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      用于抗血纖蛋白溶解治療的組合物的制作方法

      文檔序號:3574700閱讀:748來源:國知局
      專利名稱:用于抗血纖蛋白溶解治療的組合物的制作方法
      技術領域
      本發(fā)明涉及藥物組合物的制備,所述藥物組合物用于抗血纖蛋白溶解治療和與超 量血纖蛋白溶解狀況或外科操作相關的出血性并發(fā)癥。
      背景技術
      止血系統(tǒng)對維持循環(huán)流動性和防止響應于血管攻擊的出血負責。生理學上的止血 受到促進凝結和血纖蛋白形成的機制以及受到幫助其降解或血纖蛋白溶解的機制控制。凝 結的過度活化或血纖蛋白溶解的缺陷導致阻塞血管的凝塊的形成(血管內血栓形成),引 起缺血和壞死。然而,超量血纖蛋白溶解的一般情況促使出血的開始。由先天異常引起的、或在凝結-血纖蛋白溶解系統(tǒng)中獲得的超量血纖蛋白溶解狀 況導致了重要的出血性并發(fā)癥的誘因。這樣的狀況已經與溶解血栓的治療以及與含有高量 纖溶酶原激活物的器官,例如前列腺、陰莖頭、子宮和肺中的手術相關聯(lián)。并且,繼發(fā)于許多 醫(yī)學和/或外科過程的彌漫性血管內凝血(DIC),構成了與各種器官中的大出血相關的超 量血纖溶解狀況的原型。在伴有由異常凝血或血纖蛋白溶解的提高所引起的基礎性出血生理病理的疾病 中,以及除了在血液衍生物的輸血之后以外,用于治療的藥理學手段通常是抗血纖蛋白溶 解,但是治療在大約30%的病例中失敗??寡w蛋白溶解治療試圖抑制血纖蛋白的降解。在臨床治療中使用的最常見的一 種是賴氨酸的合成類似物,例如ε -氨基己酸(EACA)和氨甲環(huán)酸(AMCHA),它們與血纖蛋白 溶解酶原競爭賴氨酸結合位點,以及抑肽酶,其是具有廣泛蛋白酶抑制譜的牛肺的衍生物。這些化合物已經顯示了在各種臨床醫(yī)學的和外科情況中是有效的,例如,顱咽管 內的出血、具有提高的出現(xiàn)風險的手術以及來源于血栓溶解治療的并發(fā)癥。在外科水平上,抗纖維蛋白溶解試劑,除了降低術后出血之外,可以是心臟、肝臟 和骨科手術中的輸血和其他血液衍生物的替代。然而,這些制品的使用沒有變得一般化,部 分地因為缺少展現(xiàn)它們有效性的充分的研究,還因為它們可能提高血栓溶解并發(fā)癥的風險 (Mangano DT等人The risk associated with aprotinin in cardiac surgery. N Engl J Med 2006 ;354 353-365)。舉例來說,肝臟外科中,基礎性的肝臟移植,使用抗血纖蛋白溶解劑例如抑肽 酶和AMCHA實現(xiàn)了出血性并發(fā)癥的降低,但可能與血栓溶解問題相關(de Boer MT等 人 Minimizing blood loss in livertransplants progress through research and evolution of techniques. DigSurg 2005;22:265-275)。在顱內出血中,抗血纖蛋白溶解劑還沒有被結合到臨床實踐指南中(You H等人 Hemostatic drug therapies for acute intracerebralhaemorrhage. Cochrane Database Syst Rev 2006 ;⑶005951)。在腦出血的特定病例中,原發(fā)或繼發(fā)于血栓溶解治療,就 降低死亡率(與接受安慰劑的29%的患者相比,接受因子VIIa的18%的患者)和降低 神經病學后遺癥(Mayer S. A. , Brun N. C.等人;“Recombinant ActivatedFactor VII Intracerebral Hemorrhage Trial Investigators. Recombinantactivated factor VIIfor acute intracerebral hemorrhage";N Engl J Med. 2005 ;352 :777_785)而言,重組因 子Vila的使用是看起來具有任何有效效果的僅有的治療。彌漫性血管內凝血(DIC)是涉及大出血的另一種臨床狀況,其中施用當前的 抗血纖蛋白溶解劑是禁忌的,因為它促進一般化的血栓形成(Paramo JAoagulacion intravascular diseminada. Med clin(Bare)2006 ; 127。使用tPA或尿激酶型纖溶酶原激活物的血栓溶解是急性心臟病發(fā)作和缺血性中 風中所選的治療之一,但是它的使用與高達14%的病例的大出血、以及高達4%的病例的 顱內出血的高發(fā)生率相關。除了用血液衍生物治療之外,當存在過度的出血時,EACA或 AMCHA型抗血纖蛋白溶解劑是需要的,然而它們的使用可能促使血栓復發(fā)。在拔牙之后的過度出血是患有先天的凝血病例如血友病的患者中更為常見的 并發(fā)癥之一。在這些情況中,抗血纖蛋白溶解和抗出血試劑(例如,氨甲環(huán)酸、去氨加壓 素和因子VII)的局部使用促進了血塊的存留和出血的防止(Franchini M等人Dental procedures in adultpatients with hereditary bleeding disorders : IOyears experience in threeltalian Hemophila Centers. Haemophilia 2005 ;11 :504_509)。抗血纖蛋白溶解劑也是在患有與先天的凝血病相關的月經過多的婦女中與激素 的??夕去 的 _ 的夕臺 # (Demers C·入 Gynaecological and obstetric management of women with inheritedbleeding disorders. J Obstet Gynaecol 2005 ;27 :707_732)。血纖蛋白凝膠的表面治療的應用已經成為在防止與外科創(chuàng)傷相關的出血方面的 進步,但是它的臨床用途仍未建立(Gabay M. Absorbablehemostatic agents. Am J Health Syst Pharm. 2006 ;63 1244-53)。MMP的抑制物的靜脈內或表面施用可以更快地恢復止血,降低局部的出血性并 發(fā)癥或與 tPA 才目關的男β些(Lapchak PA,Araujo DM. Reducing bleeding complications after thrombolytic therapy for stroke :clinical potential of metalloproteinase inhibitors and spin trap agents. CNSDrugs. 2001 ; 15 :819_29),促使血塊存留,外科創(chuàng) 傷的修復和痊愈。雖然這是有前景的策略選擇,使用MMP的抑制物的大多數臨床試驗已 經失敗了 ;是由于所使用的低劑量(效力對比毒性)或由于觀察到的副作用(肌骨胳的 綜合征)。必需的是找到更為選擇性的抑制物,其僅阻斷與特定MMP相關的分子機制從而 避免θ 乍用(Peterson JT. Theimportance of estimating the therapeutic index in the development ofmatrix metalloproteinase inhibitors. Cardiovasc Res. 2006 ;69 677-687)。本發(fā)明的目的是提供抑制血纖蛋白凝塊裂解的、用于抗血纖蛋白溶解治療和用于 出血性并發(fā)癥的可選擇的治療組合物。附圖的簡要說明附

      圖1.相對于按照分鐘的實驗持續(xù)時間,表示為405nm處的吸收度值的再鈣 化的血漿的濁度分析。A 圖形顯示了在單獨的血漿(對照)或存在MMP-IO (200nM)或 MMP-3(200nM)的情況下的凝塊形成(最大吸收度);B 圖形顯示了在存在單獨的纖溶 酶原激活物tPA(30U/ml)和uPA(135U/ml),或與MMP-IO (200nM)組合的、以及在存在與 tPA(30U/ml)組合的等劑量MMP-3 (200nM)的情況下,再鈣化的血漿血纖蛋白凝塊的形成和 裂解。
      附圖2. MMP聚合的血纖蛋白斑塊,其中顯示由單獨或添加在一起的tPA(lU/ml)和 MMP-10 (200nM)產生的裂解的區(qū)域。附圖3.使用溶基質素的熒光底物,血漿中MMP-IO(IOOnM)活性的分析。通過底物 形成梯度的降低,測定了血漿中抑制MMP-10的活性的單克隆抗體(Mab)的濃度。IgG同種 型抗體用作對照。附圖4.使用抑制MMP-10的活性的抗體的Western印跡。分子量標志物(泳道 1),MMP-I (泳道3),MMP-3 (泳道3),MMP-10 (泳道4)。MMP-10活性的抗體抑制物僅識別 MMP-10酶原(55kDa)和活性的酶(45kDa),與其他金屬蛋白酶不顯示任何交叉反應。附圖5.在在存在或缺少抑制MMP-10活性的單克隆抗體(MAb)、以及IgG同種型對 照抗體的情況下,用MMP-10 (200nM)再鈣化的血漿的濁度分析。附圖6.在在存在或缺少抑制MMP-10活性的單克隆抗體(MAb)、以及IgG同種型對 照抗體的情況下,顯示了在tPA(lU/ml))和MMP-10 (200nM)產生的裂解區(qū)域中的差異的血
      纖蛋白斑塊。發(fā)明的詳細說明在第一個方面,本發(fā)明涉及中和基質金屬蛋白酶-10 (MMP-10)的抗體在制備用于 抗血纖蛋白溶解治療的藥物中的用途。MMP-10 (酶編碼EC-編號3. 4. 24. 22)也稱為基質金屬肽酶、溶基質 % -2(stromelysin2, STMY2)、轉移素-2 (transin-2)或 proteoglycanase-2。在人類中, 編碼 MMP-10 的基因位于染色體 11 上(llq22. 3 ;HUG0 Gene Nomenclature Committee HGNC-ID 7156 ;UniProtKB/Swiss-Prot Accession Number :P09238)。這種金屬蛋白酶有各種細胞類型表達,例如,內皮細胞、單核細胞和成纖維細胞, 已知它可以通過纖溶酶、calicrein、類胰蛋白酶、彈性蛋白酶和組織蛋白酶G活化,可以降 解廣泛的細胞外基質底物,例如,agrecane、彈性蛋白、纖連蛋白、明膠、層粘連蛋白、肌鍵 蛋白-C、玻連蛋白和II、III、IV、IX、X和XI型膠原蛋白。MMP-10也可以活化其他基質金 屬蛋白酶,例如,proMMP-U -3、_7、8 禾口 -9[NakamuraH 等人;Eur. J. Biochem.,1998 ;253 67-75]。還已知的是,MMP-10參與各種生理學過程,例如骨骼生長和傷口愈合。它還在患 有糖尿病性視網膜病的患者的角膜中過量表達,已經與某些類型的癌以及與淋巴腫瘤相 關聯(lián)。各種體外研究已經展現(xiàn)了,在角質形成細胞培養(yǎng)物中MMP-10的表達可以被生長因 子(角質形成細胞的表皮生長因子或TGF-β)或被前炎性細胞因子(TNF-α、IL-I β )誘 導[Rechardt 0 等人;J. Invest. Dermatol.,2000 ;115 :778_787] ; [Li deQ 等人;Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2003 ;44 :2928_2936]。同樣地,在本發(fā)明之前的通訊中,描述了 MMP-10 -可以是血管風險的炎性生物標記物[MonteroI等人;J. Am. Col. Cardiol., 2006;47:1369-1378] ; [Orbe J 等人;J. Thromb. Haemost. ;2007 ;5 91-97];-在形成3D膠原蛋白基質中的毛細管的內皮細胞中被誘導,并通過MMP-I的活化 參與毛細管形成的退化[Saunders WB 等人 J. CellSci.,2005 ;118 =2325-2340];和-在細胞內連接的維持方面起到基本作用,其在重建和血管生成的過程中保持了 血管的完整性[Chang 5等人;0611,2006;126:321-334]。
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      -參與傷口的愈合,提高角質形成細胞的遷移和組織重組織化,通過基質蛋白質的 蛋白水解降解發(fā)生[Krampert M,等人;Mol Biol Cell,2004 ;5242_5254]。在本發(fā)明中,研究了 MMP-IO和MMP-3對人血漿上凝塊的形成和裂解的影響,以及 在其他聚合化血纖蛋白的降解的體外模型中。本發(fā)明已經能夠顯示,MMP-IO不具有直接的血栓溶解活性,它本身不能改變凝塊 的形成也不能降解血纖蛋白。令人驚訝地,他們還發(fā)現(xiàn),在存在血栓溶解活化試劑、特別是 纖溶酶原激活物的情況下,MMP-IO促使血纖蛋白凝塊溶解并降低裂解的時間。因而MMP-10 作為其他血栓溶解活性劑的血栓溶解作用的促進劑或輔佐劑。相比之下,具有對血纖蛋白和纖維蛋白原的直接蛋白質分解活性的血纖蛋白溶解 基質金屬蛋白酶例如MMP-3,不降低凝塊裂解時間,這由血栓溶解的活性劑自身實現(xiàn)。更令人驚訝地,發(fā)明人發(fā)現(xiàn),添加特異于MMP-10的抗體能夠抑制MMP-10的效力, 導致凝塊溶解的完全阻斷,甚至在存在血纖蛋白溶解活性劑的情況下。結果,MMP-10抑制試劑,例如抗體,可能代表醫(yī)學和外科領域中出血控制的顯著進 步,以及是在患有由血纖蛋白溶解失調引起的過度出血的患者中對輸血的替代,1.-通過它甚至在存在纖溶酶原激活物的情況下降低和阻斷血纖蛋白凝塊的裂解 的能力,2. _通過作為一種不改變血纖蛋白凝塊的形成的分子。MMP-10不是一種通過與止血系統(tǒng)無關的機制起作用的蛋白質,不會存在常規(guī)的抗 血纖蛋白溶解的血栓溶解并發(fā)癥。此外,MMP-10的選擇性阻斷不會導致與MMP的非選擇性抑制作用相關的副作用, 例如,肌骨胳的綜合征,其中牽涉其他MMP例如MMP-9和MMP-14。MMP-10中和抗體首先,在本發(fā)明的上下文中,術語“抗體”包括多克隆抗體、單克隆抗體、重組抗體、 嵌合抗體、人源化抗體和完全的人類抗體。多克隆抗體原本是在用抗原免疫的動物的血清中產生的抗體分子的異質混合物。 它們還包括從異質混合物獲得的單特異性多克隆抗體,例如,通過在具有感興趣抗原的單 個表位的肽的柱中層析。單克隆抗體是特異于抗原的單個表位的抗體的同質群體。這些單克隆抗體可以 通過已經描述的常規(guī)技術來制備,例如Kiihler和Milstein[Nature,1975 ;256 =495-397] 或 Harlow 禾口 Lane[ "Using Antibodies. A Laboratory Manual,,,E. Harlow 禾口 D.Lane, Publisher :Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York ; 1998 (ISBN978-0879695439)]。嵌合抗體是通過來自不同動物物種的抗體的克隆或重組構建的單克隆抗體。在本 發(fā)明的典型的但是非限制性的結構中,嵌合抗體包括單克隆抗體的一部分,一般是可變區(qū) (Fv),其包括用于識別的位點并與抗原結合,以及與人類抗體相應的另一個部分,一般是包 括恒定區(qū)和鄰近的恒定區(qū)的部分。人源化抗體是通過將鼠單克隆抗體的超變互補決定區(qū)(CDR)克隆和嫁接到人類 抗體中,取代其自身的超變CDR來構建的單克隆抗體。完全人類抗體是在具有人類免疫系統(tǒng)的轉基因動物中產生的、或通過人類免疫細胞(包括遺傳免疫和傳統(tǒng)的、有和沒有佐劑、使用純的或不純的抗原;或通過向免疫系統(tǒng)暴 露抗原的任何方法)的體外免疫、或通過從人類免疫細胞產生的天然/合成文庫產生的抗 體。這些抗體可以獲自和選自轉基因動物(例如,小鼠),向所述動物中克隆了人免疫球蛋 白的基因,以及用目標抗原免疫所述動物。同樣地,這些抗體可以通過選擇單鏈可變片段 (scFv),或通過結合噬菌體文庫中呈遞(噬菌體展示)的人類抗原(Fab)、之后克隆和嫁接 到人類抗體中,或通過文庫的產生和展示的任何其他方法來獲得,所述文庫通過克隆兩條 鏈的可變區(qū),之后組合/突變這些來產生抗體文庫來產生。并且,本發(fā)明的抗體可以是任何免疫球蛋白類型或亞類,特別是IgG、IgM、IgA、IgD 和 IgE0在特定的實施方式中,抗體是完整抗體,包括天然免疫球蛋白典型的所有功能區(qū) 域,特別是用于識別和特異性結合抗原的區(qū)域。其次,術語“抗體”還包括抗體片段,從蛋白質或通過重組技術獲得,其在原核生 物、酵母、真核生物中表達,是糖基化或去糖基化的,可以由通過結合肽相互連接的抗體的 可變區(qū)組成(SCfv),或由靠近重鏈的CHI恒定區(qū)(Fd)的可變區(qū)、通過半胱氨酸或通過肽 和二硫化物橋連接到輕鏈來組成,或是新的變體,例如僅僅重鏈,或由這些制成的任何修飾 體,其目的是使它們更具特異性、更低免疫原性(人源化)或在生物液體中更加穩(wěn)定,通過 結合MMP-IO的活性中心或降低蛋白質活性的任何其他區(qū)域而具有抑制MMP-IO的能力。在本發(fā)明的上下文中,術語MMP-IO的“中和”或“拮抗”抗體是指一種在上文 所述的術語中定義的抗體,其能夠以納摩爾或皮摩爾范圍內的親和力識別和特異性結合 MMP-IO0并且,這種抗體能夠完全或部分地抑制或阻斷MMP-10的活性。特別是,這種抗體 能夠抑制或阻斷MMP-10作為血纖蛋白凝塊溶解的促進劑的作用,降低裂解時間(血纖蛋白 溶解_血栓溶解活性)。在特定的實施方式中,所述中和抗體抑制MMP-10對纖溶酶原激活 物(tPA、uPA,等等)發(fā)揮的佐劑作用。獲得MMP-10中和抗體本發(fā)明的中和抗體可以通過抗體生產已知的常規(guī)方法來產生。這不代表任何限 制,使用的方法可以包括動物中的免疫技術,包括人免疫球蛋白基因的轉基因動物,通過 雜交瘤的單克隆抗體生產,通過抗體文庫的生產,其可以是天然的、合成的或來自感興趣的 抗原免疫的生物體的,可以通過各種不同的呈遞或展示方法(噬菌體展示、核糖體展示,等 等)、之后通過遺傳工程技術的方法來選擇,可以在被設計用于不同大小、組成和結構的重 組抗體生產的載體中重新設計和表達??贵w的生產和純化的主要方法的綜述可以在下列中 找到"Handbook of Therapeutic Antibodies", S.Dubel, Publisher =Wiley-VCH, 2007, Vols :I to III(ISBN 978-3527314539);"Antibodies VoIume 1 Production and Purification,,,G. Subramanian Ed., Publisher =Springer,1st Ed,2004(ISBN978-0306482458);"Antibodies :Volume 2 :Novel Technologies and Therapeutic Use,,, G. Subramanian Ed. , Publisher =Springer,1st Ed,2004(ISBN978-0306483158);"Molecular Cloning :a Laboratory manual,,,J. Sambrook 禾口 D. W. Russel Eds. , Publisher :Cold Spring Harbour Laboratory Press,3rd edition,2001 (ISBN
      7978-0879695774)。在本發(fā)明的特定的非限制性實施方式中,獲得和產生MMP-10的中和單克隆抗體 的過程可以包括以下階段1.-用MMP-10或MMP-10的免疫原性片段的溶液或含有MMP-10或衍生物的質粒免
      疫小鼠。2.-通過Western印跡、ELISA或免疫細胞化學選擇具有針對所述抗原的多克隆反 應的那些動物。3.-進行動物脾臟與骨髓瘤細胞(SP2/0_Agl4 ;P3X63_Ag8. 6. 5. 3 ; P3-NS-I-Ag4-l ;等等)的融合,來產生不同細胞類型之間的雜交體;選擇產生抗體以及在 HAT (次黃嘌呤、氨蝶呤和胸腺嘧啶核苷)培養(yǎng)基中永生的動物淋巴細胞B和骨髓瘤細胞的 雜交體。4.-選擇分泌感興趣的抗體的雜交瘤,換言之,抑制MMP-10的活性的抗體。為 此,采集含有雜交瘤的所有反應孔的上清液的樣品來進行免疫分析使用包被ng或μ g量 MMP-10的平板進行ELISA分析;在4°C孵育15小時并用適合的蛋白質阻斷之后,添加培養(yǎng) 物的上清液,洗滌反應孔,然后添加二級小鼠抗免疫球蛋白。在洗滌和用酶反應顯色之后, 檢測出顏色并且吸收度提高的反應孔可能含有分泌針對MMP-10的抗體的雜交瘤的克隆。5.-通過使用熒光底物進行分析,選擇能夠抑制MMP-10的活性的那些雜交瘤。使 用包被有各種濃度的抗MMP-10抗體(R&D systems, Clonll0343)的微量培養(yǎng)板,以及溶 基質素的熒光底物(MCA-Arg-Pro-Lys-Pro-Val-Glu-Nval-Trp-Arg-Lys-[DNP]-NH2) (R&D systems ;ES002,Abingdon,Μ)。每5分鐘讀取熒光2小時(在熒光分光光度計(SpectraMAX GeminiXS, Molecular Devices, CA, USA)中測量 320nm 激發(fā)、405nm 發(fā)射)。相對于活性 MMP-10的恒定濃度,選擇在最低濃度下在37°C與蛋白質預孵育30分鐘之后降低MMP-10的 活性達至少50%的那些雜交體。在產生所選定上清液的反應孔中的、生產抗體的細胞進行生長,并在液氮中冷凍。6.-確保分泌抗MMP-10抗體的每個細胞培養(yǎng)物是單克隆的。應用克隆或限制稀釋 的技術,在新的培養(yǎng)物微量培養(yǎng)板中、從在第一次ELISA分析和活性分析中為陽性的原始 培養(yǎng)物或干細胞開始、生長分離的細胞。一旦從一個或更多個細胞產生的新的集落獲得了 足夠的大小,采集它們的新的上清液,將它們進行新的ELISA和活性分析。重復該過程,直 到所分析的上清液的100%含有針對MMP-10的活性的抗體。7.-在 AKTA FPLC 設備,GE Healthcare Bio-Science 中,通過液相層析(免疫親 和、親和、陽離子交換、羥磷灰石、疏水性相互作用、凝膠過濾層析,等等)從上清液純化抗 體。8.-最后,分析選擇的抗體的純度、特異性、親和力和血纖蛋白溶解活性。例如,通過利用Coomassie藍染色來展現(xiàn)單個條帶存在的聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE)可以測定抗體純度。通過在ng到μ g濃度下和通過化學發(fā)光來顯色,通過針對其他金屬蛋白酶(特別 是與其享有最大同源性的MMP-3)的Western印跡可以測定抗體特異性??贵w親合常數可以從離解常數(Kd)計算,定義為相對于提高的抗體濃度、呈現(xiàn)用 MMP-10包被的ELISA的吸收度值所獲得的斜率。
      這種抗體的血纖蛋白溶解活性的中和能力可以通過濁度形成分析和血纖蛋白凝 塊的裂解以及在聚合的血纖蛋白分析中來分析,例如,通過在實施例1和2中描述的分析。此外,編碼MMP-10中和抗體的核酸可以充當用于獲得嵌合或人源化抗體的中間 產品,所述嵌合或人源化抗體也是MMP-10的中和劑。不論上述的,MMP-10的中和抗體的生產方法不是關鍵的方面,因而本領域的技術 人員可以容易地通過生產抗體的任何常規(guī)方法生產本發(fā)明的抗體??寡w蛋白溶解治療的治療適應癥一般地,MMP-10中和抗體(或含有它的藥物)對于抗血纖蛋白溶解治療是有用的。在特定的實施方式中,本發(fā)明的抗體對于出血或出血性并發(fā)癥的處置、預防或治 療是有用的。在某些情況下,要治療的出血性并發(fā)癥可以在患有超血纖蛋白溶解狀況以及凝血 缺陷的患者中發(fā)生,所述狀況和缺陷可以由先天的異常(血友病A、von Willebrand病、 PAI-I或alpha2-抗血纖維蛋白酶缺陷)、或由獲得性并發(fā)癥引起,例如來自使用抗凝試劑 的治療,或在患有彌漫性血管內凝血(DIC)的患者中,某些手術,或富含血纖蛋白溶解激活 物的組織或器官的腫瘤,或在不能清除纖溶酶原激活物的情況下,例如,嚴重的肝臟疾病, 或與DIC相關的急性早幼粒細胞白血病。過度出血性并發(fā)癥包括在月經出血(月經過多)、胃腸出血、尿出血、牙齒出血和 在患有由于上述某些原因(血友病A^onWillebrand病、抗凝劑治療、DIC,等等)的凝血缺 陷的患者中的特定的出血。在其它情況下,要治療的出血和出血性并發(fā)癥可以在外科操作中(一般地,手術, 包括移植和活檢),在對富含纖溶酶原激活物的器官的手術(前列腺、肺、子宮)中,在對處 于超血纖蛋白溶解狀況中或患有早先指出的凝血缺陷的患者的手術中發(fā)生。在這些情況 中,目的是通過用包含MMP-10中和抗體的藥物的治療(在手術之前、期間和/或之后)降 低來自手術的出血。并且,抗MMP-10抗體的表面使用對于在進行血管移植之后恢復血管的流通是有 用的,包括在血纖蛋白凝膠型制劑中的抑制物來防止與外科傷口相關的出血。在本發(fā)明的上下文中,術語“治療”包括施用含有MMP-10中和抗體的藥物來預防 或降低超血纖蛋白溶解狀況的癥狀的開始、并發(fā)癥或生物化學的適應癥,最特別地,防止出 血性事件的早期存在。治療可以是預防性治療來防止臨床的或亞臨床的癥狀的顯現(xiàn)。還可 以是治療性治療來在癥狀出現(xiàn)之后抑制或減輕癥狀,以及如果輸血是必需的,可以作為輸 血的替代。藥物組合物根據本發(fā)明,中和抗體在作為用于抗血纖蛋白溶解治療的藥物的藥物組合物的制 備中使用。所述藥物組合物至少包含處于藥學上可接受的載體中的MMP-10中和抗體。本發(fā)明的抗體或藥物組合物對于胃腸外施用是特別有用的,例如,對于皮下的、肌 肉內的或靜脈內的施用。在本發(fā)明的特定的而非限制性的實施方式中,所述藥物組合物含有溶于可接受的 載體,例如,水性載體,例如水、緩沖的水、鹽水、甘氨酸或其他類似載體中的,針對MMP-10的中和抗體的溶液。這些溶液是無菌的,一般是無顆粒的。所述藥物組合物可以含有其他 額外的成分,例如調整PH值的試劑、防腐劑,等等。在另一個實施方式中,所述藥物組合物將適合于局部施用,以凝膠或膏劑的形式, 或在拔牙后的出血的情況下甚至是漱口藥的可飲用的安瓿瓶的形式。藥物施用的各種組合物和藥物形式,以及獲得它們所必需的賦形劑的綜述可以在 例如 “Tecnologi a farmaceutica", J. L.Vila Jato, 1997Vols I and II, Ed. Sintesis, Madrid ;或“Handbook of pharmaceuticalmanufacturing formulations", S. K. Niazi, 2004 Vols I to VI, CRC Press, Boca Raton 中找到??梢耘c載體組合來構成單劑量形式的活性成分(抗體)的數量一般地將是生產治 療效果的數量。處于劑量單位形式的胃腸外藥物組合物的制備便于劑量的施用和均勻性, 因而這是非常有益的。這些劑量單位可以由本領域的技術人員根據常規(guī)技術和考慮需要實 現(xiàn)的特定治療效果和特定的治療適應癥來制備。本發(fā)明的藥物組合物的有效劑量將取決于多種因素,包括施用的方法和途徑、目 標作用位點、患者的生理狀態(tài)、其他施用的藥物、是預防性還是治療性處理。然而,在特定的 實施方式中,本發(fā)明的中和抗體的要施用的劑量單位在ι. O和10. Omg/kg之間。一般地,施 用方式將包括具有本發(fā)明的抗體的組合物的重復施用,每次施用的間隔可以是每天的、每 周的、每月的、每兩個月的,或藥理學家根據患者的需要(特定的適應癥、嚴重度,等等)和 取決于常規(guī)的標準藥理學方案建立的任何其他的間隔。本發(fā)明的實施例下文描述了實施例,說明了直接地或與其他纖溶酶原激活物尿激酶(UPA)和組 織纖溶酶原激活物(tPA)組合地,對基質金屬蛋白酶MMP-10和MMP-3的血纖蛋白溶解和血 栓溶解活性的影響。對于實施例,使用了以下的-重組的MMP-10,作為具有20-30%的48kDa成熟酶的58kDa的酶原獲得(R&D Systems,910-MP,Abingdon,UK),其是用 TCNB 緩沖液(50mM Tris_HCl,pH 7. 5, IOmM CaCl2, 150mM NaCl,0. 05% Brij35)重構的。-重組的MMP-3,作為 52kDa 的酶原獲得(R&D Systems,513-MP,Abingdon,UK),在 具有 12. 5mM Tris、5mM CaCl2,0. 025% Brij35 和 50%甘油的溶液中提供。(uPA) (Vedim Pharma SA ;628602, Barcelona, Spain).-重組的組織纖溶酶原激活物(tPA)(Boerhinger Ingelheim ; 985937 Actilyse , Ingelheim,Germany)0對于血栓溶解劑活性的評估,濁度測定法被用于監(jiān)測血漿的樣品的血纖蛋白凝 塊的形成和裂解,根據由von dern Borne和合作者早先描述的方案[Blood,1995 ;86 3035-3042]。并且,為了評估對血纖蛋白裂解的活性,使用了在Edward[J. Clin. Path.,1972 ; 25 335-337]所描述的操作之后對血纖蛋白斑塊的分析。實施例1 :MMP-10和MMP-3對凝塊的形成和裂解的影響如早先提及的,MMP-10和MMP-3對止血系統(tǒng)的作用根據von dernBorne等人描述 的操作來評估。在這種方法中,對于每個過程,評估了隨著時間的過去作為凝塊的形成和裂解期間的指標的、混濁度/吸收度方面的改變。通過使用光度計讀取器,在我們的實例中是 ELISA讀取器(Fluostar Optima,BMG Labtech),在凝塊的形成和裂解階段期間,讀取405nm 處的吸收度,進行了混濁度的測量?;鞚岫?吸收度的提高表明血纖蛋白凝塊的形成,而這 個參數的降低表明凝塊的裂解。對于凝塊的形成,75 μ 1的檸檬酸化血漿、75 μ 1的HEPES緩沖液(25mM HEPES, 137mM NaCl,3. 5mM KCl,6mM CaCl2,1. 2mMMgCl2 禾口 0. 1% BSA,pH = 7. 5)禾口 10 μ 1 的 150mM CaCl2在微量培養(yǎng)板反應孔中混合。平板在37°C孵育,測量405nm處的吸收度2h,每30秒 讀取。為了研究MMP-10對凝塊形成的作用,活化的MMP-10 (50、100和200nM)添加到血 漿和HEPES緩沖液的初始混合物中。在實驗中使用之前,MMP-10通過在37°C熱處理1小時 來活化。在平行的分析中,還分析了 MMP-3(200nM)對凝塊形成的影響。在這種情況下, MMP-3 首先用 ImM ρ-氨基苯基醋酸汞(ΑΡΜΑ,164610,MD Biosciences, La Jolla, USA)在 37°C活化24小時。在附圖IA中可以看出,在使用的任何劑量下,MMP-10不誘導凝塊形成的速度方面 的改變,也不影響達到的最大混濁度(表1)。然而,MMP-3在形成的凝塊的最大吸收度/混 濁度方面誘導了 50%的降低,可能是通過它對纖維蛋白原的直接蛋白水解作用。這些結果顯示了,與對MMP-3所描述的相比,MMP-10不改變凝塊的形成速率,因為 它對纖維蛋白原沒有任何活性。然后,研究了血纖蛋白凝塊裂解的速率。如在前述小節(jié)中,使用了 HEPES緩沖液中 再鈣化的血漿,在濁度計測量的開始時,與纖溶酶原激活物同時地向其中添加MMP-10 (或 MMP-3),纖溶酶原激活物選自30U/ml的組織纖溶酶原激活物(tPA)或135U/ml的尿激酶 (uPA)。使用的tPA和uPA的濃度在早先的劑量_反應研究中測定,其中選定的劑量是在 2小時的間隔中完全地裂解血纖蛋白凝塊的劑量。如在附圖IB和表1中可見的,在不存在tPA和uPA的情況下MMP-10不導致血纖 蛋白凝塊的裂解,而在存在兩種激活物tPA或uPA的情況下,它誘導血纖蛋白凝塊的裂解速 率的顯著提高。在測試的最大劑量MMP-10 (200nM)下,裂解時間的降低(一半凝塊裂解的 時間)在存在tPA時是15分鐘(52. 9分鐘對比68. 3分鐘,ρ < 0. 01),在存在uPA時是5 分鐘(42分鐘對比47. 5分鐘,ρ < 0. 05)。裂解時間的這種降低代表了存在tPA的情況下 的20%降低,和uPA m 10%降低。相反,MMP-3不改變存在tPA的情況下的血塊裂解速率。這些結果表明,與MMP-3相比,MMP-10不能消化血纖蛋白,但是提高血纖蛋白溶解 酶原和血纖蛋白溶解(tPA和uPA)激活物的血纖蛋白溶解效力。MMP-10不具有作用于內源 的血纖蛋白溶解的能力,將防止或弱化出血的起始,使它成為溶解血栓療法中用作共同佐 劑的良好候選物。表1.在存在纖溶酶原激活物(tPA或uPA)的情況下血纖蛋白凝塊的裂解時間(以 分鐘表示)
      11 實施例2 =MMP-IO對血纖蛋白的降解的影響根據上述的Edward的操作,通過測量在聚合的血纖蛋白斑塊上出現(xiàn)的裂解的暈 或區(qū)域,研究了對血纖蛋白裂解的影響。血纖蛋白斑塊的制備從6mg/ml人纖維蛋白酶原(Sigma,F(xiàn)3879,Saint Louis,M0, USA)在佛羅那緩沖液(BioWhittaker,12-624E,Cambrex, MD, USA)中的溶液開始,其被過 濾,向其中添加等體積的50mM CaCl20這種溶液(6ml)與1國際單位(NIH單位)的凝血酶 (Enzyme Research Lab ;HT1200a, Swansea, UK)混合,容許聚合 6 小時。為了評估對不同的血纖蛋白斑塊的血纖蛋白溶解能力,添加了 tPA(lU/ml)、 MMP-10 (200nM)或兩者的組合。如在附圖2中可見的,單獨的MMP-10不產生聚合的血纖蛋白的裂解,而tPA產 生了顯著的暈。然而,tPA與MMP-10的組合顯著地提高了聚合血纖蛋白的裂解的區(qū)域 (188.6% ),該事實確認了與作為纖維蛋白溶解試劑的纖溶酶原激活物組合、MMP-10對血 纖蛋白溶解的促進效果。實施例3 :tPA與杭MMP-10杭體誘導的血纖蛋白溶解和凝塊裂解的抑制作用根據實施例1和2的結果,在存在(比例1 2)或不存在相同濃度的阻斷 其活性的單克隆抗體(R&D Systems, MAB9101, Abingdon, UK)或鼠IgG2B同種型對照 (eBioscience,16-4732,San Diego, CA, USA)的情況下,通過同時添加不同劑量的活性 MMP-10,分析了 MMP-10對tPA誘導的凝塊中血纖蛋白裂解的效果的特異性。酶阻斷酶活性的抗體的比例是早先在包被有抗MMP-10抗體(R& D systems, Clonll0343)的微量培養(yǎng)板中以及使用發(fā)熒光的溶基質素底物(MCA-Arg-Pro-Lys-Pro-Va I-Glu-Nval-Trp-Arg-Lys-[DNP]-NH2) (R&D systems ;ES002,Abingdon,UK) [Lombard等人; Biochimie,2005 ;87 :265_272]的 MMP-10 活性試驗中測試的。熒光(320nm 激發(fā)和 405nm 發(fā)射)在熒光分光光度計(SpectraMAX GeminiXS,MolecularDevices,CA,USA)中測量 1 小時,確定了比例1 2完全地抑制活性酶的濃度(附圖3)。通過Western印跡來除去與其他金屬蛋白酶的交叉反應的存在,研究了抗體的特 異性(附圖4)。MMP-10抑制物抗體僅僅識別該金屬蛋白酶,因而盡管金屬蛋白酶家族中的 高同源性,特別是與另一種溶基質素MMP-3的高度同源性,它激發(fā)了對其的特異性抑制。結果顯示了,對血纖蛋白溶解的共同輔助效果是對MMP-10特異性的,因為這在存 在抗MMP-10抗體的情況下降低。當添加所述抗體來阻斷血漿MMP-10的內源活性時,這種 效果是非常驚人的(附圖5)。結果確立了,血漿中缺乏MMP-10阻止了血纖蛋白凝塊的裂 解,甚至在存在tPA或uPA的情況下(表1)。這些結果在對聚合的血纖蛋白斑塊的試驗中證實了。如附圖6中所示,在存在 抗MMP-10抗體的情況下,組合的tPA =MMP-IO產生的裂解的區(qū)域被降低了(91. 2%對比 188. 6%),而對照抗體沒有作用(184. 6%)0這些數據確認了 MMP-10的特異性抗體中和以 及阻斷血纖蛋白凝塊的藥理學溶解的用途。實施例4 出血時間為了分析缺乏MMP-10的影響,研究了在1月齡的17只MMP-10敲除的小鼠(KO) 中和14只野生小鼠(WT)中的出血時間。動物用氯胺酮(100mg/kg)和賽拉嗪(5mg/kg)的 混合物腹膜內麻醉,在熱的毯子中保持在37°C。用解剖刀切下最后5mm的尾部,在37°C浸 入ImL的0.9% NaCl中。測量從出血的開始到血液自發(fā)地停止流動的時間。并且,通過在 560nm處采集的鹽水溶液中血液的吸收度,測量了失血的數量,結果與用已知體積的小鼠血 液構建的標準曲線相比較。結果出血時間提供了體內止血的另外的度量。如表2中所見的,MMP-10K0小鼠中的出血時間顯著地低于野生小鼠所顯示的。在 出血期間的失血是顯著地更低的,其表明,在不存在MMP-10的情況下,控制出血的能力高 于存在MMP-10的情況。表2
      MMP-IOKO(WT)P出血時間(S)44. 0±24. 498. 9±64. 00. 008失血(μ )4. 2±0. 912. 1±12. 10. 036
      1權利要求
      基質金屬蛋白酶 10(MMP 10)的中和抗體在制備用于抗血纖蛋白溶解治療的藥物中的用途。
      2.根據權利要求1的用途,其中所述用途是在制備用于治療出血和出血性并發(fā)癥的的 藥物中的用途。
      3.根據權利要求2的用途,其中所述用途是在制備用于在患有由先天異常引起的超血 纖蛋白溶解狀況的患者中治療出血和出血性并發(fā)癥的藥物中的用途。
      4.根據權利要求2的用途,其中所述用途是在制備用于在接受抗凝血劑治療的患者中 治療出血和出血性并發(fā)癥的藥物中的用途。
      5.根據權利要求2的用途,其中所述用途是在制備用于在患有彌漫性血管內凝血的患 者中治療出血和出血性并發(fā)癥的藥物中的用途。
      6.根據權利要求2的用途,其中所述用途是在制備用于治療由外科操作引起的出血和 出血性并發(fā)癥的藥物中的用途。
      7.根據權利要求2的用途,其中所述用途是在制備作為急性出血中輸血的替代的藥物 中的用途。
      全文摘要
      本發(fā)明涉及基質金屬蛋白酶-10(MMP-10)的中和抗體在制備用于抗血纖蛋白溶解治療以及治療各種病因的出血和出血性并發(fā)癥的藥物中的用途。
      文檔編號C07K14/81GK101918441SQ200880104515
      公開日2010年12月15日 申請日期2008年6月26日 優(yōu)先權日2007年6月26日
      發(fā)明者J·A·帕拉摩弗南德茨, J·A·羅德里古茨加西亞, J·奧爾貝洛帕特古, R·塞拉諾加斯 申請人:西馬生物醫(yī)學計劃公司
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