專利名稱：信使rna帽的抗-反向硫代磷酸類(lèi)似物的合成和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
合成了新的信使RNA帽的抗-反向(anti-reverse)硫代磷酸類(lèi)似物，并且顯示在 mRNA的翻譯中是有用的。
背景技術(shù)：
在真核細(xì)胞中，大多數(shù)信使RNA (mRNA)的5'末端被封閉，或“帽化(加帽)”。此 外，還存在有一些也被帽化的其他形式的RNA，例如核內(nèi)小RNA(snRNA)。所述帽包含有在兩 個(gè)核苷部分之間的5' -5'三磷酸鍵合和遠(yuǎn)端鳥(niǎo)嘌呤環(huán)上的7-甲基。mRNA和snRNA的帽 化促進(jìn)其在細(xì)胞中的正常功能。能夠在體外合成加帽的RNA分子是有用的，因?yàn)檫@使得工作人員能夠制備在各種 生物學(xué)應(yīng)用中表現(xiàn)適當(dāng)?shù)腞NA分子。此類(lèi)應(yīng)用包括多肽的研究應(yīng)用和商業(yè)生產(chǎn)，例如，在無(wú) 細(xì)胞翻譯體系中產(chǎn)生在特定位點(diǎn)包含“非天然”氨基酸的多肽，或在培養(yǎng)的細(xì)胞中產(chǎn)生就其 活性或穩(wěn)定性而言需要翻譯后修飾的多肽。在后者體系中，合成進(jìn)行顯著更長(zhǎng)的時(shí)間，并因 此產(chǎn)生更多的蛋白質(zhì)。最經(jīng)常用來(lái)在體外制備加帽的RNA的方法是，在所有四種核糖核苷三磷酸和帽二 核苷酸例如m7G(5' )ppp(5' )G(此后，m7GpppG)存在下用細(xì)菌或噬菌體RNA聚合酶來(lái)轉(zhuǎn) 錄DNA模板。聚合酶以下列方式來(lái)起始轉(zhuǎn)錄m7GpppG的Guo部分的3' -0H對(duì)于下一個(gè)由 模板所決定的核苷三磷酸上的a "磷酸發(fā)動(dòng)親核攻擊，從而導(dǎo)致產(chǎn)生初始產(chǎn)物m7GpppGpN。 通過(guò)在轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合物中將m7GpppG與GTP的比率設(shè)定為在5和10之間來(lái)遏制備選的、由 GTP起始的產(chǎn)物pppGpN。合成RNA可以通過(guò)DNA模板的無(wú)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄來(lái)合成。參見(jiàn)R. Contreras等人， "Simple,efficient in vitro synthesis of capped RNAuseful for direct expression of cloned eukaryotic genes, " Nucl. AcidsRes.,第 10 ， % 6353-6362 M (1982)； J. Yisraeli "Synthesis of long, capped transcripts in vitro by SP6 and T7 RNA polymerases，第 42_50 頁(yè)，在 J. Dahlberg 等人(編輯)，Meth. Enzymol.，第 卷，第42-50 頁(yè)(1989)中；禾口 D. Melton 等人，“Efficient in vitro synthesis ofbiologically active RNA and RNA hybridization probes from plasmidscontaining a bacteriophage SP6promoter, ” Nucl. Acids Res.，第 12 卷，第 7035-7056 頁(yè)(1984)。如此產(chǎn)生的加帽的RNA在體外進(jìn)行的剪接反應(yīng)中是有活性的。參見(jiàn)M. Konarska等 人,"Recognition of cap structure in splicing invitro of mRNA precursors. Cell,第 38 卷，第 731-736 頁(yè)(1984)；和 I. Edery 等人，“Cap-d印endent RNA splicing in a HeLa nuclearextract, ” Proc. Natl. Acad. Sci. USA,第 82 卷，第 7590-7594 頁(yè)(1985)。加帽的mRNA在無(wú)細(xì)胞翻譯體系中比非加帽的mRNA更有效地被翻譯。參 見(jiàn) S.Muthukrishnan 等 人，“5 ‘ -Terminal 7-methy1guanosinein eukaryotic mRNA is required for translation, "Nature,第 255 ，第 33-37 M (1975)； L.Chu 等 人，"Paradoxical observations on the 5 ' terminus of ovalbumin messenger ribonucleic acid，” J. Biol.Chem.，第 253 卷，第 5228-5231 頁(yè)(1978)； E. Darzynkiewicz 等人，“旦-GlobinmRNAs capped with m7G, m22'7G or m32' 2' 7G differ in intrinsictranslation efficiency, "Nucl. Acids Res.，第 16 卷，第 8953-8962 頁(yè)(1988)； 禾口 E.Darzynkiewicz 等 A “Inhibition of eukaryotic translationby nucleoside 5' -monophosphate analogues of mRNA 5' -cap :Changesin N7substituent affect analogue activity, ”Biochem.，第 28 卷，第 4771-4778 頁(yè)(1989)。5'-未甲基化的mRNA在翻譯上的活性比5‘-甲基化的mRNA低。參見(jiàn)G. Both ^A "Methylation-dependent translation of viralmessenger RNAs in vitro, "Proc. Natl. Acad. Sci. USA，第 72 卷，第 1189-1193 頁(yè)(1975)。通過(guò)電穿孔引入培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的加帽的mRNA比非加帽的mRNA更有 效地被翻譯。參見(jiàn) E.Grudzien 等人，"Differentialinhibition of mRNA degradation pathways by novel cap analogs,，，J. Biol. Chem.,第 281 卷，第 1857-1867 頁(yè)(2006)。A. Pasquinelli 等人，"Reverse 5' caps in RNAs made in vitro byphage RNA polymerases, ” RNA,第1卷，第957-967頁(yè)(1995)報(bào)道了，噬菌體聚合酶使用m7GpppG的 7-甲基鳥(niǎo)嘌呤部分的3' -0H來(lái)起始轉(zhuǎn)錄，這證明用該帽類(lèi)似物制備的RNA產(chǎn)物中的大約 三分之一至一半實(shí)際上包含相反方向的帽，即Gpppm7GpN。此類(lèi)反向帽化的RNA分子表現(xiàn) 異常。相同的作者報(bào)道，當(dāng)將反向帽化的pre-UlsnRNA轉(zhuǎn)錄物注射入光滑爪蟾(Xenopus laevis)細(xì)胞核中時(shí)，它們比天然轉(zhuǎn)錄物更慢地被輸出。類(lèi)似地，細(xì)胞質(zhì)中的胞質(zhì)反向帽化 的UlsnRNA不被正確地輸入到細(xì)胞核中。mRNA上帽的存在強(qiáng)烈地刺激mRNA轉(zhuǎn)錄物翻譯成蛋白質(zhì)。E. Grudzien等人， "Novel cap analogs for in vitro synthesis of mRNAswith high translational efficiency，”RNA，第10卷，第1479-1487頁(yè)(2004)證明，包含有專一地以相反方向摻入的 帽的mRNA在無(wú)細(xì)胞體系中僅以包含有專一地以正常方向摻入的帽的mRNA的效率的4%進(jìn) 行翻譯。J. Stepinski 等 人，"Synthesis and properties of mRNAs containingthe novel 'anti-reverse' cap analogues 7-methyl (3 ' -0-methy1)GpppGand 7-methyl(3' -deoxy)GpppG，” RNA，第 7 卷，第 1486-1495 頁(yè)(2001)報(bào)道了不能以相反方 向摻入的兩種新型帽類(lèi)似物，m73' dGpppG和m/’3’_°GpppG，的合成和用途。用這些“抗-反向帽類(lèi)似物” (anti-reversecap analog, ARCA)帽化的mRNA在體外體系中比用常規(guī)類(lèi)似物 m7GpppG帽化的mRNA更有效地被翻譯。還可參見(jiàn)，美國(guó)專利號(hào)7，074，596，和美國(guó)專利申請(qǐng) 公開(kāi) 2003/0194759。Z.Peng 等 A "Synthesis and application of a chain-terminatingdinucleotide mRNA cap analog，，，Org. Lett ，第 4 卷，第 161—164 頁(yè) (2002)報(bào)道了 m/’3’_°GpppG的合成以及其在均一地加帽的RNA的體外轉(zhuǎn)錄中的用途。J. Jemielity 等人，“Novel ‘ anti-reverse ‘ cap analogues withsuperior translational properties, “ RNA，第 9 卷，第 1108-1122 頁(yè)(2003)報(bào)道，用-0CH3 或 _H 在2’位進(jìn)行取代以分別產(chǎn)生m/’2’_°GpppG或m72’ dGpppG，這產(chǎn)生了具有與在3’位取代的 ARCA的性質(zhì)相等或稍微更有利的性質(zhì)的ARCA，如通過(guò)與翻譯帽結(jié)合蛋白eIF4E的結(jié)合，在 體外轉(zhuǎn)錄期間向mRNA中的正確摻入，以及在無(wú)細(xì)胞體系中所得的mRNA的翻譯效率這樣的 標(biāo)準(zhǔn)所測(cè)量的。從引入培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的合成mRNA所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的量受限于通過(guò) 天然周轉(zhuǎn)過(guò)程的mRNA降解。mRNA降解的主要體內(nèi)途徑通過(guò)由特異的焦磷酸酶Dcpl/ Dcp2(其在a和0磷酸之間進(jìn)行切割)從完整的mRNA上去除帽來(lái)起始。E. Grudzien 入〃 Differential inhibition of mRNA degradation pathways by novel cap analogs, “ J. Biol. Chem.，第281卷，第1857-1867頁(yè)(2006)設(shè)計(jì)并合成了其中亞甲基替 代了 a和3磷酸基團(tuán)之間的0原子的帽類(lèi)似物，m27’3’-°GppeH2pG，用該類(lèi)似物帽化的mRNA 在體外對(duì)于通過(guò)重組人Dcp2的水解具有抗性。當(dāng)引入培養(yǎng)的細(xì)胞中時(shí)，用m27’3’_°GpPc:H2pG 帽化的mRNA比用m/’3’ _°GpppG帽化的mRNA更為穩(wěn)定。存在兩種已知的脫帽酶DCpl/DCp2，其作用于完整的mRNA以起始5’一 3’降解；和 DcpS，其作用于由于3’一 5’降解而產(chǎn)生的短的加帽的寡核苷酸。因?yàn)镈cpl/Dcp2或單獨(dú)的 Dcp2從加帽的mRNA上釋放m7GDP，所以切割可能發(fā)生在a -和0 -磷酸之間。參見(jiàn)Z. Wang等 人，"The hDcp2 protein is a mammalian mRNA decapping enzyme," Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.，第99卷，第12663-12668頁(yè)(2002)。先前，顯示了，核苷5，-單硫代磷酸以及三 磷酸類(lèi)似物例如ATP yS.GTP Y S和⑶P0 S，對(duì)于磷酸酶是穩(wěn)定的。參見(jiàn)F. Eckstein等人，‘‘ Guanosine5' -0-(2-thiodiphosphate). An inhibitor of adenylate cyclasestimulation by guanine nucleotides and fluoride ions" , J. Biol. Chem.,第 254卷，第9829-9834頁(yè) (1979)，禾口D.Cassel等入，〃 Activation ofturkey erythrocyte adenylate cyclase and blocking of thecatecholamine-stimulated GTPase by guanosine 5' - (gamma-thio) triphosphate “ ，Biochem Biophys Res Commun，第 77 卷，第 868—873 頁(yè)(1977)。此夕卜， 還發(fā)現(xiàn)包含硫代磷酸核苷酸間鍵合的多核苷酸比其天然對(duì)應(yīng)物更緩慢地被降解。參見(jiàn) H. Matzura 等人’ “Apolyribonucleotide containing alternation P = 0 and P = S linkages"，Eur. J. Biochem.，第 3 卷，第 448-452 頁(yè)(1968)。令人感興趣的是，硫代 磷酸的非對(duì)映異構(gòu)體可以顯示出不同的對(duì)于核酸酶的敏感性。核酸酶P1水解Sp非對(duì)映 異構(gòu)體比 Rp 更‘決。參見(jiàn) B. Potter 等人，‘‘Synthesis and configurational analysis of a dinucleoside phosphateisotopically chiral at phosphorus. Stereochemical course ofPenicillium citrum nuclease PI reaction. “ ，Biochemistry，第 22 卷，第 1369-1377頁(yè)(1983)。相比于Sp，核糖核酸酶T1和蛇毒磷酸二酯酶優(yōu)先切割Rp非對(duì)映異構(gòu)體。參見(jiàn) F. Eckstein 等人，“Stereochemistryof the transesterif ication step of ribonuclease T 1 〃，Biochemistry,第 11 卷，第 3507-3512 頁(yè)(1972)，和 P. Burgers 等 人’ “AbsoluteConfiguration of the Diastereomers of Adenosine5' -0_(1-thiotriph osphate) Consequences for the stereochemistry ofpolymerization by DNA-dependent RNA polymerase from Escherichiacoli " , Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.,第 75 卷，第 4798-4800 頁(yè)(1978)。雖然用m27’3’-°GppeH2pG帽化的mRNA在培養(yǎng)的細(xì)胞中更為穩(wěn)定，但是它具有較低的 翻譯效率，推測(cè)這是因?yàn)閙/’3’_°GpPc:H2pG在體外以比m/’3’_°GpppG顯著更低的親和力與eIF4E 結(jié)合。因此，即使它在培養(yǎng)的細(xì)胞中更為穩(wěn)定，但這個(gè)優(yōu)點(diǎn)卻被較低的翻譯效率給抵消了。J. Kowalska等人〃 Synthesis and properties of mRNA capanalogs containing phosphorothioate moiety in 5' ,5' -triphosphatechain, " Nucleos. Nucleot. Nucl. Acids，第24卷，第595-600頁(yè)(2005)報(bào)道了其中用S替代a、0或Y磷酸部分中的0的 三種帽類(lèi)似物的合成，例如m7GpsppG、m7GpppsG和mtppp^pG。這些合成的硫代磷酸帽類(lèi)似 物是帽依賴性翻譯的更加穩(wěn)定的抑制劑，并且對(duì)于DcpS脫帽酶具有抗性。然而，無(wú)論在體 外還是在體內(nèi)，這些化合物并沒(méi)有顯示出比平常ARCA更高的翻譯效率，因?yàn)樗鼈兛赡茉诤?大程度上以相反方向摻入。存在對(duì)于這樣的修飾的需要，所述修飾將可能達(dá)到更高的翻譯效率和增加對(duì)于體 內(nèi)和體外降解的抗性。本文所報(bào)道的獨(dú)特的化合物可以做到這兩者。

發(fā)明內(nèi)容
我們發(fā)現(xiàn)，在一個(gè)或多個(gè)磷酸處的S-取代連同2’ -0甲基取代一起產(chǎn)生具有令人 驚訝的性質(zhì)的被稱為S-ARCA的新型類(lèi)似物。所述新的ARCA修飾確保，a、0和Y硫代磷 酸基團(tuán)在翻譯和脫帽機(jī)器(machinery)中都準(zhǔn)確地定位在帽結(jié)合蛋白的活性位點(diǎn)內(nèi)。這些 類(lèi)似物中的至少一些對(duì)于Dcpl/Dcp2具有抗性。有些S-ARCA具有相比于缺乏硫代磷酸基 團(tuán)的相應(yīng)類(lèi)似物而言高得多的對(duì)于eIF4E的親和力。當(dāng)將包含各種S-ARCA的mRNA引入培 養(yǎng)的細(xì)胞中時(shí)，有些mRNA以相比于用常規(guī)類(lèi)似物m7GpppG合成的mRNA而言高至五倍的程度 更有效地進(jìn)行翻譯。此外，用有些S-ARCA帽化的mRNA的半壽期長(zhǎng)至用未修飾的帽合成的 mRNA的半壽期的三倍。更有效地進(jìn)行翻譯的mRNA和更穩(wěn)定的mRNA的組合導(dǎo)致在經(jīng)轉(zhuǎn)染的 細(xì)胞中獲得比使用常規(guī)的合成mRNA或者使用以早期ARCA帽化的mRNA更高的報(bào)道蛋白的 總產(chǎn)量。S-ARCA增加了體內(nèi)穩(wěn)定性和令人驚訝地增加了翻譯效率，這是由于與Dcpl/Dcp2 抗性相組合的更高的對(duì)于eIF4E的親和力。令人驚訝地，在生理?xiàng)l件下對(duì)于通過(guò)Dcp2的水 解的抗性與三磷酸中的硫代磷酸基團(tuán)相關(guān)，并且預(yù)期也與四磷酸中的硫代磷酸基 團(tuán)相關(guān)。另一個(gè)相比于平常ARCA而言的優(yōu)點(diǎn)是出現(xiàn)P-非對(duì)映異構(gòu)現(xiàn)象，這歸因于硫代磷酸 部分。在當(dāng)硫代磷酸部分準(zhǔn)確地定位于a-、或位置處時(shí)的每種情況下，仍然存在 兩種可能性來(lái)放置硫原子(proR和proS)，這導(dǎo)致獲得具有可能不同的生物學(xué)活性的兩種 不同的非對(duì)映異構(gòu)體。例如，在對(duì)應(yīng)物D1和D2非對(duì)映異構(gòu)體和還有用m/’2' _°GppspG(Dl) 帽化的mRNA之間存在有對(duì)于eIF4E的結(jié)合親和力的顯著差異，并且該D1相比于其D2對(duì)應(yīng) 物而言對(duì)于Dcp2易感得多。因此，可以采用非對(duì)映異構(gòu)體純的S-ARCA作為P-手性探針， 其可用于研究牽涉帽的酶促工藝步驟的立體化學(xué)過(guò)程。
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附圖簡(jiǎn)述圖 1 描繪了 a S-ARCA m27’2’ _°GpppsG (D1 和 D2)的合成。圖2 描繪了 Y S-ARCA m/’2’ _°GpsppG(Dl 和 D2)的合成。圖 3 描繪了 3 S-ARCA m27’2’ _°GppspG(Dl 和 D2)的合成。圖4 描繪了 四磷酸 Y S-ARCA，m/’2’、ppsppG (D1 和 D2)的合成。圖5描繪了在三磷酸橋的a和0位置處具有兩個(gè)硫代磷酸部分的S-ARCA，m/‘ 2、°GppspsG(Dl、D2、D3*D4)的合成。圖6A-6H描繪了用hDcp2消化的體外合成的寡核苷酸的陰離子交換HPLC分析。圖7描繪了用S-ARCA帽化的螢光素酶mRNA在HC11細(xì)胞中的衰變。圖8描繪了用S-ARCA帽化的mRNA在HC11細(xì)胞中的翻譯效率。圖9A-9E描繪了用S-ARCA帽化的螢光素酶mRNA在HC11細(xì)胞中的多核糖體分布， 顯示為在蔗糖梯度中的沉降，通過(guò)監(jiān)測(cè)260nm處的吸光度(A)，和通過(guò)使用實(shí)時(shí)PCR以顯示 螢光素酶mRNA (B、C和D)和GAPDH mRNA (E)的分布。

圖10描繪了在用經(jīng)S-ARCA帽化的mRNA對(duì)HC11細(xì)胞進(jìn)行核穿孔 (nucleoporation)后螢光素酶表達(dá)的時(shí)間過(guò)程。本發(fā)明的實(shí)施方式材料和方法實(shí)施例1一般的化學(xué)操作程序使用在去離子水中的三乙基銨碳酸氫鹽(TEAB)的線性梯度，在DEAD-S印hadex A-25(HC03_形式)柱上通過(guò)離子交換色譜法來(lái)分離開(kāi)中間體核苷酸，并且在通過(guò)添加乙醇 在減壓下進(jìn)行蒸發(fā)后，將其分離為三乙基銨鹽。通過(guò)分析型或半制備型RP HPLC來(lái)分離開(kāi) 終產(chǎn)物(帽類(lèi)似物)，并且在反復(fù)的冷凍干燥后，將其分離為銨鹽。分析型HPLC在裝備有 Supelcosil LC-18-T反相柱(4. 6x250mm，流速為 1. 3ml/分鐘)的Spectra-Physics SP8800 裝置上進(jìn)行，其中使用在PH 5. 9的0. 05M乙酸銨緩沖液中的0-25%甲醇線性梯度，并且采 用在260nm處的UV-檢測(cè)。半制備型HPLC在裝備有WatersHR-C_18反相柱(19x300mm，流速 為 5.0m/分鐘)的 Waters 600EMultisolvent Delivery System 上進(jìn)行，其中使用在 0. 05M 乙酸銨緩沖液(PH 5.9)中的甲醇線性梯度，并且采用在260nm處的UV-檢測(cè)。GMP和GDP購(gòu)自Sigma-Aldrich，并且通過(guò)使用Dowex 50 WX 8離子交換樹(shù)脂而轉(zhuǎn) 化為三乙基按鹽。如先前在 J. Jemielity 等人〃 Novel' anti-reverse' cap analogues with superior translationalproperties, “ RNA，第 9 卷，第 1108—1122 頁(yè)(2003)中所 報(bào)道的那樣來(lái)制備其他核苷酸，即m7GMP、m/’2' -°GMP、m7OTP、m/’2' _°GDP。硫代磷酸三乙基銨 鹽通過(guò)下列方式而從妝#503制備在Dowex 50WX 8離子交換樹(shù)脂上進(jìn)行轉(zhuǎn)化，并且(在蒸 發(fā)至干后)用貯存于_20°C的99. 8%醇進(jìn)行再度蒸發(fā)。參見(jiàn)J Kowalska等人“A simple andrapid synthesis of nucleotide analogues containing a phosphorothioatemoiety at the terminal position of the phosphate chain，，，TetrahedronLett ，第 48 卷，第 5475-5479頁(yè)(2007)。如先前所報(bào)道的那樣來(lái)制備7-甲基鳥(niǎo)苷，除了使用DMF而非DM 之夕卜(參見(jiàn) J. Jones 等人，"Purine Nucleosides. 111. Methylation Studies of Certain NaturallyOccurring Purine Nucleosides”，J. Am. Chem. Soc.，第 85 卷，第 193-201 頁(yè)
14(1963))。通過(guò)類(lèi)似的操作程序，從2’ -0-甲基鳥(niǎo)苷來(lái)合成7，2’ -0-二甲基鳥(niǎo)苷。根據(jù) J. Kusmierek 等人，"A new route to2‘ (3‘ ) -0-alkyl purine nucleosides，，，Nucleic Acids Res.，第1卷，第73-77頁(yè)，特別出版號(hào)4(1978)來(lái)制備2，-0-甲基鳥(niǎo)苷。通過(guò)在RP HPLC上的再次色譜法(re-chromatography)、使用負(fù)電噴霧電離的質(zhì) 譜法(MS ESI-)以及1H NMR和31P NMR光譜學(xué)，來(lái)確認(rèn)最終化合物的結(jié)構(gòu)和均一性。(結(jié) 果顯示在表1中)分別在399. 94MHz和161. 90MHz處在Varian UNITY-plus光譜儀上于 25°C記錄了屮NMR和31P NMR譜。報(bào)告了相對(duì)于在D20中的3-三甲基甲硅烷基-[2，2，3， 3-D4]-丙酸鈉(TSP)(作為內(nèi)標(biāo))的1H NMR化學(xué)位移。報(bào)告了相對(duì)于在D20中的20%磷酸 (作為外標(biāo))的31P NMR化學(xué)位移。使用負(fù)電噴霧電離(ESI-)，在Micromass QToF IMS光 譜儀上記錄了質(zhì)譜。實(shí)施例2用于核苷酸的N-酰化咪唑(imidazolide)衍生物(GMP-Im、m/’2"°GMP-Im、⑶P_Im 和 m/’2’_°GDP-Im) (7、8 和 12-15)的一般操作程序0 JAL T. Mukaiyama 等人 〃 Phosphorylation by oxidation-reduction condensation. Preparation of active phosphorylatingreagents" , M. Bull. Chem. Soc. Jpn，第44卷，2284 (1971)。在DMF (約2. 5ml/100mg核苷酸)中混合合適的核苷酸(1當(dāng)量 的TEA鹽)、咪唑(8當(dāng)量)和2，2’ -聯(lián)硫基二吡啶(3當(dāng)量)。添加三乙胺(2當(dāng)量)和三 苯膦(3當(dāng)量)，并攪拌混合物6-8小時(shí)。用溶解在干燥的丙酮(約8ml/lml DMF)中的無(wú) 水高氯酸鈉(1當(dāng)量/ 一個(gè)負(fù)電荷)從反應(yīng)混合物中沉淀出產(chǎn)物。在冷卻至4°C后，過(guò)濾沉 淀物，用冷的干燥的丙酮反復(fù)洗滌，并在真空中通過(guò)P401(l進(jìn)行干燥。產(chǎn)率為80-100%。在 m7GMP的情況下，由于其較低的在DMF中的溶解度，使用2倍過(guò)量的試劑，并且將反應(yīng)時(shí)間延 長(zhǎng)至24小時(shí)。實(shí)施例3用于核苷5' -0-硫代磷酸(9-11)的一般操作程序?qū)⒑线m的核苷(1當(dāng)量，在真空中通過(guò)P401(l過(guò)夜干燥)在磷酸三甲酯 (1. 5ml/100mg核苷)中的懸浮液在冰/水浴上冷卻至0°C。添加2，6- 二甲基吡啶(3當(dāng) 量)和PSC13(1.5當(dāng)量)。反應(yīng)在0°C下維持過(guò)夜，然后用0.35M TEAB猝滅并在室溫下攪 拌1小時(shí)。使用0-0. 7MTEAB的線性梯度，通過(guò)DEAE Sephadex色譜法來(lái)分離開(kāi)產(chǎn)物。產(chǎn) 率(9)380mg(0. 67mmol)，從 257mg(0. 91mmol)鳥(niǎo)苷開(kāi)始(74 % ) ； (10)57mg(0. lOmmol), 從 120mg (0. 42mmol)7-甲基鳥(niǎo)苷開(kāi)始(24% ) ； (ll)75mg (0. 13mmol)，從 70mg (0. 23mmol)7, 2' -0-二甲基鳥(niǎo)苷開(kāi)始(53% )。實(shí)施例4 核苷5 ‘ - (2-0-硫代二磷酸)的合成7,2' -0-二甲基鳥(niǎo)苷 5，-0-(2_硫代二磷酸)(17)。向 14 (100mg，0. 21mmol)和硫 代磷酸三乙基銨鹽(220mg)在5ml DMF中的懸浮液之中添加無(wú)水ZnCl2(190mg，1. 40mmol)。 將所得的溶液在室溫下攪拌20分鐘。通過(guò)添加EDTA(520mg，1. 40mmol)在50ml水中的溶 液來(lái)猝滅反應(yīng)，并用固體NaHC03進(jìn)行中和。使用0-1.0M的TEAB梯度，在DEAE S印hadex上 分離產(chǎn)物。產(chǎn)率106mg(0. lSmmol)的(I7)，作為 TEA 鹽(了1%)。7-甲基鳥(niǎo)苷5' -0-(2_硫代二磷酸)(16)。如對(duì)于(17)所描述的那樣，從(13) (40mg,0. 089mmol)和硫代磷酸三乙基銨鹽(lOOmg)開(kāi)始來(lái)合成該化合物。產(chǎn)率 31mg(0. 046mmol)的(16)，作為 TEA 鹽(52%)。實(shí)施例5帽S-ARCA的合成下面是對(duì)于各種帽S-ARCA的合成的描述。合成途徑描繪在圖1、2和3中。(數(shù) 字)是指在圖1、2和3中進(jìn)行編號(hào)的化合物。m7GpppsG D1 和 D2 (la, lb)。向(9) (10mg, 0. 018mmol)禾口 7 (15mg, 0. 027mmol)在 DMF(0. 8ml)中的懸浮液之中添加無(wú)水ZnCl2 (30mg，0. 22mmol)。反應(yīng)在室溫下維持2天。通 過(guò)添加在10ml水中的90mg EDTA來(lái)猝滅反應(yīng)，并用固體NaHC03進(jìn)行中和。通過(guò)分析型RP HPLC來(lái)分離開(kāi)非對(duì)映異構(gòu)體(la)和(lb)。產(chǎn)率0. 8mg(la)和1. Omg (lb)，作為NH4+鹽。 合成的流程圖顯示在圖1中。m7GppspG D1和D2 (2a，2b)。如對(duì)于1所描述的那樣，從在2ml DMF中的16 (20mg, 0. 030mmol)、15(23mg，0. 053mmol)、ZnCl2 (60mg, 0. 44mmol)開(kāi)始來(lái)合成該化合物。產(chǎn)率 2. 2mg(2a)和1. 8mg (2b)，作為NH4+鹽。合成的流程圖顯示在圖3中。m7GpsppG D1和D2 (3a，3b)。如對(duì)于(1)所描述的那樣，從在3. 5ml DMF中的(10) (58mg，0. 090mmol)、(12) (120mg，0. 22mmol)、ZnCl2 (249mg，1. 8mmol)開(kāi)始來(lái)合成該化合物。 產(chǎn)率14. 7mg(3a)和10. lmg(3b)，作為NH4+鹽。合成的流程圖顯示在圖2中。m27’2' -0GpppsG D1 禾口 D2 (4a，4b)。將化合物(9) (48mg,0. 084mmol)禾口 (8) (57mg, 0. lOmmol)懸浮在2ml DMF中。隨后，添加無(wú)水ZnCl2 (115mg，0. 84mmol)。將所得的溶液在 室溫下維持2天。通過(guò)添加在30ml水中的350mg EDTA來(lái)猝滅反應(yīng)，并用固體碳酸氫鈉進(jìn) 行中和。在45分鐘內(nèi)，使用在0.05M乙酸胺(pH = 5.9)中的0-50%的甲醇線性梯度，通過(guò) 半制備型RP HPLC來(lái)分離開(kāi)產(chǎn)物。產(chǎn)率5. 2mg(4a)和7. 4mg(4b)，作為NH4+鹽。合成的流 程圖顯示在圖1中。m/’2' _°GppspG D1和D2(5a，5b)。如對(duì)于(4)所描述的那樣，從在5ml DMF中的 (17) (106mg，0. 16mmol)、(15) (103mg，0. 24mmol)和 ZnCl2 (260mg，1. 9mmol)開(kāi)始來(lái)合成該化 合物。用在100ml水中的800mg EDTA來(lái)猝滅反應(yīng)，并用固體碳酸氫鈉進(jìn)行中和。使用等度 的0. 05M乙酸銨(pH = 5. 9)，通過(guò)半制備型RP HPLC來(lái)分離開(kāi)產(chǎn)物。產(chǎn)率10. Omg (5a)和 12. lmg(5b)，作為NH4+鹽。合成的流程圖顯示在圖3中。m/’2' _°GpsppG D1和D2 (6a，6b)。如對(duì)于(4)所描述的那樣，從在3ml DMF中的 (11) (70mg，0. 15mmol)、(12) (107mg，0. 20mmol)和無(wú)水 ZnCl2 (220mg, 1. 6mmol)開(kāi)始來(lái)合成 該化合物。用在70ml水中的650mg EDTA來(lái)猝滅反應(yīng)。在45分鐘內(nèi)，使用在0. 05M乙酸 銨(pH = 5. 9)中的0-50%的甲醇線性梯度，通過(guò)半制備型RP HPLC來(lái)分離開(kāi)產(chǎn)物。產(chǎn)率 15mg(6a)和20mg(6b)，作為NH4+鹽。合成的流程圖顯示在圖2中。通過(guò)在RP HPLC上的再次色譜法(re-chromatography)、使用負(fù)電噴霧電離的質(zhì) 譜法(MS ESI-)以及1H NMR和31P NMR光譜學(xué)，來(lái)確認(rèn)上述最終化合物的結(jié)構(gòu)和均一性。結(jié) 果顯示在下表1中。表 1相對(duì)于內(nèi)標(biāo)3-三甲基甲硅烷基-[2，2，3，3_2H4]-丙酸鈉的以百萬(wàn)分率表示的屮NMR化學(xué)位移(士 0. 01)
以及相對(duì)于外標(biāo)H3P04的以百萬(wàn)分率表示的31P NMR化學(xué)位移(士 0. 01) 實(shí)施例6四磷酸S-ARCA的合成通過(guò)m/’2' '°GpPsPPG的合成顯示了用于合成含有5' ,5'-四磷酸橋的S-ARCA的 所開(kāi)發(fā)出的策略的效用(圖4)。通過(guò)類(lèi)似的方法可得到三種其他四磷酸S-ARCA(即，m/‘ 2' -0GpspppG、m/'2' -0GpppspG、m/'2' _0GppppsG)的合成。 將7，2，-0_ 二甲基鳥(niǎo)苷5，-(硫代二磷酸)(20mg，0. 029mmol)和鳥(niǎo)苷5，-二磷酸 N-?；溥?30mg, 0. 056mmol)懸浮在 2ml DMF 中。隨后，添加無(wú)水 ZnCl2 (61mg, 0. 45mmol)。 在室溫下攪拌所得的溶液3天。通過(guò)添加在20ml水中的EDTA(166mg，0. 45mmol)來(lái)猝滅反 應(yīng)，并用固體碳酸氫鈉進(jìn)行中和。使用0-1.2M的TEAB梯度，通過(guò)離子交換DEAE Sephadex 色譜法來(lái)分離開(kāi)產(chǎn)物。收集包含m/’2’-°GppsppG的非對(duì)映異構(gòu)體混合物的級(jí)分，倒在一起， 并在減壓下通過(guò)反復(fù)添加乙醇來(lái)進(jìn)行蒸發(fā)。在60分鐘內(nèi)，使用在0. 05M乙酸銨(pH = 5.9)中的0-25%甲醇線性梯度，通過(guò)半制備型RP HPLC來(lái)達(dá)到最后的純化。產(chǎn)率7mg m/‘ 2' _°GppsppG (非對(duì)映異構(gòu)體混合物)，作為NH4+鹽。MS ESI (-)關(guān)于 C22H30N10017P3S 的計(jì)算值897. 02 ；測(cè)定值879. 09D1 ^ NMR 8 (ppm) 9. 14 (1H, s) 8. 08 (1H, s)，5. 99 (1H, d) ,5. 813 (1H, d) ；4. 70 (1H ； t)，4. 64 (1H, t)，4. 54 (1H, t)，4. 45 (1H, m)，4. 35 (2H, m)，4. 29 (3H, m)，4. 07 (3H, s)，3. 60 (3H, s) ；31P NMR 8 30. 2 (IP, t,Py),-ll. 1 (IP, dd,P 8 ) ,-11. 9 (IP, dd，P a )，-23. 8 (IP, d，P 旦)D2 ^H NMR 8 (ppm) 9. 16 (1H, s) 8. 08 (1H, s)，6. 03 (1H, d)，5. 83 (1H, d) ；4. 70 (1H ； t)，4. 60 (1H, t)，4. 54 (1H, t)，4. 45 (1H, m)，4. 35 (2H, m)，4. 29 (3H, m)，4. 07 (3H, s)，3. 58 (3H, s) ；31P NMR 8 30. 2 (IP, t,Py),-ll. 1 (IP, dd,P 8 ) ,-11. 9 (IP, dd, P a )，-23. 8 (IP, d，P 旦)實(shí)施例7具有兩個(gè)硫代磷酸部分的S-ARCA的合成所開(kāi)發(fā)出的策略還提供了用于合成在5' ,5' _多磷酸橋中含有多個(gè)硫代磷 酸部分(這可以通過(guò)圖5中所建議的合成路線來(lái)達(dá)到)的化合物(例如，化合物m/’ 2' _°GppsPsG)的方法。將與先前對(duì)于腺苷5' -0-硫代磷酸的N-?；溥蜓苌锼?才艮道的操作程序[M. Shimazu 等人，‘‘Regio—and stereocontrolled synthesis of 2 ‘ -5 ‘ -1inkedphosphorothioate oligoadenylates by uranyl ion catalyst in aqueoussolution"，J. Chem. Soc.，Perkin Trans. 1，2002，1778-1785]相類(lèi)似地來(lái)制備鳥(niǎo) 苷5' -0-硫代磷酸的N-?；溥蜓苌?，并用三乙基銨碳酸氫鹽的線性梯度(在去離子 水中的0至0. 5M TEAB)在DEAES印hadex A-25上進(jìn)行純化。關(guān)于該合成的描繪顯示在圖 5中。鳥(niǎo)苷5' -0-(1，2_ 二硫代二磷酸)。將鳥(niǎo)苷5' -0-單硫代磷酸的N-?；溥蜓苌?三乙基銨鹽，53mg，0. lmmol)與硫代磷酸三乙基銨鹽(320mg，約1. 2mmol)相混合， 并將所得的混合物懸浮在3. 5mLDMF中。隨后，添加無(wú)水氯化鋅(55mg，0. 4mmol)和氯化錳 (50mg，0. 4mmol)。通過(guò)添加EDTA溶液(270mg，0. 8mmol，在35mL水中)來(lái)猝滅反應(yīng)，并用碳 酸氫鈉調(diào)至pH 7。用三乙基銨碳酸氫鹽的線性梯度(在去離子水中的0至0.9M TEAB)，在 DEAE-Sephadex A_25柱上進(jìn)行色譜法分離。收集包含鳥(niǎo)苷5 ‘ -0- (1，2- 二硫代二磷酸)的 級(jí)分并通過(guò)添加乙醇在減壓下進(jìn)行蒸發(fā)，并且將所得的固體在真空中通過(guò)P401(l進(jìn)行干燥。m/’2' _°GppspsG。將7，2 ‘ _0_ 二甲基鳥(niǎo)苷5 ‘ _0_單磷酸的N-?；溥蜓苌?鈉 鹽，23mg，0.05mmol)與鳥(niǎo)苷 5' _0_ (1，2-二硫代二磷酸)(三乙基銨鹽，39mg，0. 05mmol) 相混合，并將所得的混合物懸浮在1. 5mL DMF中。隨后，添加無(wú)水氯化鋅(55mg，0. 4mmol)。 通過(guò)添加EDTA溶液(13511^，0.4讓01，在201^水中)來(lái)猝滅反應(yīng)，并用碳酸氫鈉調(diào)至pH 7。 m27'2' _°GppspsG非對(duì)映異構(gòu)體(D1、D2、D3、D4)的色譜法分離和分開(kāi)通過(guò)半制備型RP HPLC 來(lái)進(jìn)行。實(shí)施例8細(xì)胞培養(yǎng)HC11乳腺上皮細(xì)胞以克隆方式衍生自C0MMA-1D小鼠乳腺細(xì)胞系。參見(jiàn)， K.Danielson 等 人’ “Epithelial mouse mammary cell lineexhibiting normal morphogenesis in vivo and functionaldifferentiation in vitro," Proc. Natl. Acad. Sci.U. S. A.，第 81 卷，第 3756-3760 頁(yè)(1984)。細(xì)胞在含有 10%牛生長(zhǎng)血清(HyClone)、 5iig/ml 牛胰島素(Sigma)、10ng/ml 重組 EGF(BD Biosciences)的 RPMI1640 培養(yǎng)基中進(jìn)行 生長(zhǎng)。實(shí)施例9mRNA的體外合成在所有四種核苷三磷酸和不同的帽二核苷酸存在下，用T7聚合酶在編碼螢 光素酶的質(zhì)粒(pluc-A6C1)存在下通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄來(lái)合成加帽的RNA。參見(jiàn)J. Jemielity 等人， “Novel ‘ anti-reverse ‘ cap analogueswith superior translational properties, “ RNA,第9卷，第1108-1122頁(yè)(2003)。典型的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)包含 40mM Tris-HCl(pH 7. 9)、6mMMgCl2、2mM 亞精胺、10mM DTT、0. lmg/ml BSAUU/u 1 的 RNasin(Promega)、0. 5mM ATP、0. 5mM CTP、0. 5mM UTP、0. ImM GTP、ImM 帽類(lèi)似物、15 ii g/ml DNA 和 1U/ ill 的 T7 聚合酶(Promega)。pluc_A6(l (其包含有在 pGEM4 (Promega)中的整 個(gè)螢火蟲(chóng)螢光素酶編碼序列和3’ -末端的60-nt poly (A)束(tract)(參見(jiàn)E. Grudzien 等人’ “Differential inhibition of mRNA degradation pathways by novelcap analogs，" J. Biol. Chem.，第 281 卷，第 1857-1867 頁(yè)(2006))用 Hpal 進(jìn)行消化以合成螢 光素酶mRNA，并且用Ncol進(jìn)行消化以合成加帽的寡核苷酸。在10iiCi/iil的[a」2P]GTP(ICN)存在下，在于37°C溫育45分鐘的50-yl反 應(yīng)混合物中合成短RNA(約48nt的加帽的寡核苷酸)。用苯酚和氯仿對(duì)反應(yīng)混合物進(jìn)行提 取，然后根據(jù)制造商的實(shí)驗(yàn)方案，使用旋轉(zhuǎn)柱(spin column) (Ambion)將RNA與未摻入的核 苷酸分離開(kāi)。通過(guò)契侖科夫(Cerenkov)計(jì)數(shù)法來(lái)測(cè)定mRNA的濃度，其中將最終轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 混合物中[a "32P]GTP的比放射性活度用于使cpm轉(zhuǎn)換為pmol。在于37°C溫育45分鐘的200- u 1反應(yīng)混合物中合成mRNA。溫育后，將200- u 1反應(yīng)混合物在37°C下用3個(gè)單位的DNA酶RQ1 (Promega)處理20分鐘，并使用制造商的實(shí) 驗(yàn)方案，用RNeasy小型試劑盒(Qiagen)來(lái)純化RNA。采用分光光度測(cè)定法來(lái)測(cè)定RNA的濃度。實(shí)施例10體外RNA脫帽測(cè)定法使用加帽的48-nt寡核苷酸(螢光素酶mRNA的截短形式(48個(gè)核苷酸))作為底 物來(lái)測(cè)量Dcp2活性。在大腸桿菌(Escherichia coli)中表達(dá)GST_hDcp2并進(jìn)行純化，如 Z. Wang 等人，“The hDcp2 proteinis a mammalian mRNA decapping enzyme, " Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.，第99卷，第12663-12668頁(yè)(2002)所描述的。首先使加帽的寡核 苷酸在37°C下在脫帽緩沖液(10mM Tris-HCl(pH 7. 5)、100mM乙酸鉀、2mM乙酸鎂、0. 5mM MnCl2、2mM 二硫蘇糖醇和0. ImM精胺)中經(jīng)歷使用GST_hDcp2來(lái)進(jìn)行的消化2小時(shí)。參見(jiàn) C. Piccirillo等人，〃 Functional characterization of the mammalian mRNAdecapping enzyme hDcp2，" RNA，第9卷，第1138-1147頁(yè)(2003)。然后，將反應(yīng)混合物用等體積的苯 酚提取一次和用氯仿提取兩次，并且用乙醇來(lái)沉淀出RNA。將脫帽反應(yīng)的產(chǎn)物進(jìn)一步用核糖 核酸酶的混合物(RiboShredder ；Epicentre)在37°C下消化1小時(shí)。產(chǎn)物在4. 6X250_mm Partisil 10SAX/25柱(Whatman)上通過(guò)陰離子交換HPLC進(jìn)行解析。梯度的組成如下水， 1分鐘；至112mM KH2P04的線性梯度(pH 4. 5)，20分鐘；112-450mM KH2P04的線性梯度，15 分鐘；450mM至1. 5M KH2P04的線性梯度，15分鐘；和以1. 5M KH2P04的等度洗脫，9分鐘；全 部以1ml/分鐘的流速。實(shí)施例11在HC11細(xì)胞中的翻譯效率和mRNA衰變的測(cè)量使用兩種方法(電穿孔和核穿孔)來(lái)將RNA遞送入細(xì)胞中。在電穿孔的情況下， 用 Bio-Rad Genepulser 設(shè)備，以 0. 22kV 和 960 ii F，在 Gene pulser 杯池(cuvette) (4mm 間隙)中，在總體積400 u 1的血清減少的RPMI 1640培養(yǎng)基中，將5 y g RNA引入107個(gè) HC11細(xì)胞中。在放電后，細(xì)胞用PBS洗滌兩次，在室溫下以300 X g離心2分鐘，重懸浮在預(yù) 熱的完全培養(yǎng)基中，并放置于37°C。根據(jù)制造商的建議，用Amaxa Nucleofector II(Amaxa Biosystems)來(lái)進(jìn)行核穿孔。使用Nucleofector溶液V和一套所建議的方案(程序T-024)， 將1微克的RNA引入106個(gè)HC11細(xì)胞中。為了測(cè)量翻譯效率，將細(xì)胞劃分入幾個(gè)Eppendorf管中，放置在37°C的水浴中，并 搖動(dòng)。為了測(cè)量mRNA穩(wěn)定性，將細(xì)胞分配入35-mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，并且放置于37°C和在5% C02潮濕氣氛中。在各個(gè)不同的時(shí)間處收獲細(xì)胞，并用PBS洗滌兩次。為了細(xì)胞質(zhì) RNA 的提取，在 175 ill 裂解緩沖液(50mM Tris_HCl(pH 8. 0) U40mM NaClU. 5mM MgCl2,0. 5% (v/v) Igepal (Sigma)和 ImM 二硫蘇糖醇)中裂解 2X105 個(gè)細(xì)胞。 RNA用RNeasy小型試劑盒來(lái)進(jìn)一步進(jìn)行純化。為了蛋白質(zhì)的提取，在200 yl螢光素酶細(xì)胞 培養(yǎng)物裂解試劑(Promega)中裂解2X105個(gè)細(xì)胞。根據(jù)制造商的實(shí)驗(yàn)方案(Promega)，測(cè) 量細(xì)胞提取物的螢光素酶活性。實(shí)施例12多核糖體的制備為了分離開(kāi)核糖體亞基和起始復(fù)合物，用包含0. lmg/ml放線菌酮的冰冷的PBS處理4 X 106個(gè)HC11細(xì)胞2分鐘，用相同的培養(yǎng)基洗滌兩次，并且在600 ill的0. 3M NaCl、15mM Tris-HCl (pH 7. 6)、15mM MgCl2、1 % Triton X-100、lmg/ml 肝素和 0. lmg/ml 放線菌酮中進(jìn) 行裂解。在以14，OOOXg離心10分鐘后，將上清液鋪層在15-45%蔗糖梯度(在相同的但 缺少Triton X-100的緩沖液中)上，并且在Beckman SW41Ti轉(zhuǎn)子中于4°C以38，OOOrpm離 心2小時(shí)。通過(guò)連續(xù)監(jiān)測(cè)在260nm處的吸光度來(lái)使梯度分級(jí)分離。從每個(gè)級(jí)分(1ml)中分 離出RNA，并通過(guò)實(shí)時(shí)PCR來(lái)進(jìn)行分析。實(shí)施例13實(shí)時(shí)PCR為了測(cè)量mRNA穩(wěn)定性，將從HC11細(xì)胞中分離并用RNeasy小型試劑盒(Qiagen)純 化的約2 u g每種總RNA樣品在37°C下用3個(gè)單位的DNA酶RQ1 (Promega)處理20分鐘。在包 含5. 5mM 1%(12、50011]\1每種(1^1\2.511]\1隨機(jī)六聚體、0.2個(gè)單位的1 ^酶抑制劑和0.8個(gè) 單位的MultiScribe反轉(zhuǎn)錄酶(Applied Biosystems)的20_ii 1反應(yīng)混合物中對(duì)400ng RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。將反應(yīng)混合物于25°C溫育10分鐘，于48°C溫育30分鐘，和于95°C溫育5分鐘。 使用以BeaconDesigner工具(Bio-Rad)對(duì)于每種mRNA而設(shè)計(jì)的特異引物來(lái)進(jìn)行定量實(shí)時(shí) PCR。關(guān)于檢測(cè)螢光素酶mRNA的5，-末端的序列，引物為5，-CGTTCGGTTGGCAGAAGCTA_3，(SEQ ID NO 1)和 5，-ACTGTTGAGCAATTCACGTTCATT-3，(SEQ ID NO :2)。從帽結(jié)構(gòu)至 3，-末端同 聚物束的開(kāi)始處，螢光素酶mRNA由1714個(gè)核苷酸組成。這些引物擴(kuò)增出核苷酸226-398。 使用引物 5，-CAATGTGTCCGTCGTGGATCT-3，(SEQ ID NO 3)和 5，-GAAGAGTGGGAGTTGCTGTTGA -3’ (SEQ ID NO :4)，通過(guò)相同的方法和在相同的RNA樣品中測(cè)量小鼠GAPDH mRNA水平。用iCycler IQ實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)，在包含5 u 1轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合物(50ng cDNA)、 12. 5u 1 IQ SYBRgreen Supermix 和 0. 3mM 引物(Bio-Rad)的 25_ii 1 反應(yīng)混合物中進(jìn)行擴(kuò) 增和檢測(cè)。溫育條件是在95°C下3分鐘以用于聚合酶活化，以及在95°C下15秒和在60°C 下1分鐘的40個(gè)循環(huán)。使用如在關(guān)于ABI Prism 7700 Sequence Detection System 的第 2 號(hào)用戶公報(bào) 中所描述的絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線方法來(lái)計(jì)算螢光素酶mRNA水平。在從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出螢光素酶 mRNA的量后，將其對(duì)于每個(gè)樣品中小鼠GAPDH mRNA的量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。將在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)處存 留的螢光素酶mRNA的量轉(zhuǎn)換為在零時(shí)存在的RNA的百分比，并將結(jié)果以“l(fā)og1(l([RNA])對(duì) 時(shí)間”的形式進(jìn)行作圖以測(cè)定半壽期。為了分析來(lái)自多核糖體梯度的RNA，在RNA分離之前， 向每個(gè)級(jí)分中添加體外合成的GFP mRNA作為內(nèi)標(biāo)以檢驗(yàn)RNA產(chǎn)量的變化。使用GFP mRNA 水平來(lái)使螢光素酶和GAPDH mRNA的水平標(biāo)準(zhǔn)化。實(shí)施例14對(duì)于eIF4E的結(jié)合親和力通過(guò)熒光猝滅來(lái)測(cè)定S類(lèi)似物對(duì)于鼠類(lèi)eIF4E的結(jié)合親和力。在LS-50B分光熒光 計(jì)(Perkin Elmer Co.)上，于 20. 0 士 0. 2°C，在 50mMHEPES/K0H(pH 7. 2) UOOmM KC1、0. 5mM EDTAUmM DTT中進(jìn)行熒光滴定測(cè)量。向1. 4ml的0. 1蛋白質(zhì)溶液中添加1 P 1濃度遞增 的帽類(lèi)似物溶液的等份試樣?？紤]到樣品稀釋和內(nèi)濾效應(yīng)，對(duì)熒光強(qiáng)度(用2.5nm帶寬在 280nm處進(jìn)行激發(fā)，和用4nm帶寬和290nm截止濾光片在337nm處進(jìn)行檢測(cè))進(jìn)行修正。通 過(guò)將熒光強(qiáng)度對(duì)于帽類(lèi)似物總濃度的理論依賴性(theoretical dependence)與根據(jù)先前 所描述的方程(參見(jiàn) A. Niedzwiecka 等人，"Biophysical studies ofeIF4E cap-bindingprotein :recognition of mRNA 5' cap structure andsynthetic fragments of eIF4G and 4E-BP1 proteins，”J. Mol. Biol.，第 319 卷，第 615-635 頁(yè)(2002))的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)點(diǎn)相擬 合，來(lái)測(cè)定平衡締合常數(shù)(Kas)。將蛋白質(zhì)濃度作為顯示“活性”蛋白質(zhì)的量的平衡方程的自 由參數(shù)進(jìn)行擬合。將最終的Kas計(jì)算為3至10次獨(dú)立滴定的加權(quán)平均值，其中將所述權(quán)重 作為數(shù)值標(biāo)準(zhǔn)差平方的倒數(shù)。使用0RGIN 6. 0(Microcal Software Inc.，USA)來(lái)進(jìn)行數(shù)值 非線性最小二乘回歸分析。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方程AG° =_RTlnKAS，從KAS值來(lái)計(jì)算結(jié)合的吉布斯 自由能。實(shí)施例15通過(guò)人和秀麗隱桿線蟲(chóng)(C. elegans) DcpS來(lái)進(jìn)行的酶促水解根據(jù)先前所描述的操作程序(L.S. Cohen等人，“Nematodem7GpppG and m3(2，2，7) GpppG decapping :activities in Ascarisembryos and characterization of C. elegans scavenger DcpS，” RNA，第10卷，第1609-1624頁(yè)(2004))，在大腸桿菌中表達(dá)人和線蟲(chóng) DcpS。這兩種蛋白質(zhì)都于 _80°C在含有 50mM KC1、0. 2mM EDTA、lmMDTT、0. 5mM PMSF 禾口 20% 甘油的20mM Tris緩沖液(pH 7. 5)中進(jìn)行貯存。在37°C下，用5. 0或7. 0 yl的在500 yl 含有 20mM MgCl2 和 60mM (NH4) 2S04 的 50mM TRIS 緩沖液(pH = 7. 9)中的 DcpS (分別來(lái)自人 或秀麗隱桿線蟲(chóng))處理濃度為ImM的合適的帽類(lèi)似物60-90分鐘。每15-20分鐘從反應(yīng)混 合物中收集100 yl樣品，并通過(guò)在90°C下溫育3分鐘來(lái)使其失活。不經(jīng)進(jìn)一步處理，通過(guò) 分析型RP HPLC來(lái)分析所收集的樣品，其中在15分鐘內(nèi)使用在0. 1M KH2P04(pH = 6. 0)中 的0-50%甲醇線性梯度，并在260nm處進(jìn)行UV-檢測(cè)。實(shí)施例16帽依賴性翻譯的抑制將經(jīng)微球菌核酸酶處理的兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物用于體外翻譯(A.Cai等人， "Quantitative assessment of mRNA cap analogues asinhibitors of in vitro translation, ”Biochemistry，第 38 卷，第 8538-8547 頁(yè)(1999))。在 100mM 乙酸鉀和 1. 4mM氯化鎂時(shí)，取得最佳的帽依賴性翻譯。為了測(cè)定由各種帽類(lèi)似物引起的翻譯的抑制， 以g/ml的濃度向裂解物中添加天然的兔珠蛋白mRNA，并通過(guò)[3H]Leu的摻入來(lái)測(cè)量蛋 白質(zhì)合成。如先前所描述的(Cai等人，1999)，進(jìn)行&數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化。使用入= 255nm和 ￡ M = 22. 6X 10_3M，在pH 7. 0下通過(guò)UV吸收來(lái)測(cè)量二核苷酸帽類(lèi)似物溶液的濃度。結(jié)果實(shí)施例17帽類(lèi)似物的合成導(dǎo)致獲得在三磷酸鏈的a、Y和0位置處擁有硫代磷酸基團(tuán)的類(lèi)似物的合成途 徑分別描繪在圖1、2和3中。我們合成了一系列的6種帽類(lèi)似物，其在5’，5’ -三磷酸鏈的a、0或Y位置處 攜帶有單個(gè)硫代磷酸部分。(參見(jiàn)下文)。由于致立體性(Stere0genic)P-中心的存在，每 種S-類(lèi)似物以兩種非對(duì)映異構(gòu)體(根據(jù)它們?cè)赗P HPLC期間的洗脫順序而命名為D1和 D2)的混合物形式而獲得。通過(guò)RP HPLC成功地對(duì)每種S-類(lèi)似物進(jìn)行了拆分，從而提供了 12種化合物，隨后對(duì)這12種化合物在生物物理學(xué)和生物化學(xué)方面進(jìn)行了表征。這些S-類(lèi) 似物中的6種包含ARCA修飾，即在m7Guo部分中的2 ‘ -0-甲基，并因此稱為S-ARCA。在3位置處引入硫代磷酸基團(tuán)產(chǎn)生了對(duì)于Dcp2的抗性，增加了半壽期，和改善了翻譯效率c
n.a.-未指定S-ARCA的該化學(xué)合成是最初對(duì)于具有未修飾的5’，5’ -多磷酸橋的帽類(lèi)似 物所幵發(fā)的化學(xué)合成的修改形式。參見(jiàn)M.Kadokura等人，“Efficient synthesis of y-methyl-capped guanosine 5 ' -triphosphate as a5 ' -terminal unique structure of U6 RNA via a new triphosphate bondformation involving activation of methyl phosphorimidazo1idate usingZnCl2 as a catalyst in DMF under anhydrous conditions, 〃 TetrahedronLett.，第 38 卷，第 8359-8362 頁(yè)(1997) ；J. Stepinski 等人， 〃 Synthesisand properties of mRNAs containing
the novel
anti-reverse
capanalogues 7-methyl(3
-0-methyl)GpppG
and 7-methyl (3 ! -deoxy) GpppG， “ RNA,第 7 卷，第 1486-1495 頁(yè)(2001)；和 J.Jemielity 等人， “Novel ‘ anti-reverse ‘ cap analogues with superior translationalproperties, “ RNA，第 9 卷，第 1108-1122 頁(yè)(2003)。將兩個(gè)單核苷酸種類(lèi)(其中之一首先轉(zhuǎn)化為反應(yīng)性N-?；溥蜓苌?在DMF中進(jìn)行偶聯(lián)。通過(guò)8倍 過(guò)量的ZnCl2來(lái)促進(jìn)反應(yīng)，所述8倍過(guò)量的ZnCl2顯著地改善反應(yīng)物在有機(jī)介質(zhì)中的溶解 度，防止N-?；溥蜓苌锏乃?，和加速反應(yīng)速率。在該合成中的重要步驟是在DMF中 在ZnCl2存在下合適的N-?；溥蜓苌锱c核苷5’ -硫代磷酸或核苷5’ -(2-硫代二磷 酸)的偶聯(lián)。在類(lèi)似的、最近開(kāi)發(fā)出的反應(yīng)(其采用硫代磷酸陰離子(PS033—)作為親核體) 中有效地獲得中間體核苷5’ -(2-硫代二磷酸)。參見(jiàn)J. Kowalska等人，“A simple and rapid synthesis of nucleotideanalogues containing a phosphorothioate moiety at the terminalposition of the phosphate chain，，，Tetrahedron Lett,第 48 卷，2007, 5475-5479。我們所開(kāi)發(fā)出的反應(yīng)策略使得能夠在多磷酸鏈的所選位置處引入硫代磷酸部 分，以及產(chǎn)生中間體核苷5’ _(2_硫代二磷酸)。如上文所顯示的和如在權(quán)利要求書(shū)中所使用的，稱為“a ”的磷酸部分是對(duì)于 7-甲基鳥(niǎo)苷部分來(lái)說(shuō)最遠(yuǎn)端的磷酸部分。稱為“0 ”的位置是在朝向7-甲基鳥(niǎo)苷部分移 動(dòng)的方向上的下一個(gè)磷酸，和稱為“ Y，，的位置是在朝向7-甲基鳥(niǎo)苷部分移動(dòng)的方向上的 下一個(gè)磷酸。在三磷酸ARCA中，如上文所顯示的，“ Y ”是最靠近7-甲基鳥(niǎo)苷部分的磷酸。 在四磷酸ARCA中，“ S ”磷酸將“ Y ”與7-甲基鳥(niǎo)苷相隔開(kāi)。(在沒(méi)有7-甲基鳥(niǎo)苷部分的 ARCA中，將會(huì)理解，應(yīng)當(dāng)修改前面的定義以換而涉及具有這樣的位置的部分，即該位置類(lèi)似 于在本文所給出的實(shí)施例中的7-甲基鳥(niǎo)苷的位置)。導(dǎo)致獲得在5'，5'-三磷酸橋的a-位置處經(jīng)修飾的類(lèi)似物1和4(即， m7GpppsG*m/’2' _°GpppsG)的合成途徑描繪在圖1中。在這兩個(gè)最后的偶聯(lián)反應(yīng)中，都使 用了 1. 5至2倍過(guò)量的磷酸N-?；溥?phosphorimidazolide)以確保核苷5'-硫代 磷酸的完全消耗。偶聯(lián)穩(wěn)步地進(jìn)行，這導(dǎo)致在1-2天內(nèi)幾乎完全消耗掉底物。在Y位置 處經(jīng)修飾的類(lèi)似物3和6(8卩，m7GpsppG和m/’2' _°GpsppG)的合成(描繪在圖2中)與上 文所描述的相似。在每種情況下，如圖2中所顯示的那樣，通過(guò)RP HPLC來(lái)指示兩種非對(duì) 映異構(gòu)體的形成。中間體核苷5'-硫代磷酸9、10和11經(jīng)過(guò)合適的核苷的硫代磷酸化 來(lái)合成，所述硫代磷酸化于0°C在2，6_ 二甲基吡啶存在下在磷酸三甲酯中通過(guò)？5(13來(lái) 進(jìn)行，類(lèi)似于先前報(bào)道的操作程序(J. R.Moran等人，“Apractical enzymatic synthesis of (S[P])-adenosine 5 ' -0-(1-thiotriphosphate)((S[P])-ATP-d-S)，” J. Org. Chem.， 第49卷，第704-706頁(yè)(1984))。在化合物10和11的情況下，N7位處的甲基化必須在 硫代磷酸化步驟之前在核苷階段進(jìn)行，這是因?yàn)榉駝t甲基碘優(yōu)先使硫原子烷基化(未發(fā)表 的發(fā)現(xiàn))。通過(guò)采用2，2'-聯(lián)硫基二吡啶/三苯膦活化體系，經(jīng)過(guò)與咪唑的反應(yīng)而容易 地達(dá)到將核苷5 ‘ - 二磷酸轉(zhuǎn)化為其N(xiāo)-?；溥蜓苌?7、8和12-15) (T. Mukaiyama等 A "Phosphorylation by oxidation-reduction condensation. Preparationof active phosphorylating reagents，”Bull. Chem. Soc. Jpn ，第 44 卷，第 2284 頁(yè)(1971))。如圖 3 中所描繪的那樣，合成在位置處經(jīng)修飾的類(lèi)似物，即m7GppspG(2)和m/’2' _°GppspG(5)。 最終的偶聯(lián)的HPLC分析揭示了兩種P-非對(duì)映異構(gòu)體的形成。但是，它們的保留時(shí)間 非常相似。為了獲得中間體核苷5' -0-(2-硫代二磷酸)16和17，我們采用了最近開(kāi) 發(fā)出的在核苷5'-單磷酸N-?；溥蚝妥鳛橛H核體的硫代磷酸(PS033—)三乙基銨鹽 之間的偶聯(lián)反應(yīng)(J. Kowalska 等人，"A simple and rapid synthesis of nucleotide analogues containing aphosphorothioate moiety at the terminal position of the
24phosphatechain”，Tetrahedron Lett，第 48 卷，2007，5475-5479)。在所有導(dǎo)致獲得帽類(lèi)似物1-6的反應(yīng)中，HLPC分析都揭示，作為主要產(chǎn)物形成了 所希望的化合物，只有適度量的副產(chǎn)物。盡管如此，制備性的產(chǎn)量令人驚訝地低于由HPLC 所指示的那些，在總體10-20%的范圍內(nèi)。這可能是由于在長(zhǎng)時(shí)間的通過(guò)RP HPLC來(lái)分離開(kāi) 非對(duì)映異構(gòu)體的過(guò)程中材料的大量損失所致，RP HPLC在許多情況下重復(fù)進(jìn)行以便獲得非 對(duì)映異構(gòu)體純的樣品。實(shí)施例18體外脫帽反應(yīng)我們就通過(guò)重組hDcp2的水解而測(cè)試了用任一種S-ARCA帽化的寡核苷酸，以測(cè)試 用m/’2’ _°GpppsG和m/’2’ _°GppspG的各種非對(duì)映異構(gòu)體帽化的mRNA在它們對(duì)于通過(guò)Dcpl/ Dcp2的切割的敏感性方面是否不同。一般地，參見(jiàn)，Z.Wang等人，‘‘The hDcp2 protein is amammalian mRNA decapping enzyme, " Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.,第 99 卷，第 12663-12668 頁(yè)(2002)；和 Z. Wang 等人，“An mRNAStability Complex Functions with Poly (A) -Binding Protein ToStabilize mRNA In Vitro “，Mol. Cell. Biol.，第 19 卷，第 4552-4560頁(yè)(1999)。所使用的帽類(lèi)似物在最初是未標(biāo)記的，因此為了追蹤消化反應(yīng)的產(chǎn) 物，我們?cè)赱a "32P]GTP和DNA模板(其中G是在啟動(dòng)子之后指定的第一個(gè)核糖核苷酸)存 在下合成了加帽的寡核苷酸。用所述S-ARCA中的任一種帽化的寡核苷酸經(jīng)歷體外Dcp2消 化，之后用核糖核酸酶混合物(來(lái)自Epicenter的RiboShredder)進(jìn)一步消化所述產(chǎn)物。通 過(guò)最近鄰轉(zhuǎn)移(nearest-neighbor transfer)，在核糖核酸酶消化后，在G殘基的5’-側(cè)處 的任意核苷酸獲得32P_標(biāo)記的3’ -磷酸基團(tuán)。然后，使用陰離子交換色譜法將在RNA中的 內(nèi)部位置處的經(jīng)標(biāo)記的3’ -核苷單磷酸(3’ -NMP * )與經(jīng)標(biāo)記的5’ -末端產(chǎn)物解析開(kāi)(圖 6)。后者分別包括源自未帽化的轉(zhuǎn)錄物的p3Gp *和m/’2’_°Gp3Gp * (當(dāng)使用m/’2’_°Gp3G時(shí))， 或者由對(duì)于酶促切割具有抗性或不具有抗性的帽化的RNA而產(chǎn)生的pGp *。所使用的所有 帽類(lèi)似物是ARCA，其確保它們僅以正確的方向摻入RNA中。這進(jìn)一步保證了，在核糖核酸酶 處理后只觀察到一種5’ -末端產(chǎn)物(m/’2’ _°Gp3Gp * )。未帽化的RNA不是Dcp2的底物，這 解釋了為什么在Dcp2消化后觀察到p3Gp *產(chǎn)物。為了確定哪些帽類(lèi)似物保護(hù)mRNA免于hDcp2切割，我們用重組hDcp2消化加 帽的、32P_標(biāo)記的短RNA，其中采用這樣的條件，即在所述條件下⑴用m/’2’-°Gp3G帽化 的寡核苷酸完全被hDcp2消化(圖6A)，和(ii)用m/’3’_°GppCH2pG帽化的寡核苷酸具有 抗性(圖6B)。先前顯示，m/’3’-°GppeH2pG保護(hù)mRNA免于hDcp2降解。參見(jiàn)E. Grudzien 等人’ “Differential inhibition of mRNA degradationpathways by novel cap analogs, “ J. Biol. Chem.，第 281 卷，第 1857-1867 頁(yè)(2006)。我們發(fā)現(xiàn)，只有m/’2’_°GppspG 的D2異構(gòu)體使RNA對(duì)于hDcp2水解保持穩(wěn)定(圖6F)。用m/’2’_°GpppsG和m/’2’_°GpsppG的 異構(gòu)體帽化的寡核苷酸不顯示在對(duì)于hDcp2的穩(wěn)定性方面的增加(圖6C、6D、6G和6H)。實(shí)施例19用硫代磷酸帽類(lèi)似物帽化的mRNA的5’降解由于用m/’2’_°GppspG(D2)帽化的短RNA對(duì)于hDcp2水解具有抗性，我們預(yù)測(cè)，該 帽類(lèi)似物的存在會(huì)影響細(xì)胞中mRNA的穩(wěn)定性。我們使用核穿孔或電穿孔來(lái)將合成的螢光 素酶mRNA引入HC11小鼠乳腺上皮細(xì)胞中。這些方法允許幾乎緊接在放電后，就測(cè)量細(xì)胞中的螢光素酶合成和螢光素酶mRNA水平。對(duì)于電穿孔，我們使用先前優(yōu)化的條件。參見(jiàn) E. Grudzien等人，“Differential inhibition of mRNAdegradation pathways by novel cap analogs, “ J. Biol. Chem.，第 281 卷，第 1857-1867 頁(yè)(2006)。對(duì)于核穿孔，我們遵 循由Amaxa Biosystems建議的條件(參見(jiàn)“材料和方法”)。由于Amaxa實(shí)驗(yàn)方案給出了 最高的轉(zhuǎn)染效率以及還有最高的細(xì)胞生存力，因而其被用于本文所描述的大多數(shù)實(shí)驗(yàn)。在體外合成了包含各種5’ -末端帽和3’ -末端60-nt poly (A)束的螢光素酶 mRNA(Luc-A60)。在核穿孔后，以直至90分鐘的間隔取出細(xì)胞以便測(cè)量翻譯效率，其中使用 螢光素酶活性增加的速率；或者以直至8小時(shí)的間隔取出細(xì)胞以通過(guò)實(shí)時(shí)PCR來(lái)測(cè)量螢光 素酶mRNA穩(wěn)定性。如果從包含經(jīng)翻譯的和未翻譯的mRNA兩者的細(xì)胞中回收mRNA，那么翻 譯效率和mRNA穩(wěn)定性的測(cè)定可能會(huì)是錯(cuò)誤的。為了解決這個(gè)問(wèn)題，我們測(cè)定了總胞質(zhì)mRNA 的降解速率，相比于多核糖體mRNA。將用m/’2’_°Gp3G帽化的螢光素酶mRNA核穿孔入HC11 細(xì)胞中，然后在各個(gè)不同時(shí)間處裂解所述細(xì)胞并且鋪層在蔗糖梯度上以將多核糖體與起始 復(fù)合物分離開(kāi)。合并多核糖體級(jí)分，并純化RNA。為了追蹤胞質(zhì)mRNA降解，我們使用從總細(xì) 胞提取物中分離出的mRNA。在這兩種情況下，均使用針對(duì)熒光素酶mRNA的5’ -末端的引 物對(duì)，通過(guò)實(shí)時(shí)PCR來(lái)定量螢光素酶mRNA。與多核糖體相聯(lián)合的轉(zhuǎn)錄物以大約與總胞質(zhì)mRNA相同的速率被降解(數(shù)據(jù)未顯 示)。這暗示，即使在任何給定時(shí)間處存在經(jīng)翻譯的和未翻譯的熒光素酶mRNA池(pool)， 但mRNA在它們之間自由交換。該觀察結(jié)果驗(yàn)證了翻譯效率和降解速率的測(cè)量結(jié)果。在核穿孔入HC11細(xì)胞中后，測(cè)定了用各種S-ARCA帽化的Luc-A6(1的穩(wěn)定性。通 過(guò)實(shí)時(shí)PCR測(cè)定了在各個(gè)不同時(shí)間處存留在細(xì)胞中的mRNA。用m/’2’_°GppspG(D2)帽化的 Luc-A60 (t1/2 = 257 分鐘)比用天然帽 m7Gp3G (t1/2 = 86 分鐘)或親本化合物 m/’2’_°Gp3G (t1/2 =155分鐘)帽化的mRNA更為穩(wěn)定(圖7和表2)。這暗示，mRNA穩(wěn)定性的增加是由于 對(duì)于通過(guò)Dcpl/Dcp2的水解的抗性而引起的。m/’2’_°GpppsG(Dl) (t1/2 = 169分鐘)和m/’ 2’_°GppspG(Dl) (t1/2 = 185分鐘)都沒(méi)有賦予比m27’2’-°Gp3G(t1/2 = 155分鐘)顯著更大的穩(wěn) 定性(表2)。值得注意的是，m/’2’-°GpppsG(Dl)和m/’2’-°GppspG(Dl)對(duì)于eIF4E的親和力 都為m/’2’ _°Gp3G的3倍。人們可能預(yù)期，用這些類(lèi)似物帽化的mRNA將會(huì)更穩(wěn)定，如果關(guān)于 eIF4E和Dcpl/Dcp2之間的競(jìng)爭(zhēng)的假說(shuō)是正確的話。參見(jiàn)E. Grudzien等人，“Differential inhibition of mRNA degradation pathways bynovel cap analogs," J. Biol. Chem. ,M 281卷，第1857-1867頁(yè)(2006)。對(duì)于用這些類(lèi)似物帽化的mRNA，我們沒(méi)有觀察到穩(wěn)定性 或翻譯效率的增加(參見(jiàn)下文)。這可以表明，雖然m/’2’_°GpppsG(Dl)和m/’2’_°GppspG(Dl) 更強(qiáng)地結(jié)合eIF4E，但存在有上限，超過(guò)了該上限，對(duì)于eIF4E的高親和力不加速總體翻譯。 根據(jù)這個(gè)解釋，當(dāng)帽結(jié)合的速率變得足夠高時(shí)，蛋白質(zhì)合成起始中的一些其他步驟就成為 是限速的。實(shí)施例20在HC11細(xì)胞中用S-ARCA帽化的螢光素酶mRNA的翻譯效率對(duì)于用S-ARCA帽化螢光素酶mRNA，我們還測(cè)定了在培養(yǎng)的細(xì)胞中的翻譯效率。這 涉及在核穿孔后的各個(gè)不同時(shí)間處進(jìn)行的兩個(gè)測(cè)量在經(jīng)澄清的細(xì)胞裂解物中通過(guò)發(fā)光測(cè) 定法而測(cè)量的螢光素酶活性，和通過(guò)實(shí)時(shí)PCR而測(cè)量的Luc-A6(i水平。通過(guò)已被遞送入細(xì) 胞中的螢光素酶mRNA的量來(lái)使螢光素酶活性標(biāo)準(zhǔn)化。為了測(cè)定在緊接于核穿孔后的時(shí)間處(即在出現(xiàn)任何衰變之前)在細(xì)胞中存在的RNA的量，在核穿孔后2至8小時(shí)的各個(gè)不 同時(shí)間處收獲細(xì)胞，并且提取胞質(zhì)RNA。使用擴(kuò)增5’ -末端附近序列的引物，通過(guò)實(shí)時(shí)PCR 來(lái)測(cè)量螢光素酶mRNA的量。將在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)處存留的螢光素酶mRNA以“l(fā)og1(1([RNA])對(duì) 時(shí)間”的形式進(jìn)行作圖以測(cè)定t1/2。將曲線外推至0小時(shí)，并計(jì)算出遞送入細(xì)胞中的RNA的 量。我們定義了這樣的條件，在所述條件下，在 30分鐘的最初的延滯期后，螢光素酶的積 累隨著時(shí)間是線性的，所述延滯期用于將mRNA募集至核糖體，完成第一條多肽鏈，和將螢 光素酶釋放到細(xì)胞溶膠中。用m/’2’_°GppspG (D1)和 m/’2’_°GppspG (D2)帽化的 Luc_A6(lmRNA 以分別為用 m7Gp3G 帽 化的mRNA的2. 8倍和5. 1倍的程度更有效地進(jìn)行翻譯(圖8和表2)。對(duì)于在兔網(wǎng)織紅細(xì)胞 裂解物體系中的無(wú)細(xì)胞翻譯，用m/’2’_°GppspG(Dl)和m/’2’_°GppspG(D2)帽化的Luc-A6(1mRNA 僅以為用m7Gp3G帽化的LUC-A6QmRNA的2. 3倍的程度更有效地進(jìn)行翻譯(數(shù)據(jù)未顯示)。 該差異暗示，在培養(yǎng)的細(xì)胞中翻譯效率的增加與更高的mRNA穩(wěn)定性(其不是無(wú)細(xì)胞翻譯體 系的因素)相關(guān)，這是因?yàn)橹挥杏脤?duì)于hDcp2具有抗性的類(lèi)似物帽化的mRNA被更有效地翻 譯。表2在HC11細(xì)胞中具有硫代磷酸帽類(lèi)似物的螢光素酶mRNA的翻譯效率和穩(wěn)定性 a在20 °C下小鼠eIF4E (氨基酸28-217)與各種帽類(lèi)似物的相互作用的 平衡締合常數(shù)。在大腸桿菌中表達(dá)小鼠eIF4E(殘基28-217)，并且進(jìn)行熒光時(shí)間 同 步滴定(fluorescence time-synchronized titration)，如在 J. Zuberek 等 人，“Phosphorylation of eIF4E attenuates its interaction withmRNA cap analogs by electrostatic repusion :Intein-mediated proteinligation strategy to obtain phosphorylated protein, “ RNA,第 9 卷，第 52-61 頁(yè)(2003)；和 A. Niedzwiecka 等 人， ” Biophysical studies of eIF4Ecap_binding protein -recognition of mRNA 5' cap structure and syntheticfragments of eIF4G and 4E—BP1 proteins，" J. Mol.Biol.，第319卷，第615-635頁(yè)(2002)中所描述的。b使用圖4的數(shù)據(jù)來(lái)估計(jì)用各種類(lèi)似物帽化的寡核苷酸對(duì)于hDcp2水解的易感性。 將在44分鐘處(未消化的帽)和在38分鐘處(pGp * )洗脫出的峰中的放射性活度對(duì)于背 景放射性活度進(jìn)行修正，并相加以代表帽中的總放射性活度。通過(guò)作為總放射性活度的百 分比來(lái)表示的在pGp *中的放射性活度來(lái)給出Dcp2易感性。(ND)未測(cè)定。c通過(guò)實(shí)時(shí)PCR(其使用針對(duì)螢光素酶mRNA的5’ -末端的引物)來(lái)測(cè)定用所示的 類(lèi)似物帽化的LuC-A6(lmRNA中5’ -末端序列的降解。d顯示了在HC11細(xì)胞中用所示的帽類(lèi)似物帽化的Luc-A6(1mRNA的翻譯效 率。通過(guò)細(xì)胞中螢光素酶RNA的量來(lái)對(duì)螢光素酶活性進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。如由J. Jemielity 等人， “Novel ‘ anti-reverse ‘ cap analogues with superiortranslational properties" RNA，第9卷，第1108-1122頁(yè)(2003)所描述的，計(jì)算出相對(duì)翻譯效率。*指明了與用m/’2'_°Gp3G帽化的mRNA顯著不同(p < 0. 05)的半壽期。實(shí)施例21在HC11細(xì)胞中用S-ARCA帽化的螢光素酶mRNA更有效地被募集至多核糖體我們采用了獨(dú)立的方法來(lái)驗(yàn)證這樣的觀察結(jié)果用m/’2°GppspG帽化的mRNA更有 效地被翻譯，即它們的多核糖體分布(圖9A-9E)。相對(duì)于延伸或終止而言起始的速率的 增加導(dǎo)致mRNA從較輕的多核糖體移動(dòng)至較重的多核糖體。參見(jiàn)H.Lodish，“ Model for theregulation of mRNA translation applied to haemoglobin synthesis, " Nature, 第251卷，第385-388頁(yè)(1974)。未預(yù)期帽結(jié)構(gòu)的類(lèi)型會(huì)影響延伸的速率。因此，移動(dòng)至更 高的多核糖體表明了更快的起始。將用m7Gp3G、m/’2’ _0Gp3G 或 m/’2’ —GppspG (D2)帽化的 LucA6(1mRNA 電穿孔入 HC11 細(xì) 胞中。在電穿孔后4小時(shí)，裂解這些細(xì)胞，并將經(jīng)澄清的上清液鋪層在蔗糖梯度上以將多 核糖體與起始復(fù)合物分離開(kāi)。螢光素酶mRNA主要地存在于多核糖體中(圖9A和9B，級(jí)分 6-11)，盡管有些也存在于起始復(fù)合物的區(qū)域中(級(jí)分3-5)。小的螢光素酶mRNA存在于未 翻譯的信使核糖核蛋白復(fù)合物(mRNP)池中(圖9A和9B，級(jí)分1-2)。用標(biāo)準(zhǔn)ARCA即m/’ 2’_°Gp3G帽化的mRNA移動(dòng)至更高的多核糖體(圖9C)。然而，用m/’2’ _°GppspG (D2)帽化的 mRNA移動(dòng)至更加高的多核糖體，并且同時(shí)從mRNP區(qū)域中丟失(圖9D)。在相同的實(shí)驗(yàn)條件 下，內(nèi)源的GAPDH mRNA被有效地翻譯(圖9E)，盡管有些也沉積在起始復(fù)合物的區(qū)域中?？?之，這些結(jié)果暗示，螢光素酶轉(zhuǎn)錄物的5’-末端處m/’2’-°GppspG(D2)的存在增加它們的起始 速率，從而確認(rèn)了基于螢光素酶活性的積累的結(jié)果。實(shí)施例22S-ARCA螢光素酶mRNA的更大的穩(wěn)定性和更大的翻譯效率的組合在HC11細(xì)胞中產(chǎn) 生更多的總體蛋白質(zhì)表達(dá)我們還測(cè)定了通過(guò)其酶促活性來(lái)測(cè)量的總的螢光素酶積累，作為關(guān)于用m/’ 2’ "°Gp3G> m/’2’ _°GppspG(Dl)禾P m/’2’ _°GppspG(D2)帽化的 mRNA 的時(shí)間的函數(shù)。對(duì) HC11 細(xì)胞 進(jìn)行核穿孔，然后在直至10小時(shí)的各個(gè)不同時(shí)間處進(jìn)行裂解。將在上清液中測(cè)量得到的螢 光素酶活性對(duì)于遞送入細(xì)胞中的Luc-A6(i的量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。如圖10中所顯示的，HC11細(xì)胞 中的螢光素酶活性在3小時(shí)處達(dá)到最大，然后在經(jīng)過(guò)10小時(shí)下降至1/10。表達(dá)的動(dòng)力學(xué)與 熒光素酶蛋白質(zhì)的半壽期(其為約180分鐘)(參見(jiàn)J. Thompson等人，“Modulation offireflyluciferase stability and impact on studies of gene regulation, " Gene, 第103卷，第171-177頁(yè)(1991))和各種螢光素酶mRNA的半壽期(其分別為155、185和 257分鐘)相一致。對(duì)于用m/’2’_°GppspG(D2)帽化的LuC-A6(l (其具有最高的翻譯效率和最 大的穩(wěn)定性)來(lái)說(shuō)，大多數(shù)螢光素酶發(fā)生積累。預(yù)測(cè)對(duì)于具有更長(zhǎng)半壽期的蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，來(lái) 自用該類(lèi)似物帽化的mRNA的總體蛋白質(zhì)表達(dá)的增加是更加大的。實(shí)施例23對(duì)于eIF4E的結(jié)合親和力所述S-類(lèi)似物的KAS值和結(jié)合自由能(AG° )，以及關(guān)于它們的未修飾的親本 化合物的同樣的數(shù)據(jù)顯示在表3中。令人驚訝地，不但硫代磷酸部分的存在沒(méi)有降低對(duì)于 eIF4E的結(jié)合親和力，而且在有些情況下，親和力還顯著增加了。KAS值強(qiáng)烈地依賴于硫代磷 酸修飾的位置和在不對(duì)稱P-中心周?chē)慕^對(duì)構(gòu)型。有趣的是，在每對(duì)非對(duì)映異構(gòu)體中，D1 成員以D2成員或親本類(lèi)似物的2. 3至4. 5倍的親和力與eIF4E結(jié)合。例如，m27,2' _°GpsppG 的D1異構(gòu)體的Kas為D2或m27,2' _°GpppG的3倍。類(lèi)似地，m27’2' _°GppspG的D1異構(gòu)體的KAS 為D2的2倍和為m/’2' _°GpppG的4. 5倍。對(duì)于、-修飾的類(lèi)似物，觀察到最大的在D1/D2 非對(duì)映異構(gòu)體之間的結(jié)合親和力的差異。在另一個(gè)方面，對(duì)于取代的類(lèi)似物，觀察到最 大的在經(jīng)修飾的和未修飾的對(duì)之間的差異。表3鼠類(lèi)eIF4E(28_217)與硫代磷酸帽類(lèi)似物的結(jié)合的平衡締合常數(shù)(KAS)和結(jié)合自 由能(AG° )，其通過(guò)熒光猝滅來(lái)測(cè)定。
m對(duì)于非對(duì)映異構(gòu)體混合物所測(cè)定的實(shí)施例24對(duì)于通過(guò)人和秀麗隱桿線蟲(chóng)DcpS的酶促水解的易感性使新系列的S-類(lèi)似物經(jīng)歷由來(lái)自人和秀麗隱桿線蟲(chóng)來(lái)源的DcpS所催化的體外酶 促水解。在所有實(shí)驗(yàn)中，將相應(yīng)的未修飾的帽類(lèi)似物用作陽(yáng)性對(duì)照，即對(duì)于非ARCA S-類(lèi)似 物來(lái)說(shuō)為m7GpppG，和對(duì)于S-ARCA來(lái)說(shuō)為m/’2' _°GpppG。優(yōu)化DcpS酶的量以提供在40-90 分鐘內(nèi)對(duì)照底物的完全降解。通過(guò)RP HPLC來(lái)分析以各個(gè)不同時(shí)間間隔從反應(yīng)混合物中收 集的樣品(如在“材料和方法”中所描述的)。在表4中，在導(dǎo)致于40-90分鐘內(nèi)未修飾的親本化合物(即，對(duì)于非ARCA S-類(lèi)似 物來(lái)說(shuō)為m7GpppG，和對(duì)于ARCA來(lái)說(shuō)為m/’2' _°GpppG)完全降解的條件下，使4 y M濃度的帽 類(lèi)似物經(jīng)歷通過(guò)DcpS的酶促消化。如在“材料和方法”中所描述的，采用在260nm處的UV 檢測(cè)通過(guò)RP HPLC來(lái)分析以各個(gè)不同時(shí)間間隔從反應(yīng)混合物中收集的樣品。在表4中，被 指定為“具有抗性”的類(lèi)似物在所應(yīng)用的條件下保持完全未被消化，而被指定為“被水解”的 類(lèi)似物以與各自未修飾的親本化合物相當(dāng)?shù)男时籇cpS水解。發(fā)現(xiàn)在位置處經(jīng)修飾 的S-類(lèi)似物對(duì)于水解具有抗性，這不依賴于P-中心絕對(duì)構(gòu)型(表4)。即使將反應(yīng)時(shí)間延 長(zhǎng)至24小時(shí)，使用各種不同的酶量，和修改反應(yīng)緩沖液的組成，結(jié)果也不變。所有其他S-類(lèi) 似物以與未修飾的親本類(lèi)似物相當(dāng)?shù)男时籬DcpS水解。對(duì)于通過(guò)來(lái)自人和秀麗隱桿線蟲(chóng) 來(lái)源的DcpS來(lái)進(jìn)行的S-類(lèi)似物水解，沒(méi)有觀察到顯著的差異。對(duì)在a-位置處經(jīng)修飾的類(lèi)似物的DcpS降解產(chǎn)物的分析使得我們能夠確定它 們?cè)诓粚?duì)稱P-中心周?chē)慕^對(duì)構(gòu)型。我們發(fā)現(xiàn)，通過(guò)DcpS來(lái)進(jìn)行的m7GpppsG(Dl)或 m7GpppsG (D2)的水解導(dǎo)致獲得m7GMP和鳥(niǎo)苷5 ‘ -0- (1-硫代二磷酸)(OTP a S)的D1或D2 異構(gòu)體，而 m/’2' _°GpppsG(Dl)或 m/’2' _°GpppsG(D2)的水解導(dǎo)致獲得 m/’2' _°GMP 和 GDP a S 的D1或D2異構(gòu)體(數(shù)據(jù)未顯示)。表4S-類(lèi)似物在體外對(duì)于通過(guò)DcpS (來(lái)自人和秀麗隱桿線蟲(chóng))的酶促水解的易感性 實(shí)施例25作為帽依賴性翻譯的抑制劑的帽類(lèi)似物在用天然兔珠蛋白mRNA進(jìn)行規(guī)劃的兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物體系中檢驗(yàn)了所述新的 S-類(lèi)似物抑制帽依賴性翻譯的能力。在所述12種S-類(lèi)似物中，選擇出在位置處經(jīng)修 飾的兩種，即m7GpsppG(Dl)和m7GpsppG(D2)，這是因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)它們對(duì)于DcpS具有抗性和因?yàn)?它們?cè)隗w內(nèi)可能更穩(wěn)定。將關(guān)于翻譯抑制的數(shù)據(jù)與理論曲線相擬合，所述理論曲線描述了 作為mRNA結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的函數(shù)的帽依賴性翻譯(Cai等人，1999)。這使得我們能夠 測(cè)定&，即在帽依賴性翻譯被抑制50 %時(shí)的帽類(lèi)似物濃度(表5)。發(fā)現(xiàn)這兩種S-類(lèi)似物都 是比m7GpppG更好的帽依賴性翻譯的抑制劑，這構(gòu)成了關(guān)于硫代磷酸部分通常使帽_eIF4E 相互作用穩(wěn)定化的額外的證據(jù)。此外，m7GpsppG(Dl)比其D2對(duì)應(yīng)物顯著地更具有抑制性
= 4. 1 士0.之！^對(duì)!^ = 12. 1 士3. 2iiM)，這與其更高的對(duì)于eIF4E的結(jié)合親和力(KAS = 30. 8 士 0. 5 對(duì) Kas = 10. 0 士 0. 2)相一致。表 5在兔網(wǎng)織紅細(xì)胞切割液翻譯體系中通過(guò)、-修飾的S-類(lèi)似物的帽依賴翻譯的抑 制的抑制常數(shù)og 實(shí)施例26作為帽依賴性翻譯的體內(nèi)抑制劑的用S-ARCA帽化的mRNA片段S-ARCA，尤其是其中硫代磷酸修飾出現(xiàn)在Y位置處的三磷酸，例如在實(shí)施例17下 的化合物6a和6b的未來(lái)應(yīng)用可能是作為帽依賴性翻譯的抑制劑。已充分證明，在癌細(xì)胞 中帽依賴性翻譯被上調(diào)，并且eIF4E的下調(diào)逆轉(zhuǎn)惡性表型。在可能出現(xiàn)完全降解成核苷酸之前，當(dāng)它們達(dá)到小于25nt的長(zhǎng)度時(shí)，由于加帽的mRNA的3’ 一 5’降解而產(chǎn)生的片段必須 進(jìn)行脫帽。預(yù)期用在Y位置處包含硫代磷酸修飾的三磷酸S-ARCA帽化的此類(lèi)片段對(duì)于 DcpS具有抗性，類(lèi)似于對(duì)于帽二核苷酸自身所顯示的(表4，見(jiàn)上)。因此，預(yù)期他們?cè)诩?xì) 胞中積累并且與正常mRNA競(jìng)爭(zhēng)募集至翻譯機(jī)器。我們將用在Y位置處進(jìn)行取代的三磷酸 S-ARCA(在實(shí)施例17下的化合物6a和6b)帽化的mRNA或mRNA片段引入培養(yǎng)的細(xì)胞中。 然后，我們使用報(bào)道構(gòu)建體來(lái)測(cè)量帽依賴性翻譯對(duì)帽非依賴性翻譯。我們預(yù)期前者優(yōu)先被 抑制。應(yīng)當(dāng)注意的是，ARCA修飾是在摻入mRNA中后這些S-ARCA的正確方向所必需的，這 是因?yàn)榉駝t硫代磷酸部分可能不處于使得mRNA片段對(duì)于DcpS具有抗性的正確位置。類(lèi)似地，我們分析作為帽依賴性翻譯的潛在抑制劑的四磷酸S-ARCA。我們預(yù)期，四 磷酸S-ARCA，尤其是包含8 -硫代磷酸基團(tuán)的那些，將不會(huì)在生理?xiàng)l件下被DcpS水解，并且 將會(huì)抑制帽依賴性翻譯。實(shí)施例27權(quán)利要求書(shū)詳細(xì)說(shuō)明了三磷酸和四磷酸帽類(lèi)似物二核苷酸的硫代磷酸修飾的所 有組合，類(lèi)似于下面所列出的那些。m7Guo的核糖部分的修飾是2’ -脫氧、3’ -脫氧、阿拉 伯糖、2’ -0-乙基和3’ -0-乙基。G的7-取代基的修飾是甲基、乙基、丙基、丁基、芐基、經(jīng) 取代的芐基、萘基甲基、經(jīng)取代的萘基甲基和其他經(jīng)取代或未取代的C1至C10脂肪族或芳 香族基團(tuán)。鳥(niǎo)嘌呤部分的修飾是使用腺嘌呤、尿苷、胞嘧啶或m7G?？梢院铣蛇@些各種修飾 物，如本申請(qǐng)中所公開(kāi)的和另外從本領(lǐng)域(例如美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)2003/0194759)已知的 方法改編的。
m27RGpspppsG m27'RGppsPspG m27RGppsppsG m27'RGpppspsG m27RGpspspspG m27,RGpspsppsG m27RGpsppspsG m27RGppspspsG
m27，RGpsPsPsPsG 本說(shuō)明書(shū)中所引用的所有參考文獻(xiàn)的全部公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)提及而合并入本文。還 通過(guò)提及而合并入了關(guān)于本發(fā)明者自己工作的下列出版物的全部公開(kāi)內(nèi)容，其不是本 串請(qǐng)的現(xiàn)有技術(shù)J. Kowalska 等人，"Synthesis and characterization of mRNA cap analogs containingphosphorothioate substitutions that bind tightly to eIF4E and areresistant to the decapping pyrophosphatase DcpS, ” RNA, % 14 卷，第 1119-1131 頁(yè)(2008) ；E. Grudzien-Nogalska 等 人，”P(pán)hosphorothioatecap analogs stabilize mRNA and increase translational efficiency inmammalian cells，，，RNA，第 13 卷， 第 1745-1755 頁(yè)(2007)；禾口 E. Darzynkiewicz 等人，“Methylene and phosphorothioate capdinucleotides :useful tools to study decapping and translantion",RNA
Meeting, Seattle,Washington, June 20-25,2006的摘要和海報(bào)。但是，在另外出現(xiàn)相矛盾 的沖突的情形下，應(yīng)當(dāng)以本說(shuō)明書(shū)為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
組合物，其包含其中每個(gè)Y選自O(shè)和S；各個(gè)Y可以是相同的或不同的；和至少一個(gè)Y是S；R1選自H、OH、OCH3和OCH2CH3；R2選自H、OH、OCH3和OCH2CH3；n是3或4；和如果R1是OH，那么R2不是OH。FPA00001029574100011.tif
2.權(quán)利要求1中所描述的組合物，其中所述組合物基本上由單種立體異構(gòu)體組成。
3.權(quán)利要求1中所描述的組合物，其中所述組合物包含至少兩種非對(duì)映異構(gòu)體，第一 非對(duì)映異構(gòu)體和第二非對(duì)映異構(gòu)體，的混合物；其中除了所述第一和第二非對(duì)映異構(gòu)體在 手性磷原子處具有不同的立體化學(xué)構(gòu)型外，所述第一和第二非對(duì)映異構(gòu)體在其他方面是相 同的；其中所述手性磷原子是與硫原子結(jié)合的磷原子。
4.RNA分子，其5'末端摻入有權(quán)利要求1的組合物。
5.用于在體外合成權(quán)利要求4中所描述的RNA分子的方法，所述方法包括使ATP、CTP、 UTP、GTP、所描述的組合物和多核苷酸模板，在RNA聚合酶存在下，在有助于所述RNA聚合酶 將所述多核苷酸模板轉(zhuǎn)錄成RNA拷貝的條件下進(jìn)行反應(yīng)；由此所述RNA拷貝中的一些將會(huì) 摻入有所描述的組合物，從而產(chǎn)生所描述的RNA分子。
6.用于在體外合成蛋白質(zhì)或肽的方法，所述方法包括在這樣的條件下在無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì) 合成體系中翻譯權(quán)利要求2中所描述的RNA分子，其中所述RNA分子包含開(kāi)放閱讀框，所述 條件有助于將所述RNA分子的所述開(kāi)放閱讀框翻譯成由所述開(kāi)放閱讀框所編碼的蛋白質(zhì) 或肽。
7.用于在體內(nèi)合成蛋白質(zhì)或肽的方法，所述方法包括在這樣的條件下將權(quán)利要求4中 所描述的RNA分子引入細(xì)胞中，其中所述RNA分子包含開(kāi)放閱讀框，所述條件有助于將所述 RNA分子的所述開(kāi)放閱讀框翻譯成由所述開(kāi)放閱讀框所編碼的蛋白質(zhì)或肽。
8.權(quán)利要求1中所描述的組合物；其中η是3并且所述組合物包含β-硫代磷酸基團(tuán)， 或者其中η是4并且所述組合物包含Y -硫代磷酸基團(tuán)；并且其中所述組合物在生理?xiàng)l件 下不被Dcp2水解。
9.權(quán)利要求1中所描述的組合物；其中η是3并且所述組合物包含Y-硫代磷酸基團(tuán)， 或者其中η是4并且所述組合物包含δ -硫代磷酸基團(tuán)；并且其中所述組合物在生理?xiàng)l件下不被DcpS水解，和所述組合物抑制帽依賴性翻譯。
10.用于在體內(nèi)合成蛋白質(zhì)或肽的方法，所述方法包括在這樣的條件下將其5'末端 摻入有權(quán)利要求8中所描述的組合物的RNA分子引入細(xì)胞中，其中所述RNA分子包含開(kāi)放 閱讀框，所述條件有助于將所述RNA分子的所述開(kāi)放閱讀框翻譯成由所述開(kāi)放閱讀框所編 碼的蛋白質(zhì)或肽；其中該體內(nèi)翻譯速率為從其中每個(gè)Y是氧原子和其中沒(méi)有Y是硫原子的 在其他方面相同的方法之中將能夠獲得的體內(nèi)翻譯速率的至少兩倍。
11.組合物，其包含 其中每個(gè)Y選自O(shè)和S;各個(gè)Y可以是相同的或不同的；和至少一個(gè)Y是S ；Rl 選自 H、OH、OCH3 禾P OCH2CH3 ；R2 選自 H、OH、OCH3 禾口 OCH2CH3 ；n是3或4 ；和如果Rl是0H，那么R2不是OH ；和B選自
12.權(quán)利要求11中所描述的組合物，其中所述組合物基本上由單種立體異構(gòu)體組成。
13.權(quán)利要求11中所描述的組合物，其中所述組合物包含至少兩種非對(duì)映異構(gòu)體，第 一非對(duì)映異構(gòu)體和第二非對(duì)映異構(gòu)體，的混合物；其中除了所述第一和第二非對(duì)映異構(gòu)體 在手性磷原子處具有不同的立體化學(xué)構(gòu)型外，所述第一和第二非對(duì)映異構(gòu)體在其他方面是 相同的；其中所述手性磷原子是與硫原子結(jié)合的磷原子。
14.RNA分子，其5'末端摻入有權(quán)利要求11的組合物。
15.用于在體外合成權(quán)利要求14中所描述的RNA分子的方法，所述方法包括使ATP、 CTP、UTP、GTP、所描述的組合物和多核苷酸模板，在RNA聚合酶存在下，在有助于所述RNA聚 合酶將所述多核苷酸模板轉(zhuǎn)錄成RNA拷貝的條件下進(jìn)行反應(yīng)；由此所述RNA拷貝中的一些 將會(huì)摻入有所描述的組合物，從而產(chǎn)生所描述的RNA分子。
16.用于在體外合成蛋白質(zhì)或肽的方法，所述方法包括在這樣的條件下在無(wú)細(xì)胞蛋白 質(zhì)合成體系中翻譯權(quán)利要求14中所描述的RNA分子，其中所述RNA分子包含開(kāi)放閱讀框，所述條件有助于將所述RNA分子的所述開(kāi)放閱讀框翻譯成由所述開(kāi)放閱讀框所編碼的蛋 白質(zhì)或肽。
17.用于在體內(nèi)合成蛋白質(zhì)或肽的方法，所述方法包括在這樣的條件下將權(quán)利要求14 中所描述的RNA分子引入細(xì)胞中，其中所述RNA分子包含開(kāi)放閱讀框，所述條件有助于將所 述RNA分子的所述開(kāi)放閱讀框翻譯成由所述開(kāi)放閱讀框所編碼的蛋白質(zhì)或肽。
18.權(quán)利要求11中所描述的組合物；其中η是3并且所述組合物包含β-硫代磷酸基 團(tuán)，或者其中η是4并且所述組合物包含Y-硫代磷酸基團(tuán)；并且其中所述組合物在生理?xiàng)l 件下不被Dcp2水解。
19.權(quán)利要求11中所描述的組合物；其中η是3并且所述組合物包含Y-硫代磷酸基 團(tuán)，或者其中η是4并且所述組合物包含δ-硫代磷酸基團(tuán)；并且其中所述組合物在生理?xiàng)l 件下不被DcpS水解，和所述組合物抑制帽依賴性翻譯。
20.用于在體內(nèi)合成蛋白質(zhì)或肽的方法，所述方法包括在這樣的條件下將其5'末端 摻入有權(quán)利要求17中所描述的組合物的RNA分子引入細(xì)胞中，其中所述RNA分子包含開(kāi)放 閱讀框，所述條件有助于將所述RNA分子的所述開(kāi)放閱讀框翻譯成由所述開(kāi)放閱讀框所編 碼的蛋白質(zhì)或肽；其中該體內(nèi)翻譯速率為從其中每個(gè)Y是氧原子和其中沒(méi)有Y是硫原子的 在其他方面相同的方法之中將能夠獲得的體內(nèi)翻譯速率的至少兩倍。
21.組合物，其包含 其中每個(gè)Y選自O(shè)和S;各個(gè)Y可以是相同的或不同的；和至少一個(gè)Y是S ；Rl 選自 H、OH、OCH3 禾P OCH2CH3 ；R2 選自 H、OH、OCH3 禾口 OCH2CH3 ；η是3或4 ；和如果Rl是0Η,那么R2不是OH ；和B選自鳥(niǎo)嘌呤、腺嘌呤、尿苷、胞嘧啶；和X選自甲基、乙基、丙基、丁基、芐基、經(jīng)取代的芐基、萘基甲基、經(jīng)取代的萘基甲基、以及 其他經(jīng)取代和未取代的Cl至ClO脂肪族或芳香族基團(tuán)。
22.權(quán)利要求21中所描述的組合物，其中所述組合物基本上由單種立體異構(gòu)體組成。
23.權(quán)利要求21中所描述的組合物，其中所述組合物包含至少兩種非對(duì)映異構(gòu)體，第 一非對(duì)映異構(gòu)體和第二非對(duì)映異構(gòu)體，的混合物；其中除了所述第一和第二非對(duì)映異構(gòu)體 在手性磷原子處具有不同的立體化學(xué)構(gòu)型外，所述第一和第二非對(duì)映異構(gòu)體在其他方面是 相同的；其中所述手性磷原子是與硫原子結(jié)合的磷原子。
24.RNA分子，其5'末端摻入有權(quán)利要求21的組合物。
25.用于在體外合成權(quán)利要求24中所描述的RNA分子的方法，所述方法包括使ATP、 CTP、UTP、GTP、所描述的組合物和多核苷酸模板，在RNA聚合酶存在下，在有助于所述RNA聚 合酶將所述多核苷酸模板轉(zhuǎn)錄成RNA拷貝的條件下進(jìn)行反應(yīng)；由此所述RNA拷貝中的一些 將會(huì)摻入有所描述的組合物，從而產(chǎn)生所描述的RNA分子。
26.用于在體外合成蛋白質(zhì)或肽的方法，所述方法包括在這樣的條件下在無(wú)細(xì)胞蛋白 質(zhì)合成體系中翻譯權(quán)利要求24中所描述的RNA分子，其中所述RNA分子包含開(kāi)放閱讀框， 所述條件有助于將所述RNA分子的所述開(kāi)放閱讀框翻譯成由所述開(kāi)放閱讀框所編碼的蛋 白質(zhì)或肽。
27.用于在體內(nèi)合成蛋白質(zhì)或肽的方法，所述方法包括在這樣的條件下將權(quán)利要求24 中所描述的RNA分子引入細(xì)胞中，其中所述RNA分子包含開(kāi)放閱讀框，所述條件有助于將所 述RNA分子的所述開(kāi)放閱讀框翻譯成由所述開(kāi)放閱讀框所編碼的蛋白質(zhì)或肽。
28.權(quán)利要求21中所描述的組合物；其中η是3并且所述組合物包含β-硫代磷酸基 團(tuán)，或者其中η是4并且所述組合物包含Y-硫代磷酸基團(tuán)；并且其中所述組合物在生理?xiàng)l 件下不被Dcp2水解。
29.權(quán)利要求21中所描述的組合物；其中η是3并且所述組合物包含Y-硫代磷酸基 團(tuán)，或者其中η是4并且所述組合物包含δ-硫代磷酸基團(tuán)；并且其中所述組合物在生理?xiàng)l 件下不被DcpS水解，和所述組合物抑制帽依賴性翻譯。
30.用于在體內(nèi)合成蛋白質(zhì)或肽的方法，所述方法包括在這樣的條件下將其5'末端 摻入有權(quán)利要求28中所描述的組合物的RNA分子引入細(xì)胞中，其中所述RNA分子包含開(kāi)放 閱讀框，所述條件有助于將所述RNA分子的所述開(kāi)放閱讀框翻譯成由所述開(kāi)放閱讀框所編 碼的蛋白質(zhì)或肽；其中該體內(nèi)翻譯速率為從其中每個(gè)Y是氧原子和其中沒(méi)有Y是硫原子的 在其他方面相同的方法之中將能夠獲得的體內(nèi)翻譯速率的至少兩倍。
31.組合物，其包含 其中每個(gè)Y選自O(shè)和S;各個(gè)Y可以是相同的或不同的；和至少一個(gè)Y是S ；η是3或4 ；B選自鳥(niǎo)嘌呤、腺嘌呤、尿苷、胞嘧啶；和X選自甲基、乙基、丙基、丁基、芐基、經(jīng)取代的芐基、萘基甲基、經(jīng)取代的萘基甲基、以及 經(jīng)取代或未取代的Cl至ClO脂肪族或芳香族基團(tuán)。
32.權(quán)利要求31中所描述的組合物，其中所述組合物基本上由單種立體異構(gòu)體組成。
33.權(quán)利要求31中所描述的組合物，其中所述組合物包含至少兩種非對(duì)映異構(gòu)體，第一非對(duì)映異構(gòu)體和第二非對(duì)映異構(gòu)體，的混合物；其中除了所述第一和第二非對(duì)映異構(gòu)體 在手性磷原子處具有不同的立體化學(xué)構(gòu)型外，所述第一和第二非對(duì)映異構(gòu)體在其他方面是 相同的；其中所述手性磷原子是與硫原子結(jié)合的磷原子。
34.RNA分子，其5'末端摻入有權(quán)利要求31的組合物。
35.用于在體外合成權(quán)利要求34中所描述的RNA分子的方法，所述方法包括使ATP、 CTP、UTP、GTP、所描述的組合物和多核苷酸模板，在RNA聚合酶存在下，在有助于所述RNA聚 合酶將所述多核苷酸模板轉(zhuǎn)錄成RNA拷貝的條件下進(jìn)行反應(yīng)；由此所述RNA拷貝中的一些 將會(huì)摻入有所描述的組合物，從而產(chǎn)生所描述的RNA分子。
36.用于在體外合成蛋白質(zhì)或肽的方法，所述方法包括在這樣的條件下在無(wú)細(xì)胞蛋白 質(zhì)合成體系中翻譯權(quán)利要求34中所描述的RNA分子，其中所述RNA分子包含開(kāi)放閱讀框， 所述條件有助于將所述RNA分子的所述開(kāi)放閱讀框翻譯成由所述開(kāi)放閱讀框所編碼的蛋 白質(zhì)或肽。
37.用于在體內(nèi)合成蛋白質(zhì)或肽的方法，所述方法包括在這樣的條件下將權(quán)利要求34 中所描述的RNA分子引入細(xì)胞中，其中所述RNA分子包含開(kāi)放閱讀框，所述條件有助于將所 述RNA分子的所述開(kāi)放閱讀框翻譯成由所述開(kāi)放閱讀框所編碼的蛋白質(zhì)或肽。
38.權(quán)利要求31中所描述的組合物；其中η是3并且所述組合物包含β-硫代磷酸基 團(tuán)，或者其中η是4并且所述組合物包含Y-硫代磷酸基團(tuán)；并且其中所述組合物在生理?xiàng)l 件下不被Dcp2水解。
39.權(quán)利要求31中所描述的組合物；其中η是3并且所述組合物包含Y-硫代磷酸基 團(tuán)，或者其中η是4并且所述組合物包含δ-硫代磷酸基團(tuán)；并且其中所述組合物在生理?xiàng)l 件下不被DcpS水解，和所述組合物抑制帽依賴性翻譯。
40.用于在體內(nèi)合成蛋白質(zhì)或肽的方法，所述方法包括在這樣的條件下將其5'末端 摻入有權(quán)利要求38中所描述的組合物的RNA分子引入細(xì)胞中，其中所述RNA分子包含開(kāi)放 閱讀框，所述條件有助于將所述RNA分子的所述開(kāi)放閱讀框翻譯成由所述開(kāi)放閱讀框所編 碼的蛋白質(zhì)或肽；其中該體內(nèi)翻譯速率為從其中每個(gè)Y是氧原子和其中沒(méi)有Y是硫原子的 在其他方面相同的方法之中將能夠獲得的體內(nèi)翻譯速率的至少兩倍。
41.組合物，其包含 其中每個(gè)Y選自O(shè)和S ；各個(gè)Y可以是相同的或不同的；和至少一個(gè)Y是S ；和η是3或4 ；和X選自甲基、乙基、丙基、丁基、芐基、經(jīng)取代的芐基、萘基甲基、經(jīng)取代的萘基甲基、以及 經(jīng)取代或未取代的Cl至ClO脂肪族或芳香族基團(tuán)；各個(gè)X可以是相同的或不同的。
42.權(quán)利要求41中所描述的組合物，其中所述組合物基本上由單種立體異構(gòu)體組成。
43.權(quán)利要求41中所描述的組合物，其中所述組合物包含至少兩種非對(duì)映異構(gòu)體，第 一非對(duì)映異構(gòu)體和第二非對(duì)映異構(gòu)體，的混合物；其中除了所述第一和第二非對(duì)映異構(gòu)體 在手性磷原子處具有不同的立體化學(xué)構(gòu)型外，所述第一和第二非對(duì)映異構(gòu)體在其他方面是 相同的；其中所述手性磷原子是與硫原子結(jié)合的磷原子。
44.RNA分子，其5'末端摻入有權(quán)利要求41的組合物。
45.用于在體外合成權(quán)利要求44中所描述的RNA分子的方法，所述方法包括使ATP、 CTP、UTP、GTP、所描述的組合物和多核苷酸模板，在RNA聚合酶存在下，在有助于所述RNA聚 合酶將所述多核苷酸模板轉(zhuǎn)錄成RNA拷貝的條件下進(jìn)行反應(yīng)；由此所述RNA拷貝中的一些 將會(huì)摻入有所描述的組合物，從而產(chǎn)生所描述的RNA分子。
46.用于在體外合成蛋白質(zhì)或肽的方法，所述方法包括在這樣的條件下在無(wú)細(xì)胞蛋白 質(zhì)合成體系中翻譯權(quán)利要求44中所描述的RNA分子，其中所述RNA分子包含開(kāi)放閱讀框， 所述條件有助于將所述RNA分子的所述開(kāi)放閱讀框翻譯成由所述開(kāi)放閱讀框所編碼的蛋 白質(zhì)或肽。
47.用于在體內(nèi)合成蛋白質(zhì)或肽的方法，所述方法包括在這樣的條件下將權(quán)利要求44 中所描述的RNA分子引入細(xì)胞中，其中所述RNA分子包含開(kāi)放閱讀框，所述條件有助于將所 述RNA分子的所述開(kāi)放閱讀框翻譯成由所述開(kāi)放閱讀框所編碼的蛋白質(zhì)或肽。
48.權(quán)利要求41中所描述的組合物；其中η是3并且所述組合物包含β-硫代磷酸基 團(tuán)，或者其中η是4并且所述組合物包含Y-硫代磷酸基團(tuán)；并且其中所述組合物在生理?xiàng)l 件下不被Dcp2水解。
49.權(quán)利要求41中所描述的組合物；其中η是3并且所述組合物包含Y-硫代磷酸基 團(tuán)，或者其中η是4并且所述組合物包含δ-硫代磷酸基團(tuán)；并且其中所述組合物在生理?xiàng)l 件下不被DcpS水解，和所述組合物抑制帽依賴性翻譯。
50.用于在體內(nèi)合成蛋白質(zhì)或肽的方法，所述方法包括在這樣的條件下將其5'末端 摻入有權(quán)利要求48中所描述的組合物的RNA分子引入細(xì)胞中，其中所述RNA分子包含開(kāi)放 閱讀框，所述條件有助于將所述RNA分子的所述開(kāi)放閱讀框翻譯成由所述開(kāi)放閱讀框所編 碼的蛋白質(zhì)或肽；其中該體內(nèi)翻譯速率為從其中每個(gè)Y是氧原子和其中沒(méi)有Y是硫原子的 在其他方面相同的方法之中將能夠獲得的體內(nèi)翻譯速率的至少兩倍。
51.組合物，其包含 其中每個(gè)Y選自O(shè)和S ；各個(gè)Y可以是相同的或不同的；和至少一個(gè)Y是S ；和η是3或4。
52.權(quán)利要求51中所描述的組合物，其中所述組合物基本上由單種立體異構(gòu)體組成。
53.權(quán)利要求51中所描述的組合物，其中所述組合物包含至少兩種非對(duì)映異構(gòu)體，第 一非對(duì)映異構(gòu)體和第二非對(duì)映異構(gòu)體，的混合物；其中除了所述第一和第二非對(duì)映異構(gòu)體 在手性磷原子處具有不同的立體化學(xué)構(gòu)型外，所述第一和第二非對(duì)映異構(gòu)體在其他方面是 相同的；其中所述手性磷原子是與硫原子結(jié)合的磷原子。
54.RNA分子，其5'末端摻入有權(quán)利要求51的組合物。
55.用于在體外合成權(quán)利要求54中所描述的RNA分子的方法，所述方法包括使ΑΤΡ、 CTP、UTP、GTP、所描述的組合物和多核苷酸模板，在RNA聚合酶存在下，在有助于所述RNA聚 合酶將所述多核苷酸模板轉(zhuǎn)錄成RNA拷貝的條件下進(jìn)行反應(yīng)；由此所述RNA拷貝中的一些 將會(huì)摻入有所描述的組合物，從而產(chǎn)生所描述的RNA分子。
56.用于在體外合成蛋白質(zhì)或肽的方法，所述方法包括在這樣的條件下在無(wú)細(xì)胞蛋白 質(zhì)合成體系中翻譯權(quán)利要求54中所描述的RNA分子，其中所述RNA分子包含開(kāi)放閱讀框， 所述條件有助于將所述RNA分子的所述開(kāi)放閱讀框翻譯成由所述開(kāi)放閱讀框所編碼的蛋 白質(zhì)或肽。
57.用于在體內(nèi)合成蛋白質(zhì)或肽的方法，所述方法包括在這樣的條件下將權(quán)利要求54 中所描述的RNA分子引入細(xì)胞中，其中所述RNA分子包含開(kāi)放閱讀框，所述條件有助于將所 述RNA分子的所述開(kāi)放閱讀框翻譯成由所述開(kāi)放閱讀框所編碼的蛋白質(zhì)或肽。
58.權(quán)利要求51中所描述的組合物；其中η是3并且所述組合物包含β-硫代磷酸基 團(tuán)，或者其中η是4并且所述組合物包含Y-硫代磷酸基團(tuán)；并且其中所述組合物在生理?xiàng)l 件下不被Dcp2水解。
59.權(quán)利要求51中所描述的組合物；其中η是3并且所述組合物包含Y-硫代磷酸基 團(tuán)，或者其中η是4并且所述組合物包含δ-硫代磷酸基團(tuán)；并且其中所述組合物在生理?xiàng)l 件下不被DcpS水解，和所述組合物抑制帽依賴性翻譯。
60.用于在體內(nèi)合成蛋白質(zhì)或肽的方法，所述方法包括在這樣的條件下將其5'末端 摻入有權(quán)利要求58中所描述的組合物的RNA分子引入細(xì)胞中，其中所述RNA分子包含開(kāi)放 閱讀框，所述條件有助于將所述RNA分子的所述開(kāi)放閱讀框翻譯成由所述開(kāi)放閱讀框所編 碼的蛋白質(zhì)或肽；其中該體內(nèi)翻譯速率為從其中每個(gè)Y是氧原子和其中沒(méi)有Y是硫原子的在其他方面相同的方法之中將能夠獲得的體內(nèi)翻譯速率的至少兩倍。
61.組合物，其包含一種或多種選自下列的化合物m/’2'-0GpPsPG ；m27'3' _°GppspG ； m27，2 ‘ "°GpppspG ；m27，3 "0GpppspG ；m27，2 ‘ °GppsppG ；m27，3 ‘ °GppsppG ；m27，2 ‘ "°GpspspG ； m27，3 ‘ "°GpspspG ；m27，2 ‘ °GppspsG ；m27，3 ‘ °GppspsG ；bn7m2 ‘ °GppspG ；bn7m3 ‘ °GppspG ； bn7m2 ‘ "°GpppspG ；bn7m3/ "°GpppspG ；bn7m2/ °GppsppG ；bn7m3/ °GppsppG ；bn7m2/ "°GpspspG ； bn7m3' -OGpspspG ；bn7m2/ °GppspsG ；禾口 bn7m3/ —0GppspsGo
62.權(quán)利要求61中所描述的組合物，其中所述組合物基本上由所述化合物之一的單種 立體異構(gòu)體組成。
63.權(quán)利要求61中所描述的組合物，其中所述組合物包含所述化合物之一的至少兩種 非對(duì)映異構(gòu)體，第一非對(duì)映異構(gòu)體和第二非對(duì)映異構(gòu)體，的混合物；其中除了所述第一和第 二非對(duì)映異構(gòu)體在手性磷原子處具有不同的立體化學(xué)構(gòu)型外，所述第一和第二非對(duì)映異構(gòu) 體在其他方面是相同的；其中所述手性磷原子是與硫原子結(jié)合的磷原子。
64.RNA分子，其5'末端摻入有權(quán)利要求61的組合物。
65.用于在體外合成權(quán)利要求64中所描述的RNA分子的方法，所述方法包括使ATP、 CTP、UTP、GTP、所描述的組合物和多核苷酸模板，在RNA聚合酶存在下，在有助于所述RNA聚 合酶將所述多核苷酸模板轉(zhuǎn)錄成RNA拷貝的條件下進(jìn)行反應(yīng)；由此所述RNA拷貝中的一些 將會(huì)摻入有所描述的組合物，從而產(chǎn)生所描述的RNA分子。
66.用于在體外合成蛋白質(zhì)或肽的方法，所述方法包括在這樣的條件下在無(wú)細(xì)胞蛋白 質(zhì)合成體系中翻譯權(quán)利要求64中所描述的RNA分子，其中所述RNA分子包含開(kāi)放閱讀框， 所述條件有助于將所述RNA分子的所述開(kāi)放閱讀框翻譯成由所述開(kāi)放閱讀框所編碼的蛋 白質(zhì)或肽。
67.用于在體內(nèi)合成蛋白質(zhì)或肽的方法，所述方法包括在這樣的條件下將權(quán)利要求64 中所描述的RNA分子引入細(xì)胞中，其中所述RNA分子包含開(kāi)放閱讀框，所述條件有助于將所 述RNA分子的所述開(kāi)放閱讀框翻譯成由所述開(kāi)放閱讀框所編碼的蛋白質(zhì)或肽。
全文摘要
公開(kāi)了新的RNA帽類(lèi)似物，其包含一個(gè)或多個(gè)硫代磷酸基團(tuán)。所述類(lèi)似物還在7-甲基鳥(niǎo)苷的2’-O位置處包含修飾，其防止它們?cè)趍RNA的體外合成過(guò)程中以相反的方向摻入，并因此是“抗-反向帽類(lèi)似物”(anti-reverse cap analog，ARCA)。所述ARCA修飾確保，S原子在翻譯和脫帽機(jī)器中都準(zhǔn)確地定位在帽結(jié)合蛋白的活性位點(diǎn)內(nèi)。所述新的S-ARCA類(lèi)似物對(duì)于體內(nèi)脫帽酶具有抗性。有些S-ARCA具有相比于不包含硫代磷酸基團(tuán)的相應(yīng)類(lèi)似物而言更高的對(duì)于eIF4E的親和力。當(dāng)將包含各種S-ARCA的mRNA引入培養(yǎng)的細(xì)胞中時(shí)，有些mRNA以相比于用常規(guī)類(lèi)似物m7GpppG合成的mRNA而言高至五倍的程度有效地進(jìn)行翻譯。
文檔編號(hào)C07H19/207GK101855231SQ200880102959
公開(kāi)日2010年10月6日 申請(qǐng)日期2008年6月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月19日
發(fā)明者E·M·戈魯?shù)络鞫?諾加爾斯卡, E·達(dá)琴奇維克孜, J·克瓦爾斯卡, J·杰米利迪, R·E·羅德斯 申請(qǐng)人:路易斯安那州州立大學(xué)及農(nóng)業(yè)機(jī)械學(xué)院管理委員會(huì);華沙大學(xué)