專利名稱：新的凝血酶功能化合物和基于其的藥物組合物的制作方法
新的凝血酶功能化合物和基于其的藥物組合物本發(fā)明涉及新的化合物，這些化合物作為凝血酶抑制劑的用途，以及基于它們的 藥物組合物，且其可用于治療和預防凝血酶-相關的血栓栓塞性事件，以及用于研究目的。凝血酶為血液凝結系統(tǒng)(將可溶血漿蛋白(纖維蛋白原)轉化為不溶的纖維蛋白 凝塊)的主要的酶。凝血酶形成(造成纖維蛋白聚合反應的過程)和凝血酶抑制(亦即抑 制凝血酶活性的過程)之間存在脆弱的平衡。過量的凝血酶形成造成血栓形成。直接凝血酶抑制劑是對強烈直接結合至活性酶中心且阻斷纖維蛋白原(天然底 物)脫離活性中心的抑制劑的命名。該阻斷中止了凝血酶-催化的纖維蛋白從纖維蛋白原 的轉化，且(作為結果)阻止纖維蛋白凝固并減緩或完全阻止血液凝固。因此，為了具有強 烈的抗凝血酶活性，直接凝血酶抑制劑應當與活性凝血酶中心具有最大可能強度的結合。 為此目的，它們應當滿足由凝血酶分子的活性中心的結構所指示的幾個條件?；钚阅钢行耐ǔ榱吮憷譃閹讉€穴(cavity)或袋(pocket)，以接受在酰 胺解反應發(fā)生點附近的其纖維蛋白原底物的不同氨基酸。袋S1為一個深且窄的穴，其具有 由憎水性氨基酸殘基和負電荷源形成的壁，且該負電荷源事實上在該穴的底部并在氨基酸 Asp 189的羧基基團存在下產生。袋S1起到將纖維蛋白原中的主要氨基酸殘基(賴氨酸或 精氨酸)直接結合至肽鍵斷裂點(在賴氨酸或精氨酸的C-端)的作用。該主要氨基酸的 長直鏈烴殘基延伸了袋S1的全長，而在烴殘基末端的正電荷主要片段對袋S1底部的負電 荷天冬氨酸殘基形成了鹽橋。因此，袋S1對于鑒定纖維蛋白原的多肽鏈中的主要氨基酸殘 基是最適宜的。另一個袋S2，通過非極性氨基酸殘基形成，緊鄰著袋S1，且起到鑒定纖維蛋白原 的氨基酸序列中在袋S1接收的主要氨基酸后(在主要氨基酸的N-端)的次要憎水性氨基 酸(纈氨酸、異亮氨酸和亮氨酸)的作用。袋S2具有比袋S1稍微較小的容積，且其并不含 有任何帶電氨基酸基團。因此，袋S2對于結合非極性脂肪氨基酸的小型烴殘基是理想適宜 的。發(fā)現另一個袋S3在凝血酶表面上與袋S2相接。其也是憎水性袋，但是其具有相 當大的容積且不是精確限定的，因為其相當大的一部分為開放的，且直接暴露于溶劑。袋S3 起到了接收纖維蛋白原的大型脂肪和芳香憎水性氨基酸片段的作用，其中該片段在肽鏈中 距離斷裂處兩至三個單元(link)。直接凝血酶抑制劑必須以優(yōu)化的方式填充于凝血酶分子的活性中心的這三個袋 中。例如，公知的三肽抑制劑D-Phe-Pro-Arg通過X-射線結構分析發(fā)現與活性凝血酶中心 反應如下精氨酸殘基填充袋S1，脯氨酸殘基占據袋S2，和D-苯丙氨酸占據袋S3。在目前臨床實踐中使用以控制血栓形成的藥物通常并不適于抑制血液中已經形 成的過量的凝血酶。醫(yī)生傾向于自由地使用間接凝血酶抑制劑，如未分級的肝素和低分子 量肝素，和維生素K拮抗劑(華法林(warfarin))。所有的這些藥物本身并不能抑制在系 統(tǒng)中累積的過量凝血酶。各種肝素僅加速了存在于血漿中的天然凝血酶抑制劑-抗凝血酶 III (AT III)-的抑制作用，且因此如果患者血漿中的AT III含量出于這種或那種原因非常 低時，肝素僅具有弱的抗凝血作用，。維生素K拮抗劑通過抑制肝中凝血因子的前體的合成
6而降低凝固速率。明顯地，這為相對較慢的選擇，其在需要快速抑制血液中存在的凝血酶的 緊急情況下不能提供幫助。間接凝血藥治療的限制已經導致了藥物公司意欲開發(fā)強效的且具選擇性的直接 凝血酶抑制劑。當目前為止，大量的此類凝血酶抑制劑已經被開發(fā)出來。然而，它們中的大 部分并沒有顯示出藥物所需的所有性質。繼續(xù)進行研究以改善它們的藥理學性質如有效時 間、低毒性、水中的溶解度、口服生物利用度等。理想的凝血酶抑制劑還必須對固定于血塊 中的凝血酶有效。其必須對凝血酶具有選擇性，而不抑制血纖蛋白溶解中涉及的蛋白酶，在 血液中保持很長時間，在肝中抵抗酶和細胞色素P450的作用，保持于水性介質中，對于血 液蛋白結合免疫(或僅稍微結合)，且為無毒的。然而，對化合物的初步測試對于其滿足這 些要求中的合適性而言是非決定性的。盡管大量有效的低分子量凝血酶抑制劑已經被合成 了，但是在今天使用的僅有一個(阿加曲班，合成于日本)(U.S.專利5，214，052，1993)，其 已經通過了所有必須的臨床測試。然而，其并不是理想的抑制劑，因為其在溶液中具有低溶 解度(其血漿中T1/2為36分鐘)。這意味著對于開發(fā)新的有效且安全合成凝血酶抑制劑仍 然存在著挑戰(zhàn)。目前可得到的公開的專利和科學研究描述了大量的凝血酶抑制劑。這些文獻總結 如下U.S.專利申請 2006/0014699 (Astra Zeneca AB) ,2006,和 U. S.專利 5，795，896 (Astra Aktiebolag)，1998，描述了包含美拉加群抑制劑的抗凝血藥物化合物?，F有技術中也已知吡咯烷凝血酶抑制劑(其描述于U. S.專利5，510，369 (Merck & Co)，1996中)和吡啶凝血酶抑制劑(如描述于U. S.專利5，792，779 (Merck & Co)，1998 中的那些)。本申請人已經研究了許多科技文獻和著作，其含有關于已有抑制劑的結構以及抑 制劑和凝血酶分子之間的反應機理的信息。研究的文獻，如表1中所顯示，事實上包括已知 為凝血酶抑制劑的所有種類的化合物。表1中所列的文獻已經相當足夠了(即使不使全部 的話)。由于我們開發(fā)了自己的凝血酶抑制劑，我們故意避開了這些文獻中描述的結構。我 們引用的文獻并不含有具有我們作為發(fā)明所要求保護的新化合物的機構特征的凝血酶抑 制劑的信息。本發(fā)明的實際目標為開發(fā)能夠作為直接凝血酶抑制劑的新化合物。這些抑制劑可 用于治療在各種病理學影響下的有機體中發(fā)展的急性血栓性病癥。有機體大量的不同的病 理學病癥涉及止血體系的病癥。作為疾病如心肌梗死、中風、深靜脈或肺動脈的血栓形成的 的結果而出現的血栓栓塞性病癥為全世界死亡的主要原因。并不令人驚訝的發(fā)現，進行了 多年研究努力以開發(fā)能夠用作有效安全臨床藥物的藥品。這些藥物主要為具有抗凝血性質 的抗凝血藥物。除非另有說明，在本說明書中使用下列定義活性中心為蛋白質大分子在生化反應中起著關鍵作用的區(qū)域。蛋白質是指蛋白質大分子。目標蛋白質是指在結合過程中涉及的蛋白質大分子。配體是指低分子量化學結構的集合。結合過程是指配體和目標蛋白質的活性中心之間形成范德華力或共價絡合
7(complex)0篩選是指在一組化學結構的化合物中鑒定與蛋白質大分子的特定區(qū)域選擇性反 應的化合物。校正定位(Correct positioning)是指將配體置于相應于配體-蛋白絡合物的最 小自由能的位置。選擇性配體是指以特異性方式結合至具體目標蛋白的配體。有效性(Validation)是指一系列計算和比較方法學以評估操作系統(tǒng)的質量和其 在從隨機組的配體中選擇可靠結合至所給目標蛋白的配體中的效力。參照蛋白是指用于調節(jié)模型計算(評分)參數以符合實驗數據的蛋白，或在操作 系統(tǒng)有效性期間，或以評價具體抑制劑的特異性結合。特異性結合配體是指僅結合至特定蛋白而不結合至其他蛋白的配體。抑制劑是指結合至具體目標蛋白的活性中心且阻止生化反應的正常進行的配體。對接(Docking)是指在蛋白的活性中心定位配體。分數(Scoring)是指估算結合配體至蛋白所需的自由能的計算。A G結合是指結合配體至目標蛋白所需的最終自由能計算增益(freeenergy calculation gain)(使用 SOL 軟件)。(V6烷基是指具有1-6個碳原子的包括直鏈或支鏈烴鏈的烷基，例如，甲基、乙基、 正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基等。(V6烷氧基是指具有1-6個碳原子的包括直鏈或支鏈烴鏈的烷氧基，例如，甲氧 基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基等。鹵素是指氯、溴、碘或氟?？伤幱名}是指由式(I)活性化合物形成的任何鹽，除了為有毒的或抑制活性化合 物的吸收和藥效的鹽。此類鹽可通過式(I)化合物和有機堿或無機堿之間的反應來制備， 如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、甲胺、乙胺等。溶劑合物是指式(I)的活性化合物的結晶形式，其晶格包含該式(I)活性化合物 從其中結晶的水或其他溶劑的分子?？伤幱幂d體是指必須與組合物的其他成分相容的且對于接受者無害的載體，亦 即，以對細胞或哺乳動物無毒的劑量和濃度使用。通常，可藥用載體為水性PH緩沖溶液。 生理學上可接受的載體的實例包括緩沖液如基于磷酸鹽、檸檬酸鹽或其他有機酸的鹽的溶 液；抗氧化劑，包括抗壞血酸、低分子量的多肽(小于10個殘基)；蛋白質，如血清白蛋白、 明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，如聚乙烯基吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天 冬酰胺、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖，和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯 合劑，如EDTA ；和糖醇，如甘露糖醇或山梨糖醇。治療有效量是指在哺乳動物有機體中達到所需凝血酶抑制程度需要的量。哺乳動物，在本文中所使用的意義，包括靈長類動物(例如，人類、類人猿、非_類 人猿，和低等猴類)，食肉動物(例如，貓、犬和熊)，嚙齒類動物(例如，小鼠、大鼠和松鼠)， 食蟲動物(例如，駒鼯和鼴鼠)等等。發(fā)明人所設定的實際目標通過開發(fā)通式(I)化合物包括其可藥用鹽或溶劑合物 而達到
8
A-B-C (I)其中C選自下列結構 其中禮、R2、R3和R4彼此獨立地為氫或C^烷基；B為-(CH2)n-，其中n為1至5的整數；和A選自下列結構
其中 R5 選自氫、Ch-烷氧基、CH2NR10Rn 和 CH(CH3)NR10Rn,
Ar
其中R6和R7彼此獨立地為氫、C^e烷基、(V6烷氧基或鹵素； R8為氫或Cm烷基； R9選自下列基團
Rl2
I
zN\ Z Ar /s；
/\ o o
r12
Ar'
O
R10和R12彼此獨立地選自氫、。烷基、(CH2)mC00R13和(CH2)mC0N(R丄，
CN 101861304 A
說 明 書5/45頁
o、
r7vvv
5
v/
,R8
I
/
N
O
,R7
Re \
Rs
10 其中m為1至4的整數，R13為氫或Ch烷基，Rn 為 Ch 烷基或 Ar ；Ar為苯基、吡啶基、噁唑基、噻唑基、噻吩基、呋喃基、嘧啶基、噠嗪基、吡嗪基、吲哚 基、苯并呋喃基或苯并噻吩基，其具有1-5個選自下列的取代基氫、Ch烷基、CH 烷氧基、鹵素、N(R13)2、OH、N02、CN、C00R13、C0N(R13)2 禾口 S02R13。所述通式⑴化合物中排除從該列表排除的化合物是已知的，具體而言，4-氨基-1-[3-[(2_甲基苯基)氨 基]-3-氧代丙基]吡啶鐺氯化物描述于Journal of Medicinal Chemistry, 17 (7), 739-744,1974,題目為“Carbocyclic Derivatives Related to Indoramin” ；4_ 氨 基-l-(2-苯氧基乙基)-吡啶鐺氯化物描述于Journal of Organic Chemistry, 26, 2740-7,1961,題目為"Application of Sodium Borohydride Reduction toSynthesis of Substituted Aminopiperidines, Aminmopiperazines, AminopyridinesAnd Hydrazines，，。 但是，應當注意，這些來源并沒有指出這些化合物用作凝血酶抑制劑的可能性。本發(fā)明的優(yōu)選實施方案描述了下列的權利要求1的化合物，和它們的可藥用鹽或 溶劑合物
接基也位于袋S3中。從結合至活性凝血酶中心的角度來看，該連接基可表示為親水性和憎 水性分子基團，但需要其通過選擇憎水連接基從而作為整體來部分地平衡抑制劑的憎水性 質，以對抑制劑分子給出有利的藥物代謝動力學性質。同樣出于該目的，位于袋S3中的憎 水性片段可使用位于該袋中的在暴露于溶劑一側的憎水性殘基來修飾。本文中描述的凝血 酶抑制劑完全滿足上述要求。本權利要求通過本發(fā)明的凝血酶抑制劑對活性凝血酶中心的選擇性定位(對接) 按照下述程序來證明。對接受到抑制劑分子的總能量的全局最小化的影響?？傄种苿┠芰?由抑制劑結合至活性凝血酶中心的對應構象中的抑制劑的內部張力能量和處于凝血酶區(qū) 域的抑制劑能量所構成。反過來，凝血酶區(qū)域引起與抑制劑分子的靜電、范德華力反應，且 許多反應由凝血酶分子和配體的單獨部分的溶劑化和脫溶劑化反應而引發(fā)。這些反應已經 描述于很多文獻中，且對于本領域的技術人員而言是熟悉的。使用遺傳算法重復多次進行 全局最小化。最小化程序得到凝血酶抑制劑在該酶的活性中心的空間位置和功能分數值， 該值用于估計形成本文所述的凝血酶抑制劑和凝血酶分子的絡合物的自由能。對于本文描 述的抑制劑，功能分數通常小于-5kCal/mol，這與在小分子范圍和下面的抑制常數所一致。 利用功能分數預測的可靠性可通過本領域技術人員已知的各種方法來測試。尤其是，所謂 的凝血酶抑制劑增強系數(表明在隨機分子中已知的活性凝血酶抑制劑的選擇性)基于功 能分數值等于0. 85，這充分證明了預測的可靠性。本文中描述的抑制劑的幾何位置通過前 述的對接程序獲得，且也滿足對于凝血酶抑制劑結合至活性凝血酶中心的優(yōu)化條件，其中 它們的內在抑制活性由凝血酶催化的纖維蛋白原酰胺解反應來顯示。所要求保護的化合物可通過對于有機化學領域的技術人員而言已知的常用方法 而獲得。生物體的許多各種病理學病癥涉及在止血系統(tǒng)中發(fā)展的病癥。在此類病癥如心肌 梗死、中風、深靜脈或肺動脈的血栓形成中出現的血栓栓塞性病癥為世界范圍的主要的死 亡的原因。本發(fā)明也包括藥物組合物，其用于治療和預防凝血酶-相關的血栓栓塞性事件， 其包含治療有效量的權利要求1的化合物或其可藥用鹽或溶劑合物，和可藥用載體。本發(fā)明的化合物可以以它們的生物累積于血液中的任何適宜的方式給藥。這可通 過腸胃外給藥方法得到，包括靜脈內、肌內、經皮、皮下和腹膜內注射。也可以使用其他的給 藥方法，如經由口服施用適宜的組合物通過胃腸道吸收?？诜┯糜捎谄涫褂萌菀锥鴥?yōu)選。 或者，藥物可通過陰道和直腸肌肉組織給藥。此外，本發(fā)明的化合物可以通過皮膚注射(例 如，透皮)或通過吸入給藥。應當理解，優(yōu)選的給藥方法取決于患者的病癥、年齡和易感性。對于口服施用，藥物組合物可以封裝為(例如)片劑或膠囊，還含有可藥用添加 劑，如粘合劑(例如，膠溶玉米淀粉、聚乙烯基吡咯烷酮或羥基丙基甲基纖維素)。填料(例 如，乳糖、微晶纖維素、磷酸氫鈣；硬脂酸鎂、滑石或二氧化硅；馬鈴薯淀粉或淀粉羥乙酸 鈉)；或潤濕劑(例如，月桂基硫酸鈉)。片劑可以為包衣的。液體口服組合物可以以下列 形式制備，例如，溶液、糖漿或懸浮液。此類液體組合物通過通常方法利用可藥用添加劑，如 助懸劑(例如，纖維素衍生物)；乳化劑(例如，卵磷脂)，稀釋劑(純化的植物油)；和防腐 劑(例如，甲基或丙基-n-羥基苯甲酸酯或山梨酸)而得到。組合物也可含有適宜的緩沖 鹽、調味劑、色素和甜味劑。
在這些組合物中的活性成分的含量介于0. 至99. 9%組合物重量之間，優(yōu)選為 5%至 90%。這些凝血酶抑制劑的毒性使用標準藥物規(guī)則在實驗室動物中測量LD5(I(50%數量 的致死劑量)來確定。對于本發(fā)明的優(yōu)選化合物，LD5(I劑量為超過367mg/kg，這與臨床測試 后阿加曲班的致死劑量相一致，阿加曲班的LD5Q = 475mg/kg。為了更好地理解本發(fā)明的主題，下面為一些實施例，其示例性地說明新化合物的 合成，以及用于它們合成的中間體產物的原料，還有用于研究本發(fā)明所要求保護的新化合 物的抗凝血活性的方法的說明。實施例僅為示例性的，且本發(fā)明的思想并不限于下面所給出的實施例的范圍。實施例1
中間體產物3-(3-氯丙氧基)-5-甲基苯酚的合成 將3. 8g(27mmol)的二羥基甲苯(orcin)水合物、4. 8g(30mmol)的 1-溴-3-氯丙 烷，和4.0g(29mmol)的碳酸鉀的混合物于30ml乙腈中在攪拌下沸騰36小時。然后蒸發(fā)反 應混合物，溶于30ml乙醚中，用15ml飽和碳酸鉀溶液洗滌兩次，棄去水層，乙醚層用15ml 的10%氫氧化鈉溶液萃取3次。棄去乙醚層，水層小心地用濃HC1酸化，然后用15ml乙醚 萃取3次。合并乙醚萃取物，用少量的飽和碳酸氫鈉溶液洗滌，并用無水硫酸鈉干燥，用約 1/3份(體積)的己烷稀釋，并通過硅膠層過濾。蒸發(fā)得到1.7g黃色油狀物，為約70%二 羥基甲苯(RfO. 10)和約30% 3-(2-氯丙氧基)-5-甲基苯酚(RfO. 26，產量約1. 2g(22%純 度))的混合物。類似方法用于制備3-(2-氯乙氧基)-5-甲基苯酚(Rf 0.26，產率約1. lg(20%純 度))，從二羥基甲苯水合物和1-溴-2-氯乙烷，以及3- (4-氯丁氧基)-5-甲基苯酚從二羥 基甲苯水合物和1-溴-4-氯丁烷得到。實施例2中間體產物苯磺酸的3-(3-氯丙氧基)-5-甲基苯基酯的合成 將3g(17mmol)苯磺酰氯和2g(20mmol)三乙胺加至1. 6g前述實施例混合物于 30ml無水四氫呋喃(THF)中的溶液中。將該混合物攪拌7小時，將沉淀三乙基氯化銨過濾出，并蒸發(fā)。將得到的油狀物溶于20ml乙醚中，并在10ml的10-12%氨水溶液中洗滌幾 次，以分離過量的未反應的苯磺酰氯(通過薄層層析(TLC)控制)，然后用10ml約20%的 鹽酸洗滌。用無水硫酸鈉干燥，并蒸發(fā)，得到1.94g黃色油狀物，其含有約等量的苯磺酸的 3_(3_氯丙氧基)-5_甲基苯基酯(Rf 0.36)和二羥基甲苯的二苯甲?；撬狨?Rf 0.25) (根據TLC)。類似地，3_(2_氯乙氧基)_5_甲基苯酚，3_(3_氯丙氧基)_5_甲基苯酚，和 3_(4_氯丁氧基)-5_甲基苯酚和適宜的芳基磺酰氯得到2-氯苯磺酸的3-(3-氯丙氧基)-5-甲基苯基酯(77%純度)2-氟苯磺酸的3- (3-氯丙氧基)-5-甲基苯基酯(88% )2-甲酯基苯磺酸的3_(3_氯丙氧基)_5_甲基苯基酯(56% )苯磺酸的3_(2_氯乙氧基)_5_甲基苯基酯(72%)2-氯苯磺酸的3-(2-氯乙氧基)-5-甲基苯基酯(35% )2-氟苯磺酸的3-(2-氯乙氧基)-5-甲基苯基酯(34% )2-甲酯基苯磺酸的3_(2_氯乙氧基)_5_甲基苯基酯(37% )苯磺酸的3-(4-氯丁氧基)-5-甲基苯基酯(45% )2-氯苯磺酸的3-(4-氯丁氧基)-5-甲基苯基酯(27% )2-氟苯磺酸的3_(4_氯丁氧基)_5_甲基苯基酯(32% )2-甲酯基苯磺酸的3-(4-氯丁氧基)-5-甲基苯基酯(21%).實施例3中間體產物2-氯苯磺酸的3_(3_碘丙氧基)_5_甲基苯基酯的合成
下文簡稱為ClPhO-3-I將2g(13mmol)經煅燒的碘化鈉加至于30ml無水丙酮中的2. 6g混合物(含有 2-氯苯磺酸的3-(3-氯丙氧基)-5-甲基苯基酯，類似于上面實施例制備)，并煮沸48小 時。然后使用10ml己烷稀釋反應混合物，并蒸發(fā)。得到2. 45g亮黃色油狀物，其含有苯磺酸 的3-(2-碘乙氧基)-5-甲基苯基酯(RfO. 35)和相應的二羥基甲苯的二苯甲酰磺酸酯(Rf 0. 25)。類似技術用于將適宜的氯化物制備為苯磺酸的3_(3_碘丙氧基)_5_甲基苯基酯2-氟苯磺酸的3_(3_碘丙氧基)_5_甲基苯基酯2-甲酯基苯磺酸的3_(3_碘丙氧基)_5_甲基苯基酯苯磺酸的3_(2_碘乙氧基)_5_甲基苯基酯 2-氯苯磺酸的3-(2_碘乙氧基)-5_甲基苯基酯2-氟苯磺酸的3_(2_碘乙氧基)_5_甲基苯基酯2-甲酯基苯磺酸的3_(2_碘乙氧基)_5_甲基苯基酯苯磺酸的3-(4-碘丁氧基)-5-甲基苯基酯2-氯苯磺酸的3-(4-碘丁氧基)-5-甲基苯基酯2-氟苯磺酸的3-(4-碘丁氧基)-5-甲基苯基酯2-甲酯基苯磺酸的3-(4-碘丁氧基)-5-甲基苯基酯實施例44-氨基-1-(3-(3-甲基-5-(2-氯苯磺?；趸?苯氧基)丙基)_吡啶鐺碘化物 (HC_023s_I0C)的合成 將0. 55g的“粗碘化物”(來源于前面實施例)(計算為70 %活性物質)和 0. 08g(0. 85mmol)的4-氨基吡啶于10ml無水二噁烷中的混合物煮沸20小時。將混合物冷 卻后，將溶液蒸發(fā)，并將得到的油狀物用幾批乙醚研磨直到其變?yōu)楣腆w。將固體沉淀過濾， 并從二噁烷和乙腈的混合物(5 1)重結晶兩次，將鹽沉淀物濾出，并用乙醚洗滌。真空下干燥，得到0.35g(65%)白色鹽。NMR ^(Bruker DRX500，500MHz，DMS0_d6， m. d.，J Hz) :2. 21s, 3H ；3. 91t，2H，J = 5. 49 ；2. 18m, 2H, J = 6. 10 ；4. 26t，2H，J = 6. 71 ；
6.40s, 1H, 6. 50s, 1H, 6. 68s, 1H ；7. 59t, 1H, J = 7. 94，7. 83t, 1H, J = 7. 94，7. 87d, 1H, J =
7.93，7. 95d, 1H, J = 7. 93 ；6. 80d, 2H, J = 6. 72,8. lid, 2H, J = 6. 72 ；8. 07s, 2H。類似技術用于將適宜的碘化物和雜環(huán)化合物、硫脲和硫脲衍生物制備為4-氨基-l-(3_(3-甲基_5-(苯磺?；趸?苯氧基)丙基)_吡啶鐺碘化物 (HC_016s_I0C)產率78%。NMR ^(Bruker DRX500, 500MHz, DMS0_d6，m. d.，J Hz) :2. 20s, 3H ；3. 88t，2H，J = 5. 50 ；2. 16m，2H，J = 6. 11 ；4. 25t，2H，J = 6. 71 ；6. 31s, 1H，6. 44s, 1H，6. 66s, 1H ；7. 68t，2H，J = 7. 94，7. 82t, 1H, J = 7. 94，7. 87d, 2H, J = 7. 32 ；6. 81d, 2H, J = 6. 72,8. 17d, 2H, J = 6. 72 ；8. 09s，2H。2-氨基-l-(3_(3-甲基-5_(苯磺酰基氧基)苯氧基)丙基)_噻唑鐺碘化物 (HC_017s_I0C) 產率65%。NMR (Bruker DRX500，500MHz，DMS0_d6，m. d.，J Hz) 2. 21 s，3H ； 3. 93t，2H，J = 6. 11 ；2. llm，2H，J = 6. 10 ；4. 15t，2H，J = 6. 71 ；6. 35s, 1H，6. 44s, 1H，6. 68s, 1H ；7. 69t，2H， J = 7. 33,7. 84t, 1H, J = 7. 32,7. 88d, 2H, J = 7. 93 ；7. 02d, 1H, J = 4. 27,7. 42d, 1H, J = 4. 27 ；9. 42s，2H。3- (3-甲基-5-(苯磺?；趸?苯氧基)丙基-異硫脲鐺碘化物(HC_018s_I0C) 產率80%。NMR ^(Bruker DRX500, 500MHz, DMS0_d6，m. d.，J Hz) :2. 21s, 3H ；3. 95t，2H，J = 6. 10 ；2. 00m, 2H, J = 6. 71 ；3. 25t, 2H, J = 7. 32 ；6. 40s, 1H, 6. 25s, 1H, 6. 74s, 1H ；7. 69t, 2H, J = 7. 94，7. 84t, 1H, J = 7. 93,7. 89d, 2H, J = 7. 33 ；9. 03s，4H。4-氨基-l-(2_(3-甲基-5_(苯磺?；趸?苯氧基)乙基)_吡啶鐺碘化物 (HC_019s_I0C) 產率60%。NMR 屯(Bruker DRX500, 500MHz, DMS0_d6，m. d.，J Hz) :2. 20s, 3H ；4. 24t，2H，J =
174. 88 ；4. 48t, 2H, J = 4. 89 ；6. 39s, 1H, 6. 45s, 1H, 6. 73s, 1H, ；7. 68t, 2H, J = 7. 93,7. 82t, 1H, J = 7. 93,7. 87d, 2H, J = 7. 32 ；6. 82d, 2H, J = 7. 32,8. 18d, 2H, J = 7. 33 ；8. 14s, 2H。2- (3-甲基-5-(苯磺?；趸?苯氧基)乙基-異硫脲鐺碘化物(HC_020s_I0C) 產率45%。NMR ^(Bruker DRX500, 500MHz, DMS0_d6，m. d.，J Hz) :2. 22s, 3H ；4. llt，2H，J = 5. 49 ；3. 54t, 2H, J = 5. 49 ；6. 41s, 1H, 6. 48s, 1H, 6. 76s, 1H ；7. 69t, 2H, J = 7. 93,7. 84t, 1H, J = 7. 93，7. 89d，2H，J = 7. 32 ；9. 10s，4H。2- (3-甲基-5- (2-氯苯磺?；趸?苯氧基)乙基_異硫脲鐺碘化物(HC_024s_ IOC) 產率53%。NMR ^(Bruker DRX500, 500MHz, DMS0_d6，m. d.，J Hz) :2. 21s, 3H ；3. 95t，2H，J = 5. 50 ；2. 12m，2H，J = 5. 50 ；4. 15t，2H，J = 6. 10 ；6. 42t, 1H，6. 51s, 1H，6. 70s, 1H ；7. 59t, 1H, J = 7. 32,7. 83t, 1H, J = 7. 94，7. 88d, 1H, J = 7. 94，7. 95d, 1H, J = 7. 94 ；7. Old, 1H, J = 4. 27，7. 42d, 1H, J = 4. 27 ；9. 39s, 2H。3-(3-甲基-5-(2-氯苯磺?；趸?苯氧基)丙基-異硫脲鐺碘化物(HC_026s_ IOC) 產率55%。NMR ^(Bruker DRX500，500MHz，DMS0_d6，m. d.，J Hz) :2. 22s, 3H ；3. 97t,2H, J =
6.10 ；2.01m，2H，J = 7. 33，J = 6. 10 ；4. 26t，2H，J = 7. 33 ；6. 47s, 1H, 6. 51s, 1H, 6. 75s, 1H ；
7.60t, 1H, J = 7. 93,7. 84t, 1H, J = 7. 94，7. 88d, 1H, J = 7. 93,7. 96d, 1H, J = 7. 94 ；8. 95s, 2H，9. 07s，2H。4-氨基_l-(2-(3-甲基-5-(2-氯苯磺酰基氧基)苯氧基)乙基)_吡啶鐺碘化物 (HC_025s_I0O 產率58%。NMR ^(Bruker DRX500, 500MHz, DMS0_d6，m. d.，J Hz) :2. 20s, 3H ；4. 26t，2H，J = 4. 88 ；4. 49t, 2H, J = 4. 88 ；6. 45s, 1H，6. 51s，1H, 6. 74s, 1H ；7. 58t, 1H, J = 7. 93,7. 84t, 1H, J = 7. 94，7. 88d, 1H, J = 7. 93,7. 94d, 1H, J = 7. 94 ；6. 82d, 2H, J = 7. 32,8. 18d, 2H，J = 7. 33 ；8. 14s，2H。以類似方式，通過描述于實施例1-4中的技術，從各種芳基苯磺酰氯和雜環(huán)苯磺 酰氯。合成化合物的化學式、質譜參數和計算的功能評分顯示在表2中?；衔锬軌蛞缘?化物、溴化物、氯化物或其他鹽的形式得到。實施例5化合物的的合成 1. 4-氯-3-硝基苯-1-磺酰氯將鄰-硝基氯苯胺(15g)在攪拌下加至30ml氯磺酸中，并在100°C加熱2小時， 接著在110°C加熱2小時，在127°C加熱5小時。將反應混合物冷卻至室溫，并傾倒至碎冰 (140g)中。將沉淀過濾；濾餅用冰水淋洗，并在空氣中干燥。得到15g的4-氯-3-硝基 苯-1磺酰氯。
2. 4-氯-N-甲基-3-硝基-N-苯基苯磺酰胺 將4-氯-3-硝基苯-1-磺酰氯(10. 6g,0. 041mol)溶于甲苯(50ml)中；然后加入 三乙胺(4. 14g，0. 041mol)。向得到的溶液中，在攪拌下加入N-甲基苯胺(4. 4g，0. 041mol)。 反應混合物在70-80°C進行1小時。此后，將其冷卻。冷卻的溶液用30ml水洗滌兩次，并 真空濃縮。殘余物從乙醇中重結晶。4-氯-N-甲基-3-硝基-N-苯基苯磺酰胺的產量為 9. 4g(61% )。3. N-甲基-4-(甲基氨基)-3-硝基-N-苯基苯磺酰胺 將4-氯-N-甲基-3-硝基-N-苯基苯磺酰胺(9. 4g，0. 029mol)于乙醇(50ml)中的 溶液與25ml的40%甲胺水溶液混合。將反應混合物加熱至70°C，并在此溫度攪拌1小時。 冷卻并過濾后，濾餅用乙醇洗滌，并在60°C干燥。N-甲基-4-(甲基氨基)-3_硝基-N-苯 基苯磺酰胺的產量為9. 0g(97% )。4. 3-氨基-N-甲基-4-(甲基氨基)-N-苯基苯磺酰胺 將N-甲基_4-(甲基氨基)-3-硝基-N-苯基苯磺酰胺(9g，0.028mol)溶于異丙 醇(90ml)中。向該溶液中，加入胼水合物(11ml)，活性炭(2g)，和FeCl3 6H20(0.5g，于 10ml乙醇中)。將反應混合物沸騰8小時?；钚蕴客ㄟ^過濾除去。將濾液蒸發(fā)至干。3-氨 基-N-甲基-4-(甲基氨基)-N-苯基苯磺酰胺的產量為8. lg(99% )。5.3-氯-N-(5-(N-甲基-N-苯基氨磺?；?-2-(甲基氨基)苯基)丙酰胺 向在冰上冷卻( 5°C )的3-氨基-N-甲基_4-(甲基氨基)-N-苯基苯磺酰胺 (5. 4g，0. 018mol)和三乙胺(1. 81g，0. 018mol)于二甲基甲酰胺(16ml)中的溶液中，加入氯 丙酰氯(2. 32g，0.018mol)。反應在室溫攪拌5小時。此時，加入水(14ml)和乙腈(5ml)， 持續(xù)5小時。形成的沉淀過濾。3-氯-N-(5-(N-甲基-N-苯基氨磺?；?-2-(甲基氨基) 苯基)丙酰胺的產量為3. lg(45%)。6. 4-氨基-1-(3-(5-(N-甲基_N_苯基氨磺酰基)_2_ (甲基氨基)苯基氨 基)-3-氧代丙基)吡啶鐺氯化物 將3-氯-N-(5_(N-甲基-N-苯基氨磺?；?_2_(甲基氨基)苯基)丙酰胺(lg， 0. 0026mol)和4-氨基吡啶鐺(0. 73g,0. 0078mol)在無水丙酮(50ml)中沸騰50小時。將 殘余物過濾，并從10 1的乙腈與乙醇的混合物中進行結晶。4-氨基-1- (3- (5- (N-甲基-N-苯基氨磺?；?_2_ (甲基氨基)苯基氨基)_3_氧 代丙基)吡啶鐺氯化物的產量為0. 54g(43% )。7.4-氨基-1-(2_(1-甲基-5_(N-甲基_N_苯基氨磺?；?-1H_苯并[d]咪 唑-2-基)乙基)吡啶鐺氯化物 向4-氨基-l-(3-(5_(N-甲基-N-苯基氨磺?；?-2_(甲基氨基)苯基氨 基)_3_氧代丙基)吡啶鐺氯化物(0.2g，0.00042mol)于乙腈(8ml)中的溶液中，加入亞硫酰氯(0. 2ml)。反應混合物沸騰10分鐘后，將其在室溫室溫靜置24小時，然后用乙醚 (8ml)稀釋。形成的沉淀通過過濾收集，并從10 1的乙腈與無水乙醇的混合物結晶。4-氨 基-l-(2-(l-甲基-5-(N-甲基-N-苯基氨磺?；?-lH-苯并[d]咪唑-2-基)乙基)吡 啶鐺氯化物的產量為0. 055g(26% )。以類似的方式，通過描述于實施例5中的技術，合成多種化合物，其化學式、質譜 參數和計算的功能評分顯示在表3中?；衔锬軌蛞缘饣?、溴化物、氯化物或其他鹽的形 式得到。實施例6測試化合物對凝血酶活性的作用的研究合成的物質對凝血酶活性的作用通過下列方法研究測量凝血酶在水性緩沖 液中水解特異低分子量底物的速率(在上述化合物存在或不存在的情況下)。這些底 物之一為發(fā)色底物 Chromozim TH(CTH) :N-(p-Tosyl)-Gly-Pro-Arg-pNA[Sonder SA, Fenton Jff 2nd. ThrombinSpecificity with Tripeptide Chromogenic Substrates Comparison of Human andBovine Thromibins with and without Fibrinogen Clotting Activities. Clin. Chem.，1986，32 (6) =934-937] 在許多實驗中使用的另一底物為熒光底 物BOC-Ala-Pro-Arg-AMC(S)，其中B0C為丁氧基羰基基團，和AMC為7-氨基-4-甲基香豆 基[Kawabata S, Miura T, Morita T,Kato H, Fujikawa K,IvanagaS,Takada K,Kimura T, Sakakibara S. Highly Sensitivepeptide-4-methylcoumaryl-7-amide Substrates for Blood-Clotting Proteases andTrypsin. Eur. J. Biochem. ,1988,172(1) : 17—25]。將普通96-孔板的各孔填充有緩沖液(其含有140mM的NaCl，20mM的HEPES，和 0. 聚乙二醇(Mw = 6000), pH = 8. 0)。加入底物(孔中最終濃度為lOOmcM)、凝血酶(最 終濃度為190pM)和不同濃度的測試化合物(建議的凝血酶抑制劑)(0. 002mM至3. 3mM)。 當使用發(fā)光底物時，在分光光度計Molecular Devices板讀數器(Thermomax，U.S.)上跟 蹤有色反應產物_對硝基苯胺_的累積，在405nm波長測量吸光度的增加。在熒光底物的 情況下，凝血酶從熒光底物分裂出氨基甲基香豆基，在水解期間以游離形式顯著地發(fā)熒光 (激發(fā)入_380nm和發(fā)射入_440nm)。反應動力學記錄在熒光TitertekFluoroskan板讀數 器(LabSystem, Finland)上。初始反應速率測量為動力學曲線傾角對直線部分的斜率(從記錄的10至15分 鐘)。假定沒有抑制劑的反應速率為100%。兩次獨立實驗的算術平均值用作最終結果。

圖1顯示的為對于發(fā)光底物Chromozim TH(CTH)在凝血酶的作用下的特征動力學 水解曲線的實例，在不同濃度化合物HC-019S-I0C(參見表4)存在下。沒有抑制劑的動力 學水解曲線用作對照。圖2顯示CTH水解抑制程度和體系中另一新合成化合物(HC-018S-I0C)(其為高 度有效的凝血酶抑制劑(參見表4))的濃度之間的關系。大量新合成化合物對凝血酶活性的抑制作用程度的數據顯示在表4中。因此，如上得到的結果顯示所有新合成的化合物為直接凝血酶抑制劑。不同的化 合物抑制程度不同，但是大多數的新化合物為高度有效的凝血酶抑制劑，適于用作用于控 制凝血酶_相關的血栓栓塞性病癥藥物組合物的基礎，且也用于研究。表1 對于多種凝血酶抑制劑的公開的關鍵文獻列表
表3通過實施例5描述的方法合成的凝血酶抑制劑的質譜參數和計算的功能分數 表4在不同濃度系列的新合成化合物存在下，凝血酶底物的水解速率的變化的實例
45
權利要求
通式(I)化合物及其可藥用鹽或溶劑合物A-B-C(I)其中C選自下列結構其中R1、R2、R3和R4彼此獨立地為氫或C1-6烷基；B為-(CH2)n-，其中n為1至5的整數；A選自下列結構其中R5選自氫、C1-6烷氧基、CH2NR10R11和CH(CH3)NR10R11；其中R6和R7獨立地為氫、C1-6烷基、C1-6烷氧基和鹵素；R8為氫或C1-6烷基；R9選自R10和R12彼此獨立地選自氫、C1-6烷基；(CH2)mCOOR13和(CH2)mCON(R13)2，其中m為1至4的整數，R13為氫或C1-6烷基，R11為C1-6烷基或Ar；Ar為苯基、吡啶基、噁唑基、噻唑基、噻吩基、呋喃基、嘧啶基、噠嗪酮基、吡嗪基、吲哚基、苯并呋喃基或苯并噻吩基，其具有1-5個選自下列的取代基氫、C1-6烷基、C1-6烷氧基、鹵素、N(R13)2、OH、NO2、CN、COOR13、CON(R13)2和SO2R13；所述通式(I)化合物中排除FPA00001037517500011.tif,FPA00001037517500012.tif,FPA00001037517500021.tif,FPA00001037517500022.tif,FPA00001037517500023.tif,FPA00001037517500031.tif,FPA00001037517500032.tif
2.權利要求1的化合物，及其可藥用鹽或溶劑合物，尤其為Rn為烷基或Ar ； Ar為苯基、吡啶基、噁唑基、噻唑基、噻吩基、呋喃基、嘧啶基、噠嗪酮基、吡嗪基、吲哚 基、苯并呋喃基或苯并噻吩基，其具有1-5個選自下列的取代基氫、Ch 烷基、CH 烷氧基、鹵素、N(R13)2、OH、N02、CN、C00R13、C0N(R13)2 禾口 S02R13 ； 所述通式(I)化合物中排除 其中Y選自氫、鹵素、C00R13、C0N(R13)jP S02R13 ；以及 r為2至5的整數。
3.權利要求1的化合物及其可藥用鹽或溶劑合物，其能夠抑制凝血酶。
4.權利要求1的化合物及其可藥用鹽或溶劑合物的用途，其用作凝血酶抑制劑。
5.藥物組合物，其用于治療和預防凝血酶_相關的血栓栓塞性事件，該組合物包含治 療有效量的權利要求1的化合物、其可藥用鹽或溶劑合物、以及可藥用載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及新的化合物、這些化合物作為凝血酶抑制劑的用途，以及基于它們的藥物組合物，以及可用于治療和預防凝血酶-相關的血栓栓塞性事件以及在研究中的用途。
文檔編號C07D401/06GK101861304SQ200880104825
公開日2010年10月13日 申請日期2008年6月27日 優(yōu)先權日2007年6月28日
發(fā)明者亞歷克西·A·博戈萊伯夫, 亞歷克西·N·羅馬諾夫, 亞歷山大·S·戈巴坦科, 伊里納·V·格里布科瓦, 埃琳娜·I·西諾里茲, 奧爾加·A·康達科瓦, 安德雷·A·巴蒂林, 尤里·V·庫茲涅索夫, 弗拉迪米爾·B·蘇利莫夫, 法佐爾·I·阿陶拉卡諾夫 申請人:Bionika有限責任公司