(dòng)物、更具體地用于人。術(shù)語(yǔ)"載體"指與該治療施用的稀釋劑、佐劑、賦形劑或云載體。這些生理載體可以是無(wú)菌液體，例如水和油，包括來(lái)自石油、動(dòng)物、蔬菜或合成來(lái)源的油，例如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。當(dāng)藥物組合物通過(guò)靜脈內(nèi)施用時(shí)，水是優(yōu)選的載體。鹽水溶液和右旋糖水溶液以及甘油溶液也可用作液體載體，特別適用于可注射溶液。適當(dāng)?shù)乃幬镔x形劑包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、大米、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、甘油單硬脂酸酯、滑石粉、氯化鈉、干脫脂牛奶、甘油、丙二醇、乙二醇、水、乙醇等。根據(jù)需要，組合物還可包含極少量的潤(rùn)濕劑或乳化劑、或是pH緩沖劑。組合物可呈溶液、懸浮液、乳液、片劑、丸劑、膠嚢、粉末、緩釋劑型等形式。組合物可與傳統(tǒng)結(jié)合劑和載體如甘油三酸酯配制為栓劑?？诜┬涂砂瑯?biāo)準(zhǔn)載體，例如藥物級(jí)的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。合適的載體的例子描述于E.W.Martin的"Remington'sPharmaceuticalSciences"。這些組合物將包含有效量的抗J本(優(yōu)選地呈純化形式)以及適量的載體，從而3是一f共正確施用至患者的形式。劑型應(yīng)當(dāng)適合施用的模式。在一個(gè)實(shí)施方案中，可參照常規(guī)方法將組合物配制成適于靜脈施用至人類的藥物組合物。用于靜脈內(nèi)施用的組合物通常為無(wú)菌等張水性緩沖液中的溶液。根據(jù)需要，組合物還可包含增溶劑和局部麻醉劑(例如利多卡因)以緩解注射位點(diǎn)的疼痛。一般而言，成分可在單位劑型中單獨(dú)提供也可混合在一起提供，例如，在密封容器(如標(biāo)明了活性藥劑量的安瓿或sachette)中作為凍干粉或無(wú)水濃縮物。當(dāng)該組合物通過(guò)輸注施用時(shí)，其可用含有無(wú)菌藥物級(jí)水或鹽水的輸液瓶分配。當(dāng)組合物通過(guò)注射施用時(shí)，可提供安瓿的注射用無(wú)菌水或鹽水，從而可在施用前混合這些成分。本發(fā)明還纟是供了包含一個(gè)或多個(gè)容器的包裝或試劑盒，所述容器填充了一種或多種本發(fā)明的藥物組合物成分。這些容器任選地帶有聲明，該聲明的形式由規(guī)范藥物或生物產(chǎn)品的制造、使用和生產(chǎn)的政府機(jī)關(guān)制定，其內(nèi)容反映了用于人體施用物品的生產(chǎn)、使用或銷(xiāo)售的機(jī)關(guān)的批準(zhǔn)。此外，本發(fā)明的抗體還可偶聯(lián)各種效應(yīng)分子，例如異源多肽、藥物、放射性核普酸或毒素。例如參見(jiàn)，PCT公開(kāi)WO92/08495;WO91/14438;WO89/12624;美國(guó)專利5,314,995;和EP396,387?？贵w或其片段可偶聯(lián)至治療性部分，例如細(xì)胞毒素(例如，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑或殺細(xì)胞劑)、治療劑、放射活性金屬離子(例如，a-放射源如213Bi)。細(xì)胞毒素或細(xì)胞毒性藥劑包括任何對(duì)細(xì)胞有害的藥劑。例子包括，紫杉醇、細(xì)胞松弛素B、短桿菌肽D、溴化乙啡啶、吐根堿、絲裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春花堿、秋水仙堿、阿霉素、柔紅霉素、二幾基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放線菌素D、l-去氫睪酮、糖皮質(zhì)激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾和噤呤霉素及其類似物或同系物。治療劑包括但不限于，抗代謝物(例如，甲氨蝶呤、6-巰基嘌呤、6-疏代鳥(niǎo)嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶氨烯咪胺)、烷化劑(例如，氮齊、thioepa苯丁酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、卡氮芥(BCNU)和環(huán)己亞硝脲(CCNU)、環(huán)磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、鏈脲菌素、絲裂霉素C以及順氯氨鉑(II)(DDP)、順鉑)、蒽環(huán)(例如，道諾紅菌素(之前為道諾霉素)和阿霉素)、抗生素(例如，放線菌素D(之前為放線菌素)、博來(lái)霉素、光神霉素、和氨茴霉素(AMC))、抗有絲分裂劑(例如，長(zhǎng)春新堿和長(zhǎng)春花堿)。用于將這些治療性部分偶聯(lián)至4元體的方法眾所周知，例如，參見(jiàn)Amon等人，"MonoclonalAntibodiesForImmunotargetingOfDrugsInCancerTherapy"，收錄于MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy，Reisfeld等人(編)，第243-56頁(yè)AlanR.Liss(1985);Hellstrom等人，"AntibodiesForDrugDelivery",收錄于ControlledDrugDelivery,第二版，Robinson等人編，第623-53頁(yè)MarcelDekker(1987);Thorpe,"AntibodyCarriersOfCytotoxicAgentsInCancerTherapy:AReview,，，收錄于MonoclonalAntibodies'84:BiologicalAndClinicalApplications，Pinchera等人編，第475-506頁(yè)(1985);"Analysis,Results，AndFutureProspectiveOfTheTherapeuticUseOfRadiolabeledAntibodyInCancerTherapy"，j]史錄于MonoclonalAntibodiesForCancerDetectionandTherapy,Baldwin等人，303-16頁(yè)，AcademicPress(1985);以及Thorpe等人，/附ww"o/Act62:119(1982)。可替代地，抗體可被結(jié)合至第二抗體，以形成異源偶聯(lián)抗體(heteroconjugate)。例如參見(jiàn)，美國(guó)專利4,676,980。本發(fā)明的偶聯(lián)物可用于改變特定的生物應(yīng)答，治療劑或藥物部分不應(yīng)解釋為僅限于經(jīng)典化學(xué)治療劑。例如，該藥物部分可以是具有所需生物活性的蛋白或多肽。這些蛋白可包括，例如，毒素，如相思子毒素、蓖麻毒素A、假單胞桿菌外毒素或白喉毒素；蛋白，例如腫瘤壞死因子，a-干擾素、P-干擾素、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、血小板衍生生長(zhǎng)因子、組織型纖溶酶原激活劑、凋亡劑(例如，TNF-a、TNF-p)、AIMI(參見(jiàn)，國(guó)際專利公布WO97/33899)、AIMII(參見(jiàn)，國(guó)際專利公布WO97/34911)、Fas配體(Takahashi等人，/ww,o/，6:1567(1994))、VEGI(參見(jiàn)，國(guó)際專利公布WO99/23105);血栓形成劑；抗血管生成劑，例如血管他丁或內(nèi)皮他??；或生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑，例如，淋巴因子、白介素-l("IL-r)、白介素-2("IL-2")、白介素-6("IL-6")、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子("GM-CSF")以及粒細(xì)胞集落刺激因子("G-CSF"))，或者其它的生長(zhǎng)因子。5.12基于抗體的基因療法在本發(fā)明的另一方面，包含編碼抗體或其功能性衍生物的序列的核酸被通過(guò)基因療法施用，以治療、抑制或預(yù)防與OX40的異常表達(dá)和/或活性相關(guān)的疾病或病癥?；虔煼ㄖ竿ㄟ^(guò)向個(gè)體施用表達(dá)的或可表達(dá)的核酸進(jìn)行的療法。在本發(fā)明的該實(shí)施方案中，核酸生成了它們編碼的蛋白，該蛋白介導(dǎo)治療性作用?，F(xiàn)有的任意基因治療方法均可用于本發(fā)明。以下描述示例性的方法。基因治療方法的一4殳綜述可參見(jiàn)Goldspiel等人，0/"/6'"/戶/^^附<3<^12:488(1993);Wu等人，傷oAerapy3:87(1991);Tolstoshev，v4w7P/wnnaco/7b;dco/32:573(1993);Mulligan，5We"ce260:926(1993);Morgan等人,7evSioc/ze附62:191(1993);May,7W￡C/H1:155(1993)。一方面，所述化合物包含了編碼抗體的核酸序列，所述核酸序列是在合適的宿主中表達(dá)所述抗體或其片段或嵌合蛋白或其重鏈或輕鏈的表達(dá)載體的一部分。特別地，這些核酸序列具有可操作地連接至抗體編碼區(qū)的啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子是可誘導(dǎo)型或?yàn)榻M成型，并任選地具有組織特異性。在另一具體實(shí)施方案中，所使用的核酸分子中抗體編碼序列和任意其它目標(biāo)序列凈皮促進(jìn)在基因組的所需位點(diǎn)上發(fā)生同源重組的區(qū)域所包夾，從而提供了抗體編碼核酸的染色體內(nèi)表達(dá)(Koller等人，乃"cAte/JomSc/L/X486:8932(1989);Zijlstra等人,胸鮮342:435(1989))。在具體實(shí)施方案中，表達(dá)的抗體分子為單鏈抗體；可替代地，核酸序列包含同時(shí)編碼抗體的重鏈和輕鏈或其片段的序列。核酸向患者的遞送可以是直接的，此時(shí)患者直接暴露至該核酸或核酸-攜帶載體；也可以是間接的，此時(shí)首先在體外以核酸轉(zhuǎn)化細(xì)胞，然后將細(xì)胞移植進(jìn)入患者。這兩種方法分別被稱為體內(nèi)或間接體內(nèi)基因療法。在具^(guò)本實(shí)施方案中，核酸序列被直接施用至體內(nèi)，在體內(nèi)該核酸序列將被表達(dá)以生成編碼產(chǎn)物。這可通過(guò)本領(lǐng)域已知的多種方法中的任意方法實(shí)現(xiàn)，例如，通過(guò)將其構(gòu)建為合適核酸表達(dá)載體的一部分，并通過(guò)例如缺陷逆轉(zhuǎn)錄病毒或減毒逆轉(zhuǎn)錄病毒或其它病毒載體的感染施用該載體，使序列進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)(參見(jiàn)美國(guó)專利4,980,286);或通過(guò)直接注射棵露DNA;或通過(guò)微粒轟擊(例如，基因槍法；Biolistic，Dupont);或以脂質(zhì)或細(xì)胞表面受體或轉(zhuǎn)染劑包覆，包封在脂質(zhì)體、微?；蛭⒛z嚢中；或通過(guò)將其與已知進(jìn)入細(xì)胞核的的肽相連接進(jìn)行施用；通過(guò)將其與受到受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用的配體相連接進(jìn)行施用(例如參見(jiàn)，Wu，etah，J祝o/C&w262:4429(1987))(其可用于耙向特異性表達(dá)該受體的細(xì)胞類型)等。在另一實(shí)施方案中，可形成核酸-配體復(fù)合物，其中該配體包含融合的病毒肽以破壞內(nèi)涵^本，使核酸避免溶酶^本降解。在另一實(shí)施方案中，該核酸可通過(guò)靶向特異性受體在體內(nèi)定向，從而進(jìn)行細(xì)胞特異性攝83取和表達(dá)(例如，參見(jiàn)PCT公開(kāi)WO92/06180;WO92/22635;WO92/20316;W093/14188,WO93/20221)?？商娲兀怂峥杀粚?dǎo)入胞內(nèi)，并通過(guò)同源重組被整合至該宿主細(xì)胞DNA中以進(jìn)行表達(dá)(Koller等人，戶rac/Va"Jem/園86:8932(1989);Zijlstra等人，淑臟342:435(1989))。在具體實(shí)施方案中，使用了包含編碼本發(fā)明抗體的核酸序列的病毒載體。例如，可使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(參見(jiàn)Miller等人，MeA五"^附o/217:581(1993))。這些逆轉(zhuǎn)錄載體包含正確包裝病毒基因組并整合進(jìn)入宿主細(xì)胞DNA所必需的成分。將在基因療法中使用的編碼抗體的核酸序列被克隆進(jìn)入一種或多種幫助基因遞送進(jìn)入患者的載體中。有關(guān)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的更多細(xì)節(jié)可參見(jiàn)Boesen等人，5/oAera;^6:291(1994),其描述了逆轉(zhuǎn)錄病毒載體遞送mdrl基因進(jìn)入造血干細(xì)胞，以使干細(xì)胞對(duì)化療更具耐受力的用途。其它闡述逆轉(zhuǎn)錄病毒在基因療法中的用途的參考文獻(xiàn)為Clowes等人，/C//"http://n'es/93:644(1994);Kiem等人，說(shuō)ood83:1467(1994);Salmons等人，T/ww"w(7ewe77zera;^4:129(1993);以及Grossman等人，CwrQp/"Ge"朋dDev3:110(1993)。腺病毒也可被用于本發(fā)明。腺病毒是本發(fā)明中用于向呼吸道上皮細(xì)胞遞送抗體的特別受人關(guān)注的運(yùn)載體。腺病毒天然感染呼吸道上皮細(xì)胞?；谙俨《镜倪f送系統(tǒng)的其它耙標(biāo)為肝、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)皮細(xì)胞和肌肉。月泉病毒具有能夠感染非分裂細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)。Kozarsky等人，Cw/rQp/wGewZ)ev3:499(1993)提供了基于腺病毒的基因療法的綜述。Bout等人，T7zera;^5:3(1994)證實(shí)了腺病毒載體在向恒河猴的呼吸道上皮細(xì)胞遞送基因中的用途。腺病毒在基因療法中的用途的其它例子可參見(jiàn)Rosenfeld等人，Sc/e"ce252:431(1991);Rosenfeld等人，Ce〃68:143(1992);Mastrangeli等人，JC/,'m/"vm/91:225(1993);PCT公開(kāi)W094/12649;Wang等人，rtera/^2:775(1995)。腺相關(guān)病毒(AAV)也已被提議用于基因療法(Walsh等人，PracSocExp編MW204:289(1993);美國(guó)專利5,436,146;6,632,670;和6,642,051)。基因療法的另一方法包括通過(guò)諸如電穿孔、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、磷酸釣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染或病毒感染等方法將基因轉(zhuǎn)移進(jìn)入組織培養(yǎng)中的細(xì)胞。轉(zhuǎn)移方法通常包括將可選擇標(biāo)記物轉(zhuǎn)移進(jìn)入該細(xì)胞。然后對(duì)該細(xì)胞進(jìn)行選擇，以分離那些攝取并表達(dá)轉(zhuǎn)移基因的細(xì)胞。這些細(xì)胞隨后被遞送進(jìn)入患者。在該實(shí)施方案中，核酸首先被導(dǎo)入細(xì)胞，隨后在體內(nèi)施用所得的重組細(xì)胞。該種導(dǎo)入可通過(guò)本領(lǐng)域任何已知的方法進(jìn)行，包括但不限于轉(zhuǎn)染、電穿孔、顯微注射、用包含核酸序列的病毒或噬菌體感染、細(xì)胞融合、染色體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移、微細(xì)胞介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移、原生質(zhì)球融合等。本領(lǐng)域中已知多種技術(shù)可用于將外源基因?qū)爰?xì)胞(例如，參見(jiàn)Loeffler等人，￡"z_ywo/217:599(1993);Cohen等人，M"/z五"矽mo/217:6]8(1993);Cline，P/ar附ac772er29:69(1985))，這些技術(shù)在受體細(xì)胞必要的發(fā)育和生理功能未被破壞的前提下可用于本發(fā)明。該技術(shù)應(yīng)能將核酸穩(wěn)定轉(zhuǎn)移至細(xì)胞，從而使核酸可被細(xì)胞表達(dá)，并優(yōu)選可被該細(xì)胞子代繼承和表達(dá)。所得的重組細(xì)胞可通過(guò)本領(lǐng)域已知的各種方法遞送至患者。重組血細(xì)胞(例如，造血干或祖細(xì)胞)優(yōu)選通過(guò)靜脈內(nèi)施用。預(yù)期使用的細(xì)胞的量取決于所需的效果、患者狀態(tài)等，并可由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。為基因治療目的導(dǎo)入核酸的細(xì)胞包括任意希望的、可獲取的細(xì)胞類型，并包括但不限于上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、角化細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、肝細(xì)胞；血細(xì)胞，如T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、巨核細(xì)胞、粒細(xì)胞；各種干細(xì)胞或祖細(xì)胞，尤其是造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞，例如，由骨髓、臍帶血、外周血、胎兒肝臟等獲得的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于基因療法的細(xì)胞與患者自體同源。編碼本發(fā)明的抗Zf本的核酸序列^皮導(dǎo)入細(xì)胞，從而使它們可^t細(xì)胞或其后代所表達(dá)，然后該重組細(xì)胞可被體內(nèi)施用以達(dá)到治療效果。在具體實(shí)施方案中，使用了干細(xì)胞或祖細(xì)胞?？杀环蛛x并在體外維持的任意干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞均潛在地可被用于本發(fā)明的該實(shí)施方案(例如，參見(jiàn)PCT公開(kāi)WO94/08598;Stemple等人，Cell71:973(1992);Rheinwald，Me,/Ce〃&o21A:229(1980);Pittelkow等人，M，C//mc/Voc61:771(1986))。6.實(shí)施例本發(fā)明可進(jìn)一步通過(guò)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案的如下實(shí)施例闡述，但應(yīng)理解這些實(shí)施例僅為闡述目的被包含在本文中，除非另行指明，無(wú)意限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1:人OX40/FC免疫原的制備兩種形式的OX40受體被用作免疫原以生成本發(fā)明的拮抗劑抗-OX40抗體。第一種是表達(dá)為融合蛋白的人OX40受體的可溶形式，該融合蛋白包含了人Fcyl和SEQIDNO:1的核苷酸殘基105至627編碼的胞外結(jié)構(gòu)域。第二種形式是基于細(xì)胞的免疫原，其包含了在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的小鼠纖維原細(xì)胞L-細(xì)胞表面表達(dá)的全長(zhǎng)OX40。OX40的可溶形式由從TCR-激活的人CD4T-細(xì)胞分離的OX40cDNA克隆而克隆得到。用于生成OX40cDNA克隆的兩種引物為(l)具有核苷酸序歹'Jcccaagctttaccccagcaacgaccggtgctgc(SEQIDNO:3)的含HindIII寸立,泉的正義引物，和(2)具有核苷酸序列cgcctcgaggacctccacgggccgggtgg(SEQIDNO:4)的含XhoI位點(diǎn)的與人Fql同框的反義引物。所得的540bpPCR片段被亞克隆進(jìn)入市售載體，該載體在5'端含有分泌信號(hào)肽序列，在3'端含有人FcYl序列(鉸鏈和恒定區(qū)CH2和CH3)。該構(gòu)建體的組成通過(guò)測(cè)序確定。為進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，采用Lipofectamine2000(Invitrogen，Carlsbad,CA)并參照制造商的方案將OX40/FcylDNA轉(zhuǎn)染進(jìn)入293T-細(xì)胞(Invitrogen，Carlsbad,CA)。轉(zhuǎn)染后72小時(shí)，從轉(zhuǎn)染的細(xì)胞采集培養(yǎng)上清液以進(jìn)行純化。同樣在293T-細(xì)胞系中建立OX40/Fcyl的穩(wěn)定表達(dá)。為了確認(rèn)表達(dá)，通過(guò)十二烷基^1酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析培養(yǎng)上清液。將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至硝基纖維素膜，并以辣根過(guò)氧化酶(HRP)偶聯(lián)的小鼠抗人IgG(Fc)單克隆抗體(Sigma，St.Louis，MO)檢測(cè)或用多克隆山羊抗-OX40抗體(R&DSystems，Minneapolis，MN)并以HRP-馬戶:I元-山羊IgG(JacksonImmunoResearchLaboratories,WestGrove,PA)檢測(cè)。免疫活性蛋白通過(guò)增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)(Pierce,Rockford，IL)在膜上鑒定。使用在磷酸鹽緩沖液(PBS)中平衡的蛋白-A親和柱(Invitrogen，Carlsbad,CA)純化OX40/Fcyl。將該細(xì)胞培養(yǎng)上清液加到柱上后，先后用大約20倍柱體積的PBS和SCC緩沖洗滌液(0.05M檸檬酸鈉，0.5M氯化鈉，pH6.0)洗滌樹(shù)脂，以去除未結(jié)合的蛋白。該OX40融合蛋白在以0.05M杵檬酸鈉、0.15M氯化鈉(pH3.0)洗脫后在PBS(pH7.0)中透析。通過(guò)SDS-PAGE分析來(lái)自親和柱的含OX40/Fcyl的組分。通過(guò)考馬斯亮藍(lán)染色分析該蛋白的純度，并采用上述山羊抗-人IgG(Fc)抗體(Sigma，StLouis，MO)和山羊抗-人OX40抗體(R&DSystems,Minneapolis,MN)通過(guò)Western免疫印跡鑒定該蛋白。第二種形式的免疫原采用由TCR-激活的人CD4T-細(xì)胞克隆的全長(zhǎng)人OX40cDNA進(jìn)行構(gòu)建。所用的兩種引物為具有核苷酸序列caccatgtgcgtgggggctcggcggctggg(SEQIDNO:5)和gatcttggccagggtggagtgggcgtcggcc(SEQIDNO:6)的OX40-特異性引物。所得的PCR產(chǎn)物被直接克隆進(jìn)入市售載體，并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染進(jìn)入小鼠L成纖維細(xì)胞，以表達(dá)高水平的0X40。在施用前，使用A型GammaCell1000Elite(MDSNordion，OttawaCanada)以6800Grays輻射該基于細(xì)胞的免疫原L-細(xì)胞，從而抑制該免疫原的增殖。實(shí)施例2:抗-OX40單克隆抗體的生成將大約20|ig的可溶OX40/Fcy1免疫原與弗氏佐劑(1:1)混合，并以7天間隔經(jīng)三次皮下注射后一次腹膜內(nèi)注射(無(wú)佐劑)施用至兩只六周大A/J小鼠(Harlan,Houston，Tex.)。最后一次注射三天后，根據(jù)下文Groth和ScheideggerC//附附w"o/Methods,1980)所述的方法將免疫小鼠的脾細(xì)胞與鼠骨髓瘤SP2/0細(xì)胞融合。對(duì)于基于細(xì)胞的免疫原，將3"06個(gè)經(jīng)y-輻射的OX40-穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的L-細(xì)胞以7天間隔經(jīng)三次皮下注射(于PBS中)后一次腹膜內(nèi)注射施用至六周大的A/J小鼠(Harlan，Houston,Tex.)。最后一次注射三天后，根據(jù)下文將免疫小鼠的脾細(xì)胞與鼠骨髓瘤SP2/0細(xì)胞融合。在導(dǎo)致抗-OX40mAb生成的融合中，由免疫小鼠的脾制備單細(xì)胞懸浮液，并采用合適的融合劑聚乙二醇(M.W.]450)(Kodak,Rochester,NY)和5%二甲亞砜(Sigma,StLouis,MO)與永生化Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞(以1:1的比例)融合，以形成雜交瘤纟田月包(Goding，MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice,AcademicPress,第59-103頁(yè)(1986)。IO天后，在合適的DMEM完全培養(yǎng)基中(Invitrogen，Carlsbad,CA)培養(yǎng)該雜交瘤細(xì)胞系，該培養(yǎng)基優(yōu)選包含次黃噤呤-氨基蝶呤-胸苷(HAT)，這是一種抑制未融合的、永生化細(xì)胞的生長(zhǎng)或存活的物質(zhì)。從2個(gè)融合實(shí)驗(yàn)得到24000個(gè)優(yōu)選永生化細(xì)胞系，這些細(xì)胞系有效融合，支持抗體的穩(wěn)定、高水平生產(chǎn)，并對(duì)HAT培養(yǎng)基敏感。實(shí)施例3:拮抗劑抗-OX-40抗體的篩選測(cè)定生長(zhǎng)雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)基中針對(duì)OX40的單克隆抗體(mAb)的生成。通過(guò)三種不同的方法測(cè)定雜交瘤生產(chǎn)的mAb的結(jié)合特異性FMAT、ELISA和流式細(xì)胞儀免疫測(cè)定。A.FMAT篩選使用FMAT方法，通過(guò)與OX40-瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的L-細(xì)胞、而非假的未轉(zhuǎn)染的L-細(xì)胞的強(qiáng)反應(yīng)性鑒定220個(gè)分泌小鼠抗-人OX40mAb的雜交瘤細(xì)胞系。抗-OX40雜交瘤懸浮液采用大共焦篩選平臺(tái)進(jìn)行FMAT篩選，以在96-孔微滴定板中對(duì)細(xì)胞數(shù)和熒光進(jìn)行成像和定量。將表達(dá)OX40抗原的L-細(xì)胞與5pl抗-OX40雜交瘤上清液孵育，并用在篩選緩沖液中稀釋至0.125嗎/ml的Cy-5-4禺聯(lián)的山羊4元-小鼠IgG-Fcy;f元體(JacksonLaboratories,PA)iiH亍熒光標(biāo)i己。在2小時(shí)后孵育后，使用FMAT8100HTS系統(tǒng)(AppliedBiosystem，CA)掃描該平板。在下文表1中的結(jié)果顯示克隆B24和B39具有與陽(yáng)性對(duì)照相當(dāng)?shù)幕钚?。B.ELISA篩選在4°C下用OX40/FcYl(5ng/微孔)或作為篩選對(duì)照的人Fcyl(25ng/微孔)涂覆聚氯乙烯96孔板(Nunc,Roskilde,Denmark)過(guò)夜，然后與含有2%BSA的PBS孵育一小時(shí)以封閉非特異性結(jié)合。添加大約50pl的雜交瘤懸浮液，并孵育1小時(shí)。用0.05%TWEEN-PBS洗滌四次后，在室溫下于1小時(shí)中添加大纟勺0.2(ig的HRP-山羊4元-小/艮IgGFey(JacksonImmunoResearchLaboratories，PA),以檢測(cè)結(jié)合的抗-OX40抗體的存在。向每個(gè)微孔添加100〖il的1mMTMB(Sigma)新鮮配制的底物溶液30分鐘，并通過(guò)添加50ml的0.2MH2S04終止反應(yīng)，并用酶標(biāo)儀(MolecularDevices,CA)在450nm讀板。在24000微孔中，有220個(gè)被FMAT和ELISA認(rèn)定為陽(yáng)性。代表性的數(shù)據(jù)報(bào)道于表1中。表1FL1(平均熒光)熒光細(xì)胞數(shù)OD柳克隆弁B245560393-4克隆弁B397665.3443.6陰性對(duì)照00NA陽(yáng)性對(duì)照5028.541NAC.流式細(xì)胞術(shù)篩選還使用OX40穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的L-細(xì)胞通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)試由FMAT和ELISA選出的220個(gè)陽(yáng)性雜交瘤，所述L-細(xì)胞用5[xl的抗-OX40雜交瘤上清液染色并用FITC-偶聯(lián)的山羊抗小鼠IgG-Fcy抗體(JacksonLaboratories,PA)熒光標(biāo)記。表2中顯示的數(shù)據(jù)表示采用抗-OX40雜交瘤上清液染色的總OX40-轉(zhuǎn)染的L-細(xì)胞的百分比。表2克隆^B2克隆#1317克隆存B36克隆#837%熒光細(xì)胞％熒光細(xì)胞％熒光細(xì)胞％焚光細(xì)胞L-細(xì)胞0.820.70.90.4OX40LL-細(xì)胞30.40.315.032.7從表1和2鑒定的220個(gè)抗-OX40單克隆抗體，B2、B24、B36、B37和B39號(hào)抗-OX40單克隆抗體克隆顯示了與OX40LL-細(xì)胞而非對(duì)未轉(zhuǎn)染的L-細(xì)胞的陽(yáng)性結(jié)合。B-17由于未顯示結(jié)合OX40LL-細(xì)胞而被排除。實(shí)施例4:拮抗劑抗-OX40單克隆抗體的初始表征當(dāng)鑒定了能夠生產(chǎn)特異性針對(duì)人OX40的抗體的220個(gè)雜交瘤后，克隆通過(guò)有限牙希#奪法進(jìn)4亍亞克隆并以標(biāo)準(zhǔn)方法培養(yǎng)(Goding，MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice,AcademicPress,第59-103頁(yè)(1986))。由亞克隆分泌的220種抗-OX40mAb采用蛋白A-瓊脂糖通過(guò)常規(guī)純化步驟從該培養(yǎng)基純化。A.細(xì)胞系制備采用特異性細(xì)胞系和新鮮分離的人初始CD4+T-細(xì)胞檢驗(yàn)OX40共刺激對(duì)人CD4+T-細(xì)胞發(fā)育的影響，以表征220個(gè)抗-OX40mAb結(jié)合劑。這些細(xì)胞系包括(1)0X40轉(zhuǎn)染的人Hut-78白血病CD4+T-細(xì)胞系，(2)OX40L-轉(zhuǎn)染的L纖維原細(xì)胞小鼠L-細(xì)胞及其親代細(xì)胞系(由M.D.AndersonCancerCenter,Houston,TX的Yong-JunLiu博士提供)，(3)人初始CD4+T-細(xì)胞，和(4)在人IL-4和GM-CSF存在下培養(yǎng)并由分離的CD14+單核細(xì)胞分化的人樹(shù)突細(xì)胞(DC)。從健康成年個(gè)體采集的血液的白細(xì)胞層組分被用作通過(guò)磁性耗竭(magneticdepletion)分離的人初始T-細(xì)胞的來(lái)源(CD4+、CD45RA+、CD45RO-和CD14-表型)；作為通過(guò)細(xì)胞分選分離的CDllc+樹(shù)突細(xì)胞(DC)的來(lái)源；或作為分化成為不成熟的DC的分離CD14+單核細(xì)胞的來(lái)源。B.功能測(cè)定1.Hut-78測(cè)定在經(jīng)輻射(6800cGray)的OX40L-轉(zhuǎn)染的L-細(xì)胞或未轉(zhuǎn)染的L-細(xì)胞的存在下，用5jig/ml抗-CD3(OKT3，BDBioscences，CA)和1jig/ml抗-CD28mAb(CD28.2，BDBioscences，CA)將OX40轉(zhuǎn)染的人Hut-78白血病CD4+T-細(xì)胞致敏48小時(shí)(OX40-Hut78細(xì)胞/L-細(xì)胞比例為4:1)。在測(cè)定開(kāi)始添加在實(shí)施例3中鑒定的220個(gè)抗-OX40mAb，以篩選拮抗性活性，該拮抗劑活性被定義為CD4+T-細(xì)胞細(xì)胞因子釋放的抑制。采用同樣的方案將該測(cè)定重復(fù)三次。在表3中總結(jié)的實(shí)驗(yàn)是三個(gè)代表性抗-OX40mAb(B66、B76和B86)的例子，并顯示在OX40L轉(zhuǎn)染的細(xì)胞存在下激活的T-細(xì)胞產(chǎn)成的IL-2(138pg/ml)和IL-13(620pg/ml)比未轉(zhuǎn)染的L-細(xì)胞存在下激活的T-細(xì)胞(IL-2為22pg/ml，而IL-13為70pg/ml)高至少10倍。添加在細(xì)胞培養(yǎng)物中的純化的抗-OX40mAbB66和B76以劑量應(yīng)答方式阻斷了Hut-78CD4+T-細(xì)胞系細(xì)胞因子生成?？寺66在最高濃度下抑制了88%的IL-2和92%的IL-13細(xì)胞因子生產(chǎn)。在所測(cè)試的220個(gè)抗-OX40mAb中，選擇了]0個(gè)顯示了對(duì)IL-2和IL-13細(xì)胞因子生成具有60%以上的抑制的克隆(數(shù)據(jù)未顯示)。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage92</column></row><table>C.初始CD4+T-細(xì)胞測(cè)定為了阻斷OX40對(duì)T-細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子生成的共刺激，對(duì)220個(gè)抗-OX40mAb抑制細(xì)胞因子生成、增殖和誘導(dǎo)人CD4十T-細(xì)胞凋亡的能力進(jìn)行功能性篩選。初始人CD4+T-細(xì)胞采用市售的初始CD4+T-細(xì)胞分離試劑盒(MiltenyiBiotec，Auburn，CA)從^:康成年志愿者(GulfCoastRegionalBloodCenter,Houston,TX)的人血液的白細(xì)胞層分離得到。分離的初始人004+丁-細(xì)胞用5(ig/mL抗畫(huà)CD3(OKT3，BDBiosciences,CA)和1fig/ml抗國(guó)CD28mAb(CD28.2，BDBiosciences,CA)在經(jīng)輻射的OX40L-轉(zhuǎn)染L-細(xì)胞或親代L-細(xì)胞的存在下(L-細(xì)胞/初始CD4+T-細(xì)胞的比例為1:4)激活。培養(yǎng)七天后，在OX40L轉(zhuǎn)染子存在下激活的初始CD4+T-細(xì)胞生成的IL-2和IL-13比L-細(xì)胞存在下致敏的細(xì)胞至少高10倍(圖2)。采用來(lái)自R&DSystems(Minneapolis,MN)的ELISA-試劑盒測(cè)定細(xì)胞因子生成的水平。細(xì)胞在OX40共刺激的存在下同樣增殖更多，如圖3所示。對(duì)于圖2和3:空心方框代表初始CD4;空心三角代表初始CD4+與對(duì)照L-細(xì)胞；實(shí)心三角代表B66與初始CD4+和OX40LL-細(xì)胞；實(shí)心方框代表2C4(同種型對(duì)照)與初始CD4+和OX40LL-細(xì)胞；而實(shí)心圓圈代表G3-519不相關(guān)mAb對(duì)照與初始CD4+和OX40L-L-細(xì)胞。向培養(yǎng)物中添加抗-OX40mAbB66抑制了細(xì)胞因子釋放(圖2)、細(xì)胞增殖(圖3)，且與2C4或G3-519對(duì)照相比，在CD4+T-細(xì)胞中以劑量依賴型方式誘導(dǎo)了凋亡(表4)。表4凋亡細(xì)胞(％)存活抑制(％)初始CD4+T-細(xì)胞+L-細(xì)胞21.922初始CD4+T-細(xì)胞+OX40LL-細(xì)胞11.0U初始CD4+T-細(xì)胞+OX40LL-細(xì)胞+B66(20嗎/ml)37.938初始CD4+T-細(xì)胞+OX40LL-細(xì)胞+A10(20iug/ml)32.332初始CD4+T-細(xì)胞+OX40LL-細(xì)胞+IC:G3-519(2011.712嗎/ml)實(shí)施例5:選定的拮抗劑抗-OX40mAb的進(jìn)一步表征細(xì)胞因子可以控制初始CD4+的分化，形成通過(guò)其細(xì)胞因子生成譜定義的T-細(xì)胞子集。IL-12推動(dòng)Thl細(xì)胞的分化，該細(xì)胞主要生成IFN-y和IL-2并控制細(xì)胞介導(dǎo)的免疫和炎癥前應(yīng)答。IL-4使初始CD4+T-細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化，該Th2細(xì)胞主要生成IL-4和IL-5并負(fù)責(zé)控制體液免疫和抗炎癥應(yīng)答。兩種由初始表征選定的抗-OX40mAb，A10和B66，均在Th1和Th2纟田胞中測(cè)試其阻斷增殖存活和細(xì)胞因子釋放的能力。為此，它們首先被轉(zhuǎn)化為包含鼠親代抗體可變區(qū)和人恒定區(qū)的嵌合形式。所有商業(yè)抗體和細(xì)胞因襲均從BDBiosciences，CA購(gòu)得。A.Thl測(cè)定人初始CD4+T-細(xì)胞按上文實(shí)施例4(B)(2)所述采用試劑盒從人血液的白細(xì)胞層分離得到。采用5嗎/ml抗-CD3(OKT3，1嗎/ml抗-CD28(CD28.2)和10嗎/ml抗-IL-4中和抗體(MP4-25D2)在添加了50ng/mlIL-12細(xì)胞因子的培養(yǎng)基中將細(xì)胞致敏7天，以誘導(dǎo)Thl-細(xì)胞因子生成譜。將該細(xì)胞與抗-CD3和抗-CD28mAb在經(jīng)輻射的OX40L-轉(zhuǎn)染的L-細(xì)胞或親代L-細(xì)胞的存在下(L-細(xì)胞/初始CD4+T-細(xì)胞比例為l:4)培養(yǎng)。由對(duì)膜連蛋白染色呈陽(yáng)性的CD4+細(xì)胞數(shù)量的減少可見(jiàn)，OX40共刺激提高了Thl效應(yīng)細(xì)胞的存活(表5)。在經(jīng)輻射的L-細(xì)胞共培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)添加嵌合抗-OX40mAbB66，抑制該種存活。OX40共刺激也提高IFN-y生成，且B66的添加以劑量依賴方式抑制其生成(表6)。表5Th存活(％)初始CD4+T-細(xì)胞十L-細(xì)胞52.6初始CD4+T-細(xì)胞+OX40LL-細(xì)胞65.9初始CD4+T-細(xì)胞+OX40LL-細(xì)胞+B66(0.2昭/ml)58.4初始CD4+T-細(xì)胞+OX40LL-細(xì)胞+B66(2嗎/ml)55.9初始CD4+T-細(xì)胞+OX40LL-細(xì)胞+B66(20pg/ml)53.2表6IFN-y濃度(pg/ml)SD(n:3)Thl細(xì)胞10280.2123.0Thl細(xì)胞+L-細(xì)胞10934.4267.7Thl細(xì)胞+OX40LL-細(xì)胞33040.4237.5Thl細(xì)月包+OX40LL-纟田月包+B66(0.2|ig/ml)17148.3234.6Thl細(xì)胞+OX40LL-細(xì)胞+B66(2|ig/ml)11049.3141.7Thl細(xì)胞+OX40LL-細(xì)胞+B66(20嗎/ml)11540.651.6B.Th2測(cè)定參照上文所述分離人初始CD4+T-細(xì)胞。采用5(ig/ml抗-CD3、1pg/ml抗-CD28和10(ig/ml抗-IFN-y中和抗體在添加了50ng/mlIL-4細(xì)胞因子的培養(yǎng)基中將細(xì)胞致敏7天，以誘導(dǎo)Tht細(xì)胞因子生產(chǎn)譜。將該細(xì)胞與抗-CD3和抗-CD28mAb在經(jīng)輻射的OX40L-轉(zhuǎn)染的L-細(xì)胞或親代L-細(xì)胞的存在下(L-細(xì)胞/初始CD4+T-細(xì)胞比例為l:4)培養(yǎng)。由對(duì)膜連蛋白染色呈陽(yáng)性的CD4+細(xì)胞數(shù)量的降低可見(jiàn)，OX40共刺激提高了Th2效應(yīng)細(xì)胞的存活(圖4)。在經(jīng)輻射的L-細(xì)胞共培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)，添加抗-OX40mAbAl0和B66抑制該種存活(圖4)，并以劑量依賴方式抑制Th2細(xì)胞增殖(圖5)以及IL-2(圖6A)和IL-13(圖6B)的細(xì)^^因子生成。C.Thl7測(cè)定在IL-23存在下致敏的T-細(xì)胞的獨(dú)特子集表征為生成IL-17，并關(guān)鍵性地參與某些慢性炎癥疾病的發(fā)病機(jī)理。最近的數(shù)據(jù)顯示Th17細(xì)胞代表了早期自Thl和Th2系分出的CD4+T-細(xì)胞的完全分離的細(xì)胞系，并被支配Thl和Th295細(xì)胞的發(fā)育的細(xì)胞因子和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑所拮抗。Thl7T-細(xì)胞被致敏以研究OX40共刺激的作用和拮抗性抗-OX40mAb抑制Thl7分化的能力。初始CD4+T-細(xì)胞參照實(shí)施例4(B)(2)所述從白細(xì)胞層分離。在100ng/mlIL-23細(xì)胞因子(R&D，Minneapolis，畫(huà))、ML-6和hTGF卩l(xiāng)各20ng/m1、5(ig/ml預(yù)涂覆的抗-CD3(OKT3，BDBiosciences,CA)、1(ig/ml可溶抗-CD28(CD28.2)、抗-IL4(MP4-25D2)以及抗-IFN-y(B27)各10嗎/ml的存在下將這些細(xì)胞致敏7天。洗滌經(jīng)致敏的細(xì)胞，并將其與抗-CD3和抗-CD28mAb在經(jīng)輻射的OX40L-轉(zhuǎn)染的L-細(xì)胞或親代L-細(xì)胞的存在下(L-細(xì)胞/初始CD4+T-細(xì)胞比例為l:4)再傳代培養(yǎng)3天。通過(guò)以O(shè)X40L-L-細(xì)胞誘導(dǎo)OX40共刺激，Thl7細(xì)胞相比于無(wú)OX40L共刺激下培養(yǎng)的相同細(xì)胞增殖4倍?？?OX40mAbA10和B66以劑量依賴方式抑制Thl7增殖(表7)。表7CMP平均±SD(n:3)Thl7細(xì)胞+L-細(xì)胞180922592.6Thl7細(xì)月包+OX40LL-細(xì)月包66035.72106.2Th17纟田月包+OX40LL-細(xì)胞+同種型對(duì)照(20|ag/ml)70176.73080.8Thl7纟田月包+OX40LL-細(xì)胞+A10(0.2嗎/ml)70176.77622.6ThH纟田胞+OX40LL-細(xì)胞+A10(2嗎/ml)40347.78059.5Thl7細(xì)胞+OX40LL-細(xì)胞+A10(20嗎/ml)17456.7563.9Thl7細(xì)胞+OX40LL-細(xì)胞+B66(0.2嗎/ml)46735.310667.1Thl7纟田月包+OX40LL-細(xì)月包+B66(2pg/ml)31658.05492.6Thl7細(xì)胞+OX40LL-細(xì)胞+B66(20嗎/ml)18336.3956.4表8的數(shù)據(jù)顯示了OX40L明顯增加Th-17存活(68%對(duì)84%)。增加的存活被抗-OX40mAbA10和B66以劑量依賴方式抑制(表8)。表8Th-17存活(％)Thl7細(xì)胞+L-細(xì)胞68.4Thl7細(xì)胞+OX40LL-細(xì)胞Thl7細(xì)胞+OX40LL-細(xì)胞+同種型對(duì)照(20|ig/ml)84.3Thl7纟田月包+OX40LL-細(xì)胞+A10(0.2(ig/ml)80.7Thl7纟田月包十OX40LL-細(xì)月包+A10(2(xg/ml)72.3Thl7纟田月包+OX40LL-細(xì)胞+A10(20(xg/ml)70.7Thl7細(xì)胞+OX40LL-細(xì)胞+B66(0.2嗎/ml)77.0Th7纟田月包+OX40LL-纟田月包+B66(2pg/ml)74.1Th17細(xì)月包+OX40LL-纟田月包+B66(20嗎/ml)67.3通過(guò)評(píng)估蛋白存活素(Survivin)(—種凋亡抑制劑和OX40蛋白的潛在靶標(biāo))的胞內(nèi)表達(dá)，OX40刺激增加了它的表達(dá)。該增加的表達(dá)被抗-OX40mAbA10和B66以劑量依賴方式抑制(表9)。表9存活素表達(dá)(％)Thl7細(xì)胞+L-細(xì)胞19.2Thl7細(xì)胞+OX40LL-細(xì)胞49.0Thl7細(xì)胞+OX40LL-細(xì)胞+同種型對(duì)照(20嗎/ml)45.4Thl7細(xì)胞+OX40LL-細(xì)胞+A10(0.2嗎/ml)34.3Thl7纟田月包+OX40LL-細(xì)胞+A10(2(ig/ml)22.8Thl7細(xì)胞+OX40LL-細(xì)胞+A10(20嗎/ml)15.4Thl7細(xì)月包+OX40LL-纟田月包+B66(0.2|ig/ml)45.2Thl7細(xì)胞+OX40LL-細(xì)胞+B66(2(ig/ml)28.3Thl7細(xì)胞+OX40LL-細(xì)胞+B66(20嗎/ml)20.3與Thl致敏細(xì)胞相比，TH17細(xì)胞在致敏初始CD4+T-細(xì)胞7天后顯示了明顯更高的IL-17水平。在對(duì)Thl7與經(jīng)輻射的OX40L轉(zhuǎn)染的L-細(xì)胞或親代L-細(xì)胞進(jìn)行了額外的共培養(yǎng)后，與Thl致敏細(xì)胞相比，Thl7細(xì)胞在OX40共刺激下生成了顯著水平的IL-17。與同種型對(duì)照G3-519(IC)相比，該IL17生成被嵌合抗-OX40mAbA10和B66以劑量依賴方式抑制(表10)。表10TH-17TH-11L-17濃度SDIL-17濃度SD(pg/ml)(n:3)(pg/ml)(n:3)CD4+細(xì)胞+L-細(xì)胞微741.129.85.4CD4+細(xì)胞/OX40LL-細(xì)胞2264.140.820.54.7CD4+細(xì)胞/OX40LL-細(xì)胞+IC(20嗎/ml)2032.790.056.110.7CD4+細(xì)胞/OX40LL-細(xì)胞+A10(0.2嗎/ml)2054.6254.041.48.4CD4+細(xì)胞/OX40LL-細(xì)胞+A10(2嗎/ml)1795.1304.639.39.4CD4+細(xì)胞/OX40LL-細(xì)胞+A10(20嗎/ml)1059.9448.654.15.7CD4+細(xì)胞/OX40LL-細(xì)胞+B66(0.2嗎/ml)2296.356.856.65.8CD4+細(xì)胞/OX40LL-細(xì)胞+B66(2嗎/ml)1144.0224.563.13.7CD4+細(xì)胞/OX40LL-細(xì)胞+B66(20嗎/ml)1069.5224.571.56.9D.L106比較采用實(shí)施例4(B)(2)中相同的方案，將抗-OX40mAbA10和B66在OX40共刺激存在下抑制激活的人CD4+T-細(xì)胞釋放細(xì)胞因子IL-2和IL-13的能力與市售的抗-OX40抗體L106(BDBioscience，SanJose，CA)進(jìn)行比較。LI06對(duì)細(xì)胞因子生成的抑制與對(duì)照抗體并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(參見(jiàn)圖7)。因此，該抗體表現(xiàn)為非功能性的(即，沒(méi)有激動(dòng)或拮抗活性)。實(shí)施例6:抗-OX40mAb的人源化鼠mAbA10和B66的重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VO的核酸序列顯示在圖14A-D中。圖12提供了鼠抗體的輕鏈可變區(qū)(來(lái)自于252-B66和252-A10的DNA序列)的氨基酸序列與選定的人輕鏈模板的比較。兩種抗體均可作為OX40拮抗劑并彼此竟?fàn)?。將這些序列與公共數(shù)據(jù)庫(kù)中可獲取的人抗體種系序列進(jìn)行比較。在決定模板時(shí)使用多種標(biāo)準(zhǔn)，包括總體長(zhǎng)度、框內(nèi)類似的CDR位置、總體同源性、CDR的大小等。所有這些標(biāo)準(zhǔn)共同提供了最佳人模板，如圖12A和圖12B中圖示的A10和B66mAb重鏈和輕《連序列與相應(yīng)人模板序列的序列比對(duì)所顯示的。噬菌體載體中的嵌合Fab被構(gòu)建為對(duì)照，其組合了鼠A10的可變區(qū)和人K鏈的恒定區(qū)和人IgG的CH1部分。在該情況下，一個(gè)以上的人框架模板被用于設(shè)計(jì)該抗體。為VH鏈選擇的人模板是亞組VI的IGHVl-46(GeneBank錄入號(hào)X92343)和種系IGHJ4(GeneBank錄入號(hào)J00256)的組合(參見(jiàn)圖12B)。為VL鏈選擇的人模板是IGKV4-l(GeneBank錄入號(hào)Z00023)和種系J模板IGHJl(GeneBank錄入號(hào)J00242)的組合(參見(jiàn)圖12A)。圖12B^是供了鼠抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序歹'J(來(lái)自于DNA序列)，其與選定的人種系模板和A10(TH)hu336F的人源化可變區(qū)序列的比對(duì)。氨基酸序列的編號(hào)可參照Kabat方法進(jìn)行。來(lái)自于A10的鼠CDR被嫁接至人可變框架。在該序列中，在該框架中的氨基酸殘基的總數(shù)為87;在該人和鼠框架之間不同的氨基酸殘基的總數(shù)為21，在人源化重鏈的框架中未殘留鼠源殘基。序列比較揭示鼠抗體B66在可變序列中僅有4個(gè)氨基酸不同于AIO，但上文實(shí)施例4中討論的功能分析顯示了B66具有更高的OX40結(jié)合和拮抗劑活性。B66中的兩個(gè)氨基酸變化位于該第一CDR,并自小鼠種系序列改變。據(jù)推測(cè)這些變化可能導(dǎo)致了B66的增強(qiáng)的活性。然而，當(dāng)來(lái)自這些抗體的CDR#1嫁接至人可變框架時(shí)，B66分泌極少，且因此相對(duì)不適于進(jìn)一步開(kāi)發(fā)。因此，B66的CDRL1和A10的CDR12和CDR13被選擇嫁接至人可變模板上，以制備人源化抗-OX40拮抗劑。通過(guò)該方法，人源化A10分子的結(jié)合親和性和拮抗劑活性相對(duì)于親代鼠抗體被提高了。A.通過(guò)BiaCore對(duì)抗-OX40Fab進(jìn)行的動(dòng)力學(xué)分析圖13顯示了生成的分子相比于原始鼠分子的OX40結(jié)合活性。CDRL1同樣被突變，以反映A10的原始CDRL1序列。以B66的CDRL1替換A10的CDRL1導(dǎo)致"人源化"AIO分子A10(TH)hu336F增高的結(jié)合活性。圖15顯示了人源化克隆A10(TH)hu336F、鼠A10及其嵌合形式對(duì)OX40的竟?fàn)幭喈?dāng)。99實(shí)施例7:A10(TH)HU336F的人源化變體的表征通過(guò)結(jié)合ELISA、基于細(xì)胞的結(jié)合測(cè)定和顯示拮抗活性的進(jìn)一步的功能測(cè)定對(duì)人源化A10候選物A10(TH)hu336F的六種變體進(jìn)行篩選。對(duì)6種人源化A10的兩種(變體A10-D和F)進(jìn)行了六種功能性測(cè)定。上述的人源化可變區(qū)被克隆進(jìn)入哺乳動(dòng)物表達(dá)載體，使得該人源化可變區(qū)與人恒定區(qū)在表達(dá)時(shí)框內(nèi)融合。其它的人源化候選物也被克隆進(jìn)入哺乳動(dòng)物表達(dá)載體，以制備全抗體進(jìn)行測(cè)試。這些其它的候選物包括具有原始A10CDRL1的人源化A10VL區(qū)(A&D)，Kabat編號(hào)34由精氨酸(N)改變?yōu)榻M氨酸(H)的人源化A10VL區(qū)(B&E)(該變體的CDR-L1包含氨基酸序列KASQTVDYDGDSYMH(SEQIDNO:61)),以及在序列編號(hào)70包含鼠源亮氨酸(L)的替代性人源化VH區(qū)(A10L70)(Kabat編號(hào)69)?？贵w以表11中所示的組合在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。表12顯示了相應(yīng)的Biacore數(shù)據(jù)。這些人源化候選物的可變區(qū)以及鼠可變區(qū)的核酸序列顯示于圖14中。表11全抗體名稱K可變候選物重鏈可變候選物AAIOLC(SH)，AlOL70BAIOLC(SN)A10L70CA10LC(TH)hu336AlOL70DAlOLC(SH)AlO人源化EAIOLC(SN)AlO人源化FA10LC(TH)hu336AlO人源化表12樣本ZCZ)[nM]何M-ls-l]SE(&)人y[s-l]SE(關(guān)X2A1.381.31e54521.79e-47.44e-70.257B0.941.70e5355.56e-46.50e-70.524C1.441.16e54831.51e-48.28e-70.352D1.211.40e55081.70e-48.55e-70,319E1.251.51e53911.91e-48.48e-70.395100Fl.21.4e54741.58e-47.53e-70.267A.TCR-激活的初始CD4+T-細(xì)胞測(cè)定根據(jù)上文實(shí)施例4(B)(2)所述的相同方案激活初始CD4+T-細(xì)胞。培養(yǎng)七天后，在OX40L存在下激活的初始CD4+T-細(xì)胞比L-細(xì)胞存在下致敏的細(xì)胞生成的IL-2、IL5和IL-13至少高10倍，且更為明顯地增殖(圖8)。與同種型對(duì)照相比，人源化變體A10-D和A10-F以與A10的鼠源親代和嵌合形式相同的水平抑制細(xì)胞因子(IL-2/IL-5/IL-13)釋放和CD4+T-細(xì)胞增殖(圖8)。B.致壽文T-細(xì)胞測(cè)定在經(jīng)輻射的OX40L轉(zhuǎn)染的L-細(xì)胞或親代L-細(xì)胞存在下測(cè)試人源化變體A10-D和A10-F的拮抗活性，對(duì)Thl致敏的T-細(xì)胞、Th2致敏的T-細(xì)胞和Thl7細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子釋放的抑制(參見(jiàn)實(shí)施例5的方案)。在Thl條件下，與該同種型對(duì)照相比，人源化變體A10-D和A10-F以與嵌合(CC-A10)和親代小鼠(M-A10)mAb相同的程度抑制IL-2、IL-5和IL-13細(xì)胞因子的生成和細(xì)胞增殖(圖9)。在Th2條件下，人源化變體A10-D和A10-F通過(guò)抑制激活的CD4+T-細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子釋放(IL-2、IL-5和IL-13)顯示了對(duì)激活的CD4+T-細(xì)胞的拮抗作用。(圖10)。人源化變體A10-D和A10-F還與它們的嵌合和小鼠抗-OX40mAb進(jìn)行平行測(cè)試，以比較它們對(duì)Th17細(xì)胞增殖、IL-17細(xì)胞因子生成和細(xì)胞凋亡的拮抗活性。結(jié)果顯示于表13中。表13增殖1L-17GM-CSF(CPM)士SD(pg/ml)±SD(pg/ml)±SD101<table>tableseeoriginaldocumentpage102</column></row><table>通過(guò)以流式細(xì)胞術(shù)和膜連蛋白-V染色鑒定凋亡細(xì)胞，表12中所示的數(shù)據(jù)顯示了OX40L顯著增加了Thl7凋亡，而人源化變體A10-D和A10-F與同種型對(duì)照G3-519處理(IC)相比以劑量依賴方式增加了凋亡(表14)。表14TH17存活(％)Thl7十L-細(xì)胞20.4Th17+OX40L-L-細(xì)胞____39.2Thl7+OX40L-L-細(xì)胞+A10-D(0.3嗎/ml)49.6Thl7+OX40L-L-細(xì)胞+A10-D(3嗎/ml)18.0Th17+OX40L-L-細(xì)胞+A10-D(30嗎/ml)22.3__Th17+OX40L-L-細(xì)胞+lC(0.3|ig/ml)46.6Thl7+OX40L-L-細(xì)胞+IC(3Mg/ml)47.1Thl7+OX40L-L-細(xì)胞+IC(30嗎/ml)44.8C.Th2/TSLP-DCCD11c+樹(shù)突細(xì)胞(DC)從健康成年志愿者的血液的白細(xì)胞層分離。采用針對(duì)種系標(biāo)記物CD3(OKT3)、CD14(M5E2)、CD15(HB78)、CD20(L27)、CD56(B159)和CD235a(10F7MN)的mAb的混合物通過(guò)陰性免疫選擇從PBMC獲得DC-富集群體。將該群體通過(guò)山羊抗-小鼠IgG-涂覆的磁性珠(M-450;MiltenyiBiotec;CA)以去除結(jié)合的細(xì)胞。CD11c+系和C:D4+細(xì)胞通過(guò)FACSAria(使用別藻藍(lán)蛋白(APC)-標(biāo)記的抗-CDlie(B-ly6)、FITC-標(biāo)記的mAbCD]9(HIB19)和CD56(NCAM16.2)的混合物以及APC-Cy7-標(biāo)記的CD4(RPA-T4)分離，以達(dá)到>99%的純度。將CDllc+DC培養(yǎng)在含2%人AB血清的Yssd培養(yǎng)基(GeminiBio-Products，Woodland,CA)中。將細(xì)胞以2x105細(xì)胞/200ml培養(yǎng)基的密度接種于存在15ng/mlTSLP(重組人TSLP由M.D.AndersonCancerCenter的Yun-JunLiu博士慷慨贈(zèng)與)的平底96-孔板培養(yǎng)基中，孵育24小時(shí)。同種異體的CD4+CD45RA+初始丁-細(xì)胞(純度>99%)采用細(xì)胞分離試劑盒II(MiltenyiBiotec,CA)分離，隨后進(jìn)行細(xì)胞分選(作為CD4+CD45RA+CD45RO-CD25—組分)。將細(xì)胞與洗過(guò)的TSLP-刺激的脊髓樹(shù)突細(xì)月包(mDC)(DC/T-細(xì)胞比例，l:5)在圓底96-孔培養(yǎng)板共培養(yǎng)7天。以mDC刺激一個(gè)周期后(7天)，采集并洗滌致敏的CD4+T-細(xì)胞。為了在培養(yǎng)上清液中檢測(cè)細(xì)胞因子生成，用平板結(jié)合的5pg/ml抗-CD3和1pg/ml可溶抗-CD28在106纟田月包/ml的濃度下重新刺激T-細(xì)胞48小時(shí)。通過(guò)ELSIA測(cè)定IL-5、IL-13和TNF-a的水平。與同種型對(duì)照抗體相比，以TSLP-激活的脊髓DC致敏的Th2細(xì)胞的細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子生成在人源化變體A10-F的存在下受到抑制(表15)。表15增殖IL-5IL-13TNF-a(CPM)士SD(pg/ml)±SD(pg/ml)±SD(pg/ml)±SDTh22745±31000Th2+TSLP-DC____195546士170342188士5605107±934456土50Th2+TSLP-DC+AT0-F(0.1295335土137lS~2109±811973士289174±14(ig/ml)Th2+TSLP-DC+A10-F(6|ig/ml)70750±19116509±931943±6895±8103Th2+TSLP-DC+A10-F(6056792±2993384±1331728±24393±75嗎/ml)_____^_Th2+TSLP陽(yáng)DC+IC(0.12嗎/ml)19176±11838327U6525341±1184543±59Th2+TSLP-DC+IC-F(6嗎/ml)2H124士163701885±2814887士673392±36Th2+TSLP-DC+lC(12(ig/ml)213641±143032261±1165632扁土356471±75為了胞內(nèi)細(xì)胞因子生成，用50ng/mlPMA加上2(ig/ml離子霉素刺激致敏的CD4+T-細(xì)胞6小時(shí)。在最后2小時(shí)中添加10(ig/ml的brefeldinA(eBioscience，SanDiego,CA)。用針對(duì)IL-2和IL-13的PE-標(biāo)記的mAb與FITC-標(biāo)記的抗IFN-y或抗-TNF-a的組合使用固定和透化緩沖液(eBioscience，CA)將該細(xì)胞染色。與同種型對(duì)照抗體相比，在人源化變體A10-F的存在下，以TSLP-激活的脊髓DC致敏的Th2細(xì)胞中IL-2、IL-13和TNF-a細(xì)胞因子的生成受到抑制(表16)。表16IL陽(yáng)2IL-13%熒光細(xì)胞%熒光細(xì)胞%焚光細(xì)胞Th2NANANATh2+TSLP-DC711144Th2+TSLP-DC+A10-F(0.12ng/ml)631031Th2+TSLP-DC+A10-F(6昭/ml)57530Th2+TSLP-DC+A10陽(yáng)F(60^g/ml)57528Th2+TSLP-DC+lC(0.12嗎/ml)721553Th2+TSLP-DC+IC(6嗎/ml)731354Th2+TSLP-DC+IC(60嗎/ml)691649OX40共刺激提高了致敏Th2細(xì)胞的存活，這顯示為以膜連蛋白染色的CD4+細(xì)胞數(shù)量的減少和具有胞內(nèi)存活素蛋白表達(dá)的CD4+細(xì)胞數(shù)量的上升。然而，向該細(xì)胞培養(yǎng)物中添加人源化變體A10-F誘導(dǎo)了凋亡的顯著上升和存活素的表達(dá)減少(表17)。表17膜連蛋白染色(％)存活素(％)Th2NANATh2+TSLP-DC1290Th2+TSLP-DC+A10-F(0.12嗎/ml)Th2+TSLP-DC+A10-F(6嗎/ml)Th2+TSLP-DC+A10-F(60嗎/ml)242935867670Th2+TSLP-DC+lC(0.12|ig/ml)Th2+TSLP-DC+IC-F(6嗎/ml)Th2+TSLP-DC+lC(12嗎/ml)141414908690D.Thl/LPS-DC方案為了分析T-細(xì)胞針對(duì)Thl特征的分化，將初始CD4T-細(xì)胞與經(jīng)LPS刺激的同種異體單核細(xì)胞衍生的DC共培養(yǎng)24小時(shí)。通過(guò)本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)方案從人PBMC生成DC。收獲該低密度PBMC，并采用CD14-微珠和AutoMacs設(shè)備(MiltenyiBiotec，Auburn，CA)陽(yáng)性選擇CD14+細(xì)胞。為了誘導(dǎo)DC分化，將106細(xì)胞/ml的CD14+單核細(xì)胞在含有5001U/ml人rGM-CSF(R&DSystems,畫(huà))和400IU/ml人rIL-4(R&DSystems，MN)的完全培養(yǎng)基(RPMI-10%FBS)中在37°C下和5%C02中培養(yǎng)。在第2或3天，向DC培養(yǎng)物中添加額外劑量的GM-CSF和IL-4。在第5天，通過(guò)輕柔吹吸收獲非貼壁DC，并以1嗎/mlLPS(Siyna-Aldrich,MO)重新培養(yǎng)。收獲LPS-激活的DC，洗滌，并用于將初始CD4T-細(xì)胞致敏為T(mén)h-1分化的T-細(xì)胞。將該細(xì)胞以1:4的DC/T-細(xì)胞比例培養(yǎng)于96-孔板中。同樣測(cè)試人源化變體A10-D和A10-F的拮抗活性；以及抑制Thl致敏的T-細(xì)胞在LPS-激活的DC存在下的增殖和細(xì)胞因子生產(chǎn)的能力。與同種型對(duì)照相比，人源化變體A10-D和F以與嵌合(CC-A10)和小鼠(M-A10)變體mAb相同的程度抑制IL-2、IFN-y和TNF-a細(xì)胞因子的生成和細(xì)胞增殖的程度(圖11)。對(duì)細(xì)胞增殖以及IFN-y和TNF-a細(xì)胞因子生產(chǎn)的抑制并不完全，因?yàn)長(zhǎng)PS-激活的DC可提供OX40以外的其它共刺激信號(hào)。E.交叉反應(yīng)性測(cè)定105根據(jù)公開(kāi)文獻(xiàn)，人和小鼠OX40蛋白被認(rèn)為具有較低的同源性。與此一致，和同種型對(duì)照(IC:2C4)相比，在ELISA平臺(tái)中，嵌合A10和B66對(duì)小鼠OX40蛋白并未顯示任何交叉反應(yīng)性(表18)。表18OD450B66A0IC(2C4)抗-小鼠OX40Ab小鼠OX40Fc(ng/ml)03.962.52500.1340.0340.0390.0450.0250.040.0350.0350.0350.0460.0780.2940.0512.4864.04.0人OX40Fc(ng/ml)03.962.52500.021.2252.8593.3770.0191.3082.5862.8320.020.0310.0270.030.0260.0470.0460.083因此，采用流式細(xì)胞染色以在臨床前動(dòng)物模型設(shè)置中測(cè)試抗-OX40mAb從而測(cè)定它們是否與猴OX40蛋白交叉反應(yīng)。采用CD4微珠(MiltenyiBiotec，Auburn，CA)將總CD4+T-細(xì)胞從恒河猴和短尾猴的總血液和從人白細(xì)胞層分離。采用5嗎/ml的預(yù)涂覆抗-CD3mAb(SP34，能夠與人以及恒河猴和短尾猴兩種物種的CD3蛋白交叉反應(yīng))和1|ig/ml可溶抗-CD28mAb(CD28.2，能夠與人以及恒河猴和短尾猴兩種物種的CD28蛋白交叉反應(yīng))將分離的細(xì)胞激活2天。使用與猴以及人CD4(L200)和CD25(M-A251)蛋白交叉反應(yīng)的抗體對(duì)細(xì)胞進(jìn)行表面染色。對(duì)于OX40細(xì)胞表面表達(dá)，采用與PE偶聯(lián)的人源化A10-FOX40mAb。數(shù)據(jù)分析顯示A10-F容易地識(shí)別人、恒河猴和短尾猴激活的CD4T-細(xì)胞(表19)。表19激活的CD4+T-細(xì)胞識(shí)別％人70短尾猴88恒河猴75實(shí)施例8:表4立定寸立A10(TH)hu336F結(jié)合的OX40表位采用兩種標(biāo)準(zhǔn)的表位定位方法(酵母表面展示和嵌合分子的構(gòu)建)進(jìn)行定位。在酵母表位展示中，OX40的胞外結(jié)構(gòu)域在釀酒酵母中作為能夠4皮分泌并在酵母表面展示的融合蛋白進(jìn)行表達(dá)。OX40表達(dá)載體的隨機(jī)突變?cè)试SOX40突變體蛋白庫(kù)在酵母表面表達(dá)。表達(dá)不能結(jié)合OX40的蛋白的突變體(通過(guò)C-末端標(biāo)記的存在進(jìn)行測(cè)定)采用熒光抗體染色并通過(guò)FACS分離。突變體表達(dá)質(zhì)粒從援救酵母(rescuedyeast)分離和測(cè)序，以確定A10(TH)hu336F-OX40結(jié)合需要哪個(gè)氨基酸殘基。第二種表位定位方法依賴于以下發(fā)現(xiàn)A10(TH)hu336F結(jié)合人而非鼠OX40。構(gòu)建嵌合OX40分子，其中人OX40區(qū)域被鼠OX40的同源區(qū)替換。該嵌合分子在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面上表達(dá)，并通過(guò)FACS監(jiān)測(cè)其與熒光標(biāo)記的A10(TH)hu336F的結(jié)合。該OX40結(jié)合表位可通過(guò)分析A10(TH)hu336F結(jié)合需要人OX40的哪些區(qū)域進(jìn)行確定。本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過(guò)不超越常規(guī)實(shí)驗(yàn)以外的方法認(rèn)識(shí)或者能夠確定本文所述的本發(fā)明的具體實(shí)施方案的眾多等同方式。本發(fā)明的權(quán)利要求意在包含這些等同方式。10權(quán)利要求1.特異性結(jié)合人OX40表位的分離的拮抗劑抗體，所述抗體包含a.重鏈可變區(qū)(VH)，其包含i.具有SEQIDNO17的氨基酸序列的VHCDR1；ii.具有SEQIDNO18的氨基酸序列的VHCDR2；和/或iii.具有SEQIDNO19的氨基酸序列的VHCDR3；和/或b.輕鏈可變區(qū)(VL)，其包含i.具有SEQIDNO12、15或61的氨基酸序列的VLCDR1；ii.具有SEQIDNO13的氨基酸序列的VLCDR2；和/或iii.具有SEQIDNO14或16的氨基酸序列的VLCDR3。2.如權(quán)利要求1所述的抗體，其中所述抗體包含a.重鏈可變區(qū)(VH),其包含i.具有SEQIDNO:17的氨基酸序列的VHCDRl;ii.具有SEQIDNO:18的氨基酸序列的VHCDR2;和iii.具有SEQIDNO:19的氨基酸序列的VHCDR3;和/或b.輕鏈可變區(qū)(VL)，其包含i.具有SEQIDNO:12的氨基酸序列的VLCDRl;ii.具有SEQIDNO:13的氨基酸序列的VLCDR2;和iii.具有SEQIDNO:14的氨基酸序列的VLCDR3。3.如權(quán)利要求l所述的抗體，其中所述抗體包含a.重鏈可變區(qū)(VH)，其包含<formula>formulaseeoriginaldocumentpage0</formula>4.i.具有SEQIDNO:15的氨基酸序列的VLCDR1;5.ii.具有SEQIDNO:13的氨基酸序列的VLCDR2;以及具有SEQIDNO:16的氨基酸的VLCDR3。6.如權(quán)利要求l所述的抗體，其中所述抗體包含a.具有SEQIDNO:10或11任意一個(gè)所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)(VH);和/或b.具有SEQIDNO:7、8或9任意一個(gè)所示氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)(VL)。7.如權(quán)利要求l所述的抗體，其中所述抗體包含a.由SEQIDNO:25、26或27任意一個(gè)核酸序列所編碼的重鏈可變區(qū)(VH);和/或b.由SEQIDNO:20、21、22、23或24任意一個(gè)核酸序列所編碼的輕鏈可變區(qū)(VL)。8.如權(quán)利要求6所述的抗體，其中所述抗體包含a.具有SEQIDNO:10中所示氨基酸序列的VH以及具有SEQIDNO:7或8任意之一所示氨基酸序列的VL;或b.具有SEQIDNO:11中所示氨基酸序列的VH和具有SEQIDNO:9所示氨基酸序列的VL。9.如權(quán)利要求7所述的抗體，其中所述抗體包含a.由SEQIDNO:25的核酸序列編碼的VH以及由SEQIDNO:20或21的核酸序列編碼的VL;b.由SEQIDNO:26的核酸序列編碼的VH以及由SEQIDNO:22、23或24的核酸序列編碼的VL;或c.由SEQIDNO:27的核酸序列編碼的VH以及由SEQIDNO:22、23或24的核酸序列編碼的VL。10.如權(quán)利要求8所述的抗體，其中所述VH包含SEQIDNO:10所示的氨基酸序列，且所述VL包含SEQIDNO:7所示的氨基酸序列。11.如權(quán)利要求8所述的抗體，其中所迷VH包含SEQIDNO:10所示的氨基酸序列，且所述VL包含SEQIDNO:8所示的氨基酸序列。12.如權(quán)利要求8所述的抗體，其中所述VH包含SEQIDNO:11所示的氨基酸序列，而所述VL包含SEQIDNO:9所示的氨基酸序列。13.如權(quán)利要求l、2、3、4、5、6、7、8或9所述的抗體，其進(jìn)一步包含恒定區(qū)。14.如權(quán)利要求13所述的抗體，其進(jìn)一步包含具有CH1、CH2或CH3結(jié)構(gòu)域的抗體恒定區(qū)。15.如權(quán)利要求14所述的抗體，其中所述恒定區(qū)來(lái)自于IgG抗體。16.如權(quán)利要求15所述的抗體，其中所述IgG抗體為IgGl抗體、IgG2抗體、IgG3抗體、或IgG4抗體。17.如權(quán)利要求l、2、3、4、5、6、7、8或9所述的抗體，其中所述抗體為人抗體。18.如權(quán)利要求1、2、3、4、5、6、7、8或9所述的抗體，其中所述抗體為嵌合抗體、人源化抗體、單克隆抗體、或重組抗體。19.如權(quán)利要求1、2、3、4、5、6、7、8或9所述的抗體，其中所述抗體為Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、單鏈Fv、單鏈抗體、二疏鍵連接的Fv、單結(jié)構(gòu)域抗體、抗原結(jié)合片段、雙鏈抗體、三鏈抗體或微抗體。20.如權(quán)利要求1、2、3、4、5、6、7、8或9所述的抗體，其進(jìn)一步包含標(biāo)記物。21.如權(quán)利要求1、2、3、4、5、6、7、8或9所述的抗體，其進(jìn)一步包含細(xì)胞毒素或免疫毒素。22.包含編碼權(quán)利要求1所述抗體的核普酸序列的分離的核酸分子。23.包含權(quán)利要求22所述的核酸分子的載體。24.包含權(quán)利要求23所述載體的宿主細(xì)胞。25.包含權(quán)利要求1、2、3、4、5、6、7、8或9所述抗體以及生理可接受的載體、稀釋劑、賦形劑和穩(wěn)定劑中至少一種的組合物。26.在患者中治療OX-40-介導(dǎo)的病癥的方法，其包括向該患者施用有效量的權(quán)利要求l、2、3、4、5、6、7、8或9任意一項(xiàng)所述的抗體，其中所述抗體阻斷OX40L與OX40的結(jié)合和/或抑制一種或多種與OX40L和OX40結(jié)合相關(guān)的功能。27.如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述OX40介導(dǎo)的病癥是炎性或自身免疫疾病。28.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述疾病為過(guò)敏、哮喘或與自身免疫或炎癥相關(guān)的疾病，例如多發(fā)性硬化癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎性腸道疾病、移植物抗宿主病、實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)、自身免疫性神經(jīng)疾病、自身免疫性葡萄膜炎、自身免疫性溶血性貧血、自身免疫性血小板減少、重癥肌無(wú)力、實(shí)驗(yàn)性利什曼病、膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎、結(jié)腸炎(例如潰瘍性結(jié)腸炎)、4婁觸超^:反應(yīng)、糖尿病、克隆氏病、Grave's病、肉狀瘤病、惡性貧血、顳動(dòng)脈炎、抗磷脂綜合癥、血管炎(例如Wegener肉芽胂病)、白塞氏病、皰滲樣皮炎、尋常天皰瘡、白斑病、原發(fā)性膽汁性肝硬變、自身免疫性肝炎、橋本氏甲狀腺炎、自身免疫性卵巢炎和睪丸炎、腎上腺的自身免疫性疾病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、石更皮病、皮膚肌炎、多發(fā)性肌炎、'皮膚肌炎、脊推關(guān)節(jié)病(例如強(qiáng)直性脊柱炎)、Reiter綜合癥、或Sjogren綜合癥。29.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述疾病為過(guò)敏、哮喘或與自身免疫或炎癥相關(guān)的疾病，例如多發(fā)性」哽化癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎性腸道疾病、移植物抗宿主病、實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)、實(shí)驗(yàn)性利什曼病、膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎、結(jié)腸炎(例如潰瘍性結(jié)腸炎)、接觸超敏反應(yīng)、糖尿病、克隆氏病、或Grave病。30.如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述抗體通過(guò)一種或多種途徑被施用至患者，所迷途徑包括靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、吸入、肌肉內(nèi)、皮下和口服途徑。31.通過(guò)抑制患者體內(nèi)IgE抗體生成來(lái)治療病癥的方法，其包括向所述患者施用有效量的權(quán)利要求l、2、3、4、5、6、7、8或9任意一項(xiàng)所述的抗體。32.如權(quán)利要求31所述的方法，其中所述病癥為支氣管哮喘、過(guò)敏性鼻炎、過(guò)敏性皮炎、過(guò)敏性反應(yīng)、蕁麻滲或異位性皮炎。33.降低哺乳動(dòng)物中哮喘的嚴(yán)重性的方法，其包括向所述哺乳動(dòng)物施用有效量的權(quán)利要求l、2、3、4、5、6、7、8或9任意一項(xiàng)所述的抗體，其中所述抗體包含至少一種如下屬性(a)以介于約1x10"Q至約1xl(T12M的KD結(jié)合人OX40;(b)抑制一種或多種與結(jié)合OX40相關(guān)的功能；和(c)抑制OX40L與OX40的結(jié)合。34.如權(quán)利要求33所述的方法，其中該抗體以介于約1x10"至約1x10-11M、1x1CT"至約1xl(y10M、1x10-10至約1x1(X9M、1xio-9至約1x1(T8M、或1x10-8至約1xl(T7M之間的KD結(jié)合人0X40。35.制備抗體的方法，其包括在適于生成所述抗體的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求24所述的細(xì)胞，并分離所述抗體。36.生成權(quán)利要求l、2、3、4、5、6、7、8或9所述的抗體的雜交瘤。37.權(quán)利要求l、2、3、4、5、6、7、8或9任意一項(xiàng)所述的抗體在藥物制備中的用途。38.權(quán)利要求1、2、3、4、5、6、7、8或9任意一項(xiàng)所述的抗體在治療OX40相關(guān)的疾病或病癥中的用途。39.如權(quán)利要求38所述的用途，其中所述疾病為過(guò)敏、哮喘或與自身免疫或炎癥相關(guān)的疾病，例如多發(fā)性硬化癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎性腸道疾病、移植物抗宿主病、實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)、自身免疫性神經(jīng)疾病、自身免疫性葡萄膜炎、自身免疫性溶血性貧血、自身免疫性血小板減少、重癥肌無(wú)力、實(shí)驗(yàn)性利什曼病、膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎、結(jié)腸炎(例如潰瘍性結(jié)腸炎)、4妻觸超^:反應(yīng)、糖尿病、克隆氏病、Grave病、肉狀瘤病、惡性貧血、顳動(dòng)月永炎、抗磷脂綜合癥、血管炎(例如Wegener肉芽胂病)、白塞氏病、皰滲樣皮炎、尋常天皰瘡、白斑病、原發(fā)性膽汁性肝硬變、自身免疫性肝炎、橋本氏甲狀腺炎、自身免疫性卵巢炎和睪丸炎、腎上腺的自身免疫性疾病、系統(tǒng)性紅斑狼瘙、硬皮病、皮膚肌炎、多發(fā)性肌炎、皮膚肌炎、脊推關(guān)節(jié)病(例如強(qiáng)直性脊柱炎)、Reiter綜合癥、或Sjogren綜合癥。40.如權(quán)利要求39所述的用途，其中所述疾病為過(guò)敏、哮喘或與自身免疫或炎癥相關(guān)的疾病，例如多發(fā)性硬化癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎性腸道疾病、移植物抗宿主病、實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)、實(shí)驗(yàn)性利什曼病、膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎、結(jié)腸炎(例如潰瘍性結(jié)腸炎)、接觸超敏反應(yīng)、糖尿病或克隆氏病。41.如權(quán)利要求l、2、3、4、5、6、7、8或9所述的抗體在檢測(cè)OX40中的用途。42.在樣本中檢測(cè)OX40的方法，其包括將所述樣本與權(quán)利要求20所述的抗體相接觸。43.試劑盒，其在容器中包含預(yù)定量的權(quán)利要求l、2、3、4、5、6、7、8或9所述的抗體，并在單獨(dú)的容器中包含緩沖液。44.試劑盒，其在容器中包含預(yù)定量的權(quán)利要求25所述的組合物，并在單獨(dú)的容器中包含緩沖液。45.包含權(quán)利要求1、2、3、4、5、6、7、8或9所述的抗體的醫(yī)學(xué)裝置。46.如權(quán)利要求45所述的醫(yī)學(xué)裝置，其為吸入裝置。47.包含權(quán)利要求25所述組合物的醫(yī)學(xué)裝置。48.如權(quán)利要求47所述的醫(yī)學(xué)裝置，其為吸入裝置。全文摘要本發(fā)明涉及針對(duì)人OX40受體(CD134)的拮抗劑抗體及其片段，包括拮抗劑抗體的氨基酸序列以及編碼該抗體的核酸。本發(fā)明還包括由所述抗體的輕鏈和/或重鏈可變區(qū)衍生的抗原結(jié)合區(qū)(CDR)。本發(fā)明的另一方面是抗-OX40拮抗劑抗體在炎性和自身免疫疾病的治療中的用途。本發(fā)明還涉及拮抗劑抗體A10的人源化序列以及該抗體的結(jié)合位點(diǎn)的表位定位。文檔編號(hào)C07K16/28GK101668776SQ200880013914公開(kāi)日2010年3月10日申請(qǐng)日期2008年2月26日優(yōu)先權(quán)日2007年2月27日發(fā)明者姚政彬,桑賈耶·辛格,薩拉赫-艾迪尼·拉姆哈邁迪-謝拉蒂申請(qǐng)人:健泰科生物技術(shù)公司