專利名稱：重組的北美1型豬繁殖與呼吸綜合征病毒及使用方法
技術領域：
本申請涉及分子病毒學領域，更具體地，涉及編碼豬繁殖與呼吸綜合征病毒 (PRRSV)的重組核酸的構建。
背景豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是世界范圍內最具經濟意義的豬的疾病。其通過母 豬的晚期生殖失敗以及仔豬的嚴重肺炎來表征。PRRS病毒(PRRSV)由兩種主要的基因型 歐洲基因型(1型)和北美基因型(2型)組成，每種基因型以前分布在不同的大陸上。近 期，1型PRRSV分離株(北美1型)已經在美國豬群中被鑒定。這組病毒具有和典型的北 美型和歐洲型PRRSV明顯不同的獨特的抗原特性和遺傳特性。在Nsp2的免疫顯性區(qū)中鑒 定了特有的51bp的缺失。PRRS的病原體是含有單股正鏈RNA基因組的小的有包膜病毒。 PRRSV屬于動脈炎病毒科(Arteriviridae)，該科包括馬動脈炎病毒(EAV)、乳酸脫氫酶增 高病毒(LDV)以及猴出血熱病毒(SHFV) (Snijder&Meulenberg，1998)。核苷酸序列比較顯 示PRRSV可分為不同的歐洲(1型)基因型和北美(2型)基因型(Allende等，1999 ；Nelson 等，1999)。PRRSV基因組長度為約15kb，并包含九個開放讀碼框?；蚪M的3，端編碼四個膜 締合性糖蛋白(GP2a、GP3、GP4和GP5 ；由sg mRNA 2_5編碼)，兩個非糖基化的膜蛋白(E和 M;由sg mRNA 2和6編碼)，以及一個核殼蛋白(N;由sg mRNA7編碼)(Bautista等，1996 ； Mardassi 等，1996 ;Meng 等，1996 ;Meulenberg&den Besten, 1996 ；Meulenberg 等；1995 ； Mounir等，1995 ；Wu等，2001，2005)。復制酶相關的基因，即ORFla和ORFlb，位于基因組的 5，端，其代表病毒基因組的近75%。預測ORF Iab編碼的多蛋白pplab在12個位點切割 形成 13 個產物:nspl α、nspl β，以及 nsp2 到 nspl2 (AlIende 等，1999 ；den Boon 等，1995 ； Nelsen 等，1999 ；Sni jder&Meulenberg, 1998)。針對PRRSV的改造的減毒疫苗目前可用于減少PRRSV相關的臨床疾病 (Boehringer-Ingelheim Animal Health, Inc.)。然而，它們無法在血清學上區(qū)分自然感 染痊愈的豬和已經接種疫苗的豬。遺傳標記的疫苗將允許區(qū)分接種疫苗的豬和自然感染的 豬，這是控制和消除PRRSV項目所需要的。概述重組的豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)在開放讀碼框(ORF) Ia中包括一個或多 個突變，所述突變使得重組的PRRSV不能產生對應于ORFla的至少一種功能性多肽。所述 突變可能是缺失。缺失可發(fā)生在nsp2區(qū)域中，并可包括表位ES4。在一實施方案中，缺失包 括ORFla的736-790位氨基酸。所述突變可包括異源DNA序列的插入。插入可在ORFla的 733位氨基酸和734位氨基酸之間。所述插入可包括綠色熒光蛋白(GFP)。重組的北美PRRS病毒由分離的多聚核苷酸分子編碼，此分子包括編碼感染性RNA 分子的DNA序列，該感染性RNA分子編碼北美PRRS病毒，并且所述DNA序列是SEQ ID NO 43或其同源序列。
疫苗包括在ORFla中具有突變的PRRSV突變體，該突變使得所述PRRSV突變體不 能產生功能性ORFla多肽，并且所述疫苗包括藥學可接受的運載體。所述突變可包括nsp2 區(qū)域中的缺失，如nsp2區(qū)域中736-790位氨基酸的缺失。所述突變可包括異源DNA序列的 插入。所述插入可以在nsp2區(qū)域中的733位氨基酸和734位氨基酸之間。試劑盒包括疫苗，該疫苗包括在ORFla中具有突變的PRRSV突變體和藥學可接受 的運載體，該突變使得所述PRRSV突變體不能產生功能性ORFla多肽，所述突變包括異源 DNA序列的插入。所述試劑盒還包括一種或多種第一多肽，該第一多肽由所述異源DNA序列 編碼，以及一種或多種第二多肽，該第二多肽由所述功能性ORFla編碼。PRRSV疫苗中的突 變可以是在nsp2區(qū)域中比如在ES4表位中的缺失，并且所述一種或多種第一多肽包括GFP， 且所述一種或多種第二多肽包括ES4表位。提供區(qū)分接種PRRSV標記疫苗的動物和自然感染PRRSV的動物的方法，其中所述 PRRSV標記疫苗包括插入突變和缺失突變。此方法包括以下步驟提供包括插入突變的第 一重組PRRSV蛋白，提供包括缺失突變的第二重組PRRSV蛋白，用第一重組PRRSV蛋白和 第二重組PRRSV蛋白孵育來自動物的血清樣品，并檢測樣品中的抗體與第一重組PRRSV蛋 白和第二重組PRRSV蛋白的結合。樣品中的抗體與第一重組PRRSV蛋白的結合指示接種疫 苗的動物，而樣品中的抗體與第二重組PRRSV蛋白的結合指示自然感染的動物。第一重組 PRRSV蛋白可包括GFP插入，而第二重組PRRSV蛋白可包括ES4缺失。附圖簡述

圖1是PRRSV基因組和克隆策略的示意圖。圖2A-2F顯示旨在檢查感染性克隆pSDOl-OS感染力的免疫熒光分析的結果。圖3是顯示克隆病毒、親本病毒和表達GFP的病毒的生長動力學的圖。圖4顯示克隆病毒和親本病毒SD01-08的RT-PCR產物的限制性內切核酸酶片段 模式。圖5A和5B是顯示克隆病毒的體內表征的圖。圖6A-6C顯示旨在檢查表達GFP的PRRSV的免疫熒光分析的結果。圖7是pSD01-08-GFP構建體的示意圖。圖8是pSD01-08_GFP/AES4構建體的示意圖。圖9是顯示GFP/Δ ES4標記病毒生長動力學的圖。圖10顯示GFP/ Δ ES4標記病毒和親本病毒的噬斑形態(tài)。圖11顯示GFP表達的穩(wěn)定性。圖12顯示野生型GFP基因和Arg_97突變的GFP基因的比較。圖13是顯示GFP/AES4標記病毒的體內特性的圖。圖14A-14C是顯示GFP/AES4標記病毒的病毒學和免疫學性質的圖。圖15A-15C顯示基于GFP和ES4表位的ELISA結果。詳述開發(fā)了北美1型PRRSV分離株的全長cDNA克隆SD01-08。SD01-08與Lelystad病 毒相比時在核苷酸水平上擁有94. 同一性(GenBank登錄號DQ489311)。SD01-08和LV 之間的重要區(qū)別是在PAM和猴腎臟細胞中的生長性質。Meulenberg等人(15)報告的結果顯示野生型和克隆的LV病毒在PAM中生長良好，但在MA-104來源的細胞系CL2621中低水 平生長。親本和克隆的SDO1-08在PAM和MARC-145細胞中生長一致良好，MARC-145細胞是 另外一種MA-104來源的細胞系。SD01-08克隆病毒的效價在48hpi時達到峰值，而此時LV 克隆病毒生長至較低效價甚至在96hpi時仍未達到峰值。因此，SD01-08感染性克隆在連 續(xù)的細胞系中良好復制。LV和SD01-08之間的另外一個不同是在毒性水平上。在PAM中， LV克隆病毒達到IO71至107_9TCID5ciAil的高效價并在大約32hpi時達到峰值。SD01-08克 隆病毒在PAM中達到了和其親本病毒相同的效價，但是它們二者的效價都低于LV的效價， 僅達到了約104TCID5(1/ml，并且在稍后約72hpi時達到峰值。這一結果顯示SD01-08克隆病 毒的毒性弱于LV克隆病毒。實地(field)觀測和實驗動物攻擊研究支持此結論。SD01-08 不引發(fā)顯著的臨床病征，并且在實驗感染的豬中僅觀察到輕微的病理損傷。相反，據報道LV 引發(fā)豬的顯著呼吸道問題和母豬的流產(34)。 感染性克隆的主要應用之一是用其作為構建遺傳工程疫苗的病毒骨架。美國目前 的PRRSV疫苗主要針對北美2型分離株。北美1型PRRSV的出現(xiàn)要求疫苗對PRRSV的兩種 基因型都有效。任何活病毒疫苗的基本要求是低毒性，不引發(fā)或者至多引發(fā)極輕微的疾病 表現(xiàn)癥狀。親本病毒SD01-08是從沒有顯示臨床病征的豬群中分離得到的。發(fā)病機理研究 證實了 SD01-08在疾病急性期擁有低毒特性，這就表明PSD01-08感染性克隆是可能的低毒 性株系并且適合疫苗構建。開發(fā)疫苗的關鍵步驟之一是包括用于診斷區(qū)分接種疫苗的動物和自然感染野生 型病毒動物的標記。標記疫苗對于致力于控制或者消除食用動物和伴侶動物的病毒感染 的項目是重要的(Babiuk，1999 ;Babiuk 等，1999，2002 ;van Oirschot，2001)。皰疹病毒標 記疫苗是首批被證實在實地有效的疫苗之一(Bosch等，1996 ；van Oirschot等，1996)，隨 后有各種遺傳修飾的RNA病毒，如典型性豬瘟病毒(Widjojoatmodjo等，2000 ；van Gennip 等，2002)和牛瘟病毒(Walsh等，2000)。在根除EAV項目中，因為馬被廣泛用于國際貿 易和交通，標記疫苗是一些立法機構所需要的。區(qū)分疫苗接種和感染正成為主流論點 (Castillo-Olivares等，2003)。同樣的，在根除PRRSV項目中，生豬和豬肉的國際貿易未來 也將可能需要標記疫苗。此外，隨著世界日益走向PRRSV的消除，血清監(jiān)測是核實疾病狀況 的基本工具。目前有效的常規(guī)疫苗無法區(qū)分野生型感染和疫苗接種。因此，血清監(jiān)測在面 臨疫苗接種時或者疫苗接種結束幾個月后是無法進行的。明顯地，標記疫苗將會有很大優(yōu) 勢。北美1型PRRSV的感染性克隆pSD01-08被用于產生重組的PRRSV。和歐洲 Lelystad病毒(LV)感染性克隆相比，pSD01_08具有幾個明顯的生物學特性(1)pSD01_08 感染性克隆來源于2001年美國分離的親本株系，該親本株系代表北美1型PRRSV; (2)親本 株系SD01-08是從8周大的顯示無臨床病征的豬群中分離得到的；并且(3)SD01-08在Nsp2 的免疫顯性區(qū)域中具有特有的51bp的缺失(Fang等，2004)。nsp2在病毒復制中發(fā)揮作用。nsp2含有位于N末端的半胱氨酸蛋白酶結構域。這 一結構域誘導nsp2/3切割，并且還作為輔因子和nsp4絲氨酸蛋白酶一起加工其他切割產 物(Snijder 等，1994，1995 ；Wassenaar 等，1997)。除了在病毒復制中的作用外，EAV和I3RRSV nsp2的半胱氨酸蛋白酶顯示屬于卵巢瘤(OTU)蛋白酶超家族。OTU蛋白酶能夠把泛素和ISG 15從細胞蛋白上解離下來，從而抑制Ub-和ISG15-依賴的先天免疫應答(Frias-Staheli等，2007)。
標記疫苗的開發(fā)是基于操作cDNA感染性克隆，其中可插入外源抗原(正標記) 或者可缺失產生免疫原性表位(負標記)。針對外源抗原或者病毒表位的抗體應答可被用 于區(qū)分接種疫苗的動物和自然感染的動物。PRRSV nsp2是用于標記改造的優(yōu)秀的候選位 點。和標記工程相關的最重要的nsp2性質是nsp2耐受大的缺失和插入的能力。已報道 了蛋白質中心區(qū)內的核苷酸序列插入/缺失(Gao等，2004 ；Shen等，2000 ；Tian等，2007 ； Han等，2007)。與標記工程相關的另一性質是在這個區(qū)域中幾個免疫顯性表位的存在。丹 麥1型病毒的nsp2區(qū)域中有六個線性B-細胞表位位點(ES) (ES2到ES7)已被鑒定出來 (Oleksiewicz等，2001)。在2型病毒中，發(fā)現(xiàn)nsp2與結構蛋白相比時含有免疫顯性表位的 頻率最高(de Lima等，2006)。制備了在美國1型PRRSV感染性克隆的nsp2區(qū)域中的標記修飾。正標記GFP 被插入到nsp2區(qū)域，但是GFP基因不穩(wěn)定。隨后，位于nsp2區(qū)域中的高度免疫原性表位 ES4 (ORFla的736到790位氨基酸)被缺失然后用反向遺傳學置換入GFP基因(位于ORFla 的733/734位氨基酸)來構建負標記。表征得到的重組病毒的體外復制特征和體內生物學 特性，以確定其作為標記疫苗抗PRRSV感染的潛在用途。測試基于GFP抗原和基于ES4肽 抗原的ELISA，以確定它們作為標記檢測和區(qū)分的伴隨診斷分析的靈敏性和特異性。I.正標記 GFP細胞和病毒。北美1型PRRSV分離株SD01-08最早在2001年從美國的8周大的豬 群中分離得到，這個豬群沒有表現(xiàn)出PRRS的臨床病征。為從體外轉錄的RNA中復原病毒， 幼倉鼠腎細胞(BHK-21C 13 美國典型培養(yǎng)物保藏中心)被用于起始的轉染。MARC-145細 胞被用于病毒拯救和后續(xù)的實驗(Fang等，2006)。豬肺泡巨噬細胞(PAM)通過對無特異病 原體無PRRSV的仔豬進行肺灌洗獲得。RNA提取、RT-PCR和測序用MOI接近0. 1的噬斑純化的病毒感染MARC-145細胞。 三天后，將培養(yǎng)物上清液層放在0. 5M蔗糖墊上，以100，OOOxg在SW41轉頭(Beckman)中離 心14小時。使用QIAamp病毒RNA試劑盒(Qiagen)從沉淀中提取RNA。為獲得親本病毒 SDO1-08的全長基因組序列，使用一系列引物進行RT-PCR(Ropp等，2004)。每個RT-PCR產 物直接從兩個方向測序至少2次以獲得共有序列。為構建感染性的克隆，通過RT-PCR擴增 側翼于獨特限制性酶位點的覆蓋全長病毒基因組的9個重疊片段(圖1)。RT-PCR擴增所 用正向和反向寡核苷酸最開始依據LV序列(GenBank登錄號M96262 ； 18)而設計，后來修改 為和SD01-08序列(表1)相匹配。進行RT-PCR(Fang等，2004)。這些RT-PCR擴增的片段 通過凝膠純化，并克隆入PCR-Blimt II-Topo載體(Invitrogen)。每個片段的三個克隆被 測序，并將含有共有序列的克隆用于感染性克隆的裝配。表1 ·用于RT-PCR擴增的引物
*為產生Seal限制性酶位點而突變的核苷酸為粗斜體。按照生產商的說明書，使用GeneRACER試劑盒(Invitrogen)確定基因組序列的5’ 和3，端。通過使用引物ElGF和E2968R(表1)的RT-PCR制備代表病毒基因組5，末端的 片段，所述片段在緊接真實的5’末端核苷酸前整合T7RNA聚合酶位點和Ascl限制性酶位 點。包含3’端序列的片段通過使用引物018聚腺苷酸對RNA進行反轉錄而構建，該片段的 側翼為41個聚腺苷酸殘基和Xbal位點。反轉錄反應之后用引物E14059F和0183’ R(表 1)進行PCR。北美1型PRRSV全長cDNA克隆的構建及其感染力的確定。北美1型PRRSV的全 長基因組cDNA克隆pSDOl-OS使用圖1所示策略進行構建。通過用填充片段置換BamHl 和Bgll位點之間的片段改造低拷貝數(shù)質粒pACYC177 (GenBank登錄號X06402)，該填充 片段制備為含有圖1所示的限制性酶位點的合成基因。使用限制性酶將每個病毒片段從 PCR-BluntII-Topo上切下并連入使用同樣的限制性酶消化的pACYC177質粒。每一個連接 步驟之后，將PACYC177構建體轉化進大腸桿菌(E.C0li)DH5a細胞，并于37°C在卡那霉素 存在下培養(yǎng)過夜。對完整裝配的全長cDNA克隆進行測序，并將全長基因組序列以登錄號 DQ489311 保存于 GenBank。為生成Seal限制性酶位點，使用位點定向誘變在0RF7的42位核苷酸(SD01-08基 因組的14588位核苷酸)生成沉默突變(G到T突變)。位點定向誘變通過重疊延伸PCR技術 (Ho 等，1989 Jespersen 等，1997)實現(xiàn)，使用了 引物對 E14059F/ScalR 和 ScalF/YFp503R。 通過DNA測序分析確認突變產物。
此構建體包含位于病毒基因組5’末端的噬菌體T7RNA聚合酶啟動子、一個被引入 到T7啟動子和病毒基因組第一個核苷酸之間的額外的鳥嘌呤核苷殘基、SD 01-08的15047 個核苷酸的全長基因組和并入到基因組的3’端的41殘基的聚腺苷酸尾。與親本病毒的基 因組序列相比，PSD01-08的DNA序列包含6個核苷酸差異(表2)。表2.親本SD 01-08分離株和全長cDNA克隆之間的核苷酸差異。 這些差異中的四個是沉默突變。引入14588位核苷酸的突變以在0RF7中生成用于 區(qū)分克隆病毒和親本病毒的獨特的Seal限制性酶位點。核苷酸突變中有兩個導致氨基酸 變化，包括位于NsplO的9492位核苷酸的C到T的取代(氨基酸P到L)，以及位于Nspll 的11261位核苷酸的T到C的取代(氨基酸Y到H)。pSDOl-OS質粒通過限制性酶Xbal線性化，并用于通過T7 RNA聚合酶的體外轉錄 來合成加帽的RNA。將體外轉錄的加帽RNA轉染入BHK-21細胞。轉染后48小時，通過使 用mAb SDOffl7的熒光抗體染色來檢查細胞的N蛋白的表達(圖2A)。圖2A的結果顯示約 5%的轉染細胞表達N蛋白。將來自轉染細胞的上清液在MARC-145細胞上傳代。72小時 后，使用 SD01-08 特異性抗-Nsp2mAb ES3-458-46 (圖 2B)，和抗-N mAbSD0W17 (圖 2C)對 MARC-145細胞進行染色。包括北美2型PRRSV特異性抗_N mAb MR39 (圖2D)作為負對照。 結果顯示在使用來自PSD01-08轉染的BHK-21細胞的上清液接種的MARC-145細胞中，Nsp2 和N蛋白二者均被檢測到。進一步將上清液在新鮮的MARC-145細胞上傳代時(MARC-145 細胞上的第2代)，感染后48到72小時(hpi)內觀察到細胞病變效應(CPE)。對MARC-145 細胞上的第2代病毒的滴定顯示平均效價為3. 6 X 107FFU/ml。這些結果表明從使用體外轉 錄的RNA轉染的細胞中拯救了有活力且具感染力的北美1型PRRSV。GFP插入通過將GFP基因序列(Clontech)插入質粒pSD01-08中病毒基因組的 Nsp2區(qū)域(核苷酸2420/2421)構建pSDO 1-08-GFP克隆。用正向引物gfpF和反向引物gfpR 從pEGFP-Nl質粒(Clontech)中擴增GFP基因。使用引物對Nsp2Fl/Nsp2Rl和Nsp2F2/ Nsp2R2通過重疊延伸PCR技術(Ho等，1989，Jesperson等，1997)插入GFP。PCR產物使用 Rsrll和Acll限制性酶消化，并連入用相同限制性酶消化的PSD01-08質粒中。PRRSV的體外轉錄和拯救質粒pSD 01-08或者pSD01-08-GFP用限制性酶Xbal線性化。使用mMessage Machine試劑盒(Ambion)用T7 RNA聚合酶轉錄加帽的RNA，并按照生產商說明書使用DMRIE-C試劑(Invitrogen)將所述加帽的RNA轉染至BHK-21細胞。 為了拯救病毒，將轉染后48小時獲得的細胞培養(yǎng)物上清液在MARC-145細胞上連續(xù)傳代。 感染性病毒的拯救通過間接的免疫熒光分析(IFA) (Ropp等，2004)來確認。開發(fā)單克隆抗 體(MAb)用于 IFA 檢測，包括特異識別 SD01-08 的 Nsp2 的 MAb ES3-458-46 (Fang 等，Conf. Res. Work. Anim, Dis.，abstr. 78，2004)。MAb MR39 特異性識別北美 2 型 PRRSV 的 N 蛋白， 而MAbSD0W17識別兩個基因型的PRRSV的N蛋白(Nelson等，1993 ；Ropp等，2004)。針對 GFP病毒的拯救，GFP的表達也使用熒光顯微鏡直接目測。通過使用MOI為0. 1的克隆病毒和親本病毒感染MARC-145細胞來檢查生長動力 學。在感染后0、6、12、24、36、48、60和72小時收集被感染細胞，通過對嫩此-145細胞的正八 確定病毒的效價并按每毫升的熒光灶單位(fluorescent focus unit per ml, FFU/ml)定 量。通過對MARC-145細胞進行噬斑分析來比較克隆病毒和親本病毒的噬斑形態(tài)。以0. IMOI 的病毒感染匯合的細胞單層。兩小時后，除去細胞培養(yǎng)物上清液，并加上瓊脂覆蓋層。37°C 下5天后，檢測噬斑，并用0. 結晶紫染色?？寺〔《镜捏w外表征。親本病毒和克隆病毒(MARC-145細胞上的第2代)在豬肺 泡巨噬細胞(PAM)中進行滴定。使用抗-N mAb進行的免疫熒光染色顯示兩種病毒均在PAM 中復制(圖2E和2F)，并在72hpi產生相似的病毒產量(2. 1-2. 8 X 104FFU/ml)。為進一步比較克隆病毒和親本病毒的生長特性，MARC-145細胞被MOI為0. 1的每 種病毒感染，并在6、12、24、36、48、60和721^1收獲。生長曲線結果顯示克隆病毒擁有和親 本病毒相似的生長動力學(圖3)。兩種病毒的效價均在48hpi達到峰值?？寺〔《拘r 的峰值是1. 39X 107FFU/ml，相比于親本病毒效價的峰值為2. 34X 107FFU/mlo這些病毒的 噬斑形態(tài)也被檢查，克隆病毒產生的噬斑的大小與親本病毒的噬斑的大小相似(數(shù)據未顯 示)。這些結果表明克隆病毒具有與親本野生型病毒相似的體外特性。為區(qū)分克隆病毒和親本病毒，我們在0RF7的42位核苷酸工程改造了 Seal限制性 酶位點。如圖4所示，克隆病毒中13875到14928位核苷酸擴增產生的1054bp的RT-PCR 片段被Seal切割。相反，親本病毒產生的RT-PCR片段不被Seal切割。pSD 01-08衍生的克隆病毒在豬模型中的病原和免疫學特性。利用看護豬模型 (nursery pig model)進行了感染性克隆衍生病毒復制特性的體內研究。21頭4周大的 PRRSV幼稚的豬從被證明為PRRSV陰性的豬群中獲得，并被隨機分成4組，分別圈養(yǎng)在隔離 的設施中。在4天的馴化期之后，每組的豬(對于克隆病毒感染組，η = 6 ；對于剩余組，η =5)鼻內接種1毫升IO5TCID5tl的克隆病毒(組1)或者親本病毒(組2)。第三組動物接 種目前的改造的活病毒(MLV) Ingelvac PRRSV疫苗。負對照組(組4)動物使用MARC-145 細胞培養(yǎng)物的上清液進行模擬攻擊。在感染后前7天，每天觀察豬的臨床病征并量取其體溫。在0、7、14、21、28、35和 42天從所有豬獲取血液樣品。血清樣品保存在-80°C以備進一步的檢測。在接種后21天 (dpi)，從每組取兩頭豬，對其實施安樂死，以便進行急性感染的事后分析。每組剩余的三頭 豬在42dpi進行安樂死。使用以前開發(fā)的基于每個肺葉貢獻給整個肺的大概容量的系統(tǒng)來 評估研究動物的肺損傷左頂葉和右頂葉、左心葉和右心葉以及中葉各自貢獻了總肺容量 的10%，而左尾葉和右尾葉各自貢獻了 25%。然后使用這些得分基于每個肺葉的相對貢獻計算總的肺損傷得分(Halbur等，1995)。為檢測病毒1 離及確定病毒量，0、7、14、21、28、35和42(1 1的血清樣品使用實時 定量PCR(Tetracore VetAlert PRRS ;Wasilk等，2004)來檢測，此技術在南達科他動物疾 病研究和診斷實驗室(SDSU-ADRDL)是常規(guī)使用的。所有血清樣品使用IDEXXHerdChek PRRS 2XR ELISA和病毒中和分析(VN)來評估抗-PRRSV抗體。在SDSU-ADRDL，這些檢測也 是以嚴格的質量保證方針常規(guī)實施的。
所有接受病毒的豬都被感染，這一點通過病毒RNA在血清中存在的陽性RT-PCR結 果和血清學得到證實。血清中的病毒在感染后約14天(dpi)達到峰值(圖5A ；表3)。在 14dpi，克隆病毒組6頭豬中的5頭，親本病毒組5頭豬中的4頭，以及疫苗組的所有5頭豬 已血清轉變(圖5B ；表3)?？寺〔《竟艚M6頭豬中的4頭在21dpi具有可檢測的中和抗 體效價，而親本病毒攻擊組5頭豬中的1頭在21dpi發(fā)展出中和抗體。MLV疫苗攻擊組中的 2頭豬在42dpi發(fā)展出可檢測的中和抗體效價(表3)。表3.感染后不同天數(shù)(dpi)接種的豬的血清的血清學和PCR結果小結。 apCR 由實時PCR確定的每一組中PCR陽性的豬的數(shù)量/豬的總數(shù)；bELISA 由 IDEXXHerdChekePRRS 2XR ELISA確定的每一組中血清陽性的豬的數(shù)量/豬的總數(shù)；eVN:由 熒光灶中和分析確定的發(fā)展中和抗體應答的豬的數(shù)量/豬的總數(shù)。結果被解釋為病毒感染 減少90%。*兩頭豬在21天被實施安樂死用于急性感染的分析。所有模擬感染的豬在整個研究期間保持RT-PCR和PRRSV抗體陰性。在任何被感 染的豬中都沒有觀察到明顯的臨床病征。僅在克隆病毒組6頭豬中的3頭，親本病毒組5 頭豬中的5頭以及疫苗組5頭豬中的2頭觀察到輕微的PRRSV特征的病理性肺損傷，例如 微弱的間質性肺炎。其余的豬沒有表現(xiàn)出總的肺損傷(表4)。有趣的是，當比較不同組的 豬的病理性損傷時，被親本病毒感染的豬顯示略高的損傷得分。表4.被感染的豬中具有總的肺炎損傷的肺的百分比。
*總的肺的病理學通過使用總的豬肺損傷評分系統(tǒng)來評測，這個系統(tǒng)評估肺的每 個肺葉的％肺炎，且每個肺葉的％肺炎加起來為整個肺的％肺炎(10)。將綠色熒光蛋白引入感染性克隆的Nsp2區(qū)。我們探索了利用此感染性克隆表達 外源基因的潛力。以前的研究顯示Nsp2是外源基因插入的優(yōu)秀候選位點。1型和2型兩者 的Nsp2的C末端區(qū)都含有高變結構域，包括氨基酸插入和缺失(7、8、27)。SD01-08和歐洲1 型病毒的原型成員LV的主要不同之一是Nsp2中存在17個氨基酸的缺失，該缺失位于LV的 ORFl的734到750位氨基酸之間。我們將綠色熒光蛋白(GFP)插入Nsp2的這一獨特缺失 位點(SD01-080RFla的733/734位氨基酸，圖7)。構建體pSD01-08-GFP被體外轉錄并轉染 進BHK-21細胞。轉染后48小時后在熒光顯微鏡下直接檢查活細胞。將來自轉染的BHK細 胞的細胞培養(yǎng)物上清液在MARC-145細胞上傳代，導致表達GFP細胞的出現(xiàn)，這些細胞最早 在感染后6小時就可以清楚顯現(xiàn)(圖6A)。為確認GFP-Nsp2融合蛋白的表達，在感染后48 小時，固定細胞并用Nsp2特異性mAb ES3-4 58-46染色。ES3-4 58-46通過用從ES3表位 序列制備的合成肽免疫接種小鼠產生，ES3表位序列位于GFP插入位點的緊接上游(圖7)。 紅色熒光Cy3偶聯(lián)的山羊抗小鼠IgG被用作二抗。共聚焦顯微鏡顯示GFP和Nsp2都定位 于核周，這與親本病毒的Nsp2定位相似(圖6B和6C)。為確定GFP的表達是否影響病毒復 制，將GFP病毒的生長特性與親本野生型及克隆病毒的生長特性進行比較。PSD01-08-GFP 病毒的復制周期與其它病毒相似，包括在48hpi達到病毒效價峰值；但是，GFP病毒感染的 效價的峰值降低了約10倍(圖3)。為研究多輪病毒復制后GFP表達的穩(wěn)定性，將GFP病毒在MARC-145細胞上連續(xù)傳 代8次。到第7代，出現(xiàn)了不表達GFP的病毒的亞群體，它占總病毒群體的15%。GFP的丟 失也通過RT-PCR被分析。從用第7代的GFP病毒感染的細胞中分離總細胞RNA，并將RNA 用作RT-PCR反應的模板，此反應使用擴增GFP插入區(qū)域的引物。RT-PCR產物被克隆和測 序。結果顯示GFP的N末端1-159位氨基酸被缺失(圖7)。更有趣的是，在1_159位氨基 酸被缺失的同時，兩個氨基酸，即甲硫氨酸(M)和谷氨酸(E)，被病毒插在GFP的160位氨基 酸前面(圖7)。因此，編碼GFP基因中的缺失的病毒基因組的選擇解釋了表達GFP的感染細胞的百分比的下降。綜合而言，這些結果表明Nsp2區(qū)能夠耐受外源基因的引入。然而， 外源基因的插入降低病毒的復制水平。因此，正標記，即GFP基因，是不穩(wěn)定的。II.負標記病毒 GFP/Δ ES4GFP/AES4負標記疫苗病毒的構建。為獲得潛在的負標記疫苗病毒，使用引物對 AES4F/E3448R 和 E1895F/AES4R (表 5)通過重疊延伸 PCR 技術(Hayashi 等，1994)缺失 位于GFP下游(在SD01-08病毒基因組的2427到2591位核苷酸)的B細胞表位ES4。PCR 產物經過Rsrll和EcoRV限制性酶消化并連入經過相同限制性酶消化的pSD01-08-GFP質 粒。得到的質粒構建體被命名為pSD01-08-GFP/AES4(圖8)。表5.用于ES4表位缺失和ELISA抗原表達的引物。
*GFP的核苷酸為粗體，限制性酶位點為斜體帶下劃線；@數(shù)字對應于SD01-08基因組內的核苷酸位置。圖8是pSD01-08-GFP/ Δ ES4構建體的示意圖。GFP被插入到ORFla的733和734位 氨基酸之間，而位于GFP下游的免疫原性B細胞表位ES4 (736到790位氨基酸)從SD01-08 病毒中被缺失。將此質粒DNA直接轉染入ΒΗΚ-21細胞啟動了完整的病毒復制周期。轉染 后48小時獲得的來自ΒΗΚ-21細胞的細胞培養(yǎng)物上清液在MARC-145細胞上傳代，回收感 染性后代病毒，并將得到的病毒命名為GFP/Δ ES4標記病毒。親本病毒SDO1-08平行地從 PSD01-08 cDNA克隆中產生。從MARC-145細胞得到的病毒的第2代用于體外和體內表征。生長動力學研究顯示GFP/AES4標記病毒以較慢的動力學進行復制，比親本病毒 SD01-08晚幾個小時達到最高效價。標記病毒的病毒效價峰值(3. 34X 104FFU/ml)比親本病 毒的病毒效價峰值(2. 56 X 106FFU/ml)低約兩個對數(shù)級(圖9)。圖9顯示GFP/ Δ ES4標記 病毒的生長動力學。MARC-145細胞平行地用MOI為0. 1的第三代的GFP/ Δ ES4標記病毒和 親本病毒進行感染。感染后0、6、12、24、36、48、60和72小時，收獲細胞并通過對MARC-145 細胞進行IFA以確定病毒效價。這些結果是實驗的三個重復的平均值，并且病毒的效價被 表示為每毫升的熒光灶單位(FFU/ml)。標記病毒和親本病毒的噬斑形態(tài)通過對MARC-145 細胞進行噬斑分析來比較。由GFP/Δ ES4標記病毒形成的病毒噬斑的大小急劇減小，并且 大多數(shù)噬斑為針尖大小(圖10)，這暗示GFP插入/ES4缺失對于感染過程中細胞到細胞的 擴散速率有負效應。圖10顯示GFP/Δ ES4標記病毒(10_1)和親本病毒(10_2)的噬斑形 態(tài)。匯合的細胞培養(yǎng)物單層用MOI為0.1的病毒進行感染。感染2小時后，移去細胞培養(yǎng) 物上清液并加上瓊脂覆蓋層。37°C下5天后檢測噬斑，并用0. 結晶紫染色。重組病毒中GFP插入或者ES4缺失的體外穩(wěn)定性通過MARC-145細胞中的10次連 續(xù)傳代(每次傳代孵育72小時)來追蹤。第十代病毒的GFP/AES4區(qū)被測序。令人驚奇 地是，與經歷了 N末端159氨基酸缺失的先前的SD01-08-GFP病毒不同，GFP/AES4標記病 毒中的GFP保持為完整的全長基因，且ES4缺失仍然存在。這一結果表明ES4表位區(qū)的缺 失提高了插入的外源基因GFP的穩(wěn)定性。感染細胞中的一小部分被鑒定到GFP相關熒光的 丟失(圖11)。用第10代的GFP/AES4標記病毒感染的MARC-145細胞中的GFP表達顯示 于11-1。用AlexiFluor標記的抗核殼體單克隆抗體SD0W17 (Nelson等，1993)染色的相同 病毒灶顯示于11-2。丟失GFP熒光的病毒群體用圓圈標出。
對于GFP/ Δ ES4區(qū)域，我們進行了三次獨立重復的PCR和測序(正反兩個方向)。 因而，總共得到六個序列。在其中一個序列中，核苷酸C-289到Τ-289的突變被鑒定出，這個 突變引起GFP的位置97處由精氨酸到半胱氨酸的氨基酸突變，而這可能對應于丟失GFP相 關熒光的小部分被感染細胞(圖12)。在其他5個序列上沒有檢測到突變。圖12顯示野生 型GFP基因和Arg-97突變的GFP基因相比較的電泳圖。細胞培養(yǎng)的第10代的GFP/ Δ ES4 標記病毒的GFP插入區(qū)域被測序。氨基酸由單字母符號表示，粗體字母指示從CGC(Arg)到 TGC(Cys)的突變氨基酸。ES4和GFP抗原的表達。ES4抗原使用以前描述的改良方法(Sun等，2004)表達 為串聯(lián)重復的ES4表位。簡述之，將三個拷貝的ES4表位(SD01-08的ORFla的736-790位 氨基酸)構建進蛋白表達載體pET_28a(+) (Novagen)。在表位之間加入柔性肽連接體，即 GGTGGTGGTGGTTCC，以幫助展示表位。有兩個正向引物。正向引物1 pET_ES4Fl含有BglII 限制性位點，但是沒有連接體序列，而正向引物2pET-ES4F2不僅包含BglII限制性位點， 而且包含連接體序列。ES4基因片段首先用正向引物1和反向引物pET-ES4R擴增。PCR 產物用BglII和HindIII消化，然后克隆進用BamHI和HindIII消化的pET_28a。這個克 隆被命名為pET-28a-ES4(+l)。ES4的第二個拷貝用正向引物2和反向引物pET ES4R進 行PCR擴增。PCR產物用BglII和HindIII消化，然后克隆進用BamHI和HindIII消化的 pET-28a-ES4(+l)。ES4的第三個拷貝利用和第二個拷貝同樣的策略插入。最終的構建體被 命名為 pET-28a-ES4 (+3)。用引物對 pET-EGFP-F/pET-EGFP-R 從 pEGFP-附質粒(Clontech) 擴增GFP基因。PCR產物用BamHI和HindIII限制性酶消化并連入用相同酶消化的pET_28a 載體。重組蛋白在大腸桿菌BL21(DE3)中表達，從而生成N末端帶有6個組氨酸殘基的融 合蛋白。所述蛋白用鎳親和層析純化，并用SDS-PAGE分析，如我們以前的出版物中所述 (Ferrin 等，2004)。GFP/Δ ES4標記病毒的體內表征。GFP/Δ ES4標記病毒的體內特性在看護豬疾病 模型中進行研究。18頭4周大的豬購自無PRRSV的豬群。動物被隨機分成三組(η = 6/ 組)，在BL2隔離條件下圈養(yǎng)，在開始實驗接種前先馴化7天的時間。組1的豬用GFP/AES4 標記病毒感染，組2的豬用親本SD01-08病毒感染作為正對照，組3的豬用細胞培養(yǎng)基模擬 感染。組1和組2的豬用1χ10650%組織培養(yǎng)感染劑量(TCID5tl)的病毒(每個部位1毫升) 通過鼻內和肌肉內兩個部位進行接種。感染后42天(dpi)，組1和組2的豬用異源的1型 株系即SD03-15病毒攻擊。SD03-15是另一個美國1型株系，是在2003年提交到我們診斷實驗室的臨床樣品 中分離得到的。在實地報告中，感染了SD03-15的豬經歷了 3周時間內80-90%的斷奶前 死亡率。減少的表現(xiàn)持續(xù)到肥育期。在成年母豬群體中，和以前的美國PRRSV爆發(fā)相比具 有輕微的流產發(fā)作。我們以前的實驗動物研究也證明了這種病毒的致病本質(Lawson等， Proc. Conf. Res. Work. Anim. Dis.，abstr. 99，2005)。組3中的三頭豬用SD03-15病毒進行攻擊，另外三頭豬保持為模擬感染對照。在 感染后的前7天和攻擊后的前7天每日觀測豬的臨床病征和體溫。比較不同攻擊組之間的 平均溫度應答。在攻擊前一天和攻擊后7天測量直腸溫度。在最初感染之后沒有在任何豬 中檢測到溫度升高并且沒有觀察到臨床病征。攻擊后，組3(最初模擬感染)中的三頭被攻 擊的豬中的直腸溫度在攻擊后一天和兩天升高(圖13)。在這三頭豬中也觀測到了臨床病征(咳嗽和鼻分泌物)。剩余的豬依舊無癥狀。每周一次從所有豬獲取血液樣品。在攻擊 后21天豬被實施安樂死。使用以前開發(fā)的基于每個肺葉貢獻給整個肺的大概容量的系統(tǒng) 來評估研究動物的總的肺損傷左頂葉和右頂葉、左心葉和右心葉以及中葉各自貢獻了總 肺容量的10%，而左尾葉和右尾葉各自貢獻了 25%。然后使用這些得分基于每個肺葉的相 對貢獻計算總的肺損傷得分(Halbur等，1995)。驗尸時，在組1、組2和所述的三頭嚴格負 對照的豬中沒有觀察到總的病理學損傷。相反，在組3中的最初模擬感染后來用SD03-15 攻擊的那三頭豬中觀察到了輕微的PRRSV特征性的總的病理學肺損傷。
病毒學和免疫學性質。確定了標記病毒的體內病毒學和免疫學性質。豬在42dpi 時接受攻擊，在圖14A-14C中被顯示為垂直虛線。病毒血癥的持續(xù)時間和高度用實時PCR 確定，并且結果被解釋為每毫升的RNA拷貝數(shù)。在感染后的每一天，具有不同大寫字母(A、 B或C)的平均病毒量差異顯著(P < 0. 05)。與組2用親本病毒感染的豬(平均病毒效價 的峰值=5. 9xl07拷貝/毫升)相比，用GFP/AES4標記病毒感染的豬具有較低的病毒量 峰值(平均病毒效價的峰值=2. OSxlO5拷貝/毫升，圖14A)。在攻擊后7天，接種疫苗的 豬比最初模擬感染然后用SD03-15病毒攻擊的那些豬的病毒量低二到三個對數(shù)。到攻擊后 21天，GFP/AES4標記病毒感染組的豬與親本組相比具有低10倍的病毒量，并且3/5的豬 消除了血清中的病毒(圖14A;表6)。表6.通過定量PCR測定的用遺傳不同的株系SD03-15攻擊后21天血清中的病毒量。 *負對照組中的三頭豬在42dpi時用異源株系SD 03-15進行攻擊。到14dpi時，感染組中的所有豬已血清轉變。PRRSV特異性血清抗體通過 IDEXX HerdChek PRRSV ELISA 2XR試劑盒測定。S/P比率大于0. 4被認為是陽性。抗體 應答在21dpi后達到近似水平(圖14B)。病毒中和抗體應答通過熒光灶中和分析確定(圖14C)。結果被解釋為病毒感染有 90%的減少，并且中和抗體效價表達為平均值(η = 6)并表示為log2標度。親本的SD01-08 病毒被用于病毒中和分析。在感染后的每一天，具有不同大寫字母(A、B或者C)的平均值 差異顯著(P <0.05)。血清中和(SN)抗體水平的進一步測量顯示，在感染親本病毒的豬 中，到感染后21天從六頭豬中的一頭豬中檢測出SN抗體，并且到感染后35天，3/6的豬發(fā) 展出可檢測的SN效價，其幾何平均效價(GMT)達到了 2。相反，在感染了 GFP/AES4標記病毒的豬中，中和抗體應答發(fā)展得更快且更高。到感染后14天，從六頭豬中的一頭豬中檢測出SN抗體，并且到感染后35天，在這個組中的所有豬中檢測到SN效價，其達到了 9. 2的平 均GMT。在用SD03-15攻擊后，觀察到增強的效應，在49dpi (攻擊后一周)時GFP/ Δ ES4標 記病毒感染組的GMT為18. 4，與之相比親本病毒感染組的GMT為5. 7。兩組在62dpi (攻擊 后三周)達到了相似的SN效價(圖14C)。這些數(shù)據表明在最初感染時，感染了 GFP/AES4 標記病毒的豬比親本病毒感染的豬產生更高的中和抗體效價。病毒分離和測序。來自7、14、21和28dpi的血清樣品被用于如前所述的病毒分離 (Wasilk等，2004)。病毒的存在通過使用PRRSV特異性抗體SD0W17 (Nelson等，1993)的 IFA證實。為確定GFP插入和ES4表位缺失的穩(wěn)定性，利用QIAamp Viral RNA微量試劑盒 (Qiagen)按照生產商的說明書從血清分離的病毒中提取病毒RNA。使用如前所述的方法 (Fang等，2004)進行RT-PCR。RT-PCR擴增的片段被凝膠純化，并在愛荷華州立大學測序機 構(Ames，IA)確定序列。引物對nsp2-2144F/nsp2_2694R(表5)被用于RT-PCR和測序，并 擴增包含GFP插入和ES4缺失的核苷酸區(qū)域(SD01-08基因組的2144到2694)。GFP/ Δ ES4 標記病毒的全長序列被提供在SEQ ID NO. 43中(表7)。GFP/ Δ ES4標記的體內穩(wěn)定性。為確定GFP/ Δ ES4標記的穩(wěn)定性，來自7到28dpi 的血清樣品被用于MARC-145細胞中的病毒分離。從7、14和21dpi收集的血清樣品中回收 病毒，但從28dpi收集的血清樣品中沒有分離出病毒。在細胞培養(yǎng)物中，我們僅觀察到一小 部分用7和14dpi分離的病毒感染的細胞顯示微弱的GFP熒光，用21dpi分離的病毒感染 的細胞中沒有觀察到GFP熒光。但是，使用核殼蛋白特異性單克隆抗體SD0W17的免疫熒光 染色證實大量病毒的存在，這與體外研究中觀察到的相似(圖11)。GFP插入/AES4缺失 的穩(wěn)定性通過對相應區(qū)域的測序來確定。結果證實ES4缺失的存在，并且GFP完整的保持 為全長基因。然而，測序結果揭示出位于GFP的144位核苷酸(C到T)和289位核苷酸(C 到T)的兩個點突變。144位核苷酸突變是沉默的，但是289位核苷酸突變引起GFP的97位 由精氨酸(R)到半胱氨酸(C)的氨基酸突變，這和我們的體外測序分析是一致的(圖12)。 有趣的是，在7和14dpi分離的病毒中還檢測到小部分無突變的GFP基因。對于每個dpi， 我們對從三頭豬分離的病毒進行了測序，并且測序使用正向和反向兩種引物來進行，對于 每個dpi得到總共六個序列。對于7dpi分離的病毒，1/6序列被發(fā)現(xiàn)沒有97位的突變，而 其他五個序列被確定包含所述R到C的突變。對于14dpi分離的病毒，2/6序列被鑒定為無 突變，而這兩個序列是從兩頭不同的豬而來。其他4個序列也被鑒定為包含所述R到C的 突變。所有從21dpi的病毒產生的序列包含所述R到C的突變。這一數(shù)據與GFP熒光的丟 失是因為R到C突變的先前報道(Kim等，2007)是一致的。小部分的無突變的GFP的存在 可以解釋在細胞培養(yǎng)物中觀察到的微弱地發(fā)熒光的細胞。這些結果暗示選擇可能是逐漸地 發(fā)生的，以產生有利于提高的病毒復制的突變?；贕FP和ES4表位的ELISA。ELISA使用Immulon II HB 96孔微量滴定板 (Thermo Labsystems,Franklin,ΜΑ)進行。重組蛋白在包被緩沖液(15mM碳酸鈉_35mM碳 酸氫鈉，PH9. 6)中進行稀釋，并在第1、3、5、7、9和11列用100微升稀釋的抗原包被所述板。 用100微升包被緩沖液對第2、4、6、8、10和12列進行處理以作為背景對照。將板在37°C 孵育1個小時，然后用于PBST緩沖液(具有0.05% Tween 20的Ix PBS)中的10%牛奶在 4°C過夜封閉多余的蛋白結合位點。所測試的血清按照于具有5%牛奶的PBST緩沖液中的1 5的稀釋度應用。在37°C孵育1小時后，板用PBST洗滌，并加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的 山羊抗豬 IgG (Kirkegaard&Perry Laboratories，Gaithersburg，MD)以結合任何 PRRSV 血 清抗體，所述PRRSV血清抗體結合板上的抗原。板在37°C孵育另一個小時，洗滌，并加入過 fl^^BI/ ^ABTS(Kirkegaard&Perry Laboratories,Gaithersburg,MD) UitifUfe。 H 色通過用XChek軟件(IDEXXLaboratories)控制的EL800微板讀數(shù)器(BioTek Instruments Inc.，Winooski, VT.)在 405nm 讀數(shù)來量化。 開發(fā)了伴隨區(qū)分診斷分析以區(qū)分接種標記疫苗的動物和那些自然感染野生病毒 的動物。因為使用了兩個標記GFP插入(正標記)和ES4缺失(負標記)，所以我們開發(fā)了 基于GFP和ES4表位的兩種ELISA分析來檢測標記。GFP和ES4表位二者都被表達為可溶 性重組蛋白。我們評估這兩種ELISA測試來檢測特異性抗體。圖15A顯示來自基于ES4表 位的ELISA的結果，而圖15B顯示來自基于GFP抗原的ELISA的結果。豬在感染后42天被 攻擊，顯示為圖15A中的垂直虛線。如所預期的，用GFP/Δ ES4標記病毒對組1的豬的感染 沒有誘導可檢測的抗缺失的ES4表位的抗體應答(圖15Α)，但是誘導了強烈的抗GFP抗原 的抗體應答，該應答從14dpi開始并持續(xù)至研究的持續(xù)時間到62dpi (圖15B)。相反地，組 2的豬用親本病毒感染，對ES4重組蛋白特異性抗體能夠在21dpi被檢測到，并同樣地持續(xù) 到62dpi (圖15A)，但沒有檢測到抗GFP抗原的特異性抗體應答(圖15B)。在周03-15攻 擊之后，組1的豬在攻擊后一周表現(xiàn)出對ES4表位的可檢測的抗體應答，因為03-15病毒包 含ES4表位(圖15A)。對于來自三個嚴格負對照的豬的血清樣品，基于GFP和ES4表位的 兩種ELISA均沒有檢測到特異性抗體應答(圖15A和15B)。來自其他1型和2型PRRSV感染動物的血清樣品。對于負標記的基本要求是其抗 原區(qū)域應該能夠和一大組野生病毒反應。為確保ES4表位在各種病毒的株系中能夠是反 應的，我們使用來自感染美國1型病毒的四種代表性株系，即SD01-07、SDO1-08, SD02-11 和 SD03-15 (Lawson 等，Proc. Conf. Res. Work. Anim. Dis.，abstr. 99,2005)中的每個的豬 的血清樣品。SD01-07和SD01-08分離株從沒有表現(xiàn)臨床疾病的豬群獲得，而SD02-11和 SD03-15從幼豬有顯著發(fā)病率和死亡率的豬群中獲得。這四個分離株也被歸入針對美國 起源的1型PRRSV分離株(Fang等，2007)開發(fā)的系統(tǒng)樹的不同分支。來自感染2型病毒 VR2332的實驗豬的血清樣品，是從PRRSV合作農業(yè)項目(CAP)的共享試劑資源中獲得的。 如圖15C所示，ES4表位與來自感染這四個病毒株系的所有豬的抗血清反應。結果被表示 為平均值(n = 6)。抗體應答在14dpi被檢測，并持續(xù)超過62dpi。然而，來自感染2型原 型株系VR2332的實驗豬組的血清樣品的進一步檢驗，顯示與ES4表位在ELISA上沒有反應 性(數(shù)據未顯示)。因而，需要另一血清學測試以區(qū)分感染1型病毒的動物和那些感染2型 病毒的動物。III.討論在PRRS病毒nsp2區(qū)域中的兩個遺傳標記被構建。正標記(GFP插入)將允許已 經接種疫苗的動物的檢測，而負標記(ES4表位缺失)將允許檢測動物中野生型病毒的存 在。與由傳統(tǒng)的多輪細胞培養(yǎng)傳代技術制備的MLV相比，使用這種精確限定的減毒的缺失 /插入類型構建的疫苗以及反向遺傳學技術的使用降低了回復突變成毒性的野生型病毒的 潛在危險。標記疫苗僅在適合的測試(伴隨診斷測試)可用于監(jiān)控疫苗接種水平和跟蹤感染的空間過程時是有用的?；贕FP抗原的ELISA在感染標記病毒的豬的組中檢測到高水平 的抗-GFP應答?；贓S4表位的ELISA在感染親本病毒的豬的組中也檢測到高水平的抗 體應答，但表現(xiàn)出比抗-GFP應答的水平發(fā)展得更慢。高水平、穩(wěn)健的抗-GFP應答能夠在 14dpi時在感染標記病毒的豬中檢測到，而在感染野生型病毒的豬中，抗-ES4抗體應答在 21dpi時被檢測到并在28dpi時達到更高水平。ES4表位在1型病毒的nsp2鑒定出的六個 B-細胞表位(Oleksiewicz等，2001)中具有最高的親水性值(Hopp&Woods，1981)。對現(xiàn)在 可利用的1型PRRSV的nsp2氨基酸序列(Meulenberg等，1993 ；Fang等，2007)的分析顯 示這個區(qū)域在1型基因型內擁有63. 6%到100%的氨基酸序列同一性。蛋白序列分析顯示 ES4表位區(qū)，AA736-AA790，實際上包含7個小的B-細胞表位(Pep Tool, Bio Tools, Inc.， Edmonton, Alberta, Canada)。表位 AA745-AA754 和 AA7 68-AA780 在 1 型基因型中是相當 保守的。我們的ES4 ELISA數(shù)據與蛋白序列分析是一致的，表明ES4表位能夠與感染1型 PRRSV的4個代表性野生株系的動物的血清樣品反應。然而，ES4表位不和感染2型分離 株的動物的血清樣品反應。在nsp2區(qū)域鑒定出的B-細胞表位(Oleksiewicz等，2001 ；de Lima等，2006)的比較中，nsp2區(qū)域中鑒定出的表位沒有一個是在1型和2型分離株之間 保守的。因而，需要另一診斷分析以區(qū)別接種ES4表位缺失的突變體的豬和那些感染2型 野生株系的豬。nsp2區(qū)域中的ES4表位看起來對于PRRSV復制不是必須的，但可能在體內的病毒 衰減和致病中起重要的作用。單獨的GFP插入沒有大量地減弱病毒的體外生長特性，然而， 當GFP下游的ES4表位被缺失掉時，病毒效價與親本病毒的效價相比被降低了至少兩個對 數(shù)。噬斑形態(tài)也顯示標記對于病毒生長的負效應。體內表征進一步顯示GFP/Δ ES4標記病 毒被減毒，其比野生型病毒具有更低水平的病毒血癥和更高水平的中和抗體應答。蛋白質 序列分析顯示ES4表位區(qū)包含nsp2上最高的親水性值(Hopp&Woods，1981)。令人驚奇的是，ES4表位的缺失提高了 nsp2中GFP插入的穩(wěn)定性。另一個有趣的 觀察結果是體外和體內的GFP熒光丟失，盡管GFP基因保持完整。序列分析鑒定出在GFP 中Arg-97到Cys的突變。所述Arg-97到Cys的突變正是從插入2型病毒nsp2區(qū)的GFP 中鑒定出的相同的氨基酸突變(Kim等，2007)。如Kim等(2007)所示，Arg-97在GFP發(fā)色 團的形成中起關鍵作用，這暗示發(fā)色團的形成可能影響nsp2的功能。此外，因為Cys是通 常參與形成蛋白質中二硫鍵的氨基酸，額外的二硫鍵可能是維持nsp2的正確構象以行使 功能所需要的。盡管如此，GFP在體內保持它的免疫原性，并且用作區(qū)別接種疫苗的動物和 野生型病毒感染的動物的優(yōu)秀的正標記。本說明書中的所有出版物和專利申請表明此項發(fā)明所屬的領域中的普通技術水 平。所有出版物和專利申請通過引用并入本文，如同每個個體出版物或者專利申請被特別 地且單獨地通過引用而指出的程度。本發(fā)明已經通過參考各種實施方案和技術來描述。但是，應該理解的是可進行許 多變化和修改，而仍保持在本發(fā)明的精神和范圍中。表7GFP/AES4標記病毒的全長序列(SEQ ID NO 43) 參考文獻1. 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權利要求
一種重組的北美1型豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)，其在開放讀碼框(ORF)1a中包括一個或多個突變，其中所述突變使得所述重組的PRRSV不能產生對應于ORF1a的至少一種功能性多肽。
2.如權利要求1所述的重組的PRRSV，其中所述突變包括缺失。
3.如權利要求2所述的重組的PRRSV，其中所述缺失是在nsp2區(qū)域中。
4.如權利要求3所述的重組的PRRSV，其中所述缺失包括表位ES4。
5.如權利要求4所述的重組的PRRSV，其中所述缺失包括ORFla的736-790位氨基酸。
6.如權利要求3所述的重組的PRRSV，其中所述突變包括異源DNA序列的插入。
7.如權利要求6所述的重組的PRRSV，其中所述插入是在ORFla的733位氨基酸和734 位氨基酸之間。
8.如權利要求6所述的重組的PRRSV，其中所述插入是綠色熒光蛋白(GFP)。
9.一種重組的北美PRRS病毒，其由分離的多聚核苷酸分子編碼，該多聚核苷酸分子包 括編碼感染性RNA分子的DNA序列，所述感染性RNA分子編碼北美PRRS病毒，其中所述DNA 序列是 SEQ ID NO :43ο
10.一種北美1型PRRSV疫苗，其包括在ORFla中具有突變的重組的PRRSV和藥學可接 受的運載體，所述突變包括在ORFla中的缺失、插入或者兩者。
11.如權利要求10所述的疫苗，其中所述突變包括nsp2區(qū)域中的缺失。
12.如權利要求11所述的疫苗，其中所述缺失是在所述nsp2區(qū)域中的736-790位氨基酸。
13.如權利要求11所述的疫苗，其中所述突變還包括異源DNA序列的插入。
14.如權利要求13所述的疫苗，其中所述插入是在所述nsp2區(qū)域中的733位氨基酸和 734位氨基酸之間。
15.一種試劑盒，其包括疫苗，該疫苗包括在ORFla中具有突變的PRRSV突變體和藥學可接受的運載體，所述突 變使得所述PRRSV突變體不能產生功能性ORFla多肽，所述突變包括異源DNA序列的插入； 一種或多種第一多肽，該第一多肽由所述異源DNA序列編碼；以及 一種或多種第二多肽，該第二多肽由所述功能性ORFla編碼。
16.如權利要求15所述的試劑盒，其中PRRSV疫苗中的所述突變是在nsp2區(qū)域中的缺失。
17.如權利要求16所述的試劑盒，其中所述缺失是ES4表位，其中所述一種或多種第一 多肽包括GFP并且所述一種或多種第二多肽包括所述ES4表位。
18.一種區(qū)分接種PRRSV標記疫苗的動物和自然感染PRRSV的動物的方法，其中所述 PRRSV標記疫苗包括插入突變和缺失突變，所述方法包括提供包括所述插入突變的第一重組PRRSV蛋白； 提供包括所述缺失突變的第二重組PRRSV蛋白；用所述第一重組PRRSV蛋白和第二重組PRRSV蛋白孵育來自動物的血清樣品；以及 檢測樣品中的抗體與所述第一重組PRRSV蛋白和第二重組PRRSV蛋白的結合； 其中所述樣品中的抗體與所述第一重組PRRSV蛋白的結合指示接種疫苗的動物，而所 述樣品中的抗體與所述第二重組PRRSV蛋白的結合指示自然感染的動物。
19.如權利要求18所述的方法，其中所述第一重組PRRSV蛋白包括GFP插入。
20.如權利要求18所述的方法，其中所述第二重組PRRSV蛋白包括ES4缺失。
全文摘要
豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)是全世界豬肉工業(yè)的一個主要問題。在疫苗中包含標記將允許診斷區(qū)分接種疫苗的動物和自然感染野生型病毒的那些動物。使用北美1型PRRSV的cDNA感染性克隆，制備了重組綠色熒光蛋白(GFP)標簽化的PRRSV，其包含免疫原性表位ES4在nsp2區(qū)域的缺失?；贕FP和ES4表位的ELISA肯定了標記鑒定。
文檔編號C07K14/08GK101848995SQ200880104270
公開日2010年9月29日 申請日期2008年6月24日 優(yōu)先權日2007年6月25日
發(fā)明者埃里克·A·納爾遜, 方穎, 簡·亨寧斯 申請人:南達科他州立大學