專利名稱：：具有高效分泌信號(hào)序列的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體的制作方法具有高效分泌信號(hào)序列的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體本發(fā)明涉及基于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)，及利用分泌性信號(hào)肽表達(dá)和分泌重組蛋白。本發(fā)明也涉及使哺乳動(dòng)物細(xì)胞，具體是CHO細(xì)胞分泌異源基因的表達(dá)盒。本發(fā)明還涉及使哺乳動(dòng)物細(xì)胞，如CHO細(xì)胞分泌異源蛋白的方法，和利用哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞生產(chǎn)分泌性重組蛋白的方法?？衫酶鞣N各樣經(jīng)基因工程改造的生物，包括原核和真核細(xì)胞來生產(chǎn)醫(yī)學(xué)、研究和獸醫(yī)應(yīng)用所需的重組多肽。然而，許多這些蛋白是糖蛋白，需要翻譯后修飾。因此，原核宿主細(xì)胞如細(xì)菌細(xì)胞不適合。為此理由，開發(fā)了利用高等真核細(xì)胞，如昆蟲細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞的其它蛋白表達(dá)系統(tǒng)。病毒表達(dá)系統(tǒng)能在昆蟲和小鼠細(xì)胞系中產(chǎn)生重組蛋白，但具有幾種嚴(yán)重缺點(diǎn)，特別是純化病毒感染系統(tǒng)中的重組蛋白問題很多。生產(chǎn)和回收重組多肽生物技術(shù)存在的主要問題是經(jīng)基因工程改造的生物其胞內(nèi)蛋白或蛋白亞基不易分泌。這些胞內(nèi)蛋白或蛋白亞基在細(xì)胞內(nèi)常常只中等水平表達(dá)，它們的純化必須包括先裂解細(xì)胞，然后經(jīng)幾步程序使所需多肽與其它胞內(nèi)蛋白分離。解決這些問題的一種方法是使重組蛋白分泌到周質(zhì)間隙或培養(yǎng)基中。只要可能分泌是優(yōu)選策略，因?yàn)槟軌蛉菀锥行У丶兓馀囵B(yǎng)基中的重組蛋白。此外，分泌產(chǎn)生的重組蛋白優(yōu)點(diǎn)是可避免被蛋白酶水解并且蛋白質(zhì)正確折疊的機(jī)會(huì)更優(yōu)。蛋白質(zhì)的成功分泌要求蛋白質(zhì)能有效穿越內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜或胞質(zhì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)。細(xì)胞分泌通過細(xì)胞膜的蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)一般為其前體形式，稱為"前蛋白"。這種"前蛋白"形式在其氨基末端含有一附加的肽序列，此附加序列為初生肽鏈靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)使其能進(jìn)入分泌通路所需。此附加肽序列稱為信號(hào)序列。然而，已知分泌常常不能達(dá)到所需程度，例如，重組蛋白自身的天然信號(hào)序列在宿主細(xì)胞中常常不能很好運(yùn)作。迄今，每種表達(dá)系統(tǒng)都需要專門定制才能符合每種蛋白生產(chǎn)的需要以確保其正確折疊、活性和所需的產(chǎn)3量。雖然已鑒定到可用于具體重組蛋白質(zhì)分泌的相當(dāng)多的信號(hào)序列，但該領(lǐng)域仍然需要能夠促進(jìn)哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞有效分泌重組蛋白，特別是免疫球蛋白的其它信號(hào)序列。因此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種使真核宿主細(xì)胞，如中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞能有效分泌非分泌性活性多肽，具體是抗體鏈的方法。本發(fā)明通過提供一種能使哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，特別是CHO細(xì)胞分泌異源蛋白的表達(dá)盒而解決了此技術(shù)問題，此表達(dá)盒包含的啟動(dòng)子功能性連接于編碼信號(hào)肽的DNA序列，該序列框內(nèi)連接于編碼異源蛋白的DNA序列，其中，編碼該信號(hào)肽的DNA序列選自SEQIDNo.2、SEQIDNo.4、SEQIDNo.6、SEQIDNo.8、SEQIDNo.lO，或編碼SEQIDNo,l、SEQIDNo.3、SEQIDNo.5、SEQIDNo.7、SEQIDNo.9所示氨基酸序列的DNA序列。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，表達(dá)盒中所用的信號(hào)序列能使與其操作性相連的多肽序列在哺乳宿主細(xì)胞中適當(dāng)加工和有效分泌。作為初步篩選，測試了19種不同的信號(hào)序列，它們衍生自常規(guī)用于重組蛋白生產(chǎn)的與CHO細(xì)胞不同物種的不同分泌性蛋白質(zhì)，其中只有5種導(dǎo)致所測試多肽分泌的改進(jìn)。因此，這些實(shí)驗(yàn)證明一般不能預(yù)測來自一種物種的信號(hào)序列在另一物種中是否也具有功能。上述5種信號(hào)序列中的二種，名為V19(SEQIDNo.9)和V17(SEQIDNo.7)的序列可導(dǎo)致細(xì)胞系分泌的抗體平均濃度比對(duì)照細(xì)胞系特別強(qiáng)地增加。根據(jù)信號(hào)肽V19的氨基酸序列產(chǎn)生了以下信號(hào)肽的共有氨基酸序列MMRP[疏水性氨基酸yrSALA。根據(jù)信號(hào)肽V17的氨基酸序列產(chǎn)生了以下信號(hào)肽的共有氨基酸序列MKT[疏水性氨基酸]nCATVHC。因此，本發(fā)明也通過提供具有通用氨基酸序列MMRP[疏水性氨基酸yrSALA的信號(hào)序列，和具有通用氨基酸序列MKT[疏水性氨基酸]nCATVHC的信號(hào)序列解決了上灘技術(shù)問題。在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，如CHO細(xì)胞中這二種信號(hào)序列能使與其操作性相連的多肽序列如抗體鏈有效分泌。此序列中心區(qū)的疏水氨基酸宜選自丙氨酸(Ala或A)、異亮氨酸(Ile或I)、亮氨酸(Leu或L)、苯丙氨酸(Phe或F)、甲硫氨酸(Met或M)和纈氨酸(Val或V)。Ala的親水指數(shù)為1.8，lie的親水指數(shù)為4.5，Leu的親水指數(shù)為3.8，Phe的親水指數(shù)為2.8，Met的親水指數(shù)為1.9，Val的親水指數(shù)為4.2。中心的疏水氨基酸延伸鏈宜由Leu(L)與一些Val、Ala、Phe和lie組成。中心的疏水氨基酸延伸鏈長度宜為4-9個(gè)氨基酸殘基。優(yōu)選中心疏水區(qū)包含4-16個(gè)氨基酸殘基，特別優(yōu)選4-9個(gè)殘基。本發(fā)明也涉及使哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞分泌異源蛋白的表達(dá)盒，該表達(dá)盒包含的啟動(dòng)子功能性連接于編碼信號(hào)肽的DNA序列，該序列框內(nèi)連接于編碼異源蛋白的DNA序列，其中，編碼該信號(hào)肽的DNA序列選自編碼氨基酸序列MMRP[疏水性氨基酸]nTSALA的DNA序列，或編碼氨基酸序列MKT[疏水性氨基酸]nCATVHC的DNA序列，其中n是4-16之間的整數(shù)，所述疏水氨基酸選自丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸或纈氨酸。在一特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，編碼所述信號(hào)序列的DNA序列選自SEQIDNo.8或SEQIDNo.lO，或編碼SEQIDNo.7或SEQIDNo.9所示氨基酸序列的DNA序列。本發(fā)明還涉及使哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞分泌異源蛋白的表達(dá)盒，該表達(dá)盒包含的啟動(dòng)子功能性連接于編碼信號(hào)肽的DNA序列，該序列框內(nèi)連接于編碼異源蛋白的DNA序列，其中，編碼該信號(hào)肽的DNA序列選自SEQIDNo.2、SEQIDNo.4、SEQIDNo.6、SEQIDNo.8、SEQIDNo.lO,或編碼SEQIDNo.1、SEQIDNo.3、SEQIDNo.5、SEQIDNo.7、SEQIDNo.9所示氨基酸序列的DNA序列。在本發(fā)明的內(nèi)容中，"表達(dá)盒"由要表達(dá)的一個(gè)或多個(gè)基因和調(diào)控它們表達(dá)的序列如啟動(dòng)子/增強(qiáng)子序列組成，包括順式作用轉(zhuǎn)錄控制元件的任何組合。調(diào)控基因表達(dá)，即基因轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的翻譯的序列通常稱為調(diào)控單元。調(diào)控單元的大部分位于異源基因編碼序列的上游并與其操作性相連。該表達(dá)盒也可包含含有聚腺苷酸化位點(diǎn)的下游3'非翻譯區(qū)。本發(fā)明的調(diào)控單元或直接與要表達(dá)的基因即轉(zhuǎn)錄單元相連，或與其分開中間插入例如異源基因的5'非翻譯區(qū)DNA。該表達(dá)盒優(yōu)選側(cè)接有一個(gè)或多個(gè)合適的限制性位點(diǎn)以便能將該表達(dá)盒插入到載體中和/或可從載體中切割下來。因此，，特別是哺乳動(dòng)物表達(dá)載體。在本發(fā)明的內(nèi)容中，術(shù)語"異源編碼序列"、"異源基因序列"、"異源基因"、"重組基因"或"感興趣基因"可互換使用。這些術(shù)語指編碼重組或異源蛋白產(chǎn)物，尋求在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)并以高產(chǎn)量收獲的DNA序列。所述基因產(chǎn)物可以是蛋白或多肽，但也可以是肽。所述異源基因序列非天然存在于宿主細(xì)胞中，可衍生自不同物種的生物。所述基因產(chǎn)物可以是任何感興趣的蛋白質(zhì)，例如治療蛋白質(zhì)如白介素，或酶，或多聚蛋白質(zhì)的亞基如抗體或其片段。所述蛋白優(yōu)選抗體或工程改造的抗體或其片段，最優(yōu)選免疫球蛋白G(IgG)抗體。按照本發(fā)明，術(shù)語"信號(hào)肽"或"信號(hào)序列"可互換使用，指分泌的膜結(jié)合蛋白質(zhì)氨基末端的連續(xù)延伸氨基酸殘基短鏈。該信號(hào)肽能使所述蛋白靶向分泌通路，使蛋白易化至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜中后從其新生鏈上切斷。信號(hào)肽由以下三個(gè)區(qū)域組成一個(gè)氨基末端極性區(qū)(N區(qū))，此區(qū)觀察到有許多陽電荷氨基酸殘基；一個(gè)由7-8個(gè)氨基酸殘基組成的中心疏水區(qū)(H區(qū))和一個(gè)包含有切割位點(diǎn)的羧基末端區(qū)(C區(qū))。信號(hào)肽從該切割位點(diǎn)被切斷產(chǎn)生成熟蛋白。"啟動(dòng)子"定義為通常位于基因上游的DNA調(diào)控序列，它通過引導(dǎo)RNA聚合酶結(jié)合DNA并引發(fā)RNA合成而介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄。術(shù)語"功能性相連"和"操作性相連"可互換使用，指二個(gè)或多個(gè)DNA區(qū)段之間，特別是要表達(dá)的基因序列與調(diào)控其表達(dá)的那些序列之間的功能關(guān)系。例如，啟動(dòng)/增強(qiáng)子序列，如果需要其能刺激或調(diào)節(jié)某編碼序列在合適的宿主細(xì)胞或其它表達(dá)系統(tǒng)中轉(zhuǎn)錄，包括順式作用轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的任何組合的啟動(dòng)/增強(qiáng)子序列應(yīng)操作性連接于編碼序列。啟動(dòng)子調(diào)控序列應(yīng)與被轉(zhuǎn)錄基因序列操作性相連并在物理上與該被轉(zhuǎn)錄序列毗連。本發(fā)明另一方面涉及一種哺乳動(dòng)物表達(dá)載體，其包含的啟動(dòng)子功能性連接于編碼信號(hào)肽的DNA序列，該序列框內(nèi)連接于編碼異源蛋白的DNA序列，其中，編碼該信號(hào)肽的DNA序列選自編碼氨基酸序列MMRP[疏水性氨基酸]rJSALA的DNA序列，或編碼氨基酸序列MKT[疏水性氨基酸LCATVHC的DNA序列，其中n是4-16之間的整數(shù)，所述疏水氨基酸是A、I、L、M、F或V。優(yōu)選編碼所述信號(hào)序列的DNA序列選自SEQIDNo.8或SEQIDNo.lO，或編碼SEQIDNo.7或SEQIDNo.9所示氨基酸序列的DNA序列。本發(fā)明也涉及一種哺乳動(dòng)物表達(dá)載體，其包含的啟動(dòng)子功能性連接于編碼信號(hào)肽的DNA序列，該序列框內(nèi)連接于編碼異源蛋白的DNA序列，其中，編碼該信號(hào)肽的DNA序列選自SEQIDNo.2、SEQIDNo.4、SEQIDNo.6、SEQIDNo.8、SEQIDNo.lO，或編碼SEQIDNo.l、SEQIDNo.3、SEQIDNo.5、SEQIDNo.7、SEQIDNo.9所示氨基酸序列的DNA序列。因此，本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明分泌異源蛋白所用表達(dá)盒的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體。在本
發(fā)明內(nèi)容中，"哺乳動(dòng)物表達(dá)載體"優(yōu)選是分離和純化的DNA分子，將其轉(zhuǎn)染入適當(dāng)?shù)牟溉閯?dòng)物宿主細(xì)胞中后能使該宿主細(xì)胞高水平表達(dá)重組基因產(chǎn)物。除編碼重組或異源基因產(chǎn)物的DNA序列外，該表達(dá)載體還含有能在宿主細(xì)胞系中有效轉(zhuǎn)錄該DNA序列成為mRNA并且將該mRNA有效翻譯成為蛋白質(zhì)所需的調(diào)控性DNA序列。在本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述哺乳動(dòng)物表達(dá)載體至少含有二個(gè)分開的轉(zhuǎn)錄單元。含二個(gè)分開轉(zhuǎn)錄單元的表達(dá)載體也稱為雙基因載體。一個(gè)例子是其中第一轉(zhuǎn)錄單元編碼抗體的重鏈或其片段，第二轉(zhuǎn)錄單元編碼抗體的輕鏈的載體。另一個(gè)例子是二個(gè)轉(zhuǎn)錄單元編碼某蛋白質(zhì)如酶的二個(gè)不同亞基的雙基因載體。然而，本發(fā)明的表達(dá)載體也可包含二個(gè)以上分開的轉(zhuǎn)錄單元，例如三個(gè)、四個(gè)或甚至更多個(gè)分開的轉(zhuǎn)錄單元，每個(gè)單元包含編碼不同多肽鏈的不同核苷酸序列。一個(gè)例子是含有四個(gè)分開的轉(zhuǎn)錄單元的載體，每個(gè)單元包含編碼由四個(gè)不同亞基組成的酶的一個(gè)亞基的不同核苷酸序列。本發(fā)明的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體優(yōu)選還包含至少一個(gè)在動(dòng)物細(xì)胞中可選擇的表達(dá)標(biāo)記。可采用任何常用的選擇標(biāo)記，如胸苷激酶(tk)、二氫葉酸還原酶(DHFR)或谷氨酰胺合成酶(GS)。在一特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述哺乳動(dòng)物表達(dá)載體含GS選擇標(biāo)記(Bebbington等，1992，利用谷氨酰胺合成酶基因作為擴(kuò)增選擇標(biāo)記使骨髓7瘤細(xì)胞高水平表達(dá)重組抗體(High-levelexpressionofarecombinantantibodyfrommyelomacellsusingaglutaminesynthetasegeneasanamplifiableselectablemarker),Bio/Technology10:169-175;Cockett等，1990，利用谷氨酰胺合成酶基因擴(kuò)增在中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞中高水平表達(dá)金屬蛋白酶組織抑制齊U(HighlevelexpressionoftissueinhibitorofmetalloproteinasesinChineseHamsterOvary(CHO)cellsusingGlutaminesynthetasegeneamplification),Bio/Technology8:662-667)。此GS系統(tǒng)是對(duì)產(chǎn)生治療性蛋白質(zhì)特別重要的僅有的兩種系統(tǒng)之一。與二氫葉酸還原酶(DHFR)系統(tǒng)相比，GS系統(tǒng)在發(fā)育過程中賦予了很大的時(shí)間優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)樗３Ｄ苁棺畛醯霓D(zhuǎn)染子產(chǎn)生高產(chǎn)細(xì)胞系，從而不需要在濃度遞增的選擇劑存在下進(jìn)行多輪選擇以實(shí)現(xiàn)基因擴(kuò)增(Brown等，1992，利用谷氨酰胺合成酶(GS)系統(tǒng)生產(chǎn)重組抗體方法的發(fā)展(Processdevelopmentfortheproductionofrecombinantantibodiesusingtheglutaminesynthetase(GS)system)，Cytotechnology9:231-236)。本發(fā)明的表達(dá)載體還優(yōu)選含有數(shù)目有限的有用的限制性位點(diǎn)以供插入本發(fā)明分泌異源蛋白的表達(dá)盒。在具體只用于短暫/游離型表達(dá)的情況下，本發(fā)明的表達(dá)載體還可包含在真核宿主細(xì)胞中能自身復(fù)制/維持游離型的復(fù)制起始位點(diǎn)，例如EB病毒(EBV)或SV40病毒的起始位點(diǎn)，但可缺乏選擇標(biāo)記。也可以在缺乏相關(guān)因子的細(xì)胞中短暫表達(dá)來促進(jìn)該載體的復(fù)制。本發(fā)明另一方面涉及含有本發(fā)明哺乳動(dòng)物表達(dá)載體的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞。術(shù)語"宿主細(xì)胞"或"宿主細(xì)胞系"指能夠在培養(yǎng)中生長并表達(dá)所需蛋白重組產(chǎn)物的任何細(xì)胞，特別是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞可以是人或非人細(xì)胞。哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的優(yōu)選例子包括但不限于MRC5人成纖維細(xì)胞、983M人黑色素瘤細(xì)胞、MDCK犬腎細(xì)胞、分離自Sprague-Dawley大鼠的RF培養(yǎng)的大鼠肺成纖維細(xì)胞、B16BL6鼠黑色素瘤細(xì)胞、P815鼠肥大細(xì)胞瘤細(xì)胞和MT1A2鼠乳房腺癌細(xì)胞。在一特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞是中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或細(xì)胞系(Puck等,1958,JExpMed.l08:945-955)。適合的CHO細(xì)胞系包括例如，CH0K1(ATCCCCL-61)、CHOpro3-、CHODG44、CHOP12或dhfr-CHO細(xì)胞系DUK-BII(Chassin等，PNAS77,1980，4216-4220)或DUXBll(Simonsen等，PNAS80,1983,2495-2499)。為了將該表達(dá)載體引入本發(fā)明哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中，可采用本領(lǐng)域熟知的對(duì)給定類型宿主細(xì)胞適合的任何轉(zhuǎn)染技術(shù)，如電穿孔、磷酸鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染、脂轉(zhuǎn)染。注意用本發(fā)明載體轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞應(yīng)解釋成是能被短暫或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系。因此，本發(fā)明的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體可維持為游離型或可穩(wěn)定地整合入哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的基因組中。短暫轉(zhuǎn)染的特征是對(duì)載體上負(fù)載的選擇標(biāo)記不施加任何選擇性壓力。在常用的轉(zhuǎn)染后至多20-50小時(shí)短暫表達(dá)的實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)染載體維持為游離型元件而不整合入基因組中。即轉(zhuǎn)染的DNA通常不整合入宿主細(xì)胞的基因組中。宿主細(xì)胞傾向于丟失轉(zhuǎn)染的DNA，并且轉(zhuǎn)染細(xì)胞在該短暫轉(zhuǎn)染細(xì)胞群培養(yǎng)中過度生長。因此，表達(dá)最強(qiáng)是在轉(zhuǎn)染后的即刻時(shí)間內(nèi)但隨著時(shí)間推移而衰減。宜將本發(fā)明的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染子理解為轉(zhuǎn)染后在缺乏選擇壓力的細(xì)胞培養(yǎng)中能維持生長最長達(dá)90小時(shí)的細(xì)胞。在本發(fā)明一優(yōu)選的實(shí)施方式中，用本發(fā)明的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，如CHO宿主細(xì)胞。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染意味著新引入的外源DNA如載體DNA通常經(jīng)隨機(jī)非同源性重組摻入到基因組DNA中。通過選擇載體序列整合入宿主細(xì)胞DNA中后已擴(kuò)增的細(xì)胞系，使得載體DNA的拷貝數(shù)和伴隨的基因產(chǎn)物產(chǎn)量增加。因此，這種穩(wěn)定的整合有可能通過接觸而進(jìn)一步提高基因擴(kuò)增的選擇壓力，使CHO細(xì)胞中的微小染色體加倍。此外，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染可能導(dǎo)致與重組基因產(chǎn)物表達(dá)不直接相關(guān)的載體序列部分，如基因組整合時(shí)多余的細(xì)菌拷貝數(shù)控制區(qū)丟失。因此，轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞將該表達(dá)載體的至少一部分或不同部分整合入基因組中。本發(fā)明的另一方面涉及一種生產(chǎn)重組蛋白的方法，包括以下步驟a)用表達(dá)載體轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞或宿主細(xì)胞系，b)在合適條件下培養(yǎng)該細(xì)胞使之增殖，表達(dá)重組蛋白并且該重組蛋白由宿主細(xì)胞分泌到培養(yǎng)基中，和c)收獲分泌到培養(yǎng)基中的重組蛋白。因此，本發(fā)明還涉及一種生產(chǎn)重組蛋白的方法，包括a)用表達(dá)載體轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞或宿主細(xì)胞系，b)在合適條件下培養(yǎng)該細(xì)胞使之增殖，表達(dá)重組蛋白并且該重組蛋白由宿主細(xì)胞分泌到培養(yǎng)基中，和C)收獲培養(yǎng)基中產(chǎn)生的重組蛋白。哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的合適培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法是本領(lǐng)域熟知的，例如可參見US5,633,162中所述。實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)或低密度細(xì)胞培養(yǎng)并且符合特定類型細(xì)胞要求的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)基的例子包括但不限于RoswellParkMemorialInstitute(RPMI)1640培養(yǎng)基(Morre，G.,美國醫(yī)學(xué)會(huì)雜志，199:519,1967)、L-15培養(yǎng)基(Leibovitz，A等，AmerJ.ofHygiene,78:173,1963)、Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)、Eagle最低必須培養(yǎng)基(MEM)、漢母F12(Ham'sF12)培養(yǎng)基(Ham,R等，P腦.Natl.Acad.Sc.53:288,1965)、或Iscoves改良的缺乏白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白和卵磷脂的DMEM培養(yǎng)基(Iscoves等，JExpMed.l:923,1978)。例如，專門設(shè)計(jì)了漢母F10或F12培養(yǎng)基用于CHO細(xì)胞培養(yǎng)。歐洲專利EP-481，791中描述了專門適合CHO細(xì)胞培養(yǎng)的其它培養(yǎng)基。已知這類培養(yǎng)基可添加胎牛血清(FBS，也稱為胎小牛血清FCS)，后者可提供天然來源的多種激素和生長因子。哺乳動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)現(xiàn)今已是科學(xué)書籍和手冊(cè)中有全面描述的常規(guī)操作，其細(xì)節(jié)可參見R.IanFresney的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)(CultureofAnimalcells)手冊(cè)，第4版，Wiley-Liss/N.Y,2000。在本發(fā)明的一優(yōu)選實(shí)施方式中，所用的細(xì)胞培養(yǎng)基不含胎牛血清(FCS或FBS)，稱之為"無血清"培養(yǎng)基。無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞通常需要在其中加入胰島素和轉(zhuǎn)鐵蛋白方能最佳生長。轉(zhuǎn)鐵蛋白可用非肽類的螯合劑或鐵載體如WO94/02592中所述的托酚酮(tropolone)至少部分替代，或提高與抗氧化劑如維生素C有益結(jié)合的有機(jī)鐵源的水平。大多數(shù)細(xì)胞系需要一種或多種合成的生長因子(包括重組多肽)，包括例如，表皮生長因子(EGF)、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、胰島素樣生長因子I和II(IGFI、IGFII)等等?？赡苄枰钠渌愋偷纳L因子包括前列腺素、轉(zhuǎn)運(yùn)和結(jié)合蛋白(如血漿銅藍(lán)蛋白、高密度和低密度載脂蛋白、牛血清白蛋白(BSA))、激素(包括類固醇激素)和脂肪酸。多肽生長因子的測試最好分步進(jìn)行，在發(fā)現(xiàn)能夠刺激生長的因子存在下檢測新的多肽因子。這些生長因子可以是合成和重組的因子。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)有幾種熟知的方法，下文將描述其中一個(gè)例子。最初的步驟是從添加血清的培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)移后獲得使細(xì)胞存活和/或緩慢生長3-6天的條件。對(duì)大多數(shù)類型的細(xì)胞而言，此條件至少部分根據(jù)接種密度。一旦發(fā)現(xiàn)最佳的激素/生長因子/多肽添加，可降低存活所需的接種密度。在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞培養(yǎng)基無蛋白質(zhì)，即無胎牛血清和單種蛋白生長因子添加劑或其它蛋白質(zhì)如重組轉(zhuǎn)鐵蛋白。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明方法涉及在例如工業(yè)化分批進(jìn)料生物反應(yīng)罐中高密度培養(yǎng)動(dòng)物宿主細(xì)胞來表達(dá)和收獲重組蛋白產(chǎn)物?？赡苄枰捎贸Ｒ?guī)的下游加工。因此，必須用高密度生長培養(yǎng)基。這類高密度生長培養(yǎng)基通常添加有營養(yǎng)物，例如所有氨基酸、上述給定范圍內(nèi)的能源如葡萄糖、無機(jī)鹽、維生素、微量元素(定義為通常最終濃度在微摩爾范圍內(nèi)的無機(jī)化合物)、緩沖劑、四種核苷或它們的相應(yīng)核苷酸、抗氧化劑如谷胱苷肽(還原型)、維生素C和其它組分，如重要的膜脂質(zhì)如膽固醇或磷酯酰膽堿，或脂質(zhì)前體如膽堿或肌醇。高密度培養(yǎng)基將富含這些化合物的大多數(shù)或全部，除了無機(jī)鹽需要根據(jù)基礎(chǔ)等滲培養(yǎng)基的滲量調(diào)節(jié)外，它們的含量與RMPI1640相比，高于GB2251249的上述標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基(強(qiáng)化)。優(yōu)選強(qiáng)化本發(fā)明的高密度培養(yǎng)基，使每升培養(yǎng)基除色氨酸外的所有氨基酸含量超過75mg。與通用氨基酸需求相結(jié)合，優(yōu)選高密度培養(yǎng)基的谷氨酰胺和/或天冬酰胺每升含量超過lg,更優(yōu)選每升2g。在本發(fā)明的內(nèi)容中，高密度細(xì)胞培養(yǎng)定義為，動(dòng)物細(xì)胞群中的活細(xì)胞短暫密度至少達(dá)到或超過105個(gè)細(xì)胞/毫升，優(yōu)選至少達(dá)到或超過106個(gè)細(xì)胞/毫升，該細(xì)胞群以恒定的或遞增的培養(yǎng)體積，在細(xì)胞培養(yǎng)基中接種一個(gè)細(xì)胞或接種低密度活細(xì)胞后不停地生長。在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法包括分批進(jìn)料培養(yǎng)。分批進(jìn)料培養(yǎng)是一種培養(yǎng)系統(tǒng)，如GB2251249所述，此系統(tǒng)除了通過單獨(dú)的進(jìn)料控制葡萄糖濃度外，還在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)至少進(jìn)料谷氨酰胺，任選與一種或幾種其它氨基酸，優(yōu)選甘氨酸一起進(jìn)料以維持培養(yǎng)基中它們的濃度。更優(yōu)選在細(xì)胞培養(yǎng)中進(jìn)料谷氨酰胺和任選一種或幾種其它氨基酸時(shí)，如EP-229809所述，共同進(jìn)料一種或多種能源如葡萄糖。進(jìn)料通常開始于啟動(dòng)培養(yǎng)后25-60小時(shí)；例如，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到106個(gè)細(xì)胞/毫升時(shí)開始進(jìn)料。本領(lǐng)域熟知在培養(yǎng)的細(xì)胞中，"谷氨酰胺代謝(glutaminolysis)"(McKeehan等，1984,動(dòng)物細(xì)胞中的谷氨酰胺代謝(Glutaminolysisinanimalcells),刊登在"培養(yǎng)細(xì)胞中的糖代謝(CarbohydrateMetabolisminCulturedCells)"，M.J.Morgan編，PlenumPress,紐約，第11-150頁)可能成為生長期的重要能源。谷氨酰胺和/或天冬酰胺(用天冬酰胺替代谷氨酰胺，參見Kurano，N等，1990,J.Biotechnology15:113-128)的進(jìn)料總量通常范圍是每升培養(yǎng)體積0.5-10g,優(yōu)選l-2g;進(jìn)料時(shí)每升培養(yǎng)基中的其它氨基酸總共10-300mg，具體說，與其它氨基酸相比，常常進(jìn)料較高量的至少150-200mg的甘氨酸、賴氨酸、精氨酸、纈氨酸、異亮氨酸或亮氨酸?？煽焖偌尤牖蜻B續(xù)泵入這種進(jìn)料，優(yōu)選幾乎連續(xù)不斷地將進(jìn)料泵入生物反應(yīng)罐中。不用說，應(yīng)加入堿或緩沖劑以小心地將分批進(jìn)料培養(yǎng)期間生物反應(yīng)罐中的pH控制為給定細(xì)胞系生長所需的大約最佳生理pH。當(dāng)采用葡萄糖作為能源時(shí)，葡萄糖的進(jìn)料總量通常為每升培養(yǎng)基l-10g，優(yōu)選3-6g。除了包括氨基酸外，進(jìn)料宜包含每升培養(yǎng)基5-20mg的少量膽堿。更優(yōu)選，基本上如US6,048,728所述，膽堿進(jìn)料與乙醇胺的添加組合，特別是與進(jìn)料谷氨酰胺組合。不用說，當(dāng)采用GS標(biāo)記系統(tǒng)時(shí)，加入的谷氨酰胺比非GS表達(dá)系統(tǒng)要少，因?yàn)槌藘?nèi)源產(chǎn)生的以外，過量谷氨酰胺的積累會(huì)產(chǎn)生銨而伴有毒性。對(duì)于GS，培養(yǎng)基或進(jìn)料中的谷氨酰胺常?？捎闷涞葍r(jià)物和/或前體，即天冬酰胺和/或谷氨酸代替。收集，即分離和/或純化培養(yǎng)過細(xì)胞的培養(yǎng)基中給定蛋白質(zhì)的方法是本領(lǐng)域熟知的。附圖中闡述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式。顯示的是圖1顯示不同的信號(hào)序列當(dāng)用于CHOKISV細(xì)胞短暫轉(zhuǎn)染時(shí)對(duì)分泌的抗體濃度的影響。顯示了用含不同信號(hào)序列的載體轉(zhuǎn)染CHOK1SV細(xì)胞所獲得抗體濃度。n=6。圖2顯示不同的信號(hào)序列當(dāng)用于靜置培養(yǎng)的穩(wěn)定細(xì)胞系時(shí)對(duì)分泌的抗體濃度的影響?？驁D顯示用含不同信號(hào)序列的載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CHOK1SV細(xì)胞所獲得抗體濃度范圍。穩(wěn)定的GS細(xì)胞系在24孔板中能過度生長14天，用蛋白AHPLC法測定此時(shí)的抗體濃度。顯示了平均抗體濃度，用*號(hào)標(biāo)出表明平均抗體濃度的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性增加(用ANOVA計(jì)算i^0,05)。n=100。圖3顯示信號(hào)序列V19當(dāng)用于懸浮培養(yǎng)的穩(wěn)定細(xì)胞系時(shí)對(duì)分泌的抗體12濃度的影響?？驁D顯示用含對(duì)照序列或V19信號(hào)序列的載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CH0K1SV細(xì)胞所獲得的抗體濃度范圍。產(chǎn)生了穩(wěn)定的GS細(xì)胞系并評(píng)價(jià)了對(duì)設(shè)計(jì)用于最小實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的生物反應(yīng)罐分批進(jìn)料培養(yǎng)最好的60個(gè)細(xì)胞系。用蛋白AHPLC法測定抗體濃度。顯示了平均抗體濃度，用ANOVA計(jì)算尸值。n=60。圖4顯示在10升生物反應(yīng)罐中培養(yǎng)穩(wěn)定細(xì)胞系時(shí)信號(hào)序列V19對(duì)分泌的抗體濃度的影響?？驁D顯示用含對(duì)照序列或V19信號(hào)序列的載體產(chǎn)生的穩(wěn)定細(xì)胞系在IO升實(shí)驗(yàn)室規(guī)模生物反應(yīng)罐中所獲得的抗體濃度范圍。產(chǎn)生了穩(wěn)定的GS細(xì)胞系并評(píng)價(jià)了分批進(jìn)料培養(yǎng)最好的8個(gè)細(xì)胞系。用蛋白AHPLC法測定抗體濃度。顯示了平均抗體濃度。n=8。以下序列表顯示SEQIDNo.l顯示構(gòu)建pV12所用信號(hào)肽的氨基酸序列。此信號(hào)肽衍生自黃白蛉(Sandflyyellow)相關(guān)蛋白，其序列如下mrfffvflaivlfqgihg。此SEQIDNo.l信號(hào)肽也稱為信號(hào)肽V12。SEQIDNo.2顯示編碼SEQIDNo.2所示信號(hào)肽氨基酸序列的核酸序歹ll，其序歹ll如下5，-atgagattctttttcgtgttcctggccatcgtgctgttccagggcatccacg-3，。SEQIDNo.3顯示構(gòu)建pV14所用信號(hào)肽的氨基酸序列。此信號(hào)肽衍生自家蠶蠶絲蛋白(SilkwormFibroin)LC，其序列如下mkpiflvllvvtsaya。此SEQIDNo.3信號(hào)肽也稱為信號(hào)肽V14。SEQIDNo.4顯示編碼SEQIDNo.3所示信號(hào)肽氨基酸序列的核酸序歹ll，其序歹U如下5，-atgaagcccatctttctggtgctgctggtcgtgaccagcgcctacgcc-3，。SEQIDNo.5顯示構(gòu)建pV16所用信號(hào)肽的氨基酸序列。此信號(hào)肽衍生自蛇PLA2，其序列如下mrtlwimavlllgveg。此SEQIDNo.5信號(hào)肽也稱為信號(hào)肽V16。SEQIDNo.6顯示編碼SEQIDNo.5所示信號(hào)肽氨基酸序列的核酸序列，其序列如下5'-atgaggaccctgtggatcatggccgtgctgctgctgggcgtggagggccaggtg-3，。SEQIDNo.7顯示構(gòu)建pV17所用信號(hào)肽的氨基酸序列。此信號(hào)肽衍生自海螢夜光蟲(CypridinaNoctiluca)螢光素酶，其序列是mktlilavalvycatvhc。13說明書第12/18頁此SEQIDNo.7信號(hào)肽也稱為信號(hào)肽V17。SEQIDNo.8顯示編碼SEQIDNo.7所示信號(hào)肽氨基酸序列的核酸序列，其序列如下5，-atgaaaaccctgatcctggccgtggccctggtgtactgcgccaccgtgcactgc-37。SEQIDNo.9顯示構(gòu)建pV19所用信號(hào)肽的氨基酸序列。此信號(hào)肽衍生自蜂鳥窩(Pinemoth)絲蛋白LC，其序列是mmrpivlvllfatsala。此SEQIDNo.9信號(hào)肽也稱為信號(hào)肽V19。SEQIDNo.10顯示編碼SEQIDNo.9所示信號(hào)肽氨基酸序列的核酸序列，其序列如下5'-atgatgaggcccatcgtgctggtgctgctgttcgccacctccgccctggcccaggtg-3，。通過以下實(shí)施例更詳細(xì)說明本發(fā)明。實(shí)施例材料和方法所用細(xì)胞CHO細(xì)胞系CH0K1SV:是細(xì)胞系CHO-K1的變體，已適應(yīng)懸浮培養(yǎng)和在無蛋白培養(yǎng)基中生長。CHOKISV細(xì)胞的增殖在裝有CD-CHO培養(yǎng)基(Invitrogen)和添加了6mM谷氨酰胺的搖瓶中常規(guī)懸浮培養(yǎng)增殖CHOKISV細(xì)胞。接種濃度為2Xl()S個(gè)細(xì)胞/ml，每4天分瓶培養(yǎng)一次。搖瓶充滿含5%<:02的空氣，36.5。C(35.5。C至37°C之間)140rpm軌道振搖培養(yǎng)。短暫轉(zhuǎn)染用懸浮培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行短暫轉(zhuǎn)染。作細(xì)胞計(jì)數(shù)后分布到24孔板添加有10%血清和6mML-谷氨酰胺的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基的各孔中，每孔2.5X105個(gè)活細(xì)胞，+36.5°0培養(yǎng)過夜。次日用lml新鮮培養(yǎng)基(同上)替換條件培養(yǎng)基，+37°<:培養(yǎng)細(xì)胞3小時(shí)。對(duì)于每種轉(zhuǎn)染，將5pg的各SGV(HC和LC-SGV—起混合)或5pg的DGV重懸浮于100|iL轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基(OptiMEM，Invitrogen)中。對(duì)于陽性對(duì)照，14還用含編碼模型抗體的IgG4ZK抗體重鏈和輕鏈基因的載體pcB72.3轉(zhuǎn)染細(xì)胞。也包括陰性對(duì)照(只是水)。對(duì)于每種轉(zhuǎn)染，取5ML脂轉(zhuǎn)染胺-2000試劑(Invitrogen)用100pL轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基稀釋，混合后室溫靜置5分鐘。合并DNA與稀釋的脂轉(zhuǎn)染胺試劑，混合后再室溫靜置20分鐘。然后取200pL混合物加入到24孔板的含細(xì)胞孔中，+37°0培養(yǎng)細(xì)胞4或10天。收集培養(yǎng)上清液并通過離心澄清，然后用組裝ELISA檢測存在的抗體。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染產(chǎn)生靜置培養(yǎng)的細(xì)胞如上所述，懸浮培養(yǎng)轉(zhuǎn)染用的細(xì)胞。離心培養(yǎng)細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基洗滌一次，然后重懸成1.43\107個(gè)細(xì)胞/毫升的濃度。取0.7毫升體積的細(xì)胞懸液和40pg質(zhì)粒DNA加入到電穿孔小杯中。將小杯置于電穿孔裝置中輸送250V和400MF單個(gè)電脈沖。轉(zhuǎn)染后將細(xì)胞分種在％孔板的孔中，每孔約2500個(gè)宿主細(xì)胞(5Xl(^個(gè)細(xì)胞/ml)，采用非選擇性DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基并添加腦dFCS進(jìn)行培養(yǎng)。36.5。C(35.5。C至37。C之間)在含10%CO2的空氣環(huán)境中培養(yǎng)該板。轉(zhuǎn)染后當(dāng)天，各孔加入添加有10%dFCS/66^ML-甲硫氨酸磺酰亞胺(L-methioninesulphoximine)的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基(150iiL/孔)，L-甲硫氨酸磺酰亞胺最終濃度50nM。監(jiān)測該板確定非轉(zhuǎn)染細(xì)胞死亡的時(shí)間和轉(zhuǎn)染細(xì)胞灶出現(xiàn)的時(shí)間。大約在轉(zhuǎn)染后3-4周轉(zhuǎn)染細(xì)胞灶變得明顯。檢查所有的細(xì)胞系，進(jìn)一步增殖只含單個(gè)集落的孔中的細(xì)胞。評(píng)估靜置培養(yǎng)細(xì)胞系的產(chǎn)率培養(yǎng)96孔轉(zhuǎn)染板大約3周使形成細(xì)胞集落。用顯微鏡檢査產(chǎn)生的集落以查證大小適合(覆蓋孔底60%以上)試驗(yàn)并且每孔只存在一個(gè)集落的細(xì)胞。將合適的集落轉(zhuǎn)移到含有l(wèi)mL選擇性培養(yǎng)基(DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基/10%dFCS/25|iiML-甲硫氨酸磺酰亞胺)的24孔板的孔中。36.5。C(35.5。C至37°C之間)在含10%(302的空氣環(huán)境中培養(yǎng)這些培養(yǎng)物14天。收集各孔上清液用蛋白AHPLC方法分析存在的抗體濃度。裝配ELISA:用能檢測裝配的人IgG的夾心ELISA測定樣品的抗體濃度。這包括將樣品和標(biāo)準(zhǔn)品捕獲到包被有抗人FC抗體的96孔板上。用連接了辣根過氧化物酶的抗人輕鏈(抗體)和顯色底物TMB揭示結(jié)合的抗體。與標(biāo)準(zhǔn)品相比，顯色程度與樣品中存在的抗體濃度成比例。蛋白AHPLC:在Agilent1100HPLC儀上進(jìn)行蛋白A親和色譜法檢測IgG。IgG產(chǎn)物能選擇性結(jié)合Poros蛋白A免疫檢測柱。洗去柱上不結(jié)合的物質(zhì)，降低溶劑的pH以釋放仍舊結(jié)合的抗體。監(jiān)測洗脫液的2S0nm吸收值，針對(duì)通用的抗體標(biāo)準(zhǔn)品給產(chǎn)物定量(用Chemstation軟件)并針對(duì)消光系數(shù)差異作出修正。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染產(chǎn)生懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞從貯藏的CH0K1SV細(xì)胞系復(fù)蘇產(chǎn)生CH0K1SV宿主細(xì)胞。離心后來生長培養(yǎng)的細(xì)胞，用CD-CHO培養(yǎng)基洗滌一次后重懸浮成1.43乂107個(gè)細(xì)胞/毫升的濃度。每次轉(zhuǎn)染時(shí)，取大約0.7毫升細(xì)胞懸液和40ng質(zhì)粒DNA加入到各電穿孔小杯中。用二個(gè)電穿孔小杯的內(nèi)容物制備了4份轉(zhuǎn)染。將各電穿孔小杯置于電穿孔裝置中，輸送300V和900pF單個(gè)電脈沖。轉(zhuǎn)染后合并所有需要的小杯中的細(xì)胞，分種在96孔板的孔中，每孔約2500個(gè)宿主細(xì)胞(0.5Xl()S個(gè)細(xì)胞/毫升)至10000個(gè)宿主細(xì)胞(2.00乂105個(gè)細(xì)胞/毫升)，采用培養(yǎng)基CD-CHO/酚紅。加入酚紅只為顯示有細(xì)胞生長。35.5°C至37°C在含10%體積<:02的空氣環(huán)境中培養(yǎng)該板。轉(zhuǎn)染后當(dāng)天，各孔加入150|iL選擇性培養(yǎng)基(CD-CHO/酚紅/66pMMSX)。各孔中MSX的最終濃度為50pM。監(jiān)測該板確定非轉(zhuǎn)染細(xì)胞死亡時(shí)留下轉(zhuǎn)染細(xì)胞灶。大約在轉(zhuǎn)染后3-4周轉(zhuǎn)染細(xì)胞灶變得明顯。以目視評(píng)估確定，檢查了所有的轉(zhuǎn)染子，進(jìn)一步增殖只含單個(gè)集落的孔中的轉(zhuǎn)染子。選擇細(xì)胞系評(píng)價(jià)靜置培養(yǎng)培養(yǎng)96孔轉(zhuǎn)染板約3-4周使形成細(xì)胞集落。用顯微鏡檢查產(chǎn)生的集落以查證大小適合(覆蓋孔底60%以上)評(píng)估并且每孔只存在一個(gè)集落的細(xì)胞。取培養(yǎng)上清液，用LonzaELISA法檢測抗體。評(píng)估取樣時(shí)該孔細(xì)胞生長融合的百分率。檢測結(jié)果除以生長融合百分率所得的值可用于細(xì)胞系排序。在含培養(yǎng)基CD-CHO/酚紅/25pMMSX(此培養(yǎng)基用于整個(gè)靜置培養(yǎng)期)的24孔板中擴(kuò)增高排序細(xì)胞系。達(dá)到融合時(shí)，用此培養(yǎng)物接種T25培養(yǎng)瓶，剩余培養(yǎng)物用新鮮培養(yǎng)基再飼養(yǎng)并放回培養(yǎng)箱。在T25瓶中達(dá)到融合時(shí)，用新鮮培養(yǎng)基飼養(yǎng)該培養(yǎng)物以促進(jìn)細(xì)胞形成多層而適應(yīng)懸浮培養(yǎng)。對(duì)于96孔板增殖的那些細(xì)胞系，進(jìn)行了第二次產(chǎn)率評(píng)估。再培養(yǎng)經(jīng)過增殖和重飼養(yǎng)的24孔板培養(yǎng)物14天直到細(xì)胞融合或達(dá)到低存活率(過度生長)。此時(shí)，收集培養(yǎng)上清液，用蛋白AHPLC方法檢測抗體濃度。按產(chǎn)率給細(xì)胞系排序，增殖高排序細(xì)胞系以進(jìn)行懸浮培養(yǎng)評(píng)價(jià)。擴(kuò)增細(xì)胞系進(jìn)行CDACF懸浮培養(yǎng)從融合生長的T25瓶培養(yǎng)物開始懸浮培養(yǎng)，采用培養(yǎng)基CD-CHO/25jliMMSX。接種細(xì)胞濃度的選擇取決于T25瓶中檢測到的活細(xì)胞濃度。如果活細(xì)胞濃度高于0.40乂106個(gè)活細(xì)胞/毫升，加入CD-CHO/25pMMSX培養(yǎng)基至活細(xì)胞濃度為0.20><106個(gè)活細(xì)胞/毫升，125mL搖瓶中細(xì)胞懸浮液的最終體積為5-30mL。如果活細(xì)胞濃度為0.25-0.40乂106個(gè)活細(xì)胞/毫升，加入CD-CHO/25|iMMSX培養(yǎng)基至細(xì)胞濃度為0.15X106個(gè)活細(xì)胞/毫升，125mL搖瓶中細(xì)胞懸液的最終體積為5-30mL。如果T25瓶培養(yǎng)最長14天后活細(xì)胞濃度低于0.25乂106個(gè)細(xì)胞/毫升，取10ml各培養(yǎng)物加入125mL搖瓶的10mLCD-CHO/25pMMSX培養(yǎng)基中自行增殖從靜置培養(yǎng)轉(zhuǎn)為懸浮培養(yǎng)后，4天傳代一次的培養(yǎng)方案用CD-CHO/25pMMSX培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞系作系列傳代培養(yǎng)，直到培養(yǎng)的細(xì)胞系達(dá)到可接受的可繁殖的生長特性。在125mL搖瓶中制備培養(yǎng)物，培養(yǎng)體積30mL，最初細(xì)胞接種濃度為0.05-0.20乂106個(gè)活細(xì)胞/毫升。當(dāng)?shù)?天(傳代培養(yǎng)當(dāng)天)活細(xì)胞濃度連續(xù)超過0.40X106個(gè)活細(xì)胞/毫升時(shí)，以0.20乂106個(gè)活細(xì)胞/毫升常規(guī)接種培養(yǎng)細(xì)胞。分批進(jìn)料搖瓶培養(yǎng)在250mL搖瓶中對(duì)選出的各細(xì)胞系培養(yǎng)物用培養(yǎng)基CM42/SPE制備30mL細(xì)胞懸液。以0.20乂106個(gè)活細(xì)胞/毫升接種培養(yǎng)物，各培養(yǎng)瓶頂部空間充滿含5%體積C02的空氣。35.5°C至37°C在搖動(dòng)平臺(tái)上140土5卬m培養(yǎng)細(xì)胞直到峰值后活細(xì)胞濃度低于或等于1.00X106個(gè)活細(xì)胞/毫升或培養(yǎng)到15天("過度生長")。此時(shí)收集培養(yǎng)物。用Vi-Cell自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器測定第7天和14天時(shí)的細(xì)胞濃度。第3天各30mL培養(yǎng)物中加入2.1mLSF40。第8和11天培養(yǎng)物中分批進(jìn)料加入360pL二代飼養(yǎng)的SF41。第7和14天取培養(yǎng)上清液樣品，-20±5°C凍存直到用蛋白AHPLC檢測裝配的抗體。IO升生物反應(yīng)罐培養(yǎng)評(píng)價(jià)了10升生物反應(yīng)罐培養(yǎng)的細(xì)胞系。使16種細(xì)胞系培養(yǎng)物的體積增加到足夠接種一個(gè)IO升氣升式生物反應(yīng)罐。調(diào)節(jié)接種體積達(dá)到接種密度約0.20乂106個(gè)細(xì)胞/毫升。用分批進(jìn)料方法運(yùn)轉(zhuǎn)生物反應(yīng)罐15天。取培養(yǎng)上清液樣品，用蛋白AHPLC檢測裝配的抗體。載體構(gòu)建合成了編碼cB72.3抗體可變區(qū)的基因優(yōu)化的DNA序列。作為合成中的一部分，加入編碼信號(hào)肽鏈的核酸序列?？偣膊捎昧?9種不同的信號(hào)序歹U(序列Vl-V19)。將輕鏈序列克隆到pEE12.4衍生表達(dá)載體pConPlusK中，此載體包含k鏈恒定區(qū)的DNA序列。將重鏈克隆到pEE6.4衍生載體pConPlusIgG4中，此載體包含IgG4恒定區(qū)的DNA序列。然后一起克隆有關(guān)載體的胸I/PvuI片段產(chǎn)生雙基因表達(dá)載體。經(jīng)DNA測序證實(shí)所有構(gòu)建物的序列正確。作為初步篩選，將19種構(gòu)建物與采用常規(guī)信號(hào)序列的相應(yīng)對(duì)照用脂轉(zhuǎn)染胺-2000(Invitrogen)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入CHOKISV宿主細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染這些構(gòu)建物六次，用ELISA檢測培養(yǎng)基中的抗體濃度。該試驗(yàn)鑒定到19種構(gòu)建物中有五種可導(dǎo)致平均抗體濃度比對(duì)照顯著增加，而其余構(gòu)建物導(dǎo)致的抗體濃度與對(duì)照相等或減少。這些構(gòu)建物是含信號(hào)序列SEQIDNo.l的pV12(信號(hào)序列V12)、含信號(hào)序列SEQIDNo.3的pV14(信號(hào)序列V14)、含信號(hào)序列SEQIDNo.5的pV16(信號(hào)序列V16)、含信號(hào)序列SEQIDNo.7的pV17(信號(hào)序列V17)和含信號(hào)序列SEQIDNo.9的pV19(信號(hào)序列V19)。采用在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)中表達(dá)改善的含5種信號(hào)序列的構(gòu)建物在CHOKISV細(xì)胞中創(chuàng)建了穩(wěn)定的細(xì)胞系。用蛋白AHPLC檢測了每種構(gòu)建物100個(gè)細(xì)胞系培養(yǎng)基中的抗體濃度。對(duì)照細(xì)胞系的平均抗體濃度為89mg/L。5種信號(hào)序列中的二種產(chǎn)生的細(xì)胞系平均抗體濃度比對(duì)照細(xì)胞系有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著增加，序列V17(SEQIDNo.7)導(dǎo)致的平均抗體濃度為106mg/L(增加19%，P=<0.05)，序列V19(SEQIDNo.9)導(dǎo)致的平均抗體濃度為118mg/L(增加32%，P=<0.05)。穩(wěn)定細(xì)胞系的數(shù)據(jù)見圖l。利用SDS-電泳評(píng)價(jià)產(chǎn)物質(zhì)量時(shí)，觀察用對(duì)照序列或替代的信號(hào)序列所產(chǎn)生抗體之間無大的結(jié)構(gòu)差異。質(zhì)譜法評(píng)價(jià)產(chǎn)物質(zhì)量表明，用替代信號(hào)序列產(chǎn)生的抗體與對(duì)照預(yù)期質(zhì)量相當(dāng)，提示它們可能已被正確加工。此研究證明不同的信號(hào)序列以不同效率起效，表明信號(hào)序列的選擇可能是優(yōu)化抗體表達(dá)的關(guān)鍵因素。為了明確在整個(gè)細(xì)胞系構(gòu)建過程中此種序列是否導(dǎo)致了抗體濃度增加，制備了編碼cB72.3的IgGl/K抗體的構(gòu)建物。該構(gòu)建物使用經(jīng)基因優(yōu)化的與編碼信號(hào)序列SEQIDNo.9(V19)(pcB72,3IgGlV19)或常用的抗體衍生信號(hào)序列(pcB72.3IgGl)的DNA序列融合的基因。將這些構(gòu)建物穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入CH0K1SV細(xì)胞中。96孔板中篩選轉(zhuǎn)染子，在24孔板中擴(kuò)增高排序細(xì)胞系。達(dá)到融合生長時(shí)，在T25培養(yǎng)瓶中增殖最好的60個(gè)細(xì)胞系然后使之適應(yīng)搖瓶懸浮培養(yǎng)。評(píng)估分批與分批進(jìn)料搖瓶培養(yǎng)的產(chǎn)率，用第14天分批進(jìn)料過度生長培養(yǎng)物的培養(yǎng)上清液分析產(chǎn)物的質(zhì)在分批進(jìn)料培養(yǎng)中，采用信號(hào)序列SEQIDNo.9的構(gòu)建物顯示平均抗體濃度比對(duì)照增加6°/。(p=0.08)。用SDS-電泳分析、IEF、寡聚糖分析進(jìn)行產(chǎn)物質(zhì)量評(píng)估時(shí)揭示，用對(duì)照或含信號(hào)序列SEQIDNo.9(V19)的構(gòu)建物轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)物之間無明顯差別。用電噴質(zhì)譜顯示用V19序列產(chǎn)生的抗體質(zhì)量與用對(duì)照構(gòu)建物產(chǎn)生的相同，提示抗體分泌過程中V19序列已被正確加工。在采用IO升實(shí)驗(yàn)室規(guī)模生物反應(yīng)罐的分批進(jìn)料生物反應(yīng)罐培養(yǎng)中，進(jìn)行了16次IO升實(shí)驗(yàn)室規(guī)模生物反應(yīng)罐培養(yǎng)。諸細(xì)胞系達(dá)到最大活細(xì)胞濃度的范圍很廣。含信號(hào)序列SEQIDNo.9(V19)的細(xì)胞系達(dá)到了9.6-17.9X106個(gè)細(xì)胞/毫升，對(duì)照信號(hào)序列的細(xì)胞系達(dá)到了8.5-19.1乂106個(gè)細(xì)胞/毫升。"新信號(hào)序列"培養(yǎng)物活細(xì)胞濃度的平均時(shí)間積分(IVC)為2395乂106個(gè)細(xì)胞.小時(shí)/毫升，而對(duì)照細(xì)胞系的IVC為2511Xl()S個(gè)細(xì)胞.小時(shí)/毫升。含信號(hào)序列V19(SEQIDNo.9)的細(xì)胞系收獲的平均抗體濃度為2870.3mg/L，對(duì)照細(xì)胞系為2577.1mg/L。第15天收獲生物反應(yīng)罐培養(yǎng)物。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室規(guī)模生物反應(yīng)罐培養(yǎng)的結(jié)論是，含V19的細(xì)胞系導(dǎo)致平均抗體濃度提高11%，然而差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義是由于觀察到的產(chǎn)率范圍太廣。權(quán)利要求1.一種使哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞分泌異源蛋白的表達(dá)盒，該表達(dá)盒包含的啟動(dòng)子功能性連接于編碼信號(hào)肽的DNA序列，該序列框內(nèi)連接于編碼異源蛋白的DNA序列，其中，編碼該信號(hào)肽的DNA序列選自編碼氨基酸序列MMRP[疏水性氨基酸]nTSALA的DNA序列，或編碼氨基酸序列MKT[疏水性氨基酸]nCATVHC的DNA序列，其中n是4-16之間的整數(shù)，所述疏水氨基酸是A、I、L、M、F或V。2.如權(quán)利要求1所述的表達(dá)盒，其特征在于，所述編碼信號(hào)序列的DNA序列選自SEQIDNo.8或SEQIDNo.lO，或編碼SEQIDNo.7或SEQIDNo.9所示氨基酸序列的DNA序列。3.—種哺乳動(dòng)物表達(dá)載體，其包含的啟動(dòng)子功能性連接于編碼信號(hào)肽的DNA序列，該序列框內(nèi)連接于編碼異源蛋白的DNA序列，其中，編碼該信號(hào)肽的DNA序列選自編碼氨基酸序列MMRP[疏水性氨基酸]nTSALA的DNA序列，或編碼氨基酸序列MKT[疏水性氨基酸]nCATVHC的DNA序列，其中n是4-16之間的整數(shù)，所述疏水氨基酸是A、I、L、M、F或V。4.如權(quán)利要求3所述的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體，其特征在于，所述編碼信號(hào)序列的DNA序列選自SEQIDNo.8或SEQIDNo.10，或編碼SEQIDNo.7或SEQIDNo.9所示氨基酸序列的DNA序列。5.含有權(quán)利要求3或4所述哺乳動(dòng)物表達(dá)載體的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞。6.如權(quán)利要求5所述的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞是中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。7.—種生產(chǎn)重組蛋白的方法，該方法包括以下步驟a)用權(quán)利要求3或4所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，b)在合適的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)該宿主細(xì)胞，使細(xì)胞增殖和表達(dá)重組蛋白，并且重組蛋白由宿主細(xì)胞分泌到培養(yǎng)基中，c)收獲培養(yǎng)基中分泌的重組蛋白。8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞是CHO細(xì)胞。全文摘要本發(fā)明涉及基于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)和分泌系統(tǒng)，及利用分泌性信號(hào)肽表達(dá)和分泌重組蛋白。本發(fā)明也涉及使哺乳動(dòng)物細(xì)胞，具體是CHO細(xì)胞分泌異源基因所用的表達(dá)盒。本發(fā)明還涉及使哺乳動(dòng)物細(xì)胞，如CHO細(xì)胞分泌異源蛋白的方法。文檔編號(hào)C07K7/08GK101687910SQ200880018842公開日2010年3月31日申請(qǐng)日期2008年6月3日優(yōu)先權(quán)日2007年6月4日發(fā)明者J·蘭斯,R·楊申請(qǐng)人:英國龍沙生物醫(yī)藥股份有限公司