專利名稱：：侵潤(rùn)宮頸惡性腫瘤的t細(xì)胞所靶向的用于疫苗的hpv表位的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)藥和免疫學(xué)領(lǐng)域。特別涉及可用于預(yù)防、治療和/或診斷HPV相關(guān)疾病的新的HPV表位。
背景技術(shù)：
：宮頸癌是全世界第二高發(fā)的癌癥(Boschetal.2003)。在大約三分之二的患者中，宮頸癌的致病原因是高風(fēng)險(xiǎn)的16型和18型人乳頭狀瘤病毒(humanpapillomavirus,HPV)(Boschetal.1995，Munozetal.2003)。HPV基因組編碼2種致癌蛋白，E6和E7，由于它們是惡性細(xì)胞表型的發(fā)作和維持所需的，因此其在高級(jí)宮頸病變和宮頸癌中組成性表達(dá)(ZurHausen，1996)。這些癌蛋白的腫瘤特異性表達(dá)，以及在幾乎二分之一的宮頸癌患者的外周血中檢測(cè)到低水平的E6-和E7特異循環(huán)性T細(xì)胞的存在(deJongetal.2004，vanderBergetal.2001，Weltersetal.2003，Weltersetal.2006，Ressingetal.1996，Bontkesetal.2000，Luxtonetal.1996)，表明它們可能充當(dāng)腫瘤排斥抗原。然而，循環(huán)的HPV特異性T細(xì)胞的存在并不意味著它們有助于抗腫瘤應(yīng)答。為了控制疾病，這些T細(xì)胞應(yīng)當(dāng)至少能夠深入腫瘤位點(diǎn)。事實(shí)上，一定比例的宮頸癌為淋巴細(xì)胞所侵潤(rùn)(Bethwaiteetal.1996，Chaoetal.1999，Piersmaetal.2007)，但或許是由于從腫瘤組織中建立T細(xì)胞培養(yǎng)物相對(duì)困難，因而對(duì)侵潤(rùn)這些宮頸腫瘤的T細(xì)胞的特異性和類型尚缺少透徹的了解。然而，一些早期的先行者能夠從腫瘤中分離到HPV特異性的腫瘤侵潤(rùn)性淋巴細(xì)胞(tumorinfiltratinglymphocytes,TIL)，結(jié)果是鑒定出HPV16的兩個(gè)單獨(dú)的CD8+T細(xì)胞表位(Evansetal.1997，Oerkeetal.2005)和兩個(gè)低流行高風(fēng)險(xiǎn)HPV59和HPV33亞型的CD4T細(xì)胞表位(Hohnetal.1999，Hohnetal.2000)。然而，迫切需要對(duì)侵潤(rùn)宮頸組織侵潤(rùn)性淋巴細(xì)胞(cervicaltissue-infiltratinglymphocytes)開展更大規(guī)模的研究，以便了解HPV特異的適應(yīng)性免疫應(yīng)答在宮頸癌中的作用和角色。此外，這將允許合理地設(shè)計(jì)成功的免疫干涉策略。最近的研究表明，兩種細(xì)胞因子即IL-7和IL-15在CD4+和CD8+效應(yīng)記憶T細(xì)胞(effectormemoryTcells)的擴(kuò)增和存活中發(fā)揮主要作用。IL-7為效應(yīng)T細(xì)胞提供存活信號(hào)(Lietal.2003)。IL-15是啟動(dòng)T細(xì)胞分裂的重要生長(zhǎng)因子，并且與通常用于擴(kuò)增TIL培養(yǎng)物的IL-2相反，其不限制T細(xì)胞的連續(xù)擴(kuò)增(Lietal.2001)。而且，IL-15也能作為CD8(+)記憶T細(xì)胞的抗原非依賴性激活劑(Liuetal.2002)。總之，IL-7和IL-15能夠與非常高效的效應(yīng)記憶T細(xì)胞一起擴(kuò)增，而中樞記憶T細(xì)胞的應(yīng)答性更小并且天然T細(xì)胞不能對(duì)這些細(xì)胞因子的剌激作出應(yīng)答(Geginatetal.2001，McKinlayetal.2007，Bacchettaetal.2002)。以往的許多研究已經(jīng)報(bào)道了II型腿C(腿CclassII)限制來自外周血單核細(xì)胞(PBMC)的T細(xì)胞識(shí)別由HPV16和/或?qū)7蛋白的序列所組成的合成肽。W002/070006公開了針對(duì)由HPV16E6蛋白的127-142位氨基酸組成的肽的DR1限制性應(yīng)答，針對(duì)由HPV16E7蛋白的35-50位氨基酸組成的肽的DQ2限制性應(yīng)答，針對(duì)由HPV16E7蛋白的43-77位氨基酸組成的肽的DR3限制性應(yīng)答，以及針對(duì)由HPV16E7蛋白的50-62位氨基酸組成的肽的DR15限制性應(yīng)答。Strang等公開了無癥狀個(gè)體PBMC中針對(duì)由HPV16E6蛋白的42_57位氨基酸組成的肽的DR7限制性應(yīng)答。Altmann等公開了DR1/DR11型無癥狀個(gè)體PBMC中針對(duì)由HPV16E7蛋白的5-18位氨基酸組成的肽的應(yīng)答，DR4/DR13型無癥狀個(gè)體PBMC中針對(duì)由HPV16E7蛋白的17-34位氨基酸組成的肽的應(yīng)答，以及DR4/DR13型無癥狀個(gè)體PBMC中針對(duì)由HPV16E7蛋白的69-82位氨基酸組成的肽的應(yīng)答。W002/090382公開了來自HPV16E6和E7蛋白的一系列重疊肽對(duì)白種人群體中最普遍的HLA-DR分子的結(jié)合親和性。W002/090382還報(bào)道了患有鮑恩樣丘疹病(bowenoidp即ulosis)患者的貧CD8PBMC中針對(duì)許多HPV16E6和E7肽的應(yīng)答。然而仍需要對(duì)HPV相關(guān)惡性腫瘤中腫瘤侵潤(rùn)性淋巴細(xì)胞的存在、類型和特異性進(jìn)行了解，優(yōu)選對(duì)諸如HPV16、18、31、33和45等更流行的高風(fēng)險(xiǎn)亞型進(jìn)行了解。本發(fā)明的目的是提供作為腫瘤侵潤(rùn)性淋巴細(xì)胞的靶標(biāo)并可以用于預(yù)防、治療和/或診斷HPV相關(guān)疾病的HPV表位。發(fā)明概述本發(fā)明提供了新的T細(xì)胞表位，其是基于我們對(duì)一大組患有宮頸惡性腫瘤的70例患者中宮頸侵潤(rùn)性淋巴細(xì)胞的存在和HPV16或HPV18特異性的分析而鑒定的。我們發(fā)現(xiàn)，這些侵潤(rùn)性淋巴細(xì)胞包含HPV特異性T細(xì)胞。在更詳細(xì)的分析中，我們鑒定出17個(gè)新的004+和CD8+T細(xì)胞表位及它們的HLA限制性元件(restrictionelements)，而且還揭示了針對(duì)E6和E7癌蛋白所有部件的HPV特異性免疫應(yīng)答。出乎預(yù)料的是，絕大數(shù)CD4+T細(xì)胞表位在HLA-DQ和HLA-DP分子較少表達(dá)的情況下呈遞。由于所鑒定的T細(xì)胞表位構(gòu)成了針對(duì)HPV16和HPV18陽性腫瘤的免疫應(yīng)答中的生理靶標(biāo)，對(duì)于優(yōu)化HPV相關(guān)疾病的預(yù)防和HPV相關(guān)疾病患者的免疫療法而言，它們是有價(jià)值的靶標(biāo)?！矫妫景l(fā)明由此涉及最近鑒定的HPV的CD4+Th和CD8+CTL細(xì)胞表位的氨基酸序列，以及HPV衍生的合成的肽，并且包含這些肽的免疫原性組合物也是本發(fā)明的一部分。在患有HPV相關(guān)疾病包括HPV相關(guān)惡性腫瘤的廣泛患者中給藥后，這類肽使CD8+CTL效應(yīng)應(yīng)答和記憶應(yīng)答大幅改善、增強(qiáng)且延長(zhǎng)。作為CD4+Th應(yīng)答的結(jié)果，此類肽也能誘導(dǎo)更可能被效應(yīng)細(xì)胞侵潤(rùn)的大幅改善的促炎微環(huán)境。既然本發(fā)明的肽優(yōu)選單獨(dú)或組合用作疫苗或者用作免疫原性組合物的一部分，因此該肽優(yōu)選稱為疫苗肽，而該組合物則優(yōu)選稱為疫苗組合物。高度優(yōu)選將相對(duì)短的肽用于醫(yī)藥目的，因?yàn)檫@些相對(duì)短的肽可以在體外有效地合成，這對(duì)大于IOO個(gè)氨基酸的天然蛋白而言是不可能的或者是不經(jīng)濟(jì)的。肽的化學(xué)合成是常規(guī)方法并且本領(lǐng)域技術(shù)人員已知各種合適的方法。肽的化學(xué)合成也克服了與重組生產(chǎn)完整蛋白有關(guān)的問題，重組生產(chǎn)難于標(biāo)準(zhǔn)化并需要繁復(fù)的純化和質(zhì)量控制手段。如W002/070006所闡述的那樣，長(zhǎng)度超過I型HLA和II型HLA表位長(zhǎng)度(例如，具有下文所述長(zhǎng)度)的肽特別有利于用作疫苗組分，因?yàn)樗鼈兇蟮阶阋员粚ｉT的抗原呈遞細(xì)胞，特別是DC攝取，并且在所含的I型HLA和II型HLA表位發(fā)生細(xì)胞表面呈遞前，就在DC中進(jìn)行了加工。由此，應(yīng)用本發(fā)明的具有本文所述長(zhǎng)度(如Zwavelingetal.，2002，J.Immunol.169:350所示)的肽防止非抗原呈遞細(xì)胞上最小I型HLA表位(minimalHLAI印itope)的系統(tǒng)性呈遞不利地誘導(dǎo)T細(xì)胞耐受性(如Toesetal.，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A93:7855和Toesetal.，1996，J.Immunol.156:3911所示)。包含不被呈遞至CTL和/或Th細(xì)胞的T細(xì)胞受體的表位的肽，優(yōu)選具有足以同時(shí)含有I型HLA表位和II型HLA表位的長(zhǎng)度。本發(fā)明的第一方面提供了包含連續(xù)氨基酸序列的肽，所述連續(xù)氨基酸序列選自HPVE6和E7蛋白中至少之一的全長(zhǎng)氨基酸序列。優(yōu)選所述連續(xù)氨基酸序列選自高風(fēng)險(xiǎn)HPV血清型例如血清型16、18、31、33或45的HPVE6和E7蛋白的全長(zhǎng)氨基酸序列，更優(yōu)選選自HPVE6和E7血清型16、18、31或33的氨基酸序列，最優(yōu)選選自HPV血清型16或18的氨基酸序列，其中血清型16是最優(yōu)選的。HPV血清型16的E6和E7蛋白的氨基酸序列分別記錄在SEQIDNos:1和2中。HPV血清型18E6和E7蛋白的氨基酸分別記錄在SEQIDNos:3和4中。優(yōu)選地，該肽包含至少一個(gè)II型HLATh細(xì)胞表位和/或至少一個(gè)I型HLA細(xì)胞毒性T細(xì)胞表位，優(yōu)選下文更詳細(xì)限定的表位。優(yōu)選該肽的長(zhǎng)度不超過IOO個(gè)氨基酸，并包含選自上述HPV蛋白中之一的氨基酸序列的至少19個(gè)連續(xù)氨基酸，其中該肽優(yōu)選包含I1型HLA表位和I型HLA表位中至少之一，更優(yōu)選既包含II型HLA表位中至少之一又包含至少一個(gè)I型HLA表位，最優(yōu)選(但不是必需的)包含兩個(gè)來自上述HPV蛋白之一的氨基酸序列的表位。更優(yōu)選地，在肽中，至少一個(gè)II型HLA表位和至少一個(gè)I型HLA表位存在于來自上述HPV蛋白之一的氨基酸序列的連續(xù)氨基酸序列中。為了便于闡述，本發(fā)明的肽優(yōu)選包含I型HLA呈遞表位和/或II型HLA呈遞表位。這些表位中的每一個(gè)都是可呈遞的且在經(jīng)過本文所述加工后將與存在于細(xì)胞上的相應(yīng)特異性HLA分子結(jié)合。在本發(fā)明的上下文中，HLA單倍型特異性表位因而也可以稱為與HLA單倍型結(jié)合、由其呈遞和/或受其限制的表位。在本發(fā)明的上下文中，"肽的長(zhǎng)度不超過100個(gè)氨基酸"優(yōu)選意指，源自HPV蛋白并存在于本文所述肽中的連續(xù)氨基酸的數(shù)量是100、98、96、94、92、92或更少。由此，通過限定，本文所述肽不同于全長(zhǎng)HPV蛋白。除源自HPV蛋白的氨基酸外，此類肽還可以包含其他氨基酸，或者可以完全由源自HPV蛋白的氨基酸序列構(gòu)成或組成。該肽所包含的來自上述HPV蛋白中之一的連續(xù)氨基酸序列的長(zhǎng)度優(yōu)選是至少19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45個(gè)氨基酸和/或優(yōu)選不超過100、99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、60、50、45、40、35、33或30個(gè)氨基酸，更優(yōu)選該肽所包含的來自上述HPV蛋白中之一的連續(xù)氨基酸序列的長(zhǎng)度是19-45，甚至更優(yōu)選是22-40個(gè)氨基酸，甚至更優(yōu)選30-35個(gè)，最優(yōu)選33-35個(gè)氨基酸。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽由任何來自本文所述HPV蛋白的連續(xù)氨基酸序列組成，由此可以理解，該來自HPV蛋白的連續(xù)氨基酸序列的任一末端都沒有添加氨基酸，該氨基酸在天然HPV蛋白序列中不與這種氨基酸序列鄰接。本發(fā)明的肽易于合成并大到足以被專門的抗原呈遞細(xì)胞攝取，被蛋白酶體加工，并且具有的物理性能和長(zhǎng)度足以含有至少一個(gè)I型HLA和/或至少一個(gè)II型HLA表位。任選地，肽可以包含N或C末端延伸，其可以是氨基酸、經(jīng)修飾的氨基酸或其他例如可以增強(qiáng)生物利用度、細(xì)胞攝取、加工和/或溶解性的功能基團(tuán)。6本發(fā)明優(yōu)選肽的長(zhǎng)度不超過100、98、96、94、92個(gè)氨基酸并包含來自HPVE6和E7蛋白中至少之一的氨基酸序列的至少19個(gè)連續(xù)氨基酸，其中該連續(xù)氨基酸序列包含T細(xì)胞識(shí)別的表位，所述T細(xì)胞侵潤(rùn)宮頸瘤病變，或所述T細(xì)胞存在于或分離自骨盆區(qū)的淋巴結(jié)，所述淋巴結(jié)從宮頸瘤病變中引流，優(yōu)選所述T細(xì)胞存在于或分離自包含轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞的引流淋巴結(jié)。本發(fā)明的肽優(yōu)選用于誘導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答。在本發(fā)明另一優(yōu)選的肽中，連續(xù)氨基酸序列包含選自如下的表位HPVE6蛋白的11-32位氨基酸、HPVE6蛋白的37-68位氨基酸、HPVE6蛋白的52-61位氨基酸、HPVE6蛋白的51-72位氨基酸、HPVE6蛋白55-86的位氨基酸、HPVE6蛋白的61-82位氨基酸、HPVE6蛋白的71-92位氨基酸、HPVE6蛋白73-105的位氨基酸、HPVE6蛋白91-112的位氨基酸、HPVE6蛋白的101-122位氨基酸、HPVE6蛋白的121-142位氨基酸、HPVE6蛋白的129-138位氨基酸、HPVE7蛋白的1_32位氨基酸、HPVE7蛋白的21-42位氨基酸、HPVE7蛋白的51-72位氨基酸、HPVE7蛋白的76-86位氨基酸、HPVE6蛋白的13-22位氨基酸、HPVE6蛋白的29-38位氨基酸、HPVE6蛋白的52-61位氨基酸、HPVE6蛋白的129-138位氨基酸、HPVE6蛋白的137-146位氨基酸、HPVE6蛋白的149-158位氨基酸以及HPVE7蛋白的11-19位氨基酸。仍然在本發(fā)明另一優(yōu)選的肽中，連續(xù)氨基酸序列包含選自SEQIDNos:5-26的表位。本發(fā)明優(yōu)選的肽包含至少II型HPV特異性CD4+Th細(xì)胞表位。優(yōu)選地，包含于本發(fā)明肽中的II型CD4+Th細(xì)胞表位能夠誘導(dǎo)或激活HPV相關(guān)疾病人類患者和/或健康對(duì)照中的CD4+Th細(xì)胞。所述激活優(yōu)選離體(exvivo)或在體內(nèi)進(jìn)行評(píng)估，更優(yōu)選地在患有諸如HPV相關(guān)惡性腫瘤之類的HPV相關(guān)疾病的人類患者中評(píng)估，其中感染的細(xì)胞和/或腫瘤細(xì)胞表達(dá)上述HPV蛋白。最優(yōu)選地，II型HLA表位能夠激活CD4+Th記憶應(yīng)答和/或CD4+Th效應(yīng)應(yīng)答，即激活CD45R0陽性CD4+Th細(xì)胞。這將通過"殺傷許可"(licensetokill)信號(hào)經(jīng)DC的CD40觸發(fā)(Lanzavecchia，1998)導(dǎo)致更強(qiáng)的CD8+效應(yīng)和記憶CTL應(yīng)答。在另一情況(setting)中，激活的CD4+Th細(xì)胞可以激活免疫系統(tǒng)的非HLA限制性殺傷細(xì)胞(non-HUVrestrictedkillercell)。包含于本發(fā)明肽(的連續(xù)序列)中的優(yōu)選II型CD4+Th細(xì)胞表位選自HPVE6蛋白的11-32位氨基酸、HPVE6蛋白的37-68位氨基酸、HPVE6蛋白的52-61位氨基酸、HPVE6蛋白的51-72位氨基酸、HPVE6蛋白的55-86位氨基酸、HPVE6蛋白的61-82位氨基酸、HPVE6蛋白的71-92位氨基酸、HPVE6蛋白的73-105位氨基酸、HPVE6蛋白的91-112位氨基酸、HPVE6蛋白的101-122位氨基酸、HPVE6蛋白的121-142位氨基酸、HPVE6蛋白的129-138位氨基酸、HPVE7蛋白的1_32位氨基酸、HPVE7蛋白的21-42位氨基酸、HPVE7蛋白的51-72位氨基酸以及HPVE7蛋白的76-86位氨基酸。包含于本發(fā)明肽(的連續(xù)序列)中的更優(yōu)選的II型CD4+Th細(xì)胞表位選自SEQIDNos:5-21。包含于本發(fā)明肽(的連續(xù)序列)中的另一優(yōu)選II型CD4+Th細(xì)胞表位是受選自DR4、DR7、DR12、DR15、DP1、DP0201、DP4、DP14、DP1401、DP17、DQ5、DQ6、DP1901、DQ*0301、DQ*0302、DQ*0308、DQ*0501的單倍型限制的表位。包含于本發(fā)明肽(的連續(xù)序列)中的另一優(yōu)選II型CD4+Th細(xì)胞表位是受DP或DQ單倍型限制的表位，其中DPl、DP0201、DP4、DP14、DP1401、DP17、DQ5、DQ6、DP1901、DQ*0301、DQ*0302、DQ*0308以及DQ*0501是更優(yōu)選的。之前公開的HLA-DQ限制性表位(W002/070006)由HPV16E7蛋白的35-50位氨基酸組7成。然而該表位是由外周T細(xì)胞識(shí)別的表位，而不是由侵潤(rùn)宮頸瘤病變的T細(xì)胞或存在于或分離自骨盆區(qū)淋巴結(jié)的T細(xì)胞識(shí)別的表位，所述淋巴結(jié)從宮頸瘤病變中引流。因此本發(fā)明肽的連續(xù)序列優(yōu)選不包含由HPV16E7蛋白的35-50位氨基酸組成的表位。因此，包含于本發(fā)明肽(的連續(xù)序列)中的優(yōu)選II型CD4+Th細(xì)胞表位是受DP或DQ單倍型限制而不是受DR單倍型限制的表位。已知HLA-DR分子的表達(dá)在腫瘤細(xì)胞中被上調(diào)。此處的呈遞，與非專門的抗原呈遞細(xì)胞(AntigenPresentingCells,APC)中的抗原呈遞一樣，導(dǎo)致耐受性的誘導(dǎo)。HLA-DP或-DQ分子的表達(dá)低得多，但在諸如DC之類專門的APC上呈遞時(shí)，HLA-DQ和HLA-DP表位可以導(dǎo)致有效的免疫應(yīng)答。包含于本發(fā)明肽(的連續(xù)序列)中的仍然另一優(yōu)選II型CD4+Th細(xì)胞表位是受DP或DQ單倍型限制的表位，且是HPVE6或E7蛋白的表位，更優(yōu)選HPV血清型16、18、31、33或45的E6或E7蛋白的表位，以及最優(yōu)選HPV血清型16或18的E6或E7蛋白的表位，其中HPV血清型16是最優(yōu)選的。包含于本發(fā)明肽(的連續(xù)序列)中的又一優(yōu)選II型CD4+Th細(xì)胞表位是選自下述的表位HPVE6蛋白的11-32位氨基酸、HPVE6蛋白的37-68位氨基酸、HPVE6蛋白的52-61位氨基酸、HPVE6蛋白的51-72位氨基酸、HPVE6蛋白的61-82位氨基酸、HPVE6蛋白的71-92位氨基酸、HPVE6蛋白的73-105位氨基酸、HPVE6蛋白的91-112位氨基酸、HPVE6蛋白的101-122位氨基酸、HPVE6蛋白的121-142位氨基酸、HPVE7蛋白的1_32位氨基酸以及HPVE7蛋白的51-72位氨基酸。包含于本發(fā)明肽(的連續(xù)序列)中的更優(yōu)選的II型CD4+Th細(xì)胞表位選自SEQIDNos:5、6、7、9、10、11、12、13、16、18、19、20和21。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽包含至少I型HPV特異性CD8+CTL表位。另外，所述I型HLA表位優(yōu)選能夠激活CD8+CTL應(yīng)答。最優(yōu)選地，在健康對(duì)照個(gè)體中，甚至更優(yōu)選在患有諸如HPV相關(guān)惡性腫瘤的HPV相關(guān)疾病的人類患者中，CTL的激活能力已經(jīng)離體和/或體內(nèi)證明，其受感染的細(xì)胞和/或腫瘤細(xì)胞表達(dá)上述HPV蛋白。由于在發(fā)動(dòng)和維持有效CTL細(xì)胞應(yīng)答中的協(xié)同作用，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在一種肽中同時(shí)存在I型HLA和II型HLA表位是特別有利的(如Zwavelingetal.，2002所示)。包含表位的肽優(yōu)選滿足多項(xiàng)要求，所述表位將被呈遞至CTL和/或Th細(xì)胞的T細(xì)胞受體。肽的長(zhǎng)度優(yōu)選足以含有I型HLA和II型HLA表位。此外，肽優(yōu)選在其I型HLA結(jié)合部分中包含錨定殘基，以便能分別結(jié)合I型分子。肽和呈遞的MHC分子之間相互作用的穩(wěn)定性優(yōu)選足以產(chǎn)生顯著而有效的免疫應(yīng)答。因而在本發(fā)明的上下文中，肽和呈遞的MHC分子之間相互作用的穩(wěn)定性優(yōu)選為肽具有中度至高度結(jié)合親和性，由此IC5?！都s5i！M被認(rèn)為是高度親和性，約5iiM<IC5?！都s15iiM被認(rèn)為是中度結(jié)合親和性，約15iiM<IC5?！?00yM被認(rèn)為是低結(jié)合親和性，而IC5。>約100iiM則被認(rèn)為是沒有結(jié)合親和性，據(jù)此肽對(duì)MHC分子的結(jié)合親和性按照vanderBurgetal.，1995和Kessleretal.，2003所述來確定。產(chǎn)生表位C末端的特異性蛋白酶體切割位點(diǎn)優(yōu)選正好處于表位氨基酸序列之后，以便從更大的肽中得以釋放并呈遞于I型HLA分子上。對(duì)II型HLA呈遞的表位而言，長(zhǎng)度要求則寬松的多，因此對(duì)精確地酶促產(chǎn)生II型結(jié)合肽的需要，沒那么絕對(duì)。這些要求已經(jīng)應(yīng)用于本發(fā)明中，以便在HPV蛋白的全長(zhǎng)序列中特別是在HPVE6和E7蛋白中定位和設(shè)計(jì)肽，所述肽包含優(yōu)選的CTL和Th細(xì)胞表位和/或其組合并由此成為高度適合接種目的的肽。此外，優(yōu)選利用體外或離體T細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)本發(fā)明肽誘導(dǎo)CD4+Th和CD8+CTL實(shí)質(zhì)性應(yīng)答能力。由此本發(fā)明在選擇相對(duì)短的肽方面提供了明顯改善，所述相對(duì)短的肽可以化學(xué)合成的包含最具潛力并可最廣泛使用的衍生于HPVE6和E7腫瘤抗原的I型HLA和/或II型HLA呈遞的T細(xì)胞表位。肽在蛋白酶體切割方面進(jìn)行特別優(yōu)化并優(yōu)選含有I型HLA和II型HLA表位中至少之一并且更優(yōu)選既含有I型HLA表位又含有II型HLA表位。本發(fā)明肽所含有的CTL表位經(jīng)20S蛋白酶體釋放C末端而提供具有CD8+CTL剌激能力的I型HLA結(jié)合片段。本發(fā)明HPV肽中的I型HLA表位優(yōu)選能呈遞于在待治療人類群體中占優(yōu)勢(shì)的HLA等位基因上。源自本發(fā)明肽的HPV中的優(yōu)選I型HLA表位是能結(jié)合HLA-A2、HLA-B7、HLA-B14、HLA-B32、HLA-B57和HLA初201的表位。最優(yōu)選的I型HLACTL表位是結(jié)合HLA-B的HPV表位，其中HLA-B7、HLA-B14、HLA-B32、HLA-B57是最優(yōu)選的。I型HLA表位優(yōu)選具有高度肽結(jié)合能力(IC5?！都s5iiM的肽)或具有至少中度親和性(5iiM<IC5。《約15iiM的肽)。包含于本發(fā)明肽(的連續(xù)序列)中的優(yōu)選的I型CTL表位是如上所述受I型單倍型限制的表位，并且是HPVE6或E7蛋白的表位，更優(yōu)選是HPV血清型16、18、31、33或45的E6或E7蛋白的表位，最優(yōu)選HPV血清型16或18的E6或E7蛋白的表位，其中血清型16是最優(yōu)選的。包含于本發(fā)明肽(的連續(xù)序列)中的優(yōu)選的I型CTL表位選自HPVE6蛋白的11-32位氨基酸、HPVE6蛋白的29-38位氨基酸、HPVE6蛋白的52-61位氨基酸、HPVE6蛋白的129-138位氨基酸、HPVE6蛋白的137-146位氨基酸、HPVE6蛋白的149-158位氨基酸以及HPVE7蛋白的11-19位氨基酸。包含于本發(fā)明肽(的連續(xù)序列)中更優(yōu)選的II型CD4+Th細(xì)胞表位選自SEQIDNos:7、14、22-26。包含于本發(fā)明肽中的優(yōu)選表位是由HLA-B分子呈遞的表位。優(yōu)選地，HLA-B分子是HLA-B7、HLA-B14、HLA-B27或HLA-B57分子。此類表位選自SEQIDNos:7、22、24、25和26。包含于本發(fā)明肽中的另一優(yōu)選表位是由HLA-A分子呈遞的表位。優(yōu)選地，HLA-A分子是HLA-A2或HLA*0201分子。此類表位選自SEQIDNos:23和26。根據(jù)更優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明肽的長(zhǎng)度不超過100、98、96、94、92個(gè)氨基酸，并包含來自HPV蛋白的連續(xù)氨基酸序列，所述連續(xù)氨基酸序列選自HPVE6蛋白的l-32位氨基酸、HPVE6蛋白的19-50位氨基酸、HPVE6蛋白的41-65位氨基酸、HPVE6蛋白的55-80位氨基酸、HPVE6蛋白的71-95位氨基酸、HPVE6蛋白的85-109位氨基酸、HPVE6蛋白的91-122位氨基酸、HPVE6蛋白的109-140位氨基酸、HPVE6蛋白的127-158位氨基酸、HPVE7蛋白的l-35位點(diǎn)氨基酸、HPVE7蛋白的22-56位氨基酸、HPVE7蛋白的43-77位氨基酸以及HPVE7蛋白的64-98位氨基酸。更優(yōu)選，本發(fā)明的肽由來自HPV蛋白的連續(xù)氨基酸序列組成，所述連續(xù)氨基酸序列選自HPVE6蛋白的1-32位氨基酸、HPVE6蛋白的19-50位氨基酸、HPVE6蛋白的41-65位氨基酸、HPVE6蛋白的55-80位氨基酸、HPVE6蛋白的71-95位氨基酸、HPVE6蛋白的85-109位氨基酸、HPVE6蛋白的91-122位氨基酸、HPVE6蛋白的109-140位氨基酸、HPVE6蛋白的127-158位氨基酸、HPVE7蛋白的1_35位點(diǎn)氨基酸、HPVE7蛋白的22-56位氨基酸、HPVE7蛋白的43-77位氨基酸以及HPVE7蛋白的64-98位氨基酸。HPVE6或E7蛋白的連續(xù)氨基酸序列優(yōu)選是HPV血清型16、18、31、33或45的連9續(xù)氨基酸序列，最優(yōu)選HPV血清型16或18的連續(xù)氨基酸序列，其中HPV血清型16是最優(yōu)選的。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說顯而易見的是，一旦本文所限定的肽中的表位存在于所述肽中，則本文所限定的肽便具有與所述肽中的表位(例如本發(fā)明中，被鑒定為HLA-DQ和HLA-DP分子中至少之一所呈遞的和/或侵潤(rùn)宮頸瘤病變的T細(xì)胞或來自引流淋巴結(jié)的T細(xì)胞所識(shí)別的表位)存在有關(guān)的期望且有利的性質(zhì)。本發(fā)明的肽優(yōu)選用于誘導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，即便本申請(qǐng)沒有鑒定出每個(gè)可設(shè)計(jì)成包含本文所鑒定的期望表位或由該表位組成的肽，但本發(fā)明囊括了本文所限定的包含本文所鑒定的表位或由所述表位組成的任何肽。在優(yōu)選實(shí)施方案中，肽不同于HPV蛋白。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中。肽不包含HPV16E7的35-50位氨基酸或不是由所述氨基酸組成。例如，一優(yōu)選表位是SEQIDNO:5(HPV16E6的11-32位氨基酸)。該段是闡述性的且可應(yīng)用于本文所鑒定的每一表位。包含SEQIDNo:5的任何肽都包括于本發(fā)明中，且可以根據(jù)本發(fā)明來使用。在該優(yōu)選實(shí)施方案中，肽與HPV蛋白不同。本發(fā)明肽的優(yōu)選氨基酸長(zhǎng)度已經(jīng)在本文中作了限定。當(dāng)設(shè)計(jì)本發(fā)明的肽時(shí)，該肽可以從本發(fā)明所鑒定的給定表位的N末端位點(diǎn)開始或者在本文所鑒定的給定表位的C末端結(jié)束?？蛇x地，給定的表位(例如SEQIDNO:5)可以包含于本發(fā)明的肽中。以SEQIDNO:5為例，如果我們?cè)O(shè)計(jì)長(zhǎng)度為45個(gè)氨基酸的肽，此類肽可以包含來自HPV16E6的11-56、1-45、2-46、3-47、4-48、5-49、5-50位氨基酸或由其組成。本發(fā)明的肽還可以包含本文所限定的或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何其他HPV表位。在該優(yōu)選實(shí)施方案中(SEQIDNO:5作為表位)，肽不包含US2005/0142541所公開的HPV16E6的9-33位氨基酸或由其組成。在該優(yōu)選實(shí)施方案中，肽不包含EP451550所公開的HPV16E6的1-37位氨基酸或由其組成。在該優(yōu)選實(shí)施方案中，肽不包含括US5，629，161所公開的HPV16E6的8-37位氨基酸或由其組成。在優(yōu)選實(shí)施方案中，包含SEQIDNO:5的肽包含10-32、1-32、1-45、11-56、2-46、3-47、5-49、5-50或由其組成，數(shù)字表示HPV16E6的啟始或終止氨基酸。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中(以SEQIDNO:8作為表位，HPV16E6的55-86位氨基酸)，肽不包含uniprot所公開的登錄號(hào)為Q919B2(1-99，該數(shù)字代表HPV16E6的啟始或終止氨基酸)或Q80882(l-84)的HPV16E6的片段或由其組成。對(duì)于該實(shí)施方案來說，包含SEQIDNO:8的肽也可以從該表位N末端位點(diǎn)啟始，或者在該表位的C末端位點(diǎn)結(jié)束，或者該表位可以存在于該肽中。例如，如果我們?cè)O(shè)計(jì)長(zhǎng)度為45個(gè)氨基酸的肽，此類肽可以包含55-100、41-86、45-90或由其組成，數(shù)字表示HPV16E6蛋白氨基酸序列的啟始或終止氨基酸。本發(fā)明HPV衍生的肽可以通過一個(gè)或多個(gè)氨基酸的缺失或取代或者通過其它氨基酸或功能基團(tuán)在N末端或C末端延伸來進(jìn)行修飾，所述其它氨基酸或功能基團(tuán)可以提高生物利用度從而靶向T細(xì)胞，或者包含或釋放提供輔助或(共)剌激作用的免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)。N末端和/或C末端處可選的其它氨基酸優(yōu)選不存在于HPV蛋白天然氨基酸序列的相應(yīng)位置上，更優(yōu)選它們不是來自任何HPVE6或E7氨基酸序列(例如SEQIDNos:l-4)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，各種HPV血清型的HPV氨基酸序列都清楚地包括于本發(fā)明中。本發(fā)明HPV衍生的肽可通過化學(xué)合成和隨后純化的方式而得到(例如，參見實(shí)施例1)。本發(fā)明HPV衍生的肽優(yōu)選可以溶解于生理上可接受的包含不超過35X、20X、10X、105X或0X匿S0的水溶液中(例如PBS)。在此類溶液中，肽優(yōu)選是可溶的，濃度至少為O.5、1、2、4或8mg/ml肽。更優(yōu)選地，一種以上不同的本發(fā)明HPV衍生肽的混合物在此類溶液中是可溶的，濃度至少為0.5、1、2、4或8mg/ml肽。本發(fā)明肽的優(yōu)選用途是作為藥物的用途，由此，更優(yōu)選地，肽用作疫苗或其活性組分。每種肽都可以單獨(dú)也可以優(yōu)選地與至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、15及最多20種不同的本發(fā)明肽組合用于治療和/或預(yù)防癌癥，制備藥物，優(yōu)選治療或預(yù)防HPV相關(guān)疾病的疫苗。本發(fā)明的此類藥物和/或抗腫瘤疫苗可用于治療患有下述非廣延名錄疾病或處于發(fā)展下述非廣延名錄疾病風(fēng)險(xiǎn)的患者宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)、外陰上皮內(nèi)瘤變(VIN)、陰道上皮內(nèi)瘤變(VaIN)、肛門上皮內(nèi)瘤變(AIN)及陰莖上皮內(nèi)瘤變(PIN)，以及宮頸癌、外陰癌、陰道癌、肛門癌、陰莖癌和頭頸癌。在另一方面，本發(fā)明還涉及可以用于治療和/或接種人類個(gè)體的組合物，其包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、15及最多20種不同的上文所限定的本發(fā)明肽，以及任選地一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑，特別是佐劑和免疫調(diào)節(jié)劑。優(yōu)選地，組合物是藥物組合物和/或意圖用作藥物。藥物組合物優(yōu)選意圖用來接種。藥物組合物優(yōu)選用于治療和/或預(yù)防癌癥，制備藥物，優(yōu)選用于治療或預(yù)防HPV相關(guān)疾病的疫苗。非窮盡的HPV相關(guān)疾病列表已在本文給出。由此，本發(fā)明一方面涉及肽在制備用于預(yù)防和/或治療HPV相關(guān)疾病的藥物中的用途，其中肽的長(zhǎng)度不超過100、98、96、94、92個(gè)氨基酸并包含來自HPVE6和E7蛋白中至少之一的氨基酸序列的至少19個(gè)連續(xù)氨基酸，其中所述連續(xù)氨基酸序列包含HLA-DQ和HLA-DP分子中至少之一所呈遞的表位。優(yōu)選地，該表位不是HLA-DQ2中所呈遞的和由HPV16E7蛋白的35-50位氨基酸組成的表位?？蛇x擇地或在另一實(shí)施方案中和前述優(yōu)選實(shí)施方案組合，連續(xù)氨基酸序列包含侵潤(rùn)宮頸瘤病變的T細(xì)胞或來自引流淋巴結(jié)的T細(xì)胞所識(shí)別的表位。肽、連續(xù)氨基酸序列和表位優(yōu)選如上述所限定的。本發(fā)明另一方面涉及肽在制備用于預(yù)防和/或治療HPV相關(guān)疾病的藥物中的用途，其中的肽長(zhǎng)度不超過100、98、96、94、92個(gè)氨基酸并包含來自HPVE6和E7蛋白中至少之一的氨基酸序列的至少19個(gè)連續(xù)氨基酸，其中所述連續(xù)氨基酸序列包含侵潤(rùn)宮頸瘤病變的T細(xì)胞或者引流淋巴結(jié)中的T細(xì)胞所識(shí)別的表位。肽、連續(xù)氨基酸序列以及表位優(yōu)選如上文所限定的。藥物的配制、給藥方法以及藥學(xué)上可接受的輔料的用途都是本領(lǐng)域已知并常用的，且描述于例如Remington;TheScienceandPracticeofPharmacy(雷明頓藥物學(xué)和實(shí)踐)，2TtEditon2005，UniversityofSciencesinPhiladelphia。盡管能夠想到使用其它給藥途徑，如通過注射肌肉給藥或/和通過注射皮內(nèi)(intradermal)和/或皮內(nèi)(intracutaneous)給藥，但本發(fā)明的藥物組合物和藥物優(yōu)選配制成適用于靜脈內(nèi)給藥或皮下給藥或肌肉內(nèi)給藥。本文優(yōu)選皮內(nèi)給藥。與皮內(nèi)給藥具體相關(guān)的優(yōu)點(diǎn)和/或優(yōu)選的實(shí)施方案稍后在名為"皮內(nèi)給藥(intradermaladministration)"的單獨(dú)一節(jié)中進(jìn)行限定。本發(fā)明包括，可以作為單次給藥，給予本發(fā)明的至少一種肽和/或至少一種組合物?？蛇x擇地，如果需要，可以重復(fù)給予至少一種肽和/或至少一種組合物，和/或可以依次給予本發(fā)明不同的肽和/或組合物。本發(fā)明的藥物組合物(也稱為藥物)可優(yōu)選地包含至少一種剌激免疫應(yīng)答的化合11物或佐劑。有利的是，本發(fā)明的藥物組合物可以另外包含一種或多種合成的佐劑。這些佐劑可以混合到本發(fā)明的藥物組合物中或可以單獨(dú)給予待治療的哺乳動(dòng)物或人。已知經(jīng)由To11樣受體和/或經(jīng)由RIG-1(維甲酸誘導(dǎo)基因-1)蛋白和/或經(jīng)由內(nèi)皮受體發(fā)揮作用的佐劑是特別優(yōu)選的。能夠激活固有免疫系統(tǒng)的免疫修飾化合物能夠通過Toll樣受體(TLR's)包括TLR'sl-10而得到很好的激活。能激活TLR受體的化合物以及其修飾物和衍生物在本領(lǐng)域中已有詳細(xì)記載。TLR1可以被細(xì)菌脂蛋白及其乙酰化形式激活，此外TLR2可以被革蘭氏陽性菌的糖脂、LPS、LPA、LTA、纖毛(fimbriae)、外膜蛋白、細(xì)菌或宿主的熱休克蛋白以及分支桿菌聚阿拉伯糖甘露糖脂(Mycobacteriallipoarabinomannan)激活。TLR3可被dsRNA特別是被病毒來源的dsRNA激活，或被poly(I:C)化合物激活。TLR4可以被革蘭氏陰性菌的細(xì)菌或宿主LPS、LTA、來自宿主或細(xì)菌的熱休克蛋白、病毒包被或包膜蛋白、泰克索(taxol)或其衍生物、含寡糖的透明質(zhì)酸及纖連蛋白激活。TLR5可以用細(xì)菌鞭毛或鞭毛蛋白激活。TLR6可以被分枝桿菌脂蛋白及B組鏈球菌熱不穩(wěn)定性可溶因子(GBS-F)或鏈球菌調(diào)制蛋白(modulins)激活。TLR7可以被咪唑喹啉(imidazoquinolines)激活。TLR9可被未甲基化的CpGDNA或染色質(zhì)-IgG復(fù)合物激活。特別是，TLR3、TLR7和TLR9在介導(dǎo)針對(duì)病毒感染的固有免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，并且特別優(yōu)選能夠激活這些受體的化合物用于本發(fā)明的治療方法和本發(fā)明的組合物或藥物中。特別優(yōu)選的佐劑包括但不限于經(jīng)合成所產(chǎn)生的化合物，其含有dsRNA、poly(1:C)、引發(fā)TLR3和TLR9受體的未甲基化的CpGDNA;IC31、TLR9激動(dòng)劑、MSAVAC、TLR4激動(dòng)劑、MontanideISA_51、MontanideISA720(S印pic7產(chǎn)佐劑，法國)。已知RIG-1蛋白通過如TLR3之類的ds-RNA激活(Immunity,(2005)，1:19-28)。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，合成的佐劑化合物與本發(fā)明的肽物理性連接。佐劑及共剌激化合物或功能基團(tuán)與包含I型HLA和II型HLA表位的肽之間的物理性連接通過同時(shí)剌激抗原呈遞細(xì)胞從而提供增強(qiáng)的免疫應(yīng)答，所述抗原呈遞細(xì)胞特別是內(nèi)在化、代謝與展示抗原的樹突狀細(xì)胞。另一優(yōu)選的免疫修飾化合物是諸如BQ-788的內(nèi)皮素受體抑制劑(BuckanovichRJetal.NatureMedicine(2008)，14:28-36，IshikawaK，PNAS(1994)91:4892)。BQ-788即N-頂式-2，6二甲基piperidinocarbonyl-L-y-甲基亮氨?；鵢D_1-甲氧基羰基色氨酰-D-己氨酸。然而任何BQ-788衍生物或修飾的BQ-788化合物也包括于本發(fā)明范圍內(nèi)。此外，優(yōu)選將W099/61065和W003/084999中所述抗原呈遞細(xì)胞(共)剌激分子與本發(fā)明的肽和組合物聯(lián)合使用。特別是，優(yōu)選將4-l-BB和/或CD40配體、激動(dòng)性抗體、0X40配體或其功能性片段及其衍生物以及具有類似激動(dòng)活性的合成化合物單獨(dú)或與本發(fā)明的肽一起給予患者，以便進(jìn)一步剌激患者最佳免疫應(yīng)答的發(fā)動(dòng)。另外，優(yōu)選的實(shí)施方案包括在諸如礦物油(例如MontanideISA51)或PLGA的緩釋媒介中送遞肽，與或不與額外的免疫剌激劑，例如TLR配體和/或抗CD40/抗-4-1BB抗體一起。可選擇地，本發(fā)明的肽可通過例如注射方式與或不與免疫剌激劑(佐劑)一起經(jīng)皮內(nèi)送遞。優(yōu)選地，為進(jìn)行皮內(nèi)送遞，本發(fā)明的肽采用組合物的形式給藥，組合物由所述肽和一種或多種免疫上惰性的藥學(xué)上可接受的載體組成，所述載體例如是具有生理性離子強(qiáng)度和/或重量摩爾滲透壓濃度的緩沖水溶液(例如PBS)。皮內(nèi)給藥在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明所用的肽或包含肽的組合物或藥物，都如本文所限定的，將它們配制成適用于皮內(nèi)給藥或應(yīng)用。皮內(nèi)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是已知的。在本發(fā)明上下文中，皮內(nèi)(intradermal)是皮內(nèi)(intracutaneous)的同義詞，并與皮下不同。物質(zhì)最表面的應(yīng)用是上表皮上(印icutaenous)，然后是皮內(nèi)應(yīng)用(在皮膚中或進(jìn)到皮膚中)，然后是皮下應(yīng)用(僅在皮膚下的組織中)，然后是肌肉內(nèi)應(yīng)用(進(jìn)入肌肉體中)。皮內(nèi)應(yīng)用通常采用注射進(jìn)行，物質(zhì)的皮內(nèi)注射通常用于測(cè)試可能的反應(yīng)，對(duì)其的過敏性和/或細(xì)胞免疫性。皮下給藥通常也采用注射方式進(jìn)行將針剌入皮膚下的組織中。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，用于本發(fā)明的藥物不含任何諸如MontanideISA-51之類的佐劑，這意味著藥物配制更簡(jiǎn)單在所用的藥物中優(yōu)選沒有基于油-水的乳劑。因此，本發(fā)明所用藥物不包含諸如MontanideISA-51之類的佐劑和/或不包含基于水包油的乳劑。因此，在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明所用藥物是具有生理性離子強(qiáng)度和/或重量摩爾滲透壓濃度的包含一種或多種前述肽或由其組成的緩沖水溶液，例如PBS(磷酸鹽緩沖液)。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道如何制備此類溶液。本發(fā)明所用藥物具有另一優(yōu)點(diǎn)，即通過皮內(nèi)給予低量本文早先所限定的肽仍能實(shí)現(xiàn)免疫原性作用。所使用的每一種肽的量?jī)?yōu)選在1-1000i！g之間，更優(yōu)選在5-500i！g之間，甚至更優(yōu)選在10-100iig之間。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，藥物包含本文早先所限定的肽以及至少一種佐劑，所述佐劑不配制于本文早先所限定的基于水包油的乳劑中和/或不是水包油乳劑類型佐劑?？蛇x地，如果需要，本文早先所限定的肽和/或佐劑可以重復(fù)給藥，和/或不同的肽和/或不同的佐劑可以依次給藥。本發(fā)明還包括，皮內(nèi)給予本發(fā)明的肽，而依次給予本文所限定的佐劑。佐劑可以皮內(nèi)給藥。然而任何其它給藥途徑都可以用于佐劑。由于實(shí)現(xiàn)在盡可能處于或盡可能靠近導(dǎo)致引流淋巴結(jié)的疾病局部激活、導(dǎo)致免疫系統(tǒng)更強(qiáng)的局部激活的疾病位點(diǎn)注射疫苗，因而肽的皮內(nèi)給藥是非常受歡迎的。特別是對(duì)于VIN、VAIN、AIN、PIN、陰莖癌、外陰癌、肛門癌、頭頸癌而言。在優(yōu)選實(shí)施方案中，皮內(nèi)給藥直接在病變或疾病位點(diǎn)實(shí)施。本文的在病變位點(diǎn)理解為在距離病變位點(diǎn)不超過5、2、1、0.5、0.2或0.lcm內(nèi)。皮內(nèi)給予本文所限定的藥物后，不僅引發(fā)Th2應(yīng)答也引發(fā)Th1應(yīng)答。這是令人驚奇的，因?yàn)橐呀?jīng)發(fā)現(xiàn)，通過基因槍引發(fā)皮膚抗原導(dǎo)致選擇性Th2免疫應(yīng)答(AlvarezD.etal，2005)。此外，所觀察到的免疫應(yīng)答不僅僅局限于皮膚，如基于(AlvarezD.etal，2005)所預(yù)期的。我們證明，分泌IFNY的特異性T細(xì)胞循環(huán)通過第二淋巴系統(tǒng)，因?yàn)樵诩ぐl(fā)后的外周血中檢測(cè)到它們。本發(fā)明藥物的另一重要優(yōu)點(diǎn)是，可以以簡(jiǎn)單制劑、單發(fā)形式(onesingleshot)，給予相對(duì)低量的肽，而無需已知會(huì)帶來不利副作用的任何佐劑如MontanideISA_51。不期望受任何理論約束，我們認(rèn)為本發(fā)明所用的HPV皮內(nèi)肽(intradermalp印tide(s))特異性地且直接靶向存在于表皮中的表皮朗格漢斯細(xì)胞(Langerhanscell，LC)。朗格漢斯細(xì)胞是可表現(xiàn)出啟動(dòng)初級(jí)免疫應(yīng)答的顯著能力的特定DC亞型(RomaniN.etal.1992)。這些LC可以看作本發(fā)明所用藥物招募的天然佐劑。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及HPV-E2、-E6和/或_E7蛋白衍生的肽在制備用于治療或預(yù)防HPV相關(guān)疾病的藥物中的用途，其中如本文早前所限定的，該藥物用于皮內(nèi)給藥，此外，其中HPV-E2、-E6和/或-E7蛋白衍生的肽，進(jìn)一步用于制備用于治療或預(yù)防HPV相關(guān)疾病的藥物，其中該藥物用于皮下給藥。本文已經(jīng)對(duì)用于皮內(nèi)給藥的藥物作了限定。用于皮下給藥的肽與用于皮下給藥的肽相同，且已經(jīng)在本文中作了限定。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道如何配制適于皮下給藥的藥物。優(yōu)選地，適于皮下給藥的藥物包含與佐劑組合使用的已在本文中限定的肽。優(yōu)選的佐劑已在本文提及。其他優(yōu)選的佐劑是諸如弗氏不完全佐劑或IFA、MontanideISA-51或MontanideISA720(S印pic法國)之類水包油的乳劑類型的佐劑。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，適于皮下給藥的藥物包含一種或多種肽、佐劑(兩者都如本文早前所限定的)以及藥學(xué)上可接受的惰性載體和/或賦形劑(它們都如本文早前所限定的)。藥物的配制以及藥學(xué)上可接受的賦形劑的應(yīng)用是本領(lǐng)域已知且慣用的，例如描述于Remington;TheScienceandPracticeofPharmacy,2lndEdition2005，UniversityofSciencesinPhiladelphia將本發(fā)明所用的第二藥物配制成適于皮下給藥。在該優(yōu)選的實(shí)施方案中，適于皮內(nèi)給藥的藥物可與適于皮下給藥的藥物同時(shí)給藥?？蛇x地，這兩種藥物可以先皮內(nèi)給藥、后皮下給藥，或反之亦可(先皮下給藥，后皮內(nèi)給藥)。在前述用于描述皮內(nèi)給藥的優(yōu)選實(shí)施方案中，如果需要，可按對(duì)本文早前所限定的肽和/或佐劑進(jìn)行重復(fù)的皮內(nèi)和/或皮下給藥，和/或可以依次對(duì)不同的肽和/或不同的佐劑進(jìn)行皮內(nèi)和/或皮下給藥。本發(fā)明還包括，本發(fā)明的肽皮內(nèi)和/或皮下給藥，而本文早前所限定的佐劑依次給藥。佐劑可以皮內(nèi)和/或皮下給藥。然而，任何其他給藥途徑也可用于佐劑。我們預(yù)期，本發(fā)明藥物皮內(nèi)和皮下給藥的組合是有益的。表皮的DC顯然與真皮和真皮下層的DC不同。皮內(nèi)(皮內(nèi)(intradermal))免疫會(huì)引起抗原加工和表皮DC(朗格漢斯陽性朗格漢斯細(xì)胞)的激活，它們通過其樹突狀網(wǎng)絡(luò)與角質(zhì)細(xì)胞緊密接觸。這也將最佳地激活朗格漢斯細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞之間相互作用的炎性通路，隨后將抗原負(fù)載和激活的朗格漢斯細(xì)胞胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)至皮膚引流淋巴結(jié)。皮下給藥會(huì)激活其他DC亞型(subset)，其也將變?yōu)樨?fù)載抗原的并獨(dú)立地行進(jìn)至皮膚引流淋巴結(jié)。令人信服的是，使用既可以皮內(nèi)給藥也可皮下給藥的藥物，可以通過不同DC亞型導(dǎo)致這些引流淋巴結(jié)中T細(xì)胞的協(xié)同剌激。本發(fā)明另一方面涉及編碼上文所限定的肽和/或表位的核酸。優(yōu)選地，該核酸不編碼野生型全長(zhǎng)HPVE6或E7蛋白而是編碼本發(fā)明的或者側(cè)翼為與野生型HPVE6或E7蛋白不鄰接的氨基酸的肽和/或表位。此類側(cè)翼氨基酸可以來自除野生型HPVE6或E7蛋白以外的蛋白和/或它們可以來自野生型蛋白E6或E7蛋白的其他位置，所述其他位置不和兩端為側(cè)翼氨基酸序列的肽/表位鄰接。在優(yōu)選實(shí)施方案中，該核酸編碼兩個(gè)或多個(gè)如成串珠(beads-on-string)排列的本發(fā)明的肽和/或表位，據(jù)此本發(fā)明的肽和/或表位(珠)直接連接在一起和/或通過接頭序列連接，所述接頭序列來自除野生型HPVE6或E7蛋白以外的蛋白，和/或來自野生型HPVE6或E7蛋白中與兩端是接頭序列的肽/表位不相鄰接的其他位置。位于肽/表位側(cè)翼或與其連接的氨基酸序列可以包含蛋白水解切割位點(diǎn)。此類核酸可以用于以各種方式送遞本發(fā)明的肽/表位。它們可以例如用于在合適的宿主(例如E.coli)中制備并純化重組蛋白?？蛇x地，該核酸可操作地連接于表達(dá)調(diào)節(jié)序列(啟動(dòng)子等)并與并入人細(xì)胞的表達(dá)構(gòu)建體?？呻x體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)此類(自體)細(xì)胞，以便將其(再)給予需要它們的患者?？蛇x地，表達(dá)構(gòu)建體可以并入到合適的基因治療載體中。對(duì)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)而言，與非病毒載體相比，病毒載體(基于缺陷病毒)是更有效的媒介。合適的病毒表達(dá)構(gòu)建體包括，例如基于腺病毒、腺相關(guān)病毒(AAV)、逆轉(zhuǎn)錄酶病毒或修飾的安卡拉疫苗(MVA)的載體。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了從能與本文所述的本發(fā)明HPV表位相互作用的T細(xì)胞中分離HPV特異性T細(xì)胞受體(Tcellrec印tor，TCR)分子的工具。本發(fā)明的TCR優(yōu)選在處于HLA分子中和/或受HLA分子展示時(shí)能和包含肽的HPV表位相互作用，反應(yīng)優(yōu)選在體外或體內(nèi)活細(xì)胞中進(jìn)行。T細(xì)胞受體以及特別是編碼本發(fā)明TCR's的核酸可以例如用于將此類TCR轉(zhuǎn)移至患者的T細(xì)胞中，否則該患者無法提高針對(duì)本發(fā)明所述HPV表位的T細(xì)胞免疫。通過這種TCR克隆方法，可以提供與待用該T細(xì)胞克隆進(jìn)行治療的患者實(shí)質(zhì)上同基因的T細(xì)胞克隆，即該TCR表達(dá)T細(xì)胞克隆與患HPV相關(guān)疾病的患者是自體的。由此該方法提供能夠識(shí)別本發(fā)明HPV表位的T細(xì)胞克隆，該T細(xì)胞克隆是在需要其的個(gè)體中針對(duì)表達(dá)HPV表位的腫瘤和/或HPV感染細(xì)胞而產(chǎn)生的且能夠被其特異性地靶向。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，從個(gè)體分離T細(xì)胞并用本文所述識(shí)別本發(fā)明HPV表位的TCR轉(zhuǎn)導(dǎo)。在篩選和擴(kuò)增后，其是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的，可以將這些正表達(dá)可以識(shí)別HPV誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞或HPV感染細(xì)胞的TCR的自體T細(xì)胞，再次輸注給患者，它們?cè)诨颊唧w內(nèi)特異性地靶向腫瘤和HPV感染的細(xì)胞。因此，本發(fā)明提供了編碼和表達(dá)能與本文所述HPV表位相互作用的T細(xì)胞受體的T淋巴細(xì)胞，優(yōu)選在HLA分子中。所述T淋巴細(xì)胞可以是重組體或天然選擇的T淋巴細(xì)胞。本發(fā)明的T淋巴細(xì)胞也可以用于本發(fā)明的方法和藥物組合物中。由此本說明書提供了至少兩種制備本發(fā)明細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的方法，包括在利于激發(fā)免疫應(yīng)答的環(huán)境下，使未分化的淋巴細(xì)胞與本發(fā)明HPV表位(或含該表位的肽)接觸，其可以例如用本發(fā)明的肽在接受植入的患者體內(nèi)或體外實(shí)施?？蛇x地，該方法可以通過將編碼與本發(fā)明HPV表位特異性相互作用的TCR的基因克隆入宿主細(xì)胞和/或宿主淋巴細(xì)胞，優(yōu)選自體淋巴細(xì)胞且任選地分化為細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)而實(shí)施，所述基因可以從前述方法所獲得的細(xì)胞中得到或者可以從表現(xiàn)出針對(duì)HPV表位的免疫應(yīng)答的個(gè)體中獲得。本實(shí)施方案方法的細(xì)節(jié)描述于例如DeWitteetal.2006禾卩Schumacheretal.2002。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及編碼本發(fā)明肽和/或表位的核酸、識(shí)別本發(fā)明表位的T細(xì)胞受體、編碼該T細(xì)胞受體的核酸、表達(dá)此類核酸的T細(xì)胞(克隆)作為藥物的用途。優(yōu)選地，該藥物用于治療和/或預(yù)防HPV相關(guān)疾病。本發(fā)明的此類藥物可以用于治療患有下列非廣延名錄疾病或處于發(fā)展該疾病風(fēng)險(xiǎn)的患者宮頸(CIN)、外陰(VIN)、陰道(ValN)、肛門(AIN)及陰莖(PIN)，以及宮頸癌、外陰癌、陰道癌、肛門癌、陰莖癌和頭頸癌。在本文及其權(quán)利要求中，詞語"包含"以及變形均采用其非限制性意義，意指包括該詞后的項(xiàng)目，但并不排除沒有被特別提到的項(xiàng)目。此外，詞語"由...組成"可以由"基本上由...組成"替換，意指除特別指明的組分以外本文所限定的肽或組合物可以包含其它組分，所述其它組分不改變本發(fā)明的獨(dú)特性質(zhì)。此外，涉及用不定冠詞"一(a)"或"一(an)"所限定的元素(element)并不排除存在超過一種該元素(element)的可能性，除非上下文明確要求存在一個(gè)且僅一個(gè)該元素。因而不定冠詞"一(a)"或"一(an)"通常表示"至少據(jù)此將本說明書中所引用的所有專利和參考文獻(xiàn)通過引用全文并入。僅處于闡述性目，提供下述實(shí)施例，并不意圖以任何方式限制本發(fā)明的范圍。1圖1A)從4例不同患者宮頸組織中分離的初始T細(xì)胞培養(yǎng)物的增殖。在利用HPV16或18、E6或E7肽庫及重組蛋白剌激后，所有T細(xì)胞培養(yǎng)物在三天的增殖分析中都能識(shí)別天然加工的抗原。C265識(shí)別HPV16E6月太庫1-92，C334識(shí)別HPV16E6月太庫71-158，C284識(shí)別HPV16E7肽庫1-98，以及C228識(shí)別HPV18E7肽庫1-106。B)通過增殖和IFNy產(chǎn)生測(cè)量利用單個(gè)肽的大批培養(yǎng)物的特異性的精細(xì)定位(finem即ping)。C265肽HPV16E637-68的剌激作出應(yīng)答，C334對(duì)HPV16E6肽137-158的剌激作出應(yīng)答，C284對(duì)HPV16E7肽71-92的剌激作出應(yīng)答，而C228對(duì)HPV18E7肽21-42的剌激作出應(yīng)答。圖2對(duì)HPV抗原作出應(yīng)答的T細(xì)胞類型進(jìn)行分析，如通過IFNy的細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色所測(cè)量的。對(duì)于陽性肽和蛋白而言，肽HPV16E641-62和HPV16E6蛋白用于C265，HPV16E6蛋白和月太137-158用于C334，HPV16E7蛋白和月太37-92用于C284，而HPV18E7蛋白和月太21-42用于C228。來自HPV負(fù)體(counterpart)的肽和蛋白用作陰性對(duì)照。C265的TIL培養(yǎng)物表現(xiàn)出CD4+和CD8+T細(xì)胞應(yīng)答，所述應(yīng)答都是對(duì)HPV16E641-62肽作出的。圖3A)在3天的增殖分析中，通過11型HLA抗體封閉CD4限制性應(yīng)答。用肽負(fù)載的自體B-LCL剌激C265衍生的T細(xì)胞，利用肽負(fù)載的僅和HLA-DR12匹配的單核細(xì)胞剌激C284衍生的T細(xì)胞，并用肽負(fù)載的單核細(xì)胞剌激C228衍生的T細(xì)胞，該單核細(xì)胞僅與HLA-DQ*0302匹配。B)TIL培養(yǎng)物的精細(xì)定位和HLA限制性。用經(jīng)10-mer(單體單位)肽脈沖的自體B-LCL剌激患者C265的CD4+T細(xì)胞，并在ELISPOT(酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法)分析中檢測(cè)，所述10-mer肽涵蓋了所識(shí)別的較長(zhǎng)肽的氨基酸序列。為了測(cè)定這些CD4+T細(xì)胞的限制性，用僅與HLA-DP2匹配的單核細(xì)胞對(duì)它們進(jìn)行剌激。同樣，通過在ELISPOT分析孵育中這些T細(xì)胞和10-mer肽，測(cè)定C334的CD8T細(xì)胞所識(shí)別的最小肽表位。利用經(jīng)肽脈沖的分離自與患者I型HLA分子部分匹配的健康個(gè)體的PBMC，測(cè)定C334CD8+T細(xì)胞應(yīng)答的HLA限制性。圖4存在于C427腫瘤引流淋巴結(jié)中的T細(xì)胞反應(yīng)性分析。A)用HPV16E6肽脈沖的自體B-LCL剌激3周后T細(xì)胞培養(yǎng)物的反應(yīng)性，其是在3天增殖分析中測(cè)量的。B)上圖T細(xì)胞培養(yǎng)物對(duì)用單一22-mer肽脈沖的自體B-LCL剌激的識(shí)別模式。下圖衍生于該初始LNMC培養(yǎng)物的T細(xì)胞克隆所識(shí)別的最小表位圖。在3天增殖分析中，剌激并檢測(cè)CD4T細(xì)胞克隆C427.47(左圖)。在IFNyELISPOT分析中，檢測(cè)CD8T細(xì)胞克隆C427.78(右圖)。C)用胞內(nèi)細(xì)胞因子染色測(cè)定T細(xì)胞應(yīng)答類型。HPV16E6肽ll-32(上圖)和肽137-158(下圖)用作陽性肽。HPV18E7肽和蛋白則用作陰性對(duì)照。D)利用II型HLA封閉性抗體對(duì)II型部分匹配的B-LCL(C427.478，上圖)和I型HLA部分匹配的B-LCL(C427.78，下圖)的限制性元件(restrictionelement)進(jìn)行分析，表明CD4+T細(xì)胞應(yīng)答受HLA-DP14限制而CD8+T細(xì)胞應(yīng)答則受HLA-B14限制。圖519例健康供體(healthydonors,HD)組中數(shù)量、出現(xiàn)的天數(shù)以及注射的誘導(dǎo)了陽性皮膚反應(yīng)的抗原的概括圖。如果在注射后不少于2天時(shí)間里出現(xiàn)直徑超過2mm的丘疹，則認(rèn)為皮膚反應(yīng)是陽性的。所示布局圖用于8個(gè)肽庫，指示了所用肽庫蛋白的第一個(gè)和最后一個(gè)氨基酸。粗體表示的布局圖分表示該時(shí)間框架中的至少一個(gè)陽性反應(yīng)；實(shí)心方形代表新發(fā)生的所示肽庫的陽性皮膚反應(yīng)。圖6利用IFNyELIspot在健康供體預(yù)激發(fā)的血樣中檢測(cè)到HPV16特異性T細(xì)胞，與所識(shí)別肽庫的早期陽性皮膚反應(yīng)(earlypositiveskinreaction)十分相關(guān)(p=0.0003，雙尾Fisher精確檢驗(yàn)(twotailedFisher—sExtracttest))。通過從實(shí)驗(yàn)孔中的斑點(diǎn)平均數(shù)減去培養(yǎng)基對(duì)照的平均斑點(diǎn)數(shù)+2XSD，計(jì)算特異性應(yīng)答。給出了每100，000個(gè)PBMC中特異性斑點(diǎn)的數(shù)量。如果在100，000個(gè)PBMC中肽庫特異性T細(xì)胞的頻率^5，則認(rèn)為應(yīng)答為陽性的。圖7健康供體激發(fā)后的血樣中陽性皮膚反應(yīng)和同時(shí)檢測(cè)(IFNyELIspot)循環(huán)HPV特異性T細(xì)胞間的關(guān)系(p<0.0001，雙尾Fisher精確檢驗(yàn))?？偣?8例皮膚測(cè)試中，有39例是陽性的。39例反應(yīng)中有25例與ELIspot中的陽性反應(yīng)相關(guān)(在100，000PBMCs中，T細(xì)胞的頻率^5)。在49個(gè)不顯示皮膚反應(yīng)的皮膚測(cè)試中，10個(gè)與陽性ELIspot相關(guān)。圖8A.在健康供體激發(fā)后的血樣中通過IFNyELIspot所檢測(cè)到的HPV16特異性T細(xì)胞應(yīng)答，表現(xiàn)出陽性皮膚反應(yīng)。對(duì)每100，000個(gè)PBMCs中斑點(diǎn)平均數(shù)作了描述。記憶應(yīng)答混合物(Memoryresponsemix,MRM)用作陽性對(duì)照。實(shí)心柱表示陽性皮膚反應(yīng)位點(diǎn)，從該位點(diǎn)中獲得了穿孔活檢(punchbiopsy)并進(jìn)行培養(yǎng)。B.在細(xì)胞因子所驅(qū)動(dòng)的14-28天擴(kuò)增期后，檢測(cè)從穿孔活檢中滲出(exfiltrate)的T淋巴細(xì)胞在受到如皮膚測(cè)試中所注射的肽(lOiig/ml)或蛋白(20iig/ml)脈沖的單核細(xì)胞剌激時(shí)的增殖能力。植物血凝素(phytohemaggutin，PHA)充當(dāng)陽性對(duì)照。利用[3H]胸苷摻入對(duì)增殖進(jìn)行測(cè)量，并將增殖應(yīng)答特定限定為剌激指數(shù)(stimulationindex,SI)>3。健康供體17(HD17)是陽性皮膚反應(yīng)位點(diǎn)由非特異性T細(xì)胞組成的實(shí)例。C.利用流式細(xì)胞珠陣列分析在B中增殖應(yīng)答的上清液中IFNY、白細(xì)胞介素4(IL4)、IL5和腫瘤壞死因子a、IL2、IL10的存在(未示出)。臨界值(cut-offvalues)以不同細(xì)胞因子的標(biāo)準(zhǔn)曲線為基礎(chǔ)(對(duì)于剩余的細(xì)胞因子而言，100pg/mlIFNy和20pg/ml)。抗原特異性細(xì)胞因子的產(chǎn)生被限定為細(xì)胞因子的濃度超過臨界水平并〉2X培養(yǎng)基對(duì)照的濃度。健康供體15(HD15)表現(xiàn)出高IL5背景水平，單在抗原剌激后增加>2X。圖9健康供體15(HD15)的庫4皮膚活檢的T細(xì)胞培養(yǎng)物由HPV16特異性CD4+和CD8+T細(xì)胞兩者組成。對(duì)與注射皮膚測(cè)試一致的蛋白(20iig/ml)和肽(10iig/ml)，在細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色中檢測(cè)培養(yǎng)物的特異性。明顯地，在4份活檢的3份中檢測(cè)到CD8+HPV16特異性T細(xì)胞。實(shí)施例實(shí)施例1:新PHV表位的鑒定和表征1.方法1.1個(gè)體在萊頓大學(xué)醫(yī)學(xué)中心的婦科部(印artmentofGynaecologyoftheLeidenUniversityMedicalCentre)以及海牙leyenburg醫(yī)院(LeyenburgHospitaltheHague),表現(xiàn)出經(jīng)組織學(xué)證實(shí)的患宮頸瘤的婦女參與了CIRCLE研究，該研究在提供知情同意書后調(diào)查針對(duì)HPV16陽性宮頸病變的免疫性。該研究方案獲得了兩家醫(yī)院的醫(yī)藥倫理委員會(huì)的許可。利用從手術(shù)切除的樣本中所分離的DNA的HPV16和HPV18特異性引物，檢測(cè)個(gè)體的HPV狀態(tài)(Classetal.1989)。用于HLA限制性分析的外周血單核細(xì)胞(PBMC)獲自知情同意的HLA型匿名健康血液供體。1.2抗原T細(xì)胞剌激分析中采用了一套涵蓋HPV16和HPV18E6及E7蛋白的重疊肽。HPV16和HPV18E6和E7由重疊12個(gè)殘基的22-mers組成。按照之前的描述合成并溶解肽(vanderBurgetal.2001，Weltersetal.2006)。按照之前的描述在重組E.coli中制備重組HPVE6和E7蛋白(vanderBurgetal.2001)。此外，制備一套HPV16E6和E7兩者的10-mer重疊(9個(gè)氨基酸重疊)，以便正確定位HPV16特異性T細(xì)胞所識(shí)別的肽表位。1.3抗原呈遞細(xì)胞將患者的EB病毒(Epstein-Barrvirus)轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞系(B-LCL)維持于含有10XFCS的MDM中。按照之前所述(deJongetal.2002)，從外周血淋巴細(xì)胞中制備單核細(xì)胞。1.4T細(xì)胞的分離和培養(yǎng)在子宮根治性切除術(shù)后獲得宮頸瘤活檢，活檢后從CINIII患者獲得宮頸瘤組織。將新鮮的宮頸組織切成約1咖3的片并在添加了10X人AB血清(Sigma，St.LouisM0，USA)、10%T細(xì)胞生長(zhǎng)因子(TCGF，Z印tometrix，BuffaloNY，US)和5ng/mlIL-15(P印rotech，RockyHillNJ，USA)的MDM中培養(yǎng)(BioWhittaker，Verviers，Belgium)。第一天，往培養(yǎng)物中添加5ng/mlIL-7(P印rotech)，以確保T細(xì)胞的生長(zhǎng)。在2-3周后，檢測(cè)T細(xì)胞(TIL，CIL)培養(yǎng)物的特異性，并利用經(jīng)照射的自體B-LCL及5ng/ml同源肽(cognat印印tide)的混合物擴(kuò)增陽性培養(yǎng)物。從骨盆區(qū)域中獲得淋巴結(jié)，該淋巴結(jié)含有腫瘤細(xì)胞，這是轉(zhuǎn)移性癌的標(biāo)志。將淋巴結(jié)切成片并在存在膠原酶(200IU/ml，Sigma)和DNAse(50yg/ml，Sigma)的情況下37。C孵育l小時(shí)，之后使所述淋巴結(jié)單核細(xì)胞通過細(xì)胞濾網(wǎng)(BD，Erebodemgem，Belgium)以獲得單細(xì)胞懸浮液。用HPV16或18E6或E7肽庫剌激單獨(dú)的LMNC培養(yǎng)物，并培養(yǎng)2_3周。根據(jù)對(duì)Evansetal改進(jìn)后的試驗(yàn)方案，利用有限稀釋(limitingdilution)分離T細(xì)胞克隆，所述改進(jìn)系用10%的TCGF和5ng/ml替換IL_2并添加0.5yg/ml植物血凝素(PHA，MurexDiagnostics,Dartford，區(qū))以激發(fā)T細(xì)胞受體。有限稀釋后，檢測(cè)T細(xì)胞的特異性并將其維持于含有10%小牛血清(FCS，PAAlaboratories,Pasching，Austria)、10%TCGF和5ng/mlIL-15的MDM中。利用培養(yǎng)基、來自3位不同供體的經(jīng)照射的PBMCT、B-LCL禾P0.5iig/mlPHA的混合物擴(kuò)增T細(xì)胞克隆。1.5T細(xì)胞特異性分析在3天的增殖分析中，在經(jīng)脈沖的自體單核細(xì)胞或經(jīng)照射的自體BVs上，一式三份檢測(cè)T細(xì)胞培養(yǎng)物(25，000-50，000個(gè)細(xì)胞/孔)對(duì)HPV16和18E6及E7肽(5yg/ml)和蛋白(lOyg/ml)的識(shí)別。48小時(shí)后收獲上清液并在-2(TC下儲(chǔ)存，用于細(xì)胞因子分析。在培養(yǎng)的最后16個(gè)小時(shí)期間，添加0.5iiCi/孔的[3H]胸苷，以便測(cè)量增殖(vanderBurgetal.2001)。按照之前描述(vanderBurgetal.1999)，用ELISA測(cè)量抗原特異性IFNy的產(chǎn)生。按照之前的報(bào)道(vanderBurgetal.1999)，利用抗HLA_DR(B8.11.2)、HLA-DQ(SPV.L3)和HLA-DP(B7-72)的鼠單克隆抗體，實(shí)施II型MHC封閉實(shí)驗(yàn)。在加入T細(xì)胞之前，將肽脈沖的APC與II型抗MHC抗體一起孵育2小時(shí)。按照之前所述(deJongeetal.2005)，列舉利用細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色所測(cè)量的IFNy產(chǎn)生T細(xì)胞。簡(jiǎn)而言之，用同源肽或重組蛋白負(fù)載APC，并與T細(xì)胞培養(yǎng)物一起孵育。孵育1小時(shí)后，添加10iig/ml布雷非德菌素A(brefeldinA，Sigma)，并孵育過夜。此后，用4%的多聚甲醛(Sigma)固定該細(xì)胞并用0.1%的皂角苷(S即onin)滲透。該樣品隨后用CD4-APC、CD8-perCP和IFNy-PE染色并通過流式細(xì)胞儀分析。用IFNyELISP0T分析CD8T細(xì)胞所識(shí)別的最小肽(vanderBurgetal.2001，Weltersetal.2006，deJongetal.2002)。以2X104的密度，將CD8T細(xì)胞系一式三份接禾中于包被有IFNy捕獲抗體(catchantibody,Mabtech.Nacha，Sweden)的Multyscreen96孑L禾反(Millipore，Etten—Leur，TheNetherlands)的孑L中。利用5iig/ml10—mer月太刺f敫微培養(yǎng)物，并孵育過夜。利用5g/ml10-mer肽脈沖的PBMC或用與等量T細(xì)胞共培養(yǎng)的B-LCL，分析CD8T細(xì)胞的HLA限制性。根據(jù)制造商的說明(Mabtech)對(duì)IFNy特異斑點(diǎn)進(jìn)行染色。在全自動(dòng)計(jì)算機(jī)輔助視屏成像系統(tǒng)(BIOSYS)中分析斑點(diǎn)的數(shù)量。2.結(jié)果2.1HPV特異性T細(xì)胞存在于宮頸瘤侵潤(rùn)性淋巴細(xì)胞中在本研究中，我們分析宮頸瘤病變中HPV16和HPV18特異性T細(xì)胞的存在、類型和特異性，所述宮頸瘤病變是HPV特異性T細(xì)胞遭遇其同源抗原并應(yīng)發(fā)揮其效應(yīng)功能的位點(diǎn)?？傆?jì)分析了74例患者。從61例患有宮頸癌的患者以及9例患有CINIII的其他患者中獲得宮頸組織。將切碎的組織片在含有IL-15的細(xì)胞因子和TCGF的混合物存在的情況培養(yǎng)2-3周。為了防止腫瘤特異性T細(xì)胞生長(zhǎng)過程中的潛在偏差，沒有給這些培養(yǎng)物提供外源性HPV抗原。在培養(yǎng)14-21天內(nèi)，收獲細(xì)胞因子擴(kuò)增的T細(xì)胞并用FACS進(jìn)行分析。這些培養(yǎng)物中CD3+T細(xì)胞的平均百分比從2周時(shí)的41%增加到3周時(shí)的68%。通常，如2周時(shí)CD3+、CD4+T細(xì)胞(34%±22%)和CD3+CD8+T細(xì)胞(52%±22%)的百分比，或者3周時(shí)(分別為38%±21%;48%±24%)的百分百所示，該培養(yǎng)方法并不有利于某一類型T細(xì)胞的選擇性生長(zhǎng)。個(gè)別培養(yǎng)物偶爾顯示出更顯著的CD4+或CD8+T細(xì)胞擴(kuò)增(未示出)。為了分析HPV特異性T細(xì)胞的存在，用經(jīng)重疊肽的不同庫以及各自重組蛋白脈沖的自體單核細(xì)胞剌激該培養(yǎng)物，所述重疊肽跨越HPV16和HPV18的E6和E7蛋白。在51例HPV16陽性或HPV18陽性患者中的19例中，我們能通過增殖檢測(cè)HPV特異性T細(xì)胞(表1，圖la)。這些培養(yǎng)物都對(duì)負(fù)載肽和蛋白的單核細(xì)胞作出應(yīng)答，表明T細(xì)胞識(shí)別天然加工的抗原。在8份培養(yǎng)物中，檢測(cè)到E6特異性T細(xì)胞，在10份培養(yǎng)物中T細(xì)胞對(duì)E7作出應(yīng)答，且在一份T細(xì)胞培養(yǎng)物中檢測(cè)到對(duì)E6和E7都作出應(yīng)答。重要的是，在HPV16和18份陰性宮頸癌組織(n=19)中未檢測(cè)到HPV16或HPV18特異性T細(xì)胞應(yīng)答，這表明體外沒有誘導(dǎo)出所觀察19到的HPV16和18特異性應(yīng)答(表1)。2.2HPV特異性CD4和CD8T細(xì)胞都侵潤(rùn)腫瘤組織對(duì)HPV特異性反應(yīng)性評(píng)價(jià)后，通過用同源肽、細(xì)胞因子混合物以及飼養(yǎng)細(xì)胞剌激，擴(kuò)增19份相應(yīng)的T細(xì)胞系。對(duì)這些HPV特異性培養(yǎng)物中的15份進(jìn)行充分?jǐn)U增，用于進(jìn)一步分析。在利用單一肽在短期剌激分析中，測(cè)定HPV特異性T細(xì)胞的良好特異性。5份培養(yǎng)物識(shí)別2種或多種不同肽，而其他10份培養(yǎng)物識(shí)別單一肽(圖lb，表1)。為了評(píng)價(jià)對(duì)抗原剌激作出應(yīng)答的T細(xì)胞的類型，用它們的同源肽和蛋白抗原對(duì)T細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行剌激，并用細(xì)胞內(nèi)IFNy染色分析應(yīng)答(圖2)。大多數(shù)TIL培養(yǎng)物都含有HPV特異的CD4+侵潤(rùn)性T淋巴細(xì)胞(n=13例患者，識(shí)別的13種不同肽)，而在6份培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)了HPV特異性CD8+T細(xì)胞侵潤(rùn)性淋巴細(xì)胞。在9份HPV特異性T細(xì)胞系中，僅檢測(cè)到CD4+T細(xì)胞應(yīng)答，在4份T細(xì)胞系中，CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞都反應(yīng)，在2份T細(xì)胞系中僅檢測(cè)到CD8T細(xì)胞應(yīng)答(表1，圖2)。2.3侵潤(rùn)淋巴細(xì)胞的腫瘤的HLA限制性利用封閉性抗體和分離自健康供體的與HLA部分匹配的APC，對(duì)參與HPV肽呈遞至CD8+T細(xì)胞以及CD4+T細(xì)胞的I型和II型HLA基因座進(jìn)行研究。發(fā)現(xiàn)廣泛多種的II型HLA分子都參與了抗原HPV16和18的E6和E7呈遞(表2)。使用抗HLA_DR、HLA_DQ和HLA-DP的封閉性抗體表明，所檢測(cè)到的應(yīng)答中的3個(gè)受HLA-DR限制，3個(gè)受HLA-DQ限制，以及3個(gè)受HLA-DP限制(圖3a，表2)。為測(cè)定參與HPV抗原呈遞的確切的HLA限制性元件，使用了健康捐供體的僅與一種HLA等位基因相匹配的APC(圖3)。在6例病例中，我們未能準(zhǔn)確確定限制性元件。在C265患者的情況下，HPV特異性CD4+和CD8+T細(xì)胞都對(duì)相同的肽作出應(yīng)答(圖2)。為區(qū)分這兩種T細(xì)胞應(yīng)答，通過有限稀釋建立T細(xì)胞克隆。不幸的是，僅僅獲得了CD4+T細(xì)胞克隆，因而只可以建立II型HLA限制性元件。因此，只可能對(duì)其他5份不同的HPV特異性CD8T細(xì)胞培養(yǎng)物中的最小肽和限制性進(jìn)行測(cè)定(表2)。作為實(shí)例，圖3顯示測(cè)定從自患者C334獲得的TIL培養(yǎng)物的CD8T細(xì)胞應(yīng)答的最小肽表位和限制性(圖3C)。由于該CD8T細(xì)胞培養(yǎng)物僅對(duì)HLA-B27匹配的肽負(fù)載APC作出應(yīng)答而不對(duì)來自其他供體的其它與I型HLA部分匹配的APC的剌激作出應(yīng)答，因而該應(yīng)答受HLA-B27限制(圖3C)。一例患者(C265)展示了針對(duì)2個(gè)不同表位的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答，而兩例患者(C176和C334)則對(duì)相同的HLA-B27限制性CTL表位作出應(yīng)答(表2)。2.4腫瘤引流淋巴節(jié)中的HPV特異性T細(xì)胞腫瘤引流淋巴結(jié)是HPV特異性T細(xì)胞受到激發(fā)和激活的位點(diǎn)，因此，也在來自6例不同宮頸癌患者的腫瘤引流淋巴結(jié)中對(duì)HPV特異性T細(xì)胞應(yīng)答進(jìn)行了研究。淋巴結(jié)單核細(xì)胞(lymphnodemononuclearcells,LNMC)的單細(xì)胞懸浮液分離自在其淋巴結(jié)中展示轉(zhuǎn)移的宮頸癌患者。我們不能在新分離的LNMC中離體直接檢測(cè)HPV特異性應(yīng)答(數(shù)據(jù)未示出)。因此，首先用HPV16或18E6和E7肽庫進(jìn)行一輪體外剌激，擴(kuò)增LNMC。在4個(gè)病例中，LNMC對(duì)HPV16作出應(yīng)答，而在1例患者中，通過增殖和IFNy產(chǎn)生檢測(cè)到HPV18應(yīng)答(表1，圖4A)。與TIL培養(yǎng)物類似，HPV16陽性腫瘤患者僅與HPV16反應(yīng)，而被診斷為HPV18陽性宮頸癌的患者則僅與HPV18反應(yīng)。盡管事實(shí)上用HPV16和HPV18肽對(duì)LNMC進(jìn)行了體外剌激，但在來自HPV16/18陰性患者的LMNC中則既沒有檢測(cè)到對(duì)HPV16的應(yīng)答也沒有檢測(cè)20到對(duì)HPV18的應(yīng)答(表1)。針對(duì)它們的良好特異性和HLA限制性元件，對(duì)分離自這些LNMC培養(yǎng)物的T細(xì)胞克隆進(jìn)行了表征。發(fā)現(xiàn)CD4+T細(xì)胞對(duì)10種不同肽的反應(yīng)性，其中7種未在TIL培養(yǎng)物中檢測(cè)到。這些表位中的3個(gè)受HLA-DQ限制，而其它4個(gè)則受HLA-DP限制。另外，鑒定出一個(gè)HLA-A*0201限制性和一個(gè)HLA-B14限制性CD8+T細(xì)胞表位(表2)。圖4顯示了對(duì)LNMC培養(yǎng)物進(jìn)行分析的實(shí)例。在一輪剌激后，該LNMC培養(yǎng)物對(duì)負(fù)載了PV16E6肽的庫或重組蛋白的APC作出特異性應(yīng)答(圖4A)。對(duì)單一肽反應(yīng)性的分析顯示識(shí)別大量全部肽(ar印ertoireofp印tides)(圖4B)，而分離自該培養(yǎng)物的CD4+和CD8+T細(xì)胞克隆則識(shí)別重組蛋白經(jīng)天然處理而得到的它們的同源抗原(圖4C)。利用II型HLA封閉性抗體和部分匹配供體的APC對(duì)限制性作了進(jìn)一步分析(圖4D)?？傊?，對(duì)TIL和腫瘤引流淋巴結(jié)細(xì)胞的分析都顯示，在54例不同HPV16或HPV18陽性患者的23例中，能夠檢測(cè)到對(duì)總共25種不同E6或E7衍生肽的特異性T細(xì)胞應(yīng)答。需要指出的是，13種CD4+T細(xì)胞肽表位受HLA-DQ或HLA-DP限制，3種受HLA-DR限制，而在6個(gè)病例中，我們未能區(qū)分HLA-DQ/DP和HLA-DR(表2)。對(duì)于所發(fā)現(xiàn)的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答，2種受HLA-A限制，4種受HLA-B限制，而2種則未得到確定(表2)。3.討論在動(dòng)物模型中，HPV16編碼的癌蛋白E6和E7能夠擔(dān)任腫瘤排斥抗原(Zwavelingetal.2002，Pengetal.2005)，表明它們?cè)趯m頸癌中也可以擔(dān)任腫瘤侵潤(rùn)性淋巴細(xì)胞的耙抗原，但這從未在大群體患者中進(jìn)行過系統(tǒng)分析。我們能夠建立大量對(duì)HPV16和HPV18具反應(yīng)性的TIL和CIN侵潤(rùn)性淋巴細(xì)胞(CIL)培養(yǎng)物，其中所述HPV16和HPV18是與宮頸癌最顯著相關(guān)的HPV類型(Boschetal.1995，Munozetal.2003)。所使用的細(xì)胞因子混合物確保了CD4和CD8T細(xì)胞兩者的生長(zhǎng)而沒有對(duì)任一類型的T細(xì)胞擴(kuò)增的明顯的偏愛。在我們的研究中，從被診斷為HPV型陽性而不是HPV16或HPV18陽性的腫瘤患者中建立19份TIL培養(yǎng)物。這些培養(yǎng)物都不與HPV16或HPV18E6和E7抗原剌激反應(yīng)。值得一提地，來自HPV16陽性患者的TIL和CIL不對(duì)HPV18的E6和E7作出應(yīng)答，反之亦然(表1)。因此，在HPV16或HPV18陽性患者TIL和CIL中所觀察到的HPV特異性的T細(xì)胞應(yīng)答不是體外誘導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答的結(jié)果而是體內(nèi)抗腫瘤應(yīng)答的反映。近來，我們證明該實(shí)驗(yàn)方案也成功擴(kuò)增來自小隊(duì)列患有卵巢癌患者的TIL培養(yǎng)物(Lambecketal.2007)。類似數(shù)量的TIL培養(yǎng)物對(duì)E6和E7作出應(yīng)答(表1)。對(duì)同源肽表位以及HPV特異性免疫應(yīng)答的HLA限制性元件進(jìn)行鑒定表明，HPV特異性免疫并不限于特定免疫優(yōu)勢(shì)區(qū)(immunodominantregion)而是針對(duì)E6或E7癌蛋白的所有結(jié)構(gòu)域(表2)，這表明HPVE6和E7特異性T細(xì)胞兩者都有助于抗腫瘤應(yīng)答。我們的分析醒目地表明，絕大多數(shù)HPV特異性CD4+T細(xì)胞應(yīng)答受HLA-DQ或DP(13/16)限制但不受HLA-DR限制(表2)。這是令人意外的，因?yàn)樵贏PC細(xì)胞表面(Schwatzetal.1988)以及發(fā)生II型HLA重新表達(dá)的宮頸癌細(xì)胞(Hildersetal.1994)中，HLA-DR是最豐富的II型HLA分子。此外，在其它腫瘤抗原中，所鑒定的大多數(shù)CD4+T細(xì)胞表位在HLA-DR中呈遞(80/93;參見http:〃www.cancerimmunity.org中的數(shù)據(jù)庫)。然而，在宮頸癌中，HLA-DQ和HLA-DP限制性T細(xì)胞似乎有更突出的作用，這提示為鑒定功能性T細(xì)胞對(duì)HPV的應(yīng)答而采用的結(jié)合計(jì)算機(jī)數(shù)學(xué)運(yùn)算的策略不應(yīng)當(dāng)僅僅集中于HLA-DR(Warrinoetal.2004，F(xiàn)acchinettietal.2005)。在7例患者中檢測(cè)到CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。除了鑒定出3個(gè)新的HLA_B7、HLA-B14和HLA-B27限制性CD8T細(xì)胞表位外，我們證實(shí)即使觀察到對(duì)肽序列11_19的更強(qiáng)反應(yīng)性，存在識(shí)別HPV16E7.11-20表位的HLA-A*0201限制性腫瘤侵潤(rùn)性CD8+T細(xì)胞(Evansetal.1997，0erkeetal.2005)。此外，檢測(cè)到對(duì)HLA-B57限制性表位HPV16E6.52-61具有反應(yīng)性的CD8+T細(xì)胞?；趯?duì)健康個(gè)體外周血中HLA-B57限制性HPV16E6.52-61特異性CD8+T細(xì)胞的檢測(cè)，已經(jīng)表明，該CTL表位可以在清除HPV16感染中發(fā)揮重要作用(Nakagawaetal.2004，Nkagawaetal.2007)。然而，在癌癥患者中所檢測(cè)到的對(duì)該表位作出應(yīng)答的CTL使該作用的可能性較小。我們的研究顯示，在54例不同的HPV16或HPV18陽性患者中的至少23例中，可以檢測(cè)到對(duì)E6和/或E7的特異性T細(xì)胞應(yīng)答(表l)。這將有利于旨在誘導(dǎo)針對(duì)這些抗原的T細(xì)胞應(yīng)答的接種策略，以恢復(fù)之前已存在免疫應(yīng)答的患者的有效抗腫瘤應(yīng)答。重要的是，本研究中T細(xì)胞所識(shí)別的T細(xì)胞表位，在針對(duì)HPV16和HPV18陽性腫瘤的應(yīng)答中，構(gòu)成了生理靶標(biāo)。由此它們對(duì)不同疾病階段中HPV特異性T細(xì)胞亞型的數(shù)量和功能性的綜合分析以及監(jiān)控免疫療法來說是有價(jià)值的。在宮頸癌患者中常存在的HPV特異性T細(xì)胞也可以構(gòu)成用于采用的T細(xì)胞轉(zhuǎn)移治療的腫瘤特異性T細(xì)胞的有價(jià)值來源。實(shí)施例2:肽的皮內(nèi)給藥材料與方法研究方案通過在患有HPV相關(guān)宮頸失調(diào)的患者以及健康個(gè)體的上臂中皮內(nèi)注射臨床級(jí)HPV16肽庫來實(shí)施用于對(duì)HPV16E2、E6和E7特異性T細(xì)胞應(yīng)答進(jìn)行分析的代表性初步研究。由于遲發(fā)型超敏反應(yīng)代表記憶T細(xì)胞應(yīng)答，在分析時(shí)不以HPV陽性為先決條件。個(gè)體—組19名健康個(gè)體(HD)在提供知情同意書后參與本研究。健康個(gè)體組的平均年齡為31歲(范圍，20-51歲)并由80%的女性和20%的男性組成。在皮膚測(cè)試給藥之前，直接從所有個(gè)體獲取外周血單核細(xì)胞(PBMCs)。健康個(gè)體中后來所出現(xiàn)的皮膚測(cè)試陽性導(dǎo)致從19例健康志愿者中的11例當(dāng)中分離第二血樣。該方案設(shè)計(jì)獲得Leiden大學(xué)醫(yī)療中心醫(yī)療道德委員會(huì)(MedicalEthicalCommitteeoftheLeidenUniversityMedicalCentre)的許可。DTH皮膚測(cè)試皮膚測(cè)試，其基于遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DelayedTypeHypersensitivityreactions，DTH)，可以用作體內(nèi)測(cè)定HPV特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答的靈敏且簡(jiǎn)便方法(Hopfl，2000;Hopfl，1991)。皮試配制品由涵蓋整個(gè)HPV16E6和E7蛋白和HPV16E2蛋白的最具免疫原性區(qū)域的長(zhǎng)的臨床級(jí)合成的肽的8個(gè)庫組成(deJong，2004)。這些臨床級(jí)肽由LUMC的內(nèi)部GMP-Facility制備。皮膚測(cè)試的每個(gè)庫由兩種或三種合成的肽組成，由該肽所覆蓋的蛋白區(qū)域中的第一和最后一個(gè)氨基酸來表示。庫1:E2庫3:E6丄，E619_5o，庫4:E64i_65，E655-8o，庫5:E685-io9，E691_122，庫6:E6109_140，E6127_158，庫7:E7i_35，E722—56，庫8:E743—77，E764—98。庫3包含SeqID5、22及23。庫4包含SeqIDs7-9。庫5包含SeqID11禾口12。庫6包含SeqID13、14、24和25。庫7包含SeqID15禾口26。庫8包含SeqIDs16和17。每個(gè)肽庫中，皮內(nèi)注射含于溶解于20mM等滲磷酸緩沖液(10yg/肽)的16%匿SO中的0.05ml0.2mg/ml的肽。肽庫及陰性對(duì)照(只有溶劑)分別注入個(gè)體上臂的皮膚測(cè)試位點(diǎn)。在注射肽后的72小時(shí)和7天內(nèi)以及首次報(bào)告第一批健康個(gè)體之一非常遲的皮試反應(yīng)后3周時(shí)，至少檢查3次皮膚測(cè)試位點(diǎn)。如果在注射后不少于2天時(shí)間里產(chǎn)生直徑超過2mm的丘疹，應(yīng)當(dāng)認(rèn)為該反應(yīng)是陽性的。從陽性皮膚反應(yīng)位點(diǎn)獲得穿孔活檢(4mm)，切成小片并在含有10X人AB血清、10XTCGF和5ng/mlIL7及IL15的MDM中進(jìn)行培養(yǎng)以使淋巴細(xì)胞移出皮膚組織。在培養(yǎng)2-4周后收獲所擴(kuò)增的T細(xì)胞并測(cè)試其HPV特異性反應(yīng)性。用于體外免疫分析的抗原—套肽，類似于皮膚測(cè)試中所用的肽，用于T細(xì)胞剌激分析和IFNy-ELISPOT分析。四種HPV16E2肽由重疊15個(gè)殘基的30-mer肽組成，HPV16E6由32_mer肽組成，而HPV16E7由35-mer肽組成，這兩者都重疊14個(gè)殘基。按照前述(vanderBurg，1999)，合成并溶解該肽。特別是，在IFNyELISPOT分析中，肽庫4和5與皮膚測(cè)試所用肽稍有差異，庫4含有肽E637—68、E655—86、E673—1Q4，而庫5則包含肽E673—1Q4、E691—122。由破傷風(fēng)類毒素(0，75Limusflocculentius/ml;NationalInstituteofPublicHealthandEnvironment,Bilthoven，TheNetherlands)、結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)聲波降解物(sonicate,5lig/ml;由Dr.PKlatser惠貝曾，RoyalTropicalInstitute,Amsterdam,TheNetherlands)禾口白色念珠菌(Candidaalbicans)(0.15mg/ml，HALAllergenenLab.，Haarlem，TheNetherlands)組成的記憶應(yīng)答混合物(MRM50X)，用作陽性對(duì)照。按照前述(vanderBurg，2001)，在重組大腸桿菌(Escherichiacoli)中制備HPV16E2、E6和E7蛋白。用IFNyELISP0T分析抗原特異性Th細(xì)胞按照前述(vanderBurg，2001)，用IFNyELISP0T分析抗原特異性Th細(xì)胞的出現(xiàn)。簡(jiǎn)而言之，在存在或不存在所述的HPV16E2、E6和E7肽庫的情況下，在24孔板(Costar，Cambridge,MA)中以2X106個(gè)細(xì)胞/孔的密度將新鮮PBMC接種于lml富集了10X人AB血清的MDM(BioWhittaker，Verviers，Belgium)中。所使用的肽的濃度為5iig/ml/肽。在37t:下孵育4天后，收獲PBMCs，洗滌并在包被有IFNy捕獲抗體(MabtechAB，Nacha，瑞典)的Multiscreen96孔板(Millipore，Etten-Leur，荷蘭)中以105個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于100ill富集了10%FCS的MDM中，一式四份。根據(jù)廠商說明書(Mabtech)實(shí)施其他抗體的孵育和ELISPOT顯影。用全自動(dòng)計(jì)算機(jī)輔助視屏成像分析系統(tǒng)(BioSys)對(duì)斑點(diǎn)計(jì)數(shù)。通過從實(shí)驗(yàn)孔中的斑點(diǎn)平均數(shù)減去培養(yǎng)基對(duì)照的平均斑點(diǎn)數(shù)+2XSD，計(jì)算特異性斑點(diǎn)(vanderBurg，2001)。T細(xì)胞增殖分析在3天的增殖分析中，檢測(cè)皮膚活檢T細(xì)胞培養(yǎng)物對(duì)特異性肽和蛋白的識(shí)別(vanderBurg，2001)。簡(jiǎn)而言之，通過37。C下在2h期間粘附到平底96孔板中的X-vivo15培養(yǎng)基(Cambrex)上，從PBMCs中分離自體單核細(xì)胞。該單核細(xì)胞被用作APCs，用10yg/ml肽和20g/ml蛋白負(fù)載過夜。以2-5X104個(gè)細(xì)胞/孔的密度將皮膚測(cè)試侵潤(rùn)性淋巴細(xì)胞接種于添加了10%AB血清的MDM中。將培養(yǎng)基單獨(dú)作為陰性對(duì)照，植物血凝素(0.5yg/ml)用作陽性對(duì)照。利用[3H]胸苷(0.5iiCi/mmo1)摻入測(cè)量增殖。增殖反應(yīng)被特定地限定為剌激指數(shù)(stimulationindex,SI)>3。孵育48小時(shí)后，收獲增殖分析的上清液，用于對(duì)抗原特異性細(xì)胞因子的產(chǎn)生進(jìn)行分析。與HPV16特異性增殖應(yīng)答相關(guān)的細(xì)胞因子分析根據(jù)廠商說明書利用流式珠陣列(cytometricbeadarray,BectonDickinson)同時(shí)檢測(cè)6種不同的Thl和Th2細(xì)胞因子IFNyJ中瘤壞死因子a、白細(xì)胞介素2(IL2)、IL4、IL5和IL10。臨界值以不同細(xì)胞因子(100pg/mlIFNy和其它細(xì)胞因子20pg/ml)的標(biāo)準(zhǔn)曲線為基礎(chǔ)。抗原特異性細(xì)胞因子的產(chǎn)生被限定為細(xì)胞因子的濃度超過臨界值水平并>培養(yǎng)基對(duì)照的濃度(deJong，2004)。細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色(IntracellularCytokineStaining,ICS)按照之前的報(bào)道(deJong，2005)，利用ICS對(duì)衍生于陽性皮膚反應(yīng)位點(diǎn)的T細(xì)胞培養(yǎng)物的特異性和特征進(jìn)行檢測(cè)。簡(jiǎn)而言之，收獲皮膚測(cè)試侵潤(rùn)性淋巴細(xì)胞、洗滌并懸浮于含10%AB血清的MDM中，向自體單核細(xì)胞中添加2-5X104個(gè)細(xì)胞，所述自體單核細(xì)胞在Xvivo培養(yǎng)基中用50ill肽(10g/ml)或蛋白(20yg/ml)脈沖過夜。培養(yǎng)基單獨(dú)作為陰性對(duì)照，植物血凝素(0.5ug/ml)用作陽性對(duì)照。同時(shí)用FITC標(biāo)記的鼠抗人IFNy(0.5g/ml，BDPharmigen)、PE木示i己的鼠抗人IL5(0.2mg/ml，BDPharmingen)、APC木示i己的抗CD4(BDBioscience)和PerCP標(biāo)記的抗CD8(BDBioscience)對(duì)樣品進(jìn)行染色。在4。C孵育后，洗滌細(xì)胞，用1%的多聚甲醛固定，并用流式細(xì)胞儀(FACSscan，BDBiosciences)分析。[OH3]統(tǒng)計(jì)分析在這些組中，利用Fisher精確檢驗(yàn)(雙尾)對(duì)PBMC中IFNy產(chǎn)生HPV特異性T細(xì)胞的檢測(cè)、皮膚活檢中皮膚測(cè)試反應(yīng)的存在或HPV特異性T細(xì)胞的存在之間的關(guān)系以及患者和健康對(duì)照有關(guān)皮膚反應(yīng)的大小或數(shù)量進(jìn)行分析。統(tǒng)計(jì)分析采用Gr即hpadInstat軟件(3.0版本)和GraphpadPrism4進(jìn)行。結(jié)果皮膚對(duì)皮內(nèi)注射HPV16E2、E6和E7肽的反應(yīng)皮內(nèi)注射HPV16E2、E6和E7肽后，我們研究了健康個(gè)體的皮膚反應(yīng)。陽性皮膚反應(yīng)看起來是直徑為2-20mm的淺紅色丘疹，其在注射后的2_25天出現(xiàn)。在152例健康志愿者的皮膚測(cè)試中檢測(cè)到46例陽性皮膚反應(yīng)?？傮w上，皮膚測(cè)試中每個(gè)肽庫都引起陽性皮膚反應(yīng)。在對(duì)照組中，最常觀測(cè)到的反應(yīng)是針對(duì)E231—75(19例個(gè)體中有10例)、E637—1Q4(9/16)及E743—98(7/19)的反應(yīng)。該反應(yīng)類型與我們之前在PBMC中所觀測(cè)到的類似(deJong，2002;Welters,2003)(圖5)。這些皮膚反應(yīng)與這些個(gè)體的PBMC中所檢測(cè)到的肽特異性T細(xì)胞應(yīng)答的出現(xiàn)一致(數(shù)據(jù)未示出)。健康供體的皮膚反應(yīng)與外周血中較高頻率出現(xiàn)的HPV16特異性T細(xì)胞相關(guān)為將皮膚測(cè)試結(jié)果與循環(huán)1型HPV16特異性T細(xì)胞的出現(xiàn)進(jìn)行比較，用在進(jìn)行皮內(nèi)肽激發(fā)前所收集的PBMC's實(shí)施IFNyELIspot分析。在19例健康志愿者的5例中，我們能夠利用IFNy-ELIspot檢測(cè)到HPV16特異性免疫應(yīng)答。在健康個(gè)體的預(yù)激發(fā)的血樣中每100，000個(gè)PBMC中檢測(cè)到^5個(gè)循環(huán)HPV16特異性T細(xì)胞，與對(duì)相同肽序列的早期(《13天)陽性皮膚反應(yīng)相關(guān)(P=0.0003，雙尾Fisher精確檢驗(yàn)；圖6)。在健康供體的預(yù)激發(fā)的血樣中沒有檢測(cè)到針對(duì)誘導(dǎo)晚期陽性皮膚反應(yīng)(latepositiveskinreacton)(14-25天)的肽的HPV16特異性循環(huán)T細(xì)胞。這表明循環(huán)抗原特異性細(xì)胞的出現(xiàn)頻率決定皮膚反應(yīng)出現(xiàn)的延遲時(shí)間。為了評(píng)估出現(xiàn)晚期皮膚反應(yīng)時(shí)HPV特異性T細(xì)胞的出現(xiàn)頻率，收集來自11例健康志愿者的額外血樣。在這些個(gè)體中，88個(gè)皮膚測(cè)試中有39個(gè)呈陽性。在39個(gè)陽性皮膚反應(yīng)的25個(gè)中以及在49個(gè)陰性皮膚反應(yīng)中的10個(gè)中每100，000個(gè)PBMC檢測(cè)到^5個(gè)HPV16特異性T細(xì)胞。在這一點(diǎn)上，在激發(fā)后血樣中檢測(cè)循環(huán)的HPV特異性IFNy產(chǎn)生T細(xì)胞和皮膚反應(yīng)的出現(xiàn)顯著相關(guān)(P<0.0001，F(xiàn)isher精確檢驗(yàn)；圖7)。這顯示用HPV16肽皮內(nèi)激發(fā)后，健康志愿者血液中HPV16特異性T細(xì)胞的出現(xiàn)頻率明顯較高，并表明皮內(nèi)注射肽抗原增加了健康志愿者血液中HPV16特異性T細(xì)胞的數(shù)量。陽性皮膚反應(yīng)位點(diǎn)的活檢由Th/Th2CD4+和CD8+HPV16特異性T細(xì)胞兩者組成約25%的健康志愿者的陽性皮膚反應(yīng)與血液中HPV16特異性IFNy產(chǎn)生T細(xì)胞的檢測(cè)無關(guān)，這提示在皮內(nèi)注射HPV16肽后，其他非IFNy產(chǎn)生類型的T細(xì)胞可以侵潤(rùn)皮膚。為了表征陽性皮膚反應(yīng)位點(diǎn)的細(xì)胞，獲取穿剌活檢?？偣矎?例健康對(duì)照的不同陽性皮膚反應(yīng)位點(diǎn)中獲得8個(gè)活檢，并與使T細(xì)胞在沒有抗原剌激的情況下體外生長(zhǎng)的細(xì)胞因子混合物一起培養(yǎng)。在8個(gè)活檢的7個(gè)中，T細(xì)胞在3-4周內(nèi)從組織中滲出并擴(kuò)增。在短期增殖分析中，檢測(cè)該擴(kuò)增T細(xì)胞的特異性。圖8表示，在受到肽庫(其也在皮膚測(cè)試過程中在此位點(diǎn)進(jìn)行了注射，HD2、HD10、HD15)脈沖的自體單核細(xì)胞以及HPV16E6蛋白脈沖的單核細(xì)胞剌激后特異性增殖的T細(xì)胞培養(yǎng)物的實(shí)例(圖8AB)。這表明這些T細(xì)胞能夠在抗原被天然加工和呈遞后識(shí)別它們的同源HLA-肽復(fù)合物。由于HPV16特異性T細(xì)胞產(chǎn)生IFNy、IL-4和IL-5，對(duì)這些增殖的T細(xì)胞培養(yǎng)物上清液所進(jìn)行的分析揭示了混合的Thl/Th2細(xì)胞因子特性(profile)(圖8C)。在每個(gè)活檢培養(yǎng)物(8個(gè)中有4個(gè))中檢測(cè)到HPV特異性T細(xì)胞的病例中，這與通過ELIspot對(duì)激發(fā)后血樣中循環(huán)的HPV16特異性IFNy產(chǎn)生T細(xì)胞所進(jìn)行的檢測(cè)結(jié)果相符(比較圖8A和B)。在其他4例陽性皮膚反應(yīng)活檢中有3例T細(xì)胞不對(duì)HPV16肽作出應(yīng)答(圖8;HD17)，并且在其中一例中根本沒有T細(xì)胞滲出組織(HD13)。在這4個(gè)病例中，我們?cè)诩ぐl(fā)后的血樣中未能檢測(cè)到循環(huán)的HPV16特異性IFNy產(chǎn)生T細(xì)胞。利用CD4和CD8細(xì)胞表面標(biāo)記對(duì)活檢T細(xì)胞所進(jìn)行的共染色顯示，在用HPV16肽進(jìn)行皮內(nèi)激發(fā)后，不但HPV16特異性CD4+T細(xì)胞而且HPV16特異性CD8+T細(xì)胞都侵潤(rùn)皮膚位點(diǎn)(圖9)?？傮w上，在HPV16特異性T細(xì)胞所侵潤(rùn)的4個(gè)活檢的3個(gè)中，我們能夠檢測(cè)到HPV16特異性CD8+T細(xì)胞。從HD2活檢(庫6)中分離的CD8+T細(xì)胞對(duì)皮試注射測(cè)試的兩種重疊肽都作出應(yīng)答HPV16E6，—14。和HPV16E6127—158(數(shù)據(jù)未示出)，而個(gè)體HD15和HD16兩者的CD8+T細(xì)胞都對(duì)HPV16E637—68作出應(yīng)答(參見HD15的實(shí)例，圖5)。總之，在用HPV16肽進(jìn)行皮內(nèi)免激發(fā)后遷入皮膚的免疫細(xì)胞群包含HPV16特異性CD4+Thl、Th2和CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞。該侵潤(rùn)與血液中循環(huán)的HPV16特異性IFNy產(chǎn)生T細(xì)胞并行。討論皮膚測(cè)試常被作為體內(nèi)測(cè)量細(xì)胞介導(dǎo)的免疫性的簡(jiǎn)單分析法。通過將結(jié)果與利用體外分析對(duì)T細(xì)胞反應(yīng)性并行測(cè)量的結(jié)果進(jìn)行比較，我們已證實(shí)皮膚測(cè)試分析在體內(nèi)測(cè)量針對(duì)早期抗原E2、E6和E7的HPV16特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答中的用途。在皮內(nèi)抗原激發(fā)后的4-12天，健康志愿者組中出現(xiàn)了早期皮膚反應(yīng)。在這些個(gè)體中，已知其在體外表現(xiàn)出I型HPV16特異性T細(xì)胞應(yīng)答(deJong，2002;Wlters，2003)，早期皮膚測(cè)試反應(yīng)的出現(xiàn)(13天內(nèi))與以每20，OOO個(gè)PBMC中至少l個(gè)的出現(xiàn)頻率檢測(cè)到IFNY產(chǎn)生HPV16特異性T細(xì)胞密切相關(guān)(圖6，p〈0.001)。Jeffries等(Jeffries,2006)推薦了ELIspot分析中陽性反應(yīng)的相同IFNy臨界標(biāo)準(zhǔn)，他利用數(shù)學(xué)工具限定與Mantoux-tests相關(guān)的合適ELISPOT臨界值。較少數(shù)量的循環(huán)記憶T細(xì)胞(圖6)可以解釋為何與典型DTH測(cè)試相比皮膚反應(yīng)的出現(xiàn)有些延遲。在產(chǎn)生足夠細(xì)胞以引起局部炎癥反應(yīng)即陽性皮膚測(cè)試之前，T細(xì)胞需要得到強(qiáng)化或再激活并開始分裂。毫無疑問，在出現(xiàn)陽性皮膚反應(yīng)時(shí)，在外周血中可以檢測(cè)到更高頻率的HPV16特異性Thl應(yīng)答(圖7)。過去推測(cè)Thl細(xì)胞誘導(dǎo)DTH應(yīng)答，然而，現(xiàn)在幾項(xiàng)研究已經(jīng)證明，侵潤(rùn)皮膚測(cè)試位點(diǎn)的Th2細(xì)胞也誘導(dǎo)DTH應(yīng)答(Wang，1999;Woodfolk，2001)。同樣，本研究表明健康志愿者的陽性皮膚測(cè)試位點(diǎn)含有Thl和Th2型HPV16特異性T細(xì)胞兩者(圖8和9)。此外，陽性皮膚反應(yīng)也可以是非特異性T細(xì)胞流入的結(jié)果，這由于兩項(xiàng)用于分析給患有直腸細(xì)胞癌或黑色素瘤患者接種后產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答的陽性皮膚測(cè)試位點(diǎn)的深入研究(Bleumer，2007)，而變得明顯。本研究還表明，許多來自健康個(gè)體的陽性皮膚測(cè)試位點(diǎn)被不對(duì)所注射的HPV16抗原作出應(yīng)答的T細(xì)胞侵潤(rùn)。迄今為止，特異性陽性皮膚反應(yīng)的原因仍然未知。出乎意料的是，我們觀測(cè)到健康個(gè)體中大多數(shù)皮膚反應(yīng)出現(xiàn)在皮內(nèi)注射抗原后的2-3周內(nèi)。同時(shí)，這些晚期陽性皮膚反應(yīng)與預(yù)激發(fā)的血液中循環(huán)HPV特異性CD4+記憶T細(xì)胞的檢測(cè)并不相關(guān)(圖6)。這些皮膚測(cè)試位點(diǎn)的免疫學(xué)組成與典型DTH測(cè)試的類似(Platt，1983;Poulter，1982)，并由HPV16特異性CD4+Thl和Th2細(xì)胞以及HPV16特異性CD8+T細(xì)胞構(gòu)成(圖8和9)。我們假設(shè)這些反應(yīng)可能是T細(xì)胞引發(fā)的結(jié)果。在29%的經(jīng)受2步結(jié)核菌素皮膚測(cè)試方案且僅在第二輪測(cè)試中呈陽性的患者中也體現(xiàn)出這一點(diǎn)(Akcay，2003)。一般而言，疫苗誘導(dǎo)的T細(xì)胞應(yīng)答在接種后的10-14天內(nèi)而并不在3周時(shí)達(dá)到峰值。然而，人們應(yīng)當(dāng)記住在此方案中注射了更高劑量的抗原以及較強(qiáng)的佐劑。因此可以合理推測(cè)皮內(nèi)激發(fā)所誘導(dǎo)的T細(xì)胞應(yīng)答發(fā)展的較為緩慢并在后期才達(dá)到峰值。由于在健康志愿者中的皮內(nèi)肽激發(fā)誘導(dǎo)了HPV16特異性CD4+和CD8+細(xì)胞兩者，因此應(yīng)當(dāng)將其看作為單次低劑量接種。本初步研究的主要目標(biāo)是為了證實(shí)HPV16特異性皮膚測(cè)試在體內(nèi)檢測(cè)1型免疫應(yīng)答中的用途。在健康志愿者中，13天內(nèi)的陽性皮膚反應(yīng)確實(shí)與體外IFNyELIspot所檢測(cè)到的循環(huán)的IFNY產(chǎn)生記憶T細(xì)胞相關(guān)。重要的是，我們也觀察到皮膚測(cè)試所獲得的結(jié)果與ELIspot所獲得的結(jié)果有不一致之處。在許多病例中，在激發(fā)后的血樣中檢測(cè)到HPV16特異性、循環(huán)IFNY產(chǎn)生T細(xì)胞，而無相伴的皮膚反應(yīng)，反之亦然(圖7)，這可以被認(rèn)為是假陰性或假陽性結(jié)果。為了充分理解其對(duì)針對(duì)HPV的1型免疫性檢測(cè)詮釋的影響，我們已經(jīng)開始在印度尼西亞對(duì)大規(guī)模HPV陽性患者和健康志愿者進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)(fieldtrial)。參考文獻(xiàn)Akcay，A.，Erdem，Y.，Alt皿，B.，Usalan，C.，Agca，E.，Yasavul，U.，Turgan，C.，andCaglar，S.Theboosterphenomenonin2-st印tuberculinskintestingofpatientsreceivinglong-termhemodialysis(在接受血液透析患者的2步結(jié)核菌素皮膚測(cè)試中的激發(fā)現(xiàn)象).Am.J.Infect.Control,31:371-374，2003.Altmannetal.，EurJCancer28:326-33，1992.AlvarezD.etal，J.ofImmunology,174:1664-1674，2005Bacchetta，R.，Sartirana，C.，Levings，M.K.，Bordignon，C.，Narula，S.，andRoncarolo，M.G.GrowthandexpansionofhumanTregulatorytypelcellsareind印endentfromTCRactivationbutrequireexogenouscytokines(人調(diào)節(jié)性1型T細(xì)胞的生長(zhǎng)和擴(kuò)增不以來TCR激活而是需要外源細(xì)胞因子).EurJImmunol,32:2237-2245，2002.Bethwaite，P.B.，Holloway，LJ.，Thornton,A.，andDelahunt，B.Infiltrationbyimmunocompetentcellsinearlystageinvasivecarcinomaoftheuterinecervix:aprognosticstudy(在早期侵害性宮頸癌中免疫活性細(xì)胞的侵潤(rùn)).Pathology，28:321-327，1996.Bleumer，I.，Tiemessen，D.M.，Oosterwijk-Wakka，J.C.，Voller，M.C.，DeWeijer，K.，Mulders,P.F.，andOosterwijk，E.PreliminaryanalysisofpatientswithprogressiverenalcellcarcinomavaccinatedwithCA9—p印tide—pulsedmaturedendriticcells(接種了CA9肽脈沖的成熟樹突狀細(xì)胞的、患有進(jìn)展性直腸細(xì)胞癌患者的初步分析).J.I匪nother.，30:116-122，2007.Bontkes，H.J.，deGruijl，T.D.，vandenMuysenberg，A.J.，Verheijen，R.H.，Stukart，M.J.，Meijer，C.J.，Sch印er，R.J.，Stacey，S.N.，Duggan—Keen，M.F.，Stern，P丄，Man,S.，Borysiewicz，L.K.，andWalboomers，J.M.Humanpapillomavirustype16E6/E7_specificcytotoxicTlymphocytesinwomenwithcervicalneoplasia(宮頸瘤女性的16型乳頭狀瘤病毒E6/E7特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞).IntJCancer,88:92-98,2000.Bosch，F(xiàn).X.anddeSanjose，S.Chapter1:Humanpapillomavirusandcervicalcancer-burdenandassessmentofcausality(第一章人乳頭狀瘤病毒、荷宮頸癌以及因果性分析).JNatlCancerInstMonogr:3-13，2003.Bosch，F(xiàn).X.，Manos，M.M.，Munoz，N.，Sherman,M.，Jansen，A.M.，Peto，J.，Schiffman，M.H.，Moreno,V.，Kurman，R.，andShah，K.V.Prevalenceofhumanpapi1lomavirusincervicalcancer:aworldwideperspective.Internationalbiologicalstudyoncervicalcancer(IBSCC)StudyGroup(人乳頭狀瘤病毒在宮頸癌中盛行全球展望).JNatlCancerInst，87:796-802，1995.Chao，H.T.，Wang，P.H.，Tseng,J.Y.，Lai，C.R.，Chiang,S.C.，andYuan,C.C丄ymphocyte-infiltratedFIG0StageIIBsquamouscellcarcinomaofthecervixisaprominentfactorfordisease-freesurvival(淋巴細(xì)胞侵潤(rùn)的FIG0期宮頸IIB鱗狀細(xì)胞癌是無疾病存活的主要因素).EurJGynaecolOncol，20:136-140，1999.Claas，E.C.，Melchers，W.J.，vanderLinden,H.C.，Lindeman，J.，andQuint，W.G.Humanpapillomavirusdetectioninparaffin—embeddedcervicalcarcinomasandmetastasesofthecarcinomasbythepolymerasechainreaction(通過激活聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)石蠟包埋的宮頸癌以及宮頸癌的轉(zhuǎn)移).AmJPathol，135:703-709,1989.deJong，A.，vanderBurg，S.H.，Kwappenberg，K.M.，vanderHulst，J.M.，F(xiàn)ranken，K丄，Geluk，A.，vanMeijgaarden，K.E.，Drijfhout，J.W.，Kenter，G.，Vermeij，P.，Melief，C.J.，and0ffringa，R.Frequentdetectionofhumanpapillomavirus16E2_specificT-helperimmunityinhealthysubjects(健康個(gè)體中16型人乳頭狀瘤病毒E2特異性T輔助細(xì)胞免疫性的頻繁檢測(cè)).CancerRes，62:472-479,2002.27deJong，A.，vanderHulst，J.M.，Kenter，G.G.，Drijfhout，J.W.，F(xiàn)ranken，K丄，Vermeij，P.，Offringa，R.，vanderBurg，S.H.，andMelief，C.J.Rapidenrichmentofhumanpapi1lomavirus(HPV)-specificpolyclonalTcellpopulationsforadoptivei匪notherapyofcervicalcancer(快速富集適用宮頸癌免疫療法的人乳頭狀瘤病毒(HPV)特異性多克隆T細(xì)胞群).IntJCancer,114:274-282，2005.deJong，A.，vanPoelgeest，M.I.，vanderHulst，J.M.，Drijfhout，J.W.，F(xiàn)leuren，G.J.，Melief，C.J.，Kenter，G.，0ffringa，R.，andvanderBurg，S.H.Humanpapi1lomavirustype16—positivecervicalcancerisassociatedwithimpairedCD4+T-cellimmunityagainstearlyantigensE2andE6(16型人乳頭狀瘤病毒陽性宮頸癌與針對(duì)早期抗原E2和E6的CD+T細(xì)胞免疫性受損有關(guān)).CancerRes，64:5449-5455,2004.DeWitteetal.，Blood，Aug1;108(3):870—7，2006.Evans，M.，Borysiewicz，L.K.，Evans，A.S.，Rowe，M.，Jones，M.，Gileadi，U.，Cerundolo，V.，andMan,S.AntigenprocessingdefectsincervicalcarcinomaslimitthepresentationofaCTLepitopefromhumanpapillomavirus16E6(宮頸癌中的抗原加工缺陷限制來自人乳頭狀瘤病毒16E6的CTL表位的呈遞).Jlmmuno1，167:5420-5428，2001.Evans，E.M.，Man,S.，Evans，A.S.，andBorysiewicz，L.K.Infiltrationofcervicalcancertissuewithhumanpapillomavirus—specificcytotoxicT-lymphocytes(用人乳頭狀瘤病毒特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞侵潤(rùn)宮頸癌組織).CancerRes，57:2943-2950，1997.Facchinetti，V.，Seresini，S.，Longhi，R.，Garavaglia，C.，Casorati，G.，andProtti，M.P.CD4+Tcellimmunityagainstthehumanp即illomavirus-18E6transformingproteininhealthydonors-identificationofpromiscuousnaturallyprocessed印itopes(健康供體中抗人乳頭狀瘤病毒-18E6轉(zhuǎn)化蛋白的CD4+T的免疫性泛主的天然加工的表位).EurJImmunol,35:806-815,2005.Geginat，J.，Sallusto，F(xiàn).，andLanzavecchia，A.Cytokine-drivenproliferationMiddifferentiationofhumannaive，centralmemory,andeffectormemoryCD4(+)Tcells(人天然中樞記憶和效應(yīng)記憶CD4(+)T細(xì)胞的細(xì)胞因子驅(qū)動(dòng)的增殖和分化).JExpMed，194:1711-1719，2001.Hilders，C.G.，Houbiers，J.G.，Krul，E.J.，andFleuren，G.J.Theexpressionofhistocompatibility—relatedleukocyteantigensinthepathwaytocervicalcarcinoma(組織相容性相關(guān)白細(xì)胞抗原在宮頸癌通路中的表達(dá)).AmJClinPathol，101:5—12，1994.Hohn，H.，Pilch，H.，G腿el，S.，Neukirch，C.，Hilmes，C.，Kaufma皿，A.，Seliger，B.，andMaeurer，M.J.CD4+tumor_infiltratinglymphocytesincervicalcancerrecognizeHUV_DR_restrictedpeptidesprovidedbyhumanp即illomavirus-E7(宮頸癌中CD4+腫瘤侵潤(rùn)性淋巴細(xì)胞識(shí)別人乳頭狀瘤病毒E7所提供的HLA-DR限制行肽).JImmunol,163:5715-5722，1999.Hohn，H.，Pilch，H.，Gunzel，S.，Neukirch，C.，F(xiàn)reitag，K.，Necker，A.，andMaeurer，M.J.Humanpapillomavirustype33E7p印tidespresentedbyHLA_DR>K)402totumor_infiltratingTcellsincervicalcancer(HLA_DR>K)402呈遞至宮頸癌中腫瘤侵潤(rùn)性T細(xì)胞的33型人乳頭狀瘤病毒E7肽)JVirol，74:6632-6636，2000.Hopfl，R.，Heim，K.，Christensen，N.，Zumbach，K.，Wieland，U.，Volgger，B.，Widschwendter，A.，Haimbuchner，S.，Muller-Holzner,E.，Pawlita，M.，Pfister，H.，andFritsch，P.SpontaneousregressionofCINanddelayed—typehypersensitivitytoHPV16oncoproteinE7(CIN的自發(fā)性退行和對(duì)HPV16癌蛋白E7遲發(fā)型超敏反應(yīng)).Lancet,356:1985-1986,2000.Hopfl，R.，Sandbichler，M.，S卿，N.，Heim，K.，Muller-Holzner，E.，Wartusch，B.，Dap皿t，0.，Jochmus—Kudielka，I.，terMeulen，J.，Gissma皿，L，and.SkintestforHPVtype16proteinsincervicalintraepithelialneoplasia(宮頸上皮內(nèi)瘤中16型HPV蛋白的皮膚測(cè)i式)Lancet,337:373-374，1991.Jeffries,D.J.，Hill，P.C.，F(xiàn)ox，A.，Lugos，M.，Jackson-Sillah，D.J.，Adegbola，R.A.，andBrookes，R.H.IdentifyingELISP0Tandskintestcut-offsfordiagnosisofMycobacteriumtuberculosisinfectioninTheGambia(鑒定用于診斷岡比亞人結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)感染的ELISP0T和皮膚測(cè)試的臨界值).Int.J.Tuberc.LungDis.，10:192—198，2006.Kessleretal.，HumImmunol.64:245，2003.Lanzavecchia，Nature393:413,1998.Lambeck，A.J.A.，Leffer，N.，Hoogeboom，B.N.，Sluiter，W.J.，MHamming，L.E.，Klip，H.，tenHoor，K.A.，Esajas，M.，van0ven，M.，Drijfhout，J.W.，Platteel，I.，0ffringa，R.，Hollema，H.，Melief，C.J.M.，vanderBurg，S.H.，vanderZee，A.G.J.，Daemen，T.，andNijman，H.W.P53—specificTcellresponjsesinpatientswithmailignantandbenignovariantumors-implicationsforp53basedimm皿other即y(患有惡性和兩心卵巢瘤的患者中P53特異性T細(xì)胞應(yīng)答對(duì)基于p53免疫療法的暗示).Int了Cancer,inpress,2007.Li，J.，Huston,G.，andSwain，S丄IL-7promotesthetransitionofCD4effectorstopersistentmemorycells(IL-7促進(jìn)CD效應(yīng)物向永生記憶細(xì)胞(persistentmemorycells)的轉(zhuǎn)運(yùn))JExpMed，198:1807—1815，2003.Li，X.C.，Demirci，G.，F(xiàn)errari-Lacraz，S.，Groves,C.，Coyle，A.，Malek，T.R.，andStrom，T.B.IL-15andIL_2:amatteroflifeanddeathforTcellsinvivo(IL-15和IL-2:體內(nèi)T細(xì)胞生死的實(shí)質(zhì)).NatMed，7:114-118,2001.Liu，K.，Catalfamo，M.，Li，Y.，Henkart，P.A.，andWeng，N.P.IL-15mimicsTcellrec印torcrosslinkingintheinductionofcellularproliferation,geneexpression,andcytotoxicityinCD8+memoryTcells(IL-15酷似在誘導(dǎo)CD8+記憶T細(xì)胞細(xì)胞增殖、基因表達(dá)和細(xì)胞毒性中交聯(lián)的T細(xì)胞受體).ProcNatlAcadSciUSA，99:6192-6197,2002.Luxton，J.C.，Rowe，A.J.，Cridland，J.C.，Coletart，T.，Wilson,P.，and29Sh印herd，P.S.ProliferativeTcellresponsestothehumanpapillomavirustype16E7proteininwomenwithcervicaldysplasiaandcervicalcarcinomaandinhealthyindividuals(在患有宮頸相位異常和宮頸癌的女性以及健康個(gè)體中針對(duì)16型人乳頭狀瘤病毒E7蛋白的增殖性T細(xì)胞應(yīng)答).JGenVirol，77(Pt7):1585-1593，1996.McKinlay，A.，Radford，K.，Kato，M.，F(xiàn)ield,K.，Gardiner,D.，Khalil，D.，B證ell，F(xiàn).，Hart，D.，andVuckovic，S.Bloodmonocytes,myeloiddendriticcellsandthemixedhelper/regulatoryfunction(血液?jiǎn)魏思?xì)胞、骨髓樹突狀細(xì)胞和細(xì)胞因子白細(xì)胞介素(IL)-7和IL-15維持具有輔助/調(diào)節(jié)功能的人CD4+T記憶細(xì)胞).Immunology,120:392-403,2007.Munoz，N.，Bosch，F(xiàn).X.，deSanjose，S.，Herrero,R.，Castellsague，X.，Shah，K.V.，Snijders，P.J.，andMeijer，C.J.Epidemiologicclassificationofhumanp即illomavirustypesassociatedwithcervicalcancer(與宮頸癌有關(guān)的人乳頭狀瘤病毒類型的流行病學(xué)分類).NEnglJMed，348:518-527,2003.Nakagawa，M.，Kim，K.H.，Gillam，T.M.，andMoscicki，A.B.HLAclassIbindingpromiscuityoftheCD8T-cellepitopesofhumanpapillomavirustype16E6protein(16型人乳頭狀瘤病毒E6蛋白CD8T細(xì)胞表位的I型HLA結(jié)合的泛主性).JVirol，81:1412-1423,2007.Nakagawa，M.，Kim，K.H.，andMoscicki，A.B.Differentmethodsofidentifyingnewantigenicepitopesofhumanpapillomavirustype16E6andE7proteins(鑒定人16型乳頭瘤狀病毒E6和E7蛋白新抗原表位的不同方法).ClinDiagnLablmmunol，11:889-896,2004.0erke，S.，Hohn，H.，Zehbe，I.，Pilch，H.，Schicketanz，K.H.，Hitzler，W.E.，Neukirch，C.，F(xiàn)reitag，K.，andMaeurer，M.J.NaturallyprocessedandHLA_B8_presentedHPV16E7epitoperecognizedbyTcellsfrompatientswithcervicalcancer(來自患有宮頸癌患者的T細(xì)胞所識(shí)別的天然加工的以及HLA-B8呈遞的HPV16E7表位)IntJCancer,114:766-778，2005.Peng，S.，Trimble,C.，Ji，H.，He，L.，Tsai，Y.C.，Macaes，B.，Hung，C.F.，andWu，T.C.CharacterizationofHPV-16E6DNAvaccinesemployingintracellulartargetingandintercellularspreadingstrategies(使用細(xì)胞內(nèi)革巴向的禾口細(xì)胞間傳播策略的HPV-16E6DNA疫苗的表征).JBiomedSci，12:689-700，2005.Piersma，S.J.，Jordanova，E.S.，vanPoelgeest，M.I.，Kwappenberg，K.M.，vanderHulst，J.M.，Drijfhout，J.W.，Melief，C.J.，Kenter，G.G.，F(xiàn)leuren，G.J.，Offringa，R.，andvanderBurg，S.H.HighnumberofintraepithelialCD8+tumor_infiltratinglymphocytesisassociatedwiththeabsenceoflymphnodemetastasesinpatientswithlargeearly—stagecervicalcancer(大量上皮內(nèi)CD+月中瘤侵潤(rùn)型淋巴細(xì)胞與患有大型早期宮頸癌患者中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移缺失有關(guān)).CancerRes，67:354-361,2007.Platt，J.L.，Grant,B.W.，Eddy，A.A.，andMichael,A.F.Immunecellpopulationsincutaneousdelayed-typehypersensitivity(皮膚的遲發(fā)型超敏反應(yīng)中■7andIL_15maintainhumanCD4+Tmemorycellswith.Poulter，L.W.，Seymour,G.J.，Duke，0.，Janossy，G.，andPanayi，G.Immunohistologicalanalysisofdelayed-typehypersensitivityinman(人遲發(fā)型超敏反應(yīng)免疫組織學(xué)分析).CellImmunol.，74:358-369,1982.Remington;TheScienceandPracticeofPharmacy(藥齊U科學(xué)禾口實(shí)踐)，21stEdition2005，UniversityofSciencesinPhiladelphia.Ressing，M.E.，vanDriel，W.J.，Celis，E.，Sette，A.，Brandt,M.P.，Hartman，M.，Anholts，J.D.，Schreuder，G.M.，terHarmsel，W.B.，F(xiàn)leuren，G.J.，Trimbos，B.J.，Kast，W.M.，andMelief，C.J.OccasionalmemorycytotoxicT—cellresponsesofpatientswithhumanpapillomavirustype16—positivecervicallesionsagainstahumanleukocyteantigen_A*0201_restrictedE7_encodedepitope(患有16型人乳頭狀瘤病毒陽性宮頸病變患者針對(duì)人白細(xì)胞抗原A*0201限制性E7編碼的表位的偶發(fā)的記憶細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答)CancerRes，56:582-588，1996.RomaniN.etal，SpringerSeminI匪nopathol.，13:265-279，1992.Schwartz,B.D.DiversityandregulationofexpressionofhumanleukocyteantigenclassIImolecules(人白細(xì)胞II型抗原分子表達(dá)的多樣性和調(diào)節(jié))AmJMed，85:6-8，1988.Schumacheretal.，NatRevImmunol.2(7):512-9，Jul2002.Strangetal.，JGenVirol.71:423—31，1990Toesetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A93:7855，1996Toesetal.，J.Immunol.156:3911，1996麗denBurgetal.，HumImmunol.44:189-198，1995vanderBurg，S.H.，Kwappenberg，K.M.，Geluk，A.，vanderKruk，M.，Pontesilli，0.，Hovenkamp，E.，F(xiàn)ranken，K.L.，vanMeijgaarden，K.E.，Drijfhout，J.W.，0ttenhoff，T.H.，Melief，C.J.，and0ffringa，R.IdentificationofaconserveduniversalThepitopeinHIV—lreversetranscriptasethatisproeessedandpresentedtoHIV_speciricCD4+TcellsbyatleastfourunrelatedHLA-DRmolecules(至少4種不相關(guān)HLA-DR分子所加工并呈遞至HIV特異性CD4+T細(xì)胞的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶中保守的通用Th表位的鑒定)JImmunol,162:152-160，1999.vanderBurg，S.H.，Piersma，S.J.，deJong，A.，vanderHulst，J.M.，Kwappenberg,K.M.，vandenHende，M.，Welters,M.J.，F(xiàn)leuren，G.J.，Melief，C.J.M.，Kenter，G.，and0ffringa，R.AssociationofcervicalcancerwiththepresenceofCD4+regulatoryTcellsspecificforhumanpapillomavirusantigens(宮頸癌與人乳頭狀瘤病毒抗原特異性CD4+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞存在的關(guān)系).submitted,2007.vanderBurg，S.H.，Ressing，M.E.，Kwappenberg,K.M.，deJong，A.，Straathof，K.，dejong，J.，Geluk，A.，vanMeijgaarden,K.E.，F(xiàn)ranken，K.L，0ttenhoff，T.H.，F(xiàn)leuren，G.J.，Kenter，G.，Melief，C.J.，and0ffringa，R.NaturalT-helperimmunityagainsthumanpapillomavirustype16(HPV16)E7_derivedpeptideepitopesinpatientswithHPV16—positivecervicallesions-identificationof3humanleukocyteantigenclassII_restricted印itopes(針對(duì)患有HPV陽性宮頸病變患者中16型人乳頭狀瘤病毒(HPV16)E7衍生的肽表位的天然T輔助細(xì)胞免疫性人白細(xì)胞II型抗原限制性表位的鑒定).IntJCancer,91:612-618，2001.Wang，S.，F(xiàn)an,Y.，Brunham，R.C.，andYang，X.IFN-gammaknockoutmiceshowTh2-associateddelayed—typehypersensitivityandtheinflammatorycellsfailtolocalizeandcontrolchlamydialinfection(IFN-Y高支除小鼠顯示Th2相關(guān)遲發(fā)型超敏反應(yīng)且炎性細(xì)胞不能定位和控制衣原體感染).Eur.J.Immunol.，29:3782-3792，1999.Warrino，D.E.，Olson，W.C.，Knapp，W.T.，Scarrow，M.I.，D'Ambrosio-Brennan，LJ.，Guido，R.S.，Edwards,R.P.，Kast，W.M.，andStorkus，W.J.Disease—stagevarianceinfunctionalCD4(+)T_cellresponsesagainstnovelp肌-humMileukocyte肌tigen-Dregionpresentedhumanp即illomavirus-16E7epitopes(在診斷新型泛人白細(xì)胞抗原D區(qū)呈遞的16型人乳頭狀瘤E7表位的功能性CD4(+)T細(xì)胞應(yīng)答中的疾病期疫苗).ClinCancerRes，10:3301—3308，2004.Welters,M.J.，vanderLogt，P.，vandenEeden，S.J.，Kwappenberg，K.M.，Drijfhout，J.W.，F(xiàn)leuren，G.J.，Kenter，G.G.，Melief，C.J.，vanderBurg，S.H.，and0ffringa，R.Detectionofhumanpapillomavirustype18E6andE7—specificCD4+T_helperlimm皿ityinrelationtohealthversusdisease(檢測(cè)有關(guān)健康禾口疾病的18型人乳頭狀瘤病毒E6和E7特異性CD4+T輔助細(xì)胞l的免疫性).IntJCancer,118:950-956,2006.Welters,M.J.，deJong，A.，vandenEeden，S.J.，vanderHulst，J.M.，Kwappenberg,K.M.，Hassane，S.，F(xiàn)ranken，K.L.，Drijfhout，J.W.，F(xiàn)leuren，G.J.，Kenter，G.，Melief，C.J.，0ffringa，R.，andvanderBurg，S.H.Frequentdisplayofhumanpapillomavirustype16E6_specificmemoryt—Helpercellsinthehealthypopulationaswitnessofpreviousviralencounter(健康群體中之前遭遇病毒的證據(jù)是，頻繁展示16型人乳頭狀瘤E6特異性記憶t輔助細(xì)胞).CancerRes，63:636-641,2003.Woodfolk，J.A.andPiatts_Mi11s，T.A.Diversityofthehumanallergen-specificTcellrepertoireassociatedwithdistinctskintestreactions:delayed—typehypersensitivity_associatedmajorepitopesinduceThl-andTh2-dominatedresponses(與不同皮膚測(cè)試反應(yīng)有關(guān)的人變應(yīng)原特異性T細(xì)胞庫的多樣性遲發(fā)型超敏反應(yīng)相關(guān)的主要表位有到Thl和Th2占優(yōu)勢(shì)的應(yīng)答).J.Immunol.，167:5412-5419，2001.zurHausen，H.Papillomavirusinfections__amajorcauseofhumancancers(人乳頭狀瘤病毒感染人癌癥的主要原因).BiochimBiophysActa,9:F55_78，1996.Zwaveling，S.，F(xiàn)erreiraMota，S.C.，Nouta，J.，Johnson,M.，Lipford，G.B.，Offringa，R.，vanderBurg，S.H.，andMelief，C.J.Establishedhumanpapillomavirustypel6—expressingtumorsareeffectivelyeradicatedfollowingvaccinationwithlongp印tides(接種長(zhǎng)肽后，有效根除16型人乳頭狀瘤病毒表達(dá)腫瘤)JImmunol，169:350-358,2002.表1在侵潤(rùn)性淋巴細(xì)胞中所檢測(cè)到的HPV16和18特異性應(yīng)答<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>*SI二應(yīng)答T細(xì)胞的刺激指數(shù)表2:由宮頸癌患者所識(shí)別的T細(xì)胞表位<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>權(quán)利要求肽在制備用于預(yù)防和/或治療HPV相關(guān)疾病的藥物中的用途，其中所述肽的長(zhǎng)度不超過100、98、96、94、92個(gè)氨基酸并包含來自HPVE6和E7蛋白中至少之一的氨基酸序列的至少19個(gè)連續(xù)氨基酸，其中所述連續(xù)氨基酸序列包含HLA-DQ和HLA-DP中至少之一所呈遞的表位，而且其中所述表位不是在HLA-DQ2中所呈遞的和由HPV16E7蛋白的35-50位氨基酸組成的表位。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中所述連續(xù)氨基酸序列包含侵潤(rùn)宮頸瘤病變的T細(xì)胞或者來自引流淋巴結(jié)的T細(xì)胞所識(shí)別的表位。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用途，其中所述表位是HPVE6蛋白的表位。4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述表位是HPV血清型16、18、31、33或45的表位，優(yōu)選HPV血清型16、18、31或33的表位，更優(yōu)選HPV血清型16或18的表位。5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述表位選自SEQIDNos:6、5、7、9、10、11、12、13、16、18、19、20和21。6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述連續(xù)氨基酸序列的長(zhǎng)度是19-45個(gè)氨基酸，優(yōu)選22-35個(gè)氨基酸并且更優(yōu)選33-35個(gè)氨基酸。7.肽在制備用于預(yù)防和/或治療HPV相關(guān)疾病的藥物中的用途，其中所述肽的長(zhǎng)度不超過100個(gè)氨基酸并包含來自HPVE6和E7蛋白中至少之一的氨基酸序列的至少19個(gè)連續(xù)氨基酸，其中所述連續(xù)氨基酸序列包含侵潤(rùn)宮頸瘤病變的T細(xì)胞或者來自引流淋巴結(jié)的T細(xì)胞所識(shí)別的表位。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其中所述表位選自SEQIDNos:5-26。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途，其中所述表位是選自SEQIDNos:7、14、22_26的I型HLACTL表位。10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其中所述連續(xù)氨基酸序列包含HLA-B分子所呈遞的表位。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的用途，其中所述HLA-B分子是HLA-B7、HLA-B14、HLA-B27或HLA-B57分子。12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的用途，其中所述表位選自SEQIDNos:7、22、24、25和26。13.根據(jù)權(quán)利要求9所述的用途，其中所述連續(xù)氨基酸序列包含HLA-A分子所呈遞的表位。14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的用途，其中所述HLA-A分子是HLA-A2或HLA*0201分子。15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的用途，其中所述表位選自SEQIDNos:23和26。16.根據(jù)權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述所述藥物包含至少兩種權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所限定的不同肽。17.根據(jù)權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述藥物還包含至少一種佐劑。18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的用途，其中所述佐劑經(jīng)由Toll樣受體發(fā)揮作用。19.根據(jù)權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述藥物用于靜脈內(nèi)、皮下、肌肉粘膜、皮內(nèi)(intradermal)禾口/或皮內(nèi)(intracutaneous)給藥。20.預(yù)防和/或治療HPV相關(guān)疾病的方法，其中所述方法包括用有效劑量的權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)所限定的藥物對(duì)有需要的患者給藥。21.權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)所限定的肽。22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的肽，其用作藥物。23.組合物，包含權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)所限定的肽和藥學(xué)上可接受的載體。24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的組合物，還包含至少一種佐劑，其中所述佐劑優(yōu)選經(jīng)由Toll樣受體發(fā)揮作用。25.核酸分子，編碼至少一種權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)所限定的肽。26.核酸分子，編碼識(shí)別選自SEQIDNos:5-26的表位的T細(xì)胞受體。27.分離的T細(xì)胞，包含權(quán)利要求26所述的核酸分子。28.分離的T細(xì)胞，包含識(shí)別選自SEQIDNos:5-26的表位的T細(xì)胞受體。全文摘要本發(fā)明涉及對(duì)HPV特異性E6和E7癌蛋白具有特異性的新的CD4+和CD8+T細(xì)胞表位，涉及包含這些新的T細(xì)胞表位的肽，以及涉及包含這些肽、用于預(yù)防和/或治療HPV相關(guān)疾病的(疫苗)組合物。優(yōu)選的表位由侵潤(rùn)宮頸瘤病變的T細(xì)胞或由來自引流淋巴結(jié)的T細(xì)胞識(shí)別，并由HLA-DQ或HLA-DP分子或HLA-B呈遞。文檔編號(hào)C07K14/025GK101765607SQ200880023046公開日2010年6月30日申請(qǐng)日期2008年5月27日優(yōu)先權(quán)日2007年5月31日發(fā)明者戈瑪·G·肯特爾,斯約爾格德·亨利庫斯·萬德伯格,柯內(nèi)利斯·約翰尼斯·瑪利亞·麥萊弗申請(qǐng)人:萊頓教學(xué)醫(yī)院