專利名稱：在多肽的重組生產(chǎn)期間防止二硫鍵還原的制作方法
在多肽的重組生產(chǎn)期間防止二硫鍵還原發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明關(guān)注用于在含雙硫的多肽(disulfide-containing polypeptide)的重組 生產(chǎn)期間防止二硫鍵還原的方法和手段。具體而言，本發(fā)明關(guān)注在自重組宿主細胞培養(yǎng)物 收獲含雙硫的多肽(包括抗體)期間防止二硫鍵還原。
背景技術(shù)：
在生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)中，制藥應(yīng)用需要使用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)多種蛋白質(zhì)。一般而言， 由細胞培養(yǎng)物生成重組蛋白，使用經(jīng)改造而生成感興趣蛋白質(zhì)的真核細胞(諸如哺乳動物 細胞)或原核細胞(諸如細菌細胞)，這通過插入含有編碼期望蛋白質(zhì)的核酸的重組質(zhì)粒來 進行。為了蛋白質(zhì)保留生物學(xué)活性，必須在其純化和分離期間維持蛋白質(zhì)的構(gòu)象(包括其 三級結(jié)構(gòu))，而且必須保護蛋白質(zhì)的多個官能團免于降解。哺乳動物細胞已經(jīng)成為生產(chǎn)用于臨床應(yīng)用的哺乳動物蛋白質(zhì)的主要系統(tǒng)，主要是 由于它們生成正確折疊和裝配的異源蛋白質(zhì)的能力及它們翻譯后修飾的能力。中國倉鼠卵 巢(CHO)細胞和自各種其它哺乳動物來源(諸如例如小鼠骨髓瘤(NSO)、幼倉鼠腎(BHK)、 人胚腎(HEK-293)和人腎細胞諸如自人腎細胞分離、提供人糖基化特征、且能夠天然生成 與人生理學(xué)匹配的抗體的PER. C6 細胞系)獲得的細胞系被管理機構(gòu)批準(zhǔn)用于生產(chǎn)生物 藥學(xué)產(chǎn)品。通常，為了開始生產(chǎn)周期，容許少量的經(jīng)轉(zhuǎn)化重組宿主細胞在培養(yǎng)物中生長幾天 (見例如圖23)。一旦細胞進行了幾輪復(fù)制，就將它們轉(zhuǎn)移至更大的容器，在那里準(zhǔn)備用它 們進行發(fā)酵。用于培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基及生產(chǎn)周期期間存在的氧、氮和二氧化碳的水平可能 對生產(chǎn)過程有顯著影響。為每種細胞系具體確定培養(yǎng)參數(shù)，而且頻繁地測量這些參數(shù)以確 保最佳的生長和生產(chǎn)條件。當(dāng)細胞生長至足夠數(shù)目時，將它們轉(zhuǎn)移至大規(guī)模生產(chǎn)罐并培養(yǎng)更長的一段時間。 在該過程中的此點，可以收獲重組蛋白。典型的是，將細胞改造成分泌多肽入細胞培養(yǎng)液 中，使得純化過程的第一步是將細胞與培養(yǎng)液分開。典型的是，收獲包括離心和過濾以生成 已收獲的細胞培養(yǎng)液(Harvested CellCulture Fluid, HCCF)。然后將培養(yǎng)液進行幾個另 外的純化步驟，除去任何細胞碎屑、不想要的蛋白質(zhì)、鹽、礦物或其它不想要的成分。在純化 過程結(jié)束時，重組蛋白是高度純的，而且是適合于人治療性用途的。雖然在過去的幾十年里對此過程進行了許多研究和改進，但是重組蛋白的生產(chǎn)仍 然是困難重重。如此，例如在包含二硫鍵的多肽(尤其是包含鏈間二硫鍵的多鏈多肽，諸如 抗體)的重組生產(chǎn)期間，重要的是要在整個生產(chǎn)、回收和純化過程中保護和保持二硫鍵，以 生成具有必要生物學(xué)活性的正確折疊的多肽。發(fā)明概述本發(fā)明一般涉及一種用于防止重組宿主細胞中表達的多肽中二硫鍵還原的方法， 包括給所述重組宿主細胞的收獲前的培養(yǎng)液(pre-harvest culturefluid)或已收獲的培 養(yǎng)液(harvested culture fluid)補充硫氧還蛋白(thioredoxin)的抑制劑或硫氧還蛋白 樣蛋白(thioredoxin-like protein)
在一個實施方案中，向所述收獲前的培養(yǎng)液添加所述硫氧還蛋白抑制劑。在另一個實施方案中，向所述已收獲的培養(yǎng)液添加所述硫氧還蛋白抑制劑。在又一個實施方案中，所述硫氧還蛋白抑制劑是硫氧還蛋白的直接抑制劑。在所有實施方案中，所述硫氧還蛋白抑制劑可以是例如烴基-2-咪唑基二硫化物 (alkyl-2-imidazolyl disulfide)或萘醌螺酮縮醇衍生物(naphthoquinonespiroketal derivative)。在又一個實施方案中，所述硫氧還蛋白抑制劑是硫氧還蛋白還原酶的特異性抑制 劑。在還有一個實施方案中，所述硫氧還蛋白抑制劑是金復(fù)合物，其中所述金復(fù)合物 可以是例如金硫葡糖(aurothioglucose，ATG)或金硫蘋果酸(aurothiomalate，ATM)。雖 然有效抑制濃度可以有所變化，但是它通常介于約0. ImM和ImM之間。類似地，最小有效抑 制濃度隨多肽性質(zhì)和總體環(huán)境而變化，而且通常在ATG或ATM濃度是收獲前的或已收獲的 培養(yǎng)液中硫氧還蛋白濃度的至少約四倍時達到。在本發(fā)明此方面的另一個實施方案中，所述硫氧還蛋白抑制劑是金屬離子，其中 所述金屬離子可以(不限于)選自下組Hg2+、CU2+、Zn2+、C02+、和Mn2+。當(dāng)所述金屬離子以硫 酸銅的形式添加時，有效抑制濃度一般介于約5 μ M和約100 μ M之間，或介于約10 μ M和約 80 μ M之間，或介于約15 μ M和約50 μ M之間。硫酸銅的最小抑制濃度也有所變化，但是通 常在硫酸銅以收獲前或已收獲的培養(yǎng)液中硫氧還蛋白濃度至少約兩倍的濃度添加時達到。在不同的實施方案中，所述硫氧還蛋白抑制劑是氧化劑，例如G6PD的抑制劑，諸 如例如吡哆醛-5’ -磷酸、1-氟-2，4-二硝基苯、脫氫表雄酮(DHEA)或表雄酮(EA)；胱氨 酸或半胱氨酸。DHEA的典型有效抑制濃度介于約0. 05mM和約5mM之間，或介于約0. ImM和 約2. 5mM之間。在又一個實施方案中，所述硫氧還蛋白抑制劑是己糖激酶活性的抑制劑，包括但 不限于金屬離子的螯合劑，諸如例如乙二胺四乙酸(EDTA)。EDTA通常以如下濃度添加且在 如下濃度是有效的介于約5mM和約60mM之間，或介于約IOmM和約50mM之間，或介于約 20mM和約40mM之間。在其它優(yōu)選實施方案中，所述己糖激酶活性的抑制劑選自下組山梨糖-1-磷酸、 多磷酸、6-脫氧-6-氟葡萄糖、2-C-羥基-甲基葡萄糖、木糖、和來蘇糖。其它抑制劑包括胱氨酸、半胱氨酸、和氧化型谷胱甘肽，它們通常以收獲前的或已 收獲的培養(yǎng)液中所討論多肽濃度至少約40倍的濃度添加。在還有一個實施方案中，所述硫氧還蛋白抑制劑是與硫氧還蛋白還原酶特異性結(jié) 合的抗體、反義核苷酸、或siRNA。在另一個實施方案中，所述硫氧還蛋白抑制劑是間接導(dǎo)致對硫氧還蛋白活性的抑 制的措施。此實施方案包括例如給重組宿主細胞的已收獲的培養(yǎng)液鼓入空氣和/或降低重 組宿主細胞的已收獲的培養(yǎng)液的PH。在各種實施方案中，用于抑制硫氧還蛋白活性的間接手段(諸如鼓入空氣和/或 降低PH)可以與直接硫氧還蛋白抑制劑(諸如上文所列的那些)的使用組合。在所有實施方案中，所述多肽可以是例如抗體或有生物學(xué)功能的抗體片段。代表 性的抗體片段包括Fab、Fab'、F(ab' )2、scFv、(ScFv)2、dAb、互補決定區(qū)(CDR)片段、線性抗體、單鏈抗體分子、微型抗體、雙抗體、和自抗體片段形成的多特異性抗體。治療性抗體包括但不限于抗HER2抗體；抗⑶20抗體；抗IL_8抗體；抗VEGF抗體； 抗CD40抗體、抗CDlla抗體；抗CD18抗體；抗IgE抗體；抗Αρο_2受體抗體；抗組織因子 (TF)抗體；抗人α 4β 7整聯(lián)蛋白抗體；抗EGFR抗體；抗⑶3抗體；抗⑶25抗體；抗⑶4抗 體；抗CD52抗體；抗Fc受體抗體；抗癌胚抗原(CEA)抗體；針對乳房上皮細胞的抗體；與結(jié) 腸癌細胞結(jié)合的抗體；抗⑶38抗體；抗⑶33抗體；抗⑶22抗體；抗EpCAM抗體；抗GpIIb/ IIIa抗體；抗RSV抗體；抗CMV抗體；抗HIV抗體；抗肝炎抗體；抗CA 125抗體；抗α ν β 3 抗體；抗人腎細胞癌抗體；抗人17-1Α抗體；抗人結(jié)腸直腸腫瘤抗體；抗人黑素瘤抗體；針 對GD3神經(jīng)節(jié)苷酯的R24;抗人鱗狀細胞癌抗體；和抗人白細胞抗原(HLA)抗體，和抗HLA DR抗體。在其它實施方案中，所述治療性抗體是與HER受體、VEGF、IgE、CD20、CDlla、CD40、 或DR5結(jié)合的抗體。在又一個實施方案中，所述HER受體是HERl和/或HER2，優(yōu)選HER2。所述HER2 抗體可以例如包含選自下組的重鏈和/或輕鏈可變域序列SEQ IDNO :16、17、18、和19。在另一個實施方案中，所述治療性抗體是與CD20結(jié)合的抗體。所述抗CD20抗體 可以例如包含選自下組的重鏈和/或輕鏈可變域序列SEQ ID NO :1-15。在還有一個實施方案中，所述治療性抗體是與VEGF結(jié)合的抗體。所述抗VEGF可 以例如包含選自下組的重鏈和/或輕鏈可變域序列SEQ ID NO :20-25。在另一個實施方案中，所述治療性抗體是與⑶Ila結(jié)合的抗體。所述抗⑶Ila抗 體可以例如包含選自下組的重鏈和/或輕鏈可變域序列SEQ ID N0:26-29。在又一個實施方案中，所述治療性抗體與DR5受體結(jié)合。所述抗DR5抗體可以是 例如選自下組Apomab 1. 1、2. 1、3. 1、4. 1、5. 1、5. 2、5. 3、6. 1、6. 2、6. 3、7. 1、7. 2、7. 3、8. 1、
8.3、9· 1、1· 2、2· 2、3· 2、4· 2、5· 2、6· 2、7· 2、8· 2、9· 2、1· 3、2· 2、3· 3、4· 3、5· 3、6· 3、7· 3、8. 3、
9.3、禾口 25. 3，而且優(yōu)選 Apomab 8. 3 或 Apomab 7. 3，而且最優(yōu)選 Apomab 7. 3。在本發(fā)明方法的其它實施方案中，所述在重組宿主細胞中表達的多肽是治療性 多肽。例如，所述治療性多肽可以選自下組生長激素，包括人生長激素和牛生長激素；生 長激素釋放因子；甲狀旁腺素；促甲狀腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰島素A鏈； 胰島素B鏈；胰島素原；促卵泡激素；降鈣素；黃體生成素；高血糖素；凝血因子，諸如因子 VIIIC、因子IX、組織因子、和von Willebrands因子；抗凝血因子，諸如蛋白C ；心房鈉尿因 子；肺表面活性劑；纖溶酶原激活劑，諸如尿激酶或人尿或組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)； 鈴蟾肽；凝血酶；造血生長因子；腫瘤壞死因子-α和-β ；腦啡肽酶；RANTES(在激活后受 到調(diào)節(jié)，正常情況下由T細胞表達和分泌)；人巨噬細胞炎癥蛋白(MIP-1-α)；血清清蛋 白，諸如人血清清蛋白；Muellerian抑制性物質(zhì)；松弛素A鏈；松弛素B鏈；松弛素原；小 鼠促性腺素相關(guān)肽；微生物蛋白質(zhì)，諸如β -內(nèi)酰胺酶；DNA酶；IgE ；細胞毒性T-淋巴細 胞相關(guān)抗原(CTLA)，諸如CTLA-4;抑制素；激活素；血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)；激素的或 生長因子的受體；蛋白A或D ；類風(fēng)濕因子；神經(jīng)營養(yǎng)性因子，諸如骨衍生神經(jīng)營養(yǎng)性因子 (BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)因子-3、-4、-5、或-6 (ΝΤ_3、ΝΤ_4、ΝΤ-5、或ΝΤ-6)、或神經(jīng)生長因子，諸如 NGF-β ；血小板衍生生長因子(PDGF)；成纖維細胞生長因子，諸如aFGF和bFGF;表皮生長 因子(EGF)；轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)，諸如 TGF- α 和 TGF- β，包括 TGF- β UTGF- β 2、TGF- β 3、TGF-β 4、或 TGF-β 5 ；胰島素樣生長因子-I 和-II (IGF-I 和 IGF-II) ；des (1-3)-IGF-I (腦 IGF-I)、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白；CD蛋白，諸如CD3、CD4、CD8、⑶19、⑶20、CD34、和 CD40;紅細胞生成素；骨誘導(dǎo)因子；免疫毒素；骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)；干擾素，諸如干擾 素1、-3，禾日-^ ；集落刺激因子(CSF)，例如M-CSF、GM-CSFjP G-CSF ；白介素(IL)，例如 IL-I至IL-10 ；超氧化物歧化酶；T細胞受體；表面膜蛋白；衰變加速因子；病毒抗原，諸如 例如AIDS包膜的一部分；運輸?shù)鞍?；歸巢受體；地址素；調(diào)節(jié)蛋白；整聯(lián)蛋白，諸如⑶11a、 CDllb、CDllc、CD18、ICAM、VLA_4 和 VCAM ；腫瘤相關(guān)抗原，諸如 HER2、HER3 或 HER4 受體；及 以上所述多肽的片段。在所有實施方案中，所述重組宿主細胞可以是真核細胞，諸如哺乳動物細胞，包括 例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。在所有實施方案中，所述重組宿主細胞也可以是原核細胞，諸如細菌細胞，包括但 不限于大腸桿菌細胞。附圖簡述

圖1。透析實驗自Bioanalyzer分析獲得的數(shù)字凝膠樣成像(每條帶代表一個 時間點)，證明了透析袋內(nèi)的ocrelizumab (rhuMAb 2H7-變體A)在溫育期間保持完整。圖2。透析實驗自Bioanalyzer分析獲得的數(shù)字凝膠樣成像(每條帶代表一個 時間點)，顯示了透析袋外的ocrelizumab在溫育期間被還原。這是通過圖中所繪完整抗體 (約150kDa)的丟失和抗體片段的形成而證明的。在48小時時間點(第7道)，被還原的 抗體表現(xiàn)出被重新氧化，大概是已收獲的細胞培養(yǎng)液(HCCF)中還原活性丟失的結(jié)果。剛好 在28kDa標(biāo)志物上方出現(xiàn)的條帶源自抗體的輕鏈。在溫育開始前HCCF中就有顯著量的游 離輕鏈存在。HCCF中過量的游離輕鏈和輕鏈二聚體的存在對于生成ocrelizumab的細胞系 是典型的。圖3。來自透析實驗的游離硫醇水平磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中純化的 ocrelizumab在透析袋內(nèi)，而含有ocrelizumab的HCCF在袋外。透析袋內(nèi)(方框)和外(菱 形)游離硫醇在數(shù)小時內(nèi)達到可比水平，指明HCCF中的小分子成分在透析袋內(nèi)與外之間有 較好的交換。圖4。硫氧還蛋白系統(tǒng)和其它涉及抗體還原的反應(yīng)硫氧還蛋白系統(tǒng)(包含硫氧 還蛋白(Trx)、硫氧還蛋白還原酶(TrxR)和NADPH)為蛋白質(zhì)中二硫鍵的還原發(fā)揮氫供體系 統(tǒng)的功能。Trx是具有經(jīng)由硫醇-二硫化物交換催化許多氧化還原反應(yīng)的CXXC活性位點基 序的小單體蛋白質(zhì)。被氧化的Trx能被NADPH經(jīng)TrxR還原。然后被還原的Trx能夠催化 蛋白質(zhì)中二硫化物的還原。硫氧還蛋白系統(tǒng)所需要的NADPH是經(jīng)由磷酸戊糖途徑和糖酵解 中的反應(yīng)提供的。圖5。硫氧還蛋白系統(tǒng)的體外活性來自Bioanalyzer分析的數(shù)字凝膠樣圖像(每 條帶代表一個時間點)，證明了將完整ocrelizumab (lmg/mL)與PBS中的0. ImM TrxR(大 鼠肝)、5mM Trx (人)、和 ImM NADPH—起溫育導(dǎo)致 ocrelizumab 的完全還原；ocrelizumab 在短于21小時里被完全還原。圖6。硫氧還蛋白系統(tǒng)的體外活性受到金硫葡糖抑制向上文圖5說明中所述相同 反應(yīng)混合物添加金硫葡糖(ATG)有效抑制ocrelizumab還原。這是通過來自Bioanalyzer 分析的數(shù)字凝膠樣圖像(每條帶代表一個時間點)看到的。
圖7。硫氧還蛋白系統(tǒng)的體外活性受到金硫蘋果酸抑制以ImM的濃度向上文圖 5說明中所述相同反應(yīng)混合物添加金硫蘋果酸(ATM)有效抑制ocrelizumab還原。這是通 過來自Bioanalyzer分析的數(shù)字凝膠樣圖像(每條帶代表一個時間點)看到的。圖8。硫氧還蛋白系統(tǒng)的體外活性來自Bioanalyzer分析的數(shù)字凝膠樣圖像(每 條帶代表一個時間點)，顯示了將完整ocrelizumab (lmg/mL)與IOmM硫酸組氨酸緩沖液中 的0. ImM TrxR(大鼠肝)、5mM Trx (人)、和ImMNADPH —起溫育導(dǎo)致ocrelizumab在短于1 小時里被還原。圖9。硫氧還蛋白系統(tǒng)的體外活性受到CuSO4抑制以50 μ M的濃度向圖8說明中 所述相同反應(yīng)混合物添加CuSO4有效抑制ocrelizumab還原，如來自Bioanalyzer分析的 數(shù)字凝膠樣圖像(每條帶代表一個時間點)中所示。圖10。ocrelizumab還原來自Bioanalyzer分析的數(shù)字凝膠樣圖像(每條帶代 表一個時間點)，顯示了 ocrelizumab在使用來自勻漿化CCF (其是自3L發(fā)酵罐生成的)的 HCCF進行的溫育實驗中被還原。圖11。HCCF中的ocrelizumab還原受到金硫葡糖抑制來自Bioanalyzer分析的 數(shù)字凝膠樣圖像(每條帶代表一個時間點)，顯示了向圖10說明中所述溫育實驗所使用的 相同HCCF添加ImM金硫葡糖抑制ocrelizumab還原。圖12。HCCF中的ocrelizumab還原受到金硫蘋果酸抑制來自Bioanalyzer分析 的數(shù)字凝膠樣圖像(每條帶代表一個時間點)，指明了向圖10說明中所述溫育實驗所使用 的相同HCCF添加ImM金硫蘋果酸抑制ocrelizumab還原。圖13。HCCF中還原活性丟失進行過數(shù)輪凍融循環(huán)的、來自ocrelizumab大規(guī)模 制造運行之一(“β”運行)的HCCF在溫育實驗中使用時證明了沒有ocrelizumab還原。 這是通過Bioanalyzer分析(每條帶代表一個時間點)顯示的，而且能與先前在新鮮融化 的、來自同一發(fā)酵批次的HCCF中看到的抗體還原形成對比。圖14。HCCF中丟失的還原活性通過添加NADPH而恢復(fù)在以5mM的濃度向HCCF (那 里的還原活性在上文圖13中所述條件下已經(jīng)被消除)中添加NADPH后在Bioanalyzer分 析(每條帶代表一個時間點)中再次觀察到ocrelizumab還原。圖15。HCCF中丟失的還原活性通過添加葡萄糖_6_磷酸而恢復(fù)在以IOmM的 濃度向HCCF(那里的還原活性由于上文圖13中所述處理已經(jīng)被消除)中添加G6P后在 Bioanalyzer分析(每條帶代表一個時間點)中再次觀察到ocrelizumab還原。圖16。ocrelizumab還原來自Bioanalyzer分析的數(shù)字凝膠樣圖像，顯示了 ocrelizumab在使用來自大規(guī)模制造運行(“α”運行)的HCCF進行的溫育實驗中被還原。圖17。EDTA抑制ocrelizumab還原來自Bioanalyzer分析的數(shù)字凝膠樣圖像 (每條帶代表一個時間點)，顯示了 ocrelizumab還原在使用來自α運行的HCCF進行的溫 育實驗中受到抑制，其中以20mM的濃度向HCCF(其還原活性展示于圖16中)添加EDTA。圖18?！唉?”運行HCCF中丟失的還原活性通過添加葡萄糖-6-磷酸而恢復(fù)，但是 EDTA不抑制還原在以5mM的濃度向HCCF (其還原活性已經(jīng)丟失，見圖13)中添加G6P和 20mM EDTA后在Bioanalyzer分析(每條帶代表一個時間點)中觀察到ocrelizumab還原。 與圖17中所示結(jié)果形成對比，EDTA的存在不阻斷ocreliumab還原。圖19。通過⑴添加EDTA、(ii)添加CuS04、或(iii)調(diào)節(jié)pH至5. 5來抑制ocrelizumab還原獨立使用的所有三種不同方法，S卩(1)添加EDTA、(2)添加CuSO4、和(3) 調(diào)節(jié)PH至5. 5，都有效抑制ocrelizumab還原。這是通過所描繪的定量Bioanalyzer結(jié)果 證明的，該結(jié)果顯示了幾乎100%的完整(150kDa)抗體保留在蛋白A洗脫合并液中。與此 對比，在對照HCCF中在20小時HCCF保持時間后ocrelizumab被完全還原。圖20。鼓入空氣抑制ocrelizumab還原給HCCF鼓入空氣有效抑制ocrelizumab 二硫鍵還原。這是通過定量Bioanalyzer結(jié)果證明的，該結(jié)果顯示了幾乎100%的完整 (150kDa)保留在蛋白A洗脫合并液中。與此對比，在對照HCCF中在鼓入氮氣5小時后 ocrelizumab被幾乎完全還原。圖21 顯示了抗 Her2 抗體(Trastuzumab)的 Vl (SEQ ID N0. 24)氨基酸序列。圖 22 顯示了抗 Her2 抗體(Trastuzumab)的 Vh (SEQ ID No. 25)氨基酸序列。圖23是示意圖，顯示了典型的大規(guī)模制造過程的一些步驟。圖24是來自Bioanalyzer分析的數(shù)字凝膠樣圖像2H7 (變體A) +lmMNADPH+5 μ M 硫氧還蛋白+0. 1 μ M硫氧還蛋白還原酶(重組體)，在IOmM硫酸組氨酸中。圖25是來自Bioanalyzer分析的數(shù)字凝膠樣圖像2H7 (變體A) +lmMNADPH+5 μ M 硫氧還蛋白+0. 1 μ M硫氧還蛋白還原酶(重組體)，在ImM硫酸組氨酸+ImM ATG中。圖26是來自Bioanalyzer分析的數(shù)字凝膠樣圖像2H7 (變體A) +lmMNADPH+5 μ M 硫氧還蛋白+0. 1 μ M硫氧還蛋白還原酶(重組體)，在IOmM硫酸組氨酸+0. 6μΜ ATG中 (6 IATG TrxR)。圖27是來自Bioanalyzer分析的數(shù)字凝膠樣圖像2H7 (變體A) +lmMNADPH+5 μ M 硫氧還蛋白+0. 1 μ M硫氧還蛋白還原酶(重組體)，在IOmM硫酸組氨酸+0. 4μΜ ATG中 (4 IATG TrxR)。圖28是來自Bioanalyzer分析的數(shù)字凝膠樣圖像2H7 (變體A) +lmMNADPH+5 μ M 硫氧還蛋白+0. 1 μ M硫氧還蛋白還原酶(重組體)，在IOmM硫酸組氨酸+0. 2 μ MATG中 (2 IATG TrxR)。圖29是來自Bioanalyzer分析的數(shù)字凝膠樣圖像2H7 (變體A) +lmMNADPH+5 μ M 硫氧還蛋白+0. 1 μ M硫氧還蛋白還原酶(重組體)，在IOmM硫酸組氨酸+0. ImM金硫蘋果酸 (ATM)中。圖30是來自Bioanalyzer分析的數(shù)字凝膠樣圖像2H7 (變體A) +lmMNADPH+5 μ M 硫氧還蛋白+0. 1 μ M硫氧還蛋白還原酶(重組體)，在IOmM硫酸組氨酸+0. OlmM金硫蘋果 酸(ATM)中。圖31是來自Bioanalyzer分析的數(shù)字凝膠樣圖像2H7 (變體A) +lmMNADPH+5 μ M 硫氧還蛋白+0. 1 μ M硫氧還蛋白還原酶(重組體)，在IOmM硫酸組氨酸+20μΜ CuSO4中 (4 ICu2+ Trx)。圖32是來自Bioanalyzer分析的數(shù)字凝膠樣圖像2H7 (變體A) +lmMNADPH+5 μ M 硫氧還蛋白+0. 1 μ M硫氧還蛋白還原酶(重組體)，在IOmM硫酸組氨酸+10μΜ CuSO4中 (2 ICu2+ Trx)。圖33是來自Bioanalyzer分析的數(shù)字凝膠樣圖像2H7 (變體A) +lmMNADPH+5 μ M 硫氧還蛋白+0. 1 μ M硫氧還蛋白還原酶(重組體)，在IOmM硫酸組氨酸+5μΜ CuSO4中 (1 ICu2+ Trx)。
圖34是來自Bioanalyzer分析的數(shù)字凝膠樣圖像2H7 (變體A) +lmMNADPH+5 μ M 硫氧還蛋白+0. 1 μ M硫氧還蛋白還原酶(重組體)，在IOmM硫酸組氨酸+532 μ M胱胺中 (20 1胱胺2Η7 二硫化物)。圖35是來自Bioanalyzer分析的數(shù)字凝膠樣圖像2Η7 (變體A) +lmMNADPH+5 μ M 硫氧還蛋白+0. 1 μ M硫氧還蛋白還原酶(重組體)，在IOmM硫酸組氨酸+266 μ M胱胺中 (10 1胱胺2Η7 二硫化物)。圖36是來自Bioanalyzer分析的數(shù)字凝膠樣圖像2Η7 (變體A) +lmMNADPH+5 μ M 硫氧還蛋白+0. 1 μ M硫氧還蛋白還原酶(重組體)，在IOmM硫酸組氨酸+133 μ M胱胺中 (5 1胱胺2Η7 二硫化物)。圖37是來自Bioanalyzer分析的數(shù)字凝膠樣圖像2Η7 (變體A) +lmMNADPH+5 μ M 硫氧還蛋白+0. 1 μ M硫氧還蛋白還原酶(重組體)，在IOmM硫酸組氨酸+26. 6μΜ胱胺中 (1 1胱胺2Η7 二硫化物)。圖38是來自Bioanalyzer分析的數(shù)字凝膠樣圖像2Η7 (變體A) +lmMNADPH+5 μ M 硫氧還蛋白+0. 1 μ M硫氧還蛋白還原酶(重組體)，在IOmM硫酸組氨酸(ρΗ = 7. 6) +2. 6mM 胱氨酸中。圖39是來自Bioanalyzer分析的數(shù)字凝膠樣圖像2H7 (變體A) +lmMNADPH+5 μ M 硫氧還蛋白+0. 1 μ M硫氧還蛋白還原酶(重組體)，在IOmM硫酸組氨酸+2. 6mM GSSG (氧化 型谷胱甘肽)中。圖40。重建的酶促還原系統(tǒng)。lmg/ml 2H7 (變體A)+10 μ g/mL己糖激酶、50 μ g/ mL葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、5 μ M硫氧還蛋白、0. 1 μ M硫氧還蛋白還原酶、2mM葡萄糖、0. 6mM ATP、2mM Mg2+、和2mM NADP，在ρΗ = 7. 38的50mM硫酸組氨酸緩沖液中。圖41。硫氧還蛋白系統(tǒng)需要NADPH。lmg/ml 2H7 (變體A)+5 μ M硫氧還蛋白、0. 1 μ M 硫氧還蛋白還原酶、和2mM NADP，在ρΗ = 7. 38的50mM硫酸組氨酸緩沖液中。發(fā)明詳述I.定義在本發(fā)明中，在蛋白質(zhì)(包括抗體)的語境中，一般而言或就任何特定蛋白質(zhì)或 抗體而言，術(shù)語“還原”用于指蛋白質(zhì)或抗體的一個或多個二硫鍵的還原。如此，例如，術(shù)語 "ocreIizumab還原”與術(shù)語“ocrelizumab 二硫鍵還原”可互換使用，而術(shù)語“抗體(Ab)還 原”與術(shù)語“抗體(Ab) 二硫鍵還原”可互換使用。術(shù)語“還原”或“二硫鍵還原”以最廣義使用，而且包括完全的和部分的還原及蛋 白質(zhì)(諸如抗體)中存在的一些或所有(鏈間的或鏈內(nèi)的)二硫鍵的還原。“蛋白質(zhì)”意指鏈長度足以生成更高水平的三級和/或四級結(jié)構(gòu)的氨基酸序列。這 與沒有此類結(jié)構(gòu)的“肽”或其它小分子量藥物有區(qū)別。典型的是，本文中的蛋白質(zhì)會具有至 少約15-20kD、優(yōu)選至少約20kD的分子量。本文中定義內(nèi)所涵蓋的蛋白質(zhì)的例子包括所有 哺乳動物蛋白質(zhì)，特別是治療性和診斷性蛋白質(zhì)，諸如治療性和診斷性抗體，及一般而言含 有一個或多個二硫鍵的蛋白質(zhì)，包括包含一個或多個鏈間和/或鏈內(nèi)二硫鍵的多鏈多肽。術(shù)語“治療性蛋白質(zhì)”或“治療性多肽”指在疾病治療中使用的蛋白質(zhì)，不管其適應(yīng) 癥或作用機制。為了使治療性蛋白質(zhì)在臨床中有用，必須大量制造它。治療性蛋白質(zhì)或其 它蛋白質(zhì)的“制造規(guī)?！鄙a(chǎn)利用范圍為約400L至約80，000L的細胞培養(yǎng)物，取決于所生產(chǎn)的蛋白質(zhì)和需求。典型的是，此類制造規(guī)模生產(chǎn)利用量為約400L至約25，000L的細胞培養(yǎng) 物。在此范圍內(nèi)，利用特定的細胞培養(yǎng)物量，諸如4，000L、約6，000L、約8，000、約10，000、 約 12，000L、約 14，000L、或約 16，OOOL0術(shù)語“治療性抗體”指在疾病治療中使用的抗體。治療性抗體可具有各種作用機 制。治療性抗體可結(jié)合并中和與抗原有關(guān)的靶物的正常功能。例如，阻斷癌細胞存活所需要 的蛋白質(zhì)的活性的單克隆抗體引起細胞死亡。另一種治療性單克隆抗體可結(jié)合并活化與抗 原有關(guān)的靶物的正常功能。例如，單克隆抗體能結(jié)合細胞上的蛋白質(zhì)并觸發(fā)凋亡信號。又 一種單克隆抗體可結(jié)合只在患病組織上表達的靶抗原；給單克隆抗體偶聯(lián)毒性凈荷(有效 藥劑)(諸如化療劑或放射性藥劑)能創(chuàng)建向患病組織特異性投遞毒性凈荷的藥劑，降低對 健康組織的損害。治療性抗體的“生物學(xué)功能性片段”會展現(xiàn)至少一項(如果不是一些或 所有的話)歸于完整抗體的生物學(xué)功能，該功能至少包含特異性結(jié)合靶抗原。術(shù)語“診斷性蛋白質(zhì)”指在疾病診斷中使用的蛋白質(zhì)。術(shù)語“診斷性抗體”指作為疾病診斷試劑使用的抗體。診斷性抗體可結(jié)合與特定 疾病特異性相關(guān)的或在特定疾病中顯示表達升高的靶抗原。診斷性抗體可用于例如檢測來 自患者的生物學(xué)樣品中的靶物，或用在患者中疾病部位(諸如腫瘤)的診斷成像中。診斷 性抗體的“生物學(xué)功能性片段”會展現(xiàn)至少一項(如果不是一些或所有的話)歸于完整抗 體的生物學(xué)功能，該功能至少包含特異性結(jié)合靶抗原?！凹兓摹币馕吨肿右灾辽?0-90% (以包含它的樣品的重量計)的濃度存在于
樣品中。純化的蛋白質(zhì)(包括抗體)優(yōu)選是基本上純的且期望是基本上同質(zhì)的(即不含污 染性蛋白質(zhì)等)。“基本上純的”蛋白質(zhì)意味著基于組合物的總重量，蛋白質(zhì)組合物包含至少約90% (以重量計)、優(yōu)選至少約95% (以重量計)的蛋白質(zhì)?！盎旧贤|(zhì)的”蛋白質(zhì)意味著基于組合物的總重量，蛋白質(zhì)組合物包含至少約 99% (以重量計)的蛋白質(zhì)。如上所述，在某些實施方案中，所述蛋白質(zhì)是抗體。“抗體”(Ab)和“免疫球蛋 白”(Ig)是具有相同結(jié)構(gòu)特征的糖蛋白。雖然抗體展現(xiàn)出對特定抗原的結(jié)合特異性，但是 免疫球蛋白包括抗體和一般缺乏抗原特異性的其它抗體樣分子二者。后一類多肽例如由淋 巴系統(tǒng)以低水平生成而由骨髓瘤以升高的水平生成。術(shù)語“抗體”以最廣義使用，明確覆蓋單克隆抗體(包括具有免疫球蛋白Fc區(qū)的 全長抗體)、多克隆抗體、具有多表位特異性的抗體組合物、雙特異性抗體、雙抗體、和單鏈 分子諸如scFv分子、以及抗體片段(例如Fab、F(ab' )2、和Fv)。術(shù)語“單克隆抗體”在用于本文時指從一群基本上同質(zhì)的抗體獲得的抗體，即構(gòu)成 群體的各個抗體相同，除了可能以極小量存在的可能的突變，例如天然存在的突變。如此， 修飾語“單克隆”表明抗體不是分立的抗體的混合物的特征。在某些實施方案中，此類單克 隆抗體典型地包括包含結(jié)合靶物的多肽序列的抗體，其中靶物結(jié)合多肽序列是通過包括從 眾多多肽序列中選擇單一靶物結(jié)合多肽序列在內(nèi)的過程得到的。例如，選擇過程可以是從 眾多克隆諸如雜交瘤克隆、噬菌體克隆或重組DNA克隆的集合中選擇獨特克隆。應(yīng)當(dāng)理解， 所選擇的靶物結(jié)合序列可進一步改變，例如為了提高對靶物的親和力、將靶物結(jié)合序列人源化、提高其在細胞培養(yǎng)物中的產(chǎn)量、降低其在體內(nèi)的免疫原性、創(chuàng)建多特異性抗體等，而 且包含改變后的靶物結(jié)合序列的抗體也是本發(fā)明的單克隆抗體。與典型的包含針對不同決 定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制備物不同，單克隆抗體制備物的每個單克隆抗體 針對抗原上的單一決定簇。除它們的特異性外，單克隆抗體制備物的優(yōu)勢還在于它們通常 未受到其它免疫球蛋白的污染。修飾語“單克隆”表明抗體從基本上同質(zhì)的抗體群獲得的特征，不應(yīng)解釋為要求 通過任何特定方法來生產(chǎn)抗體。例如，將依照本發(fā)明使用的單克隆抗體可通過多種技術(shù)來 生成，包括例如雜交瘤法(例如 Kohler et al.，Nature256 495(1975) ；Harlow et al.， Antibodies :A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press,2nd ed. 1988 ； Hammerling et al., 于MonoclonalAntibodies and T-Cell Hybridomas, 563-681, Elsevier, N. Y.，1981)、重組DNA法(參見例如美國專利No. 4，816，567)、噬菌體展示技 術(shù)(參見例如 Clackson et al.，Nature 352 :624_628 (1991) ；Marks et al.，J. Mol. Biol. 222 :581-597 (1992) ；Sidhu et al. , J. Mol. Biol. 338(2) :299_310 (2004) ；Lee et al.，J. Mol. Biol. 340(5) 1073-1093 (2004) ；Fellouse, Proc. Nat. Acad. Sci. USAlOl (34) 12467-12472(2004) ；Lee et al. , J. Immunol. Methods 284 (1-2) 119-132 (2004))、及用 于在具有部分或整個人免疫球蛋白基因座或編碼人免疫球蛋白序列的基因的動物中生成 人或人樣抗體的技術(shù)(參見例如 WO 98/24893 ；W096/34096 ；WO 96/33735 ；WO 91/10741 ； Jakobovits et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551 (1993) ；Jakobovits et al., Nature 362:255-258(1993) ；Bruggemannet al. , Year in Immuno. 7 :33 (1993)；美國專 利 No. 5，545，807 ；5，545，806 ；5，569，825 ；5，625，126 ；5，633，425 ；5，661，016 ；Marks et al.，Bio/TechnologylO :779_783(1992) ；Lonberg et al.，Nature 368 :856_859 (1994)； Morrison, Nature368 812-813 (1994) ；Fishwild et al. ， Nature Biotechnol. 14 845-851 (1996) ；Neuberger, Nature Biotechnol. 14 :826 (1996) ；Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 :65_93 (1995))。單克隆抗體在本文中明確包括“嵌合”抗體，以及此類抗體的片段，只要它們展現(xiàn) 出期望的生物學(xué)活性，其中所述抗體的重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種或?qū)儆?特定抗體類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，而鏈的剩余部分與衍生自另一物種 或?qū)儆诹硪豢贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，(美國專利No. 4，816，567和 Morrison et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851—6855(1984))。非人(例如鼠)抗體的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的 序列的嵌合抗體。在一個實施方案中，人源化抗體指人免疫球蛋白(受體抗體)中的高變 區(qū)殘基用具有期望特異性、親和力和/或能力的非人物種(供體抗體)(諸如小鼠、大鼠、家 兔、或非人靈長類動物)的高變區(qū)殘基替換的免疫球蛋白。在有些情況中，將人免疫球蛋白 的框架區(qū)(FR)殘基用相應(yīng)的非人殘基替換。此外，人源化抗體可包含在受體抗體中或在供 體抗體中沒有找到的殘基。進行這些修飾可以是為了進一步改進抗體的性能。一般而言，人 源化抗體將包含至少一個、通常兩個基本上整個如下的可變域，其中所有或基本上所有高 變環(huán)對應(yīng)于非人免疫球蛋白的高變環(huán)，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR 區(qū)。人源化抗體任選還將包含至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fe)，通常是人免疫球蛋白的恒 定區(qū)。更多細節(jié)參見 Joneset al.，Nature 321 :522_525 (1986) ；Riechmann et al. , Nature332:323-329(1988)；及 Presta，Curr. Op. Struct. Biol. 2 593-596 (1992) 還可參見以 下綜述及其弓I用的參考文獻:Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma&Immunol. 1 105-115(1998) ；Harris, Biochem. Soc. Transactions 23 1035-1038 (1995) ；Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5 :428_433 (1994)。人源化抗體包括 Primatized (靈長類化)抗 體，其中抗體的抗原結(jié)合區(qū)衍生自通過用感興趣抗原免疫獼猴而生成的抗體?！叭丝贵w”指擁有與由人生成的抗體的氨基酸序列對應(yīng)的氨基酸序列和/或使用本 文所公開的用于生成人抗體的任何技術(shù)生成的抗體。人抗體的這種定義明確排除包含非人 抗原結(jié)合殘基的人源化抗體。“親和力成熟的”抗體指在抗體的一個或多個CDR/HVR中具有一處或多處改變、 導(dǎo)致該抗體對抗原的親和力與沒有這些改變的親本抗體相比有所改進的抗體。優(yōu)選的親 和力成熟的抗體具有納摩爾或甚至皮摩爾量級的對靶抗原的親和力。親和力成熟的抗體 可通過本領(lǐng)域已知規(guī)程來生成。Marks etal.，Bio/Technology 10 :779_783 (1992)記載 了通過VH和VL結(jié)構(gòu)域改組進行的親和力成熟。以下文獻記載了⑶R/HVR和/或框架殘 基的隨機誘變Barbas etal.，Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91 :3809_3813(1994) ；Schier et al.，Genel69 147-155(1995) ；Yelton et al.，J.Immunol. 155 1994-2004(1995)； Jackson etal. ， J. Immunol. 154(7) 3310-9 (1995) ；Hawkins et al. ， J. Mol. Biol. 226 889-896(1992)?？贵w的“可變區(qū)”或“可變域”指抗體重鏈或輕鏈的氨基末端結(jié)構(gòu)域。重鏈的可變 域可以稱為“VH”。輕鏈的可變域可以稱為“VL”。這些結(jié)構(gòu)域一般是抗體的最易變部分且 包含抗原結(jié)合位點。術(shù)語“可變的”指可變域中的某些部分在抗體序列間差異廣泛且用于每種特定抗 體對其特定抗原的結(jié)合和特異性的實情。然而，變異性并非均勻分布于抗體的整個可變 域。它集中于輕鏈和重鏈可變域中稱作互補決定區(qū)(CDR)或高變區(qū)(HVR)的三個區(qū)段?？?變域中相對較高度保守的部分稱作框架區(qū)(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變域各自包含四個 FR，它們大多采取折疊片構(gòu)象，通過形成環(huán)狀連接且在有些情況中形成折疊片結(jié)構(gòu) 一部分的三個⑶R連接。每條鏈中的⑶R通過FR非常接近地保持在一起，并與另一條鏈 的CDR —起促成抗體的抗原結(jié)合位點的形成(參見Kabat et al.，Sequences ofProteins of Immunological Interest, 第 5 版，National Institute of Health, Bethesda, MD. (1991))。恒定域不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但展現(xiàn)出多種效應(yīng)器功能，諸如抗體依 賴性細胞的細胞毒性中抗體的參與。根據(jù)其恒定域的氨基酸序列，來自任何脊椎動物物種的抗體(免疫球蛋白)的“輕 鏈”可歸入兩種截然不同的型中的一種，稱作卡帕(K)和拉姆達(λ)。根據(jù)其重鏈恒定域的氨基酸序列，抗體(免疫球蛋白)可歸入不同的類。免疫球蛋 白有五大類IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些可進一步分為亞類(同種型)，例如IgGl、 IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。將與不同類的免疫球蛋白對應(yīng)的重鏈恒定域分別稱作α、 δ、ε、γ和μ。不同類別免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)造是眾所周知的，一般性描述于 例如 Abbas et al.，Cellular and Mol. Immunology,4th ed. (2000)?？贵w可以是抗體與 一種或多種其它蛋白質(zhì)或肽共價或非共價連接而形成的更大融合分子的一部分。術(shù)語“全長抗體”和“完整抗體”在本文中可互換使用，指基本上完整形式的抗體而非如下文所定義的抗體片段。該術(shù)語具體指重鏈包含F(xiàn)c區(qū)的抗體?！翱贵w片段”只包含完整抗體的一部分，其中所述部分保留該部分存在于完整抗體 中時通常與之有關(guān)的至少一項、多至大多數(shù)或所有功能。在一個實施方案中，抗體片段包含 完整抗體的抗原結(jié)合位點，如此保留結(jié)合抗原的能力。在另一個實施方案中，抗體片段，例 如包含F(xiàn)c區(qū)的抗體片段，保留通常與Fc區(qū)存在于完整抗體中時通常與之有關(guān)的至少一項 生物學(xué)功能，諸如FcRn結(jié)合、抗體半衰期調(diào)控、ADCC功能和補體結(jié)合。在一個實施方案中， 抗體片段是體內(nèi)半衰期與完整抗體基本上相似的單價抗體。例如，這樣的抗體片段可包含 一個抗原結(jié)合臂且其與能夠賦予該片段以體內(nèi)穩(wěn)定性的Fc序列相連。用木瓜蛋白酶消化抗體產(chǎn)生兩個相同的抗原結(jié)合片段，稱為“Fab”片段，各自具有 一個抗原結(jié)合位點，及剩余的“Fc”片段，其名稱反映了它易于結(jié)晶的能力。胃蛋白酶處理 產(chǎn)生F(ab' )2片段，它具有兩個抗原結(jié)合位點且仍能夠交聯(lián)抗原。Fab片段包含重鏈可變域和輕鏈可變域，而且還包含輕鏈的恒定域和重鏈的第一 恒定域(CHI)。Fab'片段與Fab片段的不同之處在于重鏈CHI結(jié)構(gòu)域的羧基末端增加了少 數(shù)殘基，包括來自抗體鉸鏈區(qū)的一個或多個半胱氨酸。Fab' _SH是本文中對其中恒定域半 胱氨酸殘基攜帶游離硫醇基的Fab'的稱謂。F(ab' )2抗體片段最初是作為在成對Fab' 片段之間有鉸鏈半胱氨酸的成對Fab'片段生成的。還知道抗體片段的其它化學(xué)偶聯(lián)形式?！癋v”是包含完整抗原結(jié)合位點的最小抗體片段。在一個實施方案中，雙鏈Fv種類 由緊密、非共價結(jié)合的一個重鏈可變域和一個輕鏈可變域的二聚體組成。在單鏈Fv(SCFv) 種類中，一個重鏈可變域和一個輕鏈可變域可以通過柔性肽接頭共價相連接，使得輕鏈和 重鏈在與雙鏈Fv種類類似的“二聚體”結(jié)構(gòu)中相結(jié)合。正是在這種構(gòu)造中，每個可變域的 三個CDR相互作用而在VH-VL 二聚體表面上限定了抗原結(jié)合位點。六個CDR —起賦予抗體 以抗原結(jié)合特異性。然而，即使是單個可變域(或是只包含對抗原特異性的三個CDR的半 個Fv)也具有識別和結(jié)合抗原的能力，只是親和力低于完整結(jié)合位點。“單鏈Fv”或“scFv”抗體片段包含抗體的VH和\結(jié)構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu)域 存在于一條多肽鏈上。一般而言，scFv多肽在VH與八結(jié)構(gòu)域之間進一步包含多肽接 頭，其使得scFv能夠形成結(jié)合抗原的期望結(jié)構(gòu)。關(guān)于scFv的綜述參見Pluckthim，于 《The Pharmacology of Monoclonal Antibodies》，第 113 卷，Rosenburg 禾口 Moore 編， Springer-Verlag, New York，第 269-315 頁，1994。術(shù)語“雙抗體”指具有兩個抗原結(jié)合位點的小型抗體片段，該片段在同一條多肽 鏈(VH-VJ中包含相連的重鏈可變域(VH)和輕鏈可變域(\)。通過使用過短的接頭使得 同一條鏈上的兩個結(jié)構(gòu)域之間不能配對，迫使這些結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補結(jié)構(gòu)域配對， 從而產(chǎn)生兩個抗原結(jié)合位點。雙抗體可以是二價的或雙特異性的。雙抗體更完整的記載 于例如 EP 404，097 ；W093/1161 ；Hudson et al. (2003) Nat. Med. 9 :129_134 ；及 Hoi linger et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448(1993)。三抗體(Triabody)和四抗體 (tetrabody)也記載于 Hudson et al. (2003) Nat. Med. 9 :129-134?？贵w可結(jié)合任何蛋白質(zhì)，包括但不限于HER受體家族的成員，諸如HER1 (EGFR)、 HER2、HER3 和 HER4 ；CD 蛋白，諸如 CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD21、CD22、和 CD34 ；細胞粘 附分子，諸如 LFA-1、Mol、pl50、95、VLA-4、ICAM_1、VCAM 和 a 3 整聯(lián)蛋白，包括其 a 或日亞基(例如抗⑶11a、抗⑶18或抗⑶lib抗體)；生長因子，諸如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF) ；IgE ；血型抗原；flk2/flt3受體；肥胖(0B)受體；和蛋白C。其它例示性蛋白質(zhì)包 括生長激素(GH)，包括人生長激素(hGH)和牛生長激素(bGH)；生長激素釋放因子；甲狀旁 腺素；促甲狀腺激素；脂蛋白；a -1-抗胰蛋白酶；胰島素A鏈；胰島素B鏈；胰島素原；促卵 泡激素；降鈣素；黃體生成素；高血糖素；凝血因子，諸如因子VIIIC、因子IX、組織因子、和 von ffillebrands因子；抗凝血因子，諸如蛋白C ；心房鈉尿因子；肺表面活性劑；纖溶酶原 激活劑，諸如尿激酶或組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)；鈴蟾肽；凝血酶；腫瘤壞死因子-a 和；腦啡肽酶；RANTES(在激活后受到調(diào)節(jié)，正常情況下由T細胞表達和分泌)；人巨噬 細胞炎癥蛋白(MIP-1-a)；血清清蛋白，諸如人血清清蛋白(HSA) ；Muellerian抑制性物 質(zhì)；松弛素A鏈；松弛素B鏈；松弛素原；小鼠促性腺素相關(guān)肽；DNA酶；抑制素；激活素；激 素的或生長因子的受體；整聯(lián)蛋白；蛋白A或D ；類風(fēng)濕因子；神經(jīng)營養(yǎng)性因子，諸如骨衍生 神經(jīng)營養(yǎng)性因子(BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)因子-3、-4、-5、或-6 (NT_3、NT_4、NT-5、或NT-6)、或神 經(jīng)生長因子，諸如NGF-0 ；血小板衍生生長因子(PDGF)；成纖維細胞生長因子，諸如aFGF 和bFGF ；表皮生長因子(EGF)；轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)，諸如TGF- a和TGF- 3，包括TGF- 3 1、 TGF-3 2、TGF-3 3、TGF-3 4、或 TGF-3 5 ；胰島素樣生長因子-I 和-II (IGF-I 和 IGF-II)； des(l-3)-IGF-I (腦IGF-I)；胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白(IGFBP)；紅細胞生成素(EP0)； 血小板生成素(TP0)；骨誘導(dǎo)因子；免疫毒素；骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)；干擾素，諸如干擾 素- a、-3、和；集落刺激因子(CSF)，例如M-CSF、GM-CSF、和G-CSF ；白介素(IL)，例如 IL-1至IL-10 ；超氧化物歧化酶；T細胞受體；表面膜蛋白；衰變加速因子(DAF)；病毒抗原， 諸如例如AIDS包膜的一部分；運輸?shù)鞍?；歸巢受體；地址素；調(diào)節(jié)蛋白；免疫粘附素；抗體； 及任何上文所列多肽的生物學(xué)活性片段或變體。許多其它抗體和/或其它蛋白質(zhì)可依照本 發(fā)明使用，而且上文列表并非意欲限制本發(fā)明。 抗體的“生物學(xué)功能性片段”只包含完整抗體的一部分，其中所述部分保留該部分 存在于完整抗體中時通常與之有關(guān)的至少一項、多至大多數(shù)或所有功能。在一個實施方案 中，抗體的生物學(xué)功能性片段包含完整抗體的抗原結(jié)合位點，如此保留結(jié)合抗原的能力。在 另一個實施方案中，抗體的生物學(xué)功能性片段(例如包含F(xiàn)c區(qū)的)保留通常與Fc區(qū)存在 于完整抗體中時通常與之有關(guān)的至少一項生物學(xué)功能，諸如FcRn結(jié)合、抗體半衰期調(diào)控、 ADCC功能和補體結(jié)合。在一個實施方案中，抗體的生物學(xué)功能性片段是體內(nèi)半衰期與完整 抗體基本上相似的單價抗體。例如，這樣的抗體的生物學(xué)功能性片段可包含一個抗原結(jié)合 臂且其與能夠賦予該片段以體內(nèi)穩(wěn)定性的Fc序列相連。術(shù)語“硫氧還蛋白抑制劑”和“Trx抑制劑”可互換使用，包括有效抑制硫氧還蛋白 活性的所有試劑和措施。如此硫氧還蛋白(Trx)抑制劑包括阻斷Trx、G6PD和/或己糖激 酶系統(tǒng)的任何成分的所有試劑和措施。在此語境中，“抑制”包括完全消除(阻斷)和降低 硫氧還蛋白活性，及因此完全或部分消除蛋白質(zhì)(諸如抗體)中的二硫鍵還原?！胺蛛x的”抗體指已經(jīng)鑒定且自其天然環(huán)境的成分分開和/或回收的抗體。其天然 環(huán)境的污染性成分指將會干擾該抗體的研究、診斷或治療用途的物質(zhì)，可包括酶、激素、和 其它蛋白質(zhì)性質(zhì)或非蛋白質(zhì)性質(zhì)的溶質(zhì)。在有些實施方案中，將抗體純化至(1)根據(jù)例如 Lowry法的測定，抗體重量超過95%，而在有些實施方案中，重量超過99%，(2)足以通過使 用例如轉(zhuǎn)杯式測序儀獲得至少15個殘基的N-末端或內(nèi)部氨基酸序列的程度，或(3)根據(jù) 還原性或非還原性條件下的SDS-PAGE及使用例如考馬斯藍或銀染色，達到同質(zhì)。既然抗體天然環(huán)境的至少一種成分不會存在，那么分離的抗體包括重組細胞內(nèi)的原位抗體。然而，分 離的抗體通常將通過至少一個純化步驟來制備。術(shù)語“蛋白A”和“ProA”在本文中可互換使用，涵蓋自其天然來源回收的蛋白A、 合成生成的蛋白A(例如通過肽合成或通過重組技術(shù))、及其保留結(jié)合具有Ch2/Ch3區(qū)(諸 如Fc區(qū))的蛋白質(zhì)的能力的變體。蛋白A可購自R印ligen、GE Healthcare和Fermatech。 蛋白A —般固定化在固相支持材料上。術(shù)語“蛋白A”還指含有對其共價附著蛋白A的層析 固體支持基質(zhì)的親和層析樹脂或柱。術(shù)語“層析”指根據(jù)混合物中的各種溶質(zhì)在流動相的影響下或在結(jié)合和洗脫過程 中穿過靜止的介質(zhì)遷移的速率的差異，將混合物中的感興趣溶質(zhì)與混合物中的其它溶質(zhì)分 開的過程。術(shù)語“親和層析”和“蛋白質(zhì)層析”在本文中可互換使用，指其中感興趣蛋白質(zhì)或感 興趣抗體可逆地且特異性地結(jié)合至生物特異性配體的蛋白質(zhì)分離技術(shù)。優(yōu)選的是，所述生 物特異性配體共價附著至層析固相材料且在溶液接觸層析固相材料時是溶液中的感興趣 蛋白質(zhì)可及的。在層析步驟期間，所述感興趣蛋白質(zhì)(例如抗體、酶、或受體蛋白質(zhì))保留 其對生物特異性配體(例如抗原、底物、輔因子、或激素)的特異性結(jié)合親和力，而混合物中 的其它溶質(zhì)和/或蛋白質(zhì)沒有可觀地或特異性地結(jié)合配體。感興趣蛋白質(zhì)對固定化配體的 結(jié)合容許污染性蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)雜質(zhì)流過層析介質(zhì)而感興趣蛋白質(zhì)保持特異性結(jié)合至固 相材料上的固定化配體。然后，特異性結(jié)合的感興趣蛋白質(zhì)用低PH、高pH、高鹽、競爭性配 體、等等以活性形式自固定化配體消除，并隨洗脫緩沖液流過層析柱，不含早先容許流過柱 的污染性蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)雜質(zhì)。任何成分都能用作用于純化其相應(yīng)特異性結(jié)合蛋白質(zhì)(例 如抗體)的配體。術(shù)語“非親和層析”和“非親和純化”指其中不利用親和層析的純化過程。非親和 層析包括依賴感興趣分子(諸如蛋白質(zhì)，例如抗體)與固相基質(zhì)之間的非特異性相互作用 的層析技術(shù)?！瓣栯x子交換樹脂”指如下的固相，其帶負電荷且因此有游離陽離子供與流過該 固相的水溶液中的陽離子交換。附著至固相以形成陽離子交換樹脂的、帶負電荷的配體可 以是例如羧酸根或磺酸根。商品化的陽離子交換樹脂包括羧甲基纖維素、在瓊脂糖上固 定化的磺丙基(SP)(例如 GE Healthcare 的 SP-SEPHAROSE FAST FLOW 或 SP-SEPHAR0SE HIGHPERFORMANCE )和固定化在瓊脂糖上的磺?；?例如GE Healthcare的S-SEPHAR0SE FAST FLOW )?！盎旌夏Ｊ诫x子交換樹脂”指經(jīng)陽離子、陰離子、和疏性模塊共價修飾的固相。 商品化的混合模式離子交換樹脂是BAKERBOND ABX (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ)，其含 有附著至硅膠固相支持介質(zhì)的弱陽離子交換基團、低濃度陰離子交換基團、和疏水性配體。術(shù)語“陰離子交換樹脂”在本文中用于指帶正電荷的固相，例如具有附著于它的一 個或多個帶正電荷的配體，諸如季氨基團。商品化的陰離子交換樹脂包括DEAE纖維素、QAE SEPHADEX 和 FAST Q SEPHAROSE (GEHealthcare)?！熬彌_液”指通過其酸-堿成對成分的作用來抵抗pH變化的溶液。Buffers. A Guide for the Preparation and Use of Buffers in Biological Systems, Gueffroy, D.，ed. Calbiochem Corporation (1975)中記載了取決于例如期望的緩沖液pH而可采用的 多種緩沖液。在一個實施方案中，所述緩沖液具有約2至約9、或者約3至約8、或者約4至約7、或者約5至約7范圍內(nèi)的pH。會將pH控制在此范圍內(nèi)的緩沖液的例示性例子包括 MES、M0PS、M0PS0、Tris、HEPES、磷酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽、琥珀酸鹽、和銨緩沖液，以及這些 緩沖液的組合?！凹虞d緩沖液”指用于將包含感興趣多肽分子和一種或多種雜質(zhì)的組合物加載到 離子交換樹脂上的緩沖液。加載緩沖液具有如下的電導(dǎo)率和/或PH，其使得感興趣多肽分 子(和一般一種或多種雜質(zhì))結(jié)合至離子交換樹脂或使得感興趣蛋白質(zhì)流過柱而雜質(zhì)結(jié)合 至樹脂。“中間緩沖液”指用于在洗脫感興趣多肽分子之前自離子交換樹脂洗脫一種或多 種雜質(zhì)的緩沖液。中間緩沖液的電導(dǎo)率和/或PH使得一種或多種雜質(zhì)自離子交換樹脂洗 脫，但不洗脫顯著量的感興趣多肽。術(shù)語“清洗緩沖液”在本文中使用時指用于在洗脫感興趣多肽分子之前清洗或再 平衡離子交換樹脂的緩沖液。方便的是，清洗緩沖液和加載緩沖液可以是相同的，但這不是 必須的?！跋疵摼彌_液”用于自固相洗脫感興趣多肽。洗脫緩沖液的電導(dǎo)率和/或PH使得 感興趣多肽自離子交換樹脂洗脫?！霸偕彌_液”可用于再生離子交換樹脂，使得它能再使用。再生緩沖液具有自離 子交換樹脂清除基本上所有雜質(zhì)和感興趣多肽所要求的電導(dǎo)率和/或PH。短語“基本上相似”或“基本上相同”在用于本文時表示兩個數(shù)值(例如，一個涉 及本發(fā)明的抗體而另一個涉及參照/比較抗體)之間足夠高的相似程度，以致本領(lǐng)域技術(shù) 人員將認為在用所述數(shù)值(例如Kd值)所測量的生物學(xué)特性背景內(nèi)兩個數(shù)值之間的差異 具有很小的或沒有生物學(xué)和/或統(tǒng)計學(xué)顯著性。作為參照/比較值的函數(shù)，所述兩個數(shù)值 之間的差異例如小于約50%，小于約40%，小于約30%，小于約20%，和/或小于約10%。短語“實質(zhì)性降低”或“實質(zhì)性不同”在用于本文時(關(guān)于量或數(shù)值，而非提到還 原的化學(xué)過程)表示兩個數(shù)值(通常一個與某分子有關(guān)而另一個與參照/比較分子有關(guān)) 之間足夠高的差異程度，以致本領(lǐng)域技術(shù)人員將認為在用所述數(shù)值(例如Kd值)所測量的 生物學(xué)特性背景內(nèi)兩個數(shù)值之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)顯著性。作為參照/比較分子該數(shù)值的 函數(shù)，所述兩個數(shù)值之間的差異例如大于約10 %，大于約20 %，大于約30 %，大于約40 %， 和/或大于約50%。術(shù)語“載體”在用于本文時意指能夠運輸與其連接的其它核酸的核酸分子。一類 載體是“質(zhì)粒”，指其中可連接另外的DNA區(qū)段的環(huán)狀雙鏈DNA。另一類載體是噬菌體載體。 另一類載體是病毒載體，其中可將另外的DNA區(qū)段連接到病毒基因組中。某些載體能夠在 其所導(dǎo)入的宿主細胞中自主復(fù)制(例如具有細菌復(fù)制起點的細菌載體和附加型哺乳動物 載體)。其它載體(例如非附加型哺乳動物載體)可在導(dǎo)入宿主細胞后整合到宿主細胞的 基因組中，由此隨著宿主基因組一起復(fù)制。此外，某些載體能夠指導(dǎo)與其可操作連接的基因 表達。此類載體在本文中稱為“重組表達載體”(或簡稱為“表達載體”)。通常，在重組DNA 技術(shù)中有用的表達載體常常是質(zhì)粒形式。在本說明書中，“質(zhì)?！焙汀拜d體”可互換使用，因 為質(zhì)粒是載體的最常用形式。關(guān)于參考多肽序列的“百分比(％ )氨基酸序列同一性”定義為對比序列并在必要 時引入缺口以獲取最大百分比序列同一性后，且不將任何保守替代視為序列同一性的一部分時，候選序列中與參考多肽序列中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分率。為測定百 分比氨基酸序列同一性目的的對比可以本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的多種方式進行，例如使用公眾 可得到的計算機軟件，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟件。本領(lǐng)域技術(shù) 人員可決定用于對比序列的適宜參數(shù)，包括對所比較序列全長獲得最大對比所需的任何算 法。然而，為了本發(fā)明的目的，％氨基酸序列同一性值是使用序列比較計算機程序ALIGN-2 獲得的。ALIGN-2序列比較計算機程序由Genentech公司編寫，源代碼已經(jīng)連同用戶文檔一 起提交給美國版權(quán)局(USCopyright Office, Washington D. C.，20559)，并以美國版權(quán)注冊 號 TXU510087 注冊。公眾可自 Genentech 公司(South San Francisco, California)得到 ALIGN-2程序，或者可以自源代碼編譯。ALIGN2程序應(yīng)當(dāng)編譯成在UNIX操作系統(tǒng)，優(yōu)選數(shù) 碼UNIX V4. 0D上使用。所有序列比較參數(shù)由ALIGN-2程序設(shè)定且不變。在采用ALIGN-2來比較氨基酸序列的情況中，給定氨基酸序列A相對于(to)、與 (with)、或針對(against)給定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者可表述為具有 或包含相對于、與、或針對給定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性的給定氨基酸序 列A)如下計算分數(shù)X/Y 乘 100其中X是由序列對比程序ALIGN-2在該程序的A和B對比中評分為相同匹配的氨 基酸殘基數(shù)，且其中Y是B中的氨基酸殘基總數(shù)?？梢灶I(lǐng)會，若氨基酸序列A的長度與氨基 酸序列B的長度不相等，則A相對于B的％氨基酸序列同一性將不等于B相對于A的％氨 基酸序列同一性。除非另有具體說明，本文中所使用的所有％氨基酸序列同一性值都是依照上一段 所述，使用ALIGN-2計算機程序獲得的?！鞍俜直?％ )核酸序列同一性”定義為對比序列并在必要時引入缺口以獲取最大 百分比序列同一性后，候選序列中與參考因子D編碼序列中的核苷酸相同的核苷酸的百分 率。本領(lǐng)域技術(shù)人員可決定用于測量對比的適宜參數(shù)，包括對所比較序列全長獲得最大對 比所需的任何算法。然后相對于較長的序列計算序列同一性，即，即使較短的序列顯示與較 長的序列一部分的100%序列同一性，整體序列同一性也會小于100%。“治療”或“處理”指治療性處理和預(yù)防性或防范性措施二者。需要治療的受試者 包括早就患有病癥的受試者以及要預(yù)防病癥的受試者?！爸委煛被颉疤幚怼痹诒疚闹泻w緩 解疾病和緩解特定疾病的征候和癥狀?！安“Y”指任何會受益于蛋白質(zhì)治療的疾患。這包括慢性和急性病癥，或包括那些 使哺乳動物傾向于所討論病癥的病理狀況的疾病。本文中要治療的病癥的非限制性例子包 括癌瘤和變態(tài)反應(yīng)。為了治療目的，“哺乳動物”指歸入哺乳類的任何動物，包括人、非人高等靈長類、 其它脊椎動物，家畜和牲畜，及動物園、運動或?qū)櫸飫游?，諸如犬、馬、貓、牛等。優(yōu)選的是，哺 乳動物指人?！案蓴_RNA”或“小干擾RNA(siRNA) ”指長度小于約30個核苷酸且降低靶基因表 達的雙鏈RNA分子。干擾RNA可使用已知方法來鑒定和合成(ShiY.，Trends in Genetics 19(1) 9-12(2003) ；W0 2003/056012 ；W0 2003/064621)，而且 siRNA 文庫可通過商業(yè)途徑 獲得，例如Dharmacon，Lafayette, Colorado。通常，siRNA能成功設(shè)計成靶向基因的5‘端。II.本發(fā)明的組合物和方法除非另有說明，本發(fā)明的實施將釆用分子生物學(xué)等的常規(guī)技術(shù)，這些都在本領(lǐng)域 的摶術(shù)范闈內(nèi)。這勝摶術(shù)在t獻中有充分解釋。參見例如MolecularCloning :A Laboratory Manual, (J. 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Borrebaeck, ed. , Oxford University Press，1995) ；and the seriesAnnual Review of Immunology ；the series Advances in Immunology。1.防lh二硫鍵還原本發(fā)明關(guān)注用于防止重組生產(chǎn)期間蛋白質(zhì)二硫鍵還原的方法。具體而言，本發(fā)明 關(guān)注用于防止發(fā)酵后加工期間重組蛋白二硫鍵還原的方法。本發(fā)明的方法對于含有二硫鍵 的蛋白質(zhì)的大規(guī)模生產(chǎn)(諸如制造規(guī)模的)特別有價值。在一個實施方案中，本發(fā)明的對 于規(guī)模超過5，000L的大規(guī)模蛋白質(zhì)生產(chǎn)是有用的。通過實驗發(fā)現(xiàn)，在加工含有二硫鍵的重組蛋白制造期間生成的已收獲的細胞培養(yǎng) 液(HCCF)期間發(fā)生二硫鍵還原。典型的是，在細胞裂解后觀察到此還原，尤其是收獲操作 期間的機械細胞裂解，當(dāng)它達到某閾值時，諸如例如約30%至約70%、或約40%至約60%、 或約50%至約60%的總細胞裂解時。此閾值會有變化，取決于所生成的蛋白質(zhì)(例如抗 體)的本質(zhì)、重組宿主、生產(chǎn)系統(tǒng)、所使用的生產(chǎn)參數(shù)、等等，而且能通過實驗容易地確定。
理論上，此類還原可源自制造過程期間的多種因素和條件，而且可源自多種還原 劑。本發(fā)明(至少部分)基于如下的認識，即此還原的根本原因是HCCF中的活性硫氧還蛋 白(Trx)或硫氧還蛋白樣系統(tǒng)。Trx酶系統(tǒng)(由Trx、硫氧還蛋白還原酶(TrxR)和NADPH構(gòu)成)是蛋白質(zhì)中二硫 鍵還原的氫供體系統(tǒng)。Trx是具有經(jīng)由硫醇-二硫化物交換催化許多氧化還原反應(yīng)的CXXC 活性位點基序的小單體蛋白質(zhì)。氧化型Trx能被NADPH經(jīng)TrxR還原。然后還原型Trx能夠 催化蛋白質(zhì)中二硫化物的還原。硫氧還蛋白系統(tǒng)所需要的NADPH是經(jīng)由磷酸戊糖途徑和糖 酵解中的反應(yīng)提供的。本文中所呈現(xiàn)的結(jié)果證明了 NADPH(其是Trx系統(tǒng)的活性所需要的) 是由葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)活性(其通過己糖激酶自葡萄糖和ATP生成NADPH)提 供的(見圖4)。在細胞裂解時，這些細胞酶(Trx系統(tǒng)、G6PD、和己糖激酶)與它們的底物 一起被釋放入CCF中，從而容許還原發(fā)生。因而，可以通過Trx酶系統(tǒng)的或為活性Trx系統(tǒng) 提供成分的上游酶系統(tǒng)(諸如G6PD和己糖激酶活性)的抑制劑來防止二硫化物還原。關(guān)于這些酶系統(tǒng)的進一步詳情或關(guān)于蛋白質(zhì)生產(chǎn)的其它詳情參見例 如Babson，A. L. and Babson，S. R. (1973)Kinetic Colorimetric Measurement ofSerum Lactate Dehydrogenase Activity.Clin :Chem. 19 :766_769 ；Michael W.Laird et al. ，"Optimization of BLyS Production and Purification from Eschericiacoli, ” Protein Expression and Purification 39 :237_246 (2005)； John C. 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Lett. 11 :2637_26410依照本發(fā)明的一個方面，可通過阻斷Trx、G6PD和己糖激酶酶系統(tǒng)的任何成分來 防止二硫鍵還原。這些酶系統(tǒng)的抑制劑在本文中統(tǒng)稱為“硫氧還蛋白抑制劑”或“Trx抑制 劑”。典型的是，將Trx抑制劑添加至含有重組宿主細胞和培養(yǎng)液的細胞培養(yǎng)液(CCF)和/ 或通過離心、過濾、或類似分離方法收獲后獲得的已收獲的細胞培養(yǎng)液(HCCF)。HCCF缺少 完整細胞，但通常含有宿主細胞蛋白質(zhì)和其它污染物，包括DNA，它們在后續(xù)純化步驟中清 除。如此，可以在收獲之前和/或在收獲期間、優(yōu)選在收獲之前添加Trx抑制劑。或者/另外，也可以使用其它非特異性方法來防止重組蛋白重組生產(chǎn)期間發(fā)酵后 的二硫鍵還原，諸如鼓入空氣或調(diào)節(jié)pH。下文表1中列舉了本文中所涵蓋的某些還原抑制 方法。表1 還原抑制方法 1在收獲之前應(yīng)用至CCF或在收獲之后立即應(yīng)用于HCCF。2當(dāng)前尚未商品化。供本發(fā)明方法中使用的“Trx抑制劑”包括但不限于(l)Trx的直接抑制劑，諸 如烴基-2-咪唑基二硫化物和相關(guān)化合物(例如1-甲基丙基-2-咪唑基二硫化物)(Kirkpatrick et al.，1998and 1999, supra)和萘醌螺酮縮醇衍生物(例如 palmarumycin CPi) (ffipf et al. ,2001, supra) ； (2) TrxR的特異性抑制劑，包括金復(fù)合物，諸如金硫葡糖 (ATG)和金硫蘋果酸(ATM)(參見例如綜述Gromer etal.，2004)，它們是TrxR的不可逆抑 制劑的例子；⑶金屬離子，諸如Hg2+、CU2+、Zn2+、C02+、和Mn2+，它們能與硫醇和硒醇容易地形 成復(fù)合物，如此可在本發(fā)明的實施方案中用作TrxR或Trx的抑制劑；(4)G6PD的抑制劑，諸 如例如吡哆醛-5’ -磷酸和1-氟-2，4-二硝基苯(Milhausen and Levy 1975，supra)，某 些類固醇，諸如脫氫表雄酮(DHEA)和表雄酮(EA) (Gordon et al. , 1995, supra) ’及(4)己 糖激酶活性(由此為G6PD生成G6P)的抑制劑，包括金屬離子(例如Mg2+)的螯合劑(諸如 EDTA)和與SH基團起反應(yīng)的化合物，山梨糖-1-磷酸、多磷酸、6-脫氧-6-氟葡萄糖、2-C-羥 基-甲基葡萄糖、木糖和來蘇糖(Sols et al.，1958，supra ；McDonald, 1955, supra)；其它 己糖激酶抑制劑披露于美國專利No. 5，854，067，題為“徹101^皿86 Inhibitors”。應(yīng)當(dāng)理 解，這些抑制劑是僅作為例示而列舉的。存在其它Trx抑制劑，而且能單獨地或以各種組合 在本發(fā)明的方法中使用。供本發(fā)明方法中使用的“Trx抑制劑”還包括如下的試劑，其通過在生產(chǎn)活動期間 的各個點降低Trx系統(tǒng)、磷酸戊糖途徑或己糖激酶的酶的水平，從而降低或防止重組生成 的抗體或蛋白質(zhì)的還原。在一些實施方案中，所述酶水平的降低可以通過使用靶向siRNA、 反義核苷酸、或抗體來實現(xiàn)。為了設(shè)計針對CH0細胞中找到的基因的靶向siRNA或反義核 苷酸，這些基因序列能自公開數(shù)據(jù)庫得到，以選擇用于靶向不同生物體中的酶的序列。關(guān)于 大腸桿菌和小鼠Trx系統(tǒng)的基因的例子，見下文實施例9。在使用上文所述抑制劑之外，在本發(fā)明的某些實施方案中還可能通過給HCCF鼓 入空氣以維持HCCF中的氧化性氧化還原勢來防止要純化的重組蛋白還原。這是一種非直 接措施，能通過連續(xù)氧化還原型Trx和TrxR來消減葡萄糖、G6P和NADPH。給HCCF罐鼓入空 氣可以例如用約100升每分鐘至約200升每分鐘、諸如例如150升每分鐘的氣流來實施。可 以實施鼓入空氣以達到終點飽和百分比；例如，可以繼續(xù)鼓入空氣直至HCCF約100%的空 氣飽和，或者可以繼續(xù)鼓入空氣直至HCCR約30%的空氣飽和，或直至介于約100%空氣飽 和至約30%空氣飽和之間。期望的抑制性效果所需要的最小溶氧量(d02)還取決于所生成 的抗體或其它重組蛋白。如此，例如，約10%的d02 (或連續(xù)流約lOsccm)會在抗體2H7 (變 體A)的生產(chǎn)期間具有期望的效果，而Apomab可要求更高(約30% )的d02。在本發(fā)明的其它實施方案中，阻斷重組蛋白還原有用的另一種非直接方法是降低 HCCF的pH。此實施方案利用較低pH值時特別慢的硫醇_ 二硫化物交換(Whitesides et al.，1977，supra ；Pleasants et al.，1989，supra)。因此，Trx 系統(tǒng)在 6 以下的 pH 值時的 活性顯著較低，如此能抑制重組蛋白(諸如ocrelizumab)的還原。非直接辦法還能彼此和/或與一種或多種Trx抑制劑的使用組合。在細胞培養(yǎng)過程完成后，優(yōu)選對于CCF在收獲之前進行或?qū)τ贖CCF在收獲后立即 進行，通過使用一種或多種Trx抑制劑和/或應(yīng)用非直接辦法，能抑制(即部分或完全阻 斷)二硫鍵還原。最佳應(yīng)用時間和模式及有效量取決于要純化的蛋白質(zhì)的本質(zhì)、重組宿主 細胞、和所使用的具體生產(chǎn)方法。最佳參數(shù)的確定完全在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的技術(shù)范圍 內(nèi)。例如，在哺乳動物細胞培養(yǎng)過程中，諸如本文實施例中所描述的CH0抗體生產(chǎn)過程，如果使用硫酸銅(CuS04，五水合物的形式或無水形式)作為Trx抑制劑，那么以約5yM 至約lOOiiM、諸如約1011] 至約8011]\1、優(yōu)選約15iiM至約50iiM的濃度范圍添加它以補充 CCF或HCCF。由于有些細胞培養(yǎng)物早就含有銅(例如本文實施例中所使用的CH0細胞培養(yǎng) 物中的約0.04 i!MCUS04)，因此此量是細胞培養(yǎng)物中早就存在的銅(如果有的話)之外的。 可使用任何銅(II)鹽代替CuS04，只要溶解度不成問題。例如，乙酸銅和氯化銅(二者都是 在水中可溶性的)可用于代替CuS04。最小有效濃度還可能取決于所生成的抗體和使用抑 制劑的階段。如此，例如，當(dāng)在裂解前添加硫酸銅時，用于抗體2H7(變體A)的最小有效濃 度是約30iiM，用于Apomab的是約75iiM，而用于抗體變體C (見表2)的是約50 y M。當(dāng)在 CC培養(yǎng)基中添加硫酸銅時，用于抗體2H7 (變體A)的最小有效濃度是約15 u M，用于Apomab 的是約25 u M,而用于抗體變體C的是約20 u M。一種典型的最小CuS04抑制劑濃度是2倍 Trx濃度(或Trx當(dāng)量)。EDTA能在寬濃度范圍中使用，取決于細胞裂解程度、所使用的重組宿主細胞、和生 產(chǎn)過程的其它參數(shù)。例如，當(dāng)使用CH0或其它哺乳動物細胞時，典型的是，能以介于約5mM 至約60mM、諸如約10mM至約50mM、或約20mM至約40mM之間的濃度添加EDTA，取決于細胞 裂解程度。對于較低的細胞裂解程度，較低的EDTA濃度會是足夠的，而對于約75% -100% 的細胞裂解，所需要的EDTA濃度較高，諸如例如約20mM至約40mM。最小有效濃度還可能取 決于所生成的抗體。如此，例如對于抗體2H7 (變體A)，最小有效EDTA濃度是約10mM。典型的是，DHEA在較低的濃度作為Trx抑制劑是有效的，諸如例如在約0. 05mM至 約5mM、優(yōu)選約0. ImM至約2. 5mM的濃度范圍內(nèi)。其它Trx抑制劑，諸如金硫葡糖(ATG)和金硫蘋果酸(ATM)，在y M濃度范圍內(nèi)抑 制二硫鍵還原。如此，例如，ATG或ATM可以以介于約0. ImM至約ImM之間的濃度添加。雖 然最小抑制性濃度隨實際條件而變化，但是對于ATG和ATM，典型的是4倍TrxR濃度左右。注意到，所有抑制劑都能以過量使用，因此，并非總是必須知道所述系統(tǒng)中Trx或 TrxR的量。在一個優(yōu)選的實施方案中，制造過程中所使用的哺乳動物細胞是中國倉鼠卵 巢(CH0)細胞(Urlaub et al.，Proc, Natl. Acad. Sci. USA 77 4216 (1980))。其它哺 乳動物細胞包括但不限于經(jīng)SV40轉(zhuǎn)化的猴腎CV1系(C0S-7，ATCC CRL1651)；人胚腎 系(293或為在懸浮培養(yǎng)中生長而亞克隆的293細胞，Graham etal.，J. Gen Virol. 36 59(1977))；幼倉鼠腎細胞(BHK, ATCC CCL 10)；小鼠塞托利細胞(TM4，Mather, Biol. R印rod. 23 =243-251(1980))；猴腎細胞(CV1，ATCC CCL 70)；非洲綠猴腎細胞(VER0-76， ATCC CRL-1587)；人宮頸癌細胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬腎細胞(MDCK，ATCC CCL 34)；牛鼠 (buffalorat)肝細胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺細胞(ff 138,ATCC CCL 75)；人肝細胞 (Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562，ATCC CCL51) ；TRI 細胞(Mather et al.， Annals N. Y. Acad. Sci. 383 :44_68 (1982)) ；MRC 5 細胞；FS4 細胞；人肝瘤系(Hep G2)；禾口 骨髓瘤或淋巴瘤細胞(例如Y0、J558L、P3和NS0細胞)(見美國專利No. 5，807，715)。用于在本文中生產(chǎn)多肽的一種優(yōu)選細胞是CH0細胞系DP12(CH0 Kldhfr_)。這是 了解最多的CH0細胞系之一，廣泛用于實驗室實踐(參見例如1989年3月15日公布的EP 0，307，247)。另外，知道其它CHO-Kl(dhfr-)細胞系，而且能在本發(fā)明的方法中使用?？梢栽诙喾N培養(yǎng)基中培養(yǎng)用于生成肽、多肽和蛋白質(zhì)的哺乳動物細胞。商品化的培養(yǎng)基，諸如 Ham 氏 F10 (Sigma)、極限必需培養(yǎng)基((MEM)，Sigma)、RPMI-1640 (Sigma)、禾口 Dulbecco氏改良Eagle氏培養(yǎng)基((DMEM，Sigma)，適合于培養(yǎng)細胞。另外，可以使用下列文 獻中記載的任何培養(yǎng)基作為細胞的培養(yǎng)基Ham and Wallace (1979)，Meth. in Enz. 58 44 ； Barnes and Sato (1980)，Anal. Biochem. 102 :255 ；美國專利 No. 4，767，704 ；4，657，866 ； 4，927，762 ；或 4，560，655 ；WO 90/03430 ；W0 87/00195 ；美國專利 No. Re. 30，985 ；或美國專 利No. 5，122，469，通過述及將它們所有的公開內(nèi)容收入本文。任何這些培養(yǎng)基可根據(jù)需要 補充激素和/或其它生長因子(諸如胰島素、運鐵蛋白、或表皮生長因子)、鹽(諸如氯化 鈉、鈣、鎂、和磷酸鹽)、緩沖劑(諸如HEPES)、核苷酸(諸如腺苷和胸苷)、抗生素(諸如 Gentamycin 藥物)、痕量元素(定義為通常以微摩爾范圍的終濃度存在的無機化合物)、 和葡萄糖或等效能源。任何其它必需補充物也可以以本領(lǐng)域技術(shù)人員會知道的適宜濃度包 括在內(nèi)。培養(yǎng)條件(諸如溫度、PH等)就是那些先前為表達而選擇用于細胞的，這對于普 通技術(shù)人員而言是顯而易見的。用于在哺乳動物(諸如CH0)細胞中生成、回收和純化重組抗體的方案可包括下列 步驟可以在攪拌罐生物反應(yīng)器系統(tǒng)中培養(yǎng)細胞，而且采用補料分批培養(yǎng)規(guī)程。在優(yōu)選的補 料分批培養(yǎng)中，首先向培養(yǎng)容器提供哺乳動物細胞和培養(yǎng)基，并在培養(yǎng)期間連續(xù)地或以離 散的增量給培養(yǎng)物補充另外的培養(yǎng)營養(yǎng)物，在培養(yǎng)終止之前有或沒有定期的細胞和/或產(chǎn) 物收獲。補料分批培養(yǎng)可以包括例如半連續(xù)補料分批培養(yǎng)，其中定期清除全部培養(yǎng)物(包 括細胞和培養(yǎng)基)并用新鮮培養(yǎng)基替換。補料分批培養(yǎng)與單批培養(yǎng)的區(qū)別在于在培養(yǎng)過程 開始時向培養(yǎng)容器提供細胞培養(yǎng)的所有成分(包括細胞和所有培養(yǎng)營養(yǎng)物)。補料分批培 養(yǎng)與灌注培養(yǎng)的區(qū)別在于在該過程期間沒有自培養(yǎng)容器清除上清液(在灌注培養(yǎng)中，通過 例如過濾、封裝、錨定至微載體等將細胞限制在培養(yǎng)物中，而且連續(xù)地或間歇地向培養(yǎng)容器 中引入培養(yǎng)基并自培養(yǎng)容器清除培養(yǎng)基)。另外，可以依照對所涵蓋的特定細胞和特定生產(chǎn)計劃合適的任何方案或慣例繁殖 培養(yǎng)物的細胞。因此，可采用單步驟或多步驟培養(yǎng)規(guī)程。在單步驟培養(yǎng)中，將細胞接種入培 養(yǎng)環(huán)境中，并在細胞培養(yǎng)的單一生產(chǎn)階段采用該過程。或者，可使用多階段培養(yǎng)。在多階段 培養(yǎng)中，可以在許多步驟或階段培養(yǎng)細胞。例如，可以在第一步或生長階段培養(yǎng)細胞，其中 將細胞(可能是取自貯藏的)接種入對于促進生長和高存活力合適的培養(yǎng)基。在生長階段 通過向細胞培養(yǎng)物添加新鮮培養(yǎng)基而將細胞維持合適的一段時間。在某些實施方案中，可設(shè)計補料分批或連續(xù)細胞培養(yǎng)條件來增強哺乳動物細胞在 細胞培養(yǎng)生長階段的生長。在生長階段，培養(yǎng)細胞的條件和時間使生長最大化。培養(yǎng)條件 (諸如溫度、PH、溶氧(d02)等等)就是那些用于特定宿主的，而且對于普通技術(shù)人員是顯而 易見的。一般而言，使用酸(例如C02)或堿(例如Na2C03或NaOH)將pH調(diào)節(jié)至介于約6. 5 和7. 5之間的水平。用于培養(yǎng)哺乳動物細胞(諸如CH0細胞)的合適溫度范圍介于約30°C 至38°C之間，而合適的d02介于5-90%空氣飽和之間。在特定階段，可以使用細胞來接種細胞培養(yǎng)的生產(chǎn)階段或步驟?；蛘撸缟纤?， 生產(chǎn)階段或步驟可以是與接種或生長階段或步驟連續(xù)的。細胞培養(yǎng)的生產(chǎn)階段期間的細胞培養(yǎng)環(huán)境通常是受到控制的。如此，如果生產(chǎn) 糖蛋白，那么可以操縱影響哺乳動物細胞的細胞比生產(chǎn)力(cell specificproductivity) 的因素，使得在所得糖蛋白中實現(xiàn)期望的唾液酸含量。在一個優(yōu)選的方面，細胞培養(yǎng)過程
27的生產(chǎn)階段前面是細胞培養(yǎng)的過渡階段，其中涉及用于細胞培養(yǎng)的生產(chǎn)階段的參數(shù)。關(guān) 于此過程的進一步詳情參見美國專利No. 5，721，121及Chaderjian et al.，Biotechnol. ProR.21 (2) :550-3 (2005)，通過述及明確將其完整公開內(nèi)容收入本文。發(fā)酵后，純化蛋白質(zhì)。用于自細胞碎屑純化蛋白質(zhì)的規(guī)程首先取決于蛋白質(zhì)表達 的部位。一些蛋白質(zhì)能自細胞直接分泌入周圍培養(yǎng)基中，其它蛋白質(zhì)是胞內(nèi)制備的。對于 后一類蛋白質(zhì)，純化過程的第一步涉及裂解細胞，這可以通過多種方法來進行，包括機械剪 切、滲壓震擾、或酶處理。此類破壞將細胞的整個內(nèi)含物釋放入勻漿中，而且另外生成由于 尺寸小而難以清除的亞細胞碎片。這些一般通過差速離心或通過過濾來清除。由于蛋白質(zhì) 生成運行的過程中細胞的天然死亡和胞內(nèi)細胞蛋白質(zhì)和成分的釋放，直接分泌的蛋白質(zhì)存 在同樣的問題，只是程度較小。一旦獲得含有感興趣蛋白質(zhì)的澄清溶液，通常使用不同層析步驟的組合來試圖將 它與細胞生成的其它蛋白質(zhì)分開。這些技術(shù)基于蛋白質(zhì)的電荷、疏水性程度、或大小將它們 的混合物分開。這些技術(shù)每一種可利用數(shù)種不同層析樹脂，從而容許為所涉及的具體蛋白 質(zhì)精確剪裁純化方案。這些分離方法每一種的本質(zhì)是能使蛋白質(zhì)以不同速率沿長柱向下移 動，從而實現(xiàn)隨它們沿柱進一步向下移動時增大的物理分離，或者是能使蛋白質(zhì)選擇性粘 附至分離介質(zhì)，然后用不同溶劑差異洗脫。在一些情況中，當(dāng)雜質(zhì)特異性粘附至柱而感興趣 蛋白質(zhì)不粘附至柱時，將期望蛋白質(zhì)與雜質(zhì)分開，也就是說，感興趣的蛋白質(zhì)存在于“流出 液”中。如此，自哺乳動物細胞的細胞培養(yǎng)物純化重組蛋白可包括一個或多個親和(例如蛋 白A)和/或離子交換層析步驟。離子交換層析是常用于純化蛋白質(zhì)的一種層析技術(shù)。在離子交換層析中，溶質(zhì)表 面上帶電荷的部分(patch)受到附著于層析基質(zhì)的相反電荷的吸引，前提是周圍緩沖液的 離子強度低。一般通過提高緩沖液的離子強度(即電導(dǎo)率)以與溶質(zhì)競爭離子交換基質(zhì)帶 電荷的位點來實現(xiàn)洗脫。改變PH，由此改變?nèi)苜|(zhì)的電荷是實現(xiàn)溶質(zhì)洗脫的另一種方式。電 導(dǎo)率或PH的變化可以是逐漸的(梯度洗脫)或逐步的(分步洗脫)。在過去，這些變化是 漸進的；即，PH或電導(dǎo)率以單一方向升高或降低。關(guān)于治療性抗體的工業(yè)性純化的進一步詳情參見例如Fahrner et al.， Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 18 :301_27 (2001)，通過述及明確將其完整公開內(nèi)容收入本文。在哺乳動物細胞之外，可以使用其它真核生物體作為用于表達重組蛋白的細 胞。為了在酵母細胞(諸如常用的面包酵母或啤酒糖酵母/釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))中表達，合適的載體包括基于2微米質(zhì)粒的附加體復(fù)制載體、整合載體、 和酵母人工染色體(YAC)載體。其它適合于重組生產(chǎn)異源蛋白質(zhì)的酵母包括粟酒裂殖 糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)(Beach and Nurse, Nature,290 140 (1981)； EP 139，383published 2May 1985)；克魯維氏酵母屬(Kluyveromyces)宿主(美國專 ^lJ No. 4, 943, 529 ；Fleer et al. , Bio/Technology, 2 968975 (1991))諸如例如乳酸克魯 維氏酵母(K. lactis) (MW98-8C, CBS683, CBS4574 ；Louvencourt et al.，J. Bacteriol.， 737(1983))、脆壁克魯維氏酵母(K. fragilis) (ATCC 12，424)、保加利亞克魯維氏酵 母(K. bulgaricus) (ATCC 16，045)、成克克魯維氏酵母(K. wickeramii) (ATCC24, 178)、 K. waltii(ATCC 56，500)、果蠅克魯維氏酵母(K. drosophilarum) (ATCC 36, 906 ；Van denBerg et al.，Bio/Technology，8 135 (1990))、耐熱克魯維氏酵母(K. thermotolerans)、 和馬克思克魯維氏酵母(K. marxianus)；亞羅酵母屬(yarrowia) (EP 402, 226)；巴 斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris) (EP 183,070 ；Sreekrishna et al.，J.Basic Microbiol. ,28 265278(1988))；假絲酵母屬(Candida)；瑞氏木霉(Trichoderma reesia)(EP 244，234)；粗糙脈孢霉(Neurospora crassa)(Case et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76 52595263 (1979))；許旺酵母屬(Schwanniomyces)，諸如西方許旺酵 母(Schwanniomycesoccidentalis) (EP 394，538published 310ct. 1990)；和絲狀真菌， 諸如例如脈孢菌屬(Neurospora)、青霉屬(Penicillium)、彎頸霉屬(Tolypocladium) (W091/00357published IOJan. 1991)、和曲霉屬(Aspergillus)宿主諸如構(gòu)巢曲霉 (A.nidulans)(Ballance et al. , Biochem. Biophys. Res. Commun. ,112 284289 (1983)； Tilburn et al.，Gene, 26 205221 (1983) ；Yelton et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 14701474(1984))和黑曲霉(A. niger) (Kelly and Hynes, EMBO J.，4 :475479 (1985))。 甲基營業(yè)性酵母在本文中是合適的，包括但不限于能夠在甲醇上生長的酵母，選自下列 屬漢遜氏酵母屬(Hansenula)、假絲酵母屬(Candida)、克勒克氏酵母屬(Kloeckera), 畢赤氏酵母屬(Pichia)、糖酵母屬(Saccharomyces)、球擬酵母屬(Torulopsis)、和紅 酵母屬(Rhodotorula)。此類酵母的例示性的具體物種的列表可見于C. Anthony，The Biochemistry ofMethylotrophs, 269 (1982)。用于所列和其它酵母的表達系統(tǒng)是本領(lǐng)域公 知的和/或是商品化的。為了在昆蟲細胞(諸如Sf9細胞)中表達，合適的載體包括桿狀病毒載體。為了 在植物宿主細胞(特別是雙子葉植物宿主，諸如煙草)中表達，合適的表達載體包括自根癌 土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的Ti質(zhì)粒衍生的載體。本發(fā)明的方法還延伸至原核細胞的培養(yǎng)。適合于表達要通過本發(fā)明的手段 來保護的抗體和其它蛋白質(zhì)的原核細胞包括古細菌和真細菌，諸如革蘭氏陰性或革蘭 氏陽性生物體。有用的細菌的例子包括埃希氏菌屬(Escherichia)(例如大腸埃希氏 菌/大腸桿菌(E. coli))、芽孢桿菌屬(Bacilli)(例如枯草芽孢桿菌(B. subtilis))、 腸桿菌屬(Enterobacteria)、假單胞菌屬(Pseudomonas)物種(例如銅綠假單胞菌 (P. aeruginosa))、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)、粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescans)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、變形菌屬(Proteus)、志賀氏菌屬(Shigella)、 根瘤菌屬(Rhizobia)、透明顫菌屬(Vitreoscilla)、或副球菌屬(Paracoccus)。在一 個實施方案中，使用革蘭氏陰性細胞。大腸桿菌菌株的實例包括菌株W3110(BaChmann， Cellular andMolecular Biology, vol. 2(Washington, D. C. American Society for Microbiology, 1987)，pp. 1190-1219 ；ATCC 保藏物 No. 27，325)及其衍生物，包括具有基 因型 W3110 AfhuA (AtonA) ptr3 lac Iq lacL8 Δ ompT Δ (nmpc-f■印Ε) degP41kanR 的菌株 33D3(美國專利No. 5，639，635)。其它菌株及其衍生物，諸如大腸桿菌294(ATCC 31，446)、 大腸桿菌B、大腸桿菌1776 (ATCC 31，537)和大腸桿菌RV308 (ATCC 31,608)也是合適的。 這些實例只是例示而非限制。本領(lǐng)域知道用于構(gòu)建具有指定基因型的任何上述細菌衍生物 的方法，參見例如Bass et al. ,Proteins,8 =309-314(1990) 通常必需考慮復(fù)制子在細菌 細胞中的可復(fù)制性來選擇適宜的細菌。例如，在使用眾所周知的質(zhì)粒諸如pBR322、pBR325、 PACYC177、或pKN410來提供復(fù)制子時，大腸桿菌、沙雷氏菌屬、或沙門氏菌屬物種可能適合
29于用作宿主。通常，宿主細胞應(yīng)當(dāng)分泌最小量的蛋白水解酶，而且可能希望在細胞培養(yǎng)中摻 入額外的蛋白酶抑制劑。用于自非哺乳動物細胞生成、回收和純化重組蛋白的方法也是本領(lǐng)域公知的。 如果在非哺乳動物細胞中生成多肽，例如微生物，諸如真菌或大腸桿菌，那么會在細胞內(nèi) 部或在周質(zhì)空間中回收多肽(Kipriyanov and Little, Molecular Biotechnology, 12 173201(1999) ； Skerra and Pluckthun, Science, 240 10381040 (1988))。因此，必須通過 提取，諸如細胞裂解，使蛋白質(zhì)自細胞釋放至胞外培養(yǎng)基。此類破壞將細胞的整個內(nèi)含物釋 放入勻漿中，而且另外生成由于尺寸小而難以清除的亞細胞碎片。這些一般通過差速離心 或通過過濾來清除。細胞裂解通常使用機械破碎技術(shù)來實現(xiàn)，諸如勻漿化或頭研磨(headmilling)。 雖然一般有效解放感興趣蛋白質(zhì)，但是此類技術(shù)具有數(shù)項缺點(Engler，Protein Purification Process EnRineerinR, Harrison eds.，3755 (1994))。力口工期間常常發(fā)生 的溫度升高可導(dǎo)致蛋白質(zhì)滅活。此外，所得懸浮液含有廣譜地污染性蛋白質(zhì)、核酸、和多糖。 核酸和多肽提高溶液粘度，可能伴有通過離心、交叉流過濾、或?qū)游鲞M行的后續(xù)加工。這些 污染物與感興趣蛋白質(zhì)的復(fù)雜關(guān)聯(lián)能使純化過程變復(fù)雜，導(dǎo)致不可接受的低產(chǎn)率。自微生 物發(fā)酵液或勻漿純化異源蛋白質(zhì)的改良方法記載于例如美國專利No. 7，169，908，通過述及 明確將其完整公開內(nèi)容收入本文。要強調(diào)，本文所述發(fā)酵、回收和純化方法只用于例示目的。本發(fā)明的方法可以與為 重組蛋白的生成、回收和純化而開發(fā)的任何制造過程組合。2.抗體在一個優(yōu)選的實施方案中，使用本發(fā)明的方法來防止抗體(包括治療性和診斷性 抗體)的鏈間和/或鏈內(nèi)二硫鍵還原。本發(fā)明范圍內(nèi)的抗體包括但不限于抗HER2抗體，包 括曲妥單抗(Trastuzumab) (HERCEPTIN ) (Carter etal. ,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 4285-4289 (1992)，美國專利 No. 5，725，856)；抗 CD20 抗體，諸如嵌合抗 CD20 “C2B8，，， 像美國專利No. 5，736，137 (RITUXAN )中的，2H7抗體的嵌合或人源化變體，像美國專 利 No. 5，721，108B1 中的或托西莫單抗(Tositumomab) (BEXXAR );抗 IL-8 (St John et al.，Chest，103 :932 (1993)及國際公開文本 No. WO 95/23865)；抗 VEGF 抗體，包括人 源化的和/或親和力成熟的抗VEGF抗體，諸如人源化抗VEGF抗體huA4. 6. 1 AVASTIN (Kim et al. , Growth Factors，7 :53_64 (1992)；國際公開文本 No. WO 96/30046 ；及 1998 年10月15日公布的WO 98/45331)；抗PSCA抗體(W001/40309)；抗CD40抗體，包括S2C6 及其人源化變體(W000/75348)；抗 CDlla(美國專利 No. 5，622，700 ；WO 98/23761 ；Steppe et al.，Transplant Intl. 4 3-7(1991)；及 Hourmant et al.，Transplantation 58 377-380(1994))；抗 IgE (Presta et al.，J. Immunol. 151 :2623_2632 (1993)；及國際公開 文本 No. W095/19181)；抗 CD18 (1997 年 4 月 22 日公告的美國專利 No. 5，622，700 ；或 1997 年7月31日公布的WO 97/26912)；抗IgE，包括E25、E26和E27 (1998年2月3日公告的 美國專利No. 5，714，338 ；1992年2月25日公告的美國專利No. 5,091,313 ；1993年3月 4日公布的WO 93/04173 ；或1998年6月30日提交的國際申請No. PCT/US98/13410 ；美 國專利No. 5，714，338)；抗Apo_2受體抗體(1998年11月19日公布的WO 98/51793)；抗 TNF- α 抗體，包括 cA2 (REMICADE )、CDP571 和 MAK-195 (參見 1997 年 9 月 30 日公告的美國專利 No. 5，672，347 ;Lorenz et al. , J. Immunol. 156(4) 1646-1653 (1996)；及 Dhainaut et al. ,Crit. Care Med. 23 (9) :1461_1469 (1995))；抗組織因子(TF) (1994 年 11 月9日授權(quán)的歐洲專利NO.0420937B1)；抗人α4β7整聯(lián)蛋白(1998年2月19日公布的 W098/06248)；抗EGFR (嵌合或人源化225抗體，像1996年12月19日公布的W096/40210 中的)；抗⑶3抗體，諸如0ΚΤ3(1985年5月7日公告的美國專利No. 4，515，893)；抗 CD25 或抗 tac 抗體，諸如 CHI-621 (SIMULECT )和(ZENAPAX )(參見 1997 年 12 月2日公告的美國專利No. 5，693，762)；抗CD4抗體，諸如cM-7412抗體(Choy et al.， Arthritis Rheum 39(1) :52_56 (1996))；抗 CD52 抗體，諸如 CAMPATH-1H(Riechmann et al.，Nature 332 :323_337 (1988))；抗 Fc 受體抗體，諸如針對 Fc γ RI 的 Μ22 抗體，像 Graziano et al.，J. Immunol. 155(10) :4996_5002 (1995)中的；抗癌胚抗原(CEA)抗體， 諸如 hMN-14 (Sharkeyet al.，Cancer Res. 55 (23Suppl) :5935s_5945s (1995))；針對乳房 上皮細胞的抗體，包括 huBrE-3、hu-Mc 3 和 CHL6 (Ceriani et al. , Cancer Res. 55(23) 5852s-5856s(1995)；及 Richman et al.，Cancer Res. 55(23Supp) :5916s_5920s (1995))； 與結(jié)腸癌細胞結(jié)合的抗體，諸如 C242 (Litton et al. ,Eur J. Immunol. 26(1) :1_9(1996))； 抗 CD38 抗體，例如 AT 13/5(Ellis et al. , J. Immunol. 155(2) :925_937 (1995))；抗 CD33 抗體，諸如 Hu M195 (Jurcic et al.，Cancer Res55 (23Suppl) :5908s_5910s(1995))和 CMA-676 或 CDP771 ；抗 CD22 抗體，諸如 LL2 或 LymphoCide (Juweid et al.，Cancer Res 55(23Suppl) :5899s-5907s(1995))；抗 EpCAM 抗體，諸如 17-1A (PANOREX );抗 GpIIb/ IIIa抗體，諸如阿昔單抗(abciximab)或c7E3Fab (REOPRO )；抗RSV抗體，諸如 MEDI-493 (SYNAGIS );抗 CMV 抗體，諸如丨抗 HIV 抗體，諸如 PR0542 ；抗
肝炎抗體，諸如抗H印B抗體OSTAVIR ;抗CA 125抗體OvaRex ；抗獨特型⑶3表位抗體 BEC2 ；抗α νβ 3抗體VITAXIN ;抗人腎細胞癌抗體，諸如ch_G250 ；ING-I ；抗人17-1A 抗體(3622W94)；抗人結(jié)腸直腸腫瘤抗體(A33)；抗人黑素瘤抗體，針對GD3神經(jīng)節(jié)苷酯的 R24 ；抗人鱗狀細胞癌抗體(SF-25抗體)；和抗人白細胞抗原(HLA)抗體，諸如Smart IDlO 和抗HLA DR抗體Oncolym(Lym-I)。本文中的抗體的優(yōu)選的靶抗原是HER2受體、VEGF、IgE、 CD20、CDllaJP CD40。這些抗體許多在臨床實踐中廣泛用于治療各種疾病，包括癌癥。在某些具體的實施方案中，本發(fā)明的方法用于生產(chǎn)下列抗體和重組蛋白?？耿?0抗體利妥昔單抗(Rituximab) (RITUXAN )是針對CD20抗原的遺傳工程嵌合鼠/ 人單克隆抗體。利妥昔單抗就是1998年4月7日公告的美國專利No. 5，736，137 (Anderson et al.)中稱作“C2B8”的抗體。利妥昔單抗指明用于治療患有復(fù)發(fā)性或頑固性低級或濾泡 性CD20陽性B細胞非何杰金氏淋巴瘤的患者。體外作用機制研究證明了利妥昔單抗結(jié)合人 補體并經(jīng)由補體依賴性細胞毒性(⑶C)裂解淋巴樣B細胞系(Reff et al.，Blood 83(2) 435-445(1994))。另外，它在抗體依賴性細胞的細胞毒性(ADCC)測定法中具有顯著活性。 最近，利妥昔單抗顯示出具有抗增殖效果(在氚標(biāo)記的胸苷摻入測定法中)和直接誘導(dǎo)凋 亡，而其它抗CD19和CD20抗體不然(Maloney et al.，Blood 88(10) :637a(1996))。還通過 實驗觀察到利妥昔單抗與化療和毒素之間的協(xié)同作用。具體而言，利妥昔單抗使耐藥性人B細胞淋巴瘤細胞系對多柔比星、CDDP、VP-16、白喉毒素和蓖麻毒蛋白的細胞毒效應(yīng)敏感 (Demidem et al. , CancerChemotherapy&Radiopharmaceuticals 12(3) 177-186(1997))。 體內(nèi)臨床前研究顯示利妥昔單抗自獼猴外周血、淋巴結(jié)、和骨髓消減B細胞，大概經(jīng)由補體 和細胞介導(dǎo)的過程(Reff et al. , Blood 83(2) :435_445 (1994))。關(guān)注CD20抗體的專利和專利公開文本包括美國專利No. 5，776，456，5，736，137， 6，399，061，和 5，843，439，以及美國專利申請 No. US2002/0197255A1, US 2003/0021781A1, US 2003/0082172A1, US2003/0095963A1, US 2003/0147885A1 (Anderson et al.)；美國 專禾Ij No. 6, 455, 043B1 和 W000/09160 (Grillo-Lopez, A.) ；W000/27428 (Grillo-Lopez 和 White) ；W000/27433(Grillo-Lopez 和 Leonard) ；W000/44788(Braslawsky etal.)； W001/10462(Rastetter, W. ) ；W001/10461 (Rastetter 禾口 White) ；W001/10460(White 禾口 Grillo-Lopez)；美國申請 No. US2002/0006404 禾口 W002/04021 (Hanna 禾口 Hariharan)；美國申請 No. US2002/0012665A1 和 W001/74388(Hanna，N.)；美國申 請 No. US 2002/0058029A1(Hanna, N.)；美國申請 No. US 2003/0103971A1(Hariharan 和 Hanna)；美國申請 No. US2002/0009444A1，和 W001/80884(Grillo-Lopez，A.)； W001/97858(White, C.)；美國申請 No. US2002/0128488A1 和 W002/34790(Reff，Μ.)； W002/060955(Braslawsky et al. ) ；W02/096948(Braslawsky et al. ) ；W002/079255(Reff 和 Davies)；美國專利 No. 6，171，586B1，和 W098/56418 (Lam et al.) ；W098/58964 (Raju, S.) ；W099/22764(Raju, S.) ；W099/51642,美國專利 No. 6，194，551B1，美國專利 No. 6，242，195B1,美國專利 No. 6，528，624B1 和美國專利 No. 6，538，124 (Idusogie et al.) ；W000/42072(Presta, L.) ；W000/67796(Curd et al.) ；W001/03734(Grillo-Lopez et al.)；美國申請 No. US2002/0004587A1 和 W001/77342 (Miller 和 Presta)；美國申 it No. US2002/0197256 (Grewal, I.)；美國申請 No. US 2003/0157108A1 (Presta, L.)；美 國專利 No. 6，090，365B1,6, 287，537B1,6, 015，542，5，843，398，和 5，595，721，(Kaminski et al.)；美國專利 No. 5，500，362，5，677，180，5，721，108，和 6，120，767 (Robinson et al.)；美國專利 No. 6，410，391B1 (Raubitschek et al.)；美國專利 No. 6，224，866B1 禾口 W000/20864 (Barbera-Guillem， Ε. ) ；WOO 1/13945 (Barbera-Gui1lem, Ε.)； W000/67795 (Goldenberg)；美國申請 No. US2003/01339301A1 和 W000/74718 (Goldenberg 和 Hansen) ；W000/76542(Golayet al.) ；W001/72333(ffolin 和 Rosenblatt)；美國專 利 No. 6，368，596B1(Ghetieet al.)；美國申請 No. US2002/0041847A1，(Goldenberg,
D.)；美國申請No. US2003/0026801A1(Weiner 和 Hartmann) ；W002/102312(Engleman,
E.)；美國專利申請No. 2003/0068664 (Albitar et al.) ；W003/002607 (Leung, S.)； W003/049694 和 US 2003/0185796A1(ffolin et al.) ；W003/061694(Sing 和 Siegall)； US 2003/0219818A1 (Bohen et al.) ；US 2003/0219433A1 和 WO 03/068821(Hansen et al.)，通過述及明確將每一篇收入本文。還可參見美國專利No. 5，849，898和歐洲專利申請 No. 330, 191 (Seed et al.)；美國專利 No. 4，861，579 和 EP332, 865A2 (Meyer 和 Weiss)；美 國專利 No. 4，861，579 (Meyer et al.)和 W095/03770 (Bhat et al.)。關(guān)注用利妥昔單抗進行的療法的出版物包括Perotta and Abuel “ Response of chronic relapsing ITP of IOyears duration to Rituximab " Abstract#3360 Blood 10(1) (part 1-2) :p. 88B (1998) ；Stashi et al. , “ Rituximab
32chimericanti_CD20monoclonal antibody treatment for adults with chronic idopathicthrombocytopenic purpura ” Blood 98 (4) :952_957 (2001) ；Matthews, R. “ MedicalHeretics “ New Scientist(7Apr.，2001) ；Leandro et al.， “ Clinical outcome in 22patients with rheumatoid arthritis treated with B lymphocyte depletion 〃 AnnRheum Dis 61 :833_888 (2002) ；Leandro et al.， 〃 Lymphocyte depletion inrheumatoid arthritis :early evidence for safety, efficacy and dose response. Arthritis&Rheumatism44(9) :S370(2001) ；Leandro et al. , 〃 An open study of Blymphocyte depletion in systemic lupus erythematosus “， Arthritis&Rheumatism46 (1) :2673_2677(2002) ；Edwards and Cambridge 〃 Sustained improvement inrheumatoid arthritis following a protocol designed to deplete B lymphocytes “ Rheumatology 40:205-211(2001) ；Edwards et al. ， “ B-Iymphocyte depletiontherapy in rheumatoid arthritis and other autoimmune disorders ” Biochem. Soc. Trans. 30 (4) :824_828 (2002) ；Edwards et al. ， “ Efficacy and safety of Rituximab,a B-cell targeted chimeric monoclonal antibody :A randomized, ρlacebocontrolied trial in patients with rheumatoid arthritis. Arthritis&Rheumatism46 (9) :S197(2002) ；Levine and Pestronk “ IgM antibody-related polyneuropathies :B_cell depletion chemotherapy using RituximabNeurology52 1701~1704 (1999) ；DeVita et al.，" Efficacy of selective B cell blockade in the treatment ofrheumatoid arthritis" Arthritis&Rheumatism 46 2029-2033(2002) ；Hidashida etal. ，" Treatment of DMARD-Refractory rheumatoid arthritis with rituximab. “ Presented at the Annual Scientific Meeting of the American College ofRheumatology ；October 24—29 ；New Orleans，La. 2002 ；Tuscano， J. “ Successfultreatment of Infliximab-refractory rheumatoid arthritis with rituximab“ Presentedat the Annual Scientific Meeting of the American College of Rheumatology ；October 24-29 ；New Orleans，La.2002。Sarwal et al.，N. Eng. J. Med. 349(2) 125-138 (July 10，2003)報告了通過DNA微陣列序型分析鑒定的急性腎同 種異基因移植物排斥中的分子異質(zhì)性。 在各種實施方案中，本發(fā)明提供了包含人源化2H7抗CD20抗體的藥物組合物。在 具體的實施方案中，所述人源化2H7抗體是表2中所列舉的抗體。表2 人源化抗CD20抗體及其變體
2H7變體VLVh完整L鏈完整H鏈
SEQ ID N0.SEQ ID NO.SEQ ID N0.SEQ ID N0,
A1267
B1268
C34910
D34911
F34912
G34913
H35914
I12615表2的抗體變體A、B和I每一個都包含輕鏈可變序列DIQMTQSPSSLSASV⑶RVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTD FTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO 1)；禾口重鏈可變序列(VH)EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFT ISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO :2)。表2的抗體變體C、D、F和G每一個都包含輕鏈可變序列DIQMTQSPSSLSASV⑶RVTITCRASSSVSYLHWYQQKPGKAPKPLIYAPSMLASGVPSRFSGSGSGTD FTLTISSLQPEDFATYYCQQWAFNPPTFGQGTKVEIKR(SEQ ID N0:3)，和重鏈可變序列(VH)EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRFT ISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSASYWYFDVWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO 4)。表2的抗體變體2包含SEQ ID NO :3 (見上文)的輕鏈可變序列(\)和重鏈可變 序列(Vh)EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRFT ISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSYRYWYFDVWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO 5)。表2的抗體變體A、B和I每一個都包含全長輕鏈序列DIQMTQSPSSLSASV⑶RVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGT DFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAK VQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO 6)。表2的變體A包含全長重鏈序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSY匪HWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRF TISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT AALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGK(SEQ ID NO :7)。表2的變體B包含全長重鏈序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSY匪HWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRF TISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT AALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGK(SEQ ID NO :8)。表2的變體I包含全長重鏈序列
34
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSY匪HWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRF TISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT AALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNAALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGK(SEQ ID NO :15)。表2的抗體變體C、D、F、G和H每一個都包含全長輕鏈序列DIQMTQSPSSLSASV⑶RVTITCRASSSVSYLHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGT DFTLTISSLQPEDFATYYCQQWAFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAK VQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO 9)。表2的變體C包含全長重鏈序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSY匪HWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRF TISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSASYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT AALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGK (SEQ ID NO 10)。表2的變體D包含全長重鏈序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSY匪HWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRF TISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSASYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT AALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPAPIEATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGK(SEQ ID NO :11)。表2的變體F包含全長重鏈序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSY匪HWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRF TISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSASYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT AALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNAALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGK(SEQ ID NO :12)。表2的變體G包含全長重鏈序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSY匪HWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRF TISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSASYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK
VEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT
KPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNAALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVS
LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHWHYTQK
SLSLSPGK(SEQ ID NO :13)。 表2的變體H包含全長重鏈序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSY匪HWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRF TISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSYRYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT AALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNAALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGK(SEQ ID NO 14)。在某些實施方案中，本發(fā)明的人源化2H7抗體進一步包含IgG Fc中的氨基酸改 變，且展現(xiàn)出比具有野生型IgG Fc的抗體升高至少60倍、至少70倍、至少80倍、更優(yōu)選至 少100倍、優(yōu)選至少125倍、甚至更優(yōu)選至少150倍至約170倍的對人FcRn的結(jié)合親和力。IgG中的N-糖基化位點位于Ch2域中的Asn297。本發(fā)明的人源化2H7抗體組合 物包括任何前述具有Fc區(qū)的人源化2H7抗體的組合物，其中組合物中約80-100% (優(yōu)選 約90-99% )的抗體包含缺少附著至糖蛋白Fc區(qū)的巖藻糖的成熟核心碳水化合物結(jié)構(gòu)。此 類組合物在本文中證明展示出乎意料的對Fc γ RIIIA (Fl58)的結(jié)合的改善，在與人IgG相 互作用方面Fc γ RIIIA(F158)不如Fc γ RIIIA(V158)有效。在正常的、健康的非洲裔美國 人和高加索人種中，F(xiàn)c γ RIIIA(F158)比 Fc γ RIIIA(V158)更常見。參見 Lehrnbecher et al.，Blood94 :4220(1999)。歷史上，在中國倉鼠卵巢細胞(CHO)(最常用的工業(yè)宿主之一) 中生成的抗體中，群體中約2-6%是未巖藻糖基化的。然而，YB2/0和Lecl3能生成78-98% 未巖藻糖基化的抗體。Shinkawa et al.，J Bio. Chem. 278 (5)，3466-347 (2003)報告了在具 有較低FUT8活性的YB2/0和Lecl3細胞中生成的抗體在體外顯示顯著升高的ADCC活性。 具有降低的巖藻糖含量的抗體的生成也記載于例如Li et al. , (GlycoFi) "Optimization of humanized IgGs inglycoengineered Pichia pastoris" in Nature Biology online publication 22Jan.2006 ；Niwa R. et al.，Cancer Res. 64(6) 2127-2133(2004) ；US 2003/0157108 (Presta) ；US 6,602,684 和 US 2003/0175884 (Glycart Biotechnology)； US2004/0093621, US 2004/0110704，US 2004/0132140 (都是 Kyowa Hakko Kogyo 的)。雙特異性人源化2H7抗體涵蓋如下的抗體，其中抗體的一條臂至少具有本發(fā)明人 源化2H7抗體H和/或L鏈的抗原結(jié)合區(qū)，且另一條臂具有針對第二抗原的V區(qū)結(jié)合特異 性。在具體的實施方案中，所述第二抗原選自下組⑶3、⑶64、⑶32A、⑶16、NKG2D或其它 NK活化性配體。抗HER2 抗體鼠HER2抗體4D5的一種重組人源化型式(huMAb4D5_8，rhuMAb HER2，曲妥單抗 (trastuzumab)或HERCEPTIN ;美國專利No. 5，821，337)臨床史在接受過廣泛在先抗 癌療法的、患有過表達HER2的轉(zhuǎn)移性乳腺癌的患者中有活性(Baselga et al. , J. Clin.1998年9月25日收到食品和藥品管理局(FDA) 的銷售批件，用于治療患有轉(zhuǎn)移性乳腺癌的、其腫瘤過表達HER2蛋白的患者。在2006年11 月，F(xiàn)DA批準(zhǔn)了 Here印tin作為含有多柔比星、環(huán)磷酰胺和帕利他塞的治療方案的一部分， 作為患有HER2陽性、結(jié)節(jié)陽性乳腺癌的患者的輔助治療。在一個實施方案中，所述抗HER2抗體包含下列\(zhòng)和Vh域序列人源化2C4型式 574 抗體 Vl (SEQ ID NO 16)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGT DFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIK,和人源化2C4 型式 574 抗體 Vh (SEQ ID NO 17)EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFT LSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSS。在另一個實施方案中，所述抗HER2抗體包含圖21和圖22分別所示曲妥單抗的 Vl (SEQ ID NO 18)和 Vh (SEQ ID NO 19)域序列。具有各種特性的其它HER2抗體記載于Tagliabue et al.，Int. Τ. Cancer47 933-937(1991) ；McKenzie et al. , Oncogene 4 543-548(1989) ；Maier et al. , Cancer Res.51 5361-5369(1991) ；Bacus et al.，Molecular Carcinogenesis3 :350_362(1990)； Stancovski et al. , PNAS(USA)88 8691~8695(1991) ；Bacuset al. , Cancer Research 52:2580-2589(1992) ；Xu et al. , Int. Τ. Cancer 53:401-408(1993) ；W094/00136 ； Kasprzyk et al. , Cancer Research 52 :2771_2776 (1992) ；Hancock et al. , Cancer Res. 51 4575-4580(1991) ；Shawver et al.，Cancer Res. 54 :1367-1373(1994) ；Arteaga et al. , Cancer Res. 54 :3758_3765 (1994) ；Harwerth et al. , J.Biol. Chem. 267 15160-15167(1992)；美國專利 No. 5，783，186 ；及 Klapper et al.，Oncogene 14: 2099-2109(1997)?？筕EGF 抗體抗VEGF抗體可以包含例如下列序列在一個實施方案中，所述抗VEGF抗體包含下列\(zhòng)序列(SEQ ID NO 20) DIQMTQTTSS LSASLGDRVI ISCSASQDIS NYLNWYQQKP DGTVKVLIYFTSSLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEP EDIATYYCQQ YSTVPffTFGGGTKLEIKR ；禾口下歹丨JVh 序歹丨J (SEQ ID NO 21)EIQLVQSGPE LKQPGETVRI SCKASGYTFT NYGMNffVKQAPGKGLKffMGff INTYTGEPTY AADFKRRFTF SLETSASTAYLQISNLKNDD TATYFCAKYP HYYGSSHWYF DVffGAGTTVT VSS。在另一個實施方案中，所述抗VEGF抗體包含下列\(zhòng)序列(SEQ IDNO 22)DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCSASQDIS NYLNffYQQKPGKAPKVLIYF TSSLHSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQYSTVPffTFGQ GTKVEIKR ；禾口下歹丨JVh 序歹丨J (SEQ ID NO 23)EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYTFT NYGMNffVRQAPGKGLEffVGff INTYTGEPTY AADFKRRFTF SLDTSKSTAYLQMNSLRAED TAVYYCAKYP HYYGSSHWYF DVffGQGTLVT VSS。在第三個實施方案中，所述抗VEGF抗體包含下列\(zhòng)序列(SEQ IDNO 24)DIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCSASQDIS NYLNffYQQKPGKAPKVLIYF TSSLHSGVPS
37RFSGSGSGTD FTLTISSLQPEDFATYYCQQ YSTVPffTFGQ GTKVEIKR ；禾口下歹丨JVh 序歹丨J (SEQ ID NO 25)EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYDFT HYGMNffVRQAPGKGLEffVGff INTYTGEPTY AADFKRRFTF SLDTSKSTAYLQMNSLRAED TAVYYCAKYP YYYGTSHWYF DVWGQGTLVTVSS?？笴Dlla 抗體人源化抗CDlla 抗體 efalizumab 或Raptiva (美國專利 No. 6，037, 454)于 2003 年10月27日收到食品和藥品管理局(Food and Drug Administration)的銷售批件，用于 治療銀屑病。一個實施方案提供了抗人⑶Ila抗體，其包含下文HuMHM24的\和Vh序列Vl (SEQ ID NO 26)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKTISKYLAWYQQKPGKAPKLLIYSGSTLQSGVPSRFSGSGSGT DFTLTISSLQPEDFATYYCQQHNEYPLTFGQGTKVEIKR ；禾口Vh (SEQ ID NO 27)EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGHWMNWVRQAPGKGLEWVGMIHPSDSETRYNQKFKDRFT ISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGIYFYGTTYFDYWGQGTLVTVSS。抗人⑶Ila抗體可包含SEQ ID NO 27的Vh和HuMHM24的全長L鏈，后者具有序 列DIQMTQSPSSLSASV⑶RVTITCRASKTISKYLAWYQQKPGKAPKLLIYSGSTLQSGVPSRFSGSGSG TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHNEYPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREA KVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO :28)，或上文L鏈及具有下列序列的H鏈EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGHWMNWVRQAPGKGLEWVGMIHPSDSETRYNQKFKDRF TISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGIYFYGTTYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTA ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSL TCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS LSLSPGK(SEQ ID NO:29)。針對DR5受體的抗體(抗DR5抗體)也可以依照本發(fā)明來生成。此類抗DR5抗體 具體包括PCT公開文本No. WO 2006/083971中披露的所有抗體變體，諸如稱作Apomab 1. 1、 2. 1、3· 1、4· 1、5· 1、5· 2、5· 3、6· 1、6· 2、6· 3、7· 1、7· 2、7· 3、8· 1、8· 3、9. Ul. 2、2· 2、3· 2、4· 2、 5. 2,6. 2,7. 2,8. 2,9. 2,1. 3,2. 2,3. 3,4. 3,5. 3,6. 3,7. 3,8. 3,9. 3 和 25. 3 的抗 DR5 抗體，尤 其是Apomab8. 3和Apomab 7. 3，優(yōu)選Apomab 7.3。通過述及明確收錄WO 2006/083971的 完整內(nèi)容。3.其它含有二硫化物的蛋白質(zhì)在抗體之外，本發(fā)明的方法可用于制造包括二硫鍵的其它多肽。此類多肽的代表 性例子包括但不限于下列治療性蛋白質(zhì)組織纖溶酶原激活劑(t-PA)，諸如人組織纖溶酶 原激活劑(htPA，阿替普酶(alt印lase)，ACTIVASE )，一種用于治療心肌梗死的溶血 栓藥；TNKase ，一種用于單次推注施用的、具有延長的半衰期和纖維蛋白特異性的ht_PA變體；用于治療兒童和成人中的生長激素缺乏的重組人生長激素(rhGH，somatropin, NUTROPIN ,PROTROPIN )；和用于治療囊性纖維化病(CF)的重組人脫氧核糖核 酸酶I (DNA酶I)。含有二硫化物的生物學(xué)重要蛋白質(zhì)的例子包括生長激素，包括人生長激素和牛生 長激素；生長激素釋放因子；甲狀旁腺素；促甲狀腺激素；脂蛋白；α -1-抗胰蛋白酶；胰島 素A鏈；胰島素B鏈；胰島素原；促卵泡激素；降鈣素；黃體生成素；高血糖素；凝血因子，諸 如因子VIIIC、因子IX、組織因子、和von Willebrands因子；抗凝血因子，諸如蛋白C ；心房 鈉尿因子；肺表面活性劑；纖溶酶原激活劑，諸如尿激酶或人尿或組織型纖溶酶原激活劑 (t-PA)；鈴蟾肽；凝血酶；造血生長因子；腫瘤壞死因子- α和- β ；腦啡肽酶；RANTES (在 激活后受到調(diào)節(jié)，正常情況下由T細胞表達和分泌)；人巨噬細胞炎癥蛋白(MIP-1-α)； 血清清蛋白，諸如人血清清蛋白；Muellerian抑制性物質(zhì)；松弛素A鏈；松弛素B鏈；松 弛素原；小鼠促性腺素相關(guān)肽；微生物蛋白質(zhì)，諸如β -內(nèi)酰胺酶；DNA酶；IgE ；細胞毒性 T-淋巴細胞相關(guān)抗原(CTLA)，諸如CTLA-4;抑制素；激活素；血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)； 激素的或生長因子的受體；蛋白A或D ；類風(fēng)濕因子；神經(jīng)營養(yǎng)性因子，諸如骨衍生神經(jīng)營 養(yǎng)性因子(BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)因子-3、-4、-5、或-6(ΝΤ-3、ΝΤ-4、ΝΤ-5、或ΝΤ-6)、或神經(jīng)生 長因子，諸如NGF-β ；血小板衍生生長因子(PDGF)；成纖維細胞生長因子，諸如aFGF和 bFGF;表皮生長因子(EGF)；轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)，諸如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β 1、 TGF-β 2、TGF-β 3、TGF-β 4、或 TGF-β 5 ；胰島素樣生長因子-I 和-II(IGF-I 和 IGF-II)； des(l-3)-IGF-I(腦IGF-I)、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白；CD蛋白，諸如CD3、CD4、CD8、 ⑶19、⑶20、⑶34、和⑶40 ；紅細胞生成素；骨誘導(dǎo)因子；免疫毒素；骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)； 干擾素，諸如干擾素-α、- β、和-γ ；集落刺激因子(CSF)，例如M-CSF、GM-CSFjP G-CSF ； 白介素(IL)，例如IL-I至IL-10 ；超氧化物歧化酶；T細胞受體；表面膜蛋白；衰變加速因 子；病毒抗原，諸如例如AIDS包膜的一部分；運輸?shù)鞍?；歸巢受體；地址素；調(diào)節(jié)蛋白；整聯(lián) 蛋白，諸如 CDlla、CDllb、CDllc、CD18、ICAM、VLA-4 和 VCAM ；腫瘤相關(guān)抗原，諸如 HER2、HER3 或HER4受體；及任何上文所列多肽的片段。4.用于重組生產(chǎn)抗體的一般方法本文中的抗體和其它重組蛋白可通過重組DNA技術(shù)的公知技術(shù)來生產(chǎn)。如此，在 上文具體鑒定的抗體之外，熟練從業(yè)人員能生成針對感興趣抗原的抗體，例如使用下文所 述技術(shù)?？乖x擇和制備本文中的抗體針對感興趣抗原。優(yōu)選的是，所述抗原是生物學(xué)重要多肽，而且給患 有疾病或病癥的哺乳動物施用所述抗體能在該哺乳動物中產(chǎn)生治療性好處。然而，也涵蓋 針對非多肽抗原(諸如腫瘤相關(guān)糖脂抗原；參見美國專利5，091，178)的抗體。若抗原是多 肽，則它可以是跨膜分子(例如受體)或配體(諸如生長因子)。例示性的抗原包括下文 章節(jié)(3)中描述的那些蛋白質(zhì)。本發(fā)明所涵蓋的抗體的例示性分子靶物包括CD蛋白，諸如 CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD22、CD34、CD40 ；ErbB 受體家族的成員，諸如 EGF 受體、HER2、 HER3 或 HER4 受體；細胞粘附分子，諸如 LFA-l、Macl、pl50、95、VLA_4、ICAM_1、VCAM 和 α ν/ β 3整聯(lián)蛋白，包括其α或β亞基(例如抗⑶11a、抗⑶18或抗⑶lib抗體)；生長因子， 諸如VEGF ；IgE ；血型抗原；flk2/flt3受體；肥胖(OB)受體；mpl受體；CTLA-4 ；蛋白C，或
39本文所述任何其它抗原。上文所列抗體所針對的抗原明確包括在本發(fā)明范圍內(nèi)?？扇苄钥乖蚱淦?任選偶聯(lián)有其它分子的)可作為免疫原用于生成抗體。對 于跨膜分子，諸如受體，它們的片段(例如受體的胞外結(jié)構(gòu)域)可用作免疫原?；蛘?，表達 跨膜分子的細胞可用作免疫原。此類細胞可衍生自天然來源(例如癌細胞系)，或者可以是 經(jīng)重組技術(shù)轉(zhuǎn)化而表達跨膜分子的細胞。對于制備抗體有用的其它抗原及其形式對于本領(lǐng)域技術(shù)人員會是顯而易見的。多克隆抗體多克隆抗體優(yōu)選在動物中生成，通過多次皮下(sc)或腹膜內(nèi)(ip)注射相關(guān)抗原 和佐劑。使用雙功能或衍生化試劑，例如馬來酰亞氨基苯甲酰基磺基琥珀酰亞胺酯(通過 半胱氨酸殘基偶聯(lián))、N-羥基琥珀酰亞胺(通過賴氨酸殘基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2或 R1N = C = NR(其中R和R1是不同的烴基)，將抗原與在待免疫物種中有免疫原性的蛋白質(zhì) 偶聯(lián)可能是有用的，例如匙孔i成血藍蛋白、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑 制劑。通過將例如100 μ g或5 μ g蛋白質(zhì)或偶聯(lián)物(分別用于兔或小鼠)與3倍體積的 弗氏完全佐劑混和并將該溶液皮內(nèi)注射于多個部位，將動物針對抗原、免疫原性偶聯(lián)物或 衍生物進行免疫。1個月后，通過多個部位的皮下注射，用弗氏完全佐劑中初始量1/5-1/10 的抗原或偶聯(lián)物對動物進行加強免疫。7-14天后，采集動物的血液并測定血清的抗體滴度。 對動物進行加強免疫直到滴度達到平臺(Plateau)。優(yōu)選的是，將動物用相同抗原但與不同 蛋白質(zhì)和/或通過不同交聯(lián)劑偶聯(lián)得到的偶聯(lián)物進行加強免疫。偶聯(lián)物還可在重組細胞培 養(yǎng)中作為蛋白質(zhì)融合物來制備。同樣，適當(dāng)使用凝聚劑諸如明礬來增強免疫應(yīng)答。單克隆抗體單克隆抗體可以使用最初由Kohler等，Nature, 256 =495(1975)記載的雜交瘤方 法來生成，或者可以通過重組DNA方法(美國專利No. 4，816，567)來生成。在雜交瘤方法中，如上所述免疫小鼠或其它適宜的宿主動物，諸如倉鼠或獼猴， 以引發(fā)生成或能夠生成如下抗體的淋巴細胞，所述抗體將特異性結(jié)合用于免疫的蛋白質(zhì)。 或者，可以在體外免疫淋巴細胞。然后使用合適的融合劑諸如聚乙二醇將淋巴細胞與骨 MiMMMM^, UMf^^^iMMM (Goding, Monoclonal Antibodies =Principles and Practice, pp. 59-103, AcademicPress,1986)。將如此制備的雜交瘤細胞在合適的培養(yǎng)基中接種和培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基優(yōu)選含有抑 制未融合的親本骨髓瘤細胞生長或存活的一種或多種物質(zhì)。例如，若親本骨髓瘤細胞缺少 次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)，則用于雜交瘤的培養(yǎng)基典型的將含有 次黃嘌呤、氨基喋呤和胸苷(HAT培養(yǎng)基)，這些物質(zhì)阻止HGPRT缺陷細胞生長。優(yōu)選的骨髓瘤細胞是那些高效融合、支持所選擇的抗體生產(chǎn)細胞穩(wěn)定且高水平 的生成抗體、且對培養(yǎng)基諸如HAT培養(yǎng)基敏感的骨髓瘤細胞。其中，優(yōu)選的骨髓瘤細胞 系是鼠骨髓瘤系，諸如那些自可從索爾克研究所細胞分配中心(Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA)獲得的 M0PC-21 和 MPC-11 小鼠腫 瘤和可從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanType Culture Collection, Rockville, Maryland USA)獲得的SP_2或X63_Ag8_653衍生的。人骨髓瘤和小鼠-人異源骨髓瘤細 胞系也有用于生成人單克隆抗體的記載(Kozbor，J. Immunol.，133 =3001(1984) ；Brodeur等，MonoclonalAntibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63, Marcel Dekker, Inc.，New York,1987)?？蓪﹄s交瘤細胞正在其中生長的培養(yǎng)基測定針對抗原的單克隆抗體的生成。優(yōu)選 的是，通過免疫沉淀或通過體外結(jié)合測定法，諸如放射性免疫測定法(RIA)或酶聯(lián)免疫吸 附測定法(ELISA)，測定由雜交瘤細胞生成的單克隆抗體的結(jié)合特異性。在鑒定出生成具有期望特異性、親和力和/或活性的抗體的雜交瘤細胞后，所述 克隆就可通過有限稀釋規(guī)程進行亞克隆，并通過標(biāo)準(zhǔn)方法進行培養(yǎng)(Goding，Monoclonal Antibodies :Principles and Practice, pp. 59-103, AcademicPress, 1986)。適于這一目 的的培養(yǎng)基包括例如D-MEM或RPMI-1640培養(yǎng)基。另外，雜交瘤細胞可在動物中作為腹水 瘤進行體內(nèi)培養(yǎng)?？赏ㄟ^常規(guī)免疫球蛋白純化規(guī)程，諸如例如蛋白A-S印harose、羥磷灰石層析、凝 膠電泳、透析、或親和層析，將由亞克隆分泌的單克隆抗體與培養(yǎng)基、腹水或血清適當(dāng)分開。 優(yōu)選的是，使用本文所述蛋白A層析規(guī)程。編碼單克隆抗體的DNA易于使用常規(guī)規(guī)程分離和測序(例如通過使用能夠特異性 結(jié)合編碼單克隆抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)。雜交瘤細胞是此類DNA的優(yōu)選 來源。一旦分離，就可將DNA置于表達載體中，然后將該表達載體轉(zhuǎn)染到不另外生成免疫球 蛋白蛋白質(zhì)的宿主細胞中，諸如大腸桿菌細胞、猿猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或 骨髓瘤細胞，以在重組宿主細胞中獲得單克隆抗體的合成。也可以修飾DNA，例如通過用人重鏈和輕鏈恒定域的編碼序列替代同源鼠序列 (美國專利 No. 4，816，567 ；Morrison 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 6851 (1984))，或通 過將免疫球蛋白編碼序列與非免疫球蛋白多肽的整個或部分編碼序列共價連接。典型地，用此類非免疫球蛋白多肽替代抗體的恒定域，或者用它們替代抗體的一 個抗原結(jié)合位點的可變域，以產(chǎn)生嵌合二價抗體，它包含對一種抗原具有特異性的一個抗 原結(jié)合位點和對不同抗原具有特異性的另一個抗原結(jié)合位點。在又一個實施方案中，可從使用McCafferty et al.，Nature，348 :552_554 (1990) 所記載的技術(shù)構(gòu)建的抗體噬菌體文庫中分離單克隆抗體。Clackson etal. , Nature, 352 624-628(1991)和 Marks et al.，J. Mol. Biol.，222 :581_597 (1991)分別記載了使用噬菌 體文庫分離鼠和人抗體。后續(xù)出版物記載了通過鏈改組(Marks et al. ,Bio/Technology, 10 :779-783(1992))，以及組合感染和體內(nèi)重組作為構(gòu)建非常大的噬菌體文庫的策略 (ffaterhouse et al. ,Nuc. Acids. Res. ,21 2265-2266 (I993))，生成高親和力(nM 范圍)的 人抗體。如此，這些技術(shù)是用于分離單克隆抗體的傳統(tǒng)雜交瘤技術(shù)的可行替代方法。人源化和人抗體人源化抗體具有一個或多個導(dǎo)入其中的來自非人來源的氨基酸殘基。這些非人氨 基酸殘基常常稱作“輸入”殘基，它們通常取自“輸入”可變域。人源化可基本上遵循Winter 及其同事的方法進行(Jones 等，Nature，321 :522_525 (1986) ；Riechmann 等，Nature，332 323-327(1988) ；Verhoeyen 等，Science，239 :1534_1536 (1988))，即用嚙齒類 CDR 或 CDR 序 列替代人抗體的相應(yīng)序列。因此，此類“人源化”抗體是嵌合抗體(美國專利4，816，567)， 其中本質(zhì)上少于整個人可變域用來自非人物種的相應(yīng)序列替代。在實踐中，人源化抗體通 常是其中一些CDR殘基和可能的一些FR殘基用來自嚙齒類抗體中類似位點的殘基替代的人抗體。用于制備人源化抗體的人可變域的選擇，包括輕鏈和重鏈，對于降低抗原性非常 重要。依照所謂的“最適”(best-fit)法，用嚙齒類抗體的可變域序列對已知的人可變域 序列的整個文庫進行篩選。然后選擇與嚙齒類序列最接近的人序列作為人源化抗體的人 FR(Sims等，J. Immunol.，151 :2296 (1993))。另一種方法使用由特定輕鏈或重鏈亞組的所 有人抗體的共有序列衍生的特定框架。同一框架可用于數(shù)種不同的人源化抗體(Carter 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 4285 (1992) ；Presta 等，J. Immunol.，151 2623 (1993))。更為重要的是，抗體在人源化后保持對抗原的高親和力及其它有利的生物學(xué)特 性。為了實現(xiàn)這一目的，依照一種優(yōu)選的方法，通過使用親本和人源化序列的三維模型分析 親本序列和各種概念性人源化產(chǎn)物的方法來制備人源化抗體。三維免疫球蛋白模型通常是 可獲得的，且為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉。還可獲得圖解和顯示所選候選免疫球蛋白序列的 可能三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)的計算機程序。檢查這些顯示圖像能夠分析殘基在候選免疫球蛋白序列 行使功能中的可能作用，即分析影響候選免疫球蛋白結(jié)合其抗原的能力的殘基。這樣，可從 受體和輸入序列中選出FR殘基并進行組合，從而獲得期望抗體特征，諸如對靶抗原的親和 力提高。通常，CDR殘基直接且最實質(zhì)性地涉及對抗原結(jié)合的影響?；蛘?，現(xiàn)在有可能生成在缺乏內(nèi)源免疫球蛋白生成的情況下能夠在免疫時生成人 抗體完整全集的轉(zhuǎn)基因動物(例如小鼠)。例如，已經(jīng)描述了嵌合和種系突變小鼠中抗體重 鏈連接區(qū)(JH)基因的純合刪除導(dǎo)致內(nèi)源抗體生成的完全抑制。在此類種系突變小鼠中轉(zhuǎn) 移大量人種系免疫球蛋白基因?qū)?dǎo)致在抗原攻擊時生成人抗體。參見例如Jakobovits等， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 2551 (1993) Jakobovits 等，Nature, 362 255-258 (1993)； Bruggermann 等，Yearin Immunol. ,7 33 (1993)；及 Duchosal 等，Nature, 355 258 (1992)。 還可從噬菌體展示庫衍生人抗體(Hoogenboom等，J. Mol. Biol.，227 =381 (1991) ；Marks等， J. Mol. Biol.，222 :581_597 (1991) ；Vaughan 等，Nature Biotech.，14 309 (1996))?？贵w片段已經(jīng)開發(fā)了用于生成抗體片段的多種技術(shù)。傳統(tǒng)上，通過蛋白水解消化完整抗 體來衍生這些片段(參見例如 Morimoto 等，Journal of Biochemical andBiophysical Methods 24:107—117(1992)；及 Brennan 等，Science，229 :81 (1985))。然而，現(xiàn)在可直接 由重組宿主細胞生成這些片段。例如，可以從上文討論的噬菌體抗體庫分離抗體片段?；?者，可直接從大腸桿菌回收Fab' -SH片段并化學(xué)偶聯(lián)以形成F(ab' )2片段(Carter等， Bio/Technology 10 163-167 (1992))。依照另一種方法，可直接從重組宿主細胞培養(yǎng)物分 離F(ab' )2片段。用于生成抗體片段的其它技術(shù)對熟練從業(yè)人員將是顯而易見的。在其 它實施方案中，所選抗體是單鏈Fv片段(scFv)(參見WO 93/16185)。多特異性抗體多特異性抗體具有對至少兩種不同抗原的結(jié)合特異性。盡管此類分子通常只結(jié) 合兩種抗原(即雙特異性抗體，BsAb)，但是此表述在用于本文時涵蓋具有額外特異性的抗 體，諸如三特異性抗體。用于構(gòu)建雙特異性抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。全長雙特異性抗體的傳統(tǒng)生產(chǎn) 基于兩對免疫球蛋白重鏈-輕鏈的共表達，其中兩種鏈具有不同的特異性(Millstein等， Nature, 305 :537_539 (1983))。由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機分配，這些雜交瘤(四源雜交瘤(quadroma))生成10種不同抗體分子的潛在混合物，其中只有一種具有正確的雙特 異性結(jié)構(gòu)。通常通過親和層析步驟進行的正確分子的純化相當(dāng)麻煩且產(chǎn)物產(chǎn)量低。類似的 規(guī)程披露于 W093/08829 及 Traunecker 等，EMBO J.，10 :3655_3659 (1991)。依照W096/27011中記載的另一種方法，可改造一對抗體分子間的界面，以將從重 組細胞培養(yǎng)物回收的異二聚體的百分比最大化。優(yōu)選的界面包含抗體恒定域的至少部分 CH3結(jié)構(gòu)域。在該方法中，將第一抗體分子界面的一個或多個小氨基酸側(cè)鏈用較大側(cè)鏈(例 如酪氨酸或色氨酸)替換。通過將大氨基酸側(cè)鏈用較小氨基酸側(cè)鏈(例如丙氨酸或蘇氨 酸)替換，在第二抗體分子的界面上產(chǎn)生與大側(cè)鏈相同或相似大小的補償性“空腔”。這提 供了較之其它不想要的終產(chǎn)物諸如同二聚體提高異二聚體產(chǎn)量的機制。雙特異性抗體包括交聯(lián)的或“異源偶聯(lián)的”抗體。例如，可以將異源偶聯(lián)物中 的一種抗體與親合素偶聯(lián)，而將另一種抗體與生物素偶聯(lián)。此類抗體已經(jīng)建議用于例 如將免疫系統(tǒng)細胞靶向不想要的細胞(美國專利No. 4，676，980)和用于治療HIV感染 (TO 91/00360, WO 92/200373，及EP 03089)。異源偶聯(lián)抗體可以使用任何方便的交聯(lián)方 法來制備。合適的交聯(lián)劑連同許多交聯(lián)技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的，而且披露于美國專利 No. 4，676，980。文獻中還記載了由抗體片段生成雙特異性抗體的技術(shù)。例如，可使用化學(xué)連接來 制備雙特異性抗體。Brerman等，Science，229 81(1985)記載了通過蛋白水解切割完整抗 體以生成F(ab' )2片段的規(guī)程。將這些片段在存在二硫醇絡(luò)合劑亞砷酸鈉的情況下還原， 以穩(wěn)定鄰近的二硫醇并防止分子間二硫鍵的形成。然后將產(chǎn)生的Fab'片段轉(zhuǎn)變?yōu)榱虼?基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后將Fab' -TNB衍生物之一通過巰基乙胺的還原重新恢復(fù)成 Fab'-硫醇，并與等摩爾量的另一種Fab' -TNB衍生物混合，以形成雙特異性抗體。產(chǎn)生 的雙特異性抗體可用作酶的選擇性固定化試劑。最近的進展推動從大腸桿菌直接回收Fab' -SH片段，該片段可以化學(xué)偶聯(lián)以形 成雙特異性抗體。Shalaby等，J. Exp. Med.，175 :217_225 (1992)記載了完全人源化的雙特 異性抗體F(ab' )2分子的生成。由大腸桿菌分開分泌每種Fab'片段，并在體外進行定向 化學(xué)偶聯(lián)以形成雙特異性抗體。如此形成的雙特異性抗體能夠結(jié)合過表達ErbB2受體的細 胞和正常人T細胞，以及觸發(fā)人細胞毒性淋巴細胞針對人乳腺腫瘤靶物的溶解活性。還記載了從重組細胞培養(yǎng)物直接生成和分離雙特異性抗體片段的多種技 術(shù)。例如，已使用亮氨酸拉鏈生成雙特異性抗體。Kostelny等，J. Immunol.，148 (5) 1547-1553(1992)。將來自Fos和Jim蛋白的亮氨酸拉鏈肽通過基因融合與兩種不同抗體 的Fab‘部分連接?？贵w同二聚體在鉸鏈區(qū)還原以形成單體，然后重新氧化以形成抗體異二 聚體。這種方法也可用于生成抗體同二聚體。Hollinger等，Proc. Natl. Acad. Sci.USA，90 6444-6448(1993)記載的“雙抗體”技術(shù)提供了構(gòu)建雙特異性抗體片段的替代機制。該片段 包含通過接頭相連的重鏈可變域(VH)和輕鏈可變域(VL)，所述接頭太短使得同一條鏈上 的兩個結(jié)構(gòu)域之間不能配對。因此，迫使一個片段上的VH和VL結(jié)構(gòu)域與另一個片段上的互 補VL和VH結(jié)構(gòu)域配對，由此形成兩個抗原結(jié)合位點。還報道了通過使用單鏈Fv(sFv) 二 聚體構(gòu)建雙特異性抗體片段的另一種策略。參見Gruber等，J. Immunol.，152 =5368(1994)。 或者，所述抗體可以是 Zapata et al.，ProteinEng. 8 (10) 1057-1062 (1995)中所記載的 “線性抗體”。簡言之，這些抗體包含一對串聯(lián)的Fd區(qū)段(Vh-ChI-Vh-ChI),其形成一對抗原結(jié)合區(qū)。線性抗體可以是雙特異性的，或者是單特異性的。設(shè)想了具有超過兩個效價的抗體。例如，可制備三特異性抗體。Tutt等， J. Immunol.，147 60(1991)。免疫粘附素最簡單且最直接的免疫粘附素設(shè)計將粘附素的結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如受體的胞外結(jié) 構(gòu)域(ECD))與免疫球蛋白重鏈的鉸鏈和Fc區(qū)組合在一起。通常，在制備本發(fā)明的免疫粘 附素時，將編碼粘附素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核酸融合在編碼免疫球蛋白恒定域序列N-末端的核 酸的C-末端，然而N-末端融化也是可能的。通常，在此類融合物中，所編碼的嵌合多肽將至少保留有功能活性的免疫球蛋白 重鏈恒定區(qū)鉸鏈、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。還可以對恒定域Fc部分的C-末端進行融合，或者緊 挨著重鏈ChI或輕鏈對應(yīng)區(qū)的N-末端進行。進行融合的精確位點不是至關(guān)重要的；具體位 點是眾所周知的，而且可以進行選擇以優(yōu)化免疫粘附素的生物學(xué)活性、分泌或結(jié)合特征。在一個優(yōu)選的實施方案中，將粘附素序列融合在免疫球蛋白G1 (IgG1)Fc域的N-末 端。有可能將整個重鏈恒定區(qū)與粘附素序列融合。然而，更優(yōu)選的是，在融合中使用在鉸鏈 區(qū)中緊挨著在化學(xué)上定義IgG Fc的木瓜蛋白酶切割位點(即殘基216，以重鏈恒定區(qū)的第 一個殘基為114)或其它免疫球蛋白的類似位點上游開始的序列。在一個特別優(yōu)選的實施 方案中，將粘附素氨基酸序列與IgG重鏈的(a)鉸鏈區(qū)、Ch2和Ch3或(b)CHl、鉸鏈、CH2和 Ch3結(jié)構(gòu)域融合。對于雙特異性免疫粘附素，將免疫粘附素裝配成多聚體，特別是異二聚體或異四 聚體。一般而言，這些裝配好的免疫球蛋白將具有已知的單元結(jié)構(gòu)。基本的四鏈結(jié)構(gòu)單元 就是IgG、IgD和IgE存在的形式。四鏈單元在更高分子量的免疫球蛋白中重復(fù)；IgM—般 作為通過二硫鍵保持在一起的四鏈基本單元的五聚體存在。IgA球蛋白及偶爾的IgG球蛋 白也可以以多聚體的形式存在于血清中。在多聚體的情況中，各個四鏈單元可以是相同的 或不同的。下面示意性的列舉了在本文范圍內(nèi)的各種例示性的裝配好的免疫粘附素ACl-ACl ；ACh- (ACh, ACl-ACh, ACl-VhCh,或 VlCl-ACh)；ACl-ACh- (ACl-ACh, ACl-VhCh, VlCl-ACh,或 VlCl-VhCh)；ACl-VhCh-(ACh，ACl-VhCh,或 VlCl-ACh)；VlCl-ACh-(ACl-VhCh,或 VlCl-ACh)；和(A-Y)n-(VlCl-VhCh)2,其中各個A代表相同或不同的粘附素氨基酸序列；
Vl是免疫球蛋白輕鏈可變域；Vh是免疫球蛋白重鏈可變域；Cl是免疫球蛋白輕鏈恒定域；Ch是免疫球蛋白重鏈恒定域；η是大于1的整數(shù)；Y代表共價交聯(lián)劑的殘基。為簡短起見，上述結(jié)構(gòu)只顯示了關(guān)鍵特征；它們沒有標(biāo)示免疫球蛋白的連接(J)或其它結(jié)構(gòu)域，也沒有顯示二硫鍵。然而，若結(jié)合活性需要此類結(jié)構(gòu)域，則它們應(yīng)當(dāng)構(gòu)建成 存在于它們在免疫球蛋白分子中所占據(jù)的通常位置?；蛘撸梢詫⒄掣剿匦蛄胁迦朊庖咔虻鞍字劓溑c輕鏈序列之間，從而得到包含嵌 合重鏈的免疫球蛋白。在該實施方案中，將粘附素序列融合在免疫球蛋白每個臂中的免疫 球蛋白重鏈的3’端，或是在鉸鏈與Ch2結(jié)構(gòu)域之間，或是在Ch2與Ch3結(jié)構(gòu)域之間。類似的 構(gòu)建物已報道于 Hoogenboom et al.，Mol. Immunol. 28 1027-1037 (1991)。盡管本發(fā)明的免疫粘附素中不需要存在免疫球蛋白輕鏈，然而可以存在免疫球蛋 白輕鏈，或是與粘附素-免疫球蛋白重鏈融合多肽共價結(jié)合，或是直接與粘附素融合。在前 一種情況中，通常將編碼免疫球蛋白輕鏈的DNA與編碼粘附素-免疫球蛋白重鏈融合蛋白 的DNA共表達。在分泌后，雜合重鏈與輕鏈將共價結(jié)合以提供包含兩對二硫鍵相連的免疫 球蛋白重鏈-輕鏈的免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)。適于制備此類結(jié)構(gòu)的方法披露于例如1989年3 月28日公告的美國專利No. 4，816，567。最方便的是通過將編碼粘附素部分的cDNA序列與免疫球蛋白cDNA序列以符合 讀碼框的形式融合來構(gòu)建免疫粘附素。然而，也可以使用與基因組免疫球蛋白片段的融合 (參見例如 Aruffo et al.，Cell 61 1303-1313 (1990) ；Stamenkovic et al.，Cell 66: 1133-1144(1991))。后一種類型的融合要求存在Ig調(diào)控序列以供表達。編碼IgG重鏈恒 定區(qū)的cDNA可以根據(jù)已發(fā)表的序列自衍生自脾或外周血淋巴細胞的cDNA文庫分離，通過 雜交或者通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)。將編碼免疫粘附素的“粘附素”和免疫球蛋白 部分的cDNA串聯(lián)插入在所選宿主細胞中指導(dǎo)高效表達的質(zhì)粒載體。提供下文實施例僅僅為了例示目的，而非意圖以任何方式限制本發(fā)明的范圍。在此完整收入本說明書中引用的所有專利和文獻作為參考。
實施例除非另有說明，實施例中提及的商品化試劑依照制造商的說明書使用。下文實 施例和整篇說明書中以ATCC編號所鑒別的那些細胞的來源是美國典型培養(yǎng)物保藏中心 (American Type Culture Collection, Manassas, Virginia)。實施例1 對材料和方法的描述實施例2-8中使用了下列材料和方法。材料實驗實施例中所描述的實驗中所使用的材料和裝置包括不銹鋼管形瓶(微型 罐，F(xiàn)low Components, Dublin, CA ；矮的(50cc)和高的(55cc))；透析管(Spectra/Por, 6-8000MWC0，產(chǎn)品目錄 #132645) ；0·22μπι 濾器(Millipore Millipak Gamma Gold，產(chǎn)品 目錄#MPGL04GH2)；磷酸鹽緩沖鹽水(PBS，EMD，產(chǎn)品目錄#6506)；乙二胺四乙酸(EDTA， Sigma，產(chǎn)品目錄#E4884) ； α -煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH，Calbiochem，產(chǎn)品目錄 #481973)；脫氫表雄酮(DHEA，TCI，產(chǎn)品目錄#D0044)；硫酸銅(Sigma，產(chǎn)品目錄#C8027)； 葡萄糖-6-磷酸(G6P，Calbiochem，產(chǎn)品目錄#346764)；金硫葡糖(ATG, USP，產(chǎn)品目錄 #1045508)；金硫蘋果酸(ATM，Alfa Aesar，產(chǎn)品目錄#39740)；還原型谷胱甘肽(GSH， J. T. Baker，產(chǎn)品目錄 #M770-01) ；monobromobimane (mBB，F(xiàn)luka，產(chǎn)品目錄 #69898)；組氨酸 (J.T.Baker，產(chǎn)品目錄 #2080-05)；硫酸鈉(J. T. Baker，產(chǎn)品目錄 #3897-05) ；Trx (Sigma,產(chǎn)品目錄#T8690) ；TrxR(Sigma，產(chǎn)品目錄#T9698)。所有化學(xué)藥品和試劑以收到的形式 使用，沒有進一步純化。配制 EDTA (250mM，ρΗ 7. 5)、CuSO4(IOmM)、ATG (30mM)、ATM(30mM)、 NADPH(75mM)、G6P (300mM)的儲備溶液，供微型罐時程研究中使用。細胞培養(yǎng)液(CCF)的牛成為了生成供各種抗原研究用的ocrelizumab CCF,利用與先前所述方法 (Chaderjian et al. ,2005)類似的代表性小規(guī)模發(fā)酵過程。簡言之，使用配有斜片葉輪的 3升玻璃攪拌罐Applikon 生物反應(yīng)器及ocreliZUmab培養(yǎng)基成分進行接種體-訓(xùn)練和生 產(chǎn)培養(yǎng)(inoculum-train and production cultures)。給生物反應(yīng)器配備校準(zhǔn)溶氧(DO)、 PH和溫度探針。使用數(shù)字控制單元來控制D0、pH、溫度、和攪動速率至ocrelizumab制造過 程的規(guī)定參數(shù)。接種體-訓(xùn)練和生產(chǎn)培養(yǎng)二者的工作體積都是1.5L。在NOVA Bioprofile 血液氣體分析儀上分析每日樣品，以確保PH和溶氧的在線值的準(zhǔn)確度以及監(jiān)測培養(yǎng)物中 的葡萄糖、乳酸鹽、銨、谷氨酰胺、谷氨酸和鈉濃度。還采集每日樣品來監(jiān)測細胞生長、存活 力、和滴度。細胞生長是使用ViCell通過可存活細胞計數(shù)以及在壓緊細胞體積(PCV)基礎(chǔ) 上這兩種方式測量的。培養(yǎng)物存活力是在ViCell儀器上通過錐蟲藍排除測定的。通過基 于HPLC的方法分析上清液樣品以測量ocrelizumab滴度值。已收獲的細胞培養(yǎng)液(HCCF)制備使用Microfluidics HC-8000勻漿器通過高壓勻漿化來實現(xiàn)CCF的完全裂解。將 該儀器的壓力調(diào)節(jié)器設(shè)置成4，000-8, OOOpsi，并使CCF穿過勻漿器以在單次通過后獲得完 全細胞裂解(膜破裂)。一旦穿過系統(tǒng)清除了水，就收集CCF勻漿。將勻漿轉(zhuǎn)移至離心瓶， 并在Sorval RC-3B轉(zhuǎn)子離心機中于20°C以4，500rpm離心30分鐘。倒出離心液，然后深部 過濾，接著使用蠕動泵及硅管0. 22 μ m無菌過濾，用以自勻漿化的CCF (100 %細胞裂解)生 成最終的HCCF。或者，將來自發(fā)酵罐的CCF直接離心，沒有任何勻漿化，然后用無菌0. 2 μ m 濾器過濾離心液以生成HCCF。微型罐操作在操作所有微型罐時使用層流通風(fēng)櫥，而且HCCF溫育實驗中使用的所有材料或 是高壓滅菌或是用70%異丙醇漂洗以使細菌污染最小化。乳酸脫氫酶測定法關(guān)于乳酸脫氫酶測定法，參見Babson&Babson(1973)及 Legrand et al.，(1992)， 通過述及將其收入本文。透析實驗實施透析實驗以確定引起ocrelizumab還原的成分是小分子還是大分子(即酶)。 將純化和配制好的ocrelizumab (30. 2mg/mL)的3mL樣品針對IL磷酸鹽緩沖鹽水(PBS， IOmM, ρΗ 7. 2)透析24小時，并在8小時后更換PBS。然后使用280nm吸光度將ocrelizumab 樣品的濃度調(diào)節(jié)至lmg/mL。使用前將等分試樣保存于-70°C。將透析管在0. 05%疊氮化 物溶液中水合過夜，并在使用前用無菌水漂洗。融化將來自3L發(fā)酵罐的CCF勻漿化獲得的 HCCF，并使用蠕動泵經(jīng)由0. 22μπι Millipak濾器過濾。給六個矮微型罐各裝30mL HCCF。 給每個微型罐添加密封透析管中的500 μ L ocrelizumab樣品。密封微型罐，并加載入以 35rpm于環(huán)境溫度運轉(zhuǎn)的臺式混合儀(Barnstead Lab-Line MAX Q4000)中。對于每個時間 點，自混合儀中取出一個微型罐，并采集HCCF(在微型罐中)和ocrelizumab樣品(在透析袋中)的等分試樣，保存于_70°C，直至用游離硫醇測定法和Bioanalyzer測定法(下文所 述)分析。對抑制劑測試小規(guī)樽體外系統(tǒng)中的還原給高微型罐裝27mL HCCF。根據(jù)實驗設(shè)計，添加各種試劑(NADPH、G6P、G6PD抑制 劑或TrxR)至期望濃度，并用PBS(10mM，pH 7.2)使微型罐中的終體積達到30mL。密封微 型罐，并加載入以35rpm于環(huán)境溫度運轉(zhuǎn)的臺式混合儀。在采樣的每個時間點，將微型罐 的外部用70% IPA滅菌，并在層流通風(fēng)櫥中打開以取出等分試樣。然后將微型罐重新密 封并再次加載入臺式混合儀中。將所有等分試樣保存于-70°C，直至用游離硫醇測定法和 Bioanalyzer測定法(下文所述)分析。體外Trx/Trx還原酶研究將商品化TrxR(大鼠肝)溶液(4 μ M)用水稀釋以產(chǎn)生2. 86 μ M溶液。將凍干的 Trx (人)用PBS(10mM，pH 7.2)重建，產(chǎn)生500 μ M溶液。在水中配制20mM NADPH溶液及 IOmM ATG 禾口 ATM 溶液。在黑色聚丙烯1. 5mL微量離心管中，溫和混合437 μ L PBS、25 μ LNADPHU6 μ L配 制好的ocrelizumab溶液(30. 2mg/mL)和5 μ L Trx。通過添加17. 5 μ L TrxR來啟動反應(yīng)。 將反應(yīng)于室溫溫育24小時。在每個采樣時間點取出20 μ L等分試樣，并保存于-70°C，直至 通過Bioanalyzer測定法(見下文)分析。實施對照以確定當(dāng)通過用等體積的PBS替代反 應(yīng)混合物中的Trx和/或TrxR來省略酶時酶途徑是否有活性。使用上文所述相同反應(yīng)條件及添加5 μ L ATG或ATM證明了對Trx系統(tǒng)的抑制。 為了證明Cu2+對Trx系統(tǒng)的抑制，向反應(yīng)混合物添加2. 5μ L CuSO4(IOmM)，使用相同的酶但 不同的緩沖液(IOmM組氨酸、IOmM Na2S04、137mM NaCl、2. 5mM KCl, pH 7.0)以防止不溶性 Cu3(PO4)2 形成。游離硫醇測定法在PBS (10mM，pH 6.0 士0.05)中生成了 GSH的標(biāo)準(zhǔn)曲線。自IlOmM GSH溶液，經(jīng)由 連續(xù)稀釋配制了 0、5. 5、11、22、44、55、110和550μΜ濃度的標(biāo)準(zhǔn)品。自mBB的乙腈儲備溶 液(10mM，保存于-20°C )，在 PBS(10mM，pH 10. 0士0.05)中配制了 mBB 的 100 μ M 溶液，并
避光保存。在黑色平底96孔板中，向每個孔中分配100 μ L mBB。對于標(biāo)準(zhǔn)曲線，添加10 μ L 標(biāo)準(zhǔn)GSH溶液，產(chǎn)生8.0士0.2的工作pH。對于樣品，向孔中添加10 μ L樣品。所有孔都 以一式三份準(zhǔn)備。將板在黑暗中于室溫溫育1小時，然后使用熒光讀板儀(Molecular Devices SpectraMax Gemini XS)讀數(shù)，使用390nm的激發(fā)波長和490nm的發(fā)射波長。使 用三個標(biāo)準(zhǔn)孔的平均結(jié)果對GSH濃度繪圖，生成了線性標(biāo)準(zhǔn)曲線。使用三個樣品孔的平均 值自標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程計算樣品中的游離硫醇水平。Bioanalyzer Illfefe使用Agilent 2100BiOanalyZer獲得了毛細管電泳測量。樣品制備如Agilent Protein 230測定法方案(手冊部分號G2938-90052)中所述進行，有輕微變化。制備前，用 水將HCCF樣品1 4稀釋并將蛋白A樣品稀釋至1.0g/L。對于變性步驟的HCCF樣品，在 所提供的2 μ L變性溶液之外還添加24 μ L 50mM碘乙酰胺(IAM) ,0.5% SDS溶液。對于蛋 白A樣品，使用不含IAM的0. 5% SDS和2 μ L變性溶液。使用Agilent 2100Expert軟件生成了數(shù)字凝膠樣圖像。用于HCCF保持時間研究的儲備溶液在實驗室規(guī)模HCCF保持時間研究中使用了三種不同的儲備溶液(1)使用EDTA 二鈉二水合物(Mallinckrodt，產(chǎn)品目錄#7727-06或Sigma,產(chǎn)品目錄#E_5134)和EDTA 四鈉二水合物(Sigma，產(chǎn)品目錄#E-6511)配制的250mMEDTA儲備溶液(pH 7.4) ； (2)硫 酸銅五水合物(CuS04，Sigma，產(chǎn)品目錄#08027)的50mM儲備溶液；和(3) IM乙酸溶液 (Mallinckrodt，產(chǎn)品目錄 #V193)。抑制劑添加和細胞培養(yǎng)液(CCF)摻合勻漿化前將250mM EDTA或50mM CuSO4的儲備溶液添加至CCF以評估防止抗體二 硫化物還原的終濃度范圍。一旦自勻漿化的CCF生成最終的HCCF，就將這些溶液與自未勻 漿化的CCF生成的HCCF (也含有EDTA或CuSO4)混合以稀釋和降低細胞裂解總水平至100 % 最大值以下。或者，將IM乙酸的儲備溶液添加至最終的摻合HCCF溶液(勻漿化的CCF和 未勻漿化的CCF)以降低溶液的pH以防止抗體二硫化物還原。在50mL 316L不銹鋼管形瓶中裝大約30_50mL每種HCCF溶液(含有EDTA、CuS04、 乙酸、或不添加而作為對照)。用夾子將管形瓶密封，不給溶液充氣或不攪動。將管形瓶保 存于室溫(18-22°C)。在預(yù)定的時間點，取出溶液并在實驗室規(guī)模蛋白A親和樹脂上純化。用其它氧化劑(諸如例如胱氨酸和氧化型谷胱甘肽)能獲得相似的結(jié)果。鼓入空氣為了評估給自勻漿化CCF生成的HCCF鼓入空氣以防止抗體二硫化物還原，利用3L 玻璃或15L不銹鋼容器。將大約1-5L HCCF通過0.22 μ m無菌過濾入每個經(jīng)過滅菌的容器 中。實驗條件維持于18-22°C和50(15L發(fā)酵罐)或275rpm(3L發(fā)酵罐)攪動，有或無通過 添加二氧化碳進行的PH控制?；蚴墙o溶液鼓入空氣以提高溶氧水平至空氣飽和，或是鼓入 氮氣(對照)以清除溶液中的任何溶氧。給每個容器的氣流是可變的，取決于是使用恒定 充氣速率還是維持最小溶氧水平。在預(yù)定的時間點，自兩種容器取出25-50mL樣品，并在實 驗室規(guī)模蛋白A親和樹脂上純化，之后分析。蛋白A加工可以使用特異性親和層析樹脂來捕捉和純化已收獲的細胞培養(yǎng)液樣品中的抗體。 選擇蛋白A樹脂(Millipore，Prosep-vA High Capacity)作為用于抗體純化的親和樹脂。 將樹脂填充到床高14cm、內(nèi)徑0. 66cm(最終柱體積4. 8mL)的玻璃柱(Omniflt )中。使用 AKTA Explorer 100 層析系統(tǒng)(GE Healthcare)來實施層析。將樹脂暴露于介于350-560cm/hr之間的線性流速的緩沖液和HCCF。用25mM Tris、25mM NaCl、5mM EDTA, pH 7. 1平衡樹脂。對于每次純化，給樹脂加載5_15mg抗體每 mL樹脂。使用固定化蛋白A HPLC柱(AppliedBiosystems, P0R0S A)測定HCCF中的抗體 濃度。加載后，用 25mM Tris、25mM NaCl、5mM EDTA、0. 5M TMAC, pH 7.1 清洗樹脂，然后使 用0. IM乙酸，pH 2. 9洗脫抗體。洗脫合并基于柱后聯(lián)機測量的280nm UV吸光度。使用IM HEPES鈉將純化后的洗脫合并液調(diào)節(jié)pH至pH 5.0-5.5。用0. IM磷酸再生樹脂后，使用相 同或相似填充的樹脂進行后續(xù)對其它HCCF溶液的純化。使用280nm UV光譜測定術(shù)測量純化后的蛋白A合并液的抗體濃度。通過 Bioanalyzer測定法分析純化后的蛋白A洗脫合并液，用以對150kDa分子量的完整抗體的百分比定量。實施例2:透析實驗設(shè)計并實施透析實驗來確定ocrelizumab的還原是由還原性小分子還是大分子 (例如酶)引起的。在此透析實驗中，將純化后的完整ocrelizumab放置在分子量截留 (MWCO) 7000的透析袋中，并將透析袋在不銹鋼微型罐中含ocrelizumab的HCCF中溫育。 如圖1和2所示，袋內(nèi)的ocrelizumab在溫育期后沒有被還原(圖1)，而HCCF中袋外的 ocrelizumab在溫育開始后不久就被顯著還原了。這是通過完整ocrelizumab (約150kDa) 的損失和ocrelizumab片段(各種重鏈和輕鏈組合)的形成證明的(圖2)。對來自被還原 制造運行的蛋白A洗脫合并液中ocrelizumab的質(zhì)譜術(shù)分析指明那些觀察到的片段是通過 只還原鏈間二硫鍵而形成的。游離硫醇測量顯示在溫育開始時透析袋內(nèi)不存在游離硫醇；然而，溫育開始后不 到5小時，透析袋內(nèi)外的游離硫醇水平變得可比，指明HCCF中的小分子成分在透析袋內(nèi)外 是完全平衡的(圖3)。由于只在MWCO 7000Da的透析袋外觀察到還原，但在透析袋內(nèi)沒有 觀察到還原，因此還原性分子的分子量必然大于7000Da。如此，酶促反應(yīng)導(dǎo)致ocrelizumab 的還原。實施例3 在體外 Trx/TrxR 對 Ocrelizumab (rhuMAb 2H7，變體 A)的還原通過與Trx、TrxRjP NADPH —起溫育完整ocrelizumab，對Trx系統(tǒng)測試它在體 外還原ocrelizumab的能力。Bioanalyzer結(jié)果指明在體外ocrelizumab被Trx系統(tǒng)還原 (圖5)。此體外系統(tǒng)中的還原速率表現(xiàn)為比HCCF慢(例如與圖2所示還原比較時)。這可 能是由于體外反應(yīng)中所使用的酶(Trx和Trx-R)的較低濃度和/或緩沖系統(tǒng)，因為Trx系 統(tǒng)的反應(yīng)速率取決于酶濃度和緩沖系統(tǒng)。實施例4 =Trx系統(tǒng)的抑制劑(i)硫酸銅對重組抗體還原的抑制已知硫酸銅有能力提供氧化還原勢，而且已經(jīng)在細胞培養(yǎng)過程中用于使重組抗體 分子中的游離硫醇水平最小化(即使未配對半胱氨酸最小化)(Chaderjian et al.，2005， supra)。對硫酸銅測試在體外抑制Trx系統(tǒng)和后續(xù)ocrelizumab還原的功效。在此體外 還原實驗中，將緩沖系統(tǒng)由PBS變成硫酸組氨酸以避免不溶性Cu3(PO4)2形成。圖8顯示了 ocrelizumab易于被硫酸組氨酸緩沖液中的Trx系統(tǒng)還原(甚至比PBS緩沖液中的快)。向 此反應(yīng)添加CuSO4明顯抑制ocrelizumab還原(圖9)。(ii)ATG和ATM對HCCF中重組抗體還原的抑制對TrxR的兩種商品化特異性抑制劑，即金硫葡糖(ATG)和金硫蘋果酸(ATM)，測試 它們在體外抑制Trx系統(tǒng)和ocrelizumab還原的能力。ATG和ATM都能在上文所述測定法 中有效抑制ocrelizumab還原(見圖6和7)。以ImM濃度向與圖5說明所述相同的反應(yīng)混 合物添加金硫葡糖或金硫蘋果酸有效抑制ocrelizumab還原，如來自Bioanalyzer分析的 數(shù)字凝膠樣圖像所示。如果Trx系統(tǒng)在HCCF中有活性并還原ocrelizumab，如導(dǎo)致被還原的抗體分子的 制造運行中或?qū)嶒炇乙?guī)模實驗中觀察到的，那么這兩種金化合物(ATG和ATM)都應(yīng)能夠抑 制HCCF中的ocrelizumab還原。圖10顯示了 ocrelizumab在來自勻漿化CCT (其是自3L 發(fā)酵罐生成的)的HCCF中在溫育一段時間后易于還原。然而，當(dāng)向HCCF添加ImM ATG或ATM時，ocreIizumab還原事件受到完全抑制(圖11和12)。這些結(jié)果證明了 Trx系統(tǒng)在 HCCF中有活性且直接造成ocreIizumab還原。實施例5 用于Trx系統(tǒng)活性的NADPH的來源及G6P和葡萄糖在還原機制中的作 用Trx系統(tǒng)對二硫化物的還原需要來自NADPH的還原性當(dāng)量(圖4)。為所有還原性 生物合成反應(yīng)提供NADPH的主要細胞代謝途徑是磷酸戊糖途徑。為了使抗體還原事件發(fā) 生，此途徑中的酶必須在HCCF中仍有活性以保持Trx系統(tǒng)有活性。最低限度，磷酸戊糖途 徑中的第一步(由G6PD催化)必須有活性以還原NADP+成NADPH同時轉(zhuǎn)變G6P成6-磷酸 葡萄糖酸內(nèi)酯。另外，G6P最有可能是HCCF中由己糖激酶活性自葡萄糖和腺苷-5’ -三磷 酸(ATP)生成的。圖4總結(jié)了 ocrelizumab還原的整個機制。HCCF中的還原活性表現(xiàn)出在一些情況中是瞬時的，而且可以在某些貯藏條件下或 在多輪凍融后隨時間受到抑制。完全喪失還原活性的HCCF提供了機會來探索NADPH和G6P 在Trx系統(tǒng)還原ocrelizumab中的作用。將來自大規(guī)模制造運行(“β ”運行)的HCCF進行數(shù)輪凍融并在設(shè)計用于測量還 原的實驗中使用；沒有觀察到ocrelizumab還原(圖13)，盡管它有能力引起抗體還原，像 先前在新鮮融化的來自此同一發(fā)酵的HCCF中看到的。以5mM的濃度向此非還原性HCCF添 加NADPH，則還原事件恢復(fù)了(圖14)。此外，Trx系統(tǒng)在不再發(fā)生還原且在提供輔因子的情 況中能夠還原蛋白質(zhì)和/或抗體的HCCF中仍是完整的且有活性的。另外，還原活性隨時間 丟失，因為NADPH源被消減(大概是由于所有競爭NADPH的還原性反應(yīng)對NADPH的氧化)， 而不是因為Trx系統(tǒng)被降解或滅活。這得到了另一項實驗的證實。向經(jīng)過反復(fù)凍融的來自β運行的HCCF添加IOmM G6P。此G6P添加再活化Trx系統(tǒng)，其隨后在HCCF溫育實驗中還原ocrelizumab (圖15)。這 證明了 HCCF中ocrelizumab的還原是由Trx系統(tǒng)和G6PD 二者的活性引起的。另外，G6PD 在經(jīng)過反復(fù)凍融的β運行HCCF中仍有活性；此經(jīng)過反復(fù)凍融的HCCF β運行中還原活性的 損失表現(xiàn)為是由于G6P的消減，如此消除NADP+向NADPH的轉(zhuǎn)變。在我們的研究中，我們觀察到EDTA在HCCF溫育實驗中能有效抑制ocrelizumab 還原。如圖16所示，將來自12，000L規(guī)模ocrelizumab制造運行(沒有反復(fù)凍融且沒有 丟失還原活性)的HCCF于環(huán)境溫度溫育超過19小時后，ocrelizumab被還原。然而，當(dāng)向 12kL HCCF添加20mM EDTA并在分開的不銹鋼微型罐中保持時，還原被完全抑制(圖17)。 在糖酵解的第一步中，己糖激酶催化磷酸基團從Mg2+-ATP轉(zhuǎn)移至葡萄糖，即需要Mg2+與 ATP絡(luò)合的反應(yīng)(Hammes&Kochavi, 1962a&1962b, supra)。由于EDTA是金屬離子螯合劑，尤 其對于Mg2+而言，因此它會是己糖激酶的有效抑制劑。過量的EDTA能有效阻斷還原的觀 察結(jié)果指明ocrelizumab還原的機制中涉及己糖激酶(即提供G6P)。不限于此或任何其它 理論，EDTA通過消除己糖激酶活性并由此降低G6PD可利用的G6P水平及隨后Trx系統(tǒng)可 利用的NADPH水平來阻斷ocrelizumab還原。雖然EDTA每一次都有效阻斷新鮮HCCF中的ocrelizumab還原，但是它沒有能力 防止喪失Trx系統(tǒng)活性、然后通過添加G6P而再活化的β運行HCCF中的ocerlizumab還 原。例如，在向完全喪失還原活性的β運行HCCF添加5mMG6P和20mM EDTA(終濃度)的 HCCF溫育實驗中觀察到ocrelizumab還原(圖18)。然而，在不添加G6P和EDTA的對照溫育實驗中沒有看到還原。不限于此或任何其它理論，以此方式使用的EDTA因此可能不抑制 Trx系統(tǒng)或G6PD，而且可能發(fā)揮為G6PD生成G6P的己糖激酶的抑制劑的功能。若沒有G6P， Trx系統(tǒng)不會得到必要的NADPH供應(yīng)來實現(xiàn)活性。實施例6 =DHEA對重組抗體還原的抑制脫氫表雄酮(DHEA)像其它類似的G6PD抑制劑一樣有效阻斷G6PD活性(Gordon et al.，1995，supra)。G6PD抑制劑還通過阻斷NADPH生成來防止HCCF中抗體(例如 ocrelizumab)的還原。在HCCF溫育實驗中證明了 DHEA抑制orcelizumab還原的能力。向 HCCF添加DHEA防止抗體還原。DHEA通常以約0. 05mM至約5mM的濃度范圍使用。DHEA通常也以約0. ImM至約 2. 5mM的濃度范圍使用。實施例7 添加(i)EDTA、(ii)硫酸銅、和(iii)乙酸對重組抗體還原的抑制在不銹鋼管形瓶中保存和保持四種不同HCCF。各溶液中細胞裂解的量是相似的， 它們是通過用來自未勻漿化CCF的HCCF稀釋來自勻漿化CCF的HCCF而生成的。例如，將 150mL第一裂解溶液與50mL第二溶液混合。在此研究中評估的四種HCCF混合物含有以下 任一項(1) 20mM EDTA, (2) 30 μ M CuSO4, (3) 15mM 乙酸(pH 5. 5)、和(4)不添加化學(xué)抑制劑 而作為對照溶液。使用蛋白A層析立即(t = 0hr)自所有四種混合物純化ocrelizumab抗 體，然后再次在不銹鋼管形瓶中保存20hr和40hr。通過Bioanalyzer測定法分析純化后 的蛋白A洗脫合并液，用以對完整抗體(150kDa)的百分比定量。結(jié)果顯示了在初始時間點 所有四種混合物中存在超過90%的完整抗體(圖19)。然而，在20hr時間點，在對照混合 物(不進行任何添加)中沒有檢測到完整抗體，指明抗體二硫鍵的還原。在其它三種混合 物中，在20hr和40hr時間點都仍檢測到超過90%的完整抗體，證明了測試的所有三種抑制 劑都防止二硫鍵還原。實施例8 給HCCF鼓入空氣對重組抗體還原的抑制在兩個分開的10L不銹鋼發(fā)酵罐中儲存和保持自勻漿化CCF生成的一份HCCF混 合物。給一個容器鼓入空氣，而給另一個容器鼓入氮氣。使用蛋白A層析立即(t = 0hr) 自初始混合物純化ocrelizumab抗體。在選定的時間點，自每個容器取出50mL樣品，并使 用蛋白A層析純化抗體。然后通過Bioanalyzer測定法分析純化后的蛋白A洗脫合并液， 用以對150kDa完整抗體的百分比定量。結(jié)果顯示了初始溶液中存在大約85%的完整抗體 (圖20)，指明暴露于氧(即發(fā)酵罐中鼓入的空氣)之前抗體二硫鍵的一些早期還原。一旦 給混合物鼓入空氣2小時，對36小時研究的剩余物測量到超過90%的完整抗體。相反，當(dāng) 給混合物鼓入氮氣時，繼續(xù)發(fā)生抗體還原事件，像2小時(28% 150kDa峰)和6小時(5% 150kDa峰)測量到的。這些結(jié)果證明了當(dāng)自勻漿化CCF生成的HCCF混合物暴露于氧時防 止抗體中的二硫鍵還原。實施例9 靶向SiRNA或反義核苷酸Trx抑制劑的設(shè)計針對CHO細胞中找到的基因的靶向siRNAs或反義核苷酸的設(shè)計可使用公眾可得 到的序列進行，諸如大腸桿菌硫氧還蛋白TrxA(SEQ ID NO :30)、大腸桿菌硫氧還蛋白還原 SlTrxB (SEQ ID NO 31)；小鼠硫氧還蛋白 1 (SEQ IDNO :32)、小鼠硫氧還蛋白 2 (SEQ ID N0: 33)、小鼠硫氧還蛋白還原酶1(SEQID NO :34)、和小鼠硫氧還蛋白還原酶2 (SEQ ID NO 35) 的序列。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能使用這些序列來選擇用于設(shè)計靶向不同生物體和/或細胞(諸如CHO細胞)中的酶的Trx抑制劑的序列。大腸桿菌硫氧還蛋白TrxA的序列是ATG TTA CAC CAA CAA CGA AAC CAA CAC GCC AGG CTT ATT CCTGTG GAG TTA TAT ATG AGC GAT AAA ATT ATT CAC CTG ACT GACGAC AGT TTT GAC ACG GAT GTA CTC AM GCG GAC GGG GCG ATCCTC GTC GAT TTC TGG GCA GAG TGG TGC GGT CCG TGC AAA ATGATC GCC CCG ATT CTG GAT GAA ATC GCT GAC GM TAT CAG GGCMA CTG ACC GTT GCA AM CTG MC ATC GAT CM MC CCT GGCACT GCG CCG AM TAT GGC ATC CGT GGT ATC CCG ACT CTG CTGCTG TTC AAA MC GGT GAA GTG GCG GCA ACC MA GTG GGT GCACTG TCT AAA GGT CAG TTG AAA GAG TTC CTC GAC GCT AAC CTGGCG TAA(SEQ ID NO 30)。大腸桿菌硫氧還蛋白TrxB的序列是ATG GGC ACG ACC AAA CAC AGT AAA CTG CTT ATC CTG GGT TCAGGC CCG GCG GGA TAC ACC GCT GCT GTC TAC GCG GCG CGC GCCAAC CTG CAA CCT GTG CTG ATT ACC GGC ATG GAA AAA GGC GGCCAA CTG ACC ACC ACC ACG GAA GTG GAA AAC TGG CCT GGC GATCCA AAC GAT CTG ACC GGT CCG TTA TTA ATG GAG CGC ATG CACGAA CAT GCC ACC MG TTT GAA ACT GAG ATC ATT TTT GAT CAT ATCAAC AAG GTG GAT CTG CAA AAC CGT CCG TTC CGT CTG AAT GGCGAT AAC GGC GAA TAC ACT TGC GAC GCG CTG ATT ATT GCC ACCGGA GCT TCT GCA CGC TAT CTC GGC CTG CCC TCT GAA GAA GCCTTT AAA GGC CGT GGG GTT TCT GCT TGT GCA ACC TGC GAC GGTTTC TTC TAT CGC AAC CAG AAA GTT GCG GTC ATC GGC GGC GGCAAT ACC GCG GTT GAA GAG GCG TTG TAT CTG TCT AAC ATC GCTTCG GAA GTG CAT CTG ATT CAC CGC CGT GAC GGT TTC CGC GCGGAA AAA ATC CTC ATT AAG CGC CTG ATG GAT AAA GTG GAG AACGGC AAC ATC ATT CTG CAC ACC MC CGT ACG CTG GAA GM GTGACC GGC GAT CAA ATG GGT GTC ACT GGC GTT CGT CTG CGC GATACG CAA AAC AGC GAT AAC ATC GAG TCA CTC GAC GTT GCC GGTCTG TTT GTT GCT ATC GGT CAC AGC CCG AAT ACT GCG ATT TTCGAA GGG CAG CTG GAA CTG GAA MC GGC TAC ATC AAA GTA CAGTCG GGT ATT CAT GGT AAT GCC ACC CAG ACC AGC ATT CCT GGCGTC TTT GCC GCA GGC GAC GTG ATG GAT CAC ATT TAT CGC CAGGCC ATT ACT TCG GCC GGT ACA GGC TGC ATG GCA GCA CTT GATGCG GAA CGC TAC CTC GAT GGT TTA GCT GAC GCA AAA TAA(SEQ IDNO : 31)。小鼠硫氧還蛋白1的序列是ATGGTGAAGCTGATCGAGAGCAAGGAAGCTTTTCAGGAGGCCCTGGCCGCCGCGGGAGACAAGCTTGT CGTGGTGGACTTCTCTGCTACGTGGTGTGGACCTTGCAAAATGATCAAGCCCTTCTTCCATTCCCTCTGTGACAAG TATTCCAATGTGGTGTTCCTTGAAGTGGATGTGGATGACTGCCAGGATGTTGCTGCAGACTGTGAAGTCAAATGC ATGCCGACCTTCCAGTTTTATAAAAAGGGTCAAAAGGTGGGGGAGTTCTCCGGTGCTAACAAGGAAAAGCTTGAA GCCTCTATTACTGAATATGCCTAA(SEQ ID NO :32)。小鼠硫氧還蛋白2的序列是ATGGCTCAGCGGCTCCTCCTGGGGAGGTTCCTGACCTCAGTCATCTCCAGGAAGCCTCCTCAGGGTGTG TGGGCTTCCCTCACCTCTAAGACCCTGCAGACCCCTCAGTACAATGCTGGTGGTCTAACAGTAATGCCCAGCCCAGC CCGGACAGTACACACCACCAGAGTCTGTTTGACGACCTTTAACGTCCAGGATGGACCTGACTTTCAAGACAGAGTTG TCAACAGTGAGACACCAGTTGTTGTGGACTTTCATGCACAGTGGTGTGGCCCCTGCAAGATCCTAGGACCGCGGCTA GAGAAGATGGTCGCCAAGCAGCACGGGAAGGTGGTCATGGCCAAAGTGGACATTGACGATCACACAGACCTTGCCATTGAATATGAGGTGTCAGCTGTGCCTACCGTGCTAGCCATCAAGAACGGGGACGTGGTGGACAAGTTTGTGGGGATCA AGGACGAGGACCAGCTAGAAGCCTTCCTGAAGAAGCTGATTGGCTGA(SEQ ID NO :33)。小鼠硫氧還蛋白還原酶1的序列是ATGAATGGCTCCAAAGATCCCCCTGGGTCCTATGACTTCGACCTGATCATCATTGGAGGAGGCTCAGGA GGACTGGCAGCAGCTAAGGAGGCAGCCAAATTTGACAAGAAAGTGCTGGTCTTGGATTTTGTCACACCGACTCCTCT TGGGACCAGATGGGGTCTCGGAGGAACGTGTGTGAATGTGGGTTGCATACCTAAGAAGCTGATGCACCAGGCAGCTT TGCTCGGACAAGCTCTGAAAGACTCGCGCAACTATGGCTGGAAAGTCGAAGACACAGTGAAGCATGACTGGGAGAAA ATGACGGAATCTGTGCAGAGTCACATCGGCTCGCTGAACTGGGGCTACCGCGTAGCTCTCCGGGAGAAAAAGGTCGT CTATGAGAATGCTTACGGGAGGTTCATTGGTCCTCACAGGATTGTGGCGACAAATAACAAAGGTAAAGAAAAAATCT ATTCAGCAGAGCGGTTCCTCATCGCCACAGGTGAGAGGCCCCGCTACCTGGGCATCCCTGGAGACAAAGAGTACTGC ATCAGCAGTGATGATCTTTTCTCCTTGCCTTACTGCCCGGGGAAGACCCTAGTAGTTGGTGCATCCTATGTCGCCTT GGAATGTGCAGGATTTCTGGCTGGTATCGGCTTAGACGTCACTGTAATGGTGCGGTCCATTCTCCTTAGAGGATTTG ACCAAGACATGGCCAACAAAATCGGTGAACACATGGAAGAACATGGTATCAAGTTTATAAGGCAGTTCGTCCCAACG AAAATTGAACAGATCGAAGCAGGAACACCAGGCCGACTCAGGGTGACTGCTCAATCCACAAACAGCGAGGAGACCAT AGAGGGCGAATTTAACACAGTGTTGCTGGCGGTAGGAAGAGATTCTTGTACGAGAACTATTGGCTTAGAGACCGTGG GCGTGAAGATAAACGAAAAAACCGGAAAGATACCCGTCACGGATGAAGAGCAGACCAATGTGCCTTACATCTACGCC ATCGGTGACATCCTGGAGGGGAAGCTAGAGCTGACTCCCGTAGCCATCCAGGCGGGGAGATTGCTGGCTCAGAGGCT GTATGGAGGCTCCAATGTCAAATGTGACTATGACAATGTCCCAACGACTGTATTTACTCCTTTGGAATATGGCTGTT GTGGCCTCTCTGAAGAAAAAGCCGTAGAGAAATTTGGGGAAGAAAATATTGAAGTTTACCATAGTTTCTTTTGGCCA TTGGAATGGACAGTCCCATCCCGGGATAACAACAAATGTTATGCAAAAATAATCTGCAACCTTAAAGACGATGAACG TGTCGTGGGCTTCCACGTGCTGGGTCCAAACGCTGGAGAGGTGACGCAGGGCTTTGCGGCTGCGCTCAAGTGTGGGC TGACTAAGCAGCAGCTGGACAGCACCATCGGCATCCACCCGGTCTGTGCAGAGATATTCACAACGTTGTCAGTGACG AAGCGCTCTGGGGGAGACATCCTCCAGTCTGGCTGCTGA(SEQ ID NO :34)。小鼠硫氧還蛋白還原酶2的序列是ATGGCGGCGATGGTGGCGGCGATGGTGGCGGCGCTGCGTGGACCCAGCAGGCGCTTCCGGCCGCGGACA CGGGCTCTGACACGCGGGACAAGGGGCGCGGCGAGTGCAGCGGGAGGGCAGCAGAGCTTTGATCTCTTGGTGATCGG TGGGGGATCCGGTGGCCTAGCTTGTGCCAAGGAAGCTGCTCAGCTGGGAAAGAAGGTGGCTGTGGCTGACTATGTGG AACCTTCTCCCCGAGGCACCAAGTGGGGCCTTGGTGGCACCTGTGTCAACGTGGGTTGCATACCCAAGAAGCTGATG CATCAGGCTGCACTGCTGGGGGGCATGATCAGAGATGCTCACCACTATGGCTGGGAGGTGGCCCAGCCTGTCCAACA CAACTGGAAGACAATGGCAGAAGCCGTGCAAAACCATGTGAAATCCTTGAACTGGGGTCATCGCGTCCAACTGCAGG ACAGGAAAGTCAAGTACTTTAACATCAAAGCCAGCTTTGTGGATGAGCACACAGTTCGCGGTGTGGACAAAGGCGGG AAGGCGACTCTGCTTTCAGCTGAGCACATTGTCATTGCTACAGGAGGACGGCCAAGGTACCCCACACAAGTCAAAGG AGCCCTGGAATATGGAATCACAAGTGACGACATCTTCTGGCTGAAGGAGTCCCCTGGGAAAACGTTGGTGGTTGGAG CCAGCTATGTGGCCCTAGAGTGTGCTGGCTTCCTCACTGGAATTGGACTGGATACCACTGTCATGATGCGCAGCATC CCTCTCCGAGGCTTTGACCAGCAAATGTCATCTTTGGTCACAGAGCACATGGAGTCTCATGGCACCCAGTTCCTGAA AGGCTGTGTCCCCTCCCACATCAAAAAACTCCCAACTAACCAGCTGCAGGTCACTTGGGAGGATCATGCTTCTGGCA AGGAAGACACAGGCACCTTTGACACTGTCCTGTGGGCCATAGGGCGAGTTCCAGAAACCAGGACTTTGAATCTGGAG AAGGCTGGCATCAGTACCAACCCTAAGAATCAGAAGATTATTGTGGATGCCCAGGAGGCTACCTCTGTTCCCCACAT CTATGCCATTGGAGATGTTGCTGAGGGGCGGCCTGAGCTGACGCCCACAGCTATCAAGGCAGGAAAGCTTCTGGCTCAGCGGCTCTTTGGGAAATCCTCAACCTTAATGGATTACAGCAATGTTCCCACAACTGTCTTTACACCACTGGAGTAT GGCTGTGTGGGGCTGTCTGAGGAGGAGGCTGTGGCTCTCCATGGCCAGGAGCATGTAGAGGTTTACCATGCATATTA TAAGCCCCTAGAGTTCACGGTGGCGGATAGGGATGCATCACAGTGCTACATAAAGATGGTATGCATGAGGGAGCCCC CACAACTGGTGCTGGGCCTGCACTTCCTTGGCCCCAACGCTGGAGAAGTCACCCAAGGATTTGCTCTTGGGATCAAG TGTGGGGCTTCATATGCACAGGTGATGCAGACAGTAGGGATCCATCCCACCTGCTCTGAGGAGGTGGTCAAGCTGCA CATCTCCAAGCGCTCCGGCCTGGAGCCTACTGTGACTGGTTGCTGA(SEQID NO 35)。實施例10 體外Trx/Trx還原酶研究測量和方法將商品化TrxR(大鼠肝)溶液(4 μ M)用水稀釋以產(chǎn)生2. 86 μ M溶液。將凍干的 Trx (人)用PBS(10mM，pH 7.2)重建，產(chǎn)生500 μ M溶液。在水中配制20mM NADPH溶液及 IOmM ATG 禾口 ATM 溶液。在黑色聚丙烯1. 5mL微量離心管中，溫和混合437 μ L反應(yīng)緩沖液(IOmM組氨酸、 IOmM Na2SO4U37mM NaCl、2. 5mM KCl, pH 7. 0)、25 μ LNADPH、16 μ L 配制好的 ocrelizumab 溶液(30. 2mg/mL)和5yL Trx0通過添加17. 5yL TrxR來啟動反應(yīng)。將反應(yīng)于室溫溫育 24小時。在每個采樣時間點取出20 μ L等分試樣，并保存于-70°C，直至通過Bioaralyzer 測定法分析。使用上文所述相同反應(yīng)條件及添加各種抑制劑證明了對Trx系統(tǒng)的抑制。1.硫氧還蛋白系繞的體外活件圖24顯示了來自Bioanalyzer分析的數(shù)字凝膠樣圖像(每條帶代表一個時間 點)，顯示了將完整ocrelizumab (“2H7”，一種人源化抗⑶20抗體，上文稱作“變體A”)(lmg/ mL)與IOmM硫酸組氨酸緩沖液中的0. 1 μ M TrxR(大鼠肝)、5 μ M Trx (人)和ImM NADPH 一起溫育導(dǎo)致不到1小時里ocrelizumab的還原。2.受到金硫葡糖抑制的硫氧還蛋白系統(tǒng)的體外活性以下列濃度向上文所述ocrel izumab混合物添加金硫葡糖(ATG) ImM ； 0.6μΜ(6 IATG TrxR) ；0.4μΜ(4 IATG TrxR)；禾口 0·2μΜ(2 IATG TrxR)。如圖25-27所示來自Bioanalyzer分析的數(shù)字凝膠樣圖像所證明的，以ImM、 0. 6 μ Μ、和0. 4μ M的濃度添加的金硫葡糖有效抑制硫氧還蛋白系統(tǒng)對ocrelizumab的還 原。然而，如圖28所示，在這些實驗條件下，以0. 2 μ M的濃度添加的金硫葡糖在24小時后 不能抑制ocrelizumab還原。3.受到金硫蘋果酸抑制的硫氧還蛋白系統(tǒng)的體外活性以0. ImM和0. OlmM的濃度向上文所述ocrelizumab混合物添加金硫蘋果酸 (ATM)。如圖29和30所示來自Bioanalyzer分析的數(shù)字凝膠樣圖像所證明的，ATM以所測 試的兩個濃度都有效抑制硫氧還蛋白系統(tǒng)對ocrelizumab的還原。4.受到CuSO1抑制的硫氧還蛋白系統(tǒng)的體外活性以 20 μ M(4 ICu2+ Trx) ； 10 μ m(2 ICu2+ Trx)；禾口 5μΜ(1 ICu2+ Trx) 的濃度向上文所述ocrelizumab混合物添加CuSO40如圖31-33所示，CuSO4在20 μ M和 10 μ M的濃度有效抑制硫氧還蛋白誘導(dǎo)的ocrelizumab還原(圖31和32)，但是5 μ M濃度 不足以導(dǎo)致對還原的完全抑制(圖33)。5.受到胱胺抑制的硫氧還蛋白系統(tǒng)的體外活性
以下列濃度向上文所述ocre 1 izumab混合物添加胱胺532 μ M (20 1胱 胺2Η7(變體Α) 二硫化物)；266 μ M (10 1胱胺2Η7 (變體Α) 二硫化物)；133 μ M (5 1 胱胺2Η7 二硫化物)；和26.6μΜ(1 1胱胺2Η7 (變體Α) 二硫化物)。如圖34-37所示， 胱胺在532 μ M (20 1胱胺2Η7 (變體Α) 二硫化物)和266 μ M (10 1胱胺2Η7 (變體 A))的濃度有效抑制硫氧還蛋白誘導(dǎo)的ocrelizumab還原(圖34和35)，但是133μΜ(5 1 胱胺2Η7 (變體Α) 二硫化物)和26. 6 μ M(1 1胱胺2H7 (變體A) 二硫化物)濃度不 足以在24小時后抑制ocrelizumab還原(圖36和37)。6.卵_耐__氧丄不舶碰白働卜謝牛以2. 6mM的濃度向上文所述ocrelizumab混合物添加胱氨酸。如圖38所示，在此 濃度，胱氨酸有效抑制硫氧還蛋白系統(tǒng)對ocrelizumab的還原。應(yīng)當(dāng)注意，胱氨酸的最小有 效濃度(正如其它抑制劑的有效最小濃度)取決于實際情況，而且對于不同蛋白質(zhì)(諸如 抗體)可以是不同的，而且可以隨添加的時間而變化。如此，例如，如果在裂解前添加胱氨 酸，那么對于抗體2H7 (變體A)的最小有效濃度為約1. 3mM,對于Apomab為約ImM而對于 抗體變體C為約4. 5mM。當(dāng)在細胞培養(yǎng)基中添加胱氨酸時，最小有效濃度通常要高一些，而 且對于2H7 (變體A)是約5. 2mM,對于Apomab是6mM而對于抗體變體C是9mM。通常，對于 胱氨酸、胱胺和氧化型谷胱甘肽(見下文)，最小有效抑制濃度是約40倍抗體濃度(以μ M 計)。7.卵丨氧·碰涵(GSSG) __氧丄不舶碰白働謎以2. 6mM的濃度向上文所述ocrelizumab混合物添加GSSG。如圖39所示，在此濃 度，GSSG有效抑制硫氧還蛋白系統(tǒng)對ocrelizumab的還原。然而，應(yīng)當(dāng)注意，氧化型谷胱甘 肽的最小有效濃度(正如其它抑制劑的)取決于實際情況，諸如例如所生成的蛋白質(zhì)(例 如抗體)的本質(zhì)和添加的時間。例如，對于抗體2H7(變體A)，裂解前添加的最小有效濃度 為約1. 3mM。8.酶促還原系繞的體外活性圖40顯示了來自Bioanalyzer分析的數(shù)字凝膠樣圖像(每條帶代表一個時間 點)，顯示了將完整ocrelizumab ( “2H7”，一種人源化抗CD20抗體，變體A) (lmg/mL)與 50mM硫酸組氨酸緩沖液pH 7. 38中的10 μ g/mL己糖激酶、50 μ g/mL葡萄糖-6-磷酸脫氫 酶、5“] 硫氧還蛋白、0.1“]\1硫氧還蛋白還原酶、21111葡萄糖、0.61111 ATP、2mM Mg2+、和2mM NADP 一起溫育在約1小時里導(dǎo)致ocrelizumab還原。添加0. ImM HDEA(—種已知的葡萄 糖-6-磷酸脫氫酶抑制劑)不抑制還原。9.酶促還原系統(tǒng)的體外活性需要NADPH如圖41來自Bioanalyzer分析的數(shù)字凝膠樣圖像所示，將完整ocrelizumab (lmg/ mL)與50mM硫酸組氨酸緩沖液pH 7. 38中的5 μ M硫氧還蛋白、0. 1 μ M硫氧還蛋白還原酶、 和2mM NADP —起溫育不導(dǎo)致ocrelizumab抗體的還原。ocrelizumab還原不能在沒有己糖 激酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶和它們的底物來生成NADPH的情況中發(fā)生。本文中合適地例示性描述的發(fā)明可以在缺乏未在本文中明確公開的任何一種或 多種成分、一項或多項限制的情況中實施。如此，例如在本文中的每種情況中，術(shù)語“包含”、 “包括”、“含有”等應(yīng)當(dāng)讀成開放式的且沒有限制。另外，本文中所采用的術(shù)語和表述作為 描述的術(shù)語使用而并非限制，而且使用此類術(shù)語和表述并不意圖排除所顯示的發(fā)明的任何等同方案或其部分，而是認識到在要求保護的發(fā)明的范圍內(nèi)的各種變化是有可能的。如此， 應(yīng)當(dāng)理解的是，盡管已經(jīng)通過優(yōu)選的實施方案和任選的特征明確地公開了本發(fā)明，但是本 領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地做出本文中公開的發(fā)明的修改和變化，并且此類修飾和變化被認 為是在本文所公開的發(fā)明的范圍內(nèi)的。本文中已經(jīng)廣泛地和一般性地描述了本發(fā)明。落 在一般公開內(nèi)的每一種更窄的種類和亞類的分組也構(gòu)成這些發(fā)明的一部分。這在每一項發(fā) 明的一般描述內(nèi)包括一項附帶條件或負面限制，其會容許自該類別中消除任何主題，不管 要消除的材料是否是具體敘述的。另外，在按馬庫什組描述本發(fā)明的特征或方面時，本領(lǐng)域 技術(shù)人員會認可本發(fā)明也由此是以馬庫什組的任何成員個體或成員亞組的方式描述的。另 外，當(dāng)提到本發(fā)明的一個方面列出成員個體的一個范圍時，像例如“SEQ ID NO :1至SEQ ID NO :100(含兩端點)”，等同于個別地列出該列表的每一個成員，而且應(yīng)當(dāng)理解，權(quán)利要求中 可以個別地排除或包括每一個成員個體。本文方法中所描繪的和/或所使用的步驟可以以與所描繪的和/或所敘述的不同 的次序?qū)嵤?。這些步驟僅僅是這些步驟可發(fā)生的次序的例示。這些步驟可以以期望的任何 次序發(fā)生，使得它仍執(zhí)行要求保護的發(fā)明的目的。根據(jù)本文中對本發(fā)明的描述，顯然可以使用各種等效方案來執(zhí)行本發(fā)明的概念而 不背離其范圍。此外，雖然已經(jīng)具體參照某些實施方案描述了本發(fā)明，但是本領(lǐng)域普通技術(shù) 人員會認識到可以在形式和細節(jié)方面做出變化而不背離本發(fā)明的精神和范圍。所描述的實 施方案在所有方面視為例示性的而非限制性的。還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明不限于本文所述特定 實施方案，但是能夠進行許多等效方案、重新安排、改良、和替換，而不背離本發(fā)明的范圍。 如此，別的實施方案也在本發(fā)明的范圍內(nèi)且在所附權(quán)利要求內(nèi)。通過述及將本文中提到的所有美國專利和申請；外國專利和申請；科學(xué)論文；書 籍；和出版物完整收入本文，就像通過述及明確且個別地指明收錄每一篇單獨的專利或出 版物一樣，包括任何圖表，就像完整列出一樣。DocCode-SCOREIFff內(nèi)容的SCORE占位頁申請?zhí)朠CT/US08/69395 文件日期07/08/2008此表格在IFW記錄中的存在指明了在上文鑒定的日期以電子格式接收了下列文 件類型。此內(nèi)容保存在SCORE數(shù)據(jù)庫中?！ぴO(shè)計圖既然這是電子提交的，那么就沒有物理人工文件夾，在PALM中沒有記錄人工文件 夾，而且不存在紙文件或物理媒體。IFW記錄中的TIFF圖像是自保存在SCORE中的原始文 件創(chuàng)建的。為了獲取SCORE數(shù)據(jù)庫中的文件，見SIRA制定的說明。在文件入口時(如上所述)·審查員可以經(jīng)eDAN界面獲取SCORE內(nèi)容?！て渌?USPTO 雇員能登記(bookmark)當(dāng)前 SCORE URL (http://es/ ScoreAccessffeb/)。 外部用戶可以經(jīng)公眾和私人PAIR(Public and Private PAIR)界面獲取SCORE 內(nèi)容。
表格修正日期2006年2月8日
權(quán)利要求
一種用于防止重組宿主細胞中表達的多肽中二硫鍵還原的方法，包括給所述宿主細胞的收獲前的或已收獲的培養(yǎng)液補充硫氧還蛋白抑制劑。
2.權(quán)利要求1的方法，其中向所述收獲前的培養(yǎng)液添加所述硫氧還蛋白抑制劑。
3.權(quán)利要求1的方法，其中向已收獲的培養(yǎng)液添加所述硫氧還蛋白抑制劑。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述硫氧還蛋白抑制劑是硫氧還蛋白的直接抑制劑。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述硫氧還蛋白抑制劑是烴基-2-咪唑基二硫化物或萘醌 螺酮縮醇衍生物。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述硫氧還蛋白抑制劑是硫氧還蛋白還原酶的特異性抑制劑。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述硫氧還蛋白抑制劑是金復(fù)合物。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述金復(fù)合物是金硫葡糖(ATG)或金硫蘋果酸(ATM)。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述ATG或所述ATM以介于約0.ImM和約ImM之間的濃度 添加。
10.權(quán)利要求8的方法，其中所述ATG或所述ATM以所述收獲前的或已收獲的培養(yǎng)液中 硫氧還蛋白還原酶濃度至少約四倍的濃度添加。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述硫氧還蛋白抑制劑是金屬離子。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述金屬離子選自下組Hg2+、Cu2+、Zn2+、Co2+和Mn2+。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述金屬離子是以硫酸銅的形式存在的Cu2+。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述硫酸銅是五水合物的形式或無水的形式。
15.權(quán)利要求13的方法，其中所述硫酸銅以介于約5μ M和約100 μ M之間的濃度添加。
16.權(quán)利要求13的方法，其中所述硫酸銅以介于約10μ M至約80 μ M之間的濃度添加。
17.權(quán)利要求13的方法，其中所述硫酸銅以介于約15μ M和約50 μ M之間的濃度添加。
18.權(quán)利要求13的方法，其中所述硫酸銅以所述收獲前的或已收獲的培養(yǎng)液中硫氧還 蛋白濃度至少約兩倍的濃度添加。
19.權(quán)利要求1的方法，其中所述硫氧還蛋白抑制劑是G6PD的抑制劑。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述硫氧還蛋白抑制劑選自下組吡哆醛_5’-磷酸、 1-氟_2，4- 二硝基苯、脫氫表雄酮(DHEA)和表雄酮(EA)。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述DHEA以介于約0.05mM和約5mM之間的濃度添加。
22.權(quán)利要求20的方法，其中所述DHEA以介于約0.ImM和約2. 5mM之間的濃度添力口。
23.權(quán)利要求1的方法，其中所述硫氧還蛋白抑制劑是己糖激酶活性的抑制劑。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述硫氧還蛋白抑制劑是金屬離子的螯合劑。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述金屬離子的螯合劑是乙二胺四乙酸(EDTA)。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述EDTA以介于約5mM和約60mM之間的濃度添加。
27.權(quán)利要求25的方法，其中所述EDTA以介于約IOmM和約50mM之間的濃度添加。
28.權(quán)利要求25的方法，其中所述EDTA以介于約20mM和約40mM之間的濃度添加。
29.權(quán)利要求23的方法，其中所述硫氧還蛋白抑制劑選自下組山梨糖-1-磷酸、多磷 酸、6-脫氧-6-氟葡萄糖、2-C-羥基-甲基葡萄糖、木糖和來蘇糖。
30.權(quán)利要求1的方法，其中所述硫氧還蛋白抑制劑是胱氨酸、半胱氨酸、或氧化型谷 胱甘肽。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所述胱氨酸、半胱氨酸或氧化型谷胱甘肽以所述收獲前 的或已收獲的培養(yǎng)液中所述多肽濃度至少約40倍的濃度添加。
32.權(quán)利要求1的方法，其中所述硫氧還蛋白抑制劑是與硫氧還蛋白還原酶特異性結(jié) 合的抗體、反義核苷酸、或siRNA。
33.權(quán)利要求1的方法，其中所述硫氧還蛋白抑制劑是間接導(dǎo)致對硫氧還蛋白活性的 抑制的措施。
34.權(quán)利要求33的方法，其中所述措施是給所述重組宿主細胞的已收獲的培養(yǎng)液鼓入空氣。
35.權(quán)利要求33的方法，其中所述措施是降低所述重組宿主細胞的已收獲的培養(yǎng)液的pH。
36.權(quán)利要求1-33任一項的方法，進一步包括給所述重組宿主細胞的已收獲的培養(yǎng)液 鼓入空氣的步驟。
37.權(quán)利要求1-33任一項的方法，進一步包括降低所述重組宿主細胞的已收獲的培養(yǎng) 液的PH的步驟。
38.權(quán)利要求1的方法，其中所述多肽是抗體或有生物學(xué)功能的抗體片段。
39.權(quán)利要求38的方法，其中所述抗體片段選自下組Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、 (SCFv)2、dAb、互補決定區(qū)(CDR)片段、線性抗體、單鏈抗體分子、微型抗體、雙抗體和自抗體 片段形成的多特異性抗體。
40.權(quán)利要求38的方法，其中所述抗體或抗體片段是治療性抗體或其生物學(xué)功能片段。
41.權(quán)利要求40的方法，其中所述治療性抗體選自下組抗HER2抗體；抗CD20抗體； 抗IL-8抗體；抗VEGF抗體；抗CD40抗體，抗CDlla抗體；抗CD18抗體；抗IgE抗體；抗 Apo-2受體抗體；抗組織因子(TF)抗體；抗人α 4 β 7整聯(lián)蛋白抗體；抗EGFR抗體；抗⑶3 抗體；抗CD25抗體；抗CD4抗體；抗CD52抗體；抗Fc受體抗體；抗癌胚抗原(CEA)抗體；針 對乳房上皮細胞的抗體；與結(jié)腸癌細胞結(jié)合的抗體；抗CD38抗體；抗CD33抗體；抗CD22抗 體；抗EpCAM抗體；抗GpIIb/IIIa抗體；抗RSV抗體；抗CMV抗體；抗HIV抗體；抗肝炎抗 體；抗CA 125抗體；抗α ν β 3抗體；抗人腎細胞癌抗體；抗人17-1Α抗體；抗人結(jié)腸直腸腫 瘤抗體；抗人黑素瘤抗體；針對GD3神經(jīng)節(jié)苷酯的R24 ；抗人鱗狀細胞癌抗體；和抗人白細 胞抗原(HLA)抗體和抗HLA DR抗體。
42.權(quán)利要求40的方法，其中所述治療性抗體是與HER受體、VEGF、IgE、⑶20、⑶11a、 ⑶40或DR5結(jié)合的抗體。
43.權(quán)利要求42的方法，其中所述HER受體是HERl和/或HER2。
44.權(quán)利要求43的方法，其中所述HER受體是HER2。
45.權(quán)利要求44的方法，其中所述治療性抗體包含選自下組的重鏈和/或輕鏈可變域 序列SEQ ID NO: 16、17、18 和 19。
46.權(quán)利要求42的方法，其中所述治療性抗體是與CD20結(jié)合的抗體。
47.權(quán)利要求46的方法，其中所述治療性抗體包含選自下組的重鏈和/或輕鏈可變域 序列SEQ ID NO :1-15。
48.權(quán)利要求42的方法，其中所述治療性抗體是與VEGF結(jié)合的抗體。
49.權(quán)利要求48的方法，其中所述治療性抗體包含選自下組的重鏈和/或輕鏈可變域 序列SEQ ID NO 20-25。
50.權(quán)利要求42的方法，其中所述治療性抗體是與CDlla結(jié)合的抗體。
51.權(quán)利要求50的方法，其中所述治療性抗體包含選自下組的重鏈和/或輕鏈可變域 序列SEQ ID NO 26-29。
52.權(quán)利要求42的方法，其中所述治療性抗體與DR5受體結(jié)合。
53.權(quán)利要求52的方法，其中所述治療性抗體選自下組=Apomab1. 1,2. 1,3. 1,4. 1、 5. 1、5· 2、5· 3、6· 1、6· 2、6· 3、7· 1、7· 2、7· 3、8· 1、8· 3、9. Ul. 2、2· 2、3· 2、4· 2、5· 2、6· 2、7· 2、 8. 2、9· 2、1· 3、2· 2、3· 3、4· 3、5· 3、6· 3、7· 3、8· 3、9· 3 和 25. 3。
54.權(quán)利要求52的方法，其中所述治療性抗體是Apomab8. 3或Apomab 7.3。
55.權(quán)利要求54的方法，其中所述治療性抗體是Apomab7.3。
56.權(quán)利要求1的方法，其中所述多肽是治療性多肽。
57.權(quán)利要求56的方法，其中所述治療性多肽選自下組生長激素，包括人生長激素 和牛生長激素；生長激素釋放因子；甲狀旁腺素；促甲狀腺激素；脂蛋白；α -1-抗胰蛋白 酶；胰島素A鏈；胰島素B鏈；胰島素原；促卵泡激素；降鈣素；黃體生成素；高血糖素；凝 血因子，諸如因子VIIIC、因子IX、組織因子、和von Willebrands因子；抗凝血因子，諸如 蛋白C ；心房鈉尿因子；肺表面活性劑；纖溶酶原激活劑，諸如尿激酶或人尿或組織型纖溶 酶原激活劑(t-PA)；鈴蟾肽；凝血酶；造血生長因子；腫瘤壞死因子-α和；腦啡肽 酶；RANTES (在激活后受到調(diào)節(jié)，正常情況下由T細胞表達和分泌)；人巨噬細胞炎癥蛋白 (MIP-1-α)；血清清蛋白，諸如人血清清蛋白；Muellerian抑制性物質(zhì)；松弛素A鏈；松弛 素B鏈；松弛素原；小鼠促性腺素相關(guān)肽；微生物蛋白質(zhì)，諸如β -內(nèi)酰胺酶；DNA酶；IgE ； 細胞毒性T-淋巴細胞相關(guān)抗原(CTLA)，諸如CTLA-4 ；抑制素；激活素；血管內(nèi)皮生長因子 (VEGF)；激素的或生長因子的受體；蛋白A或D ；類風(fēng)濕因子；神經(jīng)營養(yǎng)性因子，諸如骨衍生 神經(jīng)營養(yǎng)性因子(BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)因子-3、-4、-5或_6(ΝΤ_3、ΝΤ-4、ΝΤ-5或ΝΤ-6)、或神 經(jīng)生長因子，諸如NGF-β ；血小板衍生生長因子(PDGF)；成纖維細胞生長因子，諸如aFGF 和bFGF ；表皮生長因子(EGF)；轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)，諸如TGF- α和TGF- β，包括TGF- β 1、 TGF-β 2、TGF-β 3、TGF-β 4、或 TGF-β 5 ；胰島素樣生長因子-I 和-II(IGF-I 和 IGF-II)； des(l-3)-IGF-I(腦IGF-I)、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白；CD蛋白，諸如CD3、CD4、CD8、 ⑶19、⑶20、⑶34和⑶40 ；紅細胞生成素；骨誘導(dǎo)因子；免疫毒素；骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)； 干擾素，諸如干擾素-α、- β和-γ ；集落刺激因子(CSF)，例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF ；白 介素(IL)，例如IL-I至IL-IO ；超氧化物歧化酶；T細胞受體；表面膜蛋白；衰變加速因子； 病毒抗原，諸如例如AIDS包膜的一部分；運輸?shù)鞍祝粴w巢受體；地址素；調(diào)節(jié)蛋白；整聯(lián)蛋 白，諸如 CDlla、CDllb、CDllc、CD18、ICAM、VLA-4 和 VCAM ；腫瘤相關(guān)抗原，諸如 HER2、HER3 或HER4受體；及以上所述多肽的片段。
58.權(quán)利要求1的方法，其中所述重組宿主細胞是真核細胞。
59.權(quán)利要求58的方法，其中所述真核細胞是哺乳動物細胞。
60.權(quán)利要求59的方法，其中所述哺乳動物細胞是中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。
61.權(quán)利要求1的方法，其中所述重組宿主細胞是原核細胞。
62.權(quán)利要求61的方法，其中所述原核細胞是細菌細胞。
63.權(quán)利要求62的方法，其中所述細菌細胞是大腸桿菌細胞。
全文摘要
本發(fā)明關(guān)注用于在含雙硫的多肽的重組生產(chǎn)期間防止二硫鍵還原的方法和手段。具體而言，本發(fā)明關(guān)注在自重組宿主細胞培養(yǎng)物收獲含雙硫的多肽(包括抗體)期間防止二硫鍵還原。
文檔編號C07K1/00GK101932591SQ200880105932
公開日2010年12月29日 申請日期2008年7月8日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月9日
發(fā)明者丹尼爾·P·休伊特, 麗塔·L·旺格, 梅洛迪·T·施密特, 邁克爾·W·萊爾德, 高涌祥 申請人:健泰科生物技術(shù)公司