專利名稱：Bs3抗性基因和使用方法
Bs3抗性基因和使用方法
背景技術(shù)：
植物是大量植物病原性真菌、細(xì)菌、病毒、卵菌和線蟲導(dǎo)致的數(shù)以千計的傳染性疾病的宿主。植物通過誘導(dǎo)快速防御響應(yīng)來識別和抵抗許多侵入性的植物病原體。識別通常 是由于植物中顯性或半顯性抗性(R)基因產(chǎn)物與侵入性植物病原體表達(dá)的相應(yīng)的顯性無 毒(Avr)基因產(chǎn)物之間的相互作用。R-基因觸發(fā)的抗性通常導(dǎo)致程序性細(xì)胞死亡，已稱為 過敏反應(yīng)(HR)。認(rèn)為HR限制病原體的傳播。R基因產(chǎn)物如何介導(dǎo)對相應(yīng)的Avr蛋白的感知基本上是不清楚的。有人提出，植物 病原體Avr產(chǎn)物作為配體起作用，該植物R產(chǎn)物作為受體起作用。在這種受體_配體模型 中，Avr產(chǎn)物對植物中相應(yīng)的R產(chǎn)物的結(jié)合引起植物中產(chǎn)生HR的一連串事件，這引起疾病 抗性。在另一模型中，R蛋白感知Avr蛋白的作用而不是結(jié)構(gòu)。這一模型中，認(rèn)為Avr蛋白 為了促進(jìn)病原體的毒力而修飾植物靶蛋白(病原性靶)。通過匹配R蛋白并觸發(fā)防御響應(yīng) 來檢測病原性蛋白的修飾。試驗證據(jù)表示，一些R蛋白作為Avr受體起作用，而另一些檢測 Avr蛋白的活性。目前由植物分子生物學(xué)家常規(guī)地進(jìn)行攜帶異源基因序列的轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)生。將 分離的基因序列摻入表達(dá)盒，產(chǎn)生植物轉(zhuǎn)化載體，并轉(zhuǎn)化許多類型的植物的方法是公知的。 作為引入異源轉(zhuǎn)基因的結(jié)果，產(chǎn)生具有改變的特征的轉(zhuǎn)基因植物的實例包括=Guerineau 的美國專利第5，719，046號(通過引入細(xì)菌二氫蝶酸合酶基因而產(chǎn)生除草劑抗性植物)； Jorgensen的5，231，020 (修飾植物中的類黃酮類)；Dougherty的5，583，021 (產(chǎn)生病毒 抗性植物)；De Greve的5，767，372和Fischoff的5，500，365 (通過引入蘇云金芽胞桿菌 (Bacillus thuringiensis)基因產(chǎn)生昆蟲抗性植物)。結(jié)合這樣的技術(shù)，植物R基因的分離已經(jīng)類似地允許產(chǎn)生具有對某些病原體增強(qiáng) 的抗性的植物。自從從番茄克隆了賦予對丁香假單胞菌番茄變種(Pseudomonas syringae pv. tomato)的抗性的第一個 R 基因 Pto (Martin 等人(1993) Science 262 1432-1436)，已 經(jīng) 艮道了大量其它 R 基因(Hammond-Kosack&Jones (1997) Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48 =575-607)。大量的這些基因已經(jīng)被用于將編碼的抗性特征引入此前對相應(yīng) 的病原體易感的植物株系。例如，美國專利第5，571，706號描述為了產(chǎn)生TMV-抗性煙草植 物，將N基因引入對煙草花葉病毒(TMV)易感的煙草株系。WO 95/28423描述作為產(chǎn)生對包 括丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae)的細(xì)菌病原體的抗性的手段，產(chǎn)生攜帶來自擬南 芥(Arabidopsis thaliana)的Rps2基因的轉(zhuǎn)基因植物，且WO 98/02545描述將Prf基因 弓丨入植物以獲得廣譜的病原體抗性。植物病原性細(xì)菌野油菜黃單胞菌皰病致病變種(Xanthomonascampestris pv. vesicatoria) (Xcv)導(dǎo)致的番茄和辣椒細(xì)菌性斑點病，對于這些作物在世界上具有高 濕度和大雨量的地區(qū)的商業(yè)生產(chǎn)可以是毀滅性的。盡管在商業(yè)性農(nóng)業(yè)中對Xcv的控制主 要是基于應(yīng)用殺蟲劑，在番茄和辣椒兩者已經(jīng)描述了對細(xì)菌性斑點病的遺傳抗性(Cook 和 Stall (1963)Phytopathology 53 1060-1062 ；Cook 和 Guevara(1984)Plant Dis.68 329-330 ；Kim 禾口 Hartman(1985)Plant Dis. 69 233-235 Jones 禾口 Scott (1986)PlantDis. 70 :337-339)。在這兩種宿主中，已經(jīng)更好地表征了辣椒中的遺傳抗性。已經(jīng)鑒定了 以“基因?qū)颉狈绞劫x予抗性的多個單基因座(Bsl、Bs2和Bs3) (Hibberd等人(1987) Phytopathology 77:1304-1307)。此外，已經(jīng)從Xcv克隆了相應(yīng)的無毒基因(avrBsl、 avrBs2 禾口 avrBs3) (Swanson 等人(1988)Mol. Plant-Microbe Interact. 1 5-9 ；Minsavage 等人(1990)Mol. Plant-Microbe Interact. 3 :41_47)。對這些無毒基因的遺傳和分子表征 已經(jīng)提供了關(guān)于Xcv與辣椒之間相互作用的大量信息(Kearney等人(1988) Nature 332 541-543 ；Kearney 禾口 Staskawicz (1990) Nature 346 :385_386 ；Herbers 等人(1992) Nature 356 172-174 ；Van derAckerveken 等人(1992)Plant J. 2 :359_366)。最近，已經(jīng)分離和測 序了辣椒的Bs3基因(美國專利第6，262，343號)。Xcv采用III型分泌(T3S)系統(tǒng)來將約20種效應(yīng)蛋白的庫注入宿主細(xì)胞質(zhì)，它們 共同地促進(jìn)毒性(Thieme等人(2005) J. Bacteriol. 187 :7254)。R蛋白介導(dǎo)的響應(yīng)于Xcv 效應(yīng)蛋白的防御通常伴有程序性細(xì)胞死亡響應(yīng)，稱為過敏反應(yīng)(HR)。AvrBs3是R蛋白識別 的一種Avr蛋白，并是高度保守蛋白的黃單胞菌屬(Xanthomonas)家族的成員(Schornack 等人(2006) J. Plant Physiol. 163 :256)。AvrBs3的中心區(qū)域由決定無毒特異性的17. 5個 串聯(lián)的幾乎完全34-氨基酸(aa)重復(fù)單元組成(Herbers等人(1992) Nature 356 172)。 AvrBs3還包含類似真核轉(zhuǎn)錄因子的核定位信號(NLS)和酸性轉(zhuǎn)錄活化區(qū)(AD) (Szurek等 人(2001) Plant J. 26 523 ；Szurek等人(2002)Mol. Microbiol. 46 13)，并誘導(dǎo)宿主基因轉(zhuǎn) 錄(Marois 等人(2002)Mol. Plant-MicrobeInteract. 15 :637_646) 。AvrBs3 的 NLS 或 AD 中的突變通過匹配辣椒R基因Bs3消除病原體識別(Szurek等人(2001)Plant J. 26 523 ； Vanden Ackerveken等人(1996)Cell 87 1307)，這表示識別包括轉(zhuǎn)錄活化宿主基因。從辣椒分離Bs3基因?qū)檠芯空咛峁┻M(jìn)一步研究該識別過程的機(jī)會，并提供可用 于產(chǎn)生具有對植物病原體增加的抗性的轉(zhuǎn)基因植物的R基因。發(fā)明簡述本發(fā)明提供從辣椒(Capsicum armuum)分離的抗性(R)基因Bs3基因。已知Bs3 基因賦予植物對細(xì)菌病原體野油菜黃單胞菌皰病致病變種的抗性。如下文討論的，在本氏 煙草(Nicotiana benthamiana)葉片中瞬時共表達(dá)Bs3和avrBs3基因在葉片中觸發(fā)過敏 反應(yīng)(HR)。此外，本發(fā)明提供作為Bs3基因的第二等位基因，稱為Bs3-E等位基因，其當(dāng)在 本氏煙草(N. benthamiana)葉片中與AvrBs3_衍生物AvrBs3 Δ r印16共表達(dá)時觸發(fā)HR。因此，本發(fā)明提供包含Bs3基因兩種等位基因的核苷酸序列的分離的核酸分子。 這種核酸分子包括包含全長編碼序列的cDNA序列和基因組序列兩者。這兩種等位基因編 碼與已知黃素_依賴性單加氧酶的氨基酸序列同源的氨基酸序列。本發(fā)明進(jìn)一步提供用于增加植物對植物病原體的抗性的方法。這種方法包括以包 含編碼Bs3蛋白的核苷酸序列和驅(qū)動在植物中表達(dá)的可操作地連接的啟動子的本發(fā)明核 苷酸分子轉(zhuǎn)化植物。這種植物具有對植物病原體增加的抗性。本發(fā)明進(jìn)一步提供包含Bs3基因啟動子序列的分離的核酸分子。為了在植物中表 達(dá)基因，這種分離的核酸分子可以可操作地連接于目標(biāo)基因。因此，本發(fā)明提供在植物中表 達(dá)或增加目標(biāo)蛋白或RNA表達(dá)的方法，包括以多核苷酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物，所述多核苷酸構(gòu) 建體包含可操作地連接于編碼目標(biāo)蛋白或RNA的目標(biāo)基因的本發(fā)明的啟動子序列。另外提供了以本發(fā)明的分離的核酸分子轉(zhuǎn)化的植物、植物部分、種子、植物細(xì)胞和其它非人類宿主細(xì)胞，以及由本發(fā)明編碼序列編碼的蛋白或多肽。附圖簡述

圖1A.來自ECW-30R的Bs3等位基因的識別特異性。Bs3基因和/或avr基因經(jīng) 由根癌農(nóng)桿菌(A. tumefaciens) (OD600 = 0 . 8)在本氏煙草葉片中瞬時表達(dá)。虛線標(biāo)出接種 區(qū)域。浸潤四天后，清理葉片以使過敏反應(yīng)顯現(xiàn)(黑色區(qū)域)。圖IB. Bs3-E和/或avr基因在本氏煙草葉片中瞬時表達(dá)。圖1C. AvrBs3、AvrBs3-衍生物和AvrBs4的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)與活性之間的關(guān)系。+/_分 別表示共表達(dá)辣椒Bs3或Bs3-E等位基因后本氏煙草中存在/不存在過敏反應(yīng)(HR)。細(xì)節(jié) 參見圖1A。蛋白中間部分中的白色框和灰色框區(qū)域分別代表AvrBs3和AvrBs4的重復(fù)區(qū) 域。AD是指C-末端酸性轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域。圖ID. ECW-30R Bs3和ECW Bs3_E等位基因的基因結(jié)構(gòu)。按比例展示外顯子、內(nèi)含 子、非翻譯區(qū)和啟動子區(qū)，分別為白色、黑色、灰色和帶陰影的框。這些元件的長度(以堿基 對表示)在框中表明。Bs3等位基因之間的差異標(biāo)為粗體。Bs3-E啟動子中相對于Bs3啟 動子的13-bp插入物加下劃線。啟動子和外顯子3-多態(tài)性的核苷酸位置分別是相對于轉(zhuǎn) 錄起始位點和翻譯起始位點。由外顯子3中多態(tài)性區(qū)域編碼的氨基酸在核苷酸序列上方和 下方描述。圖2.包含Bs3等位基因(白色)的啟動子(箭頭)和Bs3_E等位基因(黑色) 的編碼區(qū)(盒)的嵌合體或倒裝組合(葉片右側(cè))與如所示的avrBs3和衍生物一起表達(dá)。 星號(* )標(biāo)出其中僅浸潤遞送嵌合構(gòu)建體的根癌農(nóng)桿菌的區(qū)域。虛線標(biāo)出接種區(qū)域。接 種四天后，清理葉片以使過敏反應(yīng)顯現(xiàn)(黑色區(qū)域)。圖3.感染24小時后，對未感染和Xcv感染的辣椒ECW_30R(Bs3)和ECW(Bs3_E) 葉片的cDNA的半定量逆轉(zhuǎn)錄_聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。標(biāo)出了在所給的Xcv菌株中表達(dá)的 aVrBS3-樣基因(括號中)。擴(kuò)增延伸因子Ia(EFla)作為對照。圖4A.衍生自Bs3和Bs3_E啟動子序列、用于電泳遷移率變動分析(EMSA)的探 針。編號是相對于轉(zhuǎn)錄起始位點。Bs3-E啟動子中13bp-插入物以粗體表示。生物素-標(biāo) 記的DNA片段的位置以啟動子序列上方和下方的線條表示。探針I(yè)和II分別對應(yīng)于Bs3 和Bs3-E啟動子，而探針I(yè)II對應(yīng)于兩種啟動子中的相同區(qū)域。圖4B. 6%非變性聚丙烯酰胺凝膠中以AvrBs3和Bs3_衍生的探針或Bs3_E_衍生 的探針的EMSA。蛋白的量以fmol表示。結(jié)合的探針和游離探針的位置在左側(cè)表示。圖4C. AvrBs3與不同量的(以fmol)未標(biāo)記的競爭物探針之間的EMSA競爭試驗。圖4D.以AvrBs3特異性抗體對來自以Xcv野生型(WT avrBs3)菌株或同基因III 型分泌缺陷型Xcv突變菌株(AhrcV avrBs3)感染的ECW_30R(Bs3)和ECW(Bs3_E)植物的 提取物進(jìn)行染色質(zhì)免疫沉淀。接種12小時后收集葉片。在免疫沉淀之前(輸入)或?qū)γ?疫沉淀的材料(IP)進(jìn)行32、34和36個循環(huán)的半定量PCR。由于Bs3_E啟動子中13_bp的 插入物，ECW-30R(Bs3)和ECW(Bs3_E)衍生的PCR產(chǎn)物的大小不同。圖5.辣椒Bs3 cDNA的核苷酸和預(yù)測的氨基酸序列。核苷酸序列通過對來自辣椒 栽培品種ECW-30R的RNA進(jìn)行RT-PCR和RACE (快速擴(kuò)增cDNA端)來獲得。RNA從以表達(dá) avrBs3的Xcv接種的葉片分離。翻譯終止密碼子標(biāo)以星號(* )。通過與基因組序列比較 而鑒定的內(nèi)含子的位置以三角形標(biāo)出。栽培品種ECW-30R中存在的鳥嘌呤核苷酸被栽培品種ECW(加下劃線)中的胸苷代替，導(dǎo)致預(yù)測的ECW蛋白中亮氨酸改變?yōu)楸奖彼?。為黃素單加氧酶(FMO)特征的序列基序標(biāo)以灰色框。這些基序中的保守殘基以粗體方式顯示。I 是FAD結(jié)合基序(GXGXXG) ；II是FMO鑒定序列基序(FXGXXXHXXX[Y/F]) ；III是NADPH結(jié)合 結(jié)構(gòu)域(GXGXX[G/A])，IV 是 “FATGY” 結(jié)構(gòu)域([F/L]ATGY)。圖6.預(yù)測的辣椒Bs3蛋白與代表性FMO的比對。FAD結(jié)合結(jié)構(gòu)域(GXGXXG)、FMO 鑒定序列基序(FXGXXXHXXX [Y/F])、NADPH結(jié)合結(jié)構(gòu)域(GXGXX [G/A])和保守的FATGY基 序([L/F]ATGY)的保守殘基的位置標(biāo)為星號(* )。來自擬南芥(A.thaliana) (At)、人類 (Homo sapiens) (Hs)和釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) (Sc)的蛋白的名稱與其登 錄號(括號中)一起提供。以ClustalW進(jìn)行比對。使用Boxshade對相同氨基酸(黑色背 景上白色字體)和> 50%序列中存在的相似氨基酸(灰色背景上)加陰影。破折號(_)表 示缺口。圖7.包含來自擬南芥(At)、釀酒酵母(S. cerevisiae) (Sc)、人類(Hs)和預(yù)測的 辣椒(Ca)的Bs3蛋白的所有預(yù)測的FMO的系統(tǒng)發(fā)生樹。蛋白的名稱與其登錄號(括號中) 一起提供。包含預(yù)測的Bs3蛋白和擬南芥YUCCA-樣蛋白的單系類群標(biāo)為灰色框。白色框 標(biāo)出最接近的Bs3-相關(guān)YUCCA蛋白(還參見圖8)。樹的分支長度與趨異度成比例。0.1 刻度代表10%的改變。以ClustalW比對氨基酸序列，以TreeView展示系統(tǒng)發(fā)生樹。圖8.預(yù)測的Bs3蛋白和來自擬南芥的YUCCA-樣蛋白結(jié)構(gòu)上不同。與預(yù)測的Bs3 蛋白緊密相關(guān)的來自擬南芥的YUCCA-樣蛋白的比對。一段72殘基在YUCCA-樣擬南芥蛋 白中保守，但在預(yù)測的Bs3蛋白中不存在(開始于YUCCA03的殘基240)。FAD-結(jié)合結(jié)構(gòu)域 (GXGXXG)、FM0-鑒定序列基序(FXGXXXHX)(X[Y/F])、NADPH-結(jié)合結(jié)構(gòu)域(GXGXX[G/A])和保 守的FATGY基序([L/F]ATGY)的保守殘基的位置標(biāo)為星號(* )。位于相應(yīng)的基因的外顯 子-外顯子聯(lián)結(jié)點的氨基酸標(biāo)為小寫的綠色。蛋白的名稱與其登錄號(括號中)一起提供。 以ClustalW進(jìn)行比對。使用Boxshade對相同氨基酸(黑色背景上白色字體)和50%相似 的氨基酸(灰色背景上的白色)加陰影。破折號(_)表示缺口。圖9.感染24小時后對未感染的和Xcv-感染的辣椒ECW-30R(Bs3)和ECW(Bs3_E) 葉片的cDNA進(jìn)行半定量逆轉(zhuǎn)錄_聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。標(biāo)出在提供的Xcv菌株中表達(dá)的 avrBs3-樣基因(括號中)。在真核蛋白合成抑制劑放線菌酮存在(+)或不存在(_)時進(jìn) 行接種。擴(kuò)增延伸因子Ia(EFla)作為對照。圖10.根癌農(nóng)桿菌瞬時轉(zhuǎn)化本氏煙草兩天后進(jìn)行GFP-示蹤的Bs3的共聚焦成像。 Bs3-GFP和avrBs3分別處于Bs3和花椰菜花葉病毒35S啟動子的轉(zhuǎn)錄控制下。圖11. Bs3和Bs3_E等位基因的組成型表達(dá)觸發(fā)Avr-獨立性HR。Bs3和Bs3_E的 編碼區(qū)在其自身啟動子(Bs3和Bs3-E)的控制下或在花椰菜花葉病毒35S啟動子(35S :Bs3 和35S:Bs3-E)的控制下表達(dá)。Bs3等位基因單獨表達(dá)或與描述的avr基因一起表達(dá)。經(jīng) 由根癌農(nóng)桿菌瞬時轉(zhuǎn)化(0D_ = 0. 8)，將基因遞送到本氏煙草葉片中。浸潤四天后，清理葉 片以使過敏反應(yīng)顯現(xiàn)(黑色區(qū)域)。圖12A.GFP、GFP_融合構(gòu)建體或空的T-DNA (對照)由根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化到本氏煙草 葉片中。Bs3和所描述的Bs3突變體處于Bs3啟動子(Bs3)或花椰菜花葉病毒35S啟動子 (35S :Bs3)的轉(zhuǎn)錄控制下。Bs3單獨表達(dá)或與如所示的avrBs3—起表達(dá)。虛線標(biāo)出接種區(qū) 域。浸潤四天后，清理葉片以使過敏反應(yīng)顯現(xiàn)(黑色區(qū)域)。
圖12B.以所示的根癌農(nóng)桿菌菌株浸潤40小時后，來自本氏煙草葉片的蛋白提取 物。蛋白由SDS-PAGE分離并使用GFP-特異性抗體由免疫印跡法分析。分子質(zhì)量在右側(cè)以 千道爾頓(kDa)提供。箭頭表示GFP和Bs3-GFP融合蛋白的預(yù)料大小。圖13A.以AvrBs3和AvrBs3Dr印16的電泳遷移率變動分析(EMSA)。蛋白量以 fmol給出。DNA探針I(yè)和II的核苷酸序列展示在圖4A。結(jié)合的探針和游離探針的位置由 左手邊圖上的箭頭標(biāo)出。圖13B.與Bs3_衍生的探針DNA的EMSA競爭測定。圖13C.與Bs3-E_衍生的探針DNA的競爭性測定。圖14.XcV感染辣椒栽培品種ECW-123R(包含R基因Bsl、Bs2和Bs3)10小時收集 的未接種的和Xcv-接種的葉片的RT-PCR。標(biāo)出在給出的Xcv菌株中表達(dá)的avr基因。延 伸因子Ia(EFla)表達(dá)用于使每個樣品中Bs3轉(zhuǎn)錄物的水平標(biāo)準(zhǔn)化。序列表列在所附的序列表的核苷酸和氨基酸序列使用核苷酸堿基的標(biāo)準(zhǔn)字母縮寫和氨 基酸的三字母編碼來顯示。核苷酸序列遵循開始于序列5’端并向前進(jìn)行(即，從每行的左 側(cè)向右側(cè))到3’端的標(biāo)準(zhǔn)慣例。只顯示每條核酸序列的一條鏈，但互補(bǔ)鏈理解為通過對所 展示的鏈的任何參考被包括。氨基酸序列遵循開始于序列氨基末端并向前進(jìn)行(即，從每 行的左側(cè)向右側(cè))到羧基末端的標(biāo)準(zhǔn)慣例。SEQ ID NO 1列出Bs3基因的Bs3等位基因的全長編碼序列。SEQ ID NO 2列出由SEQ ID NO 1編碼的Bs3氨基酸序列。SEQ ID NO 3列出Bs3基因的Bs3等位基因減去終止密碼子的全長編碼序列。SEQ ID NO 3的核苷酸1-1026對應(yīng)于SEQ ID NO 1的核苷酸1-1026。如果期望，終止密碼子可 被加到SEQ ID NO :3的核苷酸序列或缺少終止密碼子的任何其它編碼序列的3’端。這樣 的終止密碼子包括例如TAA、TAG和TGA。SEQ ID NO 4列出Bs3基因的Bs3等位基因的基因組序列。SEQ ID NO 5列出Bs3基因的Bs3等位基因的啟動子的核苷酸序列，并對應(yīng)于SEQ ID NO 4 的核苷酸 1-1087。SEQ ID NO 6列出Bs3基因的Bs3等位基因的啟動子的344bp片段。該片段由列 在SEQ ID NO 5的啟動子序列的最后344bp組成。SEQ ID NO 7列出Bs3基因的Bs3等位基因的啟動子的166bp片段。該片段由列 在SEQ ID NO 5的啟動子序列的最后166bp組成。SEQ ID NO :8列出Bs3基因的Bs3等位基因的啟動子的90bp片段。該片段由列 在SEQ ID NO 5的啟動子序列的最后90bp組成。SEQ ID NO 9列出Bs3基因的Bs3_E等位基因的全長編碼序列。SEQ ID NO 10列出由SEQ ID NO 9編碼的Bs3_E氨基酸序列。SEQ ID NO 11列出Bs3基因的Bs3_E等位基因減去終止密碼子的全長編碼序列。 SEQ ID NO 11的核苷酸1-1026對應(yīng)于SEQ ID NO 9的核苷酸1-1026。如果期望，終止密 碼子可被加到SEQ ID NO :3的核苷酸序列或缺少終止密碼子的任何其它編碼序列的3’端。 這樣的終止密碼子包括例如TAA、TAG和TGA。SEQ ID NO 12列出Bs3基因的Bs3_E等位基因的基因組序列。
SEQ ID NO 13列出Bs3基因的Bs3_E等位基因的啟動子的核苷酸序列，并對應(yīng)于 SEQ ID NO 12 的核苷酸 1-1100。SEQ ID NO :14列出Bs3基因的Bs3_E等位基因的啟動子的357bp片段。該片段 由列在SEQ ID NO 13的啟動子序列的最后357bp組成。SEQ ID NO :15列出Bs3基因的Bs3_E等位基因的啟動子的179bp片段。該片段 由列在SEQ ID NO 13的啟動子序列的最后179bp組成。SEQ ID NO 16列出Bs3基因的Bs3_E等位基因的啟動子的90bp片段。該片段由 列在SEQ ID NO 13的啟動子序列的最后90bp組成。SEQ ID NO 17列出UPA盒的共有序列。SEQ ID NO 18列出命名為Al-fwcH^R的PCR引物的核苷酸序列。SEQ ID NO 19列出命名為B5_rev_PR的PCR引物的核苷酸序列。SEQ ID NO 20列出命名為final-entry-01-fwd的PCR引物的核苷酸序列。SEQ ID NO 21列出命名為final-entry-02-rev的PCR引物的核苷酸序列。SEQ ID NO 22列出命名為Cand-7_01-fwd的PCR引物的核苷酸序列。SEQ ID NO 23列出命名為Cand-7-Ol-rev的PCR引物的核苷酸序列。SEQ ID NO 24列出命名為RS-EFrt-Fl的PCR引物的核苷酸序列。SEQ ID NO 25列出命名為RS-EFrt-Rl的PCR引物的核苷酸序列。發(fā)明詳述本發(fā)明公開來自辣椒的R基因Bs3基因的兩種等位基因的分離和測序。已知Bs3 基因賦予對細(xì)菌病原體野油菜黃單胞菌皰病致病變種(Xcv)抗性。因此，本發(fā)明提供包 含Bs3核苷酸序列的分離的核酸分子。這種核苷酸序列可用于產(chǎn)生具有對病原體，尤其 是細(xì)菌病原體，更尤其是黃單胞菌屬(Xanthomonas spp.)，甚至更尤其是野油菜黃單胞菌 (Xanthomonas campestris)，特別尤其是Xcv增加的抗性的轉(zhuǎn)化的植物。因此，本發(fā)明提供 增強(qiáng)或增加植物對植物病原體的抗性的方法。本發(fā)明提供分離的Bs3多肽和包括cDNA序列、基因序列和啟動子序列的Bs3核酸 分子。原型Bs3序列是辣椒的序列，本發(fā)明提供這些序列用于產(chǎn)生對野油菜黃單胞菌導(dǎo)致 的疾病諸如細(xì)菌性斑點病具有增強(qiáng)的抗性的轉(zhuǎn)基因植物諸如辣椒和番茄植物的用途。辣椒Bs3基因的Bs3等位基因的核苷酸序列列在SEQ ID NO :4。這一核苷酸序列 包含2個內(nèi)含子和3個外顯子以及啟動子區(qū)域中的UPA盒。cDNA序列列在SEQ ID NO :1。 Bs3基因的開放讀碼框編碼342氨基酸的Bs3蛋白。Bs3蛋白的氨基酸序列列在SEQ ID NO 2。Bs3等位基因的1087bp啟動子的核苷酸序列列在SEQ ID NO :5。包含344、166和90bp 的啟動子5，截短的核苷酸序列分別列在SEQ IDNO :6-8。辣椒Bs3基因的Bs3-E等位基因的核苷酸序列列在SEQ ID N0:12。類似Bs3等 位基因，這一核苷酸序列包含2個內(nèi)含子和3個外顯子以及啟動子區(qū)域中的UPA盒。cDNA 序列列在SEQ ID NO :9。開放讀碼框編碼342個氨基酸的Bs3-E蛋白。Bs3_E蛋白的氨基 酸序列列在SEQ ID NO :10o Bs3-E啟動子列在SEQ ID NO :13。包含357,179和90bp的啟 動子5，截短的核苷酸序列分別列在SEQ ID NO 14-16。在本公開中，除非另外指明或從上下文容易看出來，否則提及“Bs3基因”意為涵蓋 Bs3基因的兩種等位基因。類似地，除非另外指明或從上下文容易看出來，否則提及“Bs3蛋白”意為涵蓋由Bs3基因的兩種等位基因編碼的蛋白?！矫?，本發(fā)明提供包含編碼Bs3蛋白的核苷酸序列的分離的核酸分子。這種分離的核酸分子可用于在植物、植物部分、植物細(xì)胞或其它非人類宿主細(xì)胞中表達(dá)Bs3蛋白 或增加Bs3蛋白表達(dá)的方法中。由于Bs3蛋白與已知的FMO同源，在植物、植物部分、植物 細(xì)胞或其它非人類宿主細(xì)胞中表達(dá)Bs3蛋白或增加Bs3蛋白的表達(dá)將不僅導(dǎo)致Bs3蛋白水 平增加，還可能導(dǎo)致FMO活性在植物、植物部分、植物細(xì)胞或其它非人類宿主細(xì)胞中增加。對于在植物或植物細(xì)胞中表達(dá)Bs3蛋白，本發(fā)明的方法包括以編碼Bs3蛋白的本 發(fā)明多核苷酸轉(zhuǎn)化植物。這樣分離的核苷酸分子可以可操作地連接于驅(qū)動在植物細(xì)胞中表 達(dá)的啟動子。本領(lǐng)域中已知的任何啟動子可用于本發(fā)明的方法，包括但不限于，病原體誘導(dǎo) 型啟動子、損傷誘導(dǎo)型啟動子、組織偏好啟動子和化學(xué)調(diào)節(jié)啟動子。啟動子的選擇將取決于 轉(zhuǎn)化的植物中表達(dá)的期望時機(jī)和位置或其它因素。在本發(fā)明一個實施方案，采用天然Bs3 啟動子_以其天然基因組連接于下游Bs3基因序列或作為進(jìn)一步包含Bs3編碼序列的重組 核酸分子的部分_來增加植物中Bs3蛋白響應(yīng)于植物中Xcv的存在的表達(dá)或?qū)vrBs3蛋 白向植物的引入或在植物中編碼AvrBs3的核酸分子的共表達(dá)。公認(rèn)植物葉片中Bs3蛋白 的這種增加將觸發(fā)葉片中HR。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，該啟動子是包含列在SEQ ID NO 5的核苷酸序列的Bs3啟動子或包含列在SEQ ID NO 6和7的核苷酸序列的截短的Bs3啟 動子之一。本發(fā)明進(jìn)一步提供用于增加植物對至少一種植物病原體的抗性的方法。該方法包 括以編碼Bs3蛋白的本發(fā)明的核苷酸分子轉(zhuǎn)化至少一種植物細(xì)胞。該方法可進(jìn)一步包括再 生轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞為轉(zhuǎn)化的植物。在本發(fā)明一個實施方案，該分離的核苷酸分子包含列在 SEQ ID N0:4的Bs3基因序列。公認(rèn)的是，列在SEQ ID NO :4的Bs3基因的核苷酸序列包 含Bs3基因的啟動子，因此對于在目標(biāo)植物中表達(dá)不需要另外的啟動子。進(jìn)一步公認(rèn)的是， 對于指引在植物中病原體誘導(dǎo)型(或AvrBs3-誘導(dǎo)型)基因表達(dá)，并不都需要SEQ ID NO 4中翻譯開始部分5，的1087bp。進(jìn)一步公認(rèn)的是，當(dāng)從包含列在SEQ ID NO 4的核苷酸序 列的核苷酸分子省略SEQ ID NO 4的5，端的前783或921bp時，該Bs3啟動子對于植物 病原體誘導(dǎo)型基因表達(dá)是功能性的。在其它實施方案，本發(fā)明的分離的核酸分子可操作地 連接于能夠驅(qū)動植物中基因表達(dá)的啟動子。在這樣的實施方案，該分離的核苷酸分子編碼 Bs3蛋白。優(yōu)選地，該啟動子是病原體誘導(dǎo)型啟動子，尤其是驅(qū)動響應(yīng)于目標(biāo)病原體或其部 分或組分(如，Avr蛋白)表達(dá)的啟動子。優(yōu)選的啟動子包括，例如，列在SEQ ID NO 5的 Bs3啟動子和列在SEQID N0:6和7的Bs3啟動子的截短物。這樣優(yōu)選的啟動子包含對應(yīng) 于 SEQ ID NO 5 的核苷酸 968-982、SEQ ID NO 6 的核苷酸 225-239、和 SEQ ID NO 7 的核 苷酸47-61的Bs3UPA盒。其它優(yōu)選的啟動子包括列在SEQ ID NO 5的Bs3啟動子的任何功能片段，包含列 在SEQ ID NO 5的核苷酸968-982的Bs3UPA盒。尤其優(yōu)選的是作為Bs3啟動子截短物、尤 其是5’截短物的Bs3啟動子的功能片段，包括但不限于列在SEQ ID NO 6和7的Bs3啟動 子的截短物。另外，本發(fā)明涵蓋包含SEQ ID NO 5的核苷酸968-982的Bs3UPA盒。除了 Bs3啟動子和其功能片段，本發(fā)明進(jìn)一步提供Bs3_E啟動子和其功能片段。 Bs3-E啟動子和其功能片段可用于本文公開的方法。Bs3-E啟動子的功能片段包含啟動子 活性。優(yōu)選地，這樣的功能片段是病原體誘導(dǎo)型啟動子。這樣的病原體誘導(dǎo)型啟動子能夠驅(qū)動或增加可操作地連接的多核苷酸響應(yīng)于目標(biāo)病原體或其部分或組分(如，Avr蛋白) 的表達(dá)。優(yōu)選的啟動子包括，例如，列在SEQ ID NO :13的Bs3-E啟動子和列在SEQ ID NO: 14和15的Bs3-E啟動子的截短物。這樣優(yōu)選的啟動子包含對應(yīng)于SEQ ID NO 13的核苷 酸 968-995、SEQ IDNO 14 的核苷酸 225-252、和 SEQ ID NO 15 的核苷酸 47-74 的 Bs3_EUPA品。其它優(yōu)選的啟動子包括列在SEQ ID NO 13的Bs3_E啟動子的任何功能片段，包含 列在 SEQ ID NO 13 的核苷酸 968-995 的 Bs3_EUPA 盒。與 Bs3UPA 盒(TATATAAACCTAACC ； SEQ ID NO :5的核苷酸968-982)相比時，該Bs3-E UPA盒具有13個另外核苷酸的插入 (TATATAAACCT ctctattccactaAACC ；插入是小寫體；SEQ IDNO 13 的核苷酸 968-995)。尤 其優(yōu)選的是為Bs3-E啟動子的截短物、尤其是5’截短物的Bs3-E啟動子的功能片段，包括 但不限于列在SEQID NO 14和15的Bs3_E啟動子的截短物。另外本發(fā)明涵蓋包含SEQID NO 13 的核苷酸 968-995 的 Bs3_E UPA 盒。用于增加植物對至少一種植物病原體的抗性的方法可用于增加或增強(qiáng)植物、尤其 是農(nóng)業(yè)植物或作物植物對植物病原體的抗性。本發(fā)明的方法可用于包括單子葉植物和雙子 葉植物的任何植物物種。優(yōu)選的植物包括茄科植物，諸如，例如辣椒和番茄。在用于增加植物對至少一種植物病原體的抗性的方法的優(yōu)選實施方案，該植物病 原體是Xcv。然而，本發(fā)明的方法不限于植物病原體Xcv。其它植物病原體包括但不限于其 它黃單胞菌。“黃單胞菌”是指是黃單胞菌屬這一屬中的成員的細(xì)菌物種。在其它實施方案，該方法可牽涉另外的R基因以增加植物對單獨植物病原體的抗 性或增加植物對不同植物病原體的抗性。例如，可以用如上所述的編碼Bs3基因的分離的 核苷酸分子轉(zhuǎn)化包含Bs2抗性基因的辣椒植物以增加對Xcv的抗性?？蛇x地，可分別地用 Bs2和Bs3基因或以單個多核苷酸構(gòu)建體的部分轉(zhuǎn)化該植物。此前已經(jīng)公開了 Bs2的核苷 酸序列。參見美國專利第6，262，343和6，762，285號；其每一個通過引用并入本文。在另一實施方案，該方法可包括用可操作地連接于編碼Bs3蛋白的本發(fā)明多核苷 酸的病原體誘導(dǎo)型啟動子轉(zhuǎn)化植物。本發(fā)明不依賴于特定的病原體誘導(dǎo)型啟動子。優(yōu)選 地，該病原體誘導(dǎo)型啟動子是在誘導(dǎo)性病原體或其誘導(dǎo)性部分或組分不存在時指引可操作 地連接的Bs3多核苷酸表達(dá)很少或不表達(dá)的啟動子。公認(rèn)的是，通過將Bs3多核苷酸置于 這樣的病原體誘導(dǎo)型啟動子控制下，可在響應(yīng)于該啟動子對其是響應(yīng)性的一種或多種任何 病原體的植物中誘導(dǎo)Bs3多核苷酸的表達(dá)。進(jìn)一步公認(rèn)的是，在植物中從這樣的Bs3多核 苷酸表達(dá)Bs3蛋白可引起細(xì)胞死亡。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，從在植物上病原體攻擊的 部位或靠近該部位是活性的病原體誘導(dǎo)型啟動子的Bs3蛋白表達(dá)導(dǎo)致病原體攻擊部位或 靠近該部位的細(xì)胞死亡，且這樣的細(xì)胞死亡抑制或以其它方式延遲植物疾病的發(fā)展。本發(fā)明的Bs3編碼序列進(jìn)一步可用于導(dǎo)致目標(biāo)植物部分中細(xì)胞死亡的方法。這樣 的目標(biāo)植物部分可以是，例如植物細(xì)胞或細(xì)胞、植物組織、植物器官、種子或其部分。目標(biāo) 植物部分中Bs3編碼序列的表達(dá)引起B(yǎng)s3蛋白產(chǎn)生，該蛋白是導(dǎo)致目標(biāo)植物部分死亡的黃 素-依賴性單加氧酶。例如，通過在引起或支持花粉的生長和發(fā)育的花粉細(xì)胞或其它細(xì)胞 或組織、尤其是雄性生殖組織中驅(qū)動基因表達(dá)的可操作地連接的啟動子的指引下表達(dá)Bs3 編碼序列，這樣的方法可用于制備雄性不育植物。通過減少從雜交作物植物的母系親本植 物除去雄性生殖部分或器官的需要，這樣的雄性不育植物可用于產(chǎn)生雜交作物植物。
導(dǎo)致目標(biāo)植物部分中細(xì)胞死亡的方法包括用多核苷酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，所述 多核苷酸構(gòu)建體包含可操作地連接本發(fā)明的Bs3編碼序列的驅(qū)動在植物細(xì)胞中表達(dá)的啟 動子。這樣的啟動子指引目標(biāo)植物部分中Bs3的表達(dá)。優(yōu)選地，該啟動子是在期望細(xì)胞死 亡的目標(biāo)植物部分以外的植物細(xì)胞或部分指引很少表達(dá)或不表達(dá)的啟動子。該方法進(jìn)一步 包括再生轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞為轉(zhuǎn)化的植物。在轉(zhuǎn)化的植物中，在目標(biāo)植物部分中表達(dá)本發(fā)明 的Bs3編碼序列之后，細(xì)胞死亡發(fā)生在目標(biāo)植物部分中。細(xì)胞死亡可發(fā)生在目標(biāo)植物部分 中的所有細(xì)胞中或可發(fā)生在目標(biāo)植物部分中細(xì)胞子集中或甚至發(fā)生在單細(xì)胞。另一方面，本發(fā)明提供分離的核酸分子，其包含控制或調(diào)節(jié)植物中基因表達(dá)的Bs3 基因的區(qū)域的核苷酸序列(也稱為啟動子)。這樣的啟動子可用于控制植物、植物細(xì)胞或 植物部分中Bs3基因或任何其它目標(biāo)基因的表達(dá)。公認(rèn)的是，本發(fā)明的啟動子是在Xcv或 AvrBs3不存在時指引可操作地連接的核苷酸序列表達(dá)很少或不表達(dá)、但在表達(dá)avrBs3的 Xcv存在時提供高水平表達(dá)的誘導(dǎo)型啟動子。本發(fā)明的啟動子包括包含列在SEQ ID NO 5-7 和13-15的核苷酸序列的啟動子，和包含列在SEQ ID NO :5_7和13-15的核苷酸序列的包 括啟動子的病原體誘導(dǎo)型啟動子活性的片段和其變體。因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供用于在植物、植物部分或植物細(xì)胞表達(dá)目標(biāo)基因的方法。 該方法包括可操作地連接本發(fā)明的啟動子于目標(biāo)基因，從而產(chǎn)生多核苷酸構(gòu)建體。這樣的 目標(biāo)基因?qū)⒁蕾囉谄谕慕Y(jié)果，并可包括編碼目標(biāo)蛋白和/或RNA的核苷酸序列。該方法 進(jìn)一步包括用該多核苷酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化至少一種植物細(xì)胞。另外該方法可包括再生轉(zhuǎn)化的植 物細(xì)胞為轉(zhuǎn)化的植物。當(dāng)將植物、植物部分或植物細(xì)胞暴露于Xcv和/或AvrBs3后誘導(dǎo)啟 動子時，表達(dá)目標(biāo)基因?；趯s3轉(zhuǎn)錄物表達(dá)的研究，預(yù)料目標(biāo)基因的表達(dá)將在Xcv感染 或AvrBs3處理約6小時內(nèi)可檢測，在感染后約12小時達(dá)到峰值，并保持該水平直到感染或 處理后約24小時。目標(biāo)基因的表達(dá)可由本領(lǐng)域已知的用于在RNA、蛋白和/或代謝(如，酶 活性)水平測量基因表達(dá)的任何方法確定。監(jiān)控基因表達(dá)變化的方法包括，例如，Northern 印跡法、Western印跡法和酶測定?！澳繕?biāo)基因”是指當(dāng)可操作地連接于啟動子時可被表達(dá)的任何核苷酸序列。本發(fā)明 的目標(biāo)基因可以，但不必，編碼一種蛋白。除非另外指明或從上下文容易看出來，當(dāng)說明本 發(fā)明的目標(biāo)基因可操作地連接于本發(fā)明的啟動子時，該目標(biāo)基因本身不包含功能啟動子。另一方面，本發(fā)明提供用于在植物、植物部分或植物細(xì)胞中表達(dá)基因的方法。該方 法利用AvrBs3誘導(dǎo)可操作地連接于Bs3啟動子的目標(biāo)基因表達(dá)的能力，并可用于實現(xiàn)目 標(biāo)基因在植物、或其部分或細(xì)胞中高水平表達(dá)。該方法包括可連接到同一核酸分子或不連 接、作為兩個單獨的核酸分子的第一多核苷酸構(gòu)建體和第二多核苷酸構(gòu)建體。第一多核苷 酸構(gòu)建體包含可操作地連接于AvrBs3的編碼序列(EMBL登錄號X16130. 1 ；GenBank登錄號 CAA34257)的本發(fā)明的第一啟動子。第二多核苷酸構(gòu)建體包含可操作地連接于目標(biāo)基因的 本發(fā)明的第二啟動子。第一啟動子可以是能夠在植物或其部分或細(xì)胞中指引AvrBs3編碼 序列表達(dá)的任何啟動子，包括但不限于，組成型啟動子、損傷誘導(dǎo)型啟動子、病原體誘導(dǎo)型 啟動子、化學(xué)調(diào)節(jié)啟動子、化學(xué)誘導(dǎo)型啟動子、組織偏好啟動子、和本發(fā)明的Bs3啟動子。第 二啟動子是本發(fā)明的Bs3啟動子。該方法包括產(chǎn)生包含第一多核苷酸構(gòu)建體和第二多核苷 酸構(gòu)建體兩者的轉(zhuǎn)化的植物或轉(zhuǎn)基因植物。在本發(fā)明的該方法的一個實施方案，第一啟動子是化學(xué)誘導(dǎo)型啟動子，且轉(zhuǎn)化的植物包含如上述的第一多核苷酸構(gòu)建體和第二多核苷酸構(gòu)建體兩者。在這樣轉(zhuǎn)化的植物首 先暴露于化學(xué)誘導(dǎo)物之后，AvrBs3編碼序列從第一構(gòu)建體表達(dá)的增加將導(dǎo)致在植物細(xì)胞中 產(chǎn)生AvrBs3蛋白，且這樣的AvrBs3蛋白將引起第二多核苷酸構(gòu)建體中目標(biāo)基因的表達(dá)，導(dǎo) 致目標(biāo)基因的基因產(chǎn)物高水平表達(dá)。這樣的基因產(chǎn)物可以是例如蛋白或RNA。在本發(fā)明的該方法的另一個實施方案，第一啟動子是本發(fā)明的Bs3啟動子，且轉(zhuǎn)化的植物包含如上述的第一多核苷酸構(gòu)建體和第二多核苷酸構(gòu)建體兩者。在這樣轉(zhuǎn)化的植 物首先暴露于Xcv或AvrBs3之后，AvrBs3編碼序列從第一構(gòu)建體表達(dá)的增加將導(dǎo)致在植 物細(xì)胞中產(chǎn)生AvrBs3蛋白，且這樣的AvrBs3蛋白將引起第二多核苷酸構(gòu)建體中目標(biāo)基因 的表達(dá)，導(dǎo)致目標(biāo)基因的基因產(chǎn)物高水平表達(dá)。這樣的基因產(chǎn)物可以是例如蛋白或RNA。包含第一多核苷酸構(gòu)建體和第二多核苷酸構(gòu)建體兩者的植物可通過本領(lǐng)域已知 的任何方法產(chǎn)生。例如，這樣的植物可由以下步驟產(chǎn)生(1)以包含兩種構(gòu)建體的單個核酸 分子轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，或通過以各自在分開的核酸分子上的第一多核苷酸構(gòu)建體和第二多核 苷酸構(gòu)建體共轉(zhuǎn)化細(xì)胞，并(2)再生包含第一多核苷酸構(gòu)建體和第二多核苷酸構(gòu)建體兩者 的轉(zhuǎn)化的植物?？蛇x地，可產(chǎn)生包含第一多核苷酸構(gòu)建體的第一轉(zhuǎn)化的植物。將第二多核 苷酸構(gòu)建體引入第一轉(zhuǎn)化的植物的細(xì)胞并從其再生包含第一多核苷酸構(gòu)建體和第二多核 苷酸構(gòu)建體兩者的第二轉(zhuǎn)化的植物。公認(rèn)的是，在這樣的連續(xù)轉(zhuǎn)化中，可將第二多核苷酸構(gòu) 建體引入植物細(xì)胞以產(chǎn)生第一轉(zhuǎn)化的植物，隨后將第一多核苷酸構(gòu)建體引入第一植物的細(xì) 胞，隨后產(chǎn)生包含兩種構(gòu)建體的第二轉(zhuǎn)化的植物。另一種選擇包括有性生殖來組合兩種構(gòu) 建體到單株植物中。在該選擇中，將包含第一多核苷酸構(gòu)建體的第一轉(zhuǎn)化的植物與包含第 二多核苷酸構(gòu)建體的第二轉(zhuǎn)化的植物雜交，并允許產(chǎn)生包含第一多核苷酸構(gòu)建體和第二多 核苷酸構(gòu)建體兩者的后代或種子。本發(fā)明涵蓋分離的或大致純化的多核苷酸或蛋白組合物?！胺蛛x的”或“純化的”多 核苷酸或蛋白或其生物活性部分大致或基本上不含在其天然產(chǎn)生的環(huán)境通常發(fā)現(xiàn)伴隨該 多核苷酸或蛋白與該多核苷酸或蛋白相互作用的組分。因此，分離的或純化的多核苷酸或 蛋白大致不含其它細(xì)胞材料、或由重組技術(shù)產(chǎn)生時不含培養(yǎng)基、或大致不含化學(xué)合成時的 化學(xué)前體或其它化學(xué)物。最佳地，“分離的”多核苷酸不含在該多核苷酸所來自的生物體的 基因組DNA中天然地在該多核苷酸(最佳地蛋白編碼序列)側(cè)翼的序列(即，位于該多核 苷酸的5’和3’端的序列)。例如，在不同實施方案，該分離的多核苷酸可包含少于約5kb、 4kb、3kb、2kb、lkb、0. 5kb、或0. Ikb的在該多核苷酸所來自的細(xì)胞的基因組DNA中天然地 在該多核苷酸側(cè)翼的核苷酸序列。大致不含細(xì)胞材料的蛋白包括具有少于約30%、20%、 10%、5%或(按干重計)污染蛋白的蛋白制品。當(dāng)重組地產(chǎn)生本發(fā)明的蛋白或其生物 活性部分時，最佳地培養(yǎng)基代表少于約30%、20%、10%、5%或(按干重計)的化學(xué)前 體或非目標(biāo)蛋白化學(xué)物。公開的多核苷酸和從其編碼的蛋白的片段和變體也被本發(fā)明涵蓋?！捌巍笔侵?多核苷酸的部分或氨基酸序列的部分以及從其編碼的蛋白。包含編碼序列的多核苷酸片段 可能編碼保持天然蛋白的生物活性、因而保持黃素_依賴性單加氧酶活性的蛋白片段。包 含啟動子序列的多核苷酸片段保持天然啟動子的生物活性，因此保持Bs3啟動子活性?？?選地，可用作雜交探針的多核苷酸片段通常不編碼保持生物活性的蛋白或不保持啟動子活 性。因此，核苷酸序列的片段可能從至少約20核苷酸、約50核苷酸、約100核苷酸并達(dá)本發(fā)明的全長多核苷酸的范圍變化。除非另外指明或從上下文看出，"Bs3啟動子活性”意為指本文公開的Bs3啟動子或Bs3-E啟動子的啟動子活性。類似地，除非另外指明或從上下文看出，否則術(shù)語‘‘Bs3多 核苷酸”和“Bs3蛋白”(和類似術(shù)語)意為分別指Bs3基因或Bs3-E基因的多核苷酸和Bs3 蛋白或Bs3-E蛋白。除非另外指明或從上下文看出，否則這樣的術(shù)語還涵蓋本文公開的Bs3 和Bs3-E核苷酸以及氨基酸序列的變體和片段。編碼本發(fā)明的Bs3蛋白的生物活性部分的Bs3多核苷酸片段將編碼至少15、25、 30、50、100、150、200、250或300個連續(xù)氨基酸，或達(dá)本發(fā)明的全長Bs3蛋白(例如，對于SEQ ID NO :2和10兩者的342個氨基酸)中存在的氨基酸的總數(shù)。可用作雜交探針或PCR引 物的Bs3多核苷酸片段通常不必編碼Bs3蛋白或Bs3啟動子的生物活性部分。因此，Bs3多核苷酸片段可能編碼Bs3蛋白或Bs3啟動子的生物活性部分，或其 可以是可用作使用下文公開的方法中的雜交探針或PCR引物的片段?？赏ㄟ^分離本發(fā)明 的Bs3多核苷酸之一的部分，表達(dá)Bs3蛋白的編碼部分(如，通過體外重組表達(dá))，并評價 Bs3蛋白的編碼部分的活性來制備Bs3蛋白的生物活性部分。通過分離包含Bs3啟動子的 本發(fā)明的Bs3多核苷酸之一的部分，可操作地連接啟動子的該部分于核苷酸序列(如編碼 報告基因的核苷酸序列)，并通過當(dāng)將可操作地連接的啟動子部分和核苷酸序列引入植物 細(xì)胞時監(jiān)控核苷酸序列的表達(dá)來評價啟動子部分的活性，可制備Bs3啟動子的生物活性部 分。為Bs3核苷酸序列片段的多核苷酸包含至少16、20、50、75、100、125、150、175、200、250、 300、350、400、450、500、550、600、650、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、 2000,2500或3000個連續(xù)核苷酸，或達(dá)本文公開的全長Bs3多核苷酸中存在的核苷酸數(shù)目 (例如，對于 SEQ ID NO :1、3-9 和 11-16，分別是 1029、1026、3331、1087、344、166、90、1029、 1026、3344、1100、357、179 和 90 個核苷酸)。“變體”意為指大致相似的序列。對于多核苷酸，變體包括具有如下的多核苷酸在 5’和/或3’端的缺失(即，截短)；在天然多核苷酸的一個或多個內(nèi)部位點對一個或多個 核苷酸的缺失和/或添加；和/或在天然多核苷酸的一個或多個位點對一個或多個核苷酸 的取代。本文所用的“天然”多核苷酸或多肽分別包括天然存在的核苷酸序列或氨基酸序 列。對于多核苷酸，因為遺傳密碼的簡并性，保守變體包括編碼本發(fā)明的Bs3多肽之一的氨 基酸序列的那些序列。諸如這些的天然存在的等位變體可由使用公知的分子生物學(xué)技術(shù)例 如以以下列出的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和雜交技術(shù)來鑒定。變體多核苷酸還包括合成衍生 的多核苷酸，諸如例如，通過使用定點誘變產(chǎn)生、但仍編碼本發(fā)明的Bs3蛋白的多核苷酸。 通常，本發(fā)明特定多核苷酸的變體將與該特定多核苷酸具有至少約40%、45%、50%、55%、 60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%, 99%或更高的序列同一性，如由本文別處描述的序列比對程序和參數(shù)所確定的。通過比較變體多核苷酸編碼的多肽與參照多核苷酸編碼的多肽之間的序列同一 性百分比，還可評價本發(fā)明特定多核苷酸(即，參照多核苷酸)的變體。因此，例如，公開了 編碼與SEQ ID N0:2和/或SEQ IDNO :10的多肽具有給定的序列同一性百分比的多肽的分 離的多核苷酸。任何兩條多肽之間的序列同一性百分比可使用本文別處描述的序列比對程 序和參數(shù)來計算。當(dāng)通過比較其編碼的兩條多肽的序列同一性百分比來評價本發(fā)明的任何 指定多核苷酸對時，兩條編碼的多肽之間的序列同一性百分比是至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高序列同一性。 “變體”蛋白意為指通過如下衍生自天然蛋白的蛋白缺失(所謂截短)天然蛋白 N-末端和/或C-末端的一個或多個氨基酸；缺失和/或添加天然蛋白的一個或多個內(nèi)部 位點處的一個或多個氨基酸；或取代天然蛋白的一個或多個位點處的一個或多個氨基酸。 本發(fā)明涵蓋的變體蛋白是生物活性的，即其仍然具備天然蛋白的期望的生物活性，即本文 所述的黃素_依賴性單加氧酶活性。這樣的變體可能來源于，例如遺傳多態(tài)性或來源于人 類的操縱。本發(fā)明的天然Bs3蛋白的生物活性變體將與天然蛋白的氨基酸序列具有至少 約 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、 99%或更高的序列同一性，如由本文別處描述的序列比對程序和參數(shù)所確定的。本發(fā)明蛋 白的生物活性變體可能與該蛋白有少至1-15個氨基酸殘基、少至1-10、諸如6-10、少至5、 少至4、3、2、或甚至1個氨基酸殘基不同。可以以包括氨基酸取代、缺失、截短和插入的多種方式改變本發(fā)明的蛋白。這樣的 操縱方法通常是本領(lǐng)域已知的。例如，通過在DNA中突變，可制備Bs3蛋白的氨基酸序列變 體和片段。誘變和多核苷酸改變的方法是本領(lǐng)域公知的。參見，例如，Kunkel (1985)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 488-492 ；Kunkel 等人(1987)Methods in Enzymo 1. 154 :367_382 ； 美國專利第 4，873，192 號；Walker 和 Gaastra 編輯· (1983) Techniques in Molecular Biology (分子生物學(xué)技術(shù))(MacMillanPublishing Company, New York)和其中引用的參 考文獻(xiàn)。關(guān)于不影響目標(biāo)蛋白的生物活性的合適的氨基酸取代的指導(dǎo)可見于Dayhoff等 人(1978)Atlas of Protein Sequence and Structure (蛋白序列和結(jié)構(gòu)圖集)(Natl. Biomed. Res. Found.，Washington, D. C.)的模型，其通過引用并入本文。保守取代，諸如以 具有相似特征的一個氨基酸交換另一個氨基酸，可以是最佳的。因此，本發(fā)明的基因和多核苷酸包括天然產(chǎn)生的序列以及突變形式兩者。類似地， 本發(fā)明的蛋白涵蓋天然產(chǎn)生的蛋白以及其變化和修飾形式兩者。這樣的變體仍將具備期望 的Bs3生物活性，尤其是黃素_依賴性單加氧酶活性。很明顯，將在編碼變體的DNA中進(jìn)行 的突變必須不將序列置在讀碼框之外，且最佳地將不產(chǎn)生會形成二級mRNA結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)區(qū)。 參見，EP專利申請公開號75，444。預(yù)料本文涵蓋的蛋白序列的缺失、插入和取代不會產(chǎn)生蛋白特征的根本改變。然 而，當(dāng)難以在進(jìn)行之前預(yù)測取代、缺失或插入的確切作用時，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，該作 用將由常規(guī)篩選分析來評價。即，可通過黃素-依賴性單加氧酶活性分析評價該活性。參 見，例如，Krueger 等人(2005). Pharmacol. Ther. 106,357-387 ；通過引用并入本文。變異多核苷酸和蛋白還涵蓋來源于誘變和重組遺傳方案諸如DNA改組的序列和 蛋白。這樣的DNA改組的策略是本領(lǐng)域已知的。參見，例如Stemmer(1994)Proc. Natl. Acad. Sci. USA91 :10747_10751 ；Stemmer(1994)Nature 370 :389_391 ；Crameri 等人 (1997) Nature Biotech. 15 :436_438 ；Moore 等人(1997) J. Mol. Biol. 272 :336_347 ；Zhang 等人(1997)Proc. Natl. Acad. Sci. USA94 :4504-4509 ；Crameri 等人(1998) Nature 391 288-291 ；和美國專利第 5，605，793 和 5，837，458 號。本發(fā)明的多核苷酸可用于從其它生物體、尤其是其它植物分離相應(yīng)的序列。以這 種方式，諸如PCR、雜交和類似方法等方法可用于基于其與本文所列的序列的序列同源性鑒定這樣的序列。本發(fā)明涵蓋基于其與本文所列的全長Bs3序列或與其變體和片段的序列 同一性分離的序列。這樣的序列包括為公開的序列的直向同源基因的序列?！爸毕蛲椿?因”意為指來源于共同祖先基因，并作為物種形成的結(jié)果發(fā)現(xiàn)于不同物種的基因。當(dāng)其核苷 酸序列和/或其編碼的蛋白序列共有至少60%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%, 93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大的序列同一性時，發(fā)現(xiàn)于不同物種的基因被 認(rèn)為是直向同源基因。直向同源基因的功能在物種之間通常是高度保守的。因此，本發(fā)明 涵蓋具有Bs3啟動子活性或編碼Bs3蛋白并在嚴(yán)格性條件下與至少一種本文公開的Bs3多 核苷酸、或其變體或片段雜交的分離的多核苷酸。在PCR方法中，可設(shè)計寡核苷酸引物用在PCR反應(yīng)中，以從提取自任何目標(biāo)植物的cDNA或基因組DNA擴(kuò)增相應(yīng)的DNA序列。用于設(shè)計PCR引物和PCR克隆的方法通常是本 領(lǐng)域已知的并公開在Sambrook等人(1989)Molecular Cloning :A Laboratory Manual (分 子克隆實驗室指南)(第 2 版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York)。還參見 Innis 等人編輯.(1990) PCR Protocols =AGuide to Methods and Applications (PCR 實驗方案方法和應(yīng)用指南)(Academic Press, New York) ；Innis 和 Gelfand 編輯·(1995) PCRStrategies (PCR 策略)(Academic Press, New York)；和 Innis 禾口 Gelfand 編輯· (1999) PCR Methods Manual (PCR 方法手冊)(Academic Press, New York)。 PCR的已知方法包括但不限于，使用成對引物、嵌套引物、單特異性引物、簡并引物、基因特 異性引物、載體特異性引物、部分錯配引物、和類似引物的方法。雜交技術(shù)中，所有或部分的已知多核苷酸用作與從所選生物體克隆的基因組DNA 片段或cDNA片段群體(即，基因組或cDNA文庫)中存在的其它相應(yīng)的多核苷酸選擇性 地雜交的探針。雜交探針可以是基因組DNA片段、cDNA片段、RNA片段、或其它寡核苷酸， 并可用可檢測的基團(tuán)諸如32P或任何其它檢測標(biāo)志物來標(biāo)記。因此，例如，可通過標(biāo)記基 于本發(fā)明的Bs3多核苷酸的合成寡核苷酸來制備用于雜交的探針。制備用于雜交的探針 和構(gòu)建cDNA和基因組文庫的方法通常是本領(lǐng)域已知的，并公開于Sambrook等人(1989) MolecularCloning :A Laboratory Manual (分子克隆實驗室指南)(第 2 版，ColdSpring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York)。例如，本文公開的全長Bs3多核苷酸或其一個或多個部分，可以用作能夠特異性 地與相應(yīng)的Bs3多核苷酸和信使RNA雜交的探針。為了在多種條件下實現(xiàn)特異性雜交，這 樣的探針包括在Bs3多核苷酸序列之中獨特的序列，長度最佳地是至少約10個核苷酸，長 度尤其最佳地是至少約20個核苷酸。這樣的探針可以用于通過PCR從所選的植物擴(kuò)增相 應(yīng)的Bs3多核苷酸。該技術(shù)可用于從期望的植物分離另外的編碼序列或用作診斷分析以確 定編碼序列在植物中的存在。雜交技術(shù)包括雜交篩選鋪板的DNA文庫(噬菌斑或菌落；參 見,例如，Sambrook 等人(1989) Molecular Cloning :A Laboratory Manual (分子克隆實驗 室指南)(第 2 版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York)。這樣序列的雜交可以在嚴(yán)格性條件下進(jìn)行。“嚴(yán)格性條件”或“嚴(yán)格性雜交條件” 是指在其下探針將與其靶序列雜交到比與其它序列雜交可檢測的更高程度的條件(如，超 出背景至少2倍)。嚴(yán)格性條件是序列-依賴性的，并將在不同情況下不同。通過控制雜 交和/或洗滌條件的嚴(yán)格性，可鑒定與探針100%互補(bǔ)的靶序列(同源性探測)。可選地， 可調(diào)整嚴(yán)格性條件以允許序列中一些錯配從而檢測較低程度的相似性(異源性探測)。通常，探針長度少于約1000個核苷酸，最佳地長度少于500個核苷酸。一般，嚴(yán)格性條件將是其中鹽濃度少于約1. 5M Na離子，一般約0. 01至1. OM Na 離子濃度(或其它鹽)、在PH 7.0至8. 3，溫度對于短探針(如，10至50個核苷酸)是至 少約30°C，對于長探針(如，多于50個核苷酸)是至少約60°C的條件。嚴(yán)格性條件還可通 過加入去穩(wěn)定劑諸如甲酰胺來實現(xiàn)。示例性的低嚴(yán)格性條件包括在37°C與30%至35%甲 酰胺、IM NaCl、l % SDS (十二烷基硫酸鈉)的緩沖溶液雜交，并在50°C至55°C在IX至2X SSC(20X SSC = 3. OM NaCl/0. 3M檸檬酸鈉)中洗滌。示例性的中度嚴(yán)格性條件包括在37°C 在40%至45%甲酰胺、1.0M NaCl、l% SDS中雜交，并在55°C至60°C在0. 5X至IX SSC中 洗滌。示例性高嚴(yán)格性條件包括在37°C在50%甲酰胺、IM NaCl、l % SDS中雜交，并在60°C 至65°C在0. IX SSC中洗滌。任選地，洗滌緩沖液可以包含約0. 至約SDS0雜交持 續(xù)時間通常少于約24小時，一般是約4至約12小時。洗滌持續(xù)時間將是至少足以達(dá)到平 衡的時間長度。
特異性一般是雜交后洗滌的函數(shù)，關(guān)鍵因素是最終洗滌溶液的離子強(qiáng)度和溫度。 對于 DNA-DNA 雜合體，Tm 可近似于 Meinkoth 和 Wahl (1984) Anal. Biochem. 138 :267_284 的 等式=Tm = 81. 5°C +16. 6 (log Μ) +0. 41(% GC)-0. 61 形式)-500/L ；其中 M 是單價陽離 子的摩爾濃度，％ GC是DNA中鳥苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，％形式是雜交溶液中甲酰 胺的百分比，且L是雜合體的堿基對長度。Tm是在其下50%的互補(bǔ)靶序列與完全匹配的探 針雜交的溫度(在界定的離子強(qiáng)度和PH下)。對于每的錯配，Tm減少約1°C ；因此，可 調(diào)整Tm、雜交和/或洗滌條件以與期望的同一性的序列雜交。例如，如果尋求具有>90% 同一性的序列，則Tm可減少10°C。通常，選擇嚴(yán)格性條件為比特定序列和其互補(bǔ)序列在界 定的離子強(qiáng)度和PH的熱變性溫度(Tm)低約5°C。然而，極度嚴(yán)格性條件可利用在比熱變性 溫度(Tm)低1、2、3或4°C的溫度雜交和/或洗滌；中度嚴(yán)格性條件可利用在比熱變性溫度 (Tffl)低6、7、8、9或10°C的溫度雜交和/或洗滌；低嚴(yán)格性條件可利用在比熱變性溫度(Tm) 低11、12、13、14、15或20°C的溫度雜交和/或洗滌。使用該等式、雜交和洗滌組成、和期望 的Tm，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，固有地描述了雜交和/或洗滌溶液的嚴(yán)格性的變化。如果期 望的錯配程度導(dǎo)致Tm少于45°C (水溶液)或32°C (甲酰胺溶液)，最佳地是增加SSC濃度 以使可以使用較高溫度。核酸雜交的深入指南見于Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry andMoIecuIar Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes(生 物化學(xué)和分子生物學(xué)中的實驗技術(shù)_以核酸探針雜交)，第I部分，第2章(Elsevier，New York)；禾口 Ausubel 等人編輯· (1995) Current Protocolsin Molecular Biology (分子生物 學(xué)最新實驗方案)，第 2 章(GreenePublishing and Wi Iey-Interscience, New York)。參 見 Sambrook 等人(1989)Molecular Cloning :A Laboratory Manual (分子克隆實驗室指 南)(第 2 版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NewYork)。公認(rèn)的是，本發(fā)明的多核苷酸分子和蛋白涵蓋包含與SEQ IDNO :1和/或3的核苷 酸序列或與SEQ ID NO :2的氨基酸序列足夠地相同的核苷酸或氨基酸序列的多核苷酸分子 和蛋白。進(jìn)一步公認(rèn)的是，本發(fā)明的多核苷酸分子和蛋白涵蓋包含與SEQ ID N0:9和/或 11的核苷酸序列或與SEQ ID NO: 10的氨基酸序列足夠地相同的核苷酸或氨基酸序列的多 核苷酸分子和蛋白。本文使用的術(shù)語“足夠地相同”是指第一氨基酸或核苷酸序列包含與 第二氨基酸或核苷酸序列足夠或最少數(shù)目的相同或相當(dāng)(如，具有相似側(cè)鏈)氨基酸殘基或核苷酸以使第一氨基酸或核苷酸序列與第二氨基酸或核苷酸序列具有共同的結(jié)構(gòu)域和 /或共同的功能活性。例如，包含具有至少約45 %、55 %，或65 %同一性、優(yōu)選地75 %同一 性、更優(yōu)選地85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的共同的結(jié)構(gòu)域的氨基酸或 核苷酸序列在本文定義為足夠地相同。為了確定兩條氨基酸序列或兩條核酸的同一性百分比，為了最佳比較的目的比對各序列。兩條序列之間的同一性百分比是各序列共有的相同位置數(shù)目的函數(shù)(即，同一性 百分比=相同位置的數(shù)目/位置總數(shù)(如，重疊位置)X100)。在一個實施方案，兩條序列 長度相同。可通過允許或不允許缺口，使用與下文描述的技術(shù)相似的技術(shù)來確定兩條序列 之間的同一性百分比。計算同一性百分比時，一般計數(shù)確切的匹配。兩條序列之間同一性百分比的確定可使用數(shù)學(xué)算法完成。用于比較兩條序列的數(shù) 學(xué)算法的優(yōu)選、非限制性實例是 Karlin 和 Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 2264 的算法，在 Karlin 和 Altschul (1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :5873_5877 中修 改。這樣的算法整合在 Altschul 等人(1990) J. Mol. Biol. 215 403 的 NBLAST 和 XBLAST 程 序中。BLAST核苷酸搜尋可以以NBLAST程序，得分=100、字長=12進(jìn)行，來獲得與本發(fā) 明的多核苷酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白搜尋可以以XBLAST程序，得分=50、字 長=3進(jìn)行，來獲得與本發(fā)明的蛋白分子同源的氨基酸序列。為了比較目的獲得帶缺口的 比對,可利用如 Altschul 等人(1997)Nucleic Acids Res. 25 :3389 所述的 Gapped BLAST。 可選地，PSI-Blast可用于進(jìn)行檢測分子之間疏遠(yuǎn)關(guān)系的迭代的搜尋。參見Altschul等人 (1997)同上。當(dāng)利用BLAST、Gapped BLAST和PSI-Blast程序時，可使用各程序(如，XBLAST 和NBLAST)的默認(rèn)參數(shù)。參見http://www.ncbi.nlm.nih. gov。用于比較序列的數(shù)學(xué)算法 的另一優(yōu)選、非限制性實例是Myers和Miller(1988)CABI0S 4 :11_17的算法。這樣的算法 整合在ALIGN程序(2. 0版本)中，該程序是GCG序列比對軟件包的部分。當(dāng)利用ALIGN程 序來比較氨基酸序列時，可使用PAM120權(quán)重殘基表、缺口長度罰分12、和缺口罰分4。比對 還可人工地通過目視來進(jìn)行。除非另外指明，否則本文提供的序列同一性/相似性值是指使用本發(fā)明的全長 序列并使用多比對獲得的值，所述多比對借助算法ClustalW(Nucleic Acid Research, 22 (22) =4673-4680,1994)、以默認(rèn)參數(shù)使用包括在軟件包Vector NTI Suite版本 7 (InforMax, Inc.，Bethesda, MD, USA)中的程序AlignX ；或其任何等同程序?！暗韧绦颉?是指對于所討論的任何兩條序列，與使用默認(rèn)參數(shù)由CLUSTALW(版本1. 83)產(chǎn)生的相應(yīng)的 比對相比，產(chǎn)生具有相同的核苷酸或氨基酸殘基匹配和相同序列同一性百分比的比對的任 何序列比較程序(可獲得于歐洲生物信息學(xué)研究院網(wǎng)站http://WWW. ebi. ac. uk/Tools/ clustalw/index, html) 0術(shù)語“多核苷酸”的使用不意為限制本發(fā)明到包括DNA的多核苷酸。本領(lǐng)域技術(shù) 人員將理解，多核苷酸可包含核糖核苷酸與核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸的組合。這樣的 脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸包括天然存在的分子和合成類似物兩者。本發(fā)明的多核苷酸 還涵蓋所有形式的序列，包括但不限于，單鏈形式、雙鏈形式、發(fā)夾、莖環(huán)結(jié)構(gòu)、和類似形式。為了在目標(biāo)植物或其它生物體或非人類宿主細(xì)胞中表達(dá)，包含Bs3蛋白編碼序列 的本發(fā)明的Bs3多核苷酸可設(shè)在表達(dá)盒中。該盒將包括可操作地連接于本發(fā)明的Bs3多核 苷酸的5’和3’調(diào)節(jié)序列?！翱刹僮鞯剡B接的”意為指兩個或多個元件之間的功能鍵合。例如，多核苷酸或目標(biāo)基因和調(diào)節(jié)序列(即，啟動子)之間可操作的鍵合是允許表達(dá)目標(biāo)多核 苷酸的功能性連接?？刹僮鞯剡B接的元件可以是連續(xù)或不連續(xù)的。當(dāng)用于指兩個蛋白編碼 區(qū)的連接時，可操作地連接的是指編碼區(qū)在同一讀碼框中。另外該盒可包括待被共轉(zhuǎn)化到 生物體中的至少一個另外的基因?？蛇x地，另外的基因可設(shè)在多個表達(dá)盒上。這樣的表達(dá)盒 設(shè)有多個限制性位點和/或重組位點以將Bs3多核苷酸插入到處于調(diào)節(jié)區(qū)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)下。 另外表達(dá)盒可包含選擇標(biāo)志物基因。類似地，為了在目標(biāo)植物或其它生物體或非人類宿主細(xì)胞中表達(dá)，本發(fā)明的Bs3啟動子序列可設(shè)在表達(dá)盒中。該盒將包含可操作地連接于目標(biāo)多核苷酸或基因的3’調(diào)節(jié)序 列。該盒可任選地包含另外的5’調(diào)節(jié)序列。如上所述地，Bs3啟動子序列將可操作地連接 于目標(biāo)多核苷酸或基因。另外該盒可包括待被共轉(zhuǎn)化到生物體中的至少一個另外的基因。 可選地，另外的基因可設(shè)在多個表達(dá)盒上。這樣的表達(dá)盒設(shè)有多個限制性位點和/或重組 位點并另外可包含選擇標(biāo)志物基因。表達(dá)盒以5’ -3’轉(zhuǎn)錄方向包括轉(zhuǎn)錄和翻譯起始區(qū)(即，啟動子)、本發(fā)明的Bs3多 核苷酸、以及在植物或其它生物體或非人類宿主細(xì)胞中功能性的轉(zhuǎn)錄和翻譯終止區(qū)(即， 終止區(qū))功能。調(diào)節(jié)區(qū)(即，啟動子、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)和翻譯終止區(qū))和/或本發(fā)明的Bs3多核 苷酸可以是宿主細(xì)胞本身的/與宿主細(xì)胞相似或彼此相似。可選地，該調(diào)節(jié)區(qū)和/或本發(fā) 明的Bs3多核苷酸可以是宿主細(xì)胞異源的或彼此異源。本文所用的關(guān)于序列的“異源的”是 來源于外來物種的序列，或如果來源于相同物種，則是由故意的人類介入在組成和/或基 因組基因座上從天然形式大致修飾的。例如，可操作地連接于異源多核苷酸的啟動子是來 自不同于多核苷酸所來自的物種的物種，或如果來自相同/相似物種，其中之一或兩者是 從其原始形式和/或基因組基因座大致修飾的，或該啟動子不是可操作地連接的多核苷酸 本身的啟動子。本文所用的嵌合基因包含可操作地連接于轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的編碼序列，該轉(zhuǎn)錄 起始區(qū)對于編碼序列是異源的。類似地，為了在目標(biāo)植物或其它生物體或非人類宿主細(xì)胞中表達(dá)，本發(fā)明的Bs3 啟動子序列可設(shè)在表達(dá)盒中。該盒將包含可操作地連接于目標(biāo)多核苷酸或基因的3’調(diào)節(jié)序 列。該盒可任選地包含另外的5’調(diào)節(jié)序列。如上所述地，Bs3啟動子序列將可操作地連接 于目標(biāo)多核苷酸或基因。另外該盒可包括待被共轉(zhuǎn)化到生物體中的至少一個另外的基因。 可選地，另外的基因可設(shè)在多個表達(dá)盒上。這樣的表達(dá)盒設(shè)有多個限制性位點和/或重組 位點并另外可包含選擇標(biāo)志物基因。盡管使用異源啟動子表達(dá)Bs3編碼序列可能是最佳的，可使用本文以下所述的天 然啟動子序列或截短物。這樣的構(gòu)建體可以改變植物或植物細(xì)胞中Bs3蛋白的表達(dá)水平。 因此，可改變植物或植物細(xì)胞的表型。該終止區(qū)可以是轉(zhuǎn)錄起始區(qū)本身的，可以是可操作地連接的目標(biāo)Bs3多核苷酸 本身的，可以是植物宿主本身的，或可以衍生自啟動子、目標(biāo)Bs3多核苷酸、植物宿主、或 其任何組合的另一來源(即，外來或異源)。方便的終止區(qū)可從根癌農(nóng)桿菌的Ti-質(zhì)粒 獲得，諸如章魚堿合酶和胭脂堿合酶終止區(qū)。還參見Guerineau等人(1991)Mol. Gen. Genet. 262 141-144 ；Proudfoot(1991)Cell 64 :671_674 ;Sanfacon 等人(1991)Genes Dev. 5 141-149 ；Mogen 等人(1990)Plant Cell 2 :1261_1272 ；Munroe 等人(1990)Gene 91 151-158 ；Ballas 等人(1989)Nucleic AcidsRes. 17 :7891_7903 ；和 Joshi 等人(1987)Nucleic Acids Res. 15 :9627_9639。合適時，為了在轉(zhuǎn)化的植物中增加表達(dá)可以優(yōu)化多核苷酸。即，為了改進(jìn)的表達(dá)，可使用植物-偏好的密碼子合成多核苷酸。參見例如，Campbell和Gowri (1990)Plant Physiol. 92 :1_11對宿主-偏好的密碼子利用的討論。合成植物-偏好基因的方法是本領(lǐng) 域中可獲得的。參見例如，美國專利第5，380，831和5，436，391號，和Murray等人(1989) Nucleic Acids Res. 17 :477_498，其通過引用并入本文。已知另外的序列修飾增強(qiáng)細(xì)胞宿主中的基因表達(dá)。這些包括除去編碼假多腺苷 酸化信號、外顯子-內(nèi)含子剪切位點信號、轉(zhuǎn)座子-樣重復(fù)序序列、和對基因表達(dá)可能有害 的其它這樣的公知序列?？梢哉{(diào)整序列的G-C含量到給定細(xì)胞宿主的平均水平，如通過參 照宿主細(xì)胞中表達(dá)的已知基因來計算的?？赡軙r，修飾序列以避免預(yù)測的發(fā)夾二級mRNA結(jié) 構(gòu)。另外表達(dá)盒可包含5’前導(dǎo)序列。這樣的前導(dǎo)序列可能作用以增強(qiáng)翻譯。翻譯前導(dǎo) 序列是本領(lǐng)域已知的，并包括小RNA病毒前導(dǎo)序列，例如EMCV前導(dǎo)序列(腦心肌炎5’非編 碼區(qū))(Elroy-Stein 等人(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 6126-6130)；馬鈴薯 Y 病毒 前導(dǎo)序列，例如TEV前導(dǎo)序列(煙草蝕刻病毒)(Gallie等人(1995) Genel65 (2) =233-238), MDMV前導(dǎo)序列(玉米矮化花葉病毒)(Virologyl54 9-20)、和人類免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋 白(BiP) (Macejak等人(1991)Nature 353:90-94)；來自苜?；ㄈ~病毒的外殼蛋白mRNA的 非翻譯前導(dǎo)序列(AMV RNA 4) (Jobling等人(1987)Nature 325:622-625)；煙草花葉病毒 前導(dǎo)序列(TMV) (Gallie 等人(1989) Molecular Biology ofRNA (RNA 分子生物學(xué))，Cech 編 輯(Liss，New York)的第237-256頁)；和玉米褪綠斑駁病毒前導(dǎo)序列(MCMV) (Lommel等 人(1991) Virology 81 :382_385)。還參見，Della-Cioppa 等人(1987)Plant Physiol. 84 965-968。制備表達(dá)盒時，可以操縱各種DNA片段，從而提供以適當(dāng)方向、以及合適時在適當(dāng) 讀碼框中的DNA序列。為此目的，可采用適體或連接體來連接DNA片段，或可包括其它操縱 來提供方便的限制性位點、多余DNA的去除、限制性位點的去除或類似操縱。為此目的，可 包括體外誘變、引物修復(fù)、限制、退火、重新取代例如轉(zhuǎn)換和顛換。大量啟動子可用于實踐本發(fā)明?？苫谄谕慕Y(jié)果選擇啟動子。核酸可與組成型、 組織偏好、或其它啟動子組合以在植物中表達(dá)。這樣的組成型啟動子包括，例如核心CaMV 35S啟動子(Odell 等人(1985)Nature 313 :810_812)；水稻肌動蛋白(McElroy 等人(1990) Plant Cell2 :163_171)；泛素(Christensen 等人(1989)Plant Mol. Biol. 12 :619_632 和 Christensen 等人(1992)Plant Mol. Biol. 18 675-689) ；pEMU(Last 等人(1991)Theor. Appl. Genet. 81 :581_588) ；MAS(Velten 等人(1984)EMBO J. 3 :2723_2730) ；ALS 啟動子 (美國專利第5，659，026號)、和類似組成型啟動子。其它組成型啟動子包括，例如美國專 利第 5，608，149 ；5，608，144 ；5，604，121 ；5，569，597 ；5，466，785 ；5，399，680 ；5，268，463 ； 5，608，142 ；和 6，177，611 號。組織偏好啟動子可用于在特定植物組織中靶向增強(qiáng)Bs3表達(dá)。這樣的組織偏好啟 動子包括但不限于，葉片_偏好啟動子、根_偏好啟動子、種子_偏好啟動子和莖_偏好啟 動子。組織偏好啟動子包括Yamamoto等人(1997)Plant J. 12(2) :255_265 ；Kawamata等人 (1997)Plant Cell Physiol. 38(7) :792_803 ；Hansen 等人(1997)Mol. Gen Genet. 254(3)337-343 ；Russell 等人(1997) Transgenic Res. 6(2) 157-168 ；Rinehart 等人(1996) Plant Physiol. 112(3) 1331-1341 ；Van Camp 等人(1996)Plant Physiol. 112(2) :525_535 ； Canevascini 等人(1996)PlantPhysiol. 112(2) 513-524 ；Yamamoto 等人(1994)Plant Cell Physiol. 35(5) 773-778 ；Lam(1994)Results Probl. Cell Differ. 20 181-196 ； Orozco 等人(1993)Plant Mol Biol. 23(6) 1129-1138 ；Matsuoka 等人(1993)Proc Natl. Acad. Sci. USA 90(20) :9586_9590 ；和 Guevara-Garcia 等人(1993) Plant J. 4(3) 495-505。如果需要，可以為了弱表達(dá)修飾這樣的啟動子。通常，從誘導(dǎo)型啟動子，尤其是從病原體誘導(dǎo)型啟動子表達(dá)基因?qū)⑹怯幸娴?。這樣的啟動子包括來自致病-相關(guān)蛋白(I3R蛋白)的啟動子，致病-相關(guān)蛋白在被病原體感染 后誘導(dǎo)；如，I3R蛋白、SAR蛋白、β -1,3-葡聚糖酶、甲殼酶、等等。參見例如，Redolfi等人 (1983)Neth. J. Plant Pathol. 89 :245_254 ；Uknes 等人(1992)Plant Cell 4 :645_656 ；和 Van Loon (1985)Plant Mol. Virol. 4 :111_116。還參見 WO 99/43819，通過引用并入本文。感興趣的是在病原體感染部位或附近局部表達(dá)的啟動子。參見例如，Marineau 等人(1987)Plant Mol. Biol. 9 :335_342 ;Matton 等人(1989)Molecular Plant-Microbe Interactions 2 325-331 ；Somsisch φ 人(1986)Proc. Natl. Acad.Sci.USA 83 2427-2430 ；Somsisch 等人(1988)Mol. Gen. Genet. 2 :93_98 ；和 Yang(1996)Proc. Natl. Acad. Sci. USA93 :14972_14977。還參見，Chen等人(1996)Plant J. 10 955~966 ；Zhang等人 (1994)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 :2507_2511 ；Warner 等人(1993)Plant J. 3 :191_201 ； Siebertz 等人(1989)Plant Cell 1 :961_968 ；美國專利第 5，750，386 號(線蟲-誘導(dǎo)型)； 和其中引用的參考文獻(xiàn)。尤其感興趣的是玉米PRms基因的誘導(dǎo)型啟動子，其表達(dá)被病原體 串珠鐮孢(Fusarium moniliforme)誘導(dǎo)(參見例如，Cordero 等人(1992)Physiol. Mol. Plant Path. 41 189-200)。另外，由于病原體通過損傷或昆蟲損害進(jìn)入植物，損傷誘導(dǎo)型啟動子可用于本 發(fā)明的構(gòu)建體中。這樣的損傷誘導(dǎo)型啟動子包括馬鈴薯蛋白酶抑制物(Pin II)基因 (Ryan (1990) Ann. Rev. Phytopath. 28 425-449 ；Duan φ 人(1996) Nature Biotechnology 14 494-498) ；wunl 和 wun2，美國專利第 5，428，148 號；winl 和 win2 (Stanford 等人(1989) Mol. Gen. Genet. 215 :200_208)；系統(tǒng)素(McGurl 等人(1992) Science225 1570-1573)； WIPl (Rohmeier 等人(1993)Plant Mol. Biol. 22 :783_792 ；EckeIkamp 等人(1993)FEBS Letters 323:73-76) ；MPI 基因(Corderok 等人(1994) Plant J. 6 (2) 141-150)；和類似啟 動子，通過引用并入本文。通過施加外源化學(xué)調(diào)節(jié)物，化學(xué)調(diào)節(jié)啟動子可用于調(diào)節(jié)基因在植物中的表達(dá)。取 決于目標(biāo)，啟動子可以是化學(xué)誘導(dǎo)型啟動子，其中施加化學(xué)物誘導(dǎo)基因表達(dá)，或可以是化學(xué) 物_阻遏型啟動子，其中施加化學(xué)物阻遏基因表達(dá)?；瘜W(xué)物誘導(dǎo)型啟動子是本領(lǐng)域已知的 并包括但不限于，玉米In2-2啟動子(其被苯磺酰胺除草劑安全劑活化)、玉米GST啟動 子(其被用作萌前除草劑的疏水親電子化合物活化)和煙草PR-Ia啟動子(其被水楊酸 活化)。其它目標(biāo)化學(xué)物調(diào)節(jié)啟動子包括類固醇響應(yīng)性啟動子(參見例如，Schena等人 (1991)Proc. Natl. Acad. Sci. USA88 10421-10425 和McNellis 等人(1998)Plant J. 14(2) 247-257中的糖皮質(zhì)激素-誘導(dǎo)型啟動子)和四環(huán)素_誘導(dǎo)型和四環(huán)素_阻遏型啟動子 (參見例如，Gatz 等人(1991)Mol. Gen. Genet. 227 :229_237，和美國專利第 5，814，618 和5，789，156號)，通過引用并入本文。 表達(dá)盒還可包含用于選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的選擇標(biāo)志物基因。選擇標(biāo)志物基因用于 選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或組織。標(biāo)志物基因包括編碼抗生素抗性的基因，諸如編碼新霉素磷酸 轉(zhuǎn)移酶II(NEO)和潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPT)的基因，以及賦予對除草劑化合物諸如草銨 膦、溴草腈、咪唑啉酮和2，4_ 二氯苯氧基乙酸鹽(2，4-D)的抗性的基因。另外的選擇標(biāo) 志物包括表型標(biāo)志物諸如半乳糖苷酶和熒光蛋白諸如綠色熒光蛋白(GFP) (Su等人 (2004)Biotechnol Bioeng 85 :610_9 和 Fetter 等人(2004)Plant Cell 16 :215_28)、藍(lán) 綠色熒光蛋白(CYP) (Bolte 等人(2004) J. CellScience 117 :943_54 和 Kato 等人(2002) Plant Physiol 129 :913_42)和黃色熒光蛋白(來自 Evrogen 的 PhiYFP ，參見 Bolte 等人 (2004) J. CellScience 117 :943_54)。對于另外的選擇標(biāo)志物，通常參見，Yarranton (1992) Curr. Opin. Biotech. 3 506-511 ；Christopherson 等人(1992)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :6314-6318 ;Yao 等人(1992)Cell 71 63-72 ；Reznikoff(1992)Mol. Microbiol. 6 2419-2422 ；Barkley 等人(1980)的 The Operon (操縱子)，第 177-220 頁；Hu 等人(1987) Cell 48 555-566 ；Brown ^ 人(1987)Cell 49 :603_612 ;Figge 等人(1988)Cell 52: 713-722 ;Deuschle 等人(1989)Proc. Natl. Acad. Aci. USA 86 :5400_5404 ;Fuerst 等人 (1989)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 :2549_2553 ;Deuschle 等人(1990)Science 248 480-483 ；Gossen (1993)博 士論文，海德堡大學(xué)；Reines 等人(1993) Proc. Natl. Acad. Sci.USA 90 1917-1921 ；Labow 等人(1990)Mol. Cell. Biol. 10 :3343_3356 ；Zambretti 等 人(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :3952_3956 ;Baim 等人(1991) Proc. Natl. Acad. Sci.USA 88 5072-5076 ；Wyborski 等人(1991)Nucleic Acids Res. 19 4647-4653 ； Hillenand-Wissman(1989)Topics Mol. Struc. Biol. 10 143-162 ；Degenkolb 等人(1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35 :1591_1595 ；Kleinschnidt 等人(1988) Biochemistry 27 1094-1104 ；Bonin (1993)博士論文，海德堡大學(xué)；Gossen 等人(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 5547-5551 ；Oliva 等人(1992)Antimicrob. AgentsChemother. 36 :913_919 ； Hlavka 等人(1985) Handbook of ExperimentalPharmacology (實驗藥理學(xué)手冊)，第 78 卷 (Springer-Verlag, Berlin) ；Gill 等人(1988)Nature 334:721-724。這樣的公開通過引 用并入本文。選擇標(biāo)志物基因的以上列表不意味著限制。任何選擇標(biāo)志物基因可用于本發(fā)明。用于轉(zhuǎn)化植物的許多植物轉(zhuǎn)化載體和方法是可獲得的。參見例如，An, G.等 人(1986)Plant Pysiol. ,81 :301_305 ；Fry, J.等人(1987)PlantCell Rep. 6 :321_325 ； Block, Μ. (1988)Theor. Appl Genet. 了6 :767_774 ;Hinchee 等人(I99O)Stadler-Genet. Symp. 203212. 203-212 ;Cousins 等人(1991)Aust. J. Plant Physiol. 18 481-494 ； Chee, P. P.和 Slightom, J. L. (1992)Gene. 118 :255_260 ；Christou 等人(1992)Trends. Biotechnol. 10 :239_246 ；D ‘ Halluin 等人(1992)Bio/Technol. 10 :309_314 ；Dhir 等 人(1992) Plant Physiol. 99 81-88 ；Casas 等人(1993) Proc. Nat. Acad Sci. USA 90: 11212-11216 ；Christou, P. (1993)In Vitro Cell.Dev. Biol. -Plant ；29P :119_124 ； Davies 等人(1993)Plant Cell Rep. 12 :180_183 ；Dong, J. A.和 Mchughen, A. (1993) Plant Sci. 91 139-148 ；Franklin, C. I.和 Trieu, Τ. N. (1993)Plant. 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(1994)Plant Physiol. 104 :3748。本發(fā)明的方法包括將多核苷酸構(gòu)建體引入植物?！耙搿笔侵敢赃@樣一種方式向植物呈遞多核苷酸構(gòu)建體構(gòu)建體獲得進(jìn)入植物細(xì)胞內(nèi)部。本發(fā)明的方法不依賴于用于將 多核苷酸構(gòu)建體引入植物的具體方法，只要多核苷酸構(gòu)建體獲得進(jìn)入植物至少一個細(xì)胞內(nèi) 部。用于將多核苷酸構(gòu)建體引入植物的方法是本領(lǐng)域已知的，包括但不限于，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化方 法、瞬時轉(zhuǎn)化方法和病毒_介導(dǎo)的方法?！胺€(wěn)定轉(zhuǎn)化”是指引入植物的多核苷酸構(gòu)建體整合到植物基因組中，能夠被其后代 遺傳。“瞬時轉(zhuǎn)化”是指引入植物的多核苷酸構(gòu)建體不整合到植物基因組中。對于植物和植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將本發(fā)明的核苷酸序列插入適于在植 物或植物細(xì)胞中表達(dá)核苷酸序列的本領(lǐng)域已知的任何載體。載體的選擇取決于偏好的轉(zhuǎn)化 技術(shù)和待轉(zhuǎn)化的靶植物物種。在本發(fā)明的實施方案，將Bs3多核苷酸可操作地連接于已知 用于在植物細(xì)胞高水平表達(dá)的植物啟動子，隨后將該構(gòu)建體引入對咪唑啉酮除草劑易感的 植物，并再生轉(zhuǎn)化的植物。轉(zhuǎn)化的植物在暴露于能夠殺死或嚴(yán)重?fù)p害未轉(zhuǎn)化的植物的水平 的咪唑啉酮除草劑時是耐受的。這一方法可應(yīng)用于任何植物物種；然而，當(dāng)應(yīng)用于作物植物 時最有益。用于構(gòu)建植物表達(dá)盒并將外來核酸引入植物的方法通常是本領(lǐng)域已知的并已在 此前描述。例如，可使用誘導(dǎo)腫瘤(Ti)的質(zhì)粒載體來將外來DNA引入植物。用于外來DNA 遞送的其它方法包括使用PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、電穿孔、微注射纖維(whisker)和用于 直接獲取DNA的基因槍或微粒轟擊。這樣的方法是本領(lǐng)域已知的。(Vasil等人的美國專 利第 5，405，765 號；Bilang 等人(1991)Gene 100 :247_250 ；Scheid 等人，(1991)Mol. Gen. Genet.，228 104-112 ;Guerche 等人，(1987)Plant Science 52 :111_116 ;Neuhause 等人， (1987)Theor. ApplGenet. 75 :30_36 ；Klein 等人，(1987) Nature 327 :70_73 ；Howe 11 等人， (1980) Science 208 :1265 ;Horsch 等人，(1985) Science 227 :1229_1231 ;DeBlock 等人， (1989)Plant Physiology 91 694-701 ；Methods for PlantMolecular Biology(植物分 子生物學(xué)方法)(Weissbach 和 Weissbach 編輯)Academic Press, Inc. (1988)和 Methods in Plant Molecular Biology (植物分子生物學(xué)中的方法)(Schuler 和 Zielinski 編輯) Academic Press, Inc. (1989)。轉(zhuǎn)化方法取決于待轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、所用的載體的穩(wěn)定性、 基因產(chǎn)物表達(dá)水平和其它參數(shù)。將核苷酸序列引入植物細(xì)胞和隨后插入植物基因組的其它合適的方法包括如 Crossway 等人(1986)Biotechniques 4 :320_334 所述的微注射，如 Riggs 等人(1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 5602-5606 所述的電穿孔，如 Townsend 等人美國專利 第5，563,055號、Zhao等人美國專利第5，981，840號所述的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，如 Paszkowski等人(1984)EMBO J. 3 :2717_2722所述的直接基因轉(zhuǎn)移，和如以下文獻(xiàn)中描 述的基因槍顆粒加速法例如Sanford等人，美國專利第4，945，050號；Tomes等人，美國專利第5，879，918號；Tomes等人，美國專利第5，886，244號；Bidney等人，美國專利第 5，932，782 號；Tomes 等人(1995) "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells viaMicroprojectile Bombardment (經(jīng)由微粒轟擊直接轉(zhuǎn)移DNA到完整植物細(xì)胞中)”，在 Plant Cell, Tissue, and Organ Culture :FundamentalMethods (植物細(xì)胞、組織和器官培 養(yǎng)基本方法)中，Gamborg 和 Phillips 編輯(Springer-Verlag，Berlin) ；McCabe 等人 (1988)Biotechnology 6:923-926)；以及 Lecl 轉(zhuǎn)化(WO 00/28058)。還參見，Weissinger 等人(1988) Ann. Rev. Genet. 22 :421_477 ；Sanford 等人(1987) Particulate Science and Technology 5 :27_37(洋蔥)；Christou 等人(1988)Plant Physiol. 87 :671_674(大 豆)；McCabe 等人(1988)Bio/Technology 6 :923_926(大豆)；Finer 和 McMullen(1991) In VitroCell Dev. Biol. 27P 175-182 (大豆)；Singh 等人(1998) Theor. Appl. Genet. 96 319-324 (大豆)；Datta 等人(1990) Biotechnology 8 :736_740 (水稻)；Klein 等人(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 :4305_4309 (玉米)；Klein 等人(1988) Biotechnology 6 559-563 (玉米)；Tomes，美國專利第5, 240, 855號；Buising等人，美國專利第5, 322, 783 和 5，324，646 號；Tomes 等人(1995) "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells viaMicroprojectile Bombardment (經(jīng)由微粒轟擊直接轉(zhuǎn)移DNA到完整植物細(xì)胞中)”，在 Plant Cell, Tissue, and Organ Culture :FundamentalMethods (植物細(xì)胞、組織和器官培 養(yǎng)基本方法)中，Gamborg 編輯(Springer-Verlag, Berlin)(玉米)；Klein 等人(1988) Plant Physiol. 91 :440-444(玉米)；Fromm 等人(1990)Biotechnology 8:833_839(玉 米)；Hooykaas-Van Slogteren 等人(1984) Nature (London) 311 :763_764 ；Bowen 等人， 美國專利第 5，736，369 號(谷類)；Bytebier 等人(1987)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 5345_5349(百合科)；De Wet 等人(I985)在 The Experimental Manipulation of Ovule Tissues(胚珠組織的實驗操縱)，Chapman等人編輯(Longman，New York)，第197-209 頁(花粉)；Kaeppler 等人(I99O)Plant Cell Reports 9 415-418 和 Ka印pier 等人 (1992)Theor. Appl. Genet. 84 :560-566(纖維-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化)；D ‘ Halluin 等人(1992) Plant Cell 4 :1495_1505 (電穿孔)；Li 等人(1993) Plant Cell Reports 12 :250_255 與 Christou 和 Ford (1995) Annalsof Botany 75 :407_413 (水稻)；Osjoda 等人(1996) Nature Biotechnologyl4 :745_750 (經(jīng)由根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化玉米)；所有這些通過引用并入本文?？赏ㄟ^將植物與病毒或病毒核酸接觸來將本發(fā)明的多核苷酸引入植物。通常，這 樣的方法包括將本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體并入病毒DNA或RNA分子。公認(rèn)的是，本發(fā)明的 Bs3蛋白可以最初合成為病毒多蛋白的部分，其隨后經(jīng)體內(nèi)或體外蛋白水解而加工產(chǎn)生期 望的重組蛋白。進(jìn)一步公認(rèn)的是，本發(fā)明的啟動子還涵蓋用于由病毒RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄的啟 動子。用于將包含病毒DNA或RNA分子的多核苷酸構(gòu)建體引入植物和表達(dá)從其編碼的表 達(dá)蛋白的方法是本領(lǐng)域已知的。參見例如，美國專利第5，889，191、5，889，190、5，866，785、 5，589，367和5，316，931號；其通過引用并入本文。在具體實施方案，可使用多種瞬時轉(zhuǎn)化方法向植物提供本發(fā)明的Bs3序列。這樣 的瞬時轉(zhuǎn)化方法包括但不限于，直接將Bs3蛋白或其變體和片段引入植物或?qū)s3轉(zhuǎn)錄物 引入植物。這樣的方法包括例如，微注射或微粒轟擊。參見例如，Crossway等人(1986)Mol Gen.Genet. 202 179-185 ；Nomura 等人(1986)Plant Sci. 44 :53_58 ；Hepler 等人(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. 91 :2176-2180 和 Hush 等人(1994) The Journal ofCell Science107 :775-784，所有這些通過引用并入本文?？蛇x地，使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)可將多核苷酸 瞬時地轉(zhuǎn)化到植物中。這樣的技術(shù)包括如下所述的病毒載體系統(tǒng)和根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時表達(dá)。已被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可以在植物中按照常規(guī)方式生長。參見例如，McC ormick等人 (1986)Plant Cell Reports 5:81-84。隨后可以種植這些植物，并以相同轉(zhuǎn)化的株系或不 同株系授粉，所獲得的雜種具有鑒定的期望的表型特征的組成型表達(dá)。可以種植兩代或更 多代以確保期望的表型特征的表達(dá)穩(wěn)定地保持并遺傳，然后收集種子以確保已經(jīng)獲得期望 的表型特征的表達(dá)。以這種方式，本發(fā)明提供轉(zhuǎn)化的種子(還稱為“轉(zhuǎn)基因種子”)，其具有 穩(wěn)定地并入其基因組的本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體例如本發(fā)明的表達(dá)盒。本發(fā)明可以用于轉(zhuǎn)化包括但不限于單子葉植物和雙子葉植物的任何植物物 種。目標(biāo)植物物種的實例包括但不限于，辣椒(P印per)(辣椒屬(Capsicum spp)；如， 辣椒、風(fēng)鈴椒(C. baccatum)、燈籠椒(C. chinense)、小米椒(C. frutescens)、彩葉椒 (C. pubescens)、禾口類似辣椒)、番爺(tomatoe)(番爺(Lycopersicon esculentum))、煙草 (tobacco)(煙草(Nicotiana tabacum))、爺子(eggplant)(爺子(Solanum melongena))、 矮牽牛(petunia)(矮牽牛屬(Petunia spp·),如，矮牽牛(Petunia χ hybrida)或 矮牽牛(Petunia hybrida))、玉米(corn)或玉米(maize)(玉米(Zeamays))、蕓苔屬 (Brassica sp.)(如，歐洲油菜(B. napus)、蕪青(B. rapa)、芥菜(B. juncea))，尤其是可用 作種子油來源的蕓苔屬物種、苜蓿(alfalfa)(紫苜蓿(Medicago sativa))、水稻(rice) (稻(Oryza sativa))、黑麥(rye)(黑麥(Secale cereale))、高粱(sorghum)(高粱 (Sorghum bicolor)、高粱(Sorghum vulgare))、黍(millet)(如，珍珠粟(pearl millet) (珍珠粟(Pennisetum glaucum))、黍(proso millet)(黍(Pan i cum miliaceum))、粟 (foxtail millet)(粟(Setaria italica))、龍爪稷(finger millet)(龍爪稷(Eleusine coracana)))、向曰葵(sunflower)(向曰葵(Helianthusannuus))、紅花(safflower)(紅 花(Carthamus tinctorius))、小麥(wheat)(小麥(Triticum aestivum))、大豆(soybean) (Xsi (Glycine max))(tobacco) ((Nicotiana tabacum)) >(potato) (馬鈴薯(Solanum tuberosum))、花生(落花生(Arachis hypogaea))、棉花(海島棉 (Gossypium barbadense)、陸地棉(Gossypium hirsutum))、甘薯(sweetpotato)(甘薯 (Ipomoea batatus))、木暮(cassava) ( ifM (Manihotesculenta))、咖口非(coffee)(咖口非 屬(Coffea spp·))、椰子(coconut)(椰子(Cocos nucifera))、菠蘿(pineapple)(菠蘿 (Ananas comosus))、柑橘樹(citrus trees)(柑橘屬(citrus spp·))、可可(cocoa)(可 可(Theobromacacao))、茶(tea)(茶(Camellia sinensis))、香蕉(色蕉屬(Musa spp·))、 鍔梨(avocado)(鍔梨(Persea americana))、無花果(fig)(無花果(Ficuscasica))、番 石榴(guava)(番石榴(Psidium guajava))、芒果(mango)(芒果(Mangifera indica))、 橄欖(olive)(橄欖(Olea europaea))、番木瓜(papaya)(番木瓜(Carica papaya))、 腰果(cashew)(腰果(Anacardiumoccidentale))、澳洲堅果(macadamia)(澳洲堅 果(Macadamiaintegrifolia))、扁桃(almond)(扁桃(Prunus amygdalus))> 舌甘菜 (sugarbeets)(舌甘菜(Beta vulgaris))、甘蔴(sugarcane)(甘蔴屬(Saccharumspp.))、燕 麥、大麥、蔬菜、觀賞植物和針葉樹。本文所用的術(shù)語植物包括植物細(xì)胞、植物原生質(zhì)體、可從其再生植物的植物細(xì)胞組織培養(yǎng)物、植物愈傷組織、植物團(tuán)塊、和在植物或植物部分中完整的植物細(xì)胞諸如胚胎、 花粉、胚珠、種子、葉片、花、樹枝、果實、根、根尖、花藥、和類似部分。再生植物的后代、變體 和突變體還包括在本發(fā)明范圍中，只要這些部分包含引入的多核苷酸。公認(rèn)的是，以這些核苷酸序列，可構(gòu)建與Bs3多核苷酸序列的信使RNA(mRNA)的至 少一部分互補(bǔ)的反義構(gòu)建體。構(gòu)建反義核苷酸以與相應(yīng)的mRNA雜交?？蛇M(jìn)行反義序列的 修飾，只要該序列與相應(yīng)的mRNA雜交并干擾相應(yīng)的mRNA表達(dá)。以這種方式，可使用對相應(yīng) 的反義序列具有70%、優(yōu)選地80%、更優(yōu)選地85%序列同一性的反義構(gòu)建體。此外，反義核 苷酸的部分可用于破壞靶基因的表達(dá)。通常，可使用至少50個核苷酸、100個核苷酸、200 個核苷酸、或更多核苷酸的序列。本發(fā)明的核苷酸序列還可以以有義方向使用，以抑制內(nèi)源基因在植物中的表達(dá)。 以有義方向使用核苷酸序列抑制基因在植物中的表達(dá)的方法是本領(lǐng)域已知的。該方法通常 包括以DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物，所述構(gòu)建體包含可操作地連接于對應(yīng)于內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄的至 少部分核苷酸序列、驅(qū)動在植物中表達(dá)的啟動子。一般，這樣的核苷酸序列具有與內(nèi)源基因 的轉(zhuǎn)錄物序列大致的序列同一性，優(yōu)選地多于約65%序列同一性，更優(yōu)選地多于約85%序 列同一性，最優(yōu)選地多于約95%序列同一性。參見，美國專利第5，283，184和5，034，323 號；其通過引用并入本文。本發(fā)明還包括誘導(dǎo)對植物疾病的抗性的組合物和方法?！凹膊】剐浴笔侵钢参锉苊?作為植物_病原體相互作用的結(jié)果的疾病癥狀。即，阻止病原體導(dǎo)致植物疾病和相關(guān)的疾 病癥狀，或可選地，將病原體導(dǎo)致的疾病癥狀減到最少或縮小。本發(fā)明的病原體包括但不限于，病毒或類病毒、細(xì)菌、昆蟲、線蟲、真菌和類似病原 體。病毒包括任何植物病毒，例如，煙草或黃瓜花葉病毒、環(huán)斑病毒、壞死病毒、玉米矮化 花葉病毒等等。真菌病原體包括但不限于，禾生炭疽菌(Colletotrichum graminocola), 玉米色二孢(Diplodia maydis)、禾谷鐮孢(Fusarium graminearum)禾口輪枝樣鐮刀菌 (Fusarium verticillioides) 0對于主要作物的具體病原體包括大豆大豆疫霉病菌 (Phytophthora megasperma fsp· glycines)、胃 求 包胃(Macrophomina phaseolina) > 立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)、核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)、尖鐮孢 (Fusarium oxysporum)、菜豆間座殼大豆變禾中(Diaporthe phaseolorum var. sojae)(大 豆擬蓮點霉(Phomopsis sojae))、大豆北方蓮饋蕩病菌(Diaporthe phaseolorum var. caulivora)、齊整小核菌(Sclerotium rolfsii)、菊池尾孢菌(Cercosporakikuchii)、 大豆尾抱(Cercospora sojina)、大豆霜霉病菌(Peronosporamanshurica)、束狀朿丨J 盤抱(Colletotrichum dematium)(大豆炭疽病菌(Colletotichum truncatum))、 多主棒抱霄(Corynespora cassiicola)、大丑殼針抱(Septoria glycines)、灰星 _ 胃(Phyllosticta sojicola) > Ijl(Alternaria alternata)、了 # fi Ifi 胃 大豆致病變種(Pseudomonassyringae p. v. glycinea)、野油菜黃單胞菌菜豆病原變 禾中(Xanthomonascampestris p. v. phaseoli) > 白粉病菌(Microsphaera diffusa) > 半 裸鍵刀菌(Fusarium semitectum)、大豆蓮褐腐病菌(Phialophora gregata)、大豆 花葉病毒、大豆小叢殼(Glomerella glycines)、煙草環(huán)斑病毒、煙草條紋病毒、豆薯 M ■ lif (Phakopsora pachyrhizi)、/R 胃冑 β (Pythiumaphanidermatum) ^ M M (Pythium ultimum)、德巴利腐霉(Pythiumdebaryanum)、番茄斑萎病毒、大豆胞囊線蟲(Heterodera glycines)、腐皮德抱(Fusarium solani)油菜白誘菌(Albugo Candida)、鏈格抱(Alternaria brassicae)、十字花禾斗小球腔菌(Leptosphaeria maculans)、立 枯絲核菌、核盤菌、蕓苔生球腔菌(Mycosphaerella brassicicola)、終極腐霉、寄生霜 霉(Peronospora parasitica)、粉紅鐮孢(Fusariumroseum)、鏈格抱苜藉密執(zhí)安棒 狀桿菌詭譎亞種(Clavibactermichigmese subsp. insidiosum)、終極腐霉、畸雄腐霉 (Pythiumirregulare)、華麗腐霉(Pythium splendens)、德巴利腐霉、瓜果腐霉、疫霉病 菌(Phytophthora megasperma)、三葉草霜霉(Peronosporatrifoliorum)、草木禪輪紋病 菌(Phoma medicaginis var. medicaginis)、首猜尾抱(Cercospora medicaginis)、首 猜假盤菌(Pseudopezizamedicaginis)、苜猜黃斑病菌(Leptotrochila medicagini)、 尖鐮孢、黃萎輪枝孢(Verticillium albo-atrum)、野油菜黃單胞菌苜蓿致病變種 (Xanthomonas campestris p. v. alfalfae)、根腐絲囊霉(Aphanomyceseuteiches)、草 綠匍柄霉(Stemphylium herbarum)、苜蓿匍柄霉(Stemphylium alfalfae)、三葉草剌 盤 包(Colletotrichum trifolii)、^"猜格 包球殼(Leptosphaerulina briosiana)、 條紋單胞銹菌(Uromycesstriatus)、三葉草核盤菌(Sclerotinia trifoliorum)、草 木犀殼多抱(Stagonospora meliIoti)、匍柄霉(Stemphylium botryosum)、苜猜纖毛 菌(L印totrichila medicaginis)小麥丁香假單胞菌致黑致病變種(Pseudomonas syringae p. v. atrofaciens)、冰草條漂粉菌(Urocystisagropyri)、里予油菜黃單胞菌小 麥致病變種(Xanthomonas campestris p. v. translucens)、丁香假單胞菌丁香致病變種 (Pseudomonas syringae p. v. syringae)、鏈格抱、多主枝抱(Cladosporium herbarum)、 禾谷鐮？包、燕麥鐮孢(Fusarium avenaceum)、黃色鐮孢(Fusarium culmorum)、小麥 散黑粉病菌(Ustilago tritici)、小麥殼二孢(Ascochyta tritici)、麥類條斑病菌 (Cephalosporium gramineum)、禾生炭疽菌(Collotetrichumgraminicola)、小麥白粉菌 (Erysiphe graminis f. sp. tritici)、小麥禾干誘菌(Puccinia graminis f. sp. tritici)、 小麥葉誘菌(Puccinia recondita f. sp. tritici)、條形柄誘菌(Puccinia striiformis)、 小麥黃斑葉枯病菌(Pyrenophora tritici-repentis)、穎枯殼針抱(Septoria nodorum)、 小麥殼針？包(Septoria tritici)、燕麥殼針孢(Septoria avenae)、小麥基腐病菌 (Pseudocercosporella herpotrichoides)、立枯絲核菌、禾谷絲核菌(Rhizoctonia cerealis)、小麥全燭病菌(Gaeumannomyces graminis var. tritici)、瓜果腐霉、強(qiáng)雄腐 霉(Pythium arrhenommes)、終極腐霉、索氏離蠕孢(Bipolari s sorokiniana)、力胃 矮化病毒、雀麥草花葉病毒、土傳小麥花葉病毒、小麥條紋花葉病毒、小麥細(xì)長條紋病毒、 美國小麥條紋病毒、麥角菌(Clavic印s purpurea)、小麥腥黑粉菌(Tilletiatritici)、 小麥光腥黑粉菌(Tilletia laevis)、小麥散黑粉病菌(Ustilagotritici)、小麥印 度腥黑穗病菌(Tilletia indica)、立枯絲核菌、Pythiumarrhenomannes、禾生腐霉 (Pythium gramicola)、瓜果腐霉、高原病毒、歐洲小麥條紋病毒向日葵霍爾斯單軸霉 (Plasmopora halstedii)、核盤菌、翠菊黃化病、向日葵殼針孢(S印toria helianthi)、 向日葵褐腐病菌(Phomopsis helianthi)、向日葵黑斑病菌(Alternaria helianthi)、 百日草鏈格孢(Alternaria zinniae)、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、莖點霉黑莖病 (Phoma macdonaldii)、菜豆殼球抱菌、二抱白粉菌(Erysiphecichoracearum)、米根霉 (Rhizopus oryzae)、少根根霉(Rhizopusarrhizus)、匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)、向日葵柄葵銹菌(Pucciniahelianthi)、大麗花輪枝孢(Verticillium dahliae)、胡 蘿卜胃古月胃卜至禾中(Erwinia carotovorum pv. Carotovora)、Tjg 頭
抱(Cephalosporium acremonium)、隱地疫霉(Phytophthora cryptogea)、婆羅門參 白銹(Albugo tragopogonis)玉米禾生炭疽菌、串珠鐮孢亞黏團(tuán)變種(Fusarium moniliforme var. subglutinans)、斯氏歐文氏菌(Erwinia stewartii)、串珠鍵刀 菌(F. verticillioides)、玉蜀黍赤霉(Gibberella zeae)(禾谷鐮孢)、玉米穗腐病 菌(Stenocarpella maydi)(玉米色二孢)、畸雄腐霉、德巴利腐霉、禾生腐霉(Pythium graminicola)、華麗腐霉、終極腐霉、瓜果腐霉、黃曲霉(Aspergillus flavus)、小斑離 M 孢 O、T(Bipolaris maydis 0， T)(胃 $定孢月空 M (Cochliobolusheterostrophus)) > 炭色長蠕孢 I、II 和 III (Helminthosporium carbonuml, II&III)(玉米圓斑病菌 (Cochliobolus carbonum))、大斑病長螺抱 I、II 禾口 III (Exserohilum turcicum I、 II&III)、Helminthosporiumpedicel latum > 玉蜀黍節(jié)壺菌(Physoderma maydi s)、玉 米黃葉枯病菌(Phyllosticta maydis)、玉米眼斑病菌(Kabatiella maydis)、高粱尾 孢(Cercospora sorghi)、玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis)、高粱柄銹菌(Puccinia sorghi)、玉米多堆柄銹菌(Puccinia polysora)、菜豆殼球孢菌、草酸青霉(Penicillium oxalicum)、禾S 黑抱(Nigrospora oryzae)、多主枝抱(Cladosporium herbarum)、新月彎 Jfe (Curvularia lunata) > ^· ^ Sf (Curvularia inaequal i s) > ^ [=| Sf Jfe (Curvularia pallescens)、密執(zhí)安棒狀桿菌尼布拉斯力口亞種(Clavibacter michiganense subsp. nebraskense)、綠色木霉(Trichoderma viride)、玉米矮化花葉病毒A和B、小麥條紋花葉 病毒、玉米褪綠矮化病毒、高粱麥角菌(Clavic印s sorghi)、燕麥假單胞菌(Pseudonomas avenae)、菊歐文氏菌玉米致病變種(Erwiniachrysanthemi pv. Zea)、胡蘿卜軟腐歐文 氏菌(Erwinia carotovora)、玉米矮化螺原體屬(Corn stunt spiroplasma)、大抱色二 包(Diplodiamacrospora)、大 包才旨疫霄(Sclerophthora macrospora)、高梁才旨If 霄病菌 (Peronosclerospora sorghi)、菲律賓指霜霉病菌(Peronosclerosporaphilippinensis) 、玉蜀泰才旨It 病菌(Peronosclerospora maydis)、甘鹿才旨If霄病菌(Peronosclerospora sacchari)、黍軸黑粉菌(Sphacelothecareiliana)、玉米殼繡菌(Physopella zeae)、玉 蜀黍頭孢霉(C印halosporiummaydis)、頂頭孢、玉米褪綠花葉病毒、高原病毒、玉米花葉 病毒、玉米雷亞多精致病毒、玉米條紋病毒、玉米斑駁病毒、玉米粗縮病毒；高粱大斑病 長蠕孢、高粱炭疽病菌(C. sublineolum)、高粱尾孢(Cercospora sorghi)、高粱膠尾孢 (Gloeocercospora sorghi)、高粱生殼二孢(Ascochyta sorghina)、丁香假單胞菌丁香致 病變種、野油菜黃單胞菌棲絨毛草致病變種(Xanthomonas campestris p. v. holcicola)、 MIixIfi lif (Pseudomonas andropogonis)、紫柄f秀菌(Puccinia purpurea)、菜豆殼 球孢菌、高粱黑蔥花霉(Perconia circinata)、串珠鐮孢(Fusariummoniliforme)、鏈 格孢、高梁生平臍蠕孢(Bipolaris sorghicola)、高梁生長蠕孢(Helminthosporium sorghicola)、新月彎孢(Curvularia lunata)、高粱莖點霉(Phoma insidiosa)、燕麥假單 Ifelii (Pseudomonas avenae) ( ^^IlJftBf SEjix-^-Ifilii (Pseudomonas alboprecipitans)) > 蜀黍座枝孢(Ramulispora sorghi)、蜀黍生座枝孢(Ramulispora sorghicola)、甘蔴黑 痣菌(Phyllachara sacchari)、玉米絲黑穗病菌(Sporisoriumreilianum)(高梁絲黑穗 菌(Sphacelotheca reiliana))、高粱散黑粉菌(Sphacelotheca cruenta)、高梁堅軸黑粉菌(Sporisorium sorghi)、甘蔗花葉H、玉米矮化花葉病毒A和B、高粱麥角菌(Clavic^ps sorghi)、立枯絲核菌、緊密枝頂孢(Acremonium strictum)、大孢指疫霉(Sclerophthona macrospora)、高粱指霜霉病菌、菲律賓指霜霉病菌、禾生指梗霉(Sclerospora graminicola)、禾谷鐮孢、尖鐮孢、強(qiáng)雄腐霉、禾生腐霉等等。線蟲包括寄生線蟲諸如根癌線蟲、孢囊線蟲和根腐線蟲，包括異皮線蟲屬 (Heterodera spp.)、根結(jié)線蟲屬(Meloidogyne spp.)禾口胞囊線蟲屬(Globodera spp.)； 尤其是孢囊線蟲的成員，包括但不限于，大豆胞囊線蟲(Heterodera glycines)(大豆 孢囊線蟲)；甜菜胞囊線蟲(Heterodera schachtii)(甜菜孢囊線蟲)；禾谷胞囊線蟲 (Heteroderaavenae) ( )；禾口 g 令■ t _ & (Globodera rostochiensis) 和馬鈴薯白線蟲(Globodera pailida)(馬鈴薯孢囊線蟲)。根腐線蟲包括短體線蟲屬 (Pratylenchus spp.)。表型的各種改變是目標(biāo)，包括改變植物中脂肪酸組成，改變植物的氨基酸含量，改 變植物的病原體防御機(jī)制、和類似的改變。這些結(jié)果可通過提供異源產(chǎn)物的表達(dá)或增加植 物在內(nèi)源產(chǎn)物的表達(dá)來實現(xiàn)。目標(biāo)基因是商業(yè)市場的反映和作物開發(fā)中牽涉的作物的興趣。目標(biāo)作物和市場改 變，隨著發(fā)展中國家開放國際市場，還將出現(xiàn)新的作物和技術(shù)。此外，隨著人們對農(nóng)藝學(xué)性 狀和特征諸如產(chǎn)量和雜種優(yōu)勢的理解增加，用于轉(zhuǎn)化的基因選擇將相應(yīng)改變。目標(biāo)基因的 一般種類包括，例如，牽涉在信息中諸如鋅指的基因、牽涉在交流中諸如激酶的基因、和牽 涉在看家中諸如熱激蛋白的基因。更具體的轉(zhuǎn)基因種類，例如，包括編碼對農(nóng)業(yè)學(xué)重要的性 狀、昆蟲抗性、疾病抗性、除草劑抗性、不育性、谷物特征、和商業(yè)產(chǎn)物的基因。目標(biāo)基因通常 包括，牽涉在油、淀粉、糖類或營養(yǎng)代謝以及其它中的那些基因。此外，目標(biāo)基因包括從植物 和包括原核生物和其它真核細(xì)胞的其它來源的編碼酶和其它蛋白的基因。實施例1分離辣椒Bs3基因的野生型(Bs3)和Bs3_E等位基因從此前鑒定的衍生自包含Bs3基因的辣椒栽培品種EarlyCalifornian Wonder 30R(ECff-30R)的細(xì)菌人工染色體(BAC)克隆(Jordan 等人(2006) Theor. Appl. Genet. 113 895)分離辣椒的Bs3基因。材料和方法植物材料和浸潤將栽培品種Early California Wonder (ECW)和包含抗性基因Bs3的近-同基因系 ECW-30R的辣椒植物以及本氏煙草植物種植在溫室的標(biāo)準(zhǔn)條件下(日夜溫度分別是24°C和 190C )，光照16h、60%至40%的濕度。辣椒栽培品種ECW和近-同基因系ECW-30R種子由 R. E. StalKUniversity of Florida, Gainesville)提供。將六周大的辣椒植物用無針頭 的注射器接種5 X IO8菌落形成單位/ml的黃單胞菌屬。對于放線菌酮處理，以含有50 μ M 放線菌酮的如上細(xì)菌懸液接種葉組織。與BAC亞克隆互補(bǔ)將跨越Bs3 基因座的 BAC 克隆 128 (Jordan 等人(2006) Theor. Appl. Genet. 113 895)用 HindIII (Fermentas，St. Leon-Rot, Germany)部分消化。將彡 IOkb 的限制性片段 連接到在其T-DNA區(qū)不包含啟動子的雙元載體pVB61 (Schornack等人(2004) Plant J. 37 46)，并轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌菌株GV3101 (Μ. Holsters等人(1980) Plasmid 3:212)。將轉(zhuǎn)化子(OD6tltl = 0. 8)與遞送包含35S-驅(qū)動的avrBs3的T-DNA的根癌農(nóng)桿菌菌株1 1混合。 以鈍注射器將混合物注入到辣椒栽培品種ECW或本氏煙草的完全張開的葉片的背面。遞送 Bs3基因的根癌農(nóng)桿菌菌株在接種3-4天后誘導(dǎo)HR。序列和比對通過BLAST搜尋美國國家生物技術(shù)信息中心(www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/)和 SOL基因組網(wǎng)絡(luò)(http://WWW. sgn. Cornell, edu/tools/blast/)的數(shù)據(jù)庫來鑒定與辣椒 Bs3具有序列相似性的蛋白。從TAIR(www. arbidopsis. org)檢索來自擬南芥的FMO-樣序 列。用 ClustalW 程序(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)比對序列并用 boxshade 3. 21 禾呈序(http://www.ch.embnet.org/software/BOX_form.html)使得比對可見。Tree—View 1. 5. 2用于基于ClustalW的輸出結(jié)果產(chǎn)生樹。結(jié)果和討論對于基于互補(bǔ)的鑒定，將包含Bs3的BAC片段(Jordan等人(2006) Theor. Appl. Genet. 113 895)克隆到植物轉(zhuǎn)化載體中并經(jīng)由根癌農(nóng)桿菌-介導(dǎo)的瞬時轉(zhuǎn)化遞送到本氏 煙草葉片中。攜帶相同編碼序列的兩個不同克隆當(dāng)與avrBs3共轉(zhuǎn)化時在本氏煙草中觸發(fā) HR。僅包含預(yù)測的編碼序列和ATG上游約Ikb的序列的基因組DNA片段介導(dǎo)AvrBs3識別， 證實該基因是Bs3(圖1A)。缺少AD結(jié)構(gòu)域(AvrBs3 Δ AD)或重復(fù)單元11-14 (AvrBs3 Δ r印16)的AvrBs3突變 體在辣椒 Bs3 植物中不觸發(fā) HR(Herbers 等人(1992) Nature 356 172 ；Szurek 等人(2001) Plant J. 26 :523)，當(dāng)與克隆的Bs3基因共表達(dá)時也未能在本氏煙草觸發(fā)HR(圖1A)。與 AvrBs3具有97%相同但不被辣椒Bs3基因型識別的AvrBs4(Bonas等人(1993)Mol. Gen. Genet. 238 :261)，當(dāng)與Bs3共表達(dá)時也不在本氏煙草觸發(fā)HR(圖1A)。因此，在辣椒和本 氏煙草兩者中Bs3介導(dǎo)特異性識別野生型AvrBs3，但當(dāng)AvrBs3缺少AD結(jié)構(gòu)域或重復(fù)單元 11-14時不介導(dǎo)；也不介導(dǎo)識別AvrBs3-樣AvrBs4蛋白(圖1C)。Bs3基因具有三個外顯子和兩個內(nèi)含子(圖1D)，長342氨基酸(圖5)，與黃素-依 賴性單加氧酶(FMO)同源(圖 6) (Schlaich (2007) TrendsPlant Sci.，印刷中)。Bs3 與擬 南芥YUCCA家族的FMO最接近地相關(guān)(圖7)，但缺少所有相關(guān)FMO中存在的一段約70氨基 酸(圖8)。此前的分析顯示，AvrBs3_衍生物AvrBs3 Δ repl6 (缺少重復(fù)單元11-14)在辣椒栽 培品種ECW中觸發(fā)HR，但在近-同基因Bs3-抗性栽培品種ECW-30R中不觸發(fā)(Herbers等人 (1992) Nature 356 :172)。以包括約Ikb的啟動子的ECW Bs3等位基因(稱為Bs3_E)轉(zhuǎn)化 本氏煙草，顯示其介導(dǎo)AvrBs3Ar印16而不是AvrBs3的識別(圖1B)。此外，缺少C-末端 AD的AvrBs3 Ar印16當(dāng)與Bs3_E共表達(dá)時不觸發(fā)HR(圖1B)且Bs3_E不介導(dǎo)AvrBs4的識 另lj。因此，Bs3和Bs3-E代表具有不同識別特異性的功能等位基因(圖1C)。兩個Bs3等位 基因的編碼序列有單個核苷酸不同，賦予外顯子3的非同義改變，導(dǎo)致亮氨酸/苯丙氨酸的 差異(圖ID和5)。與Bs3相比，Bs3-E的啟動子區(qū)還由在相對于轉(zhuǎn)錄起始位點的位置_50 插入13-bp而不同。實施例2構(gòu)造和分析嵌合的Bs3/Bs3_E和Bs3_E/Bs3基因
將Bs3啟動子融合到Bs3_E編碼序列，并反向進(jìn)行，將這些嵌合體聯(lián)合avrBs3、 avrBs3Arepl6或相應(yīng)的AD突變體衍生物共轉(zhuǎn)化到本氏煙草。Tffe產(chǎn)生嵌合構(gòu)建體通過使用重疊延伸(SOE)PCR剪接來產(chǎn)生嵌合基因構(gòu)建體(Horton等人(1989) Gene 77 :61)。分別用 Phusion-聚合酶和引物 Al-fwd-ra(CTACGGAATAGCAGCATTAAGGCACAT CAG ；SEQID NO 18)和 B5_rev_PR (CATACGGAACACTGTATTGCTTAAGG ； SEQ ID NO 19)，從 ECW和 ECW-30R辣椒栽培品種的基因組DNA擴(kuò)增Bs3和Bs3_E啟動子。以引物f inal-entry-01-f wd(ATGATGAATCAGAATTGCTTTAATTCTTGTT C；SEQ ID NO 20)和 final-entry-02-rev (CATTT GTTCTTTCCAAATTTTGGCAATATC ；SEQ ID NO :21)擴(kuò)增編碼區(qū)。以1 1比混合編碼區(qū)和啟動 子區(qū)的PCR-產(chǎn)物，使用引物Al-fwd-PR和final-entry-02-rev進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將PCR-產(chǎn) 物克隆到pENTR-D中，測序后重新組合到T-DNA載體pGWBl中。結(jié)果和討論Bs3啟動子與BS3-E編碼序列融合專門地介導(dǎo)AvrBs3識別，而相反的嵌合體 (Bs3-E啟動子與Bs3編碼序列融合)專門地介導(dǎo)AvrBs3Ar印16的識別(圖2)。因此，啟 動子區(qū)而不是編碼區(qū)決定辣椒Bs3等位基因的識別特異性。實施例3分析以有毒和無毒Xcv菌株接種的辣椒葉片中Bs3基因的表達(dá)^^對Xcv感染的葉片的RT-PCR分析用鈍注射器將Xcv菌株85-10 (OD600 = 0 . 4)接種到ECW和ECW-30R辣椒植 物的背軸葉面。以表達(dá) avrBs3 (pDS300F) (Van denAckerveken 等人(1996) Cell 87 1307)、avrBs3AAD (pDSF341) (Szurek 等人(2001)Plant J. 26 :523)、avrBs4 (pDSF200) (Schornack 等人(2004) Plant J. 37 46), avrBs3 Δ repl6 (pDSF316) (Herbers 等人(1992) Nature356 172)或avrBs3 Δ r印16 Δ AD (pDSF317)的同基因Xcv菌株進(jìn)行接種。接種后24 小時收集四片葉盤(直徑5-mm)，并用于使用Qiagen RNeasy植物小量制備試劑盒(Qiagen， Hilden, Germany)的每次 RNA 提取。用 ND-1000 分光光度計(NanoDrop Technologies, Rockland，DE，USA)確定RNA濃度并在cDNA合成之前調(diào)整。使用寡dT_引物和Revert Aid 第一鏈合成試劑盒(Fermentas，St. Leon-Rot, Germany)由逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。對于Bs3的 RT-PCR，使用引物 Cand-7-01-fwd(ATGAATCAGAATTGCTTTAATTCTTGTTCA ;SEQ ID NO 22)禾口 Cand-7-01-rev (TGATTCTTGTGCTACATTTGTTCTTTCC ；SEQID NO :23)。為了 擴(kuò)增 EFl α (用于 RT-PCR 標(biāo)準(zhǔn)化)，使用引物 RS-EFrt-Fl (AGTCAACTACCACTGGTCAC ；SEQ ID NO 24)和 RS-EFr t-Rl (GTGCAGTAGTACTTAGTGGTC ；SEQ ID NO :25)。通過使用 SMART RACE 試劑盒(Clontech, Heidelberg, Germany)快速擴(kuò)增 cDNA 端(RACE)，分離 Bs3 和 Bs3_E cDNA 的 5，和 3，端。結(jié)果和討論半定量RT-PCR強(qiáng)有力地揭示在感染表達(dá)avrBs3的Xcv菌株而不是表達(dá) avrBs3 Δ repl6或avrBs4的Xcv菌株后辣椒ECW-30R Bs3植物中Bs3轉(zhuǎn)錄物水平增加(圖 3)。類似地，在感染表達(dá)avrBs3 Ar印16的Xcv菌株后ECW Bs3_E植物中的Bs3_E水平增 力口，但感染表達(dá)avrBs3或avrBs4的Xcv菌株后不增加。avrBs3和avrBs3 Δ repl6的AD-突變體衍生物不誘導(dǎo)Bs3或Bs3-E mRNA的積累。在翻譯抑制劑放線菌酮存在時表達(dá)模式未 改變(圖9)，說明Bs3和Bs3-E轉(zhuǎn)錄物的積累獨立于蛋白從頭合成。在Bs3啟動子控制下， 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時共表達(dá)avrBs3和Bs3_GFP融合體導(dǎo)致GFP熒光增加，而遞送Bs3_GFP本 身不產(chǎn)生GFP熒光(圖10)。這些數(shù)據(jù)一起表示，AvrBs3和AvrBs3 Δ repl6誘導(dǎo)各自的R 基因Bs3和Bs3-E轉(zhuǎn)錄，且這些R蛋白隨后的積累觸發(fā)HR。一致的是，花椰菜花葉病毒35S 啟動子控制下的Bs3或Bs3-E的組成型表達(dá)觸發(fā)avr獨立性HR(圖11)。鑒定了具有不危 及其蛋白穩(wěn)定性的單氨基酸置換的Bs3突變體，當(dāng)其在本氏煙草中表達(dá)時不再觸發(fā)HR(圖 12)，表示Bs3的酶促活性對于其作為細(xì)胞死亡誘導(dǎo)物起作用是決定性的。用遞送結(jié)構(gòu)上不相關(guān)的AvrBsl、AvrBs2或AvrBs3蛋白或無這些Avr蛋白的黃單 胞桿菌感染包含R基因Bsl、Bs2和Bs3的辣椒栽培品種ECW-123R。RT-PCR顯示，僅當(dāng)用表 達(dá)avrBs3的Xcv菌株感染后，Bs3衍生的轉(zhuǎn)錄物是可檢測的(圖14)。因此Bs3在Bsl-介 導(dǎo)的或Bs2-介導(dǎo)的HR過程中不被轉(zhuǎn)錄地活化。實施例4以AvrBs3蛋白和Bs3啟動子片段的電泳遷移率變動分析Tffe電泳遷移率變動分析(EMSA)對于DNA結(jié)合研究，以谷胱甘肽瓊脂糖4B(GE HealthcareBio-Sciences AB, Uppsala)從大腸桿菌(E. coli)BL21純化GST融合蛋白，由Bradford蛋白分析(BioRad, Hercules,CA,U. S. Α.)確定蛋白濃度。將未標(biāo)記的或5’-生物素-標(biāo)記的寡核苷酸的互補(bǔ)對 退火。根據(jù)制造商的實驗方案，用Light Shift 化學(xué)發(fā)光EMSA試劑盒(Pierce，Rockford) 進(jìn)行EMSA。使用如下參數(shù)結(jié)合反應(yīng)物包含12mMTris-HCl(pH 7. 5)、60mM KClUmM DTT、 2. 5%甘油、5mM MgCl2,50ng/μ 1 聚(dl .dC)、0. 05%NP-40,0. 2mM EDTA、50fmol 生物素-標(biāo) 記的DNA、0-10pmol未標(biāo)記的DNA、60_600fmol GST融合蛋白。加入生物素-標(biāo)記的DNA之 前，將結(jié)合反應(yīng)保持在冰上lOmin。在6%天然聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行凝膠電泳。印跡到帶 正電荷的尼龍膜(Roche Diagnostics,Mannheim)之后，通過在100°C烘烤lh，將DNA連接。結(jié)果和討論以GST_AvrBs3融合蛋白和生物素-標(biāo)記的Bs3和Bs3_E啟動子片段的電泳遷移 率變動分析(EMSA)(圖4A)顯示，AvrBs3與包含多態(tài)性的Bs3_衍生的和Bs3_E_衍生的啟 動子片段兩者結(jié)合，而對Bs3-衍生的片段表現(xiàn)更高親和性(圖4B)。以標(biāo)記的Bs3-衍生的 啟動子片段和未標(biāo)記的Bs3-衍生的和Bs3-E-衍生的啟動子片段的競爭測定以及反之亦然 的競爭測定證實，AvrBs3以高親和性結(jié)合于Bs3-啟動子片段，以低親和性結(jié)合于Bs3_E啟 動子片段(圖4C)。相反，AvrBs3不結(jié)合于來自Bs3啟動子非多態(tài)性區(qū)域的DNA片段(圖 4B)。此外EMSA研究顯示，與對Bs3-E啟動子相比，AvrBs3和AvrBs3 Ar印16兩者對Bs3具 有更高親和性(圖4和13A-C)。因此啟動子本身對AvrBs3或AvrBs3 Ar印16的結(jié)合不是 啟動子活化特異性的基礎(chǔ)。實施例5染色質(zhì)免疫沉淀分析方法染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)
對于ChIP，在分別以野油菜黃單胞菌皰病致病變種菌株82-8和82_8 Δ hrcV接種12小時后(hpi)收集3g辣椒ECW或ECW-30R葉片材料。如所述地(Offermann等人(2006) Plant Physiol. 141 1078)進(jìn)行ChIP，有如下修改所有緩沖液補(bǔ)充DTT而不是β -巰基 乙醇。IX complete (Roche)用作蛋白酶抑制劑。用Branson超聲波儀G250 (輸出控制3) 超聲處理染色質(zhì)6 X 20sec，并用ChIP稀釋緩沖液1 8.5稀釋。保留ΙΟΟμΙ澄清前的染 色質(zhì)溶液作為輸入對照，對其余溶液以15 μ 1親和性-純化的和耗盡的AvrBs3特異性抗體 Sta7進(jìn)行免疫沉淀(Bonas等人(1993)Mol. Gen. Genet. 238 :261)。由半定量PCR分析回收 的DNA，輸入DNA作為上樣對照。對輸入和共沉淀的DNA測試不同PCR循環(huán)數(shù)。結(jié)果和討論通過以表達(dá)avrBs3的Xcv野生型菌株或以同基因hrcV突變菌株浸潤辣椒 ECff-30R(Bs3)和ECW(Bs3-E)葉片來進(jìn)行染色質(zhì)免疫沉淀分析。HrcV是核心T3S系統(tǒng)的保 守蛋白，其突變體能夠遞送T3S效應(yīng)蛋白(Rossier等人(1999)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 9368)。用 AvrBs3 抗體免疫沉淀后(Knoop 等人(1991) J. Bacteriol. 173 7142)，由半定 量PCR檢測到Bs3而不是Bs3-E啟動子區(qū)的富集(圖4D)。這證實，Xcv-遞送的AvrBs3在 體內(nèi)結(jié)合Bs3啟動子的親和性比結(jié)合Bs3-E啟動子的親和性高?？紤]到Bs3啟動子富集僅 在以野生型接種的葉片材料中檢測到，而在以hrcV突變菌株接種的葉片材料中未檢測到， 推斷Bs3-啟動子在細(xì)胞裂解之前被結(jié)合。實施例6辣椒的Bs3基因的功能和結(jié)構(gòu)辣椒Bs3基因的分離揭露了機(jī)械上新型的識別機(jī)制和結(jié)構(gòu)上新型的共有對FMO的 同源性的R蛋白。最近，顯示與Bs3序列相關(guān)的一種擬南芥蛋白FMOl (參見圖6)，牽涉在 病原體防御中(Bartsch 等人(2006)Plant Cell 18 1038 ;Koch 等人(2006)Plant J. 47 629 ；Mishina&Zeier (2006) Plant Physiol. 141 :1666)。因此 FMOl 與 Bs3 可能具有相似功 能。然而，F(xiàn)MOl被包括毒性和無毒的微生物病原體的多種刺激物轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)(Bartsch等人 (2006)Plant Cell 18 1038 ；Mishina&Zeier(2006)Plant Physiol. 141 1666 ;01szak 等 人(2006)Plant Sciencel70 614)。相反，Bs3既不被毒性Xcv菌株誘導(dǎo)(圖3)也不被辣 椒R基因Bsl和Bs2介導(dǎo)的抗性反應(yīng)誘導(dǎo)(參見圖14)。此外，35S-驅(qū)動的Bs3等位基因 觸發(fā)HR反應(yīng)(圖11)，而35S-驅(qū)動的FMOl基因介導(dǎo)廣譜抗性但不介導(dǎo)HR(Bartsch等人 (2006) Plant Cell 18 1038 ;Koch 等人(2006) Plant J. 47 :629)。因此，擬南芥 FMOl 與辣 椒Bs3關(guān)于其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和功能方面不同。本文公開的結(jié)果證實，細(xì)菌效應(yīng)蛋白AvrBs3結(jié)合匹配的辣椒R基因Bs3的啟動子 并將其活化。對在相容的Xcv-辣椒相互作用中被AvrBs3( “upa”基因)J調(diào)的宿主基因 的分析(Marois 等人(2002)Mol. Plant-Microbe Interact. 15 :637_646 ；Kay 等人(2007) Science,已提交)導(dǎo)致鑒定upa-盒(TATATAAACCN2_3CC ；SEQ ID NO :17)，該盒是一種保守的 DNA元件，顯示為被AvrBs3結(jié)合，還存在于Bs3啟動子中(圖ID) (Kay等人(2007) Science， 已提交)。這表示，AvrBs3對upa-盒的結(jié)合對于相應(yīng)的啟動子的活化是決定性的。然而， 因為AvrBs3Ar印16結(jié)合Bs3的親和性比對Bs3_E啟動子更高(圖13)但僅活化Bs3_E而 不是Bs3啟動子(圖3)，AvrBs3-樣蛋白的結(jié)合不必導(dǎo)致啟動子活化。因為AvrBs3 Δ r印16 與AvrBs3的結(jié)構(gòu)不同，假設(shè)DNA結(jié)合后其功能結(jié)構(gòu)域(如，AD)暴露于不同啟動子位置，這可能界定AvrBs3Ar印16與AvrBs3是否能夠活化指定啟動子。另外，考慮到Bs3啟動子決 定識別特異性，Bs3啟動子可能是共同進(jìn)化來與快速改變的AvrBs3-樣蛋白保持相容；這與 在 NB-LRR 蛋白觀察到的相似(McDowell&Simon (2006)Mol. Plant Pathol. 7 437 ；Ellis 等 人(2007)Annu. Rev. Phytopathol. 45 289)?？赡懿粌HAvrBs3，還有其它AvrBs3同系物結(jié)合匹配的R基因的啟動子并將其活 化。最近分離的介導(dǎo)來自水稻黃單胞菌水稻致病變種(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)的 AvrBs3-樣 AvrXa27 蛋白的識別的水稻 R 基因 Xa27 (Gu 等人(2005) Nature 435 1122)被 AvrXa27轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)，因此傾向于推測Xa27啟動子是AvrXa27的直接靶。然而，AvrXa27是否 直接作用于Xa27啟動子有待闡明。本文所用的冠詞“一(a)”和“一(an)”是指一個或多于一個(即，至少一個)該 冠詞的語法對象。例如，“一種元件”是指一個或多個元件。在說明書全文中，詞語“包含(comprising) ”或變化形式諸如“包含(comprises)，， 或“包含(comprising) ”應(yīng)理解為意味著包含所指的成分、整數(shù)或步驟，或成分、整數(shù)或步驟 的組，但不排除任何其它成分、整數(shù)或步驟，或成分、整數(shù)或步驟的組。說明書中提及的所有出版物和專利申請表示本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員的水平。所 有出版物和專利申請通過引用并入本文，如同具體地和單獨地指明每篇單獨出版物或?qū)＠?申請通過引用并入的相同程度。盡管已經(jīng)為了清楚理解的目的，部分詳細(xì)地以示例和舉例的方式描述了前述發(fā) 明，將清楚的是，在所附權(quán)利要求書的范圍中，可以進(jìn)行某些改變和修改。
權(quán)利要求
一種分離的核酸分子，包含選自以下組成的組的核苷酸序列(a)列在SEQ ID NO1、3、4、9、11或12的核苷酸序列；(b)核苷酸序列，其編碼列在SEQ ID NO2或10的氨基酸序列；(c)核苷酸序列，其包含與列在SEQ ID NO1、3、4、9、11和/或12的核苷酸序列至少85％的核苷酸序列同一性，其中所述核苷酸分子編碼包含黃素單加氧酶活性的多肽；(d)核苷酸序列，其編碼包含與列在SEQ ID NO2和/或10的氨基酸序列至少85％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中所述核苷酸分子編碼包含黃素單加氧酶活性的多肽；(e)列在SEQ ID NO5、6、7、13、14或15的核苷酸序列；(f)核苷酸序列，其包含與列在SEQ ID NO5、6、7、13、14和/或15的核苷酸序列至少85％的核苷酸序列同一性，其中所述核苷酸分子包含Bs3啟動子活性；(g)核苷酸序列，其包含列在SEQ ID NO5、6或7的核苷酸序列的片段，其中所述片段包含UPA盒，且所述核苷酸分子包含Bs3啟動子活性；(h)核苷酸序列，其包含列在SEQ ID NO13、14或15的核苷酸序列的片段，其中所述片段包含UPA盒，且所述核苷酸分子包含Bs3啟動子活性；(i)核苷酸序列，其包含列在SEQ ID NO5的核苷酸序列的核苷酸968-982；(j)核苷酸序列，其包含列在SEQ ID NO13的核苷酸序列的核苷酸968-995；和(k)核苷酸序列，其與(a)-(j)任一項的核苷酸序列完全互補(bǔ)。
2.一種轉(zhuǎn)化的植物，包含穩(wěn)定地并入其基因組的異源多核苷酸，所述異源多核苷酸包 含選自以下組成的組的核苷酸序列(a)列在SEQID NO :1、3、9或11的核苷酸序列，所述核苷酸序列可操作地連接于驅(qū)動 在植物細(xì)胞中表達(dá)的啟動子；(b)核苷酸序列，其編碼列在SEQID NO :2或10的氨基酸序列，所述核苷酸序列可操 作地連接于驅(qū)動在植物細(xì)胞中表達(dá)的啟動子；(c)核苷酸序列，其包含與列在SEQID NO :1、3、9和/或11的核苷酸序列至少85% 的核苷酸序列同一性，其中所述核苷酸序列可操作地連接于驅(qū)動在植物細(xì)胞中表達(dá)的啟動 子，且所述核苷酸序列編碼包含黃素單加氧酶活性的多肽；(d)核苷酸序列，其編碼包含與列在SEQID NO :2和/或10的氨基酸序列至少85%的 氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中所述核苷酸序列可操作地連接于驅(qū)動在植物細(xì)胞中 表達(dá)的啟動子，且所述核苷酸序列編碼包含黃素單加氧酶活性的多肽；(e)列在SEQID NO 4或12的核苷酸序列；和(f)核苷酸序列，其包含與列在SEQID NO :4和/或12的核苷酸序列至少85%的核苷 酸序列同一性，其中所述核苷酸序列編碼包含黃素單加氧酶活性的多肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的轉(zhuǎn)化的植物，其中所述啟動子包含選自以下組成的組的核苷 酸序列⑴列在SEQ ID NO :5、6、7、13、14或15的核苷酸序列；(ii)核苷酸序列，其包含與列在SEQID而5、6、7、13、14和/或15的核苷酸序列至 少85%的核苷酸序列同一性，其中所述核苷酸分子包含Bs3啟動子活性；(iii)核苷酸序列，其包含列在SEQID NO :5、6或7的核苷酸序列的片段，其中所述片段包含UPA盒，且所述核苷酸分子包含Bs3啟動子活性；(iv)核苷酸序列，其包含列在SEQ ID NO :13、14或15的核苷酸序列的片段，其中所述 片段包含UPA盒，且所述核苷酸分子包含Bs3啟動子活性；(ν)核苷酸序列，其包含列在SEQ ID NO 5的核苷酸序列的核苷酸968-982 ；和 (vi)核苷酸序列，其包含列在SEQ ID NO :13的核苷酸序列的核苷酸968-995。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的轉(zhuǎn)化的植物，其中所述植物是單子葉植物或雙子葉植物。
5.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的轉(zhuǎn)化的植物，其中所述轉(zhuǎn)化的植物選自以下組成的組 辣椒、番茄、煙草、嫩莖花椰菜、花椰菜、卷心菜、豇豆、葡萄、油菜、扁豆、大豆、水稻、玉米、小 麥、大麥、柑橘、棉花、木薯、胡桃、茄子、矮牽牛和擬南芥。
6.根據(jù)權(quán)利要求2-5任一項所述的轉(zhuǎn)化的植物的種子，其中所述種子包含所述異源多 核苷酸。
7.一種轉(zhuǎn)化的植物，包含穩(wěn)定地并入其基因組的異源多核苷酸，其中所述異源多核苷 酸包含可操作地連接于目標(biāo)基因的啟動子，且所述啟動子包含選自以下組成的組的核苷酸 序列(a)列在SEQID NO :5、6、7、13、14或15的核苷酸序列；(b)核苷酸序列，其包含與列在SEQID NO :5、6、7、13、14和/或15的核苷酸序列至少 85%的核苷酸序列同一性，其中所述核苷酸分子包含Bs3啟動子活性；(c)核苷酸序列，其包含列在SEQID NO :5、6或7的核苷酸序列的片段，其中所述片段 包含UPA盒，且所述核苷酸分子包含Bs3啟動子活性；(d)核苷酸序列，其包含列在SEQID NO :13、14或15的核苷酸序列的片段，其中所述 片段包含UPA盒，且所述核苷酸分子包含Bs3啟動子活性；(e)核苷酸序列，其包含列在SEQID NO 5的核苷酸序列的核苷酸968-982 ；和(f)核苷酸序列，其包含列在SEQID NO :13的核苷酸序列的核苷酸968-995。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的轉(zhuǎn)化的植物，其中所述目標(biāo)基因包含選自以下組成的組的核 苷酸序列(i)列在SEQ ID NO :1、3、9或11的核苷酸序列，所述核苷酸序列可操作地連接于驅(qū)動 在植物細(xì)胞中表達(dá)的啟動子；( )核苷酸序列，其編碼列在SEQ ID NO :2或10的氨基酸序列，所述核苷酸序列可操 作地連接于驅(qū)動在植物細(xì)胞中表達(dá)的啟動子；iii)核苷酸序列，其包含與列在SEQ ID NO :1、3、9和/或11的核苷酸序列至少85% 的核苷酸序列同一性，其中所述核苷酸序列可操作地連接于驅(qū)動在植物細(xì)胞中表達(dá)的啟動 子，且所述核苷酸序列編碼包含黃素單加氧酶活性的多肽；和(iv)核苷酸序列，其編碼包含與列在SEQ ID NO :2和/或10的氨基酸序列至少85% 的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中所述核苷酸序列可操作地連接于驅(qū)動在植物細(xì)胞 中表達(dá)的啟動子，且所述核苷酸序列編碼包含黃素單加氧酶活性的多肽。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的轉(zhuǎn)化的植物，其中所述植物是單子葉植物或雙子葉植物。
10.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的轉(zhuǎn)化的植物，其中所述轉(zhuǎn)化的植物選自以下組成的組 辣椒、番茄、煙草、嫩莖花椰菜、花椰菜、卷心菜、豇豆、葡萄、油菜、扁豆、大豆、水稻、玉米、小 麥、大麥、柑橘、棉花、木薯、胡桃、茄子、矮牽牛和擬南芥。
11.根據(jù)權(quán)利要求7-10任一項所述的轉(zhuǎn)化的植物的種子，其中所述種子包含所述異源多核苷酸。
12.一種用包含選自以下組成的組的核苷酸序列的核苷酸分子轉(zhuǎn)化的非人類宿主細(xì)胞(a)列在SEQID NO :1、3、4、9、11或12的核苷酸序列；(b)核苷酸序列，其編碼列在SEQID NO 2或10的氨基酸序列；(c)核苷酸序列，其包含與列在SEQID N0:l、3、4、9、ll和/或12的核苷酸序列至少 85%的核苷酸序列同一性，其中所述核苷酸分子編碼包含黃素單加氧酶活性的多肽；(d)核苷酸序列，其編碼包含與列在SEQID NO :2和/或10的氨基酸序列至少85% 的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中所述核苷酸分子編碼包含黃素單加氧酶活性的多 肽；(e)列在SEQID NO :5、6、7、13、14或15的核苷酸序列；(f)核苷酸序列，其包含與列在SEQID NO :5、6、7、13、14和/或15的核苷酸序列至少 85%的核苷酸序列同一性，其中所述核苷酸分子包含Bs3啟動子活性；(g)核苷酸序列，其包含列在SEQID NO :5、6或7的核苷酸序列的片段，其中所述片段 包含UPA盒，且所述核苷酸分子包含Bs3啟動子活性；(h)核苷酸序列，其包含列在SEQID NO :13、14或15的核苷酸序列的片段，其中所述 片段包含UPA盒，且所述核苷酸分子包含Bs3啟動子活性；(i)核苷酸序列，其包含列在SEQID NO 5的核苷酸序列的核苷酸968-982 ； (j)核苷酸序列，其包含列在SEQ ID NO 13的核苷酸序列的核苷酸968-995 ；和 (k)核苷酸序列，其與(a)-(j)任一項的核苷酸序列完全互補(bǔ)。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的宿主細(xì)胞，其中所述核苷酸分子還包含可操作地連接于該 核苷酸表達(dá)的啟動子，所述啟動子驅(qū)動所述核苷酸序列在所述宿主細(xì)胞中表達(dá)。
14.根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是植物細(xì)胞。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的宿主細(xì)胞，其中所述植物細(xì)胞是種子細(xì)胞。
16.一種增加植物對至少一種植物病原體的抗性的方法，所述方法包括以包含選自以 下組成的組的核苷酸序列的核苷酸分子轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞(a)列在SEQID NO :1、3、9或11的核苷酸序列，所述核苷酸序列可操作地連接于驅(qū)動 在植物細(xì)胞中表達(dá)的啟動子；(b)核苷酸序列，其編碼列在SEQID NO :2或10的氨基酸序列，所述核苷酸序列可操 作地連接于驅(qū)動在植物細(xì)胞中表達(dá)的啟動子；(c)核苷酸序列，其包含與列在SEQID NO :1、3、9和/或11的核苷酸序列至少85% 的核苷酸序列同一性，其中所述核苷酸序列可操作地連接于驅(qū)動在植物細(xì)胞中表達(dá)的啟動 子，且所述核苷酸序列編碼包含黃素單加氧酶活性的多肽；(d)核苷酸序列，其編碼包含與列在SEQID NO :2和/或10的氨基酸序列至少85%的 氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中所述核苷酸序列可操作地連接于驅(qū)動在植物細(xì)胞中 表達(dá)的啟動子，且所述核苷酸序列編碼包含黃素單加氧酶活性的多肽；(e)列在SEQID NO 4或12的核苷酸序列；和(f)核苷酸序列，其包含與列在SEQID NO :4和/或12的核苷酸序列至少85%的核苷酸序列同一性，其中所述核苷酸序列編碼包含黃素單加氧酶活性的多肽。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，還包括從所述轉(zhuǎn)化的細(xì)胞再生轉(zhuǎn)化的植物。
18.根據(jù)權(quán)利要求16或17所述的方法，其中所述核苷酸分子還包含可操作地連接的啟 動子。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述啟動子是病原體誘導(dǎo)型啟動子。
20.根據(jù)權(quán)利要求18或19所述的方法，其中所述啟動子包含選自SEQID NO :5_7和 13-15組成的組的核苷酸序列。
21.根據(jù)權(quán)利要求16-20任一項所述的方法，其中所述植物選自以下組成的組辣椒、 番茄、煙草、嫩莖花椰菜、花椰菜、卷心菜、豇豆、葡萄、油菜、扁豆、大豆、水稻、玉米、小麥、大 麥、柑橘、棉花、木薯、胡桃、茄子、矮牽牛和擬南芥。
22.根據(jù)權(quán)利要求16-21任一項所述的方法，其中所述植物病原體是野油菜黃單胞菌 (Xanthomonas campestris)0
23.根據(jù)權(quán)利要求16-21任一項所述的方法，其中所述植物病原體是野油菜黃單胞菌 皰病致病變禾中(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria) (Xcv)。
24.根據(jù)權(quán)利要求16-23任一項所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)化的植物還包含編碼Bs2蛋白 的核苷酸序列。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中編碼該Bs2蛋白的所述核苷酸序列包含重組DNA。
26.一種在植物或植物細(xì)胞表達(dá)目標(biāo)基因的方法，所述方法包括以包含可操作地連接 于目標(biāo)基因的啟動子的多核苷酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其中所述啟動子包含選自以下組成 的組的核苷酸序列(a)列在SEQID NO :5、6、7、13、14或15的核苷酸序列；(b)核苷酸序列，其包含與列在SEQID NO :5、6、7、13、14和/或15的核苷酸序列至少 85%的核苷酸序列同一性，其中所述核苷酸分子包含Bs3啟動子活性；(c)核苷酸序列，其包含列在SEQID NO :5、6或7的核苷酸序列的片段，其中所述片段 包含UPA盒，且所述核苷酸分子包含Bs3啟動子活性；(d)核苷酸序列，其包含列在SEQID NO :13、14或15的核苷酸序列的片段，其中所述 片段包含UPA盒，且所述核苷酸分子包含Bs3啟動子活性；(e)核苷酸序列，其包含列在SEQID NO 5的核苷酸序列的核苷酸968-982 ；和(f)核苷酸序列，其包含列在SEQID NO :13的核苷酸序列的核苷酸968-995。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，還包括再生所述轉(zhuǎn)化的細(xì)胞為轉(zhuǎn)化的植物。
28.根據(jù)權(quán)利要求26或27所述的方法，其中所述目標(biāo)基因編碼該Bs3蛋白。
29.根據(jù)權(quán)利要求26-28任一項所述的方法，其中所述植物選自以下組成的組辣椒、 番茄、煙草、嫩莖花椰菜、花椰菜、卷心菜、豇豆、葡萄、油菜、扁豆、大豆、水稻、玉米、小麥、大 麥、柑橘、棉花、木薯、胡桃、茄子、矮牽牛和擬南芥。
30.一種在植物或植物細(xì)胞中高水平基因表達(dá)的方法，所述方法包括以第一多核苷酸 構(gòu)建體和第二多核苷酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其中所述第一多核苷酸構(gòu)建體包含可操作地 連接于編碼AvrBs3的核苷酸序列的第一啟動子，所述第二多核苷酸構(gòu)建體包含可操作地 連接于目標(biāo)基因的第二啟動子，且其中所述第二啟動子包含選自以下組成的組的核苷酸序列(a)列在SEQID NO :5、6、7、13、14或15的核苷酸序列；(b)核苷酸序列，其包含與列在SEQID NO :5、6、7、13、14和/或15的核苷酸序列至少 85%的核苷酸序列同一性，其中所述核苷酸分子包含Bs3啟動子活性；(c)核苷酸序列，其包含列在SEQID NO :5、6或7的核苷酸序列的片段，其中所述片段 包含UPA盒，且所述核苷酸分子包含Bs3啟動子活性；(d)核苷酸序列，其包含列在SEQID NO :13、14或15的核苷酸序列的片段，其中所述 片段包含UPA盒，且所述核苷酸分子包含Bs3啟動子活性；(e)核苷酸序列，其包含列在SEQID NO 5的核苷酸序列的核苷酸968-982 ；和(f)核苷酸序列，其包含列在SEQID NO 13的核苷酸序列的核苷酸968-995 ；其中所述目標(biāo)基因在所述植物或植物細(xì)胞中表達(dá)。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中與缺少所述第一多核苷酸構(gòu)建體的植物相比， 所述目標(biāo)基因以高水平表達(dá)。
32.根據(jù)權(quán)利要求30或31所述的方法，還包括再生所述轉(zhuǎn)化的細(xì)胞為轉(zhuǎn)化的植物。
33.根據(jù)權(quán)利要求30-32任一項所述的方法，其中所述植物選自以下組成的組辣椒、 番茄、煙草、嫩莖花椰菜、花椰菜、卷心菜、豇豆、葡萄、油菜、扁豆、大豆、水稻、玉米、小麥、大 麥、柑橘、棉花、木薯、胡桃、茄子、矮牽牛和擬南芥。
34.根據(jù)權(quán)利要求30-33任一項所述的方法，其中所述第一啟動子選自以下組成的組 組成型啟動子、損傷誘導(dǎo)型啟動子、病原體誘導(dǎo)型啟動子、化學(xué)調(diào)節(jié)啟動子、化學(xué)誘導(dǎo)型啟 動子和組織偏好啟動子。
35.根據(jù)權(quán)利要求30-34任一項所述的方法，其中所述第一啟動子包含選自以下組成 的組的核苷酸序列(a)列在SEQID NO :5、6、7、13、14或15的核苷酸序列；(b)核苷酸序列，其包含與列在SEQID NO :5、6、7、13、14和/或15的核苷酸序列至少 85%的核苷酸序列同一性，其中所述核苷酸分子包含Bs3啟動子活性；(c)核苷酸序列，其包含列在SEQID NO :5、6或7的核苷酸序列的片段，其中所述片段 包含UPA盒，且所述核苷酸分子包含Bs3啟動子活性；(d)核苷酸序列，其包含列在SEQID NO :13、14或15的核苷酸序列的片段，其中所述 片段包含UPA盒，且所述核苷酸分子包含Bs3啟動子活性；(e)核苷酸序列，其包含列在SEQID NO 5的核苷酸序列的核苷酸968-982 ；和(f)核苷酸序列，其包含列在SEQID NO :13的核苷酸序列的核苷酸968-995。
36.導(dǎo)致目標(biāo)植物部分中細(xì)胞死亡的方法，其包括以包含可操作地連接于驅(qū)動植物細(xì) 胞中基因表達(dá)的啟動子的核苷酸序列的多核苷酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其中所述核苷酸序 列選自以下組成的組(a)列在SEQID NO :1、3、9或11的核苷酸序列；(b)核苷酸序列，其編碼列在SEQID NO 2或10的氨基酸序列；(c)核苷酸序列，其包含與列在SEQID N0:l、3、9和/或11的核苷酸序列至少85%核 苷酸序列同一性，其中所述核苷酸序列編碼包含黃素單加氧酶活性的多肽；和(d)核苷酸序列，其編碼包含與列在SEQID NO :2和/或10的氨基酸序列至少85%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中所述核苷酸序列編碼包含黃素單加氧酶活性的多 肽；其中在所述目標(biāo)植物部分中表達(dá)所述核苷酸序列后，該目標(biāo)植物部分中發(fā)生細(xì)胞死亡。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，還包括從所述轉(zhuǎn)化的細(xì)胞再生轉(zhuǎn)化的植物。
38.根據(jù)權(quán)利要求36或37所述的方法，其中所述啟動子選自以下組成的組組織偏好 啟動子、化學(xué)誘導(dǎo)型啟動子和病原體誘導(dǎo)型啟動子。
39.根據(jù)權(quán)利要求36-38任一項所述的方法，其中所述植物選自以下組成的組辣椒、 番茄、煙草、嫩莖花椰菜、花椰菜、卷心菜、豇豆、葡萄、油菜、扁豆、大豆、水稻、玉米、小麥、大 麥、柑橘、棉花、木薯、胡桃、茄子、矮牽牛和擬南芥。
40.一種分離的多肽，包含選自以下組成的組的氨基酸序列(a)列在SEQID NO :2或10的氨基酸序列；(b)氨基酸序列，其由列在SEQID NO :1、3、4、9、11和12的核苷酸序列編碼；和(c)氨基酸序列，其具有與列在SEQID NO :2和/或10的氨基酸序列至少85%的氨基 酸序列同一性，其中所述多肽包含黃素單加氧酶活性。
全文摘要
提供了賦予對植物病原體野油菜黃單胞菌(Xanthomonascampestris)的抗性的分離的核酸分子。為了增強(qiáng)本來易于被這種細(xì)菌感染的植物對這種植物病原體的抗性，這些分子可被引入該植物。另外提供了分離的多肽和包含植物啟動子的分離的核酸分子。提供了使用核酸分子來增加植物對病原體的抗性并在植物中表達(dá)目標(biāo)基因的方法。
文檔編號C07K14/415GK101815722SQ200880109032
公開日2010年8月25日 申請日期2008年9月25日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月28日
發(fā)明者P·勒默爾, T·拉哈耶, U·博納斯 申請人:雙刃基金會