專利名稱：：中和抗體的制作方法中和抗體發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明總體上涉及結(jié)合粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)的抗體。更具體地說，本發(fā)明涉及GM-CSF的特異性高親和力、中和性人源化單克隆抗體。本發(fā)明還涉及這種抗體在治療或預(yù)防GM-CSF介導(dǎo)和GM-CSF相關(guān)性疾病或病癥中的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及通過給予本發(fā)明抗體來調(diào)節(jié)GM-CSF介導(dǎo)和GM-CSF相關(guān)性疾病或病癥的方法。
背景技術(shù)：
：粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)是調(diào)節(jié)粒細(xì)胞和單核細(xì)胞，例如巨噬細(xì)胞分化、增殖和功能的造血生長因子。GM-CSF還是強(qiáng)效的炎性細(xì)胞因子，其活性或過表達(dá)具有顯著的有害作用。GM-CSF參與各種自身免疫和炎性疾病，包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、哮喘、多發(fā)性硬化癥和特發(fā)性血小板減少性紫癜。在哮喘和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中，檢測(cè)到GM-CSF水平升高，其與炎性過程有關(guān)，而在實(shí)驗(yàn)性自身免疫腦脊髓炎中(多發(fā)性硬化癥的動(dòng)物模型)，GM-CSF敲除小鼠受保護(hù)而免于疾病發(fā)作。因此，明顯需要開發(fā)有效的方法以耙向GM-CSF并阻斷或中和GM-CSF活性。作為具有明確治療應(yīng)用的GM-CSF拮抗劑，抗GM-CSF的抗體提供了一種特別適合的備選方案，例如用于治療或預(yù)防自身免疫或炎性疾病。雖然抗GM-CSF的抗體是本領(lǐng)域已知的，但依然需要開發(fā)改進(jìn)的抗體，例如具有增強(qiáng)的結(jié)合親和力。發(fā)明概述除非文中另有要求，在本說明書和隨附的權(quán)利要求書中，詞語"包含"和變形，例如"包括"或"包含著"應(yīng)理解為暗示包括所述整數(shù)或步驟或整數(shù)或步驟的組，但不排除任何其它整數(shù)或步驟或整數(shù)或步驟的組。本發(fā)明總體上涉及與GM-CSF或其片段或部分結(jié)合、相互作用或者締合并拮抗或中和GM-CSF活性的抗體。這些抗體優(yōu)選單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段。這些抗體通常是分離的、均質(zhì)或完全或部分純化的形式。最典型的抗體是適合給予人的人源化或人抗體。這些抗體包括從，例如鼠單克隆抗體制備的人源化抗體以及，例如采用轉(zhuǎn)基因小鼠或通過噬菌體展示制備的人單克隆抗體。按照本發(fā)明的具體實(shí)施方式，制備以高親和力結(jié)合人GM-CSF并抑制GM-CSF活性的人源化單克隆抗體。本發(fā)明一方面提供結(jié)合人GM-CSF或其片段的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，該抗體包含含有SEQIDNO:1所示序列或其片段或變體的輕鏈可變區(qū)。本發(fā)明另一方面提供結(jié)合人GM-CSF或其片段的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，該抗體包含SEQIDNO:2所示的重鏈可變序列或其片段或變體。本發(fā)明另一方面提供結(jié)合人GM-CSF或其片段的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，該抗體包含含有SEQIDNO:1所示序列或其片段或變體的輕鏈可變區(qū)，以及如SEQIDNO:2所示的重鏈可變序列或其片段或變體。在一個(gè)實(shí)施方式中，該抗體是抑制GM-CSF活性的鼠抗體或其人源化衍生物。該抗體可以是2007年5月17日保藏在英國索爾茲伯里普當(dāng)應(yīng)用微生物與研究中心的歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏所(ECACC)(EuropeanCollectionofCellCultures(ECACC),CentreforAppliedMicrobiologyandResearch,PortonDown,Salisbury,UnitedKingdom)的鼠單克隆抗體4K21，登錄號(hào)為07051601。鼠單克隆抗體4K21的人源化衍生物的輕鏈可變區(qū)可包含SEQIDNO:9-U中任一所示的序列或其片段或變體。鼠單克隆抗體4K21的人源化衍生物的重鏈可變區(qū)可包含SEQIDNO:13-15、17或18-27中任一所示的序列或其片段或變體。本發(fā)明另一方面提供結(jié)合人GM-CSF或其片段的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，該抗體在輕鏈可變區(qū)內(nèi)包含至少一個(gè)含有SEQIDNO:3-5中任一所示序列的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，其中該抗體或其抗原結(jié)合片段抑制GM-CSF的活性。在一個(gè)實(shí)施方式中，該抗體是人源化抗體。本發(fā)明另一方面提供結(jié)合人GM-CSF或其片段的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，該抗體在重鏈可變區(qū)內(nèi)包含至少一個(gè)含有SEQIDNO:6-8中任一所示序列的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，其中該抗體或其抗原結(jié)合片段抑制GM-CSF的活性。在一個(gè)實(shí)施方式中，該抗體是人源化抗體。本發(fā)明另一方面提供結(jié)合人GM-CSF或其片段的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，該抗體在輕鏈可變區(qū)內(nèi)包含至少一個(gè)含有SEQIDNO:3-5中任一所示序列的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，在重鏈可變區(qū)內(nèi)包含至少一個(gè)含有SEQIDNO:6-8中任一所示序列的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。在一個(gè)實(shí)施方式中，該抗體是人源化抗體。該人源化抗體可包含含有SEQIDNO:9、SEQIDNO:IO或SEQIDNO:l1所示序列或其片段或變體的輕鏈可變區(qū)。該人源化抗體可包含含有SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15或SEQIDNO:17所示序列或其片段或變體的重鏈可變區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方式中，該人源化抗體或其抗原結(jié)合片段的重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:13所示序列或其片段或變體。變體重鏈可變區(qū)可包含用相應(yīng)鼠重鏈可變區(qū)中相應(yīng)位置的氨基酸殘基替代SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15或SEQIDNO:17所示序列的氨基酸殘基的一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代。在一個(gè)實(shí)施方式中，在包含SEQIDNO:13所示序列的重鏈可變區(qū)中作出所述一個(gè)或多個(gè)上述氨基酸取代。在一個(gè)實(shí)施方式中，變體重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:18-27中任一所示的序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，變體重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:27所示的序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述人源化抗體選自包含下表所示輕鏈可變序列和重鏈可變序列的組<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>本發(fā)明還提供包含與SEQIDNO:l-27中任一所示氨基酸序列具有至少約70%序列相同性的氨基酸序列的單克隆抗體。本發(fā)明還提供產(chǎn)生本發(fā)明單克隆抗體的雜交瘤。在另一方面，本發(fā)明提供治療或預(yù)防GM-CSF介導(dǎo)疾病或病癥或與GM-CSF表達(dá)和/或活性升高或異常相關(guān)的疾病或病癥的方法，該方法包括給予有此需要的對(duì)象有效量的至少一種本發(fā)明抗體或其抗原結(jié)合片段。所述疾病或病癥通常是自身免疫或炎性疾病或病癥。所述疾病或病癥可以選自，例如哮喘、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、慢性阻塞性肺病、特發(fā)性血小板減少性紫癜、急性呼吸窘迫綜合征、多發(fā)性硬化癥、阿爾茨海默病、克羅恩病、腸易激綜合征、結(jié)腸炎、銀屑病、黃斑變性、葡萄膜炎、華勒變性、抗磷脂綜合征、視網(wǎng)膜變性(restinosis)、動(dòng)脈粥樣硬化、特發(fā)性肺纖維化、復(fù)發(fā)性多軟骨炎、肝炎、腎小球腎炎、狼瘡和其它代謝性疾病。在另一方面，本發(fā)明提供本發(fā)明抗體或其抗原結(jié)合片段在制備治療或預(yù)防GM-CSF-介導(dǎo)疾病或病癥或與GM-CSF表達(dá)和/或活性升高或異常有關(guān)疾病或病癥的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供包含一種或多種本發(fā)明抗體或其抗原結(jié)合片段的藥物組合物，其任選含有合適的藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體和/或稀釋劑。附圖簡述現(xiàn)在將參考附圖描述本發(fā)明，只是作為非限制性的實(shí)施例。圖1.與商品化購得的抗-GM-CSF抗體(BD)相比，13種鼠抗-GM-CSF單克隆抗體中和人GM-CSF的細(xì)胞生長促進(jìn)活性的能力。圖2.與商品化購得的抗-GM-CSF抗體(BD)相比，有鼠抗-GM-CSF單克隆抗體存在下，鼠FDC-P1細(xì)胞的增殖。圖3.4K21單克隆抗體和4種人源化變體的輕鏈可變區(qū)序列的比對(duì)。標(biāo)出了CDRL1、L2禾口L3。還示出了框架4、G105Q和V109L中的突變。圖4.4K21單克隆抗體和5種人源化變體的重鏈可變序列的比對(duì)。標(biāo)出了CDRH1、H2和H3。圖5.與鼠4K21單克隆抗體和商品化購得的抗-GM-CSF抗體(BD)相比，通過BIAcore分析測(cè)定15種人源化4K21單克隆抗體對(duì)人GM-CSF的結(jié)合親和力(RU)。為簡明起見，每隔一種人源化單克隆抗體進(jìn)行編號(hào)(4K21-1、4K21-3等)。圖6.人源化4K21抗體的BIACore結(jié)合分析。注射濃度從66.7nM到4.17nM的兩倍連續(xù)稀釋抗體。顯示了GM-CSF人源化抗體的結(jié)合親和力(A)、結(jié)合速率(B)和解離速率(C)。圖7.4K21單克隆抗體和5種人源化變體的重鏈可變區(qū)序列的比對(duì)，顯示了4K21鼠框架和人源化h4Vh/10框架區(qū)之間8個(gè)不同氨基酸殘基的位置和種類(框)。帶框殘基上的編號(hào)(19-25)表明用回復(fù)突變構(gòu)建的人源化抗體的身份。還標(biāo)出了CDRH1、H2和H3。圖8.人源化抗體中和人GM-CSF的細(xì)胞生長促進(jìn)活性。制備濃度從400nM到28fM的三倍連續(xù)稀釋抗體，并與GM-CSF混合1小時(shí)再加入細(xì)胞。細(xì)胞生長72小時(shí)，然后通過311-胸苷的摻入定量測(cè)定細(xì)胞生長。各點(diǎn)以一式三份計(jì)算。圖9.4K21和人源化4K21抗體hGM4/11、hGM4/21、hGM4/22和hGM4/34的BIACore結(jié)合分析。將抗體通過抗鼠IgG或抗人IgG抗體偶聯(lián)于CM5芯片。注射濃度從1000nM到15.63nM的兩倍連續(xù)稀釋GM-CSF。顯示了GM-CSF抗體的結(jié)合親和力(A)、結(jié)合速率(B)和解離速率(C)。以序列標(biāo)識(shí)符(SEQIDNO:)指定核苷酸和氨基酸序列。SEQIDNO:在數(shù)字上對(duì)應(yīng)于序列標(biāo)識(shí)符<400>1(SEQIDNO:l)、<400>2(SEQIDNO:2)，等等。在說明書末尾提供了序列表。具體地說，本發(fā)明抗體的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)和CDR的氨基酸序列見SEQIDNo:1-27。發(fā)明詳述本文所用的冠詞"一"和"一個(gè)"指一個(gè)或一個(gè)以上(即，至少一個(gè))的該冠詞在語法上的對(duì)象。例如，"一個(gè)元素"表示一個(gè)元素或一個(gè)以上的元素。術(shù)語"多肽"表示由通過肽鍵連接在一起的氨基酸構(gòu)成的多聚物。術(shù)語"多肽"和"蛋白質(zhì)"在本文可互換使用，雖然出于本發(fā)明的目的，"多肽"可以構(gòu)成全長蛋白質(zhì)的一部分。在本說明書的范圍內(nèi)，述及"抗體"包括述及抗體的各種形式，包括但不限于完整抗體、抗體片段，包括，例如Fv、Fab、Fab'和F(ab')2片段，通過遺傳工程改造技術(shù)產(chǎn)生的人源化抗體、人抗體和免疫球蛋白-衍生多肽。在本說明書的范圍內(nèi)，述及某抗體的"結(jié)合"表示與靶抗原，例如GM-CSF的結(jié)合、相互作用或締合。述及"GM-CSF"包括其含有抗體結(jié)合表位的片段或部分。述及"GM-CSF與抗體結(jié)合"在其范圍內(nèi)包括抗體或其抗原結(jié)合片段與GM-CSF的部分、片段或含表位區(qū)域的結(jié)合、相互作用或締合。"結(jié)合"、"相互作用"或"締合"通常表示或包括抗體與GM-CSF或其部分的特異性結(jié)合、相互作用或締合。本文所用的術(shù)語"抑制"與GM-CSF活性有關(guān)，不一定表示完全抑制活性。而是指可以將活性抑制到足以產(chǎn)生所需效果的一定程度和/或一段時(shí)間。因此，抑制GM-CSF活性可以是部分或完全減弱GM-CSF的一種或多種生物學(xué)效應(yīng)，這種抑制可以在時(shí)間和/或空間上受限制。時(shí)間和/或空間上受限制表示抑制可以局限于身體的特定生理?xiàng)l件或環(huán)境和/或特定的區(qū)域。在本說明書的范圍內(nèi)，術(shù)語"活性"與GM-CSF有關(guān)時(shí)，其表示GM-CSF通過本身的蛋白質(zhì)或多肽形式或其任何片段或部分施加的任何細(xì)胞功能、作用、效應(yīng)或影響。本文所用的術(shù)語"治療"和"預(yù)防"指以任何方式治療疾病或癥狀，預(yù)防病癥或疾病的產(chǎn)生，或預(yù)防、阻止、延遲或逆轉(zhuǎn)病癥或疾病或其它不良癥狀的進(jìn)程的任何或所有應(yīng)用。因此，術(shù)語"治療"和"預(yù)防"等應(yīng)在其最寬的范圍內(nèi)考慮。例如，治療不一定暗示治療患者直至完全康復(fù)。本文所用的術(shù)語"有效量"的含義包括某藥物提供所需作用的無毒但有效10的用量。所需的確切用量或劑量取決于以下因素而在對(duì)象之間有所不同所治療的物種、對(duì)象的年齡和總體狀況、所治療疾病的嚴(yán)重性、所給予的具體藥物和給藥方式等等。因此，不可能規(guī)定確切的"有效量"。然而，對(duì)于任何給定的情況，本領(lǐng)域技術(shù)人員只采用常規(guī)實(shí)驗(yàn)即可確定合適的"有效量"。本文所用的術(shù)語"對(duì)象"通常指哺乳動(dòng)物，包括人、靈長類、牲畜(例如，綿羊、豬、牛、馬、驢)、實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)動(dòng)物(例如，小鼠、家兔、豚鼠)、陪伴動(dòng)物(例如，狗、貓)和捕獲的野生動(dòng)物(例如，狐、袋鼠、鹿)。哺乳動(dòng)物優(yōu)選人或?qū)嶒?yàn)室檢驗(yàn)動(dòng)物。所述哺乳動(dòng)物甚至更優(yōu)選人。本發(fā)明提供可用作GM-CSF拮抗劑并可用于治療GM-CSF水平和/或活性升高所誘導(dǎo)或與之有關(guān)的某些疾病的抗體。本發(fā)明還提供治療這些疾病的方法，包括給予患有這種疾病的患者本發(fā)明抗-GM-CSF抗體。還提供了用于這些方法的組合物，該組合物包含一種或多種抗-GM-CSF抗體。本發(fā)明抗體與GM-CSF或其部分結(jié)合、相互作用或締合。這些抗體通常對(duì)特定物種的GM-CSF，例如人GM-CSF具有特異性，或者就不同物種的GM-CSF之間的序列相似性水平而言，這些抗體可以與兩種或更多種物種的GM-CSF顯示一定的交叉反應(yīng)性。在抗體針對(duì)人GM-CSF的情況中，與GM-CSF的其它哺乳動(dòng)物形式具有一定交叉反應(yīng)性水平在某些情況下可能是理想的，例如為在特定疾病的動(dòng)物模型中檢驗(yàn)抗體和進(jìn)行毒理學(xué)、安全性和劑量研究。本發(fā)明抗體通常是單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段。這些抗體最優(yōu)選適合給予人的人源化或人抗體。這些抗體包括從，例如鼠單克隆抗體制備的人源化抗體和可利用，例如轉(zhuǎn)基因小鼠或通過噬菌體展示制備的人單克隆抗體。可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的各種方法制備本發(fā)明抗體。例如，可參考《單克隆抗體，雜交瘤生物學(xué)分析的新空間》(MonoclonalAntibodies,Hybridomas:ANewDimensioninBiologicalAnalyses),Kennet等(編)，普萊納姆出版社(PlenumPress),紐約(1980);《抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(Antibodies:ALaboratoryManual),Harlow禾PLand(編)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(ColdSpringHarborLaboratoryPress),冷泉港，紐約，(1988);禾B《單克隆抗體原理和實(shí)踐》(MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice),Goding，第三版,學(xué)術(shù)出版社(AeademicPress)(1996)。它們的內(nèi)容通過引用全文納入本文。類似地，可通過常規(guī)技術(shù)純化雜交瘤細(xì)胞系分泌的單克隆抗體。例如，產(chǎn)生本發(fā)明抗體的一種方法包括用GM-CSF多肽或其免疫原性部分或片段免疫非人動(dòng)物，例如小鼠或轉(zhuǎn)基因小鼠，從而在所述動(dòng)物產(chǎn)生抗GM-CSF多肽的抗體?？捎糜诿庖邉?dòng)物的GM-CSF多肽或其免疫原性部分或片段可以來自任何哺乳動(dòng)物來源。所述GM-CSF多肽或其免疫原性部分或片段通常是GM-CSF?？赏ㄟ^常規(guī)技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明抗體的抗原結(jié)合片段。這種片段的例子包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段，包括單鏈Fv片段(稱為sFv或scFv)。也考慮使用通過遺傳工程改造技術(shù)產(chǎn)生的抗體片段和衍生物，例如二硫鍵穩(wěn)定的Fv片段(dsFv)、單鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域(Abs)分子和小抗體。除非另有規(guī)定，本文所用的術(shù)語"抗體"和"單克隆抗體"包括完全抗體及其抗原結(jié)合片段?？赏ㄟ^已知技術(shù)制備這種抗GM-CSF的單克隆抗體的衍生物，并篩選其所需特性。這些技術(shù)可以包括，例如分離編碼感興趣單克隆抗體的多肽鏈(或其一部分)的DNA，和通過重組DNA技術(shù)操作DNA。該DNA可用于產(chǎn)生感興趣的另一DNA，或經(jīng)改變(例如，通過誘變或其它常規(guī)技術(shù))而，例如添加、缺失或取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。可從用GM-CSF免疫的小鼠的B細(xì)胞分離編碼抗體多肽(或重鏈或輕鏈，只有可變區(qū)或全長)的DNA?？赏ㄟ^包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)在內(nèi)的常規(guī)方法分離DNA。噬菌體展示是可制備本發(fā)明抗體的衍生物的另一合適技術(shù)。在一個(gè)方法中，可以在任何合適的重組表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)作為感興趣抗體的諸部分的多肽，可裝配表達(dá)的多肽以形成抗體分子?？赏ㄟ^氨基酸橋(短肽接頭)連接重鏈和輕鏈可變區(qū)(Fv區(qū))片段以形成單鏈抗體，從而得到一根多肽鏈。可通過在編碼兩個(gè)可變區(qū)多肽(VL和VH)的DNA之間融合編碼肽接頭的DNA來制備這種單鏈Fv(scFv)。根據(jù)兩個(gè)可變區(qū)之間彈性接頭的長度，得到的抗體片段可形成二聚體或三聚體(參見Kortt等，ProteinEngineering10:423，1997)。為產(chǎn)生單鏈抗體而開發(fā)的技術(shù)包括以下文獻(xiàn)所述的技術(shù)美國專利號(hào)4,946,778;Bird(Science242:423，1988)、Huston等，(Proc.Natl.AcadSciUSA85:5879,1988)和Ward等(Nature334:544,1989)。它們的內(nèi)容通過引用全文納入本文。本發(fā)明包括衍生自本文所提供抗體的單鏈抗體。本發(fā)明考慮的單克隆抗體的例子是鼠單克隆抗體4K21，其產(chǎn)生方法如本文所述。鼠單克隆抗體4K21包含SEQIDNO:l所示的輕鏈可變序列和SEQIDNO:2所示的重鏈可變序列。4K21的輕鏈CDR序列如SEQIDNO:3-5所示。4K21的重鏈CDR序列如SEQIDNO:6-8所示。產(chǎn)生鼠單克隆抗體4K21的雜交瘤于2007年5月17日保藏在英國索爾茲伯里普當(dāng)應(yīng)用微生物與研究中心的歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏所(ECACC)，登錄號(hào)為07051601。應(yīng)該知道，本發(fā)明單克隆抗體的氨基酸序列可包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代，這種取代使得雖然多肽的基本序列改變了，但該抗體結(jié)合GM-CSF的能力以及該抗體的活性依然保留。所述取代可以是保守性取代。本文所用的術(shù)語"保守性氨基酸取代"指在多肽鏈(蛋白質(zhì)的一級(jí)序列)中用一種氨基酸取代或替代特性相似的另一氨基酸。例如，荷電氨基酸谷氨酸(Glu)取代類似荷電的氨基酸天冬氨酸(Asp)是保守性氨基酸取代。本發(fā)明考慮本文公開的輕鏈和重鏈序列的變體，這種變體屬于本發(fā)明的范圍。本文所用的術(shù)語"變體"指基本上相似的序列。多肽序列變體通常具有共同的定性生物學(xué)活性。變體多肽序列可以是本文公開序列的衍生物，該衍生物包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸的添加、缺失或取代。變體可在輕鏈或重鏈序列的框架區(qū)或CDR內(nèi)與公開的序列不同。例如，考慮了包含與SEQIDNO:l-27所示氨基酸序列有至少約70%序列相同性的氨基酸序列的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段。所述單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段可包含與SEQIDNO:l-27所示氨基酸序列有至少約75%、80%、85°/。、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列相同性的氨基酸序列。術(shù)語"變體"包括通過任何合適的方式從本文公開的那些序列修飾的抗體序列。例如，當(dāng)用于鼠序列時(shí)，術(shù)語"變體"的范圍包括這種序列的人源化形式。當(dāng)用于本文公開的人源化序列時(shí)，該術(shù)語"變體"的范圍包括包含一個(gè)或多個(gè)鼠回復(fù)突變的修飾序列。源自非人動(dòng)物，例如小鼠的抗體通常不適合給予人，因?yàn)樗鼈兛赡軐?dǎo)致免疫反應(yīng)，并產(chǎn)生抗-小鼠抗體(所謂的HAMA反應(yīng))。HAMA反應(yīng)可通過快速清除血液中的小鼠抗體而中和它們，因而阻止了小鼠抗體與其靶標(biāo)結(jié)合。13為避免產(chǎn)生HAMA反應(yīng)。一種策略是通過用人序列替代非表位結(jié)合區(qū)中許多"外來"殘基而"人源化"小鼠抗體?？贵w與抗原之間相互作用的特異性涉及可變區(qū)中的超變區(qū)或互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。人源化過程中通常不改變這些殘基。通常用人序列替代重鏈和輕鏈上可變區(qū)中的其余殘基，其稱為抗體的框架區(qū)(FW)和恒定區(qū)。為避免破壞抗體-結(jié)合袋的結(jié)構(gòu)和抗體的特異性或親和力，可能需要保留框架區(qū)中某些鼠殘基。合適的人源化方法，例如CDR嫁接(CDRgrafting)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。本文示例了特別合適的方法。以下文獻(xiàn)也描述了用于產(chǎn)生嵌合型和人源化單克隆抗體的方法，例如Riechmann等，Nature332:323,1988;Liu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:3439，1987;Larrick等，Bio/Technology7:934，1989;Winter和Harris，TIPS14:139,1993。可采用Kabat等在《免疫學(xué)感興趣的蛋白質(zhì)的序列》(S叫uencesofProteinsofImmunologicalInterest),第五版，美國健康與人類服務(wù)部(USDept.ofHealthandHumanServices),PHS，NIH，NIH出版號(hào)91-3242，1991)中所述的系統(tǒng)鑒定給定抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。例如，本文所述的鼠單克隆抗體4K21經(jīng)人源化以降低該抗體的免疫原性。鑒定了保留對(duì)人GM-CSF的高結(jié)合親和力(皮摩爾范圍)以及合適GM-CSF抑制活性的22種人源化抗體，如本文所示例的。在具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明的人源化抗體在其輕鏈可變區(qū)中包含至少一個(gè)在鼠抗體4K21的輕鏈中發(fā)現(xiàn)的CDR，如SEQIDNO:3-5所示。因此，本發(fā)明所考慮的抗體是包含鼠抗體4K21輕鏈可變區(qū)的1個(gè)到所有3個(gè)CDR序列的那些抗體。此外，本發(fā)明所考慮的抗體是在其重鏈可變區(qū)中包含至少一個(gè)在鼠抗體4K21的重鏈中發(fā)現(xiàn)的CDR(如SEQIDNO:6-8所示)的那些抗體。因此，本發(fā)明所考慮的抗體是包含鼠抗體4K21重鏈可變區(qū)的1個(gè)到所有3個(gè)CDR序列的那些抗體。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明抗體包含鼠抗體4K21的重鏈和輕鏈可變區(qū)的1個(gè)到所有6個(gè)CDR序列。本發(fā)明特定實(shí)施方式的人源化抗體如下表2所述。表2-衍生自鼠單克隆抗體4K21的人源化抗體人源化抗體重鏈包含輕鏈包含<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>本領(lǐng)域技術(shù)人員開發(fā)并熟知在非人動(dòng)物中產(chǎn)生人抗體的方法?？贵w可以是部分人的，或完全人的抗體。例如，可用已引入編碼一個(gè)或多個(gè)人免疫球蛋白鏈的遺傳材料的轉(zhuǎn)基因小鼠來產(chǎn)生抗體。所述轉(zhuǎn)基因小鼠可以這樣的，即免疫后該動(dòng)物產(chǎn)生的至少一些抗體中存在替換內(nèi)源性免疫球蛋白鏈的人免疫球蛋白多肽鏈。產(chǎn)生人抗體的另一種方法是噬菌體展示。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知產(chǎn)生人抗體的噬菌體展示技術(shù)，包括劍橋抗體技術(shù)公司(CambridgeAntibodyTechnology)和MS公司(MorphoSys)所用的方法，這些方法描述于國際專利公布號(hào)WO92/01047、WO92/20791、WO93/06213和WO93/11236(其內(nèi)容通過引用納入本文)。可篩選并操作本發(fā)明的抗體或包含這種抗體的雜交瘤以進(jìn)一步鑒定具有特別理想特性，例如結(jié)合親和力增加、免疫原性降低和/或?qū)M-CSF的抑制15活性增加的單克隆抗體。本發(fā)明提供治療或預(yù)防GM-CSF-介導(dǎo)疾病或病癥、與GM-CSF的水平和/或活性升高有關(guān)的疾病或病癥以及可能從通過給予本發(fā)明抗體抑制或中和GM-CSF活性的治療中受益的其它疾病或病癥的方法?？筛鶕?jù)本發(fā)明治療的疾病和病癥包括自身免疫和炎性疾病。這種疾病包括但不限于哮喘、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、慢性阻塞性肺病、特發(fā)性血小板減少性紫癜、急性呼吸窘迫綜合征、多發(fā)性硬化癥、阿爾茨海默病、克羅恩病、腸易激綜合征、結(jié)腸炎、銀屑病、黃斑變性、葡萄膜炎、華勒變性、抗磷脂綜合征、視網(wǎng)膜變性、動(dòng)脈粥樣硬化、特發(fā)性肺纖維化、復(fù)發(fā)性多軟骨炎、肝炎、腎小球腎炎、狼瘡和其它代謝性疾病。可根據(jù)本發(fā)明治療的其它自身免疫疾病包括全身性硬化癥、硬皮病、斯耶格侖綜合征、脊椎關(guān)節(jié)炎、SAPHO綜合征、青少年特發(fā)性關(guān)節(jié)液(juvenileiodipathicarthritis)、萊姆病、多發(fā)性肌炎、皮肌炎、自身免疫性甲狀腺炎(autoimmunethyroditis)、格雷夫斯病、1型糖尿病、腎上腺炎(adrenaltis)、自身免疫性阿狄森病、多內(nèi)分泌腺綜合征(polyendocrinesyndromes)、胃炎、惡性貧血、垂體炎、溶血性貧血、嗜中性白血球減少癥、再生障礙性貧血、凝血病(clottingdisorder),包括獲得性馮維勒布蘭德綜合征、格-巴二氏綜合征、慢性炎性脫髓鞘多發(fā)性神經(jīng)根性神經(jīng)病(chronicinflammatorydemyelinatingpolyradiculoneuropathy"重癥肌無力、伊頓-蘭伯特肌無力綜合征、獲得性神經(jīng)性肌強(qiáng)直、強(qiáng)直人綜合征、小腦性共濟(jì)失調(diào)、拉斯姆森腦炎(RasmussenEncephalitis)、莫凡綜合征(MorvanSyndrome)、邊緣系腦炎、眼病、內(nèi)耳病、乳糜瀉、原發(fā)性膽汁性肝硬變(primarybiliarycirrhosis)、原發(fā)性硬化性膽管炎、胰腺炎、天皰瘡(pemphiguspemphigoid)、斑禿、白癜風(fēng)、慢性蕁麻疹、古德帕斯徹病、ANCA-相關(guān)腎小球腎炎、睪丸炎、卵巢炎、風(fēng)濕性心臟病、心肌炎、擴(kuò)張性心肌病、結(jié)節(jié)性多發(fā)性關(guān)節(jié)液(polyartheritisnodosa)、川畸病、韋格納肉芽腫病、顯微多脈管炎、丘-施二氏綜合征、冷球蛋白血癥脈管炎(cryoglobulenemicvasculitis)、亨-舍二氏紫癜、貝切特(氏)病、巨細(xì)胞動(dòng)脈炎、高安動(dòng)脈炎、特發(fā)性梗阻性細(xì)支氣管炎(idi叩athicbronchiolitisobliterans)、特發(fā)性肺纖維變性、肺的自身免疫疾病和眼陣攣-肌陣攣綜合征(Opsoclonus-Myoclonussyndrome)。本文公開的抗體還可應(yīng)用于治療失敗或排異的植入物和假體及失敗或排異的器官移植，例如肺、腎、心和肝。還考慮了本發(fā)明抗體在體內(nèi)和體外的其它應(yīng)用。例如，設(shè)計(jì)用于檢測(cè)GM-CSF的存在和/或純化GM-CSF的試驗(yàn)可利用本發(fā)明抗體。還可在特定疾病的動(dòng)物模型中檢驗(yàn)抗體，以進(jìn)行毒理學(xué)、安全性和劑量研究。對(duì)于治療性和預(yù)防性應(yīng)用，將能獲得所需治療或預(yù)防作用的有效量的本發(fā)明抗體給予有此需要的對(duì)象。應(yīng)該知道，任何特定對(duì)象的具體有效量或劑量取決于各種因素，包括，例如所用具體抗體的活性、年齡、體重、待治療個(gè)體的總體健康狀況和飲食、給藥時(shí)間、排出速率和與任何其它治療或療法聯(lián)用?？梢愿鶕?jù)治療醫(yī)師選擇的劑量水平和模式進(jìn)行單次或多次給藥。如果需要，治療或預(yù)防自身免疫和炎性疾病時(shí)，本發(fā)明考慮給予多種抗體。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)具體的病例決定給予一種或多種抗體是否是合適或理想的。本發(fā)明還考慮聯(lián)合治療，其中本文所述抗體與可能有助于所需治療或預(yù)防后果的其它合適藥物共同給予。例如，就哮喘而言，可尋求維持現(xiàn)有的抗炎治療以控制炎癥的發(fā)生率同時(shí)利用本發(fā)明實(shí)施方式的藥物。"共同給予"表示通過相同或不同途徑在同一制劑或兩種不同制劑中同時(shí)給予，或通過相同或不同途徑而順次給予。"順次"給予表示兩種藥物的給藥時(shí)間相差數(shù)秒、數(shù)分鐘、數(shù)小時(shí)、數(shù)日、數(shù)周、數(shù)月或數(shù)年?？刹捎萌魏雾樞蚪o予這些藥物。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，可采用任何合適的形式給予抗體。根據(jù)本發(fā)明，通常給予藥物組合物形式的抗體，所述組合物可包含一種或多種藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體、賦形劑或稀釋劑。這種組合物可以通過任何合適的途徑，例如通過胃腸外(包括靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)或肌肉內(nèi))、口服、經(jīng)鼻、局部和皮下途徑而全身性、區(qū)域或局部給予。藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體或稀釋劑的例子是去除礦物質(zhì)的水或蒸餾水；鹽水溶液；植物油，例如花生油、紅花油、橄欖油、棉籽油、玉米油、芝麻油、花生油或椰油；硅油，包括聚硅氧烷，例如甲基聚硅氧垸、苯基聚硅氧烷和甲基苯基聚硅氧烷；揮發(fā)性硅酮；礦物油，例如液體石蠟、軟石蠟或角鯊垸；纖維素衍生物，例如甲基纖維素、乙基纖維素、羧甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉或17羥丙基甲基纖維素；低級(jí)垸醇，例如乙醇或異丙醇；低級(jí)芳垸醇；低級(jí)聚亞垸基二醇或低級(jí)亞烷基二醇，例如聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇、丙二醇、1,3-丁二醇或甘油；脂肪酸酯，例如棕櫚酸異丙酯、肉豆蔻酸異丙酯或油酸乙酯；聚乙烯吡咯烷酮；瓊脂；角叉聚糖；黃蓍膠或阿拉伯膠和石油凝膠。以組合物的重量計(jì)，運(yùn)載體通常占10%-99.9%。適用于口服的運(yùn)載體、稀釋劑、賦形劑和輔助劑的一些例子包括花生油、液體石蠟、羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、海藻酸鈉、阿拉伯膠、黃蓍膠、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、明膠和卵磷脂。此外，這些口服制劑可含有合適的調(diào)味劑和著色劑。當(dāng)用于膠囊形式時(shí)，可用延遲崩解的化合物，例如單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯包衣所述膠囊。輔助劑通常包括軟化劑、乳化劑、增稠劑、防腐劑、殺菌劑和緩沖劑。對(duì)于采用可注射溶液或懸液給藥，胃腸外可接受的無毒稀釋劑或運(yùn)載體可包括林格液、中鏈甘油三酯(MCT)、等滲鹽水、磷酸緩沖鹽水、乙醇和1,2丙二醇。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知制備可胃腸外給予的組合物的方法，更多細(xì)節(jié)見，例如通過引用全文納入本文的《雷明頓藥物科學(xué)》(Remington'sPharmaceuticalScience),第15版，馬克出版公司(MackPublishingCompany),伊斯頓(Easton),賓夕法尼亞州。本說明書引用任何在先出版物(或從中獲得的信息)或任何已知的物質(zhì)不是，并且不應(yīng)理解為承認(rèn)或認(rèn)可或是以任何形式暗示該在先出版物(或從中獲得的信息)或已知物質(zhì)在任何國家中構(gòu)成本說明書有關(guān)領(lǐng)域的公知常識(shí)?，F(xiàn)在參考以下具體實(shí)施例描述本發(fā)明，這些實(shí)施例不應(yīng)理解成以任何形式限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例實(shí)施例l-產(chǎn)生鼠單克隆抗體4K21將CFA(完全弗氏佐劑)配制的50嗎重組人GM-CSF(PT公司(Peprotech))腹膜內(nèi)注射入BALB/c小鼠來產(chǎn)生抗人GM-CSF抗體。2周和4周后，再注射IFA(不完全弗氏佐劑)配制的25嗎重組人GM-CSF兩次。首次注射后6個(gè)月，腹膜內(nèi)給予IFA配制的25重組人GM-CSF加強(qiáng)免疫。最后，加強(qiáng)免疫后2周靜脈內(nèi)給予磷酸緩沖鹽水配制的50pg重組人GM-CSF。5天后，收集小鼠脾臟，并與SP2/0細(xì)胞融合。通過ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)篩選表達(dá)抗體的雜交瘤上清液與重組人GM-CSF的特異性結(jié)合情況。釆用TF-1和FDC-P1生物學(xué)試驗(yàn)(參見實(shí)施例2)進(jìn)一步篩選抗-人GM-CSF抗體的中和活性。如此產(chǎn)生的一種鼠抗-人GM-CSF單克隆抗體指定為4K21-011-E14(下文稱為4K21)。mAb4K21的可變區(qū)氨基酸序列如下所示輕鏈DWMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVNSNGNTYLHWFLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPPTFGGGTKLEIK(SEQIDN0:1)重鏈EVQLVESGGGLVKSGGSLKLSCAASGFAFSAYDMSWVRQTPEKRLELVAYISSGGSSFYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCTRHLGFDYWGQGTTLTVSS(SEQIDN0:2)含有4K21的雜交瘤于2007年5月17日保藏在英國索爾茲伯里普當(dāng)應(yīng)用微生物與研究中心的歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏所(ECACC)，登錄號(hào)為07051601。實(shí)施例2-鼠單克隆抗體4K21的生物學(xué)特性在TF-1細(xì)胞生長生物學(xué)試驗(yàn)中，證明鼠抗-人GM-CSF單克隆抗體4K21能中和人GM-CSF的生長促進(jìn)功能(圖1)。TF-1細(xì)胞的生長依賴GM-CSF的存在，用2ng/ml重組GM-CSF(PT公司)維持該細(xì)胞。為進(jìn)行中和試驗(yàn)，用含0.25ng/mlGM-CSF的TF-1生長培養(yǎng)基制備10ng/ml-10，000ng/ml濃度的抗體?；旌细鳚舛鹊目贵w與GM-CSF，在96孔板中37"C溫育1小時(shí)。然后將經(jīng)清洗的TF-1細(xì)胞(lxl()5)加入各孔，37'C溫育72小時(shí)。通過用0.5uCi的3H-胸苷脈沖處理各孔4小時(shí)以定量測(cè)定細(xì)胞生長。相反，4K21顯示抗-人GM-CSF特異性，但該抗體不能中和鼠GM-CSF介導(dǎo)的FDC-P1細(xì)胞生長(圖2)。為進(jìn)行該中和試驗(yàn)，用含5ng/ml鼠GM-CSF的FDC-P1生長培養(yǎng)基制備10ng/ml-10,000ng/ml濃度的抗體。混合各濃度的抗體與GM-CSF，在96孔板中37r溫育1小時(shí)。然后將經(jīng)清洗的FDC-P1細(xì)胞(lxlO"加入各孔，37'C溫育72小時(shí)。通過用0.5uCi的311-胸苷脈沖處理各孔4小時(shí)以定量測(cè)定細(xì)胞生長。采用Biacore測(cè)定4K21單克隆抗體的結(jié)合動(dòng)力學(xué)，并與購自BD生物科學(xué)公司(BDBiosciences,BD;目錄號(hào)554501)的大鼠抗-人GM-CSF抗體的結(jié)合動(dòng)力學(xué)作比較(參見下表1)。將重組人GM-CSF包被到CM5芯片上以測(cè)定4K21抗體的結(jié)合動(dòng)力學(xué)。未包被的流動(dòng)小室(cell)用作參照。在2分鐘內(nèi)注射用HBS-EP制備成66.7nM到4.17nM濃度的兩倍連續(xù)稀釋抗體，穩(wěn)定時(shí)間為IO分鐘，解離時(shí)間為15分鐘。運(yùn)行BIACore動(dòng)力學(xué)分析向?qū)?BIACorekineticanalysiswizard)來確定各抗體與GM-CSF的締合(ka[固s])、解離(kd[l/s])和親和力(KD[nM])。如表3所示，4K21顯示對(duì)人GM-CSF的結(jié)合親和力極高，在低皮摩爾濃度即可結(jié)合。表3-4K21單克隆抗體的結(jié)合動(dòng)力學(xué)用重組人GM-CSF包被CM5芯片以測(cè)定4K21抗體的結(jié)合動(dòng)力學(xué).抗體ka(1/Ms)kd(1/s)KA(1/M)KD(M)KD(nm)BD5.20E+04<le-5>5.2e9<1.9e-10<0.194K21-011-E14(小鼠)5.卯E+04<le-5>5.9e9<1.7e-10<0.17實(shí)施例3-4K21的人源化激定C￡>/鵬艦殘基通常按照各種編號(hào)方案，例如Kabat、Chothia或IMGT(ImMunoGeneTicsinformationsystemhttp:〃imgt.cines.fr)來確定某抗體的CDR和框架區(qū)。Kabat定義是基于序列變異性，是最常用的。然而，Kabat確定的給定抗體的CDR不一定與其它編號(hào)系統(tǒng)確定的CDR相同。兩種編號(hào)系統(tǒng)確定的CDR可能重疊，或者一種可在另一種的某側(cè)延伸幾個(gè)殘基。聯(lián)用Kabat和IMGT編號(hào)系統(tǒng)以確定可變(V)區(qū)中的CDR和框架區(qū)。其目標(biāo)是盡可能提高嫁接入人框架區(qū)的小鼠CDR序列的范圍，從而保持抗原結(jié)合20袋的結(jié)構(gòu)。因此，GM-CSF抗體CDR包括由Kabat和IMGT編號(hào)系統(tǒng)分類為CDR的所有殘基。其余序列包含V區(qū)框架。遂譯會(huì)適游乂貧^V^^^^/為選擇嫁接小鼠CDR的合適人抗體框架序列，采用多種方案采用BlastP檢索序列數(shù)據(jù)庫，鑒定與GM-CSF抗體的小鼠可變區(qū)同源性最高的人IgV區(qū)輕鏈和重鏈序列。根據(jù)以下三條標(biāo)準(zhǔn)對(duì)人IgV區(qū)重鏈和輕鏈序列排序a)與完整鼠可變區(qū)序列的總體相似性和相同性b)經(jīng)典的結(jié)構(gòu)比較c)框架相似性評(píng)分。選擇與小鼠GM-CSF抗體的同源性最高的已知人抗體，利用那些人可變區(qū)框架嫁接小鼠GM-CSF抗體CDR。胂微微鄉(xiāng)鄉(xiāng)絲雄小鼠4K21可變區(qū)氨基酸序列(重鏈和輕鏈)分別用作對(duì)NCBI非冗余數(shù)據(jù)庫作Blasp檢索的査詢序列。然后選擇源自人來源的序列。檢查參照物，在不清楚克隆是否確實(shí)分離自人來源的情況中，忽略這些序列。根據(jù)Tomlinson等，五M50J14:4628-4638，1995的定義確定輕鏈經(jīng)典結(jié)構(gòu)。相似地，根據(jù)Chothia等，/Mo/.胸.227:799-817，1992的定義確定重鏈經(jīng)典結(jié)構(gòu)。從各檢索獲得與査詢序列的同源性最高的序列清單，見下表4和5。選擇人輕鏈框架表4-與小鼠GM-CSFmAb輕鏈可變區(qū)同源的人序列<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>具有與4K21輕鏈(4-1-1)相同的經(jīng)典結(jié)構(gòu)。這些抗體中許多的來源不明，因此忽略它們。選擇用于比較的抗體是hlgVLGMCSF02、05、06、19和09?？贵w02和05具有相同的框架，因此，總共確定了4種不同的框架。確定的框架非常相似，事實(shí)上，除了在框架4中有兩個(gè)突變以外，兩對(duì)框架是相同的。兩對(duì)中突變是相同的-G105Q和V109L-參見圖3。根據(jù)該數(shù)據(jù)，決定只合成h4a、h4b和h4c，因?yàn)樵撦p鏈組合可以覆蓋框架4中的突變，如果它們重要的話。透摔乂重離菜表5-與小鼠GM-CSFmAb重鍵;可變區(qū)同源的人序列.hlgHVGMCSF序列ID%相同性。/。相似性經(jīng)典結(jié)構(gòu)框架相似性評(píng)分參照1AAX82494.1GI:62421461806卜3-8參照-人抗體21FH5HGI:1083^839806卜3-9可能是鼠3AAC51009.1GI:17910317212-174CAC28887.1GI:127339687213-18BAC01301.1GI:216685487412卜3-16無參照-人治療性文庫克隆6S22657Gl:74387587113-177CAA4腦.1Gl:327787113-198CAD60378.1GI:277533356912-169BAC01458.1GI:216688627112-1710CAD60354.1GI:277532876713-1811AAC18279,1GI:31709537213-15參照-人抗體12CAD60概1GI:277534656911-1813GI:277533577011-1814CAD60364.1GI:277533076913-1715CAD60352.1Gl:277532836911-1823<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>與4K21重鏈可變區(qū)同源性最高的框架是hlgVHGMCSFOl、02、05和26。所有這些抗體具有與4K21重鏈(l-3)相同的經(jīng)典結(jié)構(gòu)。下一大組抗體的相同性和相似性評(píng)分非常類似，但根據(jù)它們的框架相似性評(píng)分選擇兩種抗體。通過分析框架區(qū)中的各殘基來計(jì)算框架相似性，評(píng)分是非相同殘基數(shù)。這兩種抗體是hlgVHGMCSF11和20。檢査所有抗體的來源，除了被忽略hlgVHGMCSF02外，所有抗體都是人來源的。因此，選擇的與4K21重鏈可變區(qū)同源性最高的抗體是hIgVHGMCSFOl、05、11、20和26。CZ)i縱乂絲柳#產(chǎn)主乂,艘楚贈(zèng)鏈顏乂,眾^C"存鏈產(chǎn)生4種形式的人源化4K21輕鏈可變區(qū)。圖3顯示這些人源化形式的4K21輕鏈抗體的比對(duì)。這些抗體中的3種，h4a、h4b和h4c用于本文所述的人源化抗體中。人源化抗GM-CSF輕鏈h4a(SEQIDN0:9)是基于hlgVLGMCSF02和05框架-這兩種抗體輕鏈具有相同的框架。兩種抗體均分離自治療性人抗體的文庫。從人扁桃體、臍帶、外周血和骨髓的混合物產(chǎn)生該文庫。人源化抗GM-CSF輕鏈h4b(SEQIDNO:10)是基于hlgVLGMCSF06框架。該抗體分離自慢性淋巴細(xì)胞性白血病患者的外周血(Stamatopoulos等，Blood106(10):3575-3583，2005)。人源化抗GM-CSF輕鏈h4c(SEQIDNO:ll)是基于hlgVLGMCSF09框架。該抗體分離自治療性人抗體的文庫。從人扁桃體、臍帶、外周血和骨髓的混合物產(chǎn)生該文庫。乂微/畫鏈產(chǎn)生5種形式的人源化4K21重鏈可變區(qū)。圖4顯示這5種人源化形式的4K21重鏈抗體的比對(duì)。人源化抗GM-CSF重鏈h4/10(SEQIDNO:13)是基于hlgVHGMCSF01。該抗體分離自耐受瘧疾感染的患者(Lundquist等，/"/e"/ww"".74(6):3222-3231,2006)。人源化抗GM-CSF重鏈h4/20(SEQIDNO:14)是基于hlgVHGMCSF05。該抗體分離自治療性人抗體的文庫。從人扁桃體、臍帶、外周血和骨髓的混合物產(chǎn)生該文庫。人源化抗GM-CSF重鏈h4/30(SEQIDN0:15)是基于hlgVHGMCSFl1。該抗體分離自兩位健康的成年人(Wang和Stollar，CY/"./ww""o/.93(2):132-142,1999)。人源化抗GM-CSF重鏈h4/40(SEQIDNO:16)是基于hlgVHGMCSF20。該抗體分離自CD5+B細(xì)胞群。人源化抗GM-CSF重鏈h4/50(SEQIDNO:17)是基于hlgVHGMCSF26。該人抗體分離自毛細(xì)胞性白血病的患者。注意數(shù)據(jù)庫中的條目不具有框架l的完整序列(前16個(gè)氨基酸缺失)。為完成框架區(qū)1，插入小鼠重鏈的等效殘基。鼠抗體的所有這些殘基均出現(xiàn)在人數(shù)據(jù)庫中，除了氨基酸14處是絲氨酸。氨基酸14處的絲氨酸看來是鼠獨(dú)有的。因此，對(duì)于4K21重鏈的這種人源化形式，在氨基酸14處包含絲氨酸可視作框架回復(fù)突變成鼠殘基。實(shí)施例4-表達(dá)人源化抗體游貧體W變^基歷克燈乂^短定X基像游載體^如上所述設(shè)計(jì)重鏈和輕鏈可變區(qū)氨基酸序列。為產(chǎn)生含有這些結(jié)構(gòu)域的抗體，優(yōu)化編碼各可變區(qū)的DNA序列并由德國格納特股份有限公司(GeneartGmbH,Germany)合成。輕鏈可變基因在各端具有獨(dú)特的5swBl限制性位點(diǎn)。重鏈基因在5'端具有&mBl位點(diǎn)，在3，端具有滿el位點(diǎn)。此外，為便于亞克隆入其它載體，在5，或3'端加入五coRI和i//"dIII位點(diǎn)。為構(gòu)建全長抗體基因，將可變區(qū)基因亞克隆入編碼分泌信號(hào)和恒定區(qū)的載體。對(duì)于輕鏈，該載體含有通過兩個(gè)獨(dú)特SswBl位點(diǎn)隔開的分泌信號(hào)序列和人恒定區(qū)k(Ck)基因。重鏈載體含有通過^ymBl和W/zel位點(diǎn)隔開的分泌信號(hào)和人恒定區(qū)Y(Cy1)基因。克隆方法包括通過標(biāo)準(zhǔn)方法制備質(zhì)粒DNA，根據(jù)生產(chǎn)商(NEB)的推薦用5swBl(輕鏈載體和Vk區(qū)基因)或5swBl和7V/7el(重鏈載體和Vh區(qū)基因)消化質(zhì)粒DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，利用凝膠提取試劑盒(JetQuick，基諾邁得公司(Genomed))從凝膠回收DNA片段，將可變區(qū)26基因片段連接于載體片段(T4DNA連接酶，NEB)，將DNA轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞(TOPIO，英杰公司(Invitrogen))。通過限制性消化分析轉(zhuǎn)化細(xì)胞的質(zhì)粒DNA，測(cè)序質(zhì)粒中的抗體基因以證實(shí)可變區(qū)亞克隆入正確的讀框。搭絲基艦克廣乂教載沐證實(shí)全長抗體基因具有正確序列后，將其亞克隆入表達(dá)載體?？捎玫谋磉_(dá)載體的例子包括以下任一種pcDNA-、pLENTI-、pT匿REX-、pAd-、pREP-或pCEP-哺乳動(dòng)物表達(dá)載體(英杰公司)，pTriExl或pBac載體(諾瓦金(Novagen)),ZAP和pCMV表達(dá)載體(斯特拉塔基因公司(Stratagene))，GS表達(dá)系統(tǒng)載體(隆扎公司(Lonza))，pCMV5cumate表達(dá)系統(tǒng)載體(QBG公司(Qbiogene))，UCOE表達(dá)系統(tǒng)質(zhì)粒(ML實(shí)驗(yàn)室公司(MLLaboratories))或MARtech表達(dá)質(zhì)粒(賽勒克斯公司(Selexis))。在該情況中，將重鏈基因(在5'端含有///"dill位點(diǎn)，在3'端含有￡coRI位點(diǎn))亞克隆入pEE6.4載體(隆扎生物公司(LonzaBiologies)，英國)中CMV啟動(dòng)子下游的///"dIII-￡coRI位點(diǎn)。將輕鏈基因(在5'端含有//,力din位點(diǎn)，在3'端含有五coRI位點(diǎn))亞克隆入pEE12.4載體(隆扎生物公司，英國)中的///milIKEcoRI位點(diǎn)。將重鏈表達(dá)盒(含啟動(dòng)子、重鏈編碼序列和多聚腺苷酸化信號(hào)并且在5'端含有WWI位點(diǎn)，在3'端含有SamHI位點(diǎn))亞克隆入輕鏈表達(dá)盒下游的A^I-SomHI位點(diǎn)，從而產(chǎn)生同時(shí)表達(dá)重鏈和輕鏈的單一載體。在鐒教動(dòng)欽潘應(yīng)^表達(dá)乂薪眾貧沐為表達(dá)人源化抗體，在一些情況中，利用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑(英杰公司)將重鏈和輕鏈載體共轉(zhuǎn)染入CHO細(xì)胞。或者，可通過電穿孔、磷酸鈣沉淀、直接注射、基因槍或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它方法轉(zhuǎn)染載體DNA。在大多數(shù)情況中，通過電穿孔將同時(shí)編碼重鏈和輕鏈的單一載體轉(zhuǎn)染入CHO細(xì)胞。斷貧沐存染浙表這轉(zhuǎn)染之日，用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑將150pgDNA轉(zhuǎn)染入1.5x107CHO細(xì)胞中(至少90%為活細(xì)胞，隆扎生物公司，英國)。3-4天后通過ELISA監(jiān)測(cè)抗體表達(dá)。^眾乂滯論拔沐轉(zhuǎn)染的細(xì)胞將抗體分泌入生長培養(yǎng)基。通過G蛋白親和層析純化抗體。合并通過SDS-PAGE或人IgG特異性ELISA鑒定的含抗體組分。采用人IgG特異性ELISA測(cè)定回收的抗體量及其濃度。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳估計(jì)抗體純度。產(chǎn)全浙漱定游乂,化拔沐游清卓下表6列出了產(chǎn)生的不同抗體，顯示抗體中存在的重鏈和輕鏈序列。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>實(shí)施例5-人源化抗體的生物學(xué)特性乂#眾貧GM-GSF貧體游翁會(huì)襲浙力分析通過BIACore分析測(cè)定人源化抗體的結(jié)合親和力。用乙酸鈉，pH5制備100ng/ml的重組GM-CSF(PT公司)，通過胺偶聯(lián)固定于CM5傳感器芯片。約1200RU結(jié)合于芯片。第一個(gè)實(shí)驗(yàn)是測(cè)定15種人源化抗體的結(jié)合活性。用HBS-EP制備1jug/ml的這些抗體，在3分鐘內(nèi)注射，與鼠4K21和商品化購得的抗GM-CSF抗體(BD)比較。圖5顯示15種抗體中有12種顯示等效，在一些情況中，與GM-CSF結(jié)合最多是鼠4K21的3.5倍。進(jìn)行第二實(shí)驗(yàn)以測(cè)定這些抗體結(jié)合人GM-CSF的動(dòng)力學(xué)。用HBS-EP制備濃度為66.7nM到4.17nM的兩倍連續(xù)稀釋抗體。利用偶聯(lián)于CM5芯片的重組GM-CSF再次定量測(cè)定直接結(jié)合，未包被的流動(dòng)小室用作參照。在2分鐘內(nèi)注射各濃度的抗體，穩(wěn)定時(shí)間為IO分鐘，解離時(shí)間為15分鐘。運(yùn)行BIACore動(dòng)力學(xué)分析向?qū)泶_定各抗體與GM-CSF的締合(ka[1/Ms])、解離(kd[l/s])和親和力(KD[nM])。表7和圖6顯示hGM4/1的締合速率最高，hGM4/6的親和力最高。<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>乂象眾貧沐超箭GM-C^^導(dǎo)游紛應(yīng)f長用TF-1細(xì)胞生長生物試驗(yàn)測(cè)定各抗體的GM-CSF中和活性。TF-1細(xì)胞的生長依賴于GM-CSF的存在，用2ng/ml重組GM-CSF(PT公司)維持該細(xì)胞。為進(jìn)行中和試驗(yàn)，用含0.25ng/mlGM-CSF的TF-1生長培養(yǎng)基制備各種濃度的抗體?；旌细鳚舛鹊目贵w與GM-CSF,在96孔板中37'C溫育1小時(shí)。然后將經(jīng)清洗的TF-1細(xì)胞(lxl()S)加入各孔，37T:溫育72小時(shí)。通過用0.5uCi的3&胸苷脈沖處理各孔4小時(shí)以定量測(cè)定細(xì)胞生長并計(jì)算EC50。測(cè)試濃度為400nM到28fM的3倍連續(xù)稀釋抗體。如表8所示，抗體hGM4/1、hGM4/6和hGM4/11顯示中和活性良好。表8.與非-GF-CSF特異性hlgGl抗體相比，4K21和人源化抗體的EC50值<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>實(shí)施例6-人源化抗體重鏈序列中的回復(fù)突變以及所產(chǎn)生抗體的特性在以上實(shí)施例5中所述TF-1生物試驗(yàn)中顯示具有最佳中和活性的抗體(hGM4/1、hGM4/6和hGM4/ll)均具有相同的重鏈序列(h4/10;SEQIDN0:13)。不想局限于理論，但估計(jì)這些抗體的至少相當(dāng)一部分的結(jié)合活性源自該重鏈。從圖7可以看出，與鼠框架相比，h4/10重鏈框架的氨基酸序列在8個(gè)位置不同(圖7中框出的)。將一系列點(diǎn)回復(fù)突變和兩個(gè)雙回復(fù)突變(doublebackmutation)(回復(fù)突變成相應(yīng)的鼠序列)引入h4/10序列的這些位點(diǎn)以增加人源化抗GM-CSF抗體的結(jié)合親和力。采用定點(diǎn)誘變(斯特拉塔基因公司；按照生產(chǎn)商的使用說明書)產(chǎn)生含"回復(fù)"突變的重鏈序列。將這些改變的重鏈克隆入抗體表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染入CHO細(xì)胞，表達(dá)，通過G蛋白親和層析純化并如上所述定量測(cè)定。表9顯示含改變的框架和產(chǎn)生的"回復(fù)"突變的抗體清單。表9.所含人框架"回復(fù)"突變成鼠殘基的人源化抗體<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>采用以上實(shí)施例5所述的TF-1生物試驗(yàn)測(cè)定表9所列各抗體的中和活性。與hGM4/11相比，3種抗體，即hGM4/19、hGM4/21和hGM4/22顯示結(jié)合活性改善。由于hGM4/21和hGM4/22中的回復(fù)突變分別位于CDR2和CDR3附近，所以產(chǎn)生雙回復(fù)突變(W47L,A97T)(hGM4/34)。與原始4K21抗體相比，該抗體也顯示中和活性改善(參見圖8)。通過BIAcore分析以測(cè)定表9所列抗體的結(jié)合動(dòng)力學(xué)。采用從以上實(shí)施例5所述方案改進(jìn)而來的方案進(jìn)行這些動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)。對(duì)于本動(dòng)力學(xué)分析，通過固定抗小鼠IgG或抗人IgG來制備CM5芯片。然后分別通過抗小鼠IgG或抗人IgG將4K21或人源化變體固定于芯片。用HBS-EP制備濃度為1000nM到15.63nM的2倍連續(xù)稀釋GM-CSF。在2分鐘內(nèi)注射各濃度的GM-CSF，在接下來的10分鐘內(nèi)檢測(cè)解離情況(流速30微升/分鐘)。運(yùn)行BIACore動(dòng)力學(xué)分析向?qū)泶_定各抗體的締合(ka[1/Ms])、解離(kd[l/s])和親和力(KD[nM])。圖9顯示hGM4/21和hGM4/34的親和力與4K21相同。權(quán)利要求1.一種結(jié)合人GM-CSF或其片段的抗體或其抗原結(jié)合片段，所述抗體包含含有SEQIDNO1所示序列或其片段或變體的輕鏈可變區(qū)。2.—種結(jié)合人GM-CSF或其片段的抗體或其抗原結(jié)合片段，所述抗體包含SEQIDNO:2所示的重鏈可變序列或其片段或變體。3.—種結(jié)合人GM-CSF或其片段的抗體或其抗原結(jié)合片段，所述抗體包含含有SEQIDNO:1所示序列或其片段或變體的輕鏈可變區(qū)，以及SEQIDNO:2所示的重鏈可變序列或其片段或變體。4.如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其特征在于，所述抗體是抑制GM-CSF活性的鼠單克隆抗體或其人源化衍生物。5.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其特征在于，所述抗體是2007年5月17日保藏在英國索爾茲伯里普當(dāng)應(yīng)用微生物與研究中心的歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏所(ECACC)的鼠單克隆抗體4K21，登錄號(hào)為07051601。6.鼠單克隆抗體4K21的人源化形式，所述抗體于2007年5月17日保藏在英國索爾茲伯里普當(dāng)應(yīng)用微生物與研究中心的歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏所(ECACC)中，登錄號(hào)為07051601。7.如權(quán)利要求6所述鼠單克隆抗體4K21的人源化形式，其特征在于，輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:9-11中任一所示的序列或其片段或變體。8.如權(quán)利要求6或7所述鼠單克隆抗體4K21的人源化形式，其特征在于，重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:13-15、17或18-27中任一所示的序列或其片段或變體。9.一種結(jié)合人GM-CSF或其片段的抗體或其抗原結(jié)合片段，所述抗體在輕鏈可變區(qū)內(nèi)包含至少一個(gè)含有SEQIDNO:3-5中任一所示序列的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段抑制GM-CSF的活性。10.如權(quán)利要求9所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其特征在于，所述抗體是人源化抗體。11.一種結(jié)合人GM-CSF或其片段的抗體或其抗原結(jié)合片段，其特征在于，所述抗體在重鏈可變區(qū)內(nèi)包含至少一個(gè)含有SEQIDNO:6-8中任一所示序列的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，其中該抗體或其抗原結(jié)合片段抑制GM-CSF的活性。12.如權(quán)利要求11所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其特征在于，所述抗體是人源化抗體。13.—種結(jié)合人GM-CSF或其片段的抗體或其抗原結(jié)合片段，所述抗體在輕鏈可變區(qū)內(nèi)包含至少一個(gè)含有SEQIDNO:3-5中任一所示序列的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，在重鏈可變區(qū)內(nèi)包含至少一個(gè)含有SEQIDNO:6-8中任一所示序列的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。14.如權(quán)利要求13所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其特征在于，所述抗體是人源化抗體。15.如權(quán)利要求14所述的人源化抗體或其抗原結(jié)合片段，其特征在于，所述人源化抗體或其抗原結(jié)合片段包含含有SEQIDNO:9、SEQIDNO:IO或SEQIDNO:l1所示序列或其片段或變體的輕鏈可變區(qū)。16.如權(quán)利要求14或15所述的人源化抗體或其抗原結(jié)合片段，其特征在于，所述人源化抗體或其抗原結(jié)合片段包含含有SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15或SEQIDNO:17所示序列或其片段或變體的重鏈可變區(qū)。17.如權(quán)利要求16所述的人源化抗體或其抗原結(jié)合片段，其特征在于，所述重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:13所示序列或其片段或變體。18.如權(quán)利要求16所述的人源化抗體或其抗原結(jié)合片段，其特征在于，所述變體重鏈可變區(qū)包含用相應(yīng)鼠重鏈可變區(qū)中相應(yīng)位置的氨基酸殘基替代SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15或SEQIDNO:17所示序列的氨基酸殘基的一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代。19.如權(quán)利要求18所述的人源化抗體或其抗原結(jié)合片段，其特征在于，在包含SEQIDNO:13所示序列的重鏈可變區(qū)中作出所述一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代。20.如權(quán)利要求19所述的人源化抗體或其抗原結(jié)合片段，其特征在于，所述變體重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:18-27中任一所示的序列。21.如權(quán)利要求20所述的人源化抗體或其抗原結(jié)合片段，其特征在于，所述變體重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:27所示的序列。22.如權(quán)利要求14-21中任一項(xiàng)所述的人源化抗體或其抗原結(jié)合片段，其特征在于，所述人源化抗體包含選自下組的輕鏈和重鏈可變區(qū)序列SEQIDNO:9禾BSEQIDNO:13;SEQIDNO:9禾口SEQIDNO:14;SEQIDNO:9和SEQIDNO:15;SEQIDNO:9和SEQIDNO:17;SEQIDNO:10和SEQIDNO:13;SEQIDNO:10和SEQIDNO:14;SEQIDNO:10禾卩SEQIDNO:15;SEQIDNO:10和SEQIDNO:17;SEQIDNO:l1和SEQIDNO:13;SEQIDNO:II禾卩SEQIDNO:14;SEQIDNO:l1和SEQIDNO:15;SEQIDNO:11和SEQIDNO:17;SEQIDNO:ll禾口SEQIDNO:18-27中任一項(xiàng)。23.—種抗體或其抗原結(jié)合片段，所述抗體包含與SEQIDNO:l-27中任一所示氨基酸序列具有至少約70%序列相同性的氨基酸序列。24.—種治療或預(yù)防GM-CSF介導(dǎo)疾病或病癥或者與GM-CSF表達(dá)和/或活性升高或異常相關(guān)的疾病或病癥的方法，所述方法包括給予有此需要的對(duì)象有效量的至少一種權(quán)利要求1-23中任一項(xiàng)所述的抗體或其抗原結(jié)合片段。25.—種藥物組合物，其包含一種或多種權(quán)利要求1-23中任一項(xiàng)所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，任選含有藥學(xué)上可接受的合適運(yùn)載體和/或稀釋劑。全文摘要本發(fā)明提供與GM-CSF或其片段或部分結(jié)合、相互作用或者締合并拮抗或中和GM-CSF活性的抗體。按照本發(fā)明的實(shí)施方式，產(chǎn)生以高親和力結(jié)合人GM-CSF并抑制GM-CSF活性的人源化單克隆抗體。文檔編號(hào)C07K16/24GK101687926SQ200880023397公開日2010年3月31日申請(qǐng)日期2008年5月23日優(yōu)先權(quán)日2007年5月23日發(fā)明者C·麥凱,D·扎拉申請(qǐng)人:哮喘和氣道Crc有限公司