專利名稱：四氫吡喃核酸類似物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了四氫吡喃核苷類似物、由其制備的寡聚化合物以及使用該寡聚化合 物的方法。更具體地，各四氫吡喃類似物使用取代的四氫吡喃環(huán)替代天然存在的呋喃核糖 環(huán)。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的寡聚化合物與靶RNA的一部分雜交從而導(dǎo)致靶RNA 喪失正常功能。
背景技術(shù)：
反義技術(shù)是降低一種或多種特定基因產(chǎn)物表達(dá)的有效方法，并因此被證實(shí)在許多 治療、診斷和研究應(yīng)用中特別有效。化學(xué)修飾的核苷通常用于結(jié)合至反義序列以增強(qiáng)諸如 親和力和核酸酶耐性等的一種或多種特性。一種此類化學(xué)修飾的核苷包括四氫吡喃核苷類 似物，其中，呋喃糖環(huán)被四氫吡喃環(huán)所替代。文獻(xiàn)中已經(jīng)報(bào)道了各種四氫吡喃核苷類似物的合成，例如參見=Verheggen等， J. Med. Chem.，1995，38，826-835 ；Altmann 等，Chimia，1996，50，168-176 ；Herdewijn 等， Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters,1996,6(13),1457-1460 ；Verheggen 等， Nucleosides & Nucleotides，1996，15(1-3)，325—335 ；Ostrowski 等，J. Med. Chem.，1998， 41,4343-4353 ；Allart 等，Tetrahedron. ，1999,55,6527-6546 ；Wouters 等，Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters,1999,9,1563-1566 ;Brown 等，Drug Development Res., 2000，49，253-259 ；公開的 PCT 申請:W0 93/25565 ；WO 02/18406 ；和 WO 05/049582 ；美國專 利 5，314，893 ；5，607，922 ；和 6，455，507。已經(jīng)描述的各種四氫吡喃核苷類似物是單體并已被結(jié)合至寡聚化合物(例如 參見1993 年 12 月 23 日公開的 PCT 申請 WO 93/25565 ;Augustyns 等，Nucleic Acids Res.，1993, 21 (20)，4670-4676 ；Verheggen 等，J. Med. Chem.，1993，36，2033-2040 ； Van Aerschol φ, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. , 1995, 34 (12), 1338-1339 ；Anderson 等， Tetrahedron Letters,1996,37(45) ,8147-8150 ；Herdewijn φ, Liebigs Ann.,1996, 1337-1348 ；De Bouvere 等，LiebigsAnn./Recueil，1997，1453-1461 ；1513-1520 ；Hendrix 等，Chem. Eur. J.，1997，3(1)，110-120 ；Hendrix 等，Chem. Eur. J, 1997,3(9)，1513-1520 ； Hossain 等，J. Org. Chem.，1998，63，1574-1582 ；Allart 等，Chem. Eur. J.，1999,5(8)， 2424-2431 ；Boudou 等，Nucleic Acids Res.，1999，27 (6)，1450-1456 ；Kozlov 等，J.Am. Chem. Soc,1999，121，1108-1109 ；Kozlov 等，J. Am. Chem. Soc,1999，121,2653-2656 ；Kozlov 等，J Am. Chem. Soc,1999，121,5856-5859 ；Pochet 等，Nucleosides & Nucleotides,1999， 18(4&5)，1015-1017;V￡istm￡ms φ, Collection Symposium Series, 1999,2,156-160 ； Froeyen 等，HelveticaChimica Acta,2000，83，2153—2182 ;Kozlov 等，Chem. Eur. J，2000， 6(1), 151-155 ；Atkins 等，Parmazie，2000，55(8)，615-617 ;Lescrinier等，Chemistry& Biology, 2000，7，719-731；Lescrinier等，Helvetica Chimica Acta,2000，83，1291-1310 ； Wang 等，J. Am. Chem.，2000，122，8595-8602 ；美國專利申請 US 2004/0033967 ；公開的美國 專利申請US 2008/0038745 ；公開并授權(quán)的美國專利7，276，592)。文獻(xiàn)中已經(jīng)評述了 DNA 類似物(參見Leumann，J. C，Bioorganic & Medicinal Chemistry，2002，10，841-854)，其中包括對四氫吡喃核苷類似物(在“己糖醇核酸家族”標(biāo)題下)的一般討論。已制備具有磷酸二酯連接的3-H四氫吡喃核苷類似物的寡聚化合物(本領(lǐng)域也 稱其為HNA-己糖醇核酸或1，5_脫水己糖醇核酸)供細(xì)胞試驗(yàn)評價(jià)。已評價(jià)的不同基序 是充分修飾的(其中，各單體是磷酸二酯連接的3-H四氫吡喃核苷類似物)并且是有缺口 的(其中，寡聚化合物3和5外部區(qū)域的各單體各自為磷酸二酯連接的3-H四氫吡喃核苷 類似物，而內(nèi)部區(qū)域的各單體為硫代磷酸酯連接的脫氧核糖核苷(參見Kang等，Nucleic Acids Research, 2004, 32 (H), 4411-4419 ；Vandermeeren 等，2000，5 5，655-663 ；Flores 等， Parasitol Res.，1999，85，864-866 ；禾口 Hendrix 等，Chem. Eur. J, 1997，3 (9)，1513-1520)。已經(jīng)制備了具有磷酸二酯連接的3-0H四氫吡喃核苷類似物的寡聚化合物(本領(lǐng) 域也稱其為ANA或D-阿卓糖醇核酸)并進(jìn)行了結(jié)構(gòu)評價(jià)和體外評價(jià)(Allart等，Chem. Eur. J.，1999,5(8) ,2424-2431)。已經(jīng)制備了具有結(jié)合了己糖醇核苷酸的化學(xué)修飾的SiRNA(本領(lǐng)域也稱其為HNA 核酸)并測試了其沉默能力(參見公開的PCT申請，WO 06/047842，
公開日2006年5月 11日。因此，仍舊需要通過反義機(jī)制特異性調(diào)節(jié)基因表達(dá)的試劑。本發(fā)明公開了 4-取代 的-5-羥基-6-羥基-甲基-四氫吡喃核苷類似物，其可用于制備調(diào)節(jié)基因表達(dá)途徑的反 義化合物，包括那些依賴于RNA酶H、RNAi和dsRNA酶等作用機(jī)制以及基于靶降解或靶占有 的其它反義機(jī)制的化合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員通過本發(fā)明公開的內(nèi)容無需額外試驗(yàn)就能夠鑒 另O、制備和開發(fā)用于這些用途的反義化合物。發(fā)明概述本發(fā)明提供了四氫吡喃核苷類似物、包含四氫吡喃類似物的寡聚化合物以及使用 該寡聚化合物的方法。所述四氫吡喃核苷類似物能使結(jié)合了它們的寡聚化合物具有增強(qiáng)的 特性。本發(fā)明進(jìn)一步地分別詳細(xì)定義了各個(gè)變量。應(yīng)理解，本發(fā)明提供的四氫吡喃核苷 類似物、寡聚化合物以及其使用方法包括本發(fā)明所披露的實(shí)施方案和本發(fā)明所定義變量的 所有組合。在某些實(shí)施方案中，提供了具有式XVI的四氫吡喃核苷類似物
<formula>formula see original document page 10</formula>其中Bx是雜環(huán)堿基部分；T5是羥基保護(hù)基；
L1是H、鹵素、C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基；Z1 是0-或 OE1;Z2 是 OH、OE1 或 N (E1) (E2)；E1和E2各自獨(dú)立地為烷基或取代的烷基；q” q2、q3、q4、q5、q6和q7各自獨(dú)立地為H、C「C6烷基、取代的C「C6烷基、C2-C6烯 基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基；其中，各取代的基團(tuán)包含一個(gè)或多個(gè)獨(dú)立地選自下組的任選被保護(hù)的取代基鹵 素、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、OC ( = X) J1、OC ( = X) NJ1J2、NJ3C ( = X) NJ1J2 和 CN，其中，J1、J2 和 J3 各自獨(dú)立地是H或C1-C6烷基，且X為0、S或NJ115在某些實(shí)施方案中，提供了具有式XVI的四氫吡喃核苷類似物，其中，qi、q2、q3、q4、 %、屮和％各自是H。在某些實(shí)施方案中…^如如如如 和七中的至少一個(gè)不是扎在 某些實(shí)施方案中，qi> q2、q3、q4、q5、q6和q7中的至少一個(gè)是甲基。在某些實(shí)施方案中，提供了具有式XVI的四氫吡喃核苷類似物，其中，Bx是尿嘧 啶、5-甲基尿嘧啶、5-噻唑并-尿嘧啶、2-硫代-尿嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、胸腺嘧啶、 2-硫代-胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-噻唑并-胞嘧啶、5-丙炔基-胞嘧啶、腺嘌 呤、鳥嘌呤、2，6- 二氨基嘌呤、IH-嘧啶并[5，4-b] [ 1，4]苯并噁嗪2 (3H)-酮、IH-嘧啶并 [5,4-b] [1,4]苯并噻嗪-2(3H)_酮、9-(2_氨基乙氧基)-H-嘧啶并[5，4_b][l，4]苯并噁 嗪2(3H)_酮、2H-嘧啶并[4，5-b]吲哚_2_酮或H-吡啶并[3，2 :4，5]吡咯并[2，3_d]嘧 啶-2-酮。在某些實(shí)施方案中，Bx是尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞 嘧啶、2，6-二氨基嘌呤、腺嘌呤或鳥嘌呤。在某些實(shí)施方案中，提供了具有式XVI的四氫吡喃核苷類似物，其中，T5是乙酰基、 叔丁基、叔丁氧基甲基、甲氧基甲基、四氫吡喃基、1-乙氧基乙基、1-(2-氯乙氧基)乙基、 2-三甲基甲硅烷基乙基、對-氯苯基、2，4_ 二硝基苯基、芐基、苯甲?；?、對-苯基苯甲酰 基、2，6_ 二氯芐基、二苯基甲基、對-硝基芐基、三苯基甲基(三苯甲基)、4_甲氧基三苯甲 基、4，4_ 二甲氧基三苯甲基、三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔 丁基二苯基甲硅烷基、三苯基甲硅烷基、三異丙基甲硅烷基、苯甲酰甲酸酯基、氯乙酰基、三 氯乙酰基、三氟乙酰基、新戊酰基、9-芴基甲基碳酸酯基、甲磺酸酯基、甲苯磺酸酯基、三氟 甲磺酸酯基、三苯甲基、單甲氧基三 苯甲基、二甲氧基三苯甲基、三甲氧基三苯甲基或取代 的9-苯基黃嘌呤-9-基(pixyl)。在某些實(shí)施方案中，T5是乙?；?、芐基、叔丁基二甲基甲 硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基或二甲氧基三苯甲基。在某些實(shí)施方案中，提供了具有式XVI的四氫吡喃核苷類似物，其中，！^是？。在 某些實(shí)施方案中，L1是H。在某些實(shí)施方案中，提供了具有式XVI的四氫吡喃核苷類似物，其中，Z1是0_，且Z2 是OH。在某些實(shí)施方案中，Z1是0 (CH2) 2CN, Z2是N[CH2 (CH3) 2] 2，T5是4，4- 二甲氧基三苯甲 基。在某些實(shí)施方案中，Z1是0_，Z2是0H，其在四氫吡喃核苷類似物的4位提供了 H膦酸酯 基團(tuán)，其也可寫為3-0-P( = 0)(H)(0H或0_胺+)。在某些實(shí)施方案中，21是0(012)2^ Z2 是N [CH2 (CH3) 2] 2，并且T5是4，4- 二甲氧基三苯甲基，其在3-位提供了亞磷酰胺。在某些實(shí)施方案中，提供了具有式XVI的四氫吡喃核苷類似物，其具有式XVII所 示構(gòu)型<formula>formula see original document page 12</formula>在某些實(shí)施方案中，提供了具有式XVII的四氫吡喃核苷類似物，其中，qi、q2、q3、 q4、q5、q6和q7各自是H ；Bx是尿嘧啶、5_甲基尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5_甲基胞嘧啶、2， 6- 二氨基嘌呤、腺嘌呤或鳥嘌呤；T5是4，4- 二甲氧基三苯甲基-’τγ是O(CH2)2CN ；且Z2是 N [CH2 (CH3) 2]2。在某些實(shí)施方案中，提供了寡聚化合物，其包含至少一個(gè)式X的四氫吡喃核苷類 似物
<formula>formula see original document page 12</formula>其中，所述至少一個(gè)式X的四氫吡喃核苷類似物各自獨(dú)立地滿足Bx是雜環(huán)堿基部分；1~3和T4各自獨(dú)立地為將四氫吡喃核苷類似物連接到寡聚化合物的核苷間連接基 團(tuán)；或者T3和T4中的一個(gè)是將四氫吡喃核苷類似物連接到寡聚化合物的核苷間連接基團(tuán)， 且T3和T4中的另一個(gè)是H、羥基保護(hù)基、連接的共軛基團(tuán)或者5或3-末端基團(tuán)；Q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7各自獨(dú)立地為H、C「C6烷基、取代的C「C6烷基、C2-C6烯 基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基；隊(duì)和1 2中的一個(gè)為氟，而R1和R2中的另一個(gè)是H、鹵素、C1-C6烷基或取代的C1-C6 燒基；各取代的基團(tuán)包含一個(gè)或多個(gè)獨(dú)立地選自下組的任選被保護(hù)的取代基鹵素、 0J1 >NJ1J2,SJ1,N3>OC( = Χ)Λ>00( = X)NJ1J2,NJ3C( = X)NJ1J2 和 CN，其中，X 是 0、S 或 NJ1, 且J1、J2和J3各自獨(dú)立地是H或C1-C6烷基；和其中，所述寡聚化合物包含約8個(gè)至約40個(gè)通過核苷間連接基團(tuán)連接的單體亞單 元，且至少一個(gè)核苷間連接基團(tuán)是硫代磷酸酯核苷間連接基團(tuán)。在某些實(shí)施方案中，所述寡聚化合物包含至少兩個(gè)式X的四氫吡喃核苷類似物。 在某些實(shí)施方案中，所述寡聚化合物包含至少兩個(gè)通過硫代磷酸酯核苷間連接基團(tuán)連接的鄰近的式X的四氫吡喃核苷類似物。在某些實(shí)施方案中，所述寡聚化合物包含至少一個(gè)式X的四氫吡喃核苷類似物和 至少一個(gè)3-D-2-脫氧核糖核苷。在某些實(shí)施方案中，所述寡聚化合物包含至少一個(gè)通過 硫代磷酸酯核苷間連接基團(tuán)連接到β -D-2-脫氧核糖核苷的式X的四氫吡喃核苷類似物。在某些實(shí)施方案中，所述寡聚化合物包含至少一個(gè)具有2至約5個(gè)鄰近的式X的 四氫吡喃核苷類似物的區(qū)域。在某些實(shí)施方案中，所述寡聚化合物包含至少一個(gè)具有2 至約5個(gè)鄰近的式X的四氫吡喃核苷類似物的區(qū)域和至少一個(gè)具有除β -D-核糖核苷和 β -D-2-脫氧核糖核苷以外的1至約5個(gè)鄰近的單體亞單元的額外區(qū)域，其中，所述額外區(qū) 域通過至少一個(gè)β-D-2-脫氧核糖核苷與所述至少一個(gè)區(qū)域隔開。在某些實(shí)施方案中，提 供了寡聚化合物，其包含至少兩個(gè)區(qū)域，各區(qū)域具有1至約5個(gè)鄰近的式X的四氫吡喃核苷 類似物，且其中所述兩個(gè)區(qū)域通過至少一個(gè)單體亞單元隔開，其中，各單體亞單元獨(dú)立地為 核苷或修飾的核苷。在某些實(shí)施方案中，提供的寡聚化合物包含有缺口的(gapped)寡聚化合物，其包 含至少兩個(gè)區(qū)域，各區(qū)域具有1至約5個(gè)鄰近的式X的四氫吡喃核苷類似物，其中，所述鄰 近的式X的四氫吡喃核苷類似物的至少兩個(gè)區(qū)域中的一個(gè)位于5-端，而所述鄰近的式X的 四氫吡喃核苷類似物的至少兩個(gè)區(qū)域中的另一個(gè)位于3-端，且其中所述兩個(gè)區(qū)域通過包 含約6至約18個(gè)單體亞單元的內(nèi)部區(qū) 域隔開，其中，各單體亞單元獨(dú)立地為核苷或修飾的 核苷。在某些實(shí)施方案中，所述寡聚化合物包含至少一個(gè)磷酸二酯核苷間連接基團(tuán)。在 某些實(shí)施方案中，各核苷間連接基團(tuán)是硫代磷酸酯核苷間連接基團(tuán)。在某些實(shí)施方案中，提供了寡聚化合物，其中1、七、七、％、％、％和％各自是!1。在 某些實(shí)施方案中，qi>q2> q3、q4、q5、q6或q7中的至少一個(gè)不是H。在某些實(shí)施方案中，Ql、q2、 q3、q4、q5、q6或q7中的至少一個(gè)是甲基。在某些實(shí)施方案中，提供了寡聚化合物，其中，各四氫吡喃核苷類似物具有式XI 的構(gòu)型
屯<h
T3-O-^T0 Q3
qoOA5Bx
rJ Rj Rj
14
XI
O在某些實(shí)施方案中，提供了寡聚化合物，其中，各四氫吡喃核苷類似物具有式 XII <formula>formula see original document page 14</formula>在某些實(shí)施方案中，提供了寡聚化合物，其在長度上包含約10至約21個(gè)單體亞單 元。在某些實(shí)施方案中，提供了寡聚化合物，其在長度上包含約10至約16個(gè)單體亞單元。 在某些實(shí)施方案中，提供了寡聚化合物，其在長度上包含約10至約14個(gè)單體亞單元。在某 些實(shí)施方案中，術(shù)語“包含”僅僅是為了在寡聚化合物中常規(guī)添加額外的取代基，例如但不 限于諸如羥基保護(hù)基之類的保護(hù)基、任選連接的共軛基團(tuán)、5和/或3-末端基團(tuán)和/或其它 取代基。在某些實(shí)施方案中，提供了寡聚化合物，其包含至少兩個(gè)式XIII的四氫吡喃核苷 類似物
<formula>formula see original document page 14</formula>
其中所述式XIII的四氫吡喃核苷類似物各自獨(dú)立地滿足Bx是雜環(huán)堿基部分；1~3和T4各自獨(dú)立地為將四氫吡喃核苷類似物連接到寡聚化合物的核苷間連接基 團(tuán)；或者T3和T4中的一個(gè)是將四氫吡喃核苷類似物連接到寡聚化合物的核苷間連接基團(tuán)， 且T3和T4中的另一個(gè)是H、羥基保護(hù)基、連接的共軛基團(tuán)或者5或3-末端基團(tuán)；q” q2、q3、q4、q5、q6和q7各自獨(dú)立地為H、CrC6烷基、取代的CrC6烷基、C2-C6烯 基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基；R3和R4各自獨(dú)立地為H、羥基、鹵素、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基 或取代Wc1-C6烷氧基；各取代的基團(tuán)包含一個(gè)或多個(gè)獨(dú)立地選自下組的任選被保護(hù)的取代基鹵素、 0J1 >NJ1J2,SJ1,N3>OC( = Χ)Λ>00( = X)NJ1J2,NJ3C( = X)NJ1J2 和 CN，其中，X 是 0、S 或 NJ1, 且J1、J2和J3各自獨(dú)立地是H或C1-C6烷基；其中所述寡聚化合物包含約8至約40個(gè)單體亞單元；和至少兩個(gè)式XIII的四氫吡喃核苷類似物通過硫代磷酸酯核苷間連接基團(tuán)連接。在某些實(shí)施方案中，提供了寡聚化合物，其中，對于至少一個(gè)式XIII的四氫吡喃 核苷類似物而言，R3和R4之一是H，而R3和R4中的另一個(gè)是H、OCH3或F。在某些實(shí)施方案中，提供的寡聚化合物包含至少一個(gè)脫氧核糖核苷。在 某些實(shí)施方案中，提供的寡聚化合物包含至少一個(gè)β-D-2-脫氧核糖核苷，其中，至少一個(gè) β -D-2-脫氧核糖核苷通過硫代磷酸酯核苷間連接基團(tuán)連接到式XIII的四氫吡喃核苷類似物。在某些實(shí)施方案中，提供的寡聚化合物包含至少一個(gè)具有2至約5個(gè)鄰近的式XIII的四氫吡喃核苷類似物的區(qū)域。在某些實(shí)施方案中，提供的寡聚化合物包含至少一個(gè) 具有2至約5個(gè)鄰近的式XIII的四氫吡喃核苷類似物的區(qū)域和至少一個(gè)具有除β -D-核 糖核苷和β -D-2-脫氧核糖核苷外的1至約5個(gè)鄰近的單體亞單元的額外區(qū)域，其中，所述 額外區(qū)域通過至少一個(gè)β-D-2-脫氧核糖核苷與所述至少一個(gè)區(qū)域隔開。在某些實(shí)施方 案中，提供的寡聚化合物包含至少一個(gè)具有2至約5個(gè)鄰近的式XIII的四氫吡喃核苷類似 物的區(qū)域和至少一個(gè)具有1至約5個(gè)鄰近的式XIII的四氫吡喃核苷類似物的額外區(qū)域，其 中，具有2至約5個(gè)鄰近的式XIII的四氫吡喃核苷類似物的所述至少一個(gè)區(qū)域通過至少一 個(gè)核苷或修飾的核苷與具有1至約5個(gè)鄰近的式XIII的四氫吡喃核苷類似物的所述額外 區(qū)域隔開。在某些實(shí)施方案中，提供了寡聚化合物，其包含至少兩個(gè)具有1至約5個(gè)鄰近的式 XIII的四氫吡喃核苷類似物的區(qū)域，該寡聚化合物包含有缺口的寡聚化合物，其中，所述鄰 近的式XIII的四氫吡喃核苷類似物的至少兩個(gè)區(qū)域中的一個(gè)位于5-端，而所述鄰近的式 XIII的四氫吡喃核苷類似物的至少兩個(gè)區(qū)域中的另一個(gè)位于3-端，且其中所述兩個(gè)區(qū)域 通過包含約6至約14個(gè)單體亞單元的內(nèi)部區(qū)域隔開，其中，各單體亞單元獨(dú)立地為核苷或 修飾的核苷。在某些實(shí)施方案中，提供了寡聚化合物，其包含至少一個(gè)磷酸二酯核苷間連接基 團(tuán)。在某些實(shí)施方案中，提供了寡聚化合物，其中，各核苷間連接基團(tuán)是硫代磷酸酯核苷間 連接基團(tuán)。在某些實(shí)施方案中，提供了寡聚化合物，其中，Q1, q2、q3、q4、q5、q6和q7各自是H。 在某些實(shí)施方案中，其中，qi> q2、q3、q4、q5、q6或q7中的至少一個(gè)不是H。在某些實(shí)施方案 中，其中，91、七、七、94、％、96或％中的至少一個(gè)是甲基。在某些實(shí)施方案中，提供了寡聚化合物，其中，式XIII的各四氫吡喃核苷類似物 具有式XIV的構(gòu)型<formula>formula see original document page 15</formula>在某些實(shí)施方案中，提供了寡聚化合物，其中，至少一個(gè)四氫吡喃核苷類似物具有 式XV <formula>formula see original document page 16</formula>其中Bx是雜環(huán)堿基部分；和R5 是 H、OCH3 或 F。在某些實(shí)施方案中，提供了寡聚化合物，其中，各四氫吡喃核苷類似物具有式XV。 在某些實(shí)施方案中，提供了寡聚化合物，其中，各四氫吡喃核苷類似物具有式XV且各R5是 H。在某些實(shí)施方案中，提供了寡聚化合物，其中，各四氫吡喃核苷類似物具有式XV且各R5 是0CH3。在某些實(shí)施方案中，提供了寡聚化合物，其中，各四氫吡喃核苷類似物具有式XV且 各R5是F。在某些實(shí)施方案中，提供了寡聚化合物，其在長度上包含約10至約21個(gè)單體亞單 元。在某些實(shí)施方案中，提供了寡聚化合物，其在長度上包含約10至約16個(gè)單體亞單元。 在某些實(shí)施方案中，提供了寡聚化合物，其在長度上包含約10至約14個(gè)單體亞單元。在某 些實(shí)施方案中，術(shù)語“包含”僅僅是為了在寡聚化合物中常規(guī)添加額外的取代基，例如但不 限于諸如羥基保護(hù)基之類的保護(hù)基、任選連接的共軛基團(tuán)、5和/或3-末端基團(tuán)和/或其它 取代基。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于治療的寡聚化合物。在某些實(shí)施方案中，所 述治療是治療以不希望的基因表達(dá)為特征的疾病。在某些實(shí)施方案中，所述治療是通過抑 制基因表達(dá)來治療疾病。在某些實(shí)施方案中，使動(dòng)物細(xì)胞與所述寡聚化合物接觸。在某些 實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的寡聚化合物被用于制備用于治療以不希望的基因表達(dá)為特征的 疾病的藥物。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的寡聚化合物被用于制備通過抑制基因表達(dá) 來治療疾病的藥物。在某些實(shí)施方案中，提供了包含本發(fā)明提供的寡聚化合物和藥學(xué)上可 接受的載體的藥物組合物。在某些實(shí)施方案中，提供了式I的四氫吡喃核苷類似物<formula>formula see original document page 16</formula>其中Bx是雜環(huán)堿基部分；T1和T2中的一個(gè)是H或羥基保護(hù)基，而T1和T2中的另一個(gè)是H、羥基保護(hù)基或反 應(yīng)性磷基團(tuán)；
q” q2、q3、q4、q5、q6和q7各自獨(dú)立地為H、CrC6烷基、取代的CrC6烷基、C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基；隊(duì)和1 2中的一個(gè)為氟，而R1和R2中的另一個(gè)是H、鹵素、C1-C6烷基或取代的C1-C6 烷基；和其中，各取代的基團(tuán)包含一個(gè)或多個(gè)獨(dú)立地選自下組的任選被保護(hù)的取代基鹵 素、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、OC ( = X) J1、OC ( = X) NJ1J2、NJ3C ( = X) NJ1J2 和 CN，其中，J1、J2 和 J3 各自獨(dú)立地是H或C1-C6烷基，且X為0、S或NJ115在某些實(shí)施方案中，R1和R2中的另一個(gè)是H。在某些實(shí)施方案中，R1和R2各自為 氟。在某些實(shí)施方案中，R1和R2中的另一個(gè)是C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基。在某些實(shí)施 方案中，R1和R2中的另一個(gè)是甲基、乙基、取代的甲基或取代的乙基,R1和R2中的另一個(gè)是甲基。在某些實(shí)施方案中，^2、七、^5、％和％各自是!1。在某些實(shí)施方案中，qi、q2、 q3、q4、q5、q6和q7中的至少一個(gè)是C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基。在某些實(shí)施方案中，Q1 > q2、q3、q4、q5、q6和q7中的至少一個(gè)是甲基。在某些實(shí)施方案中，1和q2中的至少一個(gè)是甲 基。在某些實(shí)施方案中，七和％中的至少一個(gè)是甲基。在某些實(shí)施方案中，q5、％和％中 的至少一個(gè)是甲基。在某些實(shí)施方案中，1\和1~2各自是H。在某些實(shí)施方案中，1\和1~2中的至少一 個(gè)是羥基保護(hù)基。在某些實(shí)施方案中，各羥基保護(hù)基獨(dú)立地是乙?；?、叔丁基、叔丁氧基甲 基、甲氧基甲基、四氫吡喃基、1-乙氧基乙基、1-(2_氯乙氧基)乙基、2-三甲基甲硅烷基乙 基、對_氯苯基、2，4_ 二硝基苯基、芐基、苯甲?；?苯基苯甲?；?、2，6_ 二氯芐基、二 苯基甲基、對-硝基芐基、三苯基甲基(三苯甲基)、4_甲氧基三苯甲基、4，4_ 二甲氧基三 苯甲基、三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基-二苯基甲硅 烷基、三苯基甲硅烷基、三異丙基甲硅烷基、苯甲酰甲酸酯基、氯乙?；⑷纫阴；?、三氟 乙?；?、新戊?；?、9-芴基甲基碳酸酯基、甲磺酸酯基、甲苯磺酸酯基、三氟甲磺酸酯基、三 苯甲基、單甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基、三甲氧基三苯甲基或取代的9-苯基黃嘌 呤-9-基(pixyl)。在某些實(shí)施方案中，T1是乙酰基、芐基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲 硅烷基、4-甲氧基三苯甲基或4，4- 二甲氧基三苯甲基。在某些實(shí)施方案中，T1和T2中的一 個(gè)是羥基保護(hù)基，而T1和T2中的另一個(gè)是二異丙基氰基乙氧基亞磷酰胺或H-膦酸酯。在 某些實(shí)施方案中，T1是4，4- 二甲氧基三苯甲基，T2是二異丙基氰基乙氧基亞磷酰胺。在某些實(shí)施方案中，Bx是尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤或鳥嘌呤。在某些實(shí) 施方案中，Bx是嘧啶、取代的嘧啶、嘌呤或取代的嘌呤，其中，所述取代不是插入劑或當(dāng)該四 氫吡喃核苷類似物位于寡聚化合物內(nèi)時(shí)不與靶核酸相互作用的連接基團(tuán)。在某些實(shí)施方案 中，Bx是尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5-噻唑并-尿嘧啶、2-硫代-尿嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、 胸腺嘧啶、2-硫代-胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-噻唑并-胞嘧啶、5-丙炔基-胞 嘧啶、腺嘌呤、鳥嘌呤、2，6_ 二氨基嘌呤、IH-嘧啶并[5，4-b][l，4]苯并噁嗪_2 (3H)-酮、 IH-嘧啶并[5，4-b][l，4]苯并噻嗪_2 (3H)-酮、9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并[5，4_b][l， 4]苯并噁嗪-2(3H)_酮、2H-嘧啶并[4，5-b]吲哚_2_酮或H-吡啶并[3，2:4，5]吡咯并 [2，3-d]嘧啶-2-酮。Bx是尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基-胞嘧啶、5-丙炔基-胞嘧啶、腺嘌呤或鳥嘌呤。在某些實(shí)施方案中，所述四氫吡喃核苷類似物具有式Ia所示的構(gòu)型<formula>formula see original document page 18</formula>
其中Bx是雜環(huán)堿基部分；T1和T2中的一個(gè)是H或羥基保護(hù)基而T1和T2中的另一個(gè)是H、羥基保護(hù)基或反應(yīng) 性磷基團(tuán)；qi、q2、q3、q4、q5、q6和q各自獨(dú)立地為=IC1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、 取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基；隊(duì)和1 2中的一個(gè)為氟，而R1和R2中的另一個(gè)是H、鹵素、C1-C6烷基或取代的C1-C6 烷基；和其中，各取代的基團(tuán)包含一個(gè)或多個(gè)獨(dú)立地選自下組的任選被保護(hù)的取代基鹵 素、OJ1、NJ1J2, SJ1、N3、0C( = Χ) Λ、0C( = X)NJ1J2, NJ3C( = Χ)M1J2 和 CN，其中，各 Λ、J2 和 J3獨(dú)立地是H或C1-C6烷基，且X為0、S或NJ115在某些實(shí)施方案中，提供了具有如式Ia所示構(gòu)型的四氫吡喃核苷類似物，其中，R2 是氟。在某些實(shí)施方案中，提供了具有如式Ia所示構(gòu)型的四氫吡喃核苷類似物，其中，R1是 禮且1 2是氟。在某些實(shí)施方案中，提供了具有如式Ia所示構(gòu)型的四氫吡喃核苷類似物，其 中，R1 是 H, R2 是氟,且 q” q2、q3、q4、q5、q6 禾口 q7 各自是 H。在某些實(shí)施方案中，提供了具有如式Ia所示構(gòu)型的四氫吡喃核苷類似物，其中，R1 是C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基。在某些實(shí)施方案中，提供了具有如式Ia所示構(gòu)型的四氫 吡喃核苷類似物，其中，R1是甲基、乙基、取代的甲基或取代的乙基。在某些實(shí)施方案中，提 供了有如式Ia所示構(gòu)型的四氫吡喃核苷類似物，其中，R1和R2各自為氟。在某些實(shí)施方案中，提供了具有式II的四氫吡喃核苷類似物
<formula>formula see original document page 18</formula>
其中Bx是雜環(huán)堿基部分。在某些實(shí)施方案中，提供了寡聚化合物，其包含至少一個(gè)式III的四氫吡喃核苷類似物
<formula>formula see original document page 19</formula>其中，所述至少一個(gè)式III的四氫吡喃核苷類似物各自獨(dú)立地滿足Bx是雜環(huán)堿基部分；1~3和T4各自獨(dú)立地為將四氫吡喃核苷類似物連接到寡聚化合物的核苷間連接基 團(tuán)；或者T3和T4中的一個(gè)是將四氫吡喃核苷類似物連接到寡聚化合物的核苷間連接基團(tuán)； 且T3和T4中的另一個(gè)是H、羥基保護(hù)基、連接的共軛基團(tuán)或者5或3-末端基團(tuán)；q” q2、q3、q4、q5、q6和q7各自獨(dú)立地為H、C「C6烷基、取代的C「C6烷基、C2-C6烯 基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基；隊(duì)和1 2中的一個(gè)為氟，而R1和R2中的另一個(gè)是H、鹵素、C1-C6烷基或取代的C1-C6 燒基；各取代的基團(tuán)包含一個(gè)或多個(gè)獨(dú)立地選自下組的任選被保護(hù)的取代基鹵素、 OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、0C( = Χ)Λ、0C( = X)NJ1J2、NJ3C( = Χ)NJ1J2 和 CN，其中，各 Λ、J2 和 J3 獨(dú)立地是H或C1-C6烷基，且X為0、S或NJ1 ；和其中，所述寡聚化合物包含約8至約40個(gè)單體亞單元。在某些實(shí)施方案中，R1和R2中的另一個(gè)是H。在某些實(shí)施方案中，R1和R2各自為 氟。在某些實(shí)施方案中，R1和R2中的另一個(gè)是C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基。在某些實(shí)施 方案中，R1和R2中的另一個(gè)是甲基、乙基、取代的甲基或取代的乙基。在某些實(shí)施方案中， R1和R2中的另一個(gè)是甲基。在某些實(shí)施方案中，^2、七、^5、％和％各自是!1。在某些實(shí)施方案中，qi、q2、 q3、q4、q5、q6和q7中的至少一個(gè)是C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基。在某些實(shí)施方案中，Q1 > q2、q3、q4、q5、q6和q7中的至少一個(gè)是甲基。在某些實(shí)施方案中，1和q2中的至少一個(gè)是甲 基。在某些實(shí)施方案中，七和％中的至少一個(gè)是甲基。在某些實(shí)施方案中，q5、％和％中 的至少一個(gè)是甲基。在某些實(shí)施方案中，T3和T4中的至少一個(gè)是連接的共軛基團(tuán)。在某些實(shí)施方案中，各核苷間連接基團(tuán)獨(dú)立地為磷酸二酯或硫代磷酸酯核苷間連 接基團(tuán)。在某些實(shí)施方案中，各核苷間連接基團(tuán)是硫代磷酸酯核苷間連接基團(tuán)。在某些實(shí)施方案中，各Bx獨(dú)立地為尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤或鳥嘌呤。 在某些實(shí)施方案中，各Bx獨(dú)立地為嘧啶、取代的嘧啶、嘌呤或取代的嘌呤，其中，所述取 代不是插入劑或不與靶核酸相互作用的連接基團(tuán)。在某些實(shí)施方案中，Bx獨(dú)立地為尿嘧 啶、5-甲基尿嘧啶、5-噻唑并-尿嘧啶、2-硫代-尿嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、胸腺嘧啶、 2-硫代-胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-噻唑并-胞嘧啶、5-丙炔基-胞嘧啶、腺嘌呤、鳥嘌呤、2，6- 二氨基嘌呤、IH-嘧啶并[5，4-b] [1,4]苯并噁嗪2 (3H)-酮)、1H_嘧啶并 [5,4-b] [1,4]苯并噻嗪_2 (3H)-酮、9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并[5，4_b][l，4]苯并噁 嗪2(3H)_酮、2H-嘧啶并[4，5-b]吲哚_2_酮或H-吡啶并[3，2:4，5]吡咯并[2，3_d]嘧 啶-2-酮。在某些實(shí)施方案中，各Bx獨(dú)立地為尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、 胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-丙炔基-胞嘧啶、腺嘌呤或鳥嘌呤。在某些實(shí)施方案中，式III的各四氫吡喃核苷類似物具有式IIIa所示構(gòu)型
<formula>formula see original document page 20</formula>其中Bx是雜環(huán)堿基部分；1~3和T4各自獨(dú)立地為將四氫吡喃核苷類似物連接到寡聚化合物的核苷間連接基 團(tuán)；或者T3和T4中的一個(gè)是將四氫吡喃核苷類似物連接到寡聚化合物的核苷間連接基團(tuán)， 且T3和T4中的另一個(gè)是H、羥基保護(hù)基、連接的共軛基團(tuán)或者5或3-末端基團(tuán)；q” q2、q3、q4、q5、q6和q7各自獨(dú)立地為H、C「C6烷基、取代的C「C6烷基、C2-C6烯 基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基；隊(duì)和1 2中的一個(gè)為氟，而R1和R2中的另一個(gè)是H、鹵素、C1-C6烷基或取代的C1-C6 燒基；各取代的基團(tuán)包含一個(gè)或多個(gè)獨(dú)立地選自下組的任選被保護(hù)的取代基鹵素、 OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、0C( = Χ)Λ、0C( = X)NJ1J2、NJ3C( = Χ)NJ1J2 和 CN，其中，各 Λ、J2 和 J3 獨(dú)立地是H或C1-C6烷基，且X為0、S或NJ1 ；和其中，所述寡聚化合物包含約8至約40個(gè)核苷、修飾的核苷和/或四氫吡喃核苷 類似物。在某些實(shí)施方案中，提供了具有式IIIa的四氫吡喃核苷類似物，其中，R2是氟。在 某些實(shí)施方案中，提供了具有式IIIa的四氫吡喃核苷類似物，其中，R2是氟且R1是扎在某 些實(shí)施方案中，提供了具有式IIIa的四氫吡喃核苷類似物，其中，R2是氟，R1是禮且qi、q2、 Q3> Q4> Q5> Q6 禾口 ％ 各自是 Ho在某些實(shí)施方案中，提供了寡聚化合物，其中，各四氫吡喃核苷類似物具有式IV
<formula>formula see original document page 20</formula>其中
Bx是雜環(huán)堿基部分。在某些實(shí)施方案中，提供了寡聚化合物，其具有至少一個(gè)1至約5個(gè)四氫吡喃核苷 類似物的鄰近區(qū)域，其中，各四氫吡喃核苷類似物具有式Ilia。在某些實(shí)施方案中，提供了 寡聚化合物，其具有至少一個(gè)1至約5個(gè)四氫吡喃核苷類似物的鄰近區(qū)域，其中，各四氫吡 喃核苷類似物具有式IIIa且該寡聚化合物包含嵌段物(blockmer)。在某些實(shí)施方案中，提 供了寡聚化合物，其具有至少一個(gè)1至約5個(gè)四氫吡喃核苷類似物的鄰近區(qū)域，其中，各四 氫吡喃核苷類似物具有式IIIa且該寡聚化合物包含3或5-半體(hemimer)。在某些實(shí)施方案中，提供了寡聚化合物，其具有至少一個(gè)1至約5個(gè)四氫吡喃核苷 類似物的鄰近區(qū)域，其中，各四氫吡喃核苷類似物具有式IV
<formula>formula see original document page 21</formula>其中Bx是雜環(huán)堿基部分。在某些實(shí)施方案中，提供了寡聚化合物，其具有通過至少一個(gè)核苷或修飾的核苷 隔開的至少兩個(gè)區(qū)域，所述區(qū)域各具有1至約5個(gè)鄰近的具有式IIIa的四氫吡喃核苷類似 物。在某些實(shí)施方案中，提供了具有至少兩個(gè)區(qū)域的寡聚化合物，所述各區(qū)域具有1至約5 個(gè)鄰近的具有式IIIa的四氫-吡喃核苷類似物，所述寡聚化合物包含有缺口的寡聚化合 物，其中，所述四氫吡喃核苷類似物的至少兩個(gè)區(qū)域中的一個(gè)位于5-端，且所述四氫吡喃 核苷類似物的至少兩個(gè)區(qū)域中的另一個(gè)位于3-端，且其中所述四氫吡喃核苷類似物的兩 個(gè)區(qū)域通過包含約6至約14個(gè)獨(dú)立地選自核苷、修飾的核苷和四氫吡喃核苷類似物的單體 亞單元的內(nèi)部區(qū)域隔開。在某些實(shí)施方案中，實(shí)質(zhì)上，所述內(nèi)部區(qū)域中的各單體亞單元是 β -D-2-脫氧核糖核苷。在某些實(shí)施方案中，所述內(nèi)部區(qū)域包含約6至約14個(gè)β -D-2-脫 氧-核糖核苷。在某些實(shí)施方案中，所述內(nèi)部區(qū)域包含約10至約12個(gè)脫氧核糖 核苷。在某些實(shí)施方案中，所述內(nèi)部區(qū)域包含約10至約14個(gè)脫氧核糖核苷。在某些實(shí)施方案中，提供了具有至少兩個(gè)區(qū)域的的寡聚化合物，所述各區(qū)域具有2 至約3個(gè)鄰近的具有式IIIa的四氫吡喃核苷類似物，所述寡聚化合物包括有缺口的寡聚化 合物，其中，所述四氫吡喃核苷類似物的至少兩個(gè)區(qū)域中的一個(gè)位于5-端，而所述四氫吡 喃核苷類似物的至少兩個(gè)區(qū)域中的另一個(gè)位于3-端，且其中所述四氫吡喃核苷類似物的 兩個(gè)區(qū)域通過包含約6至約14個(gè)獨(dú)立地選自核苷、修飾的核苷和四氫吡喃核苷類似物的單 體亞單元的內(nèi)部區(qū)域隔開。在某些實(shí)施方案中，四氫吡喃核苷類似物的各區(qū)域獨(dú)立地包含 2個(gè)四氫吡喃核苷類似物。在某些實(shí)施方案中，四氫吡喃核苷類似物的各區(qū)域獨(dú)立地包含2 個(gè)四氫吡喃核苷類似物且所述內(nèi)部區(qū)域包含10個(gè)β -D-2-脫氧核糖核苷。在某些實(shí)施方案中，提供了有缺口的寡聚化合物，其中，四氫吡喃核苷類似物的各 區(qū)域獨(dú)立地包含2個(gè)四氫吡喃核苷類似物，且所述內(nèi)部區(qū)域包含10個(gè)β -D-2-脫氧核糖核苷，且各四氫吡喃核苷類似物具有式IV <formula>formula see original document page 22</formula>其中Bx是雜環(huán)堿基部分。在某些實(shí)施方案中，提供了具有至少兩個(gè)區(qū)域的寡聚化合物，所述各區(qū)域具有2 至約3個(gè)鄰近的具有式IIIa的四氫吡喃核苷類似物，所述寡聚化合物包括有缺口的寡聚化 合物，其中，所述四氫吡喃核苷類似物的至少兩個(gè)區(qū) 域中的一個(gè)位于5-端，且所述四氫吡 喃核苷類似物的至少兩個(gè)區(qū)域中的另一個(gè)位于3-端，且其中所述四氫吡喃核苷類似物的 兩個(gè)區(qū)域通過包含14個(gè)β-D-2-脫氧核糖核苷的內(nèi)部區(qū)域隔開。在某些實(shí)施方案中，四氫 吡喃核苷類似物的各區(qū)域獨(dú)立地包含2個(gè)四氫吡喃核苷類似物。在某些實(shí)施方案中，各四 氫吡喃核苷類似物具有式IV <formula>formula see original document page 22</formula>其中Bx是雜環(huán)堿基部分。在某些實(shí)施方案中，提供了還包含3-末端基團(tuán)的有缺口的寡聚化合物。在某些實(shí) 施方案中，所述3-末端基團(tuán)包含1至約4個(gè)修飾的或未修飾的核苷。在某些實(shí)施方案中，提供了寡聚化合物，其在長度上包含約10至約21個(gè)單體亞單 元。在某些實(shí)施方案中，提供了寡聚化合物，其在長度上包含約10至約16個(gè)單體亞單元。 在某些實(shí)施方案中，提供了寡聚化合物，其在長度上包含約10至約14個(gè)單體亞單元。在某些實(shí)施方案中，提供了包含至少兩個(gè)鄰近的式V的四氫吡喃核苷類似物的寡
聚化合物<formula>formula see original document page 23</formula>其中，所述式V的四氫吡喃核苷類似物各自獨(dú)立地滿足Bx是雜環(huán)堿基部分；1~3和T4各自獨(dú)立地為將四氫吡喃核苷類似物連接到寡聚化合物的核苷間連接基 團(tuán)；或者T3和T4中的一個(gè)是將四氫吡喃核苷類似物連接到寡聚化合物的核苷間連接基團(tuán)， 且T3和T4中的另一個(gè)是H、羥基保護(hù)基、連接的共軛基團(tuán)、或者5或3-末端基團(tuán)；Q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7各自獨(dú)立地為H、CrC6烷基、取代的C1-C6烷基、C2-C6烯 基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基；R3和R4各自獨(dú)立地為H、羥基、氟、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基或 取代的C1-C6烷氧基；各取代的基團(tuán)包含一個(gè)或多個(gè)獨(dú)立地選自下組的任選被保護(hù)的取代基鹵素、 OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、OC ( = Χ) Λ、OC ( = X) NJ1J2、NJ3C ( = X) NJ1J2 和 CN，其中，Λ、J2 和 J3 各 自獨(dú)立地是H或C1-C6烷基，且X為0、S或NJ1 ；所述寡聚化合物包含約8至約40個(gè)單體亞單元；和其中，所述至少兩個(gè)鄰近的四氫吡喃核苷類似物中的至少兩個(gè)通過除磷酸二酯核 苷間連接基團(tuán)之外的核苷間連接基團(tuán)連接。在某些實(shí)施方案中，Q1, q2、q3、q4、q5、Q6和q7中的至少一個(gè)是C「C6烷基或取代的 C1-C6烷基。在某些實(shí)施方案中，1、七、七、1、％、％和％中的至少一個(gè)是甲基。在某些實(shí)施 方案中，Q1和％中的至少一個(gè)是甲基。在某些實(shí)施方案中，％和％中的至少一個(gè)是甲基。 在某些實(shí)施方案中，q5、q6和q7中的至少一個(gè)是甲基。在某些實(shí)施方案中，^2、七、^5、％和％各自是!1。在某些實(shí)施方案中，qi、q2、 q3、q4、q5、q6和q7各自是H，且R3是H。在某些實(shí)施方案中，q:、q2、q3、q4、q5、q6和q7各自是 H，R3是H，且R4是H。在某些實(shí)施方案中41、％、七、94、％46和q7各自是H，R3是H，且R4是 OCH30在某些實(shí)施方案中…^如如如如 和七各自是扎民是扎且禮是氟。在某些實(shí) 施方案中，Q1^ q2> Q3> Q4> Q5> Q6和％各自是H，R3是H，且R4是羥基。在某些實(shí)施方案中，q” q2、q3、q4、q5、q6和q7各自是H，R3是H，而各R4是H、OCH3、氟或羥基。在某些實(shí)施方案中，提供了寡聚化合物，其包含至少兩個(gè)鄰近的式V的四氫吡喃 核苷類似物，其中，1~3和T4中的至少一個(gè)是連接的共軛基團(tuán)，且其中，所述至少兩個(gè)鄰近的 四氫吡喃核苷類似物中的至少兩個(gè)通過除磷酸二酯核苷間連接基團(tuán)之外的核苷間連接基 團(tuán)連接。在某些實(shí)施方案中，所述至少兩個(gè)鄰近的四氫吡喃核苷類似物中的至少兩個(gè)通過 硫代磷酸酯核苷間連接基團(tuán)連接。在某些實(shí)施方案中，所述至少兩個(gè)鄰近的四氫吡喃核苷 類似物中的至少兩個(gè)通過含磷的核苷間連接基團(tuán)連接。在某些實(shí)施方案中，所述至少兩個(gè) 鄰近的四氫吡喃核苷類似物中的至少兩個(gè)通過不含磷的核苷間連接基團(tuán)連接。在某些實(shí)施方案中，所述至少兩個(gè)鄰近的四氫吡喃核苷類似物中的至少兩個(gè)通過中性核苷間連接基團(tuán) 連接。在某些實(shí)施方案中，各核苷間連接基團(tuán)獨(dú)立地為磷酸二酯或硫代磷酸酯核苷間連接 基團(tuán)。在某些實(shí)施方案中，各核苷間連接基團(tuán)是硫代磷酸酯核苷間連接基團(tuán)。在某些實(shí)施方案中，提供了寡聚化合物，其包含至少兩個(gè)鄰近的式V的四氫吡喃 核苷類似物，其中，所述至少兩個(gè)鄰近的四氫吡喃核苷類似物中的至少兩個(gè)通過除磷酸二 酯核苷間連接基團(tuán)之外的核苷間連接基團(tuán)連接，且其中，各Bx獨(dú)立地為尿嘧啶、胸腺嘧啶、 胞嘧啶、腺嘌呤或鳥嘌呤。在某些實(shí)施方案中，各Bx獨(dú)立地為嘧啶、取代的嘧啶、嘌呤或取 代的嘌呤，其中，所述取代不是插入劑或不與靶核酸相互作用的連接基團(tuán)。在某些實(shí)施方 案中，各Bx獨(dú)立地為尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5-噻唑并-尿嘧啶、2-硫代-尿嘧啶、5-丙 炔基_尿嘧啶、胸腺嘧啶、2-硫代-胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-噻唑并-胞嘧啶、 5_丙炔基-胞嘧啶、腺嘌呤、鳥嘌呤、2，6_ 二氨基嘌呤、IH-嘧啶并[5，4-b][l，4]苯并噻 嗪-2 (3H)-酮)、IH-嘧啶并[5，4-b] [1,4]苯并噻嗪_2 (3H)-酮、9- (2-氨基乙氧基)-H-嘧 啶并[5，4-b][l，4]苯并噁嗪2(3H)_酮、2H-嘧啶并[4，5_b]吲哚_2_酮或H-吡啶并[3， 2 :4，5]_吡咯并[2，3-d]嘧啶-2-酮。在某些實(shí)施方案中，各Bx獨(dú)立地為尿嘧啶、5-甲基 尿嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-丙炔基-胞嘧啶、腺嘌呤 或鳥嘌呤。在某些實(shí)施方案中，提供了寡聚化合物，其包含至少兩個(gè)鄰近的式V的四氫吡喃 核苷類似物，其中，所述至少兩個(gè)鄰近的四氫吡喃核苷類似物中的至少兩個(gè)通過除磷酸二 酯核苷間連接基團(tuán)之外的核苷間連接基團(tuán)連接，其中，各式V的四氫吡喃核苷類似物具有 式Va所示構(gòu)型
<formula>formula see original document page 24</formula>Bx是雜環(huán)堿基部分；1~3和T4各自獨(dú)立地為將四氫吡喃核苷類似物連接到寡聚化合物的核苷間連接基 團(tuán)；或者T3和T4中的一個(gè)是將四氫吡喃核苷類似物連接到寡聚化合物的核苷間連接基團(tuán)， 且T3和T4中的另一個(gè)是H、羥基保護(hù)基、連接的共軛基團(tuán)、或者5或3-末端基團(tuán)；q” q2、q3、q4、q5、q6和q7各自獨(dú)立地為H、CrC6烷基、取代的CrC6烷基、C2-C6烯 基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基；R3和R4各自獨(dú)立地為H、羥基、氟、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基或 取代的C1-C6烷氧基；和各取代的基團(tuán)包含一個(gè)或多個(gè)獨(dú)立地選自下組的任選被保護(hù)的取代基鹵素、 OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、OC ( = Χ) Λ、OC ( = X) NJ1J2、NJ3C ( = X) NJ1J2 和 CN，其中，Λ、J2 和 J3 各 自獨(dú)立地是H或C1-C6烷基，且X為0、S或NJ115在某些實(shí)施方案中，提供了寡聚化合物，其包含至少兩個(gè)鄰近的式Va的四氫吡喃核苷類似物，其中，所述至少兩個(gè)鄰近的四氫吡喃核苷類似物中的至少兩個(gè)通過除磷酸二 酯核苷間連接基團(tuán)之外的核苷間連接基團(tuán)連接，且其中所述寡聚化合物包含具有1至約5 個(gè)四氫吡喃核苷類似物的至少一個(gè)鄰近區(qū)域。在某些實(shí)施方案中，所述寡聚化合物包含嵌 段物。在某些實(shí)施方案中，所述寡聚化合物包含3或5-半體。在某些實(shí)施方案中，提供了寡聚化合物，其包含至少兩個(gè)鄰近的式Va的四氫吡喃 核苷類似物，其中，所述至少兩個(gè)鄰近的四氫吡喃核苷類似物中的至少兩個(gè)通過除磷酸二 酯核苷間連接基團(tuán)之外的核苷間連接基團(tuán)連接，且其中所述寡聚化合物包含通過至少一個(gè) 核苷或修飾的核苷隔開的至少兩個(gè)區(qū)域，所述各區(qū)域具有1至約5個(gè)鄰近的四氫吡喃核苷 類似物。在某些實(shí)施方案中，所述寡聚化合物包含有缺口的寡聚化合物，其中，四氫吡喃核 苷類似物的一個(gè)外部區(qū)域位于5-端，而四氫吡喃核苷類似物的第二個(gè)外部區(qū)域位于3-端， 且其中，所述兩個(gè)外部區(qū)域通過包含約6至約14個(gè)獨(dú)立地選自核苷、修飾的核苷、和四氫吡 喃核苷類似物的單體亞單元的內(nèi)部區(qū)域隔開。在某些實(shí)施方案中，實(shí)質(zhì)上，所述內(nèi)部區(qū)域中 的各單體亞單元是脫氧核糖核苷。在某些實(shí)施方案中，所述內(nèi)部區(qū)域包含約6至 約14個(gè)脫氧核糖核苷。在某些實(shí)施方案中，所述內(nèi)部區(qū)域包含約10至約12個(gè) 3-D-2-脫氧核糖核苷。在某些實(shí)施方案中，所述內(nèi)部區(qū)域包含約10至約14個(gè)i3-D-2-脫 氧核糖核苷。在某些實(shí)施方案中，各外部區(qū)域獨(dú)立地包含2至約3個(gè)四氫吡喃核苷類似物。 在某些實(shí)施方案中，各外部區(qū)域獨(dú)立地包含2個(gè)四氫吡喃核苷類似物。在某些實(shí)施方案中， 各外部區(qū)域獨(dú)立地包含2個(gè)四氫吡喃核苷類似物且所述內(nèi)部區(qū)域包含10個(gè)β -D-2-脫氧 核糖核苷。在某些實(shí)施方案中，提供了寡聚化合物，其包含至少兩個(gè)鄰近的式V的四氫吡喃 核苷類似物，其中，所述至少兩個(gè)鄰近的四氫吡喃核苷類似物中的至少兩個(gè)通過除磷酸二 酯核苷間連接基團(tuán)之外的核苷間連接基團(tuán)連接，且其中的各四氫吡喃核苷類似物具有式Vb 所示的結(jié)構(gòu)式和構(gòu)型<formula>formula see original document page 25</formula>其中Bx是雜環(huán)堿基部分；1~3和T4各自獨(dú)立地為將四氫吡喃核苷類似物連接到寡聚化合物的核苷間連接基 團(tuán)；或者T3和T4中的一個(gè)是將四氫吡喃核苷類似物連接到寡聚化合物的核苷間連接基團(tuán)， 且T3和T4中的另一個(gè)是H、羥基保護(hù)基、連接的共軛基團(tuán)、或者5或3-末端基團(tuán)；和R4 是 H、羥基、氟或 OCH3。在某些實(shí)施方案中，提供了寡聚化合物，其包含至少兩個(gè)鄰近的式V的四氫吡喃 核苷類似物，其中，所述至少兩個(gè)鄰近的四氫吡喃核苷類似物中的至少兩個(gè)通過除磷酸二 酯核苷間連接基團(tuán)之外的核苷間連接基團(tuán)連接，且其中各四氫吡喃核苷類似物具有式Vb 和禮扎在某些實(shí)施方案中，R4是羥基。在某些實(shí)施方案中，禮是0013。在某些實(shí)施方案中，R4是氟。在某些實(shí)施方案中，提供了寡聚化合物，其包含至少兩個(gè)鄰近的式V的四氫吡喃核苷類似物，其中，所述至少兩個(gè)鄰近的四氫吡喃核苷類似物中的至少兩個(gè)通過除磷酸二 酯核苷間連接基團(tuán)之外的核苷間連接基團(tuán)連接，且其中各寡聚化合物在長度上包含約10 至約21個(gè)單體亞單元。在某些實(shí)施方案中，各寡聚化合物在長度上包含約10至約16個(gè)單 體亞單元。在某些實(shí)施方案中，各寡聚化合物在長度上包含約10至約14個(gè)單體亞單元。在某些實(shí)施方案中，提供了方法，該方法包括將動(dòng)物細(xì)胞與寡聚化合物接觸，所述 寡聚化合物包含至少一個(gè)式V的四氫吡喃核苷類似物
<formula>formula see original document page 26</formula>其中，所述至少一個(gè)式V的四氫吡喃核苷類似物各自獨(dú)立地滿足Bx是雜環(huán)堿基部分；1~3和T4各自獨(dú)立地為將四氫吡喃核苷類似物連接到寡聚化合物的核苷間連接基 團(tuán)；或者T3和T4中的一個(gè)是將四氫吡喃核苷類似物連接到寡聚化合物的核苷間連接基團(tuán)， 且T3和T4中的另一個(gè)是H、羥基保護(hù)基、連接的共軛基團(tuán)、或者5或3-末端基團(tuán)；q” q2、q3、q4、q5、q6和q7各自獨(dú)立地為H、CrC6烷基、取代的CrC6烷基、C2-C6烯 基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基；R3和R4各自獨(dú)立地為H、羥基、氟、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基或 取代的C1-C6烷氧基；各取代的基團(tuán)包含一個(gè)或多個(gè)獨(dú)立地選自下組的任選被保護(hù)的取代基鹵素、 OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、OC ( = Χ) Λ、OC ( = X) NJ1J2、NJ3C ( = X) NJ1J2 和 CN，其中，Λ、J2 和 J3 各 自獨(dú)立地是H或C1-C6烷基，且X為0、S或NJ1 ；和其中所述寡聚化合物包含約8至約40個(gè)單體亞單元并與靶RNA互補(bǔ)。在某些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是人細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，所述靶RNA選自 mRNA、前-mRNA和微RNA。在某些實(shí)施方案中，所述靶RNA是mRNA。在某些實(shí)施方案中，所 述靶RNA是人mRNA。在某些實(shí)施方案中，所述靶RNA被裂解從而其功能受到抑制。在某些實(shí)施方案中，所述方法還包括評價(jià)所述寡聚化合物對所述細(xì)胞的反義活 性。在某些實(shí)施方案中，所述評價(jià)包括檢測靶RNA的水平。在某些實(shí)施方案中，所述評價(jià)包 括檢測蛋白質(zhì)水平。在某些實(shí)施方案中，所述評價(jià)包括檢測一種或多種表型效應(yīng)。在某些實(shí)施方案中，提供了方法，其包括將動(dòng)物細(xì)胞與寡聚化合物接觸，所述寡聚 化合物包含至少一個(gè)式V的四氫吡喃核苷類似物，其中，qi> q2、q3、q4、q5、q6和q7各自是H。 在某些實(shí)施方案中，1、％、七、％、％、％和％各自是11，且1 3是!1。在某些實(shí)施方案中，Q1 > q2、q3、q4、q5、q6和q7各自是H，R3是H，且R4是0CH3。在某些實(shí)施方案中，q” q2、q3、q4、q5、 q6和q7各自是H，R3是H，且R4是氟。在某些實(shí)施方案中，q” q2、q3、q4、q5、q6和q7各自是H，R3是H，且R4是羥基。在某些實(shí)施方案中，q” q2、q3、q4、q5、q6和q7各自是H，R3是H，且 各R4是H、OCH3、氟或羥基。在某些實(shí)施方案中，提供了方法，其包括將動(dòng)物細(xì)胞與寡聚化合物接觸，所述寡聚 化合物包含至少一個(gè)式V的四氫吡喃核苷類似物，其中，各核苷間連接基團(tuán)獨(dú)立地為磷酸 二酯或硫代磷酸酯核苷間連接基團(tuán)。在某些實(shí)施方案中，各核苷間連接基團(tuán)是硫代磷酸酯 核苷間連接基團(tuán)。在某些實(shí)施方案中，提供了方法，其包括將動(dòng)物細(xì)胞與寡聚化合物接觸，所述寡聚 化合物包含至少一個(gè)式V的四氫吡喃核苷類似物，其中，各式V的四氫吡喃核苷類似物具有 如式Vb所示構(gòu)型<formula>formula see original document page 27</formula>
其中Bx是雜環(huán)堿基部分；1~3和T4各自獨(dú)立地為將四氫吡喃核苷類似物連接到寡聚化合物的核苷間連接基 團(tuán)；或者T3和T4中的一個(gè)是將四氫吡喃核苷類似物連接到寡聚化合物的核苷間連接基團(tuán)， 且T3和T4中的另一個(gè)是H、羥基保護(hù)基、連接的共軛基團(tuán)、或者5或3-末端基團(tuán)；q1、 q2、q3、q4、q5、q6和q7各自獨(dú)立地為H、CrC6烷基、取代的CrC6烷基、C2-C6烯 基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基；R3和R4各自獨(dú)立地為H、羥基、氟、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基或 取代的C1-C6烷氧基；和各取代的基團(tuán)包含一個(gè)或多個(gè)獨(dú)立地選自下組的任選被保護(hù)的取代基鹵素、 OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、OC ( = Χ) Λ、OC ( = X) NJ1J2、NJ3C ( = X) NJ1J2 和 CN，其中，Λ、J2 和 J3 各 自獨(dú)立地是H或C1-C6烷基，且X為0、S或NJ115在某些實(shí)施方案中，提供了方法，其包括將動(dòng)物細(xì)胞與寡聚化合物接觸，所述寡聚 化合物包含至少一個(gè)四氫吡喃核苷類似物，其中，所述寡聚化合物包含至少一個(gè)鄰近區(qū)域， 其具有1至約5個(gè)具有式Va的四氫吡喃核苷類似物。在某些實(shí)施方案中，所述寡聚化合物 是嵌段物。在某些實(shí)施方案中，所述寡聚化合物是3或5-半體。在某些實(shí)施方案中，提供了方法，其包括將動(dòng)物細(xì)胞與寡聚化合物接觸，所述寡聚 化合物包含至少兩個(gè)具有1至約5個(gè)鄰近的四氫吡喃核苷類似物的區(qū)域，所述區(qū)域通過至 少一個(gè)核苷或修飾的核苷隔開。在某些實(shí)施方案中，所述寡聚化合物包含有缺口的寡聚化 合物，其中，四氫吡喃核苷類似物的一個(gè)外部區(qū)域位于5-端，而四氫吡喃核苷類似物的第 二個(gè)外部區(qū)域位于3-端，且其中，所述兩個(gè)外部區(qū)域通過包含約6至約14個(gè)獨(dú)立地選自核 苷、修飾的核苷和四氫吡喃核苷類似物的單體亞單元的內(nèi)部區(qū)域隔開。在某些實(shí)施方案中， 所述內(nèi)部區(qū)域中的各單體亞單元是脫氧核糖核苷。在某些實(shí)施方案中，所述內(nèi)部區(qū)域包含約6至約14個(gè)β-D-2-脫氧核糖核苷。在某些實(shí)施方案中，所述內(nèi)部區(qū)域包含約 10至約12個(gè)i3-D-2-脫氧核糖核苷。在某些實(shí)施方案中，所述內(nèi)部區(qū)域包含約10至約14 個(gè)β -D-2-脫氧核糖核苷。在某些實(shí)施方案中，各外部區(qū)域獨(dú)立地包含2至約3個(gè)四氫吡 喃核苷類似物。在某些實(shí)施方案中，各外部區(qū)域獨(dú)立地包含2個(gè)四氫吡喃核苷類似物。在 某些實(shí)施方案中，各外部區(qū)域獨(dú)立地包含2個(gè)四氫吡喃核苷類似物，且所述內(nèi)部區(qū)域包含 10個(gè)i3-D-2-脫氧核糖核苷。在某些實(shí)施方案中，提供了方法，其包括將動(dòng)物細(xì)胞與寡聚化合物接觸，所述寡聚 化合物包含至少一個(gè)式V的四氫吡喃核苷類似物，且其中，各四氫吡喃核苷類似物具有如 式Vb所示構(gòu)型
<formula>formula see original document page 28</formula>其中Bx是雜環(huán)堿基部分；1~3和T4各自獨(dú)立地為將四氫吡喃核苷類似物連接到寡聚化合物的核苷間連接基 團(tuán)；或者T3和T4中的一個(gè)是將四氫吡喃核苷類似物連接到寡聚化合物的核苷間連接基團(tuán)， 且T3和T4中的另一個(gè)是H、羥基保護(hù)基、連接的共軛基團(tuán)、或者5或3-末端基團(tuán)；和禮是!1、羥基、氟或0013。在某些實(shí)施方案中，R4是H。在某些實(shí)施方案中，R4是羥 基。在某些實(shí)施方案中，禮是0013。在某些實(shí)施方案中，R4是氟。在某些實(shí)施方案中，提供了方法，其包括將細(xì)胞與寡聚化合物接觸，所述寡聚化合 物包含至少兩個(gè)鄰近的式V的四氫吡喃核苷類似物
<formula>formula see original document page 28</formula>其中，所述式V的四氫吡喃核苷類似物各自獨(dú)立地滿足Bx是雜環(huán)堿基部分；1~3和T4各自獨(dú)立地為將四氫吡喃核苷類似物連接到寡聚化合物的核苷間連接基 團(tuán)；或者T3和T4中的一個(gè)是將四氫吡喃核苷類似物連接到寡聚化合物的核苷間連接基團(tuán)， 且T3和T4中的另一個(gè)是H、羥基保護(hù)基、連接的共軛基團(tuán)或者5或3-末端基團(tuán)；q” q2、q3、q4、q5、q6和q7各自獨(dú)立地為H、C「C6烷基、取代的C「C6烷基、C2-C6烯 基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基；R3和R4各自獨(dú)立地為H、羥基、氟、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基或取代的C1-C6烷氧基；各取代的基團(tuán)包含一個(gè)或多個(gè)獨(dú)立地選自下組的任選被保護(hù)的取代基鹵素、 OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、OC ( = Χ) Λ、OC ( = X) NJ1J2、NJ3C ( = X) NJ1J2 和 CN，其中，Λ、J2 和 J3 各 自獨(dú)立地是H或C1-C6烷基，且X為0、S或NJ1 ；所述寡聚化合物包含約8至約40個(gè)單體亞單元并與靶RNA互補(bǔ)；和其中，所述兩個(gè)鄰近的四氫吡喃核苷類似物中的至少兩個(gè)通過除磷酸二酯核苷間 連接基團(tuán)之外的核苷間連接基團(tuán)連接。在某些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞在動(dòng)物體內(nèi)。在某些 實(shí)施方案中，所述細(xì)胞在人體內(nèi)。在某些實(shí)施方案中，所述靶RNA選自mRNA、前-mRNA和微 RNA。在某些實(shí)施方案中，所述靶RNA是mRNA。在某些實(shí)施方案中，所述靶RNA是人mRNA。 在某些實(shí)施方案中，所述靶RNA被裂解從而其功能受到抑制。在某些實(shí)施方案中，所述方法還包括評價(jià)所述寡聚化合物對所述細(xì)胞的反義活 性。在某些實(shí)施方案中，所述評價(jià)包括檢測靶RNA的水平。在某些實(shí)施方案中，所述評價(jià)包 括檢測蛋白質(zhì)水平。在某些實(shí)施方案中，所述評價(jià)包括檢測一種或多種表型效應(yīng)。在某些實(shí)施方案中，提供了方法，其包括將細(xì)胞與寡聚化合物接觸，所述寡聚化合物包含至少兩個(gè)鄰近的式V的四氫吡喃核苷類似物，其中，至少兩個(gè)四氫吡喃核苷類似物 通過除磷酸二酯核苷間連接基團(tuán)之外的核苷間連接基團(tuán)連接，且其中，1、％、^、％、％、％和 q7各自是H。在某些實(shí)施方案中，R3是H。在某些實(shí)施方案中，禮是0013。在某些實(shí)施方案 中，R4是氟。在某些實(shí)施方案中，R4是羥基。在某些實(shí)施方案中，各R4是OCH3、氟或羥基。在某些實(shí)施方案中，提供了方法，其包括將細(xì)胞與寡聚化合物接觸，所述寡聚化合 物包含至少兩個(gè)鄰近的式V的四氫吡喃核苷類似物，其中，至少兩個(gè)四氫吡喃核苷類似物 通過除磷酸二酯核苷間連接基團(tuán)之外的核苷間連接基團(tuán)連接，且其中，至少兩個(gè)四氫吡喃 核苷類似物通過硫代磷酸酯核苷間鍵連接。在某些實(shí)施方案中，所述至少兩個(gè)鄰近的四氫 吡喃核苷類似物中的至少兩個(gè)通過除磷酸二酯核苷間鍵之外的含磷的核苷間鍵連接。在某 些實(shí)施方案中，所述至少兩個(gè)鄰近的四氫吡喃核苷類似物中的至少兩個(gè)通過不含磷的核苷 間鍵連接。在某些實(shí)施方案中，所述至少兩個(gè)鄰近的四氫吡喃核苷類似物中的至少兩個(gè)通 過中性核苷間鍵連接。在某些實(shí)施方案中，各核苷間連接基團(tuán)獨(dú)立地是磷酸二酯或硫代磷 酸酯核苷間連接基團(tuán)。在某些實(shí)施方案中，各核苷間連接基團(tuán)是硫代磷酸酯核苷間連接基 團(tuán)。在某些實(shí)施方案中，提供了方法，其包括將細(xì)胞與寡聚化合物接觸，所述寡聚化合 物包含至少兩個(gè)鄰近的四氫吡喃核苷類似物，其中，至少兩個(gè)四氫吡喃核苷類似物通過除 磷酸二酯核苷間連接基團(tuán)之外的核苷間連接基團(tuán)連接，且其中，各式V的四氫吡喃核苷類 似物具有如式Vb所示構(gòu)型<formula>formula see original document page 30</formula>其中Bx是雜環(huán)堿基部分；1~3和T4各自獨(dú)立地為將四氫吡喃核苷類似物連接到寡聚化合物的核苷間連接基 團(tuán)；或者T3和T4中的一個(gè)是將四氫吡喃核苷類似物連接到寡聚化合物的核苷間連接基團(tuán)， 且T3和T4中的另一個(gè)是H、羥基保護(hù)基、連接的共軛基團(tuán)、或者5或3-末端基團(tuán)；且q” q2、q3、q4、q5、q6和q7各自獨(dú)立地為H、C「C6烷基、取代的C「C6烷基、C2-C6烯 基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基；R3和R4各自獨(dú)立地為H、羥基、氟、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基或 取代的C1-C6烷氧基；和各取代的基團(tuán)包含一個(gè)或多個(gè)獨(dú)立地選自下組的任選被保護(hù)的取代基鹵素、 OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、0C( = Χ)Λ、0C( = X)NJ1J2、NJ3C( = Χ)NJ1J2 和 CN，其中，各 Λ、J2 和 J3 獨(dú)立地是H或C1-C6烷基，且X為0、S或NJ115在某些實(shí)施方案中，提供了方法，其包括將細(xì)胞與寡聚化合物接觸，所述寡聚化合 物包含至少兩個(gè)鄰近的四氫吡喃核苷類似物，其中，至少兩個(gè)四氫吡喃核苷類似物通過除 磷酸二酯核苷間連接基團(tuán)之外的核苷間連接基團(tuán)連接，且其中，所主張的寡聚化合物包含 至少一個(gè)具有1至約5個(gè)具有式Vb的四氫吡喃核苷類似物的鄰近區(qū)域。在某些實(shí)施方案 中，所述寡聚化合物包含嵌段物。在某些實(shí)施方案中，所述寡聚化合物包含3或5-半體。在某些實(shí)施方案中，提供了方法，其包括將細(xì)胞與寡聚化合物接觸，所述寡聚化合 物包含至少兩個(gè)鄰近的四氫吡喃核苷類似物，其中，至少兩個(gè)四氫吡喃核苷類似物通過除 磷酸二酯核苷間連接基團(tuán)之外的核苷間連接基團(tuán)連接，且其中所主張的寡聚化合物包含至 少兩個(gè)鄰近的區(qū)域，所述各區(qū)域具有1至約5個(gè)具有式Vb的四氫吡喃核苷類似物，其中，所 述區(qū)域通過至少一個(gè)核苷或修飾的核苷隔開。在某些實(shí)施方案中，所述寡聚化合物包含有 缺口的寡聚化合物，其中，四氫吡喃核苷類似物的一個(gè)外部區(qū)域位于5-端，而四氫吡喃核 苷類似物的第二個(gè)外部區(qū)域位于3-端，其中，所述兩個(gè)外部區(qū)域通過包含約6至約14個(gè)獨(dú) 立地選自核苷、修飾的核苷和四氫吡喃核苷類似物的單體亞單元的內(nèi)部區(qū)域隔開。在某些 實(shí)施方案中，所述內(nèi)部區(qū)域中的各單體亞單元是脫氧核糖核苷。在某些實(shí)施方案 中，所述內(nèi)部區(qū)域包含約6至約14個(gè)脫氧核糖核苷。在某些實(shí)施方案中，所述內(nèi) 部區(qū)域包含約10至約12個(gè)脫氧核糖核苷。在某些實(shí)施方案中，所述內(nèi)部區(qū)域包 含約10至約14個(gè)脫氧核糖核苷。在某些實(shí)施方案中，各外部區(qū)域獨(dú)立地包含2 至約3個(gè)四氫吡喃核苷類似物。在某些實(shí)施方案中，各外部區(qū)域獨(dú)立地包含2個(gè)四氫吡喃 核苷類似物。在某些實(shí)施方案中，各外部區(qū)域獨(dú)立地包含2個(gè)四氫吡喃核苷類似物且所述內(nèi)部區(qū)域包含10個(gè)β -D-2-脫氧核糖核苷。在某些實(shí)施方案中，提供了方法，其包括將細(xì)胞與寡聚化合物接觸，所述寡聚化合 物包含至少兩個(gè)鄰近的四氫吡喃核苷類似物，其中，至少兩個(gè)四氫吡喃核苷類似物通過除 磷酸二酯核苷間連接基團(tuán)之外的核苷間連接基團(tuán)連接，且其中，各四氫吡喃核苷類似物具 有式V以及以下如式Vb所示構(gòu)型
<formula>formula see original document page 31</formula>其中Bx是雜環(huán)堿基部分；1~3和T4各自獨(dú)立地為將四氫吡喃核苷類似物連接到寡聚化合物的核苷間連接基 團(tuán)；或者T3和T4中的一個(gè)是將四氫吡喃核苷類似物連接到寡聚化合物的核苷間連接基團(tuán)， 且T3和T4中的另一個(gè)是H、羥基保護(hù)基、連接的共軛基團(tuán)、或者5或3-末端基團(tuán)；和禮是!1、羥基、氟或0013。在某些實(shí)施方案中，R4是H。在某些實(shí)施方案中，R4是羥 基。在某些實(shí)施方案中，禮是0013。在某些實(shí)施方案中，R4是氟。在某些實(shí)施方案中，提供了減少靶信使RNA的方法，所述方法包括將一種或多種 細(xì)胞、組織或動(dòng)物與包含至少一個(gè)式V的四氫吡喃核苷類似物的寡聚化合物接觸
<formula>formula see original document page 31</formula>Bx是雜環(huán)堿基部分；1~3和T4各自獨(dú)立地為將四氫吡喃核苷類似物連接到寡聚化合物的核苷間連接基 團(tuán)；或者T3和T4中的一個(gè)是將四氫吡喃核苷類似物連接到寡聚化合物的核苷間連接基團(tuán)， 且T3和T4中的另一個(gè)是H、羥基保護(hù)基、連接的共軛基團(tuán)或者5或3-末端基團(tuán)；Q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7各自獨(dú)立地為H、C「C6烷基、取代的C「C6烷基、C2-C6烯 基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基；R3和R4各自獨(dú)立地為H、羥基、氟、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基或 取代的C1-C6烷氧基；各取代的基團(tuán)包含一個(gè)或多個(gè)獨(dú)立地選自下組的任選被保護(hù)的取代基鹵素、 OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、OC ( = Χ) Λ、OC ( = X) NJ1J2、NJ3C ( = X) NJ1J2 和 CN，其中，Λ、J2 和 J3 各 自獨(dú)立地是H或C1-C6烷基，且X為0、S或NJ1 ；和
其中所述寡聚化合物包含約8至約40個(gè)核苷、修飾的核苷和/或四氫吡喃核苷類 似物。在某些實(shí)施方案中，1、％、如、％、％、％和％各自是H。在某些實(shí)施方案中，qi、q2、q3、 q4、q5、q6禾Π q7各自是H，且R3是H。在某些實(shí)施方案中，Ql、q2、q3、q4、q5、q6和q7各自是H。 在某些實(shí)施方案中，q” q2、q3、q4、q5、q6和q7各自是H，R3是H，且R4是OCH3。在某些實(shí)施方 案中，qi、q2、q3、q4、q5、q6和q7各自是H，R3是H，且R4是氟。在某些實(shí)施方案中，q^q^l、 q4、q5、Q6和q7各自是H，R3是H，且R4是羥基。在某些實(shí)施方案中，q” q2、q3、q4、q5、q6和q7 各自是H，R3是H，且各R4是H、OCH3、氟或羥基。在某些實(shí)施方案中，提供了減少靶信使RNA的方法，所述方法包括將一種或多種 細(xì)胞、組織或動(dòng)物與包含至少一個(gè)式V的四氫吡喃核苷類似物的寡聚化合物接觸，其中，各 核苷間連接基團(tuán)獨(dú)立地為磷酸二酯或硫代磷酸酯核苷間連接基團(tuán)。在某些實(shí)施方案中，各 核苷間連接基團(tuán)是硫代磷酸酯核苷間連接基團(tuán)。在某些實(shí)施方案中，提供了減少靶信使RNA的方法，所述方法包括將一種或多種 細(xì)胞、組織或動(dòng)物與包含至少一個(gè)四氫吡喃核苷類似物的寡聚化合物接觸，其中所述各四 氫吡喃核苷類似物具有式Vb
<image>image see original document page 32</image>
Bx是雜環(huán)堿基部分；1~3和T4各自獨(dú)立地為將四氫吡喃核苷類似物連接到寡聚化合物的核苷間連接基 團(tuán)；或者T3和T4中的一個(gè)是將四氫吡喃核苷類似物連接到寡聚化合物的核苷間連接基團(tuán)， 且T3和T4中的另一個(gè)是H、羥基保護(hù)基、連接的共軛基團(tuán)、或者5或3-末端基團(tuán)；q” q2、q3、q4、q5、q6和q7各自獨(dú)立地為H、C「C6烷基、取代的C「C6烷基、C2-C6烯 基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基；R3和R4各自獨(dú)立地為H、羥基、氟、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基或 取代的C1-C6烷氧基；和各取代的基團(tuán)包含一個(gè)或多個(gè)獨(dú)立地選自下組的任選被保護(hù)的取代基鹵素、 OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、OC ( = Χ) Λ、OC ( = X) NJ1J2、NJ3C ( = X) NJ1J2 和 CN，其中，Λ、J2 和 J3 各 自獨(dú)立地是H或C1-C6烷基，且X為0、S或NJ115在某些實(shí)施方案中，提供了減少靶信使RNA的方法，所述方法包括將一種或多種 細(xì)胞、組織或動(dòng)物與包含至少一個(gè)四氫吡喃核苷的寡聚化合物接觸，所述寡聚化合物包含 至少一個(gè)具有1至約5個(gè)四氫吡喃核苷類似物的鄰近區(qū)域，且其中，各四氫吡喃核苷類似物 具有式Vb。在某些實(shí)施方案中，所述寡聚化合物包含嵌段物。在某些實(shí)施方案中，所述寡聚 化合物包含3或5-半體。在某些實(shí)施方案中，提供了減少靶信使RNA的方法，所述方法包括將一種或多種 細(xì)胞、組織或動(dòng)物與寡聚化合物接觸，所述寡聚化合物包含至少兩個(gè)具有1至約5個(gè)鄰近的四氫吡喃核苷類似物的區(qū)域，所述區(qū)域通過至少一個(gè)核苷或修飾的核苷隔開，且其中各 四氫-吡喃核苷類似物具有式Vb。在某些實(shí)施方案中，所述寡聚化合物包含有缺口的寡聚 化合物，其中，四氫吡喃核苷類似物的一個(gè)外部區(qū)域位于5-端，而四氫吡喃核苷類似物的 第二個(gè)外部區(qū)域位于3-端，其中，所述兩個(gè)外部區(qū)域通過包含約6至約14個(gè)獨(dú)立地選自核 苷、修飾的核苷和四氫吡喃核苷類似物的單體亞單元的內(nèi)部區(qū)域隔開。在某些實(shí)施方案中， 實(shí)質(zhì)上，所述內(nèi)部區(qū)域中的各單體亞單元是脫氧核糖核苷。在某些實(shí)施方案中，所 述內(nèi)部區(qū)域包含約6至約14個(gè)β-D-2-脫氧核糖核苷。在某些實(shí)施方案中，所述內(nèi)部區(qū)域 包含約10至約12個(gè)β -D-2-脫氧核糖核苷。在某些實(shí)施方案中，所述外部區(qū)域獨(dú)立地包 含2至約3個(gè)四氫吡喃核苷類似物。在某些實(shí)施方案中，各外部區(qū)域獨(dú)立地包含2個(gè)四氫 吡喃核苷類似物。在某些實(shí)施方案中，各外部區(qū)域獨(dú)立地包含2個(gè)四氫吡喃核苷類似物，且 所述內(nèi)部區(qū)域包含10個(gè)β -D-2-脫氧核糖核苷。
在某些實(shí)施方案中，提供了減少靶信使RNA的方法，所述方法包括將一種或多種 細(xì)胞、組織或動(dòng)物與包含至少一個(gè)四氫吡喃核苷類似物的寡聚化合物接觸，其中各四氫吡 喃核苷類似物具有式Vb <formula>formula see original document page 33</formula>其中Bx是雜環(huán)堿基部分；1~3和T4各自獨(dú)立地為將四氫吡喃核苷類似物連接到寡聚化合物的核苷間連接基 團(tuán)；或者T3和T4中的一個(gè)是將四氫吡喃核苷類似物連接到寡聚化合物的核苷間連接基團(tuán)， 且T3和T4中的另一個(gè)是H、羥基保護(hù)基、連接的共軛基團(tuán)、或者5或3-末端基團(tuán)；和R4是羥基、氟或0CH3。在某些實(shí)施方案中，R4是羥基。在某些實(shí)施方案中，R4是 OCH3。在某些實(shí)施方案中，R4是氟。在某些實(shí)施方案中，提供了具有式I的四氫吡喃核苷類似物
<formula>formula see original document page 33</formula>其中Bx是雜環(huán)堿基部分；T1和T2中的一個(gè)是H或羥基保護(hù)基，而T1和T2中的另一個(gè)是H、羥基保護(hù)基或反 應(yīng)性磷基團(tuán)；Q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7各自獨(dú)立地為H、C「C6烷基、取代的C「C6烷基、C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基；隊(duì)和1 2中的一個(gè)為氟，而R1和R2中的另一個(gè)是H、鹵素、C1-C6烷基或取代的C1-C6 烷基；和其中各取代的基團(tuán)包含一個(gè)或多個(gè)獨(dú)立地選自下組的任選被保護(hù)的取代基鹵 K^OJ1, NJ1J2, SJ1, N3> OC ( = X)J”0C( = X) NJ1J2, NJ3C ( = X) NJ1J2 和 CN，其中，各 J^J2 和 J3獨(dú)立地是H或C1-C6烷基，且X為0、S或NJ115在某些實(shí)施方案中，R1和R2 中的一個(gè)為氟，而R1和R2中的另一個(gè)是H。在某些實(shí) 施方案中，R1和R2各自為氟。在某些實(shí)施方案中，R1和R2中的一個(gè)為氟，而R1和R2中的另 一個(gè)為C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基。在某些實(shí)施方案中，R1和R2中的一個(gè)是氟，而R1和 R2中的另一個(gè)是甲基、乙基、取代的甲基、或取代的乙基。在某些實(shí)施方案中，R1和R2中的 一個(gè)是氟，而R1和R2中的另一個(gè)是甲基。在某些實(shí)施方案中，^2、七、^5、％和％各自是!1。在某些實(shí)施方案中，qi、q2、 q3、q4、q5、q6和q7中的至少一個(gè)是C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基。在某些實(shí)施方案中，Q1 > q2、q3、q4、q5、q6和q7中的至少一個(gè)是甲基。在某些實(shí)施方案中，1和q2中的至少一個(gè)是甲 基。在某些實(shí)施方案中，七和％中的至少一個(gè)是甲基。在某些實(shí)施方案中，q5、％和％中 的至少一個(gè)是甲基。在某些實(shí)施方案中，1\和1~2各自是H。在某些實(shí)施方案中，1\和1~2中的至少一 個(gè)是羥基保護(hù)基。在某些實(shí)施方案中，各羥基保護(hù)基獨(dú)立地為乙?；⑹宥』?、叔丁氧基甲 基、甲氧基甲基、四氫吡喃基、1-乙氧基乙基、1-(2_氯乙氧基)乙基、2-三甲基甲硅烷基乙 基、對_氯苯基、2，4_ 二硝基苯基、芐基、苯甲?；?、對-苯基苯甲?；?、2，6_ 二氯芐基、二 苯基甲基、對-硝基芐基、三苯基甲基(三苯甲基)、4_甲氧基三苯甲基、4，4_ 二甲氧基三 苯甲基、三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基-二苯基甲硅 烷基、三苯基甲硅烷基、三異丙基甲硅烷基、苯甲酰甲酸酯基、氯乙酰基、三氯乙?；?、三氟 乙酰基、新戊?；?、9-芴基甲基碳酸酯基、甲磺酸酯基、甲苯磺酸酯基、三氟甲磺酸酯基、三 苯甲基、單甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基、三甲氧基三苯甲基、或取代的9-苯基黃嘌 呤-9-基(pixyl)。在某些實(shí)施方案中，T1是乙?；?、芐基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基 二苯基甲硅烷基、4-甲氧基三苯甲基、或4，4- 二甲氧基三苯甲基。在某些實(shí)施方案中，T1和 T2中的一個(gè)是羥基保護(hù)基，而T1和T2中的另一個(gè)是二異丙基氰基乙氧基亞磷酰胺或H-膦 酸酯。在某些實(shí)施方案中，T1是4，4- 二甲氧基三苯甲基，且T2是二異丙基氰基乙氧基亞磷 酰胺。在某些實(shí)施方案中，Bx是尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤或鳥嘌呤。在某些實(shí) 施方案中，Bx是嘧啶、取代的嘧啶、嘌呤或取代的嘌呤，其中，所述取代不是插入劑或當(dāng)該四 氫吡喃核苷類似物位于寡聚化合物內(nèi)時(shí)不與靶核酸反應(yīng)的連接基團(tuán)。在某些實(shí)施方案中， Bx是尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5-噻唑并-尿嘧啶、2-硫代-尿嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、胸 腺嘧啶、2-硫代-胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-噻唑并-胞嘧啶、5-丙炔基-胞嘧 啶、腺嘌呤、鳥嘌呤、2，6_二氨基嘌呤、IH-嘧啶并[5，4-b] [1,4]苯并噁嗪2 (3H)-酮、IH-嘧 啶并[5，4-b][l，4]苯并噻嗪_2 (3H)_酮、9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并[5，4_b][l，4]苯 并噁嗪2(3H)_酮、2H-嘧啶并[4，5-b]吲哚_2_酮或H-吡啶并[3，2 :4，5]吡咯并[2，3_d] 嘧啶-2-酮。在某些實(shí)施方案中，Bx是尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-丙炔基-胞嘧啶、腺嘌呤或鳥嘌呤。在某些實(shí)施方案中，提供了具有如式Ia所示構(gòu)型的四氫吡喃核苷類似物
<formula>formula see original document page 35</formula>其中Bx是雜環(huán)堿基部分；T1和T2中的一個(gè)是H或羥基保護(hù)基，而T1和T2中的另一個(gè)是H、羥基保護(hù)基或反 應(yīng)性磷基團(tuán)；q” q2、q3、q4、q5、q6和q7各自獨(dú)立地為H、CrC6烷基、取代的CrC6烷基、C2-C6烯 基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基；隊(duì)和1 2中的一個(gè)為氟，而R1和R2中的另一個(gè)是H、鹵素、C1-C6烷基或取代的C1-C6 烷基；和其中各取代的基團(tuán)包含一個(gè)或多個(gè)獨(dú)立地選自下組的任選被保護(hù)的取代基鹵 素、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、OC ( = X) J1、OC ( = X) NJ1J2、NJ3C ( = X) NJ1J2 和 CN，其中，J1、J2 和 J3 各自獨(dú)立地是H或C1-C6烷基，且X為0、S或NJ115在某些實(shí)施方案中，提供了具有如式Ia所示構(gòu)型的四氫吡喃核苷類似物，其中，R2 是氟。在某些實(shí)施方案中，提供了具有如式Ia所示構(gòu)型的四氫吡喃核苷類似物，其中，R1是 禮且1 2是氟。在某些實(shí)施方案中，提供了具有如式Ia所示構(gòu)型的四氫吡喃核苷類似物，其 中，R1 是 H, R2 是氟,且 q” q2、q3、q4、q5、q6 禾口 q7 各自是 H。在某些實(shí)施方案中，提供了具有如式Ia所示構(gòu)型的四氫吡喃核苷類似物，其中，R1 是C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基，且R2是氟。在某些實(shí)施方案中，提供了具有如式Ia所示 構(gòu)型的四氫吡喃核苷類似物，其中，R1是甲基、乙基、取代的甲基或取代的乙基，其R2是氟。在某些實(shí)施方案中，提供了具有如式Ia所示構(gòu)型的四氫吡喃核苷類似物，其中，R1 和R2各自為氟。在某些實(shí)施方案中，提供了寡聚化合物，所述各寡聚化合物包含至少一個(gè)式II的
四氫吡喃核苷類似物<formula>formula see original document page 35</formula>，
Bx是雜環(huán)堿基部分； 1~3和T4各自獨(dú)立地為將四氫吡喃核苷類似物連接到寡聚化合物的核苷間連接基 團(tuán)；或者T3和T4中的一個(gè)是將四氫吡喃核苷類似物連接到寡聚化合物的核苷間連接基團(tuán)， 且T3和T4中的另一個(gè)是H、保護(hù)基、連接的共軛基團(tuán)、或者5或3-末端基團(tuán)；q” q2、q3、q4、q5、q6和q7各自獨(dú)立地為H、CrC6烷基、取代的CrC6烷基、C2-C6烯 基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基；隊(duì)和1 2中的一個(gè)為氟，而R1和R2中的另一個(gè)是H、鹵素、C1-C6烷基或取代的C1-C6 燒基；各取代的基團(tuán)包含一個(gè)或多個(gè)獨(dú)立地選自下組的任選被保護(hù)的取代基鹵素、 OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、OC ( = Χ) Λ、OC ( = X) NJ1J2、NJ3C ( = X) NJ1J2 和 CN，其中，Λ、J2 和 J3 各 自獨(dú)立地是H或C1-C6烷基，且X為0、S或NJ1 ；和其中所述寡聚化合物包含約8至約40個(gè)核苷、修飾的核苷和/或四氫吡喃核苷類 似物。在某些實(shí)施方案中，R1和R2中的一個(gè)為氟，而R1和R2中的另一個(gè)是H。在某些實(shí) 施方案中，R1和R2各自為氟。在某些實(shí)施方案中，R1和R2中的一個(gè)是氟，而R1和R2中的另 一個(gè)是C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基。在某些實(shí)施方案中，R1和R2中的一個(gè)是氟，而R1和 R2中的另一個(gè)是甲基、乙基、取代的甲基或取代的乙基。在某些實(shí)施方案中，R1和R2中的一 個(gè)是氟，而R1和R2中的另一個(gè)是甲基。在某些實(shí)施方案中，^2、七、^5、％和％各自是!1。在某些實(shí)施方案中，qi、q2、 q3、q4、q5、q6和q7中的至少一個(gè)是C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基。在某些實(shí)施方案中，Q1 > q2、q3、q4、q5、q6和q7中的至少一個(gè)是甲基。在某些實(shí)施方案中，1和q2中的至少一個(gè)是甲 基。在某些實(shí)施方案中，七和％中的至少一個(gè)是甲基。在某些實(shí)施方案中，q5、％和％中 的至少一個(gè)是甲基。在某些實(shí)施方案中，T3和T4中的至少一個(gè)是連接的共軛基團(tuán)。在某些實(shí)施方案中，各核苷間連接基團(tuán)獨(dú)立地為磷酸二酯或硫代磷酸酯。在某些 實(shí)施方案中，各核苷間連接基團(tuán)是硫代磷酸酯。在某些實(shí)施方案中，Bx是尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤或鳥嘌呤。在某些實(shí) 施方案中，Bx是嘧啶、取代的嘧啶、嘌呤或取代的嘌呤，其中，所述取代不是插入劑或當(dāng)該四 氫吡喃核苷類似物位于寡聚化合物內(nèi)時(shí)不與靶核酸相互作用的連接基團(tuán)。在某些實(shí)施方案 中，Bx是尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5-噻唑并-尿嘧啶、2-硫代-尿嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、 胸腺嘧啶、2-硫代-胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-噻唑并-胞嘧啶、5-丙炔基-胞嘧 啶、腺嘌呤、鳥嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、IH-嘧啶并[5，4-b] [1,4]苯并噁嗪2 (3H)-酮、IH-嘧 啶并[5，4-b][l，4]苯并噻嗪_2 (3H)_酮、9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并[5，4_b][l，4]苯 并噁嗪2(3H)_酮、2H-嘧啶并[4，5-b]吲哚_2_酮或H-吡啶并[3，2 :4，5]吡咯并[2，3_d] 嘧啶-2-酮。在某些實(shí)施方案中，Bx是尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、胸腺嘧 啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-丙炔基-胞嘧啶、腺嘌呤或鳥嘌呤。在某些實(shí)施方案中，提供了包含至少一個(gè)具有式IIa所示構(gòu)型的四氫吡喃核苷類
似物的寡聚化合物<formula>formula see original document page 37</formula>
其中Bx是雜環(huán)堿基部分；1~3和T4各自獨(dú)立地為將四氫吡喃核苷類似物連接到寡聚化合物的核苷間連接基 團(tuán)；或者T3和T4中的一個(gè)是將四氫吡喃核苷類似物連接到寡聚化合物的核苷間連接基團(tuán)， 且T3和T4中的另一個(gè)是H、保護(hù)基、連接的共軛基團(tuán)、或者5或3-末端基團(tuán)；q” q2、q3、q4、q5、q6和q7各自獨(dú)立地為H、CrC6烷基、取代的CrC6烷基、C2-C6烯 基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基；隊(duì)和1 2中的一個(gè)為氟，而R1和R2中的另一個(gè)是H、鹵素、C1-C6烷基或取代的C1-C6 燒基；各取代的基團(tuán)包含一個(gè)或多個(gè)獨(dú)立地選自下組的任選被保護(hù)的取代基鹵素、 OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、OC ( = Χ) Λ、OC ( = X) NJ1J2、NJ3C ( = X) NJ1J2 和 CN，其中，Λ、J2 和 J3 各 自獨(dú)立地是H或C1-C6烷基，且X為0、S或NJ1 ；和其中所述寡聚化合物包含約8至約40個(gè)核苷、修飾的核苷和/或四氫吡喃核苷類 似物。在某些實(shí)施方案中，提供了包含至少一個(gè)具有式IIa所示構(gòu)型的四氫吡喃核苷類 似物的寡聚化合物，其中，R2是氟。在某些實(shí)施方案中，提供了包含至少一個(gè)具有式IIa所 示構(gòu)型的四氫吡喃核苷類似物的寡聚化合物，其中，R1是禮且R2是氟。在某些實(shí)施方案中， 提供了包含至少一個(gè)具有式IIa所示構(gòu)型的四氫吡喃核苷類似物的寡聚化合物，其中，禮是 H, R2 是氟,且 q” q2、q3、q4、q5、q6 禾口 q7 各自是 H。在某些實(shí)施方案中，提供了寡聚化合物，其包含至少一個(gè)具有1至約5個(gè)各自具有 式IIa所示構(gòu)型的四氫吡喃核苷類似物的鄰近區(qū)域。在某些實(shí)施方案中，提供了包含具有 至少一個(gè)鄰近區(qū)域的嵌段物基序的寡聚化合物，所述鄰近區(qū)域具有1至約5個(gè)各自具有式 IIa所示構(gòu)型的四氫吡喃核苷類似物。在某些實(shí)施方案中，提供了包含具有至少一個(gè)鄰近區(qū) 域的3或5-半體基序的寡聚化合物，所述鄰近區(qū)域具有1至約5個(gè)各自具有式IIa所示構(gòu) 型的四氫吡喃核苷類似物。在某些實(shí)施方案中，提供了包含至少一個(gè)具有1至約5個(gè)四氫吡喃核苷類似物的
鄰近區(qū)域的寡聚化合物，所述四氫吡喃核苷類似物各自具有以下結(jié)構(gòu)式和構(gòu)型
<formula>formula see original document page 37</formula>在某些實(shí)施方案中，提供包含至少兩個(gè)區(qū)域的寡聚化合物，所述各區(qū)域具有1至 約5個(gè)鄰近的各自具有式II的四氫吡喃核苷類似物，且所述區(qū)域通過至少一個(gè)核苷或修飾的核苷隔開。在某些實(shí)施方案中，提供了寡聚化合物，其包含有缺口的基序，所述基序具有 至少兩個(gè)區(qū)域，所述各區(qū)域具有1至約5個(gè)鄰近的各自具有式II的四氫吡喃核苷類似物， 其中，四氫吡喃核苷類似物的一個(gè)區(qū)域位于5-端，而四氫吡喃核苷類似物的另一個(gè)區(qū)域位 于3-端，且其中所述四氫吡喃核苷類似物的兩個(gè)區(qū)域通過包含約6至約14個(gè)獨(dú)立地選自 核苷、修飾的核苷和四氫吡喃核苷類似物的單體亞單元的內(nèi)部區(qū)域隔開。在某些實(shí)施方案 中，所述內(nèi)部區(qū)域中的各單體亞單元是3-D-2-脫氧核糖核苷。在某些實(shí)施方案中，所述內(nèi) 部區(qū)域包含約6至約14個(gè)i3-D-2-脫氧核糖核苷。在某些實(shí)施方案中，所述內(nèi)部區(qū)域包含 約10至約12個(gè)β -D-2-脫氧核糖核苷。在某些實(shí)施方案中，四氫吡喃核苷類似物的各區(qū) 域獨(dú)立地包含2至約3個(gè)四氫吡喃核苷類似物。在某些實(shí)施方案中，四氫吡喃核苷類似物 的各區(qū)域獨(dú)立地包含2個(gè)四氫吡喃核苷類似物。在某些實(shí)施方案中，所述內(nèi)部區(qū)域包含10 個(gè)i3-D_2-脫氧核糖核苷。在某些實(shí)施方案中，所述內(nèi)部區(qū)域包含10個(gè)i3-D_2-脫氧核糖
核苷且各四氫吡喃核苷類似物具有以下結(jié)構(gòu)式和構(gòu)型
<formula>formula see original document page 38</formula>
在某些實(shí)施方案中，提供了寡聚化合物，其包含有缺口的基序，所述基序具有至少 兩個(gè)區(qū)域，所述各區(qū)域具有1至約5個(gè)鄰近的各自具有式II的四氫吡喃核苷類似物，其 中，四氫吡喃核苷類似物的一個(gè)區(qū)域位于5-端，而四氫吡喃核苷類似物的另一個(gè)區(qū)域位于 3_端，所述兩個(gè)區(qū)域的四氫吡喃核苷類似物通過包含約6至約14個(gè)獨(dú)立地選自核苷、修 飾的核苷和四氫吡喃核苷類似物的單體亞單元的內(nèi)部區(qū)域隔開，且所述寡聚化合物還包含 3-末端基團(tuán)。在某些實(shí)施方案中，所述3-末端基團(tuán)包含1至約4個(gè)修飾的或未修飾的核 苷。在某些實(shí)施方案中，提供了寡聚化合物，其中，各寡聚化合物包含至少一個(gè)式II 的四氫吡喃核苷類似物，其在長度上包含約10至約21個(gè)核苷和/或核苷類似物。在某些 實(shí)施方案中，各寡聚化合物包含至少一個(gè)式II的四氫吡喃核苷類似物，其在長度上包含約 10至約16個(gè)核苷和/或核苷類似物。在某些實(shí)施方案中，各寡聚化合物包含至少一個(gè)式 II的四氫吡喃核苷類似物，其在長度上包含約10至約14個(gè)核苷和/或核苷類似物。在某些實(shí)施方案中，提供了減少靶信使RNA的方法，所述方法包括將一種或多種 細(xì)胞、組織或動(dòng)物與一種寡聚化合物接觸，所述寡聚化合物包含至少一個(gè)式II的四氫吡喃 核苷類似物。在某些實(shí)施方案中，提供了減少靶信使RNA的方法，所述方法包括將一種或多種 細(xì)胞、組織或動(dòng)物與一種寡聚化合物接觸，所述寡聚化合物包含至少一個(gè)式III的四氫吡 喃核苷類似物<formula>formula see original document page 39</formula>其中Bx是雜環(huán)堿基部分；1~3和T4各自獨(dú)立地為將四氫吡喃核苷類似物連接到寡聚化合物的核苷間連接基 團(tuán)；或者T3和T4中的一個(gè)是將四氫吡喃核苷類似物連接到寡聚化合物的核苷間連接基團(tuán)， 且T3和T4中的另一個(gè)是H、保護(hù)基、連接的共軛基團(tuán)、或者5或3-末端基團(tuán)；q” q2、q3、q4、q5、q6和q7各自獨(dú)立地是H、C「C6烷基、取代的C「C6烷基、C2-C6烯 基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基、或取代的C2-C6炔基；各R3和R4獨(dú)立地是H、羥基、氟、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基；各取代的基團(tuán)包含一個(gè)或多個(gè)獨(dú)立地選自下組的任選被保護(hù)的取代基鹵素、 OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、0C( = Χ)Λ、0C( = X)NJ1J2、NJ3C( = Χ)NJ1J2 和 CN，其中，各 Λ、J2 和 J3 獨(dú)立地是H或C1-C6烷基，且X為0、S或NJ1 ；和其中所述寡聚化合物包含約8至約40個(gè)核苷、修飾的核苷和/或四氫吡喃核苷類 似物。在某些實(shí)施方案中，^2、七、^5、％和％各自是!1。在某些實(shí)施方案中，qi、q2、 q3、q4、q5、q6和q7各自是H，且R3是H。在某些實(shí)施方案中，q:、q2、q3、q4、q5、q6和q7各自是 H，R3是H，且R4是0CH3。在某些實(shí)施方案中，qi、q2、q3、q4、q5、q6和q7各自是H，R3是H，且 R4是氟。在某些實(shí)施方案中，Qp q2、q3、q4、q5、Q6和q7各自是H，R3是H，且R4是羥基。在某些實(shí)施方案中，用于所述方法的各寡聚化合物中的各四氫吡喃核苷類似物具 有以下結(jié)構(gòu)式和構(gòu)型
<formula>formula see original document page 39</formula>其中Bx是雜環(huán)堿基部分；1~3和T4各自獨(dú)立地為將四氫吡喃核苷類似物連接到寡聚化合物的核苷間連接基 團(tuán)；或者T3和T4中的一個(gè)是將四氫吡喃核苷類似物連接到寡聚化合物的核苷間連接基團(tuán)， 且T3和T4中的另一個(gè)是H、保護(hù)基、連接的共軛基團(tuán)、或者5或3-末端基團(tuán)；q” q2、q3、q4、q5、q6和q7各自獨(dú)立地為H、CrC6烷基、取代的CrC6烷基、C2-C6烯 基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基；各R3和R4獨(dú)立地是H、羥基、氟、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基；和
各取代的基團(tuán)包含一個(gè)或多個(gè)獨(dú)立地選自下組的任選被保護(hù)的取代基鹵素、 OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、0C( = Χ)Λ、0C( = X)NJ1J2、NJ3C( = Χ)NJ1J2 和 CN，其中，各 Λ、J2 和 J3 獨(dú)立地是H或C1-C6烷基，且X為0、S或NJ115在某些實(shí)施方案中，用于所述方法的寡聚化合物包含有缺口的基序，其中四氫吡 喃核苷類似物的一個(gè)外部區(qū)域位于5-端，而四氫吡喃核苷類似物的第二個(gè)外部區(qū)域位于 3_端，其中，所述兩個(gè)外部區(qū)域通過包含約6至約14個(gè)獨(dú)立地選自核苷、修飾的核苷和四氫 吡喃核苷類似物的單體亞單元的內(nèi)部區(qū)域隔開。在某些實(shí)施方案中，實(shí)質(zhì)上，所述內(nèi)部區(qū)域中的各單體亞單元是i3-D_2-脫氧核 糖核苷。在某些實(shí)施方案中，所述內(nèi)部區(qū)域包含約6至約14個(gè)β-D-2-脫氧核糖核苷。在 某些實(shí)施方案中，所述內(nèi)部區(qū)域包含約10至約12個(gè)脫氧核糖核苷。在某些實(shí)施 方案中，各外部區(qū)域獨(dú)立地包含2至約3個(gè)四氫吡喃核苷類似物。在某些實(shí)施方案中，各外 部區(qū)域獨(dú)立地包含2個(gè)四氫吡喃核苷類似物。在某些實(shí)施方案中，所述內(nèi)部區(qū)域包含10個(gè)
脫氧核糖核苷。在某些實(shí)施方案中，用于本發(fā)明方法的各四氫吡喃核苷類似物具有以下結(jié)構(gòu)式和 構(gòu)型
<formula>formula see original document page 40</formula>
其中Bx是雜環(huán)堿基部分；1~3和T4各自獨(dú)立地為將四氫吡喃核苷類似物連接到寡聚化合物的核苷間連接基 團(tuán)；或者T3和T4中的一個(gè)是將四氫吡喃核苷類似物連接到寡聚化合物的核苷間連接基團(tuán)， 且T3和T4中的另一個(gè)是H、保護(hù)基、連接的共軛基團(tuán)、或者5或3-末端基團(tuán)；和R4是羥基、氟或OCH3。在某些實(shí)施方案中，R4是羥基。在某些實(shí)施方案中，R4是0CH3。在某些實(shí)施方案 中，R4是氟。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了四氫吡喃核苷類似物、包含這種類似物的寡聚化合物以及使用該寡 聚化合物的方法。本發(fā)明還包括了制備該四氫吡喃核苷類似物和寡聚化合物的中間體和方 法。所述四氫吡喃核苷類似物各自具有包含四氫呋喃環(huán)的核心結(jié)構(gòu)。與氧原子側(cè)翼的兩個(gè) 碳原子之一相連的為能夠形成核苷間鍵的第一基團(tuán)，而與另一側(cè)翼碳原子(從氧原子上除 去的碳原子)相鄰的碳原子相連的為雜環(huán)堿基部分。所述雜環(huán)堿基部分可任選被基團(tuán)取代 以增強(qiáng)其對諸如核酸靶之類第二鏈中的互補(bǔ)堿基的親和力。在某些實(shí)施方案中，所述四氫 吡喃核苷類似物在離環(huán)氧原子最遠(yuǎn)的碳上還包含至少一個(gè)與雜環(huán)堿基相鄰的氟原子。具有 所述氟原子的碳原子可被進(jìn)一步取代或不被取代。在某些實(shí)施方案中，所述四氫吡喃核苷類似物具有式XVI <formula>formula see original document page 41</formula>其中Bx是雜環(huán)堿基部分；T5是羥基保護(hù)基^是H、鹵素、C1-C6烷基或取代的 C1-C6烷基-,Z1是O-或OE1 ;Z2是OH、OE1或N(E1) (E2) 和E2各自獨(dú)立地為烷基或取代的 烷基；q” q2、q3、q4、q5、q6和q7各自獨(dú)立地為:H, C「C6烷基、取代的C「C6烷基、C2-C6烯基、 取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基；其中各取代的基團(tuán)包含一個(gè)或多個(gè)獨(dú)立 地選自下組的任選被保護(hù)的取代基鹵素、OJ1AJ1J2、SJ^N3、OC( = Χ)Λ,00( = X)NJ1J2和 CN，其中，各J1、J2和J3獨(dú)立地是H或C1-C6烷基，且X為0、S或NJ1。在某些實(shí)施方案中，所述四氫吡喃核苷類似物具有式XVII的構(gòu)型
<formula>formula see original document page 41</formula>在某些實(shí)施方案中，式XVII的四氫吡喃核苷類似物被進(jìn)一步定義，其中qi、q2、 q3、q4、q5、q6和q7各自是H ；Bx是尿嘧啶、5_甲基尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5_甲基胞嘧啶、 2,6- 二氨基嘌呤、腺嘌呤或鳥嘌呤；T5是4，4- 二甲氧基三苯甲基是O(CH2)2CN ；和Z2是 N [CH2 (CH3) 2]2。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的寡聚化合物包含至少一個(gè)式X的四氫吡喃核苷 類似物
<formula>formula see original document page 41</formula>
其中，所述至少一個(gè)式X的四氫吡喃核苷類似物各自獨(dú)立地滿足Βχ是雜環(huán)堿基 部分；TjPT4各自獨(dú)立地為將四氫吡喃核苷類似物連接到寡聚化合物的核苷間連接基團(tuán)， 或者T3和T4中的一個(gè)是將四氫吡喃核苷類似物連接到寡聚化合物的核苷間連接基團(tuán)，且T3 和T4中的另一個(gè)是H、羥基保護(hù)基、連接的共軛基團(tuán)、或者5或3-末端基團(tuán)；qi、q2、q3、q4、q5、 Q6和q7各自獨(dú)立地為=IC1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基氓和&中的一個(gè)為氟，而R1和&中的另一個(gè)是H、鹵素、C1-C6烷 基或取代的C1-C6烷基；各取代的基團(tuán)包含一個(gè)或多個(gè)獨(dú)立地選自下組的任選被保護(hù)的取 代基鹵素、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、0C( = Χ) Λ、0C( = X) NJ1J2、NJ3C ( = Χ) NJ1J2 和 CN，其中，X 是0、S或NJ1，且Λ、J2和J3各自獨(dú)立地是H或C1-C6烷基；和其中所述寡聚化合物包含約 8至約40個(gè)通過核苷間連接基團(tuán)連接的單體亞單元，且至少一個(gè)核苷間連接基團(tuán)是硫代磷 酸酯核苷間連接基團(tuán)。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的寡聚化合物各自包含至少一個(gè)式XI的四氫吡 喃核苷類似物
<formula>formula see original document page 42</formula>在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的各寡聚化合物中的四氫吡喃核苷類似物各自具 有式XII
<formula>formula see original document page 42</formula>在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的寡聚化合物包含至少兩個(gè)式XIII的四氫吡喃 核苷類似物
<formula>formula see original document page 42</formula>其中，式XIII的四氫吡喃核苷類似物各自獨(dú)立地滿足Βχ是雜環(huán)堿基部分；Τ3和 T4各自獨(dú)立地為將四氫吡喃核苷類似物連接到寡聚化合物的核苷間連接基團(tuán)，或者T3和 T4中的一個(gè)是將四氫吡喃核苷類似物連接到寡聚化合物的核苷間連接基團(tuán)，且T3和T4中的 另一個(gè)是H、羥基保護(hù)基、連接的共軛基團(tuán)、或者5或3-末端基團(tuán)；qi、q2、q3、q4、q5、q6和q7 各自獨(dú)立地為=Hj1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或 取代的C2-C6炔基；R3和R4各自獨(dú)立地為H，羥基、鹵素、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6 烷氧基或取代WC1-C6烷氧基；各取代的基團(tuán)包含一個(gè)或多個(gè)獨(dú)立地選自下組的任選被保 護(hù)的取代基鹵素、OJ^NJ1J2、SJ^N3、OC( = Χ)Λ>00( = X)NJ1J2、NJ3C( = X)NJ1J2 和 CN,其中，X是O、S或NJ1，且Λ、J2和J3各自獨(dú)立地是H或C1-C6烷基；其中所述寡聚化合物包含 約8至約40個(gè)單體亞單元；和至少兩個(gè)式XIII的四氫吡喃核苷類似物通過硫代磷酸酯核 苷間連接基團(tuán)連接。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的寡聚化合物包含至少兩個(gè)式XIII的四氫吡喃 核苷類似物，其中各四氫吡喃核苷類似物還具有式XIV的構(gòu)型
<formula>formula see original document page 43</formula>在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的寡聚化合物包含至少兩個(gè)式XIII的四氫吡喃 核苷類似物，其中，至少一個(gè)四氫吡喃核苷類似物具有式XV
<formula>formula see original document page 43</formula>其中Bx是雜環(huán)堿基部分；且R5是H、OCH3或F。在某些實(shí)施方案中，提供了方法，其包括將動(dòng)物細(xì)胞與一種或多種本發(fā)明所述的 寡聚化合物接觸。在某些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是人細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，提供了具有式I的四氫吡喃核苷類似物
<formula>formula see original document page 43</formula>其中Bx是雜環(huán)堿基部分；T1和T2中的一個(gè)是H或羥基保護(hù)基，且T1和T2中的另一個(gè)是H、羥基保護(hù)基或反 應(yīng)性磷基團(tuán)；q” q2、q3、q4、q5、q6和q7各自獨(dú)立地為H、CrC6烷基、取代的CrC6烷基、C2-C6烯 基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基；R1和R2中的一個(gè)為氟，而R1和R2中的另一個(gè)是H、鹵素、C1-C6烷基或取代的C-C6烷基；和其中各取代的基團(tuán)包含一個(gè)或多個(gè)獨(dú)立地選自下組的任選被保護(hù)的取代基鹵 素、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、OC ( = X) J1、OC ( = X) NJ1J2、NJ3C ( = X) NJ1J2 和 CN，其中，J1、J2 和 J3 各自獨(dú)立地是H或C1-C6烷基，且X為0、S或NJ115在某些實(shí)施方案中，提供了具有如式Ia所示構(gòu)型的四氫吡喃核苷
<formula>formula see original document page 44</formula>其中所述構(gòu)型已經(jīng)定義，但變量的定義與上述式I相同。在某些實(shí)施方案中，提供了具有式II的四氫吡喃核苷
<formula>formula see original document page 44</formula>其中Bx是雜環(huán)堿基部分。在某些實(shí)施方案中，提供了包含至少一個(gè)式III的四氫吡喃核苷類似物的寡聚化
合物
<formula>formula see original document page 44</formula>其中，所述至少一個(gè)式III的四氫吡喃核苷類似物各自獨(dú)立地滿足Bx是雜環(huán)堿基部分；1~3和T4各自獨(dú)立地為將四氫吡喃核苷類似物連接到寡聚化合物的核苷間連接基 團(tuán)；或者T3和T4中的一個(gè)是將四氫吡喃核苷類似物連接到寡聚化合物的核苷間連接基團(tuán)， 且T3和T4中的另一個(gè)是H、羥基保護(hù)基、連接的共軛基團(tuán)、或者5或3-末端基團(tuán)；q” q2、q3、q4、q5、q6和q7各自獨(dú)立地為H、CrC6烷基、取代的CrC6烷基、C2-C6烯 基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基；
隊(duì)和1 2中的一個(gè)為氟，而R1和R2中的另一個(gè)是H、鹵素、C1-C6烷基或取代的C1-C6 燒基； 各取代的基團(tuán)包含一個(gè)或多個(gè)獨(dú)立地選自下組的任選被保護(hù)的取代基鹵素、 OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、OC ( = Χ) Λ、OC ( = X) NJ1J2、NJ3C ( = X) NJ1J2 和 CN，其中，Λ、J2 和 J3 各 自獨(dú)立地是H或C1-C6烷基，且X為0、S或NJ1 ；和其中所述寡聚化合物包含約8至約40單體亞單元。在某些實(shí)施方案中，提供了寡聚化合物，其中式III的各四氫吡喃核苷類似物具 有下式IIIa所示構(gòu)型
<image>image see original document page 45</image>
其中所述構(gòu)型已經(jīng)定義，但變量的定義與上述式III相同。在某些實(shí)施方案中，提供了寡聚化合物，其中，各四氫吡喃核苷類似物具有式IV <image>image see original document page 45</image>其中Bx是雜環(huán)堿基部分。在某些實(shí)施方案中，提供的寡聚化合物具有至少兩個(gè)鄰近的式V的四氫吡喃核苷 類似物
<image>image see original document page 45</image>
其中，式V的所述四氫吡喃核苷類似物各自獨(dú)立地滿足Bx是雜環(huán)堿基部分；1~3和T4各自獨(dú)立地為將四氫吡喃核苷類似物連接到寡聚化合物的核苷間連接基 團(tuán)；或者T3和T4中的一個(gè)是將四氫吡喃核苷類似物連接到寡聚化合物的核苷間連接基團(tuán)， 且T3和T4中的另一個(gè)是H、羥基保護(hù)基、連接的共軛基團(tuán)、或者5或3-末端基團(tuán)；
q” q2、q3、q4、q5、q6和q7各自獨(dú)立地為H、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C2-C6烯 基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基；R3和R4各自獨(dú)立地為H、羥基、氟、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基或 取代的C1-C6烷氧基；各取代的基團(tuán)包含一個(gè)或多個(gè)獨(dú)立地選自下組的任選被保護(hù)的取代基鹵素、 OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、0C( = Χ)J1、0C( = X)NJ1J2、NJ3C( = Χ)NJ1J2 和 CN，其中，各 Λ、J2 和 J3 獨(dú)立地是H或C1-C6烷基，且X為0、S或NJ1 ；所述寡聚化合物包含約8至約40個(gè)單體亞單元；和其中所述至少兩個(gè)鄰近的四氫吡喃核苷類似物中的至少兩個(gè)通過除磷酸二酯核 苷間連接基團(tuán)之外的核苷間連接基團(tuán)連接。在某些實(shí)施方案中，提供了寡聚化合物，其具有至少兩個(gè)鄰近的式Va的四氫吡喃 核苷類似物
<formula>formula see original document page 46</formula>其中所述構(gòu)型已經(jīng)定義，但變量的定義與上述式V相同，且其中的各寡聚化合物 包含約8至約40個(gè)單體亞單元；和，其中對各寡聚化合物而言，至少兩個(gè)四氫吡喃核苷類似物通過除磷酸二酯核苷間 連接基團(tuán)之外的核苷間連接基團(tuán)連接。在某些實(shí)施方案中，提供的寡聚化合物具有至少兩個(gè)鄰近的式Vb的四氫吡喃核 苷類似物
<formula>formula see original document page 46</formula>其中Bx是雜環(huán)堿基部分；1~3和T4各自獨(dú)立地為將四氫吡喃核苷類似物連接到寡聚化合物的核苷間連接基 團(tuán)；或者T3和T4中的一個(gè)是將四氫吡喃核苷類似物連接到寡聚化合物的核苷間連接基團(tuán)， 且T3和T4中的另一個(gè)是H、羥基保護(hù)基、連接的共軛基團(tuán)、或者5或3-末端基團(tuán)；和R4 是 H、羥基、氟或 OCH3。在某些實(shí)施方案中，提供了使用該寡聚化合物的方法，所述方法包括將動(dòng)物細(xì)胞 與寡聚化合物接觸，所述寡聚化合物包含至少一個(gè)式V的四氫吡喃核苷類似物
<formula>formula see original document page 47</formula>其中，所述至少一個(gè)式V的四氫吡喃核苷類似物各自獨(dú)立地滿足Bx是雜環(huán)堿基部分；1~3和T4各自獨(dú)立地為將四氫吡喃核苷類似物連接到寡聚化合物的核苷間連接基 團(tuán)；或者T3和T4中的一個(gè)是將四氫吡喃核苷類似物連接到寡聚化合物的核苷間連接基團(tuán)， 且T3和T4中的另一個(gè)是H、羥基保護(hù)基、連接的共軛基團(tuán)、或者5或3-末端基團(tuán)；q” q2、q3、q4、q5、q6和q7各自獨(dú)立地為H、C「C6烷基、取代的C「C6烷基、C2-C6烯 基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基；R3和R4各自獨(dú)立地為H、羥基、氟、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基或 取代的C1-C6烷氧基；各取代的基團(tuán)包含一個(gè)或多個(gè)獨(dú)立地選自下組的任選被保護(hù)的取代基鹵素、 OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、0C( = Χ)Λ、0C( = X)NJ1J2、NJ3C( = Χ)NJ1J2 和 CN，其中，各 Λ、J2 和 J3 獨(dú)立地是H或C1-C6烷基，且X為0、S或NJ1 ；和其中所述寡聚化合物包含約8至約40個(gè)單體亞單元并與靶RNA互補(bǔ)。一方面，提供的方法包括將細(xì)胞與寡聚化合物接觸，所述寡聚化合物包含至少兩 個(gè)鄰近的式V的四氫吡喃核苷類似物
<formula>formula see original document page 47</formula>其中，所述式V的四氫吡喃核苷類似物各自獨(dú)立地滿足Bx是雜環(huán)堿基部分；1~3和T4各自獨(dú)立地為將四氫吡喃核苷類似物連接到寡聚化合物的核苷間連接基 團(tuán)；或者T3和T4中的一個(gè)是將四氫吡喃核苷類似物連接到寡聚化合物的核苷間連接基團(tuán)， 且T3和T4中的另一個(gè)是H、羥基保護(hù)基、連接的共軛基團(tuán)、或者5或3-末端基團(tuán)；Q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7各自獨(dú)立地為H、C「C6烷基、取代的C「C6烷基、C2-C6烯 基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基；R3和R4各自獨(dú)立地為H、羥基、氟、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基或取代的C1-C6烷氧基；各取代的基團(tuán)包含一個(gè)或多個(gè)獨(dú)立地選自下組的任選被保護(hù)的取代基鹵素、 OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、OC ( = Χ) Λ、OC ( = X) NJ1J2、NJ3C ( = X) NJ1J2 和 CN，其中，Λ、J2 和 J3 各 自獨(dú)立地是H或C1-C6烷基，且X為0、S或NJ1 ；所述寡聚化合物包含約8至約40個(gè)單體亞單元并與靶RNA互補(bǔ)；和其中所述至少兩個(gè)鄰近的四氫吡喃核苷類似物中的至少兩個(gè)通過除磷酸二酯核 苷間連接基團(tuán)之外的核苷間連接基團(tuán)連接。在某些實(shí)施方案中，提供了方法，其包括將一種或多種細(xì)胞、組織或動(dòng)物與一種寡 聚化合物接觸，所述化合物包含至少一個(gè)式V的四氫吡喃核苷類似物
<formula>formula see original document page 48</formula>其中Bx是雜環(huán)堿基部分；1~3和T4各自獨(dú)立地為將四氫吡喃核苷類似物連接到寡聚化合物的核苷間連接基 團(tuán)；或者T3和T4中的一個(gè)是將四氫吡喃核苷類似物連接到寡聚化合物的核苷間連接基團(tuán)， 且T3和T4中的另一個(gè)是H、羥基保護(hù)基、連接的共軛基團(tuán)、或者5或3-末端基團(tuán)；q” q2、q3、q4、q5、q6和q7各自獨(dú)立地為H、C「C6烷基、取代的C「C6烷基、C2-C6烯 基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基；R3和R4各自獨(dú)立地為H、羥基、氟、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基或 取代的C1-C6烷氧基；各取代的基團(tuán)包含一個(gè)或多個(gè)獨(dú)立地選自下組的任選被保護(hù)的取代基鹵素、 OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、OC ( = Χ) Λ、OC ( = X) NJ1J2、NJ3C ( = X) NJ1J2 和 CN，其中，Λ、J2 和 J3 各 自獨(dú)立地是H或C1-C6烷基，且X為0、S或NJ1 ；和其中所述寡聚化合物包含約8至約40個(gè)核苷、修飾的核苷和/或四氫吡喃核苷類 似物。在某些實(shí)施方案中，當(dāng)細(xì)胞在人體內(nèi)且所述靶RNA是mRNA時(shí)進(jìn)行該方法。能夠形成核苷間鍵的基團(tuán)是可變的。在某些實(shí)施方案中，能夠形成核苷間鍵的基 團(tuán)包括任選被保護(hù)的伯醇和仲醇以及反應(yīng)性磷基團(tuán)。在某些實(shí)施方案中，一種能夠形成核 苷間鍵的基團(tuán)是任選被保護(hù)的羥基亞甲基，而另一基團(tuán)是任選被保護(hù)的羥基或反應(yīng)性磷基 團(tuán)。將兩種不同的四氫吡喃核苷類似物結(jié)合至2/10/2缺口寡聚化合物的側(cè)翼中并與 側(cè)翼中具有2-0-M0E修飾核苷的2/10/2缺口寡聚化合物進(jìn)行比較。在每個(gè)寡聚化合物中， 缺口中的10個(gè)核苷各自為β-D-2-脫氧核糖核苷，側(cè)翼一致經(jīng)過修飾，且各核苷間鍵是硫代磷酸酯。評價(jià)所述缺口寡聚化合物在體外和體內(nèi)抑制PTEN的能力。四氫吡喃核苷類似 物和2-0-M0E修飾核苷的結(jié)構(gòu)式和構(gòu)型如下所示
<formula>formula see original document page 49</formula>與2-0-M0E修飾核苷相比，具有3-0_CH3和3_F四氫吡喃核苷類似物的寡聚化合 物被證實(shí)具有增強(qiáng)的體外和體內(nèi)活性，且與未處理對照相比，3-F被證實(shí)具有最高降低水 平(見實(shí)施例31和33)。修飾的結(jié)合親和力(Tm :2-0-M0E > 3-F > 3_0_CH3)未能預(yù)見到 結(jié)合了 3-0-CH3或3-F的四氫吡喃核苷類似物的寡聚化合物具有增強(qiáng)的體外活性。與具有 2-0-M0E修飾核苷的寡聚化合物相比，具有3-0-CH3或3-F的四氫吡喃核苷類似物的寡聚化 合物分別具有較低的Tm?；谥肮_的體外數(shù)據(jù)也未能預(yù)測出該活性水平。根據(jù)公開的美國專利申請US 2004/0033967，測定了具有一致3-H四氫吡喃核苷類似物的寡聚化合物對RNA的Tm。在均 一的3-H寡聚化合物中結(jié)合的各3-0-CH3四氫吡喃核苷類似物使RNA的Tm升高了 0. 4°C /
次修飾
<formula>formula see original document page 49</formula>之前曾經(jīng)報(bào)道(Kang等，Nucleic Acids Research，2004，32 (14)，4411-4419)，將 在側(cè)翼中具有磷酸二酯連接的3-H四氫吡喃核苷類似物、并在缺口中具有硫代磷酸酯連接 的β-D-2-脫氧核糖核苷的有缺口的寡聚化合物的活性與具有完全硫代磷酸酯核苷間鍵 并在側(cè)翼中具有2-0-Μ0Ε修飾核苷的有缺口的相似寡聚化合物的活性進(jìn)行了比較。報(bào)道 稱，具有3-Η四氫吡喃核苷類似物的缺口聚合物(gapmer)顯示出的體外活性與MOE缺口聚 合物類似。報(bào)道還稱，具有3-H四氫吡喃核苷類似物的缺口聚合物在更高濃度下顯示出毒 性(Kang，同上)。Kang等提出，從脫氧核糖核苷酸缺口區(qū)段中除去硫代磷酸酯核苷間鍵可 能會(huì)降低觀察到的細(xì)胞毒性同時(shí)維持所需的核酸酶耐性和靶結(jié)合。本發(fā)明報(bào)道的在缺口中具有β -D-2-脫氧核糖核苷并在側(cè)翼中具有3_0CH3或3_F 四氫吡喃核苷類似物的有缺口的寡聚化合物(完整硫代磷酸酯連接的缺口聚合物)的體外 數(shù)據(jù)與在側(cè)翼中具有2-0-M0E核苷的缺口聚合物相比顯示了輕微提升的活性。2-0-M0E缺 口聚合物的IC5tl為37，相比之下，具有3-0-CH和3-F四氫吡喃核苷類似物的缺口聚合物的 IC50分別為23和16。由于這些四氫吡喃核苷類似物中每一種的結(jié)構(gòu)和Tm數(shù)據(jù)都與Kang 報(bào)道的3-H核苷類似物類似，因此各四氫吡喃核苷類似物的IC5tl低于2-0-M0E寡聚物是出 乎意料的。除了與2-0-M0E缺口聚合物相比具有更高的體外活性，在側(cè)翼中具有3_F或3-0013四氫吡喃核苷類似物并在缺口中具有β-D-2-脫氧核糖核苷的缺口聚合物在更高研 究劑量時(shí)所顯示出的體內(nèi)功效也是這些化合物的Tm或體外活性無法預(yù)料的。與2-0-M0E 缺口聚合物相比，3-0-CH3缺口聚合物顯示功效升高兩倍，而3-F缺口聚合物顯示功效升高 8倍。與具有含有4-CH2-0_2橋糖的鎖核苷的有缺口的寡聚化合物相比，同樣出乎意料 的是具有3-F四氫吡喃核苷類似物的有缺口的寡聚化合物的體外和體內(nèi)活性水平。具有這 些基序的有缺口的寡聚化合物(實(shí)施例32和35)顯示出非常高的體外和體內(nèi)活性水平，且 在各次研究中，兩種化合物的水平實(shí)質(zhì)上是相等的。如本發(fā)明所示，對于具有鎖核苷的有缺 口的寡聚化合物，互補(bǔ)RNA的Tm為60. 5°C，而對于具有3-F四氫吡喃修飾的核苷類似物的 有缺口的寡聚化合物為52. 6 (對于側(cè)翼2/10/2基序單體上有/沒有5-CH3基團(tuán)的寡聚化 合 物為50. 7)。這與具有含有4-CH2-0-2橋糖的鎖核苷的寡聚化合物之間有8-10°C的差異。 基于8-10°C的Tm差異無法預(yù)料側(cè)翼中具有3-F四氫吡喃核苷類似物和含有4-CH2-0_2橋 糖的鎖核苷的寡聚化合物的體外和體內(nèi)活性水平。除了具有增強(qiáng)的活性，如體內(nèi)實(shí)驗(yàn)所證實(shí)，與鎖核苷相比，四氫吡喃核苷類似物還 顯示出較低毒性。在具有4-CH2-0-2橋的鎖核苷的高劑量組中，ALT和AST水平急劇升高 (實(shí)施例35)。對于具有選定的四氫吡喃核苷類似物的不同的有缺口的寡聚化合物(2/10/2 和2/14/2基序)而言，ALT和AST未顯示出顯著升高。除了具有增強(qiáng)的活性，預(yù)計(jì)四氫吡喃核苷類似物還可用于增強(qiáng)將其結(jié)合其中的寡 聚化合物的所希望的性質(zhì)例如核酸酶耐性。預(yù)計(jì)包含這些四氫吡喃核苷類似物的寡聚化合 物還可用作各種診斷應(yīng)用中的引物和探針。在某些實(shí)施方案中，四氫吡喃核苷類似物可用于在一個(gè)或多個(gè)位置修飾寡聚化合 物。這些修飾的寡聚化合物可具有特定基序。在某些實(shí)施方案中，所述基序包括但不限于 有缺口的基序、半體基序、嵌段物基序、完全修飾的基序、特定位置修飾的基序以及交替基 序。與這些基序結(jié)合，還可使用各種鍵，其中包括但不限于一致地或組合使用的磷酸二酯鍵 和硫代磷酸酯鍵。四氫吡喃核苷類似物的定位以及鍵策略的應(yīng)用可方便地優(yōu)化以增強(qiáng)對于 選定靶的活性?？赏ㄟ^加入5或3-末端基團(tuán)(諸如共軛基團(tuán))來進(jìn)一步修飾這種基序。術(shù)語“基序”表示核苷在寡聚化合物中的模式。該模式通過具有未修飾的 (β -D-核糖核苷和/或β -D-2-脫氧核糖核苷)和/或修飾的糖基的核苷在寡聚化合物中 的位置來描述。用于各個(gè)位置的雜環(huán)堿基和核苷間鍵的類型是可變的，且不是決定寡聚化 合物基序的因素。一種或多種其它基團(tuán)(包括但不限于加帽基團(tuán)和共軛基團(tuán))的存在也不 適決定基序的因素。教導(dǎo)了代表性基序的制備的代表性美國專利包括但不限于5，013，830; 5，149，797 ；5，220，007 ；5，256，775 ；5，366，878 ；5，403，711 ；5，491，133 ；5，565，350 ； 5,623,065 ；5, 652, 355 ；5, 652, 356 ；和5，700,922,其中的一些為本申請人所有，各申 請作為參考完整并入本發(fā)明。基序還描述于2005年6月2日提交的國際申請PCT/ US2005/019219(該申請于2005年12月22日作為WO 2005/121371公開)以及2005年6 月2日提交的PCT/US2005/019220(該申請于2005年12月22日作為WO 2005/121372公 開)；它們各自作為參考并入本發(fā)明。本發(fā)明中使用的術(shù)語“交替基序”意在包括核苷的鄰近序列，其包含在寡聚化合物的幾乎整體序列上交替排列的兩種不同單體亞單元。交替模式可通過下式描述 5-A(-L-B-L-A)n(-L-B)m-3,其中各A或各B之一是四氫吡喃核苷類似物，而各A或B中的 另一個(gè)是除四氫吡喃核苷之外的單體亞單元，各L是核苷間連接基團(tuán)，rm是O或1，且η是 約4至約12。這樣允許交替寡聚化合物的長度為約9至約26個(gè)單體亞單元。該長度范圍 并非是限制性的，更長和更短的寡聚化合物也可用于本發(fā)明中。該式還允許奇數(shù)和偶數(shù)長 度的交替寡聚化合物。在某些實(shí)施方案中，各A或B中的另一個(gè)選自β-D-核糖核苷、2-修飾的核苷、 4-硫代修飾的核苷、4-硫代-2-修飾的核苷、二環(huán)糖修飾的核苷以及其它修飾核苷。交替 基序不由核堿基序列或核苷間鍵決定。本發(fā)明中使用的術(shù)語“完全修飾的基序”意在包括單體亞單元的鄰近序列，所述單 體亞單元具有相同的糖或糖替代物基團(tuán)。在某些實(shí)施方案中，完全修飾的基序包括四氫吡 喃核苷類似物的鄰近序列。在某些實(shí)施方案中，3和5-末端包括未修飾的核苷。本發(fā)明中使用的術(shù)語“半體基序”意在包括寡聚化合物，其具有一種類型單體亞 單元的鄰近序列，并在末端之一具有第二種類型的單體亞單元的鄰近序列。所述兩種類型 的單體亞單元在組成核苷的糖或糖替代物基團(tuán)上不同，與使用的堿基和鍵的類型無關(guān)。糖 替代物基團(tuán)包括除核糖類型的糖以外的物質(zhì)，如本發(fā)明所述的四氫吡喃核苷類似物，其中， 四氫呋喃環(huán)用來代替核糖環(huán)。在某些實(shí)施方案中，糖替代物基團(tuán)是包含四氫吡喃核苷類似 物的四氫吡喃部分。在某些實(shí)施方案中，半體基序包括約10至約28個(gè)一種類型單體亞單 元的鄰近序列并在末端之一有1-5個(gè)或2-5個(gè)第二種類型單體亞單元。在某些實(shí)施方案 中，半體是約8至約20個(gè)β -D-2-脫氧核糖核苷的鄰近序列，其在末端之一具有1-12個(gè)鄰 近的四氫吡喃核苷類似物。在某些實(shí)施方案中，在某些實(shí)施方案中，半體是約8至約20個(gè) β -D-2-脫氧核糖核苷的鄰近序列，其在末端之一具有1-5個(gè)鄰近的四氫吡喃核苷類似物。 在某些實(shí)施方案中，半體是約12至約18個(gè)β-D-2-脫氧核糖核苷的鄰近序列，其在末端之 一具有1-3個(gè)鄰近的四氫吡喃核苷類似物。本發(fā)明所使用的術(shù)語“嵌段物基序”意在包括寡聚化合物，其具有一種類型的單體 亞單元的鄰近序列，并在其內(nèi)部具有第二種類型的單體亞單元的鄰近序列。兩種類型的單 體亞單元在組成核苷的糖或糖替代物基團(tuán)上不同，并與使用的堿基和鍵的類型無關(guān)。嵌段 物在定義上可能會(huì)與缺口聚合物部分重疊，但在嵌段物中通常只有嵌段中的單體亞單元是 修飾的，而在缺口聚合物中只有外部區(qū)域內(nèi)的單體亞單元是修飾的。在某些實(shí)施方案中，嵌 段物在整個(gè)寡聚化合物中未被嵌段占據(jù)的位置上可具有其它類型的修飾的單體亞單元。本發(fā)明中使用的術(shù)語“特定位置修飾的基序”意在包括一種類型的單體亞單元的 序列，該序列被兩個(gè)或多個(gè)具有1至約5個(gè)修飾的一種類型的單體亞單元的區(qū)域打斷。在 某些實(shí)施方案中，特定位置修飾的寡聚化合物是具有8至20個(gè)β -D-2-脫氧核糖核苷的序 列，該序列進(jìn)一步包括兩個(gè)或三個(gè)各自具有2至約5個(gè)鄰近的四氫吡喃核苷的區(qū)域。特定 位置修飾的寡聚化合物明顯不同于有缺口的基序、半體基序、嵌段物基序和交替基序，這是 由于由任何位置基序定義的區(qū)域取代模式不是由這些其它基序所定義的。特定位置修飾的 基序不由核堿基序列或者核苷間鍵的位置或類型決定。術(shù)語“特定位置修飾的寡聚化合物” 包括許多不同的特異性取代模式。本發(fā)明中使用的術(shù)語“缺口聚合物(gapmer) ”或“有缺口的寡聚化合物”意在包括分成以下3個(gè)區(qū)域的核苷鄰近序列內(nèi)部區(qū)域以及其5和3端的外部區(qū)域。各區(qū)域至少通過具有不同的組成核苷的糖或糖替代物基團(tuán)而相互區(qū)別。在某些實(shí)施方案中，外部區(qū)域各 自獨(dú)立地為1至約5個(gè)修飾的核苷，而內(nèi)部區(qū)域?yàn)?至18個(gè)核苷。通常用來區(qū)分有缺口 的寡聚化合物各個(gè)區(qū)域的核苷的類型包括，但不限于β -D-核糖核苷、β -D-2-脫氧核糖 核苷、2-修飾的核苷、4-硫代修飾的核苷、4-硫代-2-修飾的核苷、二環(huán)糖修飾的核苷以及 含有糖替代物的核苷，例如四氫吡喃核苷類似物。有缺口的寡聚化合物的各個(gè)區(qū)域基本上 是統(tǒng)一修飾的，例如，糖或糖替代物基團(tuán)是相同的，但至少內(nèi)部區(qū)域具有不同于各外部區(qū)域 的糖基。內(nèi)部區(qū)域或缺口通常包含β-D-2-脫氧核糖核苷，但也可以是糖修飾的核苷的序 列。在某些實(shí)施方案中，如本發(fā)明所述，有缺口的寡聚化合物包含β -D-2-脫氧核糖 核苷的內(nèi)部區(qū)域和一個(gè)包含四氫吡喃核苷類似物的外部區(qū)域。在某些實(shí)施方案中，如本發(fā) 明所述，有缺口的寡聚化合物包含β-D-2-脫氧核糖核苷的內(nèi)部區(qū)域和兩個(gè)包含四氫吡喃 核苷類似物的外部區(qū)域。在某些實(shí)施方案中，有缺口的寡聚化合物包含3-D-2-脫氧核糖 核苷的內(nèi)部區(qū)域和兩個(gè)包含式II所示四氫吡喃核苷類似物的外部區(qū)域。有缺口的基序的 其它例子示于實(shí)施例32和35中，其中，包含14個(gè)核苷的寡聚化合物在其3和5各末端上 具有2個(gè)二環(huán)核苷并在內(nèi)部區(qū)域內(nèi)包含10個(gè)未修飾的脫氧核糖核苷。該寡聚化 合物具有有缺口的基序，其中，二環(huán)核苷的末端外部區(qū)域被認(rèn)為是側(cè)翼，而脫氧核 糖核苷內(nèi)部區(qū)域被認(rèn)為是缺口。在某些實(shí)施方案中，提供了有缺口的寡聚化合物，其包含位于5-端的一個(gè)或兩個(gè) 四氫吡喃核苷類似物，位于3-端的兩個(gè)或三個(gè)四氫吡喃核苷類似物，以及具有10-16個(gè)核 苷的內(nèi)部區(qū)域。在某些實(shí)施方案中，提供了有缺口的寡聚化合物，其包含位于5-端的一個(gè) 四氫吡喃核苷類似物，位于3-端的兩個(gè)四氫吡喃核苷類似物，以及具有10-16個(gè)核苷的內(nèi) 部區(qū)域。在某些實(shí)施方案中，提供了有缺口的寡聚化合物，其包含位于5-端的一個(gè)四氫吡 喃核苷類似物，位于3-端的兩個(gè)四氫吡喃核苷類似物，以及具有10-14個(gè)核苷的內(nèi)部區(qū)域。 在某些實(shí)施方案中，內(nèi)部區(qū)域基本上是i3_D-2-脫氧核糖核苷的鄰近序列。在另一實(shí)施方 案中，提供了寡聚化合物，其還包含，但不限于，一個(gè)或多個(gè)5或3-末端基團(tuán)，如進(jìn)一步修飾 的或未修飾的核苷、連接的共軛基團(tuán)以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它基團(tuán)。在某些實(shí)施方案中，提供的有缺口的寡聚化合物長度為約10至約21個(gè)核苷。在 另一實(shí)施方案中，提供的有缺口的寡聚化合物長度為約12至約16個(gè)核苷。在進(jìn)一步的實(shí) 施方案中，提供的有缺口的寡聚化合物長度為約12至約14個(gè)核苷。一方面，提供了包含具有式III的四氫吡喃核苷類似物的寡聚化合物。另一方面， 提供了包含具有式IIIa的四氫吡喃核苷類似物的寡聚化合物。另一方面，提供了包含具有 式IV的四氫吡喃核苷類似物的寡聚化合物。另一方面，提供了包含具有式V的四氫吡喃核 苷類似物的寡聚化合物。另一方面，提供了包含具有式Va的四氫吡喃核苷類似物的寡聚化 合物。另一方面，提供了包含具有式Vb的四氫吡喃核苷類似物的寡聚化合物。本發(fā)明使用的術(shù)語“取代基”和“取代基團(tuán)”意在包括通常加至其它基團(tuán)或母體化 合物以增強(qiáng)所需特性或得到所需效果的基團(tuán)。取代基可以被保護(hù)或未被保護(hù)，并且可被加 至母體化合物中的一個(gè)或多個(gè)可用位點(diǎn)。取代基也可被其它取代基進(jìn)一步取代并且可直接 或通過如烷基或烴基等連接基團(tuán)結(jié)合到母體化合物。這些基團(tuán)包括但不限于商素、羥基、烷基、烯基、炔基、?；?-C(O)Raa)、羧基(-C(O)O-Raa)、脂肪基、脂環(huán)基、烷氧基、取代的氧基 (-O-Raa)、芳基、芳烷基、雜環(huán)基、雜芳基、雜芳基烷基、氨基(-NRbbRJ、亞氨基(=NRbb)、酰 氨基(-C (O)NRbbRcx 或-N (Rbb) C (O)Raa)、疊氮基(-N3)、硝基(-NO2)、氰基(-CN)、脲基(-OC(O) NRbbRcc 或-N (Rbb) C (0) ORaa)、脲基(_N (Rbb) C (0) NRbbRj、硫代脲基(_N (Rbb) C ⑶ NRbbRj、胍基 (-N (Rbb) C ( = NRbb) NRbbRJ、脒基(-C ( = NRbb) NRbbRcc 或-N (Rbb) C (NRbb) Rj、硫醇(-SRj、亞 磺?；?-S (O)RJ、磺酰基(-S(O)2RJ、磺酰胺基(-3(0)2觀況?；?則‘)3(0)2‘)和共軛 基團(tuán)，其中，各Raa、Rbb和R。。獨(dú)立地是H、任選連接的化學(xué)官能團(tuán)或進(jìn)一步的取代基，其優(yōu)選 列表包括但不限于H、烷基、烯基、炔基、脂肪基、烷氧基、?；?、芳基、芳烷基、雜芳基、脂環(huán) 基、雜環(huán)和雜芳基烷基。本發(fā)明所述化合物中選擇的取代基以循環(huán)程度出現(xiàn)。本發(fā)明中，“循環(huán)取代基(recursive substituent) ”表示取代基可引入另一個(gè)自 身。由于這些取代基的循環(huán)特性，理論上，任意給定的取代基可能存在很大數(shù)目。藥物化學(xué) 和有機(jī)化學(xué)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能夠理解這些 取代基的總數(shù)目受到化合物所需特性的合 理限制。這種特性包括，例如但不限于物理特性(例如分子量、溶解度或log P)、應(yīng)用性 質(zhì)(如對目的靶的活性)、以及實(shí)踐特性(如合成的難易度)。循環(huán)取代基是本發(fā)明的一個(gè)方面。藥物化學(xué)和有機(jī)化學(xué)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員理解 這些取代基的多能性。至于循環(huán)取代基在本發(fā)明權(quán)利要求中的存在程度，其總數(shù)將如上所 述來確定。本發(fā)明中使用的術(shù)語“烷基”表示含有至多達(dá)24個(gè)碳原子的飽和的直鏈或支鏈烴 殘基。烷基的例子包括但不限于甲基、乙基、丙基、丁基、異丙基、正己基、辛基、癸基、十二 烷基等。烷基通常包含1至約24個(gè)碳原子，更通常為1至約12個(gè)碳原子(C1-C12烷基)，更 優(yōu)選為1至約6個(gè)碳原子。本發(fā)明中使用的術(shù)語“低級烷基”包含1至約6個(gè)碳原子。本 發(fā)明中使用的烷基可任選包含一個(gè)或多個(gè)其它取代基團(tuán)。本發(fā)明中使用的術(shù)語“烯基”指含有最多達(dá)24個(gè)碳原子并具有至少一個(gè)碳碳雙鍵 的直鏈或支鏈烴鏈殘基。烯基的例子包括但不限于乙烯基、丙烯基、丁烯基、1-甲基-2-丁 烯-1-基、二烯如1，3- 丁二烯等等。烯基通常包含2至約24個(gè)碳原子，更通常為2至約12 個(gè)碳原子，更優(yōu)選為2至約6個(gè)碳原子。烯基在文中可任選包含一個(gè)或多個(gè)其它取代基團(tuán)。本發(fā)明中使用的術(shù)語“炔基”表示含有至多達(dá)24個(gè)碳原子并具有至少一個(gè)碳碳三 鍵的直鏈或支鏈烴殘基。炔基的例子包括但不限于乙炔基、ι-丙炔基、1-丁炔基等等。炔 基通常包含2至約24個(gè)碳原子，更通常為2至約12個(gè)碳原子，更優(yōu)選為2至約6個(gè)碳原子。 本發(fā)明中使用的炔基可任選包含一個(gè)或多個(gè)其它取代基團(tuán)。本發(fā)明中使用的術(shù)語“?；北硎境ビ袡C(jī)酸上的羥基而形成的具有通式-C(O)-X 的殘基，其中X通常是脂肪基、脂環(huán)基或芳基。例子包括脂肪族羰基、芳族羰基、脂肪族磺酰 基、芳族亞磺?；?、脂肪族亞磺酰基、芳族磷酸酯基、脂肪族磷酸酯基等等。本發(fā)明中使用的 ?；扇芜x包含其它取代基團(tuán)。術(shù)語“脂環(huán)的”或“脂環(huán)基”是指環(huán)系統(tǒng)，其中所述環(huán)是脂肪族的。環(huán)系統(tǒng)可包含 一個(gè)或多個(gè)環(huán)，其中至少一個(gè)環(huán)是脂肪族的。優(yōu)選的脂環(huán)基包括環(huán)內(nèi)具有約5至約9個(gè)碳 原子的環(huán)。脂環(huán)基在文中可任選包含其它取代基團(tuán)。本發(fā)明中使用的術(shù)語“脂肪族的”表示含有至多達(dá)24個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烴殘 基，其中，任意兩個(gè)碳原子之間的飽和度是單鍵、雙鍵或三鍵。脂肪族基團(tuán)優(yōu)選含有1至約24個(gè)碳原子、更通常為1至約12個(gè)碳原子、更優(yōu)選為1至約6個(gè)碳原子。脂肪族基團(tuán)的直鏈或支鏈可被一個(gè)或多個(gè)雜原子間斷，其中包括氮、氧、硫和磷。這種被雜原子間斷的脂肪 族基團(tuán)包括但不限于聚烷氧基類，如聚亞烷基二醇、聚胺和聚亞胺。本發(fā)明中使用的脂肪族 基團(tuán)可任選包含其它取代基團(tuán)。本發(fā)明中使用的術(shù)語“烷氧基”表示在烷基和氧原子之間形成的殘基，其中所述氧 原子用來將烷氧基連接到母體分子。烷氧基的例子包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、 異丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、正戊氧基、新戊氧基、正己氧基等等。本發(fā)明中使 用的烷氧基在文中可任選包含其它取代基團(tuán)。本發(fā)明中使用的術(shù)語“氨基烷基”表示氨基取代的烷基殘基。該術(shù)語的含義包括 在任意位置包括具有氨基取代基的C1-C12烷基，且其中烷基將氨基烷基基團(tuán)連接到母體分 子。氨基烷基基團(tuán)的烷基和/或氨基部分可被取代基進(jìn)一步取代。術(shù)語“芳烷基”和“芳基烷基”在文中指在烷基和芳基之間形成的殘基，其中，烷基 用來將芳烷基連接到母體分子。實(shí)施例包括但不限于芐基、苯乙基等等。本發(fā)明中使用的 芳烷基可任選包含與烷基、芳基或兩種基團(tuán)相連以形成殘基的其它取代基團(tuán)。本發(fā)明中使用的術(shù)語“芳基”和“芳香的”表示具有一個(gè)或多個(gè)芳環(huán)的單環(huán)或多環(huán) 碳環(huán)系統(tǒng)。芳基的例子包括但不限于苯基、萘基、四氫萘基、茚滿基、茚基(idenyl)等。優(yōu) 選的芳基環(huán)系統(tǒng)在一個(gè)或多個(gè)環(huán)上具有約5至約20個(gè)碳原子。本發(fā)明中使用的芳基可任 選包含其它取代基團(tuán)。本發(fā)明中使用的術(shù)語“鹵代”和“鹵素”表示選自氟、氯、溴和碘的原子。本發(fā)明中使用的術(shù)語“雜芳基”和“雜芳的”表示包含單環(huán)或多環(huán)芳香環(huán)的基團(tuán)、 環(huán)系統(tǒng)、或稠環(huán)系統(tǒng)，其中至少一個(gè)環(huán)是芳環(huán)并包含一個(gè)或多個(gè)雜原子。雜芳基的含義還包 括稠環(huán)系統(tǒng)，包括其中一個(gè)或多個(gè)稠環(huán)不含雜原子的系統(tǒng)。雜芳基通常包括一個(gè)選自硫、氮 或氧的環(huán)原子。雜芳基的例子包括但不限于吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、吡咯基、吡唑基、咪唑 基、噻唑基、噁唑基、異噁唑基、噻二唑基、噁二唑基、苯硫基、呋喃基、喹啉基、異喹啉基、苯 并咪唑基、苯并噁唑基、喹喔啉基等等。雜芳基可直接或通過脂肪族基團(tuán)或雜原子等連接部 分與母體分子結(jié)合。本發(fā)明中使用的雜芳基可任選包含其它取代基團(tuán)。本發(fā)明中使用的術(shù)語“雜芳基烷基”表示如上文所定義的雜芳基，其具有可將雜芳 基烷基連接于母體分子的烷基。例子包括但不限于吡啶基甲基、嘧啶基乙基、萘啶基丙基 等等。本發(fā)明中使用的雜芳基烷基可任選地在雜芳基或烷基部分的其中之一或兩者上包含 其它取代基團(tuán)。本發(fā)明中使用的術(shù)語“雜環(huán)基”表示包括至少一個(gè)雜原子的不飽和的、部分飽和 的、或完全飽和的單環(huán)或多環(huán)的環(huán)系統(tǒng)，因此包括雜芳基。雜環(huán)的含義也包括稠環(huán)系統(tǒng)，其 中，一個(gè)或多個(gè)稠環(huán)含有至少一個(gè)雜原子且其它的環(huán)可含有一個(gè)或多個(gè)雜原子或任選不含 雜原子。雜環(huán)基通常含有至少一個(gè)選自硫、氮或氧的原子。雜環(huán)基的例子包括[1，3] 二氧 戊環(huán)、吡咯烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基、噁唑烷基、異噁 唑烷基、嗎啉基、噻唑烷基、異噻唑烷基、喹喔啉基、噠嗪酮基、四氫呋喃基等等。雜環(huán)基在文 中可任選包含其它取代基團(tuán)。術(shù)語“烴基”包括含有C、0和H的基團(tuán)。包括具有任何飽和度的直鏈、支鏈、或環(huán) 狀基團(tuán)。這些烴基可包含一個(gè)或多個(gè)選自N、0或S的雜原子并可進(jìn)一步被一個(gè)或多個(gè)取代基單取代或多取代。本發(fā)明中使用的術(shù)語“單環(huán)或多環(huán)結(jié)構(gòu)”包括所有單環(huán)或多環(huán)的環(huán)系統(tǒng)，其具有稠合的或連接的環(huán)，其含義包括獨(dú)立地選自下組的單個(gè)的和混合的環(huán)系統(tǒng)脂肪基、脂環(huán)基、 芳基、雜芳基、芳烷基、芳基烷基、雜環(huán)基、雜芳基、雜芳基、雜芳基烷基。這些單環(huán)和多環(huán) 結(jié)構(gòu)可含有一致的環(huán)或具有不同飽和度的環(huán)，包括完全飽和的、部分飽和的、或完全不飽和 的。各環(huán)可包含選自C、N、0和S的環(huán)原子以得到雜環(huán)以及僅含碳環(huán)原子的環(huán)，所述環(huán)可存 在于混合基序中，如苯并咪唑，其中，一個(gè)環(huán)僅具有碳環(huán)原子而稠環(huán)具有兩個(gè)氮原子。單環(huán) 或多環(huán)結(jié)構(gòu)可被取代基進(jìn)一步取代，如鄰苯二甲酰亞胺，其有兩個(gè)=0基團(tuán)與一個(gè)環(huán)連接。 另一方面，單環(huán)或多環(huán)結(jié)構(gòu)可直接地或通過環(huán)原子、通過取代基或通過雙功能連接部分與 母體分子相連。術(shù)語“氧代”表示基團(tuán)(=0)。術(shù)語“二環(huán)核酸(BNA) ”和“二環(huán)核苷”表示核苷，其中所述核苷的呋喃糖部分包含 連接呋喃酮環(huán)上兩個(gè)碳原子的橋從而形成二環(huán)系統(tǒng)。術(shù)語“二環(huán)核苷類似物”指BNA樣核苷，其中所述核糖可被替代或修飾。當(dāng)用于本 申請時(shí)，四氫吡喃核苷類似物指四氫吡喃核苷類似物，其中所述核苷的核糖部分被四氫呋 喃環(huán)代替。術(shù)語“穩(wěn)定化合物”和“穩(wěn)定結(jié)構(gòu)”表示足夠堅(jiān)固從而能夠經(jīng)歷自反應(yīng)混合物中的 分離而達(dá)到有用的純度水平并被制成有效的治療劑的化合物。本發(fā)明僅涵蓋穩(wěn)定的化合 物。連接基團(tuán)或雙功能連接部分，如本領(lǐng)域已知的連接基團(tuán)或雙功能連接部分，可用 于將化學(xué)官能團(tuán)、共軛基團(tuán)、報(bào)告基團(tuán)和其它基團(tuán)連接到母體化合物如寡聚化合物中的選 擇性位點(diǎn)上。通常，雙功能連接部分包含具有兩種官能團(tuán)的烴基部分。選擇一種官能團(tuán)以 連接至母體分子或目標(biāo)化合物，而選擇另一種官能團(tuán)以主要連接任何選定基團(tuán)，如化學(xué)官 能團(tuán)或共軛基團(tuán)。在一些實(shí)施方案中，接頭包括鏈結(jié)構(gòu)或具有重復(fù)單元(如乙二醇或氨基 酸單元)的寡聚物。通常用于雙功能連接部分的官能團(tuán)的例子包括但不限于與親核基團(tuán) 反應(yīng)的親電子試劑以及與親電子基團(tuán)反應(yīng)的親核試劑。在一些實(shí)施方案中，雙官能連接部 分包括氨基、羥基、羧酸、硫醇、不飽和(如雙鍵或三鍵)等等。雙官能連接部分的一些非限 制性例子包括8-氨基-3，6- 二氧雜辛酸(ADO)、琥珀酰亞胺基4-(N-馬來酰亞氨基甲基) 環(huán)己烷-1-羧酸酯(SMCC)以及6-氨基己酸(AHEX或AHA)。其它連接基團(tuán)包括但不限于 取代的C1-Cltl烷基、取代或未取代的C2-Cltl烯基、或取代或未取代的C2-Cltl炔基，其中，優(yōu)選 的取代基的非限制性列表包括羥基、氨基、烷氧基、羧基、芐基、苯基、硝基、硫醇、硫代烷氧 基、鹵素、烷基、芳基、烯基和炔基。在某些實(shí)施方案中，寡聚化合物通過共價(jià)結(jié)合一個(gè)或多個(gè)5或3-末端基團(tuán)進(jìn)行修 飾。本發(fā)明中使用的術(shù)語“末端基團(tuán)”意在包括本領(lǐng)域已知的有用基團(tuán)，所述基團(tuán)被置于寡 聚化合物的3和5-端之一或兩端上以實(shí)現(xiàn)各種目的，例如實(shí)現(xiàn)對寡聚化合物的示蹤(熒光 標(biāo)記或其它報(bào)告基團(tuán))、提高寡聚化合物的藥代動(dòng)力學(xué)或藥效學(xué)(用于增強(qiáng)攝取和遞送的 基團(tuán))、或增強(qiáng)寡聚化合物的一種或多種其它所需特性(改善核酸酶穩(wěn)定性或結(jié)合親和力 的基團(tuán))。在某些實(shí)施方案中，3和5-末端基團(tuán)包括但不限于一個(gè)或多個(gè)修飾的或未修飾 的核苷、共軛基團(tuán)、加帽基團(tuán)、磷酸酯部分和保護(hù)基。
在某些實(shí)施方案中，寡聚化合物通過共價(jià)結(jié)合一個(gè)或多個(gè)共軛基團(tuán)進(jìn)行修飾。通 常，共軛基團(tuán)修飾被連接的寡聚化合物的一種或多種特性，包括但不限于，藥效學(xué)特性、藥 代動(dòng)力學(xué)特性、結(jié)合特性、吸附特性、細(xì)胞分布特性、細(xì)胞攝取特性、加載和清除特性。共軛 基團(tuán)是化學(xué)領(lǐng)域通常使用的并直接或通過任選的連接部分或連接基團(tuán)連接到母體化合物 如寡聚化合物。共軛基團(tuán)的優(yōu)選列表包括但不限于插入劑、報(bào)告分子、聚胺、聚酰胺、聚乙 二醇、硫醚、聚醚、膽固醇、硫代膽固醇、膽汁酸部分、葉酸、脂質(zhì)、磷脂、生物素、吩嗪、菲啶、 蒽醌、金剛烷、吖啶、熒光素、羅丹明、香豆素和染料。在某些實(shí)施方案中，寡聚化合物通過共價(jià)結(jié)合一個(gè)或多個(gè)5或3-末端基團(tuán)進(jìn)行修 飾，所述基團(tuán)包括但不限于其它修飾的或未修飾的核苷。這些末端基團(tuán)可用于增強(qiáng)寡聚化 合物的特性，如例如核酸酶穩(wěn)定性、攝入和遞送。本發(fā)明使用的術(shù)語“保護(hù)基”表示不穩(wěn)定的化學(xué)部分，本領(lǐng)域已知其可用在合成過 程中保護(hù)反應(yīng)性基團(tuán)(包括但不限于羥基、氨基和硫醇基團(tuán))不發(fā)生不希望的反應(yīng)的。保 護(hù)基通常被選擇性地和/或正交性地使用以在其它反應(yīng)性位點(diǎn)反應(yīng)期間保護(hù)某些位點(diǎn)并 且然后可被除去而留下未保護(hù)的基團(tuán)維持原樣或參與進(jìn)一步的反應(yīng)。如本領(lǐng)域已知，保護(hù) 基通常描述于 Greene 禾口 Wuts 的 Protective Groups in Organic Synthesis,第三版，John Wiley & Sons，紐約(1999)。
基團(tuán)可被選擇性結(jié)合至作為前體的本發(fā)明的寡聚化合物。例如，氨基可作為疊氮 基團(tuán)放入本發(fā)明化合物中，該基團(tuán)能夠在合成中希望的時(shí)間點(diǎn)化學(xué)轉(zhuǎn)變成氨基。通常，基團(tuán) 被保護(hù)或作為前體存在，這將使它們對修飾母體分子其它區(qū)域的反應(yīng)無活性并在合適的時(shí) 刻轉(zhuǎn)變?yōu)樗鼈兊淖罱K基團(tuán)。其它的典型保護(hù)基團(tuán)或前體基團(tuán)描述于Agrawal等，Protocols for OligonucleotideConjugates, Humana Press ；新澤西，1994 ·,% 26 卷，1-72 頁。羥基保護(hù)基的例子包括但不限于乙酰基、叔丁基、叔丁氧基甲基、甲氧基甲基、四 氫吡喃基、1-乙氧基乙基、1-(2_氯乙氧基)乙基、對-氯苯基、2，4_ 二硝基苯基、芐基、2， 6_ 二氯芐基、二苯基甲基、對-硝基芐基、雙(2-乙酰氧基乙氧基)甲基(ACE)、2-三甲基甲 硅烷基乙基、三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲 硅烷基、三苯基甲硅烷基、[(三異丙基甲硅烷基)氧基]甲基(Τ0Μ)、苯甲酰甲酸酯基、氯乙 ?；⑷纫阴；?、三氟乙?；⑿挛祯；⒈郊柞；?、對-苯基苯甲?；?-芴基甲基碳酸 酯基、甲磺酸酯基、甲苯磺酸酯基、三苯基甲基(三苯甲基)、單甲氧基三苯甲基、二甲氧基 三苯甲基(DMT)、三甲氧基三苯甲基、1(2-氟苯基)-4-甲氧基哌啶-4-基(FPMP)、9_苯基 黃嘌呤-9-基(Pixyl)和9-(對-甲氧基苯基)黃嘌呤-9-基(MOX)。其中，更優(yōu)選的羥基 保護(hù)基包括但不限于芐基、2，6_ 二氯芐基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷 基、苯甲?；?、甲磺酸酯基、甲苯磺酸酯基、二甲氧基三苯甲基(DMT)、9_苯基黃嘌呤-9-基 (Pixyl)和9-(對-甲氧基苯基)黃嘌呤-9-基(MOX)。氨基保護(hù)基的例子包括但不限于氨基甲酸酯-保護(hù)基，例如2-三甲基甲硅烷 基乙氧基羰基(Teoc)U-甲基-l-(4-聯(lián)苯基)乙氧基羰基(Bpoc)、叔丁氧基羰基(BOC)、 烯丙氧基羰基(Alloc)、9_芴基甲氧基羰基(Fmoc)、以及芐氧基羰基(Cbz)；酰胺保護(hù)基， 例如甲?；?、乙?；?、三鹵乙?；⒈郊柞；拖趸交阴；换酋０?保護(hù)基，例如 2-硝基苯磺?；缓蛠啺繁Ｗo(hù)基以及環(huán)亞胺保護(hù)基，如苯二甲酰亞氨基和二硫代琥珀酰基 (dithiasuccinoyl)。硫醇保護(hù)基的例子包括但不限于三苯基甲基(三苯甲基)、芐基(Bn)寸。在某些實(shí)施方案中，寡聚化合物通過將核苷與任選被保護(hù)的含磷核苷間鍵相連來 制備。含磷核苷間鍵(例如磷酸二酯鍵和硫代磷酸酯鍵)的典型保護(hù)基包括β-氰基乙 基、二苯基甲硅烷基乙基、δ-氰基丁烯基、氰基對-二甲苯基(CPX)、N-甲基-N-三氟乙酰 基乙基(META)、乙酰氧基苯氧基乙基(APE)、和丁烯-4-基。參見例如美國專利4，725，677 和再公告專利 34，069 ( β -氰基乙基)；Beaucage, S. L.和 Iyer，R. P.，Tetrahedron, 49，10，第 1925-1963 頁(1993) ；Beaucage, S. L.和 Iyer, R. P.，Tetrahedron,49,46,第 10441-10488 頁(1993) ；Beaucage, S. L.和 Iyer，R. P.，Tetrahedron, 48,12，第 2223-2311 頁(1992)。術(shù)語“正交保護(hù)”指被不同類別的保護(hù)基保護(hù)的官能團(tuán)，其中，各種類型的保 護(hù)基可以以任意順序并在所有其它類型的保護(hù)基存在下被除去(參見Barany，G.和 Merrifield, R. B.，J. Am. Chem. Soc, 1977，99，7363 ；同上，1980，102，3084)。正交保護(hù)被廣泛 用于例如自動(dòng)寡核苷酸合成。在一個(gè)或多個(gè)不受去封閉過程影響的其它受保護(hù)的官能團(tuán)的 存在下將某官能團(tuán)去封閉。該去封閉的官能團(tuán)以某種方式反應(yīng)，并在某一時(shí)刻在不同反應(yīng) 條件下除去其它正交保護(hù)基。這使得能夠通過選擇化學(xué)得到所需的化合物或寡聚化合物。在某些實(shí)施方案中，提供了具有反應(yīng)性磷基團(tuán)的化合物，其能用于形成核苷間鍵， 包括例如磷酸二酯和硫代磷酸酯。這種反應(yīng)性磷基團(tuán)是本領(lǐng)域已知的并含有Pm或Pv價(jià)態(tài) 的磷原子，包括但不限于亞磷酰胺、H-膦酸酯、磷酸三酯以及含磷的手性佐劑。優(yōu)選的固 相合成法利用亞磷酰胺(Pm)作為反應(yīng)性亞磷酸酯。然后采用本領(lǐng)域已知方法將中間體亞 磷酸酯化合物氧化成Pv態(tài)以得到磷酸二酯或硫代磷酸酯核苷酸間鍵。其它的反應(yīng)性磷酸 酉旨禾口亞憐酸酉旨描述于 Tetrahedron Report Number 309 (Beaucage 禾口 Iyer, Tetrahedron, 1992,48,2223-2311)。本發(fā)明中使用的術(shù)語“核苷間鍵”意在包括本領(lǐng)域已知的所有形式的核苷間 連接基因，包括但不限于含磷核苷間連接基團(tuán)(如磷酸二酯和硫代磷酸酯)、不含磷 的核苷間連接基團(tuán)(如甲?；蛠喖谆鶃啺被?、以及中性非離子核苷間連接基團(tuán)如酰 胺-3 (3-CH2-C ( = 0) -N (H) -5)、酰胺-4 (3_CH2_N (H) -C ( = 0) -5)。用于本發(fā)明的寡聚化合物的具體例子包括含有修飾的(例如非天然存在的)核苷 間鍵的寡核苷酸。通過存在或不存在磷原子定義了兩種主要類型的核苷間鍵。具有磷原子 的修飾的核苷間鍵包括但不限于硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、 氨基烷基_磷酸三酯、甲基膦酸酯及其它烷基膦酸酯(包括3-亞烷基膦酸酯、5-亞烷基膦 酸酯和手性膦酸酯)、亞膦酸酯、氨基磷酸酯(包括3-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷 酸酯)、硫羰基氨基磷酸酯、硫羰基烷基膦酸酯、硫羰基烷基磷酸三酯、硒基磷酸酯和硼代磷 酸酯，它們具有常規(guī)的3-5鍵，這些寡核苷酸的2-5連接的類似物，以及那些具有反極性的 寡核苷酸，其中，一個(gè)或多個(gè)核苷酸間鍵是3 — 3、5 — 5或2 — 2鍵。具有反極性的寡核苷 酸可在最靠近3端的核苷間鍵處包括3 — 3鍵，即單個(gè)反轉(zhuǎn)的核苷殘基，其可以是脫堿基的 (沒有核堿基或用羥基取代核堿基)。也包括各種鹽、混合鹽和游離酸形式。教導(dǎo)制備上述含磷鍵的典型美國專利包括但不限于U. S. :3，687，808 ； 4，469，863 ；4，476，301 ；5，023，243 ；5，177，196 ；5，188，897 ；5，264，423 ；5，276，019 ； 5，278，302 ；5，286，717 ；5，321，131 ；5，399，676 ；5，405，939 ；5，453，496 ；5，455，233 ；5，466，677 ；5，476，925 ；5，519，126 ；5，536，821 ；5，541，306 ；5，550，111 ；5，563，253 ； 5，571，799 ；5，587，361 ；5，194，599 ；5，565，555 ；5，527，899 ；5，721，218 ；5，672，697 和 5，625，050，其中一些專利為本申請人所有，各專利作為參考并入本發(fā)明。不含磷原子的修飾的核苷間鍵包括但不限于那些由短鏈烷基或環(huán)烷基核苷間鍵、混合的雜原子和烷基或環(huán)烷基核苷間鍵、或者一個(gè)或多個(gè)短鏈雜原子或雜環(huán)核苷間鍵形成 的鍵。其中包括具有硅氧烷主鏈；硫化物、亞砜和砜主鏈；甲酰基和硫代甲?；麈湥粊喖?基甲?；土虼柞；麈?；核糖乙?；麈?；含烯烴主鏈；氨基磺酸酯主鏈；亞甲基亞氨 基和亞甲基胼基主鏈；磺酸酯和磺酰胺主鏈；酰胺主鏈；以及具有混合的N、0、S和CH2組成 部分的那些。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“寡核苷”表示通過不含磷原子的核苷間鍵連接的 兩個(gè)或更多核苷的序列。教導(dǎo)制備上述寡核苷的典型美國專利包括但不限于U. S. :5，034，506 ； 5，166，315 ；5，185，444 ；5，214，134 ；5，216，141 ；5，235，033 ；5，264，562 ；5，264，564 ； 5，405，938 ；5，434，257 ；5，466，677 ；5，470，967 ；5，489，677 ；5，541，307 ；5，561，225 ； 5，596，086 ；5，602，240 ；5，610，289 ；5，602，240 ；5，608，046 ；5，610，289 ；5，618，704 ； 5，623，070 ；5，663，312 ；5，633，360 ；5，677，437 ；5，792，608 ；5，646，269 和 5，677，439，其中 的一些專利為本申請人所有，各專利作為參考并入本發(fā)明。本發(fā)明使用的術(shù)語“中性核苷間鍵”表示包括非離子性核苷間鍵。中性核苷間 鍵包括但不限于磷酸三酯、甲基膦酸酯、匪I (3-CH2-N (CH3) -0-5)、酰胺-3 (3-CH2-C (= 0) -N(H) -5)、酰胺-4(3-CH2-N(H)-C( = 0) -5)、甲酰?；?formacetal) (3-0-CH2-0_5)和硫 代甲?；?3-S-CH2-0-5)。其它中性核苷間鍵包括非離子性鍵，包括硅氧烷(二烷基硅氧 烷)、羧酸酯、羧酰胺、硫化物、磺酸酯和酰胺(例如參見Carbohydrate Modifications in Antisense Research ；Y. S. Sanghvi 禾口 P. D. Cook 編，ACS Symposium Series 580 ；第 3 禾口 4 章(第40-65頁))。其它中性核苷間鍵包括含有混合N、0、S和CH2組分的非離子性鍵。本發(fā)明所述的化合物可通過任何適用的有機(jī)合成技術(shù)來制備，如下面的實(shí)施例中 列舉的技術(shù)。許多此類技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。然而，許多已知技術(shù)詳細(xì)描述在Compendium of Organic Synthetic Methods (John Wiley & Sons，紐約)，第 1 卷，Ian Τ. Harrison 禾口 Shuyen Harrison (1971)；第 2 卷，Ian T. Harrison 禾口 Shuyen Harrison (1974)；第 3 卷，Louis S. Hegedus 禾口 Leroy Wade (1977)；第 4 卷，Leroy G. Wade Jr.，(1980)；第 5 卷，Leroy G. Wade Jr. (1984)；和第 6 卷，Michael B. Smith ；以及 March，J.，Advanced Organic Chemistry，第三片反，John Wiley & Sons，紐約(1985) ；Comprehensive Organic Synthesis.Selectivity, Strategy & Efficiency in Modern Organic Chemistry，第 9 卷，BarryM. Trost 主編，Pergamon Press，紐約(1993) ；Advanced Organic Chemistry, B 部:Reactions and Synthesis,第 4 片反；Carey 禾口 Sundberg ；KluwerAcademic/Plenum Publishers 紐 約(2001) ；Advanced Organic Chemistry, Reactions，Mechanisms， and Structure，第 2 片反，March，McGraw Hill(1977) ；Protecting Groups in Organic Synthesis，第二版，Greene，T. W.和 Wutz，P. G. Μ·，John Wiley & Sons，紐約(1991)；以及 Comprehensive Organic Transformations，第二片反，Larock，R. C.，John Wiley & Sons，紐 約(1999)ο本發(fā)明所述化合物含有一個(gè)或多個(gè)不對稱中心且因此能產(chǎn)生對映體、非對映體和其它立體異構(gòu)形式，以絕對立體化學(xué)而言，例如對于氨基酸，立體異構(gòu)形式可被定義為 (R)-或(S)-、α或β、或者(D)-或(L)-。本發(fā)明包括所有這些可能的異構(gòu)體以及它們 的外消旋和光學(xué)純化形式。光學(xué)異構(gòu)體可通過上述方法或者通過拆分外消旋混合物從它 們各自的光學(xué)活性前體制備?？赏ㄟ^層析或通過反復(fù)結(jié)晶或者通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知 的這些技術(shù)的組合在存在拆分劑時(shí)進(jìn)行拆分。有關(guān)拆分的進(jìn)一步的細(xì)節(jié)可在Jacques等， Enantiomers, Racemates, and Resolutions (John Wiley & Sons，1981)中找到。除非另有 說明，當(dāng)本發(fā)明所述化合物含有烯屬雙鍵、其它不飽和度、或者其它幾何不對稱中心時(shí)，所 述化合物將同時(shí)包括E和Z幾何異構(gòu)體或者順_和反_異構(gòu)體。同樣，所有互變異構(gòu)形式 也包括在內(nèi)。除非另有說明，本發(fā)明中出現(xiàn)的任何碳碳雙鍵構(gòu)型的選擇僅出于簡便的目的 而并非指定某種特定構(gòu)型；因此，在本發(fā)明中被隨意描述成反式的碳碳雙鍵或碳_雜原子 雙鍵可以是順式的、反式的、或者是兩者任意比例的混合物。本發(fā)明中，術(shù)語“寡聚化合物”意在包括具有至少一個(gè)能夠與核酸分子雜交的區(qū)域 的聚合物。術(shù)語“寡聚化合物”包括寡核苷酸、寡核苷酸類似物和寡核苷以及核苷酸模擬物 和/或含有核酸和非核酸組分的混合聚合物，以及包含來自任意這些種類的核苷混合物的 嵌合寡聚化合物。四氫吡喃核苷類似物可被歸類為模擬物，因?yàn)楹颂遣糠忠驯凰臍溥拎?團(tuán)取代。寡聚化合物通常線性制備，但也可連接或者通過其它方法制成環(huán)形，并可包含分 支。寡聚化合物可形成雙鏈構(gòu)建物，如兩條鏈雜交形成雙鏈組合物。雙鏈組合物可連接或 分離，并可在末端包含懸臂。通常，寡聚化合物包含連接的單體亞單元的主鏈，其中，各連接 的單體亞單元直接或間接連接于雜環(huán)堿基部分。寡聚化合物也可包含 未連接于雜環(huán)堿基部 分的單體亞單元從而提供脫堿基位點(diǎn)。連接單體亞單元、糖部分或糖替代物以及雜環(huán)堿基 部分的鍵可獨(dú)立修飾。鍵-糖單元(可包含或不包含雜環(huán)堿基)可被模擬物取代，如肽核 酸中的單體。在寡聚化合物各位點(diǎn)修飾或者取代部分或完整單體的能力導(dǎo)致產(chǎn)生大量可能 的基序。如本領(lǐng)域所知，核苷是堿基-糖組合。核苷的堿基部分通常是雜環(huán)堿基部分。最 常見的兩類這樣的雜環(huán)堿基是嘌呤和嘧啶。核苷酸是進(jìn)一步包含了磷酸基的的核苷，所述 磷酸基共價(jià)連接到核苷的糖部分。對于那些包含呋喃戊糖基糖的核苷，磷酸基可連接于所 述糖的2、3或5羥基部分。在形成寡核苷酸時(shí)，磷酸基將鄰近的核苷彼此共價(jià)連接從而形 成線性聚合物。該線性聚合結(jié)構(gòu)的兩端可通過雜交或通過形成共價(jià)鍵連接形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。 然而，通常希望開放的線性結(jié)構(gòu)。在寡核苷酸結(jié)構(gòu)內(nèi)，磷酸基通常用來指形成寡核苷酸的核 苷間鍵。RNA和DNA的常規(guī)核苷間鍵是3 — 5磷酸二酯鍵。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“寡核苷酸”指核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸(DNA) 的寡聚物或聚合物。該術(shù)語包括由天然核堿基、糖和共價(jià)核苷間鍵構(gòu)成的寡核苷酸。術(shù)語 “寡核苷酸類似物"指具有一個(gè)或多個(gè)非天然部分的寡核苷酸。較之天然寡核苷酸，這些非 天然寡核苷酸通常是優(yōu)選的，因?yàn)樗鼈兙哂兴Ｍ奶匦?，如增加的?xì)胞攝入、對靶核酸增 強(qiáng)的親和力以及在存在核酸酶時(shí)提高的穩(wěn)定性。在本發(fā)明上下文中，術(shù)語“寡核苷”指通過不含磷原子的核苷間鍵連接的核苷序 列。這種類型的核苷間鍵包含短鏈烷基、環(huán)烷基、混合的雜原子烷基、混合的雜原子環(huán)烷基、 一個(gè)或多個(gè)短鏈雜原子和一個(gè)或多個(gè)短鏈雜環(huán)。這些核苷間鍵包括但不限于硅氧烷、硫化 物、亞砜、砜、乙?；?、甲?；?、硫代甲酰基、亞甲基甲?；?、硫代甲?；?、烯基、氨基磺酸酯、亞甲基亞氨基、亞甲基胼基、磺酸酯、磺酰胺、酰胺以及其它具有混合的N、0、S和CH2組分的
基團(tuán)。教導(dǎo)上述寡核苷制備的典型美國專利包括但不限于U. S. :5，034，506 ； 5，166，315 ；5，185，444 ；5，214，134 ；5，216，141 ；5，235，033 ；5，264，562 ；5，264，564 ； 5，405，938 ；5，434，257 ；5，466，677 ；5，470，967 ；5，489，677 ；5，541，307 ；5，561，225 ； 5，596，086 ；5，602，240 ；5，610，289 ；5，602，240 ；5，608，046 ；5，610，289 ；5，618，704 ； 5，623，070 ；5，663，312 ；5，633，360 ；5，677，437 ；5，792，608 ；5，646，269 和 5，677，439，其中 的一些專利為本申請人所有，各專利作為參考并入本發(fā)明。本發(fā)明使用的術(shù)語“核堿基”或 “雜環(huán)堿基部分”與“核酸堿基或其模擬物”同義。通常，核堿基或雜環(huán)堿基部分是含有能夠 與核酸堿基形成氫鍵的一個(gè)或多個(gè)原子或多組原子的任何亞結(jié)構(gòu)。本發(fā)明中使用的“未修飾的”或“天然”核堿基包括嘌呤堿基腺嘌呤(A)和鳥嘌呤 (G)，以及嘧啶堿基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修飾的核堿基包括其它合成的 和天然的核堿基，如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)，5-羥基甲基胞嘧啶，黃嘌呤，次黃嘌呤，2-氨 基腺嘌呤，腺嘌呤和鳥嘌呤的6-甲基衍生物及其它烷基衍生物，腺嘌呤和鳥嘌呤的2-丙 基衍生物以及其它烷基衍生物，2-硫代尿嘧啶，2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶，5-鹵代 尿嘧啶和胞嘧啶，5-丙炔基(-C ε C-CH3)尿嘧啶和胞嘧啶以及嘧啶堿基的其它炔基衍生 物，6-偶氮尿嘧啶，胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫代尿嘧啶，8-鹵代、 8_氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羥基以及其它8-取代的腺嘌呤和鳥嘌呤，5-鹵代(尤其 是5-溴)、5_三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鳥嘌呤和7-甲基腺嘌 呤，2-F-腺嘌呤，2-氨基腺嘌呤，8-氮雜鳥嘌呤和8-氮雜腺嘌呤，7-脫氮鳥嘌呤和7-脫氮 腺嘌呤，3-脫氮鳥嘌呤和3-脫氮腺嘌呤，通用堿基，疏水堿基，雜亂堿基，大小膨脹的堿基 (size-expanded base)以及如本發(fā)明所定義的氟化堿基。其它的修飾的核堿基包括三環(huán) 嘧啶如吩噁嗪胞苷(1H-嘧啶并[5，4-b][l，4]苯并噁嗪2(3H)_酮)、吩噻嗪胞苷(1H-嘧 啶并[5，4-b][l，4]苯并噻嗪_2 (3H)_酮)、G-鉗例如取代的吩噁嗪胞苷(如9_(2_氨基乙 氧基)-H-嘧啶并[5，4-b][l，4]苯并噁嗪2(3H)_酮)、咔唑胞苷(2H-嘧啶并[4，5_b]吲 哚-2-酮)、吡啶并吲哚胞苷(H-吡啶并[3，2 :4，5]吡咯并[2，3-d]嘧啶_2_酮)。修飾的核 堿基還可以包括其中的嘌呤或嘧啶堿基被其它雜環(huán)替代的核堿基，例如7-脫氮-腺嘌呤、 7_脫氮鳥苷、2-氨基吡啶和2-吡啶酮。其它核堿基包括以下文獻(xiàn)中披露的那些美國專利 3, 687, 808 ；The Concise Encyclopedia Of Polymer Science AndEngineering,第858-859 頁，Kroschwitz,J. I.編，John Wiley & Sons, 1990 ；Englisch等，Angewandte Chemie,國際 版，1991, 30,613 ；以及 Sanghvi, Y. S.,第 15 章，Antisense Research and Applications, 第 289-302 頁，Crooke, S. Τ.和 Lebleu，B.編，CRC 出版社，1993。修飾的核堿基包括但不限于遍在堿基、疏水堿基、雜亂堿基、大小膨脹的堿基、以 及如本發(fā)明所定義的氟化堿基。這些核堿基中的一些對于提高本發(fā)明寡聚化合物的結(jié)合親 和力特別有用。其中包括5-取代的嘧啶、6-氮雜嘧啶和N-2、N-6和0-6取代的嘌呤，包括 2_氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。已顯示5-甲基胞嘧啶取代能提 高核酸雙鏈體穩(wěn)定性 0. 6-1. 2°C (Sanghvi，Y. S.，Crooke，S. Τ· ^P Lebleu, B.編，Antisense Research andApplications, CRC 出版社，Boca Raton, 1993，第 276—278 頁)。教導(dǎo)上述修飾的核堿基以及其它修飾的核堿基的制備的典型的美國專利包括但不限于上述 U. S. 3，687，808，以及 U. S. :4，845，205 ；5，130，302 ；5，134，066 ；5，175，273 ； 5，367，066 ；5，432，272 ；5，457，187 ；5，459，255 ；5，484，908 ；5，502，177 ；5，525，711 ； 5，552，540 ；5，587，469 ；5，594，121 ；5，596，091 ；5，614，617 ；5，645，985 ；5，830，653 ； 5，763，588 ；6，005，096 ；和5，681，941，其中的一些專利為本申請人所有，各專利作為參考 并入本發(fā)明，以及美國專利5，750，692，該專利為本申請人所有，各專利作為參考并入本發(fā) 明。在某些實(shí)施方案中，寡聚化合物也可包含一個(gè)或多個(gè)具有修飾的糖部分的核 苷。呋喃糖基糖環(huán)可通過許多方法修飾，其中包括用取代基(2、3、4或5)取代，橋連形 成BNA，以及用S或N(R)等雜原子取代4-0。教導(dǎo)這些修飾的糖的制備的一些典型美國 專利包括但不限于:U. S. 4, 981，957 ；5，118，800 ；5，319，080 ；5，359，044 ；5，393，878 ； 5，446，137 ；5，466，786 ；5，514，785 ；5，519，134 ；5，567，811 ；5，576，427 ；5，591，722 ； 5，597，909 ；5，610，300 ；5，627，053 ；5，639，873 ；5，646，265 ；5，658，873 ；5，670，633 ； 5，792，747 ；5，700，920 ；6，600，032 ；和 2005 年 6 月 2 日提交并于 2005 年 12 月 22 日作為 WO 2005/121371公布的國際專利申請PCT/US2005/019219，其中的一些為本申請人所有， 各專利作為參考并入本發(fā)明。優(yōu)選的修飾的糖的典型列表包括但不限于具有2-F、2-0CH2 或2-0 (CH2) 2-0CH3 (2-M0E或簡寫為Μ0Ε)的取代的糖；4-硫代修飾的糖，4-硫代-2-取代的 糖和二環(huán)修飾的糖。本發(fā)明中使用的術(shù)語“核苷模擬物”意在包括那些用來在寡聚化合物的一個(gè)或多 個(gè)位置代替糖或者糖和堿基而非鍵的結(jié)構(gòu)，例如，具有嗎啉的核苷模擬物或二環(huán)[3. 1.0] 己基糖模擬物，如具有磷酸二酯鍵的非呋喃糖單元。術(shù)語“糖替代物”與范圍略寬的術(shù) 語“核苷模擬物”有重疊，但表示僅替換糖單元(呋喃糖環(huán))。術(shù)語“核苷酸模擬物”意在 包括那些用來在寡聚化合物一個(gè)或多個(gè)位置代替核苷以和鍵的結(jié)構(gòu)，例如肽核酸或嗎啉 (與_N(H)-C( = 0)-0-或其它非磷酸二酯鍵連接的嗎啉)。本發(fā)明中使用的術(shù)語“修飾的核苷”意在包括可采用寡聚物合成方法結(jié)合至寡聚 化合物的所有形式的修飾的核苷。該術(shù)語包括具有呋喃核糖并可包含雜環(huán)堿基的核苷，但 也可包括脫堿基的修飾的核苷。一組典型的修飾的核苷包括但不限于二環(huán)核苷、2-修飾 的核苷、4-硫代修飾的核苷以及4-硫代-2-修飾的核苷和堿基修飾的核苷。本發(fā)明中使用的術(shù)語“單體亞單元”意在包括可采用寡聚物合成方法結(jié)合至寡聚 化合物的所有形式的單體。該術(shù)語包括具有呋喃核糖和雜環(huán)堿基的核苷，但也可包括具有 修飾的糖或糖替代物如模擬物的單體。因此，該術(shù)語包括核苷、修飾的核苷(如二環(huán)核苷)、 核苷模擬物(如本發(fā)明提供的四氫吡喃核苷類似物)。了解本發(fā)明的公開內(nèi)容的本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠制備實(shí)際上任何可行長度的寡聚化合物以實(shí)踐本發(fā)明所述方法。這些寡聚化合物將包括至少一個(gè)、且優(yōu)選多個(gè)本發(fā)明提 供的四氫吡喃基核苷類似物，并可包含其它單體亞單元，所述亞單元包括但不限于核苷、修 飾的核苷和核苷模擬物。因此，術(shù)語“單體亞單元”包括可用于寡聚物合成的所有形式的單 體單元，單體亞單元的優(yōu)選列表包括，例如，四氫吡喃核苷類似物、二環(huán)核苷、核苷、修飾的 核苷和核苷模擬物。在某些實(shí)施方案中，寡聚化合物包含長度為約8至約80個(gè)單體亞單元。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解本發(fā)明示例性寡聚化合物的長度為8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、 44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、 69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80個(gè)單體亞單元，或其間的任意范圍。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的寡聚化合物長度為8至40個(gè)單體亞單元。本領(lǐng)域 普通技術(shù)人員將理解這種示例性寡聚化合物的長度為8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39 或 40 個(gè)單體亞單 元，或其間的任意范圍。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的寡聚化合物的長度為8至20個(gè)單體亞單元。本領(lǐng)域 普通技術(shù)人員將理解這種示例性寡聚化合物的長度為8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19或20個(gè)單體亞單元，或其間的任意范圍。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的寡聚化合物的長度為10至16個(gè)單體亞單元。本領(lǐng) 域普通技術(shù)人員將理解這種示例性寡聚化合物的長度為10、11、12、13、14、15或16個(gè)單體 亞單元，或其間的任意范圍。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的寡聚化合物的長度為12至16個(gè)單體亞單元。本領(lǐng) 域普通技術(shù)人員將理解這種示例性寡聚化合物的長度為12、13、14、15或16個(gè)單體亞單元， 或其間的任意范圍。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的寡聚化合物的長度為10至14個(gè)單體亞單元。本領(lǐng) 域普通技術(shù)人員將理解這種示例性寡聚化合物的長度為10、11、12、13或14個(gè)單體亞單元， 或其間的任意范圍。在某些實(shí)施方案中，提供了具有各種長度范圍的連接的單體亞單元的寡聚化合 物。在某些實(shí)施方案中，提供的寡聚化合物由X-Y個(gè)連接的單體亞單元構(gòu)成，其中X和Y各 自獨(dú)立地選自 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、 30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49 和 50 ；前提是 X < Y。 例如，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的寡聚化合物包含8-9、8-10、8-11、8-12、8-13、 8-14、8-15、8-16、8-17、8-18、8-19、8-20、8-21、8-22、8-23、8-24、8-25、8-26、8-27、8-28、
8-29、8-30、9-10、9-11、9-12、9-13、9-14、9-15、9-16、9-17、9-18、9-19、9-20、9-21、9-22、
9-23、9-24、9-25、9-26、9-27、9-28、9-29、9-30、10-11、10-12、10-13、10-14、10-15、10-16、
10-17、10-18、10-19、10-20、10-21、10-22、10-23、10-24、10-25、10-26、10-27、10-28、
10-29、10-30、11-12、11-13、11-14、11-15、11-16、11-17、11-18、11-19、1卜20、11-21、
11-22、11-23、11-24、11-25、1卜26、11-27、11-28、11-29、11-30、12-13、12-14、12-15、
12-16、12-17、12-18、12-19、12-20、12-21、12-22、12-23、12-24、12-25、12-26、12-27、
12-28、12-29、12-30、13-14、13-15、13-16、13-17、13-18、13-19、13-20、13-21、13-22、
13-23、13-24、13-25、13-26、13-27、13-28、13-29、13-30、14-15、14-16、14-17、14-18、
14-19、14-20、14-21、14-22、14-23、14-24、14-25、14-26、14-27、14-28、14-29、14-30、
15-16、15-17、15-18、15-19、15-20、15-21、15-22、15-23、15-24、15-25、15-26、15-27、
15-28、15-29、15-30、16-17、16-18、16-19、16-20、16-21、16-22、16-23、16-24、16-25、
16-26、16-27、16-28、16-29、16-30、17-18、17-19、17-20、17-21、17-22、17-23、17-24、
17-25、17-26、17-27、17-28、17-29、17-30、18-19、18-20、18-21、18-22、18-23、18-24、
18-25、18-26、18-27、18-28、18-29、18-30、19-20、19-21、19-22、19-23、19-24、19-25、19-26、19-29、19-28、19-29、19-30、20-21、20-22、20-23、20-24、20-25、20-26、20-27、
20-28、20-29、20-30、21-22、21-23、21-24、21-25、21-26、21-27、21-28、21-29、21-30、
22-23、22-24、22-25、22-26、22-27、22-28、22-29、22-30、23-24、23-25、23-26、23-2八
23-28、23-29、23-30、24-25、24-26、24-27、24-28、24-29、24-30、25-26、25-27、25-28、 25-29、25-30、26-27、26-28、26-29、26-30、27-28、27-29、27-30、28-29、28-30、或 29-30 個(gè) 連接的單體亞單元。在某些實(shí)施方案中，寡聚化合物的長度范圍為8-16、8-40、10-12、10-14、10_16、 10-18、10-20、10-21、12-14、12-16、12-18、12-20 和 12-24 個(gè)連接的單體亞單元。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明列出的寡聚化合物的范圍意在限制寡聚化合物中單體 亞單元的數(shù)目，然而，這些寡聚化合物可進(jìn)一步包含保護(hù)基，如羥基保護(hù)基、任選連接的共 軛基團(tuán)、5和/或3-末端基團(tuán)和/或其它取代基。嵌合寡聚化合物在兩個(gè)或更多位置具有差異修飾的核苷且通常被定義為具有基 序。本發(fā)明的嵌合寡聚化合物可形成成為兩個(gè)或更多如上文所述的寡核苷酸、寡核苷酸 類似物、寡核苷和/或寡核苷酸模擬物的組合結(jié)構(gòu)。教導(dǎo)這些雜合結(jié)構(gòu)的制備的典型美 國專利包括但不限于:U. S. 5, 013，830 ；5，149，797 ；5，220，007 ；5，256，775 ；5，366，878 ； 5，403，711 ；5，491，133 ；5，565，350 ；5，623，065 ；5，652，355 ；5，652，356 ；和 5，700，922，其 中一些專利為本申請人所有，各專利作為參考完整并入本發(fā)明。在某些實(shí)施方案中，修飾的和未修飾的核苷及其模擬物的寡聚化根據(jù)文獻(xiàn)中合 適的 DNA(Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Agrawal 編(1993), Humana Press)和 / 或 RNA(Scaringe， Methods(2001)，23，206-217 ;Gait 等，Applications of Chemically synthesized RNA in RNA :ProteinInteractions, Smith 編(1998),1-36 ； Gallo等，Tetrahedron (2001), 57, 5707-5713)合成方法適當(dāng)進(jìn)行。其它固相合成方法可 在 Caruthers 的美國專利 4，415，732 ；4，458，066 ；4，500，707 ；4，668，777 ；4，973，679 ；和 5，132，418 ；以及Koster的美國專利4，725，677和再公告專利34，069中找到。通常用于基于支持介質(zhì)合成寡聚化合物和相關(guān)化合物的市售設(shè)備由若干供應(yīng)商 出售，包括例如Applied Biosystems (Foster City，加州)。可額外或替換使用本領(lǐng)域 已知的用于此類合成的任何其它方法。包括自動(dòng)合成技術(shù)在內(nèi)的合適的固相技術(shù)描述 于 F. Eckstein(編)，Oligonucleotide and Analogues, aPractical Approach, Oxford University Press，紐約(1991)。相對于DNA及相關(guān)類似物的合成，隨著RNAi研究的增加，RNA及相關(guān)類似物的合成也在持續(xù)增長。目前使用的主要的RNA合成策略通常包括5-0-DMT-2-0-叔丁基 二甲基甲硅烷基(TBDMS)、5-0-DMT-2-0-[ 1(2-氟苯基)-4-甲氧基哌啶_4_基](FPMP)、 2-0-[(三異丙基甲硅烷基)氧基]甲基(2-0-CH2-0-Si(iPr)3(T0M)、和5-0-甲硅烷基 醚-2-ACE(5-0-雙(三甲基甲硅烷氧基)環(huán)十二烷氧基甲硅烷基醚(DOD)-2-0-雙(2-乙 酰氧基乙氧基)甲基(ACE)。目前，提供RNA產(chǎn)物的一些主要公司包括Pierce Nucleic AcidTechnoIogies> Dharmacon Research Inc.、Ameri Biotechnologies Inc.以 及 Integrated DNA Technologies，Inc.。Princeton Separations 公司f、肖售 RNA合成 舌化齊[J， 這種活化劑據(jù)宣傳能減少偶聯(lián)時(shí)間，尤其是當(dāng)使用TOM和TBDMS法時(shí)。用于商業(yè)RNA合成的主要基團(tuán)包括
TBDMS = 5-0-DMT-2-0-叔丁基二 甲基甲硅烷基；TOM = 2-0-[(三異丙基甲硅烷基)氧基]甲基；D0D/ACE = (5_0_雙(三甲基甲硅烷氧基)環(huán)十二烷氧基甲硅烷基醚_2_0-雙 (2-乙酰氧基乙氧基)甲基FPMP = 5-0-DMT-2-0-[l (2_ 氟苯基)_4_ 甲氧基哌啶 _4_ 基]。在某些實(shí)施方案中，上述各種RNA合成策略可用于本發(fā)明。同樣適用于本發(fā)明 的策略也可以是上述方法的組合，例如采用一種策略中的5-保護(hù)基和另一種策略中的 2-0-保護(hù)。在本發(fā)明上下文中，“雜交”表示將寡聚化合物的互補(bǔ)鏈配對。在某些實(shí)施方案中， 一種配對機(jī)制涉及在寡聚化合物鏈的互補(bǔ)核苷或核苷酸堿基(核堿基)之間形成氫鍵，所 述氫鍵可以是Watson-Crick、Hoogsteen或反向Hoogsteen氫鍵。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶 是互補(bǔ)的核堿基，通過形成氫鍵配對。雜交可在各種環(huán)境下發(fā)生。當(dāng)化合物與靶核酸的結(jié)合影響靶核酸的正常功能從而造成活性損失，并且存在足 夠的互補(bǔ)程度以在希望特異性結(jié)合的條件(即，對于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)或治療性處理，在生理?xiàng)l件 下；以及對于體外實(shí)驗(yàn)，在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的條件下)下避免寡聚化合物與非靶核酸序列之間的 非特異性結(jié)合時(shí)，該寡聚化合物是可特異性雜交的。本發(fā)明中使用的“互補(bǔ)”表示兩個(gè)核堿基的精確配對能力，與核堿基的位置無關(guān)。 例如，如果在寡聚化合物某個(gè)位置上的核堿基能夠與靶核酸某個(gè)位置上的核堿基形成氫 鍵，所述靶核酸是DNA、RNA或寡核苷酸分子，則寡核苷酸和靶核酸之間的氫鍵位置被認(rèn)為 是互補(bǔ)位置。當(dāng)寡聚化合物以及其它DNA、RNA或寡核苷酸各分子中足夠數(shù)量的互補(bǔ)位置被 可相互形成氫鍵的核堿基占據(jù)時(shí)，所述分子是彼此互補(bǔ)的。因此，術(shù)語“可特異性雜交”和 “互補(bǔ)”用來表示在足夠數(shù)量的核堿基之間足夠程度的精確配對能力或互補(bǔ)性，從而可在寡 核苷酸和靶核酸之間發(fā)生穩(wěn)定且特異性的結(jié)合。本領(lǐng)域已知，寡聚化合物序列不需要與其可被特異性雜交的靶核酸序列100%互 補(bǔ)。此外，寡核苷酸可在一個(gè)或多個(gè)區(qū)段上雜交，因此相干或相鄰區(qū)段不參與雜交(例如， 環(huán)結(jié)構(gòu)或發(fā)夾結(jié)構(gòu))。在某些實(shí)施方案中，寡聚化合物可包含與它們所靶向的靶核酸中的 靶區(qū)域至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%或至少約99%的序列互補(bǔ)性。 例如，在寡聚化合物的20個(gè)核堿基中有18個(gè)與靶區(qū)域互補(bǔ)從而發(fā)生特異性雜交的寡聚化 合物代表90%互補(bǔ)性。在本例中，其余的非互補(bǔ)性核堿基可以是成簇的或散布在互補(bǔ)的核 堿基之間，不需要相互鄰近或與互補(bǔ)的核堿基鄰近。這樣，長度為18個(gè)核堿基、具有4個(gè) 非互補(bǔ)的核堿基(其側(cè)翼為兩個(gè)與靶核酸完全互補(bǔ)的區(qū)域)的寡聚化合物與靶核酸的整 體互補(bǔ)性為77. 8%，落入本范圍內(nèi)。寡聚化合物與靶核酸區(qū)域的互補(bǔ)性百分?jǐn)?shù)可通過使用 BLAST程序(局部序列比對基本檢索工具)和本領(lǐng)域已知的PowerBLAST程序(Altschul 等，J. MoI. Biol.，1990，215，403-410 ；Zhang 和 Madden, Genome Res.，1997，7，649-656)常 規(guī)確定。本發(fā)明進(jìn)一步包括了寡聚化合物諸如反義寡聚化合物、反義寡核苷酸、核酶、外部 引導(dǎo)序列(EGS)寡核苷酸、交替剪接物、引物、探針以及其它可與靶核酸的至少一部分雜交 的寡聚化合物。由此，這些寡聚化合物可以以單鏈、雙鏈、環(huán)狀或發(fā)夾寡聚化合物形式被引 入，并可含有諸如內(nèi)部或末端凸出或環(huán)等結(jié)構(gòu)元件。一旦被引入系統(tǒng)，本發(fā)明的寡聚化合物可引發(fā)一種或多種酶或結(jié)構(gòu)蛋白的作用從而實(shí)現(xiàn)對靶核酸的修飾。這些酶的一個(gè)非限制性例子是RNA酶H，一種切割RNA: DNA雙鏈體的RNA鏈的細(xì)胞內(nèi)切核酸酶。本領(lǐng)域已知，“DNA-樣”的單鏈寡聚化合物引發(fā)RNA酶H。因此，RNA酶H的活 化導(dǎo)致RNA靶的切割，從而大大增強(qiáng)寡核苷酸介導(dǎo)對基因表達(dá)的抑制的效率。已經(jīng)假定其 它核糖核酸酶如RNA酶III和核糖核酸酶L家族的酶具有類似作用。盡管一種形式的寡聚化合物是單鏈反義寡核苷酸，但在許多物種中，引入雙鍵結(jié) 構(gòu)如雙鏈RNA(dsRNA)分子顯示能誘導(dǎo)強(qiáng)且特異的對基因或其相關(guān)基因產(chǎn)物功能的反義介 導(dǎo)的降低。這種現(xiàn)象在植物和動(dòng)物中均有發(fā)生，并被認(rèn)為與病毒防御和轉(zhuǎn)座子沉默進(jìn)化相 關(guān)。在一些實(shí)施方案中，“合適的靶區(qū)段”可用于篩選調(diào)節(jié)所選蛋白質(zhì)表達(dá)的其它寡聚 化合物?！罢{(diào)節(jié)劑”是那些降低或升高編碼蛋白質(zhì)的核酸分子的表達(dá)的寡聚化合物，其包含 至少一個(gè)與合適的靶區(qū)段互補(bǔ)的8-核堿基部分。所述篩選方法包括以下步驟使編碼蛋 白質(zhì)的核酸分子的合適靶區(qū)段接觸一種或多種候選調(diào)節(jié)劑，并選擇降低或升高編碼蛋白質(zhì) 的核酸分子表達(dá)的一種或多種候選調(diào)節(jié)劑。一旦顯示候選調(diào)節(jié)劑能夠調(diào)節(jié)(例如，降低或 升高)編碼肽的核酸分子的表達(dá)，然后可將該調(diào)節(jié)劑用于本發(fā)明以進(jìn)一步研究所述肽的功 能，或者用作研究、診斷或治療試劑。合適的靶區(qū)段也可與本發(fā)明提供的它們各自的互補(bǔ)反義寡聚化合物組合形成穩(wěn) 定的雙鏈(雙鏈體的)寡核苷酸。本領(lǐng)域已知這種雙鏈寡核苷酸部分能夠通過反義機(jī)制調(diào) 控靶表達(dá)、調(diào)節(jié)翻譯以及RNA加工。此外，可對雙鏈部分進(jìn)行化學(xué)修飾(Fire等，Nature, 1998，391，806-811 ；Timmons 禾口 Fire，Naturel998,395,854 ；Timmons 等，Gene，2001，263， 103-112 ；Tabara 等，Science, 1998, 282,430-431 ；Montgomery 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998,95,15502-15507 ；Tuschl 等，Genes Dev. ,1999,13,3191-3197 ；Elbashir 等， Nature，2001，411，494-498 ；Elbashir等，Genes Dev. 2001，15，188-200)。例如，這些雙鏈部 分已顯示能通過雙鏈體反義鏈與靶的經(jīng)典雜交從而引發(fā)靶的酶降解來抑制靶(Tijsterman 等，Science, 2002，295，694-697)。本發(fā)明提供的寡聚化合物也可用于藥物開發(fā)和靶驗(yàn)證領(lǐng)域。在某些實(shí)施方案中， 本發(fā)明提供了本發(fā)明鑒定的寡聚化合物和靶在藥物開發(fā)中的應(yīng)用，以闡明蛋白質(zhì)和疾病狀 態(tài)、表型或病癥之間的關(guān)系。這些方法包括檢測或調(diào)節(jié)靶肽，包括使樣品、組織、細(xì)胞或器官 與本發(fā)明提供的一種或多種寡聚化合物接觸，在處理后的一段時(shí)間測量靶的核酸或蛋白質(zhì) 水平和/或相關(guān)表型或化學(xué)終點(diǎn)，以及任選地將測量值與未處理樣品或用本發(fā)明的其它寡 聚化合物處理的樣品進(jìn)行比較。這些方法也可平行進(jìn)行或與其它試驗(yàn)組合進(jìn)行，以確定未 知基因的功能(對靶驗(yàn)證過程而言)，或確定特定基因產(chǎn)物作為靶對于治療或預(yù)防特定疾 病、癥狀或表型的有效性。在某些實(shí)施方案中，提供了本發(fā)明所述寡聚化合物在治療中的應(yīng) 用。在某些實(shí)施方案中，所述治療是減少靶信使RNA。本發(fā)明使用的術(shù)語“劑量”表示單次施用中提供的藥劑的具體量。在某些實(shí)施方 案中，劑量可通過兩次或多次推注、片劑或注射進(jìn)行施用。例如，在某些實(shí)施方案中，需要皮 下施用時(shí)，所需劑量要求的體積不是通過一次注射就能方便提供的。在該實(shí)施方案中，可采 用兩次或多次注射來實(shí)現(xiàn)所需劑量。在某些實(shí)施方案中，劑量可通過兩次或多次注射施用 以使個(gè)體注射部位的反應(yīng)最小化。
在某些實(shí)施方案中，相比未修飾的DNA，化學(xué)修飾的本發(fā)明的寡聚化合物對靶RNA 的親和力更高。在某些此類實(shí)施方案中，高親和力又提供了增強(qiáng)的功效，從而使施用較低劑 量的此類化合物、降低毒性潛能、改善治療指數(shù)以及降低治療整體花費(fèi)成為可能。核苷修飾對RNAi活性的作用按照現(xiàn)有文獻(xiàn)進(jìn)行評價(jià)(Elbashir等， Nature (2001) ,411,494-498 ；Nishikura 等，Cell (2001)，107，415-416 ；和 Bass 等， Cell(2000)，101,235-238)。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的寡聚化合物可用于診斷、治療、預(yù)防以及作為研 究試劑和試劑盒。此外，能夠以極高特異性抑制基因表達(dá)的反義寡核苷酸通常被本領(lǐng)域普 通技術(shù)人員用來闡述特定基因的功能或用來區(qū)分生物途徑各成員的功能。在某些實(shí)施方案 中，本發(fā)明提供的寡聚化合物能夠單獨(dú)使用或與其它寡聚化合物或治療劑組合使用，能夠 用作差分和/或組合分析的工具以闡明細(xì)胞和組織內(nèi)表達(dá)的基因的一部分或全部補(bǔ)體的 表達(dá)模式。在有利于基因擴(kuò)增或檢測的條件下，寡聚化合物也可分別用作引物和探針。這 些引物和探針可用于需要特異性檢測編碼蛋白質(zhì)的核酸分子的方法以及用于核酸分子的 擴(kuò)增以用于檢測或進(jìn)行深入研究。本發(fā)明的反義寡核苷酸(尤其是引物和探針)與核酸的 雜交可通過本領(lǐng)域已知方法檢測。這些方法可包括將酶與寡核苷酸結(jié)合、放射性標(biāo)記寡核 苷酸或任何其它合適的檢測方法。也可制備采用所述檢測手段用于檢測樣品中所選蛋白質(zhì) 水平的試劑盒。
一個(gè)非限制性的例子是，將用一種或多種寡聚化合物處理的細(xì)胞或組織內(nèi)的表達(dá) 模式與未用寡聚化合物處理的細(xì)胞或組織進(jìn)行比較，并對產(chǎn)生的模式進(jìn)行基因表達(dá)差異水 平的分析，因?yàn)樗鼈兩婕?，例如，檢測基因的疾病關(guān)聯(lián)性、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、細(xì)胞定位、表達(dá)水 平、大小、結(jié)構(gòu)或功能。這些分析可在刺激或未刺激的細(xì)胞上并在存在或不存在影響表達(dá)模 式的其它化合物和/或寡聚化合物時(shí)進(jìn)行。本領(lǐng)域已知的分析基因表達(dá)的方法的例子包括DNA陣列或微陣列(Brazma和 Vilo, FEBS Lett.，2000，480，17-24 ；Celis 等，F(xiàn)EBS Lett.，2000，480，2-16)、SAGE (基因表 達(dá)系列分析)(Madden 等，Drug Discov. Today，2000，5，415-425)、READS (消化 cDNA 的限制 性酶擴(kuò)增)(Prashar 和 Weissman，Methods Enzymo 1.，1999，303，258-72)、T0GA(總基因表 達(dá)分析)(Sutcliffe 等，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α.，2000，97，1976-81)、蛋白質(zhì)陣列和 蛋白質(zhì)組學(xué)(Celis 等，F(xiàn)EBS Lett.，2000，480，2-16 Jungblut 等，Electrophoresis，1999， 20，2100-10)、表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)測序(Celis 等，F(xiàn)EBS Lett.，2000，480，2-16 ；Larsson 等，J. Biotechnol. ,2000,80,143-57)、消減 RNA 指紋(SuRF) (Fuchs 等，Anal. Biochem.， 2000，286，91-98 ； Larson 等，Cytometry，2000，41，203-208)、差減克隆、差示技術(shù)(DD) (Jurecic 和 Belmont，Curr. Opin. Microbiol.，2000，3，316-21)、比較基因組雜交(Carulli 等，J.Cell Biochem. Suppl.，1998，31，286-96)、FISH(熒光原位雜交)技術(shù)(Going 和 Gusterson, Eur. J. Cancer, 1999，35，1895-904)和質(zhì)譜法(To, Comb. Chem. High Throughput Screen, 2000, 3, 235-41)。盡管在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的寡聚化合物按照描述使用，以下實(shí)施例僅 用于例證而非限制。實(shí)施例(一般)分別在300MHz和75MHz Bruker光譜儀上記錄1H和13C匪R光譜。實(shí)施例1
合成核苷亞磷酰胺核苷亞磷酰胺的制備按照本發(fā)明以及本領(lǐng)域中所示的方法進(jìn)行，例如但不限于美國專利6，426，220和公開的PCT申請WO 02/36743。實(shí)施例2寡核苷合成本發(fā)明使用的寡聚化合物通常可通過已知的固相合成技術(shù)方便且常規(guī)地進(jìn)行制 備。用于這些合成的設(shè)備由若干供應(yīng)商出售，包括例如AppliedBiosystems (Foster City, CA)。本領(lǐng)域已知的用于這些合成的任何其它手段可另外或可選擇的使用。用類似技術(shù)來 制備寡核苷酸如烷基化衍生物以及具有硫代磷酸酯鍵的寡核苷酸是已知的。寡核苷酸可采用標(biāo)準(zhǔn)亞磷酰胺化學(xué)法使用碘氧化在自動(dòng)DNA分析儀(Applied Biosystems，型號394)上合成未取代的和取代的磷酸二酯(P = 0)寡核苷酸。硫代磷酸酯(P = S)采用類似于磷酸二酯寡核苷酸的方法合成，除了以下差別 在某些實(shí)施方案中，進(jìn)行硫雜化時(shí)用10% w/v的3，H-I，2-苯并二硫雜環(huán)戊二烯-3-酮1， 1-二氧化物的乙腈溶液來氧化亞磷酸鍵。硫雜化反應(yīng)步驟時(shí)間提高到180秒，在常規(guī)加帽 步驟之后進(jìn)行。從CPG柱上切下并在55°C的濃氫氧化銨中去封閉(12-16小時(shí))之后，用3 倍以上體積的乙醇從IM NH4OAc溶液中沉淀來回收寡核苷酸。亞膦酸寡核苷酸可按照美國 專利5，508，270的描述制備。烷基膦酸酯寡核苷酸可按照美國專利4，469，863的描述制備。3-脫氧-3-亞甲基膦酸酯寡核苷酸可按照美國專利5，610，289或5，625，050的描 述制備。亞磷酰胺寡核苷酸可按照美國專利5，256，775或美國專利5，366，878的描述制備。烷基硫代膦酸酯寡核苷酸可按照公開的PCT申請PCT/US94/00902和PCT/ US93/06976(分別作為WO 94/17093和WO 94/02499公開)的描述制備。3-脫氧-3-氨基氨基磷酸酯寡核苷酸可按照美國專利5，476，925的描述制備。磷酸三酯寡核苷酸可按照美國專利5，023，243的描述制備。硼代磷酸酯寡核苷酸可按照美國專利5，130，302和5，177，198的描述制備。寡核苷亞甲基甲基亞氨基連接的寡核苷(也稱為MMI連接的寡核苷)、亞甲基二 甲基次聯(lián)氨基連接的寡核苷(也稱為MDH連接的寡核苷)、以及亞甲基羰基氨基連接的寡核 苷(也稱為酰胺-3連接的寡核苷)、和亞甲基氨基羰基連接的寡核苷(也稱為酰胺_4連接 的寡核苷)、以及具有例如交替的MMI和P = 0或P = S鍵的混合骨架寡聚化合物可按照美 國專利 5，378，825,5, 386，023,5, 489，677,5, 602，240 和 5，610，289 的描述制備。甲酰酰基和硫代甲酰?；B接的寡核苷可按照美國專利5，264，562和5，264，564 的描述制備。環(huán)氧乙烷連接的寡核苷可按照美國專利5，223，618的描述制備。實(shí)施例3分離寡核苷酸從可控孔玻璃固體支持物或其它支持介質(zhì)上切下并在55°C的濃氫氧化銨中去封 閉12-16小時(shí)之后，用3倍以上體積的乙醇從IM NH4OAc溶液中沉淀來回收寡核苷酸或寡核苷。合成的寡核苷酸通過電噴霧質(zhì)譜法(測定分子量)和毛細(xì)管凝膠電泳分析。通過正 確分子量與-16amu產(chǎn)物(+/_32+/_48)的比值來確定合成中獲得的硫代磷酸酯鍵和磷酸二 酯鍵的相對量。在一些研究中，寡核苷酸通過HPLC純化，如Chiang等，J. Biol. Chem. 1991， 266，18162-18171所述。HPLC-純化材料所得結(jié)果通常類似于非-HPLC純化材料的結(jié)果。實(shí)施例4寡核苷酸合成-96孔板模式可在能夠以96孔模式同時(shí)裝配96條序列的自動(dòng)合成儀上通過固相P(III)亞磷 酰胺化學(xué)法合成寡核苷酸。可用碘的水溶液氧化得到磷酸二酯核苷酸間鍵。在無水乙腈中 用3，H-I，2苯并二硫雜環(huán)戊二烯-3-酮1，1 二氧化物(Beaucage試劑)進(jìn)行硫化生成硫代 磷酸酯核苷酸間鍵。標(biāo)準(zhǔn)堿基-保護(hù)的β-氰基乙基-二異丙基亞磷酰胺購自商業(yè)供應(yīng)商 (如 PE-Applied Biosystems, Foster City，CA，或 Pharmacia，Piscataway，NJ)。非標(biāo)準(zhǔn)核 苷按照標(biāo)準(zhǔn)方法或?qū)＠椒ê铣?。它們被用作堿基-保護(hù)的β-氰基乙基二異丙基亞 磷酰 胺。將寡核苷酸從支持物上切下并在較高溫度(55-60°C )用濃NH4OH進(jìn)行12_16小 時(shí)的去保護(hù)，然后真空干燥釋放的產(chǎn)物。然后將干燥的產(chǎn)物重懸于無菌水以得到主平板 (master plate)，然后用自動(dòng)移液器從該主平板稀釋所有的分析和測試平板樣品。實(shí)施例5用96孔板模式進(jìn)行寡核苷酸分析各孔內(nèi)寡核苷酸的濃度通過樣品稀釋和UV吸收光譜評價(jià)。各產(chǎn)物的全長完整性 通過毛細(xì)管電泳(CE)評價(jià)，電泳采取96孔模式(Beckman P/ACE MDQ)，或者，對于單獨(dú)制 備的樣品，在市售CE設(shè)備(如，Beckman P/ACE 5000, ABI 270)上進(jìn)行。堿基和骨架組成 通過用電噴霧_質(zhì)譜法對寡聚化合物進(jìn)行質(zhì)量分析來證實(shí)。所有測試平板采用單通道和多 通道自動(dòng)移液器從主平板稀釋得到。如果平板上至少85%的寡聚化合物達(dá)到全長的至少 85%，則認(rèn)為該平板是可接受的。實(shí)施例6細(xì)胞培養(yǎng)和寡核苷酸處理可以在任何細(xì)胞類型中測試寡聚化合物對靶核酸表達(dá)的影響，只要該靶核酸以可 測水平存在。這通?？刹捎茫?，PCR或Northern印跡分析來檢測。從多種組織和物種 獲得的細(xì)胞系可從美國典型培養(yǎng)物保藏所(ATCC，馬納薩斯，VA)獲得。出于示例目的，提供以下細(xì)胞類型，但也可常規(guī)使用其它細(xì)胞類型，前提是靶可在 所選細(xì)胞類型中表達(dá)。這可通過本領(lǐng)域常規(guī)方法如Northern印跡分析、核糖核酸酶保護(hù)試 驗(yàn)或RT-PCR方便地確定。b. END細(xì)胞鼠腦內(nèi)皮細(xì)胞系 b. END從Max Plank Institute (Bad Nauheim，德國) 的Dr. Werner Risau處獲得。b. END細(xì)胞通常在添加有10%胎牛血清(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)白勺 ι 葡萄 If (Invitrogen LifeTechnologies, Carlsbad, CA)DMEM中培養(yǎng)。通過胰蛋白酶消化并當(dāng)細(xì)胞達(dá)到約90%匯合時(shí)稀釋來對細(xì)胞進(jìn)行常規(guī) 傳代。以約3000細(xì)胞/孔的密度將細(xì)胞接種于96孔板(Falcon-Primaria#353872，BD Biosciences, Bedford, ΜΑ)以便使用，其中包括但不限于進(jìn)行寡聚化合物轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。涉及用寡聚化合物處理細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)
當(dāng)細(xì)胞達(dá)到適當(dāng)匯合時(shí)，用本發(fā)明所述轉(zhuǎn)染方法采用寡聚化合物來處理細(xì)胞。LIP0FECTIN 當(dāng)細(xì)胞達(dá)到65-75 %匯合時(shí)，用寡核苷酸處理細(xì)胞。在0pti-MEM -l減少 血清的培養(yǎng)基(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)中將寡核苷酸與 LIPOFECTIN (Invitrogen Life Technologies,Carlsbad,CA)混合以達(dá)到所需的寡核苷酸 濃度，并使LIPOFECTIN 濃度達(dá)到2. 5或3 μ g/mL每IOOnM寡核苷酸。將這種轉(zhuǎn)染混合物 在室溫培育約0. 5小時(shí)。對于在96孔板中生長的細(xì)胞，各孔用100 μ L OPTI-MEMtm-I洗滌 一次，然后用130 μ L轉(zhuǎn)染混合物處理。生長在24孔板或其它標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)平板內(nèi)的細(xì)胞用適 當(dāng)體積的培養(yǎng)基和寡核苷酸類似處理。以雙份或三份形式處理細(xì)胞并獲得數(shù)據(jù)。在37°C處 理約4-7小時(shí)后，用新鮮培養(yǎng)基代替含轉(zhuǎn)染混合物的培養(yǎng)基。用寡核苷酸處理16-24小時(shí) 后收獲細(xì)胞。本領(lǐng)域已知的其它合適轉(zhuǎn)染試劑包括但不限于CYT0FECTINtm、LIPOFECTAMINE 、 0LIG0FECTAMINE 和FUGENE 。本領(lǐng)域已知的其它合適轉(zhuǎn)染方法包括但不限于電穿孔。實(shí)施例7靶mRNA水平的實(shí)時(shí)定量PCR分析使用ABI PRISM 7600,7700 或 7900 序列檢測系統(tǒng)(PE-AppliedBiosystems， Foster City, CA)按照制造商的說明通過實(shí)時(shí)定量PCR完成靶mRNA水平的量化。這是 一種閉管的、非基于凝膠的熒光檢測系統(tǒng)，其能夠?qū)酆厦告準(zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的產(chǎn)物進(jìn)行 實(shí)時(shí)高通量量化。與擴(kuò)增產(chǎn)物在PCR完成之后量化的標(biāo)準(zhǔn)PCR不同，實(shí)時(shí)定量PCR的 產(chǎn)物在它們累積時(shí)量化。這是通過在PCR反應(yīng)中加入在正向和反向PCR引物之間特異 性退火并包含兩種熒光染料的寡核苷酸探針來實(shí)現(xiàn)的。報(bào)告染料(如FAM或J0E，獲自 PE-AppliedBiosystems, Foster City, CA ；Operon Technologies Inc., Alameda, CA ； 或 Integrated DNA Technologies Inc.，Coralville，ΙΑ)附于探針的 5 端，而淬滅染料 (如 TAMRA,獲自 PE-Applied Biosystems, Foster City, CA ；OperonTechnologies Inc., Alameda, CA ；或 Integrated DNA Technologies Inc.，Coralville, IA)附于探針的 3 端。 當(dāng)探針和染料完整時(shí)，報(bào)告染料的發(fā)射由于靠近3淬滅染料而被猝滅。在擴(kuò)增期間，探針和 靶序列退火產(chǎn)生能被Taq聚合酶的5-外切核酸酶活性切割的底物。在PCR擴(kuò)增循環(huán)的延 伸階段，Taq聚合酶將探針切除導(dǎo)致報(bào)告染料從剩余探針上釋放(即從淬滅劑部分釋放)并 生成序列特異性熒光信號。每輪循環(huán)中，額外的報(bào)告染料分子從它們各自的探針上切除，熒 光強(qiáng)度通過ABI PRISM 序列檢測系統(tǒng)中的激光光學(xué)模塊以固定時(shí)間間隔監(jiān)測。在每次試 驗(yàn)中，包括來自未處理對照樣品的連續(xù)稀釋的mRNA的一系列平行反應(yīng)產(chǎn)生了標(biāo)準(zhǔn)曲線，該 曲線被用來量化用反義寡核苷酸處理檢測樣品后的抑制百分?jǐn)?shù)。在定量PCR分析之前，用GAPDH擴(kuò)增反應(yīng)評價(jià)了特異于被測量的靶基因的引物_探針組的“多重化”能力。在多重化中，靶基因和內(nèi)標(biāo)基因GAPDH在單個(gè)樣品內(nèi)同時(shí)擴(kuò) 增。在該分析中，從未處理細(xì)胞分離的mRNA被連續(xù)稀釋。各稀釋物在僅特異于GAPDH、僅特 異于靶基因(“單重化”)或同時(shí)特異于這兩者(“多重化”)的引物-探針組存在時(shí)被擴(kuò) 增。PCR擴(kuò)增之后，從單重化和多重化樣品中生成了作為稀釋度函數(shù)的GAPDH和靶mRNA信 號的標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果由多重化樣品生成的GAPDH和靶信號曲線的斜率以及相關(guān)系數(shù)同時(shí)落 入由單重化樣品生成的它們相應(yīng)值的10%之內(nèi)，則認(rèn)為特異于該靶的引物-探針組是可多重化的。其它PCR方法也是本領(lǐng)域已知的。RT 和 PCR 試劑獲自 Invitrogen Life Technologies (Carlsbad，CA)。進(jìn)行 RT，實(shí) 時(shí)PCR時(shí)，在含有30 μ L總RNA溶液(20_200ng)的96孔板中加入20 μ L PCR雞尾酒(2. 5 X 的扣除 MgCl2 的 PCR 緩沖液，6. 6mM MgCl2, dATP、dCTP、dCTP 和 dGTP 各 375 μ Μ，正向引物禾口 反向引物各375ηΜ，125ηΜ探針，4單位RNA酶抑制劑，1. 25單位PLATINUM Taq，5單位 MuLV反轉(zhuǎn)錄酶，以及2. 5XROX染料)。在48°C培育30分鐘來進(jìn)行RT反應(yīng)。在95°C培育 10分鐘以激活PLATINUM Taq后，進(jìn)行40輪兩步PCR方案95°C 15秒(變性)，然后 60 0C 1.5分鐘(退火/延伸)。
通過RT，實(shí)時(shí)PCR獲得的基因靶的量用GAPDH( 一種穩(wěn)定表達(dá)的基因)的表達(dá)水平 或通過用 RIBOGREEN (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR)量化總 RNA 來標(biāo)準(zhǔn)化。GAPDH 表達(dá)通過實(shí)時(shí)RT-PCR來量化，與靶多重化同時(shí)進(jìn)行或單獨(dú)進(jìn)行?？俁NA用RiboGreen RNA 量化試劑(Molecular Probes, Inc. Eugene, OR)來量化。通過 RIBOGREEN 量化 RNA 的方 法遵從 Jones，L. J.等，(Analytical Biochemistry, 1998, 265, 368-374)的教導(dǎo)。在本分析中，吸取170 μ L RIBOGREEN 工作試劑(以1 350稀釋于IOmM Tris-HCl，ImM EDTA, pH 7. 5 中的 RIBOGREEN 試劑)加入含 30 μ L 純化的細(xì)胞 RNA 的 96 孔板。平板在CytoFluor 4000 (PE Applied Biosystems)上讀取，激發(fā)波長為485nm，發(fā)射 波長為530nm。實(shí)施例8制備化合物8，方案1<formula>formula see original document page 71</formula>
a)制備化合物2將化合物1(13. lg，55. 9mmol，l，5 :2，3_ 二脫水 _4，6_0_ 苯亞甲基-D-蒜糖醇， 購自Carbosynth，英國)溶于無水N，N-二甲基甲酰胺(2IOmL)。在該溶液中加入尿嘧啶 (7. 52g,67. lmmol)和 1，8-二氮雜二環(huán)[5.4.0] ^^一碳 _7_ 烯(10. OmL, 67. Immol) 將該 混合物加熱至85°C維持7小時(shí)。然后將混合物冷卻至室溫，倒入乙酸乙酯(IL)，并用半飽 和的NaHCO3水溶液(4X1L)洗滌。水性部分用無水硫酸鈉干燥，過濾，并蒸發(fā)成灰白色泡 沫，該物質(zhì)通過硅膠層析(2%甲醇的CH2Cl2溶液)純化得到12. 5克(64. 5%產(chǎn)率)白色 泡沫狀化合物2。ESI-MS [M+H+]計(jì)算值347Da ；實(shí)測值347Da。1H NMR與結(jié)構(gòu)一致。該過 禾呈可參考Abramov, M. ；Marchand, A. ；Calleja-Marchand, A. ；Herdewi jn, P. Systhesisof D-Altritol Nucleosides with a 3-0-tert-butyldimethylsilyl protecting group(用 3-0-叔丁基二甲基甲硅烷基保護(hù)基合成D-阿卓糖醇核苷)，Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids(2004)23，439。b)制備化合物3將化合物2 (12. Ig, 35. Ommol)溶于無水CH2Cl2 (50mL)和無水吡啶(50mL)的 混合物。將該混合物冷卻至0°c，然后用甲磺酰氯(6.77mL，87.4mmol)處理。在0°C維 持15分鐘后將混合物升至室溫并再攪拌5小時(shí)。真空下濃縮得到金色軟泥，將其重懸于 CH2Cl2 (500mL)，用半飽和的NaHCO3水溶液洗滌，用無水硫酸鈉干燥，過濾，并蒸發(fā)成金色油 狀物。隨后通過硅膠層析純化(2%甲醇的CH2Cl2溶液)得到11. 7克(78. 6%產(chǎn)率)淡黃 色泡沫狀的化合物3。ESI-MS[Μ+ ]計(jì)算值425Da ；實(shí)測值425Da。1H NMR與結(jié)構(gòu)相符。
c)制備化合物4將化合物3(11. 2g，26. 5mmol)懸浮于1，4_ 二噁烷(IOOmL)。在該懸浮液中加入IOOmL 2M NaOH水溶液。將所得混合物升至60°C并攪拌3. 5小時(shí)。將混合物冷卻至室溫， 然后用乙酸(11.4mL)中和。將混合物真空濃縮成約IOOmL,然后倒入CH2Cl2(500mL)。所 得混合物用飽和的NaHCO3水溶液(500mL)洗滌，用無水硫酸鈉干燥，過濾，并蒸發(fā)得到8. 23 克(89. 7%產(chǎn)率)灰白色固體狀化合物4。ESI-MS[M+H+]計(jì)算值347Da ；實(shí)測值347Da。1H NMR與結(jié)構(gòu)相符。d)制備化合物5將化合物4(7. 96g，23. Ommol)溶于無水THF(IOOmL)。在該溶液中加入1，8_ 二 氮雜二環(huán)[5.4.0] i^一碳-7-烯(5. lmL，34mmol)，然后邊攪拌邊逐滴加入九氟丁烷磺酰 氯(11.6mL，34mmol)。將該混合物在30°C培育84小時(shí)。將混合物倒入乙酸乙酯(400mL)， 用半飽和的NaHCO3水溶液洗滌(2X500mL)，用無水硫酸鈉干燥，過濾，并蒸發(fā)成灰白色泡 沫。硅膠層析(1 1己烷乙酸乙酯)得到7. 92克化合物5，其為不純的混合物。該混合 物無需進(jìn)一步純化即用于隨后的反應(yīng)。一小部分通過硅膠層析更小心地純化供分析表征。 ESI-MS [M+H+]計(jì)算值 349Da ；實(shí)測值 349Da (主要雜質(zhì)[M+H+] = 329，與 HF 消除一致)。1H 和19F NMR都與化合物5的結(jié)構(gòu)一致。e)制備化合物6將不純的化合物5 (6. 87g，19. 7mmol)溶于無水CH2Cl2 (IOOmL)。在該溶液中加入 三氟乙酸(35mL)。室溫?cái)嚢?小時(shí)后將該混合物真空濃縮成淡橙色油狀物。通過硅膠層析 純化(分步梯度從甲醇到10%甲醇的CH2Cl2溶液)得到3. 58克(69%產(chǎn)率)白色泡 沫狀化合物6。ESI-MS [M+H+]計(jì)算值261Da;實(shí)測值261Da。f)制備化合物7將化合物6(3. 37g，12. 9mmol)溶于無水吡啶(40mL)。冷卻至0°C后，用4，4-二甲 氧基三苯甲基氯(6. 59g，19. 5mmol)處理該溶液。在0°C攪拌20分鐘后，將混合物升至室溫 再維持3小時(shí)。將所得混合物真空濃縮成棕色油狀物，將其重懸于CH2Cl2 (400mL)，用半飽 和的NaHCO3水溶液洗滌(2X400mL)，用無水硫酸鈉干燥，過濾，并蒸發(fā)。硅膠層析(2% ν/ν 甲醇的CH2Cl2溶液)得到5. 68克(77. 9%產(chǎn)率)淺褐色泡沫狀化合物7。1H和19F NMR都 與結(jié)構(gòu)一致。g)制備化合物8將化合物7(2. 50g，4. 45mmol)溶于無水N，N- 二甲基甲酰胺(11. 2mL)。在該溶液 中加入 2-氰基乙基-N，N，N，，N，-四異丙基磷酰二胺(2-cyanoethyl-N，N，N，，N，-tetrais opropylphosphorodiamidite) (1. 98mL,6. 23mmol)、四唑(156mg，2. 22mmol)和 N-甲基咪唑 (89 μ L，1. llmmol)。室溫?cái)嚢?小時(shí)后，用三乙胺(2. 48mL, 17. 8mmol)處理混合物，攪拌5 分鐘，然后倒入乙酸乙酯(250mL)。所得溶液用1 1的飽和NaHCO3水溶液飽和NaCl水 溶液(lX200mL)處理，然后用飽和NaCl水溶液(lX200mL)處理。有機(jī)部分用無水硫酸鈉 干燥，過濾，并蒸發(fā)。硅膠層析(1 1己烷乙酸乙酯)得到2. 61克(76. 8%產(chǎn)率)淡黃 色泡沫狀化合物8。1H^19F和31P NMR與化合物8的結(jié)構(gòu)一致，為含磷非對映體的混合物。實(shí)施例9制備化合物13，方案2<formula>formula see original document page 73</formula>
a)制備化合物9將化合物7(2. 50g，4. 44mmol，在之前的實(shí)施例中制備)溶于無水N，N-二甲基甲酰 胺(IOmL)。在該溶液中加入咪唑(1.82g，26. 7mmol)和叔丁基二甲基甲硅烷基氯(1. 34g， 8. 88mmol)。室溫?cái)嚢?2小時(shí)后將混合物倒入乙酸乙酯(250mL)，用半飽和的NaHCO3水溶 液(2X200mL)和飽和的NaCl水溶液(2X200mL)洗滌，用無水硫酸鈉干燥，過濾，并蒸發(fā)。 硅膠層析(1 1己烷乙酸乙酯)得到2. 52克(83. 8%產(chǎn)率)化合物9，其為白色泡沫。 1H和19F NMR與所示結(jié)構(gòu)一致。b)制備化合物10在冰冷的(0°C ) 1,2,4-三唑(3. 40g，49. 2mmol)的無水乙腈(44mL)懸浮液中加 入氯氧化磷(1. 3ImL, 14. Immol)。在0°C攪拌20分鐘后，向混合物中加入三乙胺(9. 8mL， 70mmol)。在所得漿液中加入化合物9 (2. 38g，3. 52mmol)的無水乙腈(20mL)溶液。將混合 物在0°C維持1小時(shí)，然后升至室溫維持2小時(shí)。隨后將混合物濃縮至其原始體積的約一 半，倒入乙酸乙酯(250mL)，用半飽和的NaCl水溶液(2X200mL)洗滌，用無水硫酸鈉干燥， 過濾，并蒸發(fā)成黃色泡沫。將該殘余物重溶于1，4_二噁烷(20mL)并用濃氨水(20mL)處理。將反應(yīng)容器密封并室溫?cái)嚢?2小時(shí)，此時(shí)將混合物減壓濃縮，倒入CH2Cl2 (200mL)，用半飽 和的NaHCO3水溶液洗滌(lX200mL)，用無水硫酸鈉干燥，過濾，并蒸發(fā)。硅膠層析(1.5% ν/ν甲醇的CH2Cl2溶液)得到1. 98克(83. 4% )化合物10，其為黃色泡沫。ESI-MS[Μ_Η+] 計(jì)算值674. 8Da ；實(shí)測值674. 3Da。1H和19F NMR與結(jié)構(gòu)一致。c)制備化合物11將化合物10 (1. 86g，2. 76mmol)溶于無水N，N- 二甲基甲酰胺(IOmL)。在所得溶液 中加入苯甲酸苷(938mg，4. 14mmol)。室溫?cái)嚢?4小時(shí)后，將混合物倒入乙酸乙酯(250mL)， 用飽和的NaHCO3水溶液(lX200mL)和半飽和的NaCl水溶液(2X200mL)洗滌，用無水硫 酸鈉干燥，過濾并蒸發(fā)。硅膠層析(1 1己烷乙酸乙酯)得到2. 12克(98.4%)化合物 11，其為白色泡沫。ESI-MS[M-H+]計(jì)算值778Da ；實(shí)測值778Da。1H和19F NMR與結(jié)構(gòu)一致。d)制備化合物12將化合物11 (1. 98g，2. 54mmol)溶于無水THF (3mL)。在該溶液中加入3. 3mL的IM 四丁基氟化銨的THF溶液。13小時(shí)后將混合物蒸發(fā)，重溶于CH2Cl2，并進(jìn)行硅膠層析。用 1. 5% (ν/ν)甲醇的CH2Cl2溶液洗脫得到1. 58克(93. 9% )化合物12，其為灰白色泡沫。 ESI-MS [M-H+]計(jì)算值 664. 7Da ；實(shí)測值 664. 2Da。1H 和 19F NMR 與結(jié)構(gòu)一致。e)制備化合物13將化合物12(1. 52g，2. 28mmol)溶于無水N，N- 二甲基甲酰胺(5. 8mL)。在該溶 液中加入2-氰基乙基-N，N，N，，N，-四異丙基磷酰二胺(1. OOmL, 3. 19mmol)、四唑(80mg， 1. 14mmol)禾Π N-甲基咪唑(45 μ L，0. 57mmol)。室溫?cái)嚢?小時(shí)后，用三乙胺(1. 27mL， 9. 13mmol)處理混合物，攪拌5分鐘，然后倒入乙酸乙酯(200mL)。所得溶液用1 1的飽 和NaHCO3水溶液飽和NaCl水溶液(1 X 200mL)洗滌，然后用飽和NaCl水溶液(2 X 200mL) 洗滌。有機(jī)部分用無水硫酸鈉干燥，過濾，并蒸發(fā)。硅膠層析(1 1己烷乙酸乙酯)得 到1. 58克(80. 產(chǎn)率)化合物13，其為淡黃色泡沫。1Hj9F和31P NMR與化合物13的結(jié) 構(gòu)一致，其為含磷非對映體的混合物。實(shí)施例10制備化合物20，方案3<image>image see original document page 75</image>
a)制備化合物14將化合物l(30.0g，128mmol)溶于無水乙腈(600mL)。在該溶液中加入胸腺嘧 啶(48. 4g，384mmol)和 1，8-二氮雜二環(huán)[5.4.0] ^^ — 碳 _7_ 烯(57. 4mL，384mmol)。將 該混合物加熱至85°C維持12小時(shí)。冷卻至室溫后，未反應(yīng)的胸腺嘧啶通過過濾除去。將 過濾后的溶液真空濃縮成黃色的油，將其重溶于CH2Cl2(500mL)，用飽和的NaHCO3水溶液 (2X500mL)洗滌，硫酸鈉干燥，過濾，并濃縮成黃色油狀物，硅膠層析(2%甲醇的CH2Cl2溶 液)該干燥的殘余物得到30. 3克(65. 6% )化合物14，其為灰白色泡沫。1H NMR與結(jié)構(gòu)一 致。ESI-MS[M+H+]計(jì)算值 361. 4Da ；實(shí)測值 361. IDa。b)制備化合物15將化合物14(30. Ig,83. 6mmol)溶于無水 CH2Cl2(IOOmL)和無水吡啶(IOOmL)的 混合物。將該混合物冷卻至0°c，然后用甲磺酰氯(8. 4mL，109mmol)處理。將混合物在0°C 維持30分鐘，然后升至室溫并再攪拌24小時(shí)。將混合物真空濃縮成橙色的油，將其重溶于 CH2Cl2 (500mL)，用半飽和的NaHCO3水溶液洗滌(2 X 500mL)，用無水硫酸鈉干燥，過濾，并蒸 發(fā)成淡橙色泡沫。1HNMR與結(jié)構(gòu)一致。ESI-MS[M+H+]計(jì)算值439. 4Da ；實(shí)測值439. IDa0所 得材料無需進(jìn)一步純化即可用于隨后的反應(yīng)。c)制備化合物16將化合物15 (約34g粗制化合物，78mmol)懸浮于1，4_ 二噁烷(125mL)。在該懸浮液中加入125mL 2M NaOH水溶液。將所得混合物升至60°C并攪拌3小時(shí)。將混合物冷卻 至室溫，然后用乙酸(14mL)中和。將混合物真空濃縮到約75mL，然后倒入CH2C12(1.75L)。 混合物用飽和的NaHCO3水溶液(2X1. 5L)洗滌，用無水硫酸鈉干燥，過濾并蒸發(fā)得到黃色 固體，該物質(zhì)無需進(jìn)一步純化即可用于隨后的反應(yīng)。ESI-MS[M+H+]:計(jì)算值361.4Da;實(shí)測 it 361. IDa0 1HNMR 與結(jié)構(gòu)相符。d)制備化合物17將化合物16 (26. 6g粗制化合物，73. 8mmol)溶于無水THF(450mL)。在該溶液中加 入1，8-二氮雜二環(huán)[5.4.0] i^一碳-7-烯(16. 5mL，lllmmol)，然后邊攪拌邊逐滴加入九 氟丁烷磺酰氯(34mL，lllmmol)。將該混合物在30°C溫?zé)?2小時(shí)。將所得混合物濃縮至約 75mL，然后倒入EtOAc (500mL)，用半飽和的NaHCO3水溶液洗滌(2 X 500mL)，用無水硫酸鈉 干燥，過濾并蒸發(fā)成棕色油狀物。硅膠層析(3 2己烷乙酸乙酯)得到18. 1克(67.8%) 化合物17，其為不純的混合物(通過LCMS和1H NMR測得純度約82% )。該混合物無需進(jìn) 一步純化即用于隨后的反應(yīng)。ESI-MS [M+H+]計(jì)算值363Da ；實(shí)測值363Da (主要雜質(zhì)[M+H+] =343，與HF消除一致)。e)制備化合物18將不純的化合物17 (4. 57g，12. 6mmol)溶于甲醇(300mL)。在該溶液中加入 Pd(0H)2/C(9g)。燒瓶用氫氣吹掃，密封，用氫氣維持，并室溫?cái)嚢琛?2小時(shí)后排除氫氣， Pd(0H)2/C通過硅藻土塞過濾除去，塞子再用甲醇徹底洗滌。真空濃縮成白色泡沫。硅膠層 析(5%甲醇的CH2Cl2溶液)，得到10. 7克(95% ) 18，其為白色泡沫。ESI-MS [M+H+]計(jì)算 值275. 2Da ；實(shí)測值275. IDa。1HNMR和19F NMR都與結(jié)構(gòu)一致。f)制備化合物19將化合物18(10. 6g，38. 6mmol)溶于無水吡啶(120mL)，冷卻至0°C并用4，4_ 二甲 氧基三苯甲基氯(26. Ig, 77. 2mmol)處理。所得溶液緩慢升至室溫并攪拌14小時(shí)。反應(yīng)混 合物用甲醇(IOmL)猝滅并真空濃縮成棕色軟泥。將混合物重溶于CH2Cl2 (500mL)，用半飽 和的NaHCO3水溶液洗滌(2X500mL)，用無水硫酸鈉干燥，過濾并蒸發(fā)成有粘性的棕色泡沫。 硅膠層析(1%甲醇的CH2Cl2溶液)得到20. 3克(91% )化合物19，其為黃色泡沫。1HNMR 與結(jié)構(gòu)相符。g)制備化合物20將化合物19(9. OOg, 15. 6mmol)溶于無水N，N- 二甲基甲酰胺(37mL)，加入2-氰基乙基-N，N, N’，N，-四異丙基磷酰二胺(7. 43mL，23. 4mmol)、四唑(656mg，9. 37mmol)和 N-甲基咪唑(311 μ L，3. 9mmol)。室溫?cái)嚢?小時(shí)后用三乙胺(8. 7mL，62. 4mmol)處理混 合物，攪拌5分鐘，然后倒入乙酸乙酯(500mL)。所得溶液用半飽和的NaHCO3水溶液洗滌 (3X500mL)，用無水硫酸鈉干燥，過濾并蒸發(fā)成有粘性的黃色泡沫。硅膠層析(2 3己烷 乙酸乙酯)，然后從己烷/乙酸乙酯沉淀得到10. 5克(87%產(chǎn)率)化合物20，其為淡黃色泡 沫。1H^9F和31P NMR都與結(jié)構(gòu)一致，為非對映體的混合物。實(shí)施例11制備化合物25，方案4<formula>formula see original document page 77</formula>
a)制備化合物21將化合物19(11. 2g，19. 4mmol，在之前的實(shí)施例中制備)溶于無水N，N_ 二甲基甲 酰胺(44mL)。在該溶液中加入咪唑(7.9g，116mmol)和叔丁基二甲基甲硅烷基氯(5. 85g， 38. 8mmol)。室溫?cái)嚢?4小時(shí)后加入甲醇(IOmL)猝滅，倒入乙酸乙酯(500mL)，用半飽和的 NaHCO3水溶液洗滌(3 X 500mL)，用無水硫酸鈉干燥，過濾，并蒸發(fā)成13. 2克(98%)化合物 21，其為淡黃色泡沫。1H NMR與所示結(jié)構(gòu)一致。該材料無需進(jìn)一步純化即可用于隨后的反 應(yīng)。b)制備化合物22在冰冷的(0°C ) 1，2，4-三唑(18. 4g,267mmol)的無水乙腈(350mL)懸浮液中加入 氯氧化磷(7. ImL, 76mmol)。在0°C攪拌30分鐘后中混合物中加入三乙胺(53mL，382mmol)。 在所得漿液中加入化合物21 (13. 2g，19. lmmol)的無水乙腈(IOOmL)溶液。將混合物在0°C 維持1小時(shí)，然后升至室溫維持3. 5小時(shí)。隨后將混合物濃縮到其最初體積的約一半，倒入 乙酸乙酯(500mL)，用半飽和的NaCl水溶液(2X500mL)洗滌，用無水硫酸鈉干燥，過濾，并 蒸發(fā)成黃色泡沫。將該殘余物重溶于1，4_ 二噁烷(175mL)并用濃氨水(175mL)處理。將 反應(yīng)容器密封并室溫?cái)嚢?4小時(shí)，此時(shí)將混合物減壓濃縮，倒入CH2Cl2 (500mL)，用半飽和 的NaHCO3水溶液洗滌(2X 500mL)，用無水硫酸鈉干燥，過濾，并蒸發(fā)成12. 4克(94% )化 合物22，其為黃色泡沫，通過干燥過夜進(jìn)行結(jié)晶。1HNMR與結(jié)構(gòu)一致。該材料無需進(jìn)一步純化即可用于隨后的反應(yīng)。c)制備化合物23將化合物22 (12. 3g，17. 8mmol)溶于無水N，N- 二甲基甲酰胺(60mL)。在所得溶液中加入苯甲酸苷(6. 05g，26. 7mmol)。室溫?cái)嚢?2小時(shí)后將混合物倒入乙酸乙酯(500mL)， 用半飽和的NaHCO3水溶液洗滌(3X500mL)，用無水硫酸鈉干燥，過濾并蒸發(fā)。硅膠層析 (3 1己烷乙酸乙酯)得到13. 4克(95. )化合物23，其為白色泡沫。1H NMR與結(jié) 構(gòu)相符。d)制備化合物24將化合物23 (13. 4g，16. 9mmol)溶于無水THF (14mL)。在該溶液中加入22mL IM四 丁基氟化銨的THF溶液。5小時(shí)后將混合物蒸發(fā)，然后進(jìn)行硅膠層析。用2 1的己烷乙 酸乙酯洗脫得到9. 57克(83. 2% )化合物24，其為白色泡沫。1H NMR與結(jié)構(gòu)相符。e)制備化合物25將化合物24(9. 5g，14. Ommo 1)溶于無水N，N- 二甲基甲酰胺(33mL)。在該溶液 中加入2-氰基乙基-N，N, N，，N，-四異丙基磷酰二胺(6. 7mL，21.0mmOl)、四唑(589mg， 8. 41mmol)禾Π N-甲基咪唑(279 μ L，3. 50mmol)。室溫?cái)嚢?小時(shí)后，用三乙胺(7. 8mL， 56mmol)處理混合物，攪拌5分鐘，然后倒入乙酸乙酯(500mL)。所得溶液用飽和的NaCl水 溶液(3X500mL)洗滌，用無水硫酸鈉干燥，過濾，并蒸發(fā)。硅膠層析(3 1己烷乙酸乙 酯)得到11. 8克(95%產(chǎn)率)化合物25，其為白色泡沫。1H和31P NMR與化合物25的結(jié)構(gòu) 一致，其為含磷非對映體的混合物。實(shí)施例12制備化合物33，方案4<formula>formula see original document page 79</formula>
a)制備化合物27將化合物1(5. 40g，4. 56mmol，l，5 :2，3_ 二脫水 _4，6_0_ 苯亞甲基-D-蒜糖醇， 購自Carbosynth，英國)與2_氨基_6_氯嘌呤化合物26 (5. 89g，34. 69mmol)混合并用 P2O5減壓干燥過夜。將混合物懸浮于無水六甲基磷酰胺(86mL)，加入18-冠-6(2. 86g， 10. 82mmol)和K2CO3 (3. 46g，25. 04mmol)。將反應(yīng)混合物在90°C攪拌3小時(shí)，然后平衡至室 溫。加入碎冰并攪拌1小時(shí)。濾出形成的沉淀并用冷水和二乙醚洗滌。粗制材料通過硅膠 柱層析純化，用5% MeOH的CH2Cl2溶液洗脫得到化合物27 (7. Olg, 75% ) 1H NMR(300MHz, DMS0-d6) 5 3. 61(m, 1H),3. 78 (t, J = 10. IHz, 1H), 3. 92 (m, 1Η) ,4. 18-4. 28 (m，4Η)，5· 63 (1， 1Η)，5· 83(d, J = 4. 2Hz, 1Η)，5· 40(d, J = 6. 3Hz, 1Η)，5· 85(d, J = 3. 8Hz, 1Η)，6· 99(s，2H)， 7.31-7. 42(m,5H),8. 21(s,lH) ；MS(ES)m/z 404. O[M+H]實(shí)施例13制備化合物41，方案5<image>image see original document page 80</image>
化合物1，1，5 :2，3_二脫水-4，6_0-苯亞甲基-D-蒜糖醇，購自Carbosynth，英國。實(shí)施例14制備化合物49<formula>formula see original document page 81</formula>a)制備化合物43將新戊酰氯(5. 5mmol，0. 67mL)加入至市售的1，5_脫水_4，6_0_苯亞甲基-D-山 梨醇(Carbosynth，英國)、化合物 42(5mmol，1. 25g)、三乙胺(5. 5mmol,0. 77mL)和二甲基 氨基吡啶(20mg)在二氯甲烷(25mL)中的溶液中。室溫?cái)嚢?4小時(shí)后，反應(yīng)用二氯甲烷 稀釋并用5% HC1、飽和碳酸氫鈉和鹽水洗滌，然后干燥(Na2SO4)并濃縮。通過柱層析純化 (硅膠，用10-30%乙酸乙酯的己烷溶液洗脫)得到化合物43(1. 06g)和化合物44(0. 64g)， 都為白色固體。化合物 43:屯 NMR (300MHz，氯仿-d) δ = 7. 56-7. 44 (m，2Η)，7. 36 (m，3Η)， 5. 49 (s，1H)，4. 98-4. 81 (m, 1H)，4. 40-4. 22 (m, 1H)，4. 16-3. 99 (m, 1H)，3. 82 (s, 1H)，3. 65 (s, 1H)，3. 46 (s，1H)，3. 41-3. 27 (m, 1H)，3. 27-3. 15 (m, 1H)，3. 04-2. 80 (m, 1H)，1. 29-1. 16 (m, 9H)。化合物 44 =1H NMR (300MHz,氯仿-d) 5 = 7. 49-7. 40 (m, 2H)，7. 39-7. 32 (m, 3H)， 5. 53 (s，1H)，5. 08-4. 91 (m, 1H)，4. 42-4. 29 (m, 1H)，4. 19-4. 04 (m, 1H)，3. 92-3. 76 (m, 1H)，
3.76-3. 55 (m, 2H)，3. 50-3. 30 (m, 2H)，1. 24 (s,9H)。b)制備化合物46將三氟甲磺酸酐(4. 8mmol, 0. 8mL)加入化合物43 (3. 2mmol, 1. 07g)和吡啶 (0. 5mL)的冷(0°C )溶液中。攪拌1小時(shí)后加水猝滅反應(yīng)，有機(jī)層用水和鹽水洗滌，然 后干燥(Na2SO4)并濃縮以提供粗制化合物45，該物質(zhì)無需任何進(jìn)一步純化即可使用。1H NMR(300MHz，氯仿 _d) δ = 7. 53-7. 42 (m，2Η)，7· 42-7. 32 (m，3Η)，5· 59 (s, 1Η)，5· 10(s，2H)，
4.48-4. 33 (m, 1H)，4. 32-4. 15 (m, 1H)，3. 90-3. 69 (m, 2H)，3. 57-3. 42 (m, 1H)，3. 40-3. 22 (m, 1H)，1. 24(s，9H)。將化合物45和氟化銫(lOmmol，1. 5g)的叔丁醇(IOmL)溶液在70°C加熱2小時(shí)。 然后將反應(yīng)物冷卻至室溫，用乙酸乙酯稀釋，有機(jī)層用水和鹽水洗滌，然后干燥(Na2SO4) 并濃縮。通過柱層析純化(硅膠，洗脫采用10-20%乙酸乙酯的己烷溶液)得到化合物 46(0. 94g，從 43 制備的產(chǎn)率為 90% )。1HnmrGOOMHz,氯仿 _d) δ = 7. 49 (m，2Η)，7. 37 (m， 3H)，5. 56 (s，1H)，5. 29-5. 02 (m, 1H)，5. 02-4. 81 (m, 1H)，4. 49-4. 32 (m, 1H)，4. 22-4. 04 (m,1H)，3. 99-3. 54 (m, 7H)，1. 23 (s,9H)。c)制備化合物49將碳酸鉀(3.2mmol,0. 44g)加入化合物 46(1. 18mmol,0. 4g)的甲醇(IOmL)溶液 中。室溫?cái)嚢?小時(shí)后減壓蒸發(fā)溶劑并將殘余物在乙酸乙酯和水之間分配。將有機(jī)層干燥 (Na2SO4)并濃縮以提供化合物47，該物質(zhì)無需任何進(jìn)一步純化即可使用。1H NMR (300MHz，氯 仿-d) δ = 7. 58-7. 30 (m, 5H)，5. 54 (s, 1H)，5. 23-4. 94 (m, 1H)，4. 39 (dd, J = 4. 7,10. OHz, 1H)，4. 02-3. 43 (m, 6H)，2. 25-2. 08 (m, 1H)。將三氟甲磺酸酐(0. 45mmol, 0. 08mL)加入化合物47 (0. 3mmol, 0. 08g)和口比 啶(0.05mL)的冷(0°C)溶液中。攪拌1小時(shí)后通過加水猝滅反應(yīng)，有機(jī)層用水和鹽 水洗滌，然后干燥(Na2SO4)并濃縮以提供粗物質(zhì)49，該物質(zhì)無需任何進(jìn)一步純化即可 使用。1H NMR(300MHz,氯仿 _d) δ = 7. 58—7. 32 (m，5Η)，5. 55 (s，1Η)，5. 28 (1Η，d, J = 55Hz)，5. 02-4. 85 (m, 1H)，4. 42 (dd, J = 4. 9，10. 4Hz, 1H)，4. 09 (dd, J = 5. 7，10. 8Hz, 1H)，
4.01-3. 80 (m, 2H)，3. 78-3. 50 (m, 2H) ；MS (e/z)，387 (m+1)。實(shí)施例15制備化合物49 (備選途徑)
<formula>formula see original document page 82</formula>a)制備化合物48將三氟甲磺酸酐(12. Ommo 1,2. OmL)加入化合物42 (4. Ommol，1. Og)和吡啶 (16mmol.，1. 3mL)的冷(0°C ) 二氯甲烷溶液(40mL)。攪拌1小時(shí)后通過加水猝滅反應(yīng)， 有機(jī)層用水和鹽水洗滌，然后干燥并濃縮以提供粗制化合物48 (2. 24g，定量)，該物質(zhì)無 需任何進(jìn)一步純化即可使用。1H NMR(CDCl3) δ 7. 52-7. 45(m，2H)，7. 41-7. 35(m，3H)，
5.58 (s，1H)，5. 08 (1H, t, J = 9Hz)，5. 06-4. 91 (m, 1H)，4. 50-4. 25(m，2H)，3. 83-3. 69 (m, 2H)，3. 65-3. 43 (m, 2H)。MS (e/z)，517 (m+1)。b)制備化合物49和50將化合物48(2. 05mmol, 1. Ig)和 CsF (6. 2mmol.，0. 94g)與無水叔丁醇(15mL)混 合并將混合物在90°C攪拌25分鐘。將反應(yīng)物冷卻至室溫并用乙酸乙酯萃取。將乙酸乙酯溶 液濃縮至干，將殘余物通過硅膠層析純化，采用5%乙酸乙酯的己烷溶液洗脫。獲得澄清油 狀的化合物 49(0. 47g，59% 產(chǎn)率)。1HNMR (300MHz，氯仿-d) 5 = 7. 58-7. 32 (m，5H)，5. 55 (s, 1H)，5. 28 (1H, d, J = 55Hz)，5. 02-4. 85 (m, 1H)，4. 42 (dd, J = 4. 9，10. 4Hz, 1H)，4. 09 (dd, J =5. 7，10. 8Hz, 1H)，4· 01-3. 80 (m，2Η)，3. 78-3. 50 (m, 2H) ；MS (e/z)，387 (m+1)。獲得白色固體狀化合物 50(0. 14g, 18%產(chǎn)率)/H NMR(CDC13) δ 7. 50-7. 43 (m，2Η)，7. 40-7. 34 (m, 3H)， 5. 64 (s，1H)，5. 15-4. 90 (m, 2H)，4. 45-4. 15 (m, 3H)，3. 80-3. 52 (m, 2H)，3. 55-3. 40 (m, 1H)。 MS(e/z)，387(m+l)。<formula>formula see original document page 83</formula>
a)制備化合物51將NaH(1. 3mmol,52mg)加入化合物 47(1. Ommol,0. 27g)和 2_(溴甲基)萘 (1. 3mmol,0. 28g)的冷(0°C ) 二甲基甲酰胺(5mL)溶液中。攪拌1小時(shí)后通過加水猝滅 反應(yīng)并用乙酸乙酯萃取混合物。乙酸乙酯溶液用水和鹽水洗滌，然后干燥并濃縮以提供粗 制化合物51，該物質(zhì)通過硅膠柱層析純化，洗脫采用5%乙酸乙酯的己烷溶液。獲得白色 固體狀化合物 51(0. 4g，定量)。1HNMr(CDCI3) δ 8. 0-7. 25 (m，12H)，5. 47 (s，1H)，5. 17 (1H, d, J = 54Hz)，4. 87-4. 76 (m, 2H)，4. 40-4. 30 (m, 1H)，3. 95-3. 78 (m, 2H)，3. 75-3. 56 (m, 2H)， 3. 51-3. 39(m，2H)。MS (e/z)，395，417 (m+1，m+23)。b)制備化合物52將分子篩4A(粉末，4. 45g)放入IOOmL燒瓶并在140°C下真空加熱4小時(shí)。冷卻 至室溫后加入化合物51和二氯甲烷(15mL)。室溫?cái)嚢?小時(shí)后將混合物冷卻至_78°C，在連續(xù)攪拌下依次加入 Et3SiH(4. Ilmmol. 0. 66mL)和 PhBCl3 (3. 63mmol. 0. 48mL)。將混合 物在-78°C再攪拌10分鐘，加入30% H2O2 (12. 6mmol. 1. 6mL)。過濾后用二氯甲烷萃取反 應(yīng)混合物。有機(jī)溶液用水和鹽水洗滌，然后干燥并濃縮以提供粗制化合物52，該物質(zhì)通過 硅膠柱層析純化，洗脫采用丙酮的二氯甲烷溶液。獲得白色固體狀化合物52(0. 31g， 62%) O1H NMR (CDCl3) δ 7. 87-7. 77 (m, 4H)，7. 52-7. 46 (m, 3H)，7. 40-7. 30 (m, 5H)，5. 14 (1H, d, J = 54Hz)，4. 83-4. 52 (m, 4H)，3. 90-3. 83 (m, 2H)，3. 73-3. 66 (m, 3H)，3. 56-3. 34 (m, 2H)， 1. 68 (1H，t，3 = 6Hz)。MS (e/z)，419 (m+23)。c)制備化合物53將化合物52 (0. 025mmol. 0. Olg)溶于二氯甲烷(0. 3mL)，加入 Dess-Martin 試劑 (0. 025mmol. 0. Olg)。將反應(yīng)物室溫?cái)嚢?0分鐘并濃縮以提供化合物53。1HNMR(⑶Cl3) δ 9. 70 (s，1Η)，8. 1-7. 3 (m, 12H)，5. 17 (1H, d, J = 54Hz)，4. 80 (s, 2H)，4. 45-4. 75 (m, 2H)， 4. 25-4. 20 (m, 1H)，4. 0-3. 90 (m, 1H)，3. 85-3. 35 (m, 3H)。d)制備化合物58a
通過在存在氯化鈰時(shí)加入MeMgBr從化合物53制備化合物54a和54b。或者，化合 物54a和54b可通過Mitsunobu反應(yīng)彼此相互轉(zhuǎn)化。54a中的仲羥基被作為酯、優(yōu)選異丁 ?；ミM(jìn)行保護(hù)，并用DDQ除去20-萘基，然后與三氟甲磺酸苷反應(yīng)以提供化合物55a。在 50-100°C的溫度下在DMSO之類的溶劑中與適當(dāng)保護(hù)的核堿基和氫化鈉之類的強(qiáng)堿反應(yīng)， 隨后用催化加氫除去芐基并作為甲硅烷基醚重保護(hù)以得到化合物56a。用甲醇氨溶液或碳 酸鉀的甲醇溶液除去異丁?；?，隨后在25-50°C下用二甲基吡啶和吡啶作為溶劑與DMTCl 反應(yīng)，然后用三氫氟化三乙胺除去甲硅烷基保護(hù)基得到化合物57a。進(jìn)行亞磷酸酯化反應(yīng)得 到亞磷酰胺，化合物58a。實(shí)施例17制備化合物58b<formula>formula see original document page 85</formula>化合物54a和54b是在存在氯化鈰時(shí)加入MeMgBr從醛53制備的。或者，化合物54a 和54b可通過Mitsimobu反應(yīng)彼此相互轉(zhuǎn)化。54b中的仲羥基被作為酯、優(yōu)選異丁?；ミM(jìn) 行保護(hù)，并用DDQ除去20-萘基，然后與三氟甲磺酸苷反應(yīng)以提供化合物55b。在50-100°C 的溫度下在DMSO之類的溶劑中與適當(dāng)保護(hù)的核堿基和氫化鈉之類的強(qiáng)堿反應(yīng)，隨后用催 化加氫除去芐基并作為甲硅烷基醚重保護(hù)以得到化合物56b。用甲醇氨溶液或碳酸鉀的甲 醇溶液除去異丁?；?，隨后在25-50°C下用二甲基吡啶和吡啶作為溶劑與DMTCl反應(yīng)，然后 用三氫氟化三乙胺除去甲硅烷基保護(hù)基得到化合物57b。進(jìn)行亞磷酸酯化反應(yīng)得到亞磷酰 胺 58b。實(shí)施例18制備化合物63<formula>formula see original document page 86</formula>a)制備化合物59將化合物53 (0. 7mmol. 0. 27g)溶于 THF (2mL)，加入水(0. 7mL) ,HCHO (0. 7mL)和 4N NaOH(水溶液，0.7mL)。反應(yīng)物在室溫?cái)嚢?天。反應(yīng)物用乙酸乙酯萃取并用水和鹽水洗 滌，然后干燥并濃縮以提供粗制的59，該物質(zhì)通過硅膠柱層析純化，洗脫采用10%丙酮的 二氯甲烷溶液。獲得白色固體狀化合物59(0. 19g，64% )。1H NMR(CDCl3) :7. 94-7. 80 (m， 4H)，7. 61-7. 45 (m, 3H)，7. 42-7. 21 (m, 5H)，5. 20 (1H, d, J-54Hz)，4. 49-4. 40 (m, 4H)， 4. 20-3. 35 (m, 11H)，2. 10-1. 95 (m, 1H)，1. 90-1. 75 (m, 1H)。b)制備化合物63使化合物59與TBDPSC1反應(yīng)得到單甲硅烷基化產(chǎn)物的混合物，分離產(chǎn)物并通過 Barton還原反應(yīng)將羥基還原以得到化合物60。用DDQ除去20-萘基，然后進(jìn)行三氟甲磺酸 化，并在50-100°C的溫度下在DMSO之類的溶劑中與適當(dāng)保護(hù)的核堿基和氫化鈉之類的強(qiáng) 堿反應(yīng)以得到化合物61。用三氫氟化三乙胺除去甲硅烷基保護(hù)基，然后通過催化氫化除去 芐基得到化合物62。將伯羥基作為DMT醚保護(hù)，然后通過亞磷酸酯化反應(yīng)得到亞磷酰胺，化 合物63。實(shí)施例19制備化合物68LMeMgBrl.Pd/C, H2
<formula>formula see original document page 87</formula>68化合物65 按照 Bihovsky (J. Org. Chem.，1988，53，4026-4031)描述的方法從已知 化合物64制備。用催化氫化除去芐基保護(hù)基，然后將4-0H和6-0H作為苯亞甲基縮醛保 護(hù)。與三氟甲磺酸苷反應(yīng)得到雙三氟甲磺酸酯66。按照實(shí)施例15的描述用CsF選擇性置 換3-三氟甲磺酸酯基，然后在50-100°C下在存在氫化鈉等強(qiáng)堿以及二甲亞砜等極性溶劑 時(shí)與適當(dāng)保護(hù)的核堿基一起加熱，并在50-100°C下用乙酸水溶液除去苯亞甲基保護(hù)基以得 到核苷67。伯醇與DMTCl反應(yīng)，隨后進(jìn)行亞磷酸酯化反應(yīng)得到亞磷酰胺，化合物68。實(shí)施例20制備化合物75<image>image see original document page 88</image>在60_80°C下在存在對甲苯磺酸時(shí)將市售甲基- β -D-吡喃葡糖與二甲基苯亞甲 基縮醛反應(yīng)制備化合物69。用新戊酰氯選擇性保護(hù)化合物69，三氟甲磺酸化，用CsF置換， 并按照實(shí)施例14所述用碳酸鉀的甲醇溶液水解新戊酰酯得到化合物70。除去苯亞甲基保 護(hù)基，然后重保護(hù)羥基作為芐醚，得到化合物71。與乙酸和硫酸水溶液一起加熱將Ome縮醛 水解，然后用乙酸酐的DMSO溶液將內(nèi)半縮醛氧化，并用Tebbe試劑或Petassis試劑進(jìn)行烯 化反應(yīng)得到烯烴72。將乙烯基還原并用催化氫化除去芐基保護(hù)基，隨后重保護(hù)40Η和60Η 作為苯亞甲基縮醛，得到化合物73。用三氟甲磺酸苷進(jìn)行三氟甲磺酸化，然后在50-100°C 的溫度下在DMSO之類的溶劑中與適當(dāng)保護(hù)的核堿基和氫化鈉之類的強(qiáng)堿反應(yīng)以得到74。 用催化氫化除去苯亞甲基保護(hù)基，保護(hù)伯醇作為DMT醚，并進(jìn)行亞磷酸酯化反應(yīng)得到亞磷 酰胺化合物75。實(shí)施例21制備化合物81<formula>formula see original document page 89</formula>
化合物76按照Houlton (Tetrahedron, 1993，49，8087)描述的方法制備，并通過催 化氫化反應(yīng)還原成化合物77。保護(hù)40H和60H作為苯亞甲基縮醛得到化合物78。按照實(shí) 施例14描述的方法用新戊酰氯處理20H，然后Barton還原30H，并水解新戊酰酯得到化合 物79。用三氟甲磺酸苷進(jìn)行三氟甲磺酸化，然后在50-100°C的溫度下在DMSO之類的溶劑 中與適當(dāng)保護(hù)的核堿基和氫化鈉之類的強(qiáng)堿反應(yīng)以得到化合物80。用催化氫化除去苯亞甲 基保護(hù)基，保護(hù)伯醇作為DMT醚并進(jìn)行亞磷酸酯化反應(yīng)得到亞磷酰胺，化合物81。實(shí)施例22制備化合物85<formula>formula see original document page 90</formula>將化合物43 (按照實(shí)施例14所示的方法制備)氧化，然后進(jìn)行Wittig反應(yīng)得到 化合物82。通過催化氫化反應(yīng)還原烯烴，接著用碳酸鉀的甲醇溶液除去新戊?；玫交?物83。用三氟甲磺酸苷進(jìn)行三氟甲磺酸化，然后在50-100°C的溫度下在DMSO之類的溶劑 中與適當(dāng)保護(hù)的核堿基和氫化鈉之類的強(qiáng)堿反應(yīng)以得到化合物84。用催化氫化除去苯亞甲 基保護(hù)基，保護(hù)伯醇作為DMT醚并進(jìn)行亞磷酸酯化反應(yīng)得到亞磷酰胺，化合物85。實(shí)施例23制備化合物92<formula>formula see original document page 91</formula>
使化合物45 (按照實(shí)施例14所述方法制備)與合適的親核試劑如疊氮化鈉、氰化 鈉、硫化鈉、伯胺或仲胺衍生物或者甲醇鈉反應(yīng)得到化合物86，其中，所述親核試劑(Nu)可 選自任何所需的親核試劑，其中可包括疊氮化合物、氰化物、硫醇、硫醚、胺或醇鹽之類的親 核試劑。用碳酸鉀水解新戊?；玫交衔?7。用三氟甲磺酸苷將羥基三氟甲磺酸化得到 化合物88。在50-100 0C的溫度下在DMSO之類的溶劑中與適當(dāng)保護(hù)的核堿基和氫化鈉之類 的強(qiáng)堿反應(yīng)以得到化合物89。用催化氫化或通過與乙酸水溶液反應(yīng)將苯亞甲基保護(hù)基除去 得到化合物90。保護(hù)伯醇作為DMT醚得到化合物91，然后進(jìn)行亞磷酸酯化反應(yīng)得到亞磷酰 胺，化合物92。實(shí)施例24制備化合物99<formula>formula see original document page 92</formula>在合適的溶劑中用乙酸鉀和18-冠-6處理化合物45得到SN2取代的三氟甲磺 酸酯。在低溫下用甲醇氨溶液處理所得產(chǎn)物得到化合物93。或者，可將化合物45置于 Mitsunobu條件(R3P，DIAD, Ρ02ΝΒζ0Η)下，然后進(jìn)行氨解以得到相同的化合物93。93依次 用三氟甲磺酸苷處理，分離三氟甲磺酸酯基，并用氟化銫的叔丁醇溶液處理得到94，與上文 所述從化合物45制備化合物46類似。用碳酸鉀的甲醇溶液處理94得到氟醇95，該物質(zhì) 用三氟甲磺酸苷的吡啶溶液處理轉(zhuǎn)化成三氟甲磺酸酯。分離，然后在存在氫化鈉之類強(qiáng)堿 時(shí)用核堿基處理得到化合物96。用90%乙酸水溶液除去苯亞甲基保護(hù)基得到化合物97。 與4，4_ 二甲氧基三苯甲基氯的吡啶溶液反應(yīng)得到化合物98，分離之后將該物質(zhì)轉(zhuǎn)化成氰 基乙基亞磷酰胺，化合物99。實(shí)施例25制備化合物106<formula>formula see original document page 93</formula>
在Swern條件(草酰氯，DMS0，三乙胺，二氯甲烷)下氧化化合物43 (按照實(shí)施例14所述方法制備)得到酮100。用氟化試劑如1，1，2，2_四氟乙基-N，N-二甲胺(或者 deoxofIuor ( —種氟化試劑)或DAST)處理得到化合物101。在碳酸鉀/甲醇條件下除去 新戊?；玫交衔?02。依次用三氟甲磺酸苷的吡啶溶液處理，分離，并在存在堿時(shí)用核 堿基處理得到核苷類似物，化合物103。用90%乙酸水溶液除去苯亞甲基得到化合物104， 用4，4-二甲氧基三苯甲基氯的吡啶溶液處理該物質(zhì)將其轉(zhuǎn)化成化合物105。進(jìn)行亞磷酸酯 化反應(yīng)得到亞磷酰胺，化合物106。實(shí)施例26制備化合物116<formula>formula see original document page 94</formula>在存在氫化鈉時(shí)用2_(溴甲基)_萘(Nap溴化物)處理化合物42 (按照實(shí)施例14 所述方法制備)得到Nap-保護(hù)的位置異構(gòu)體(regioisomer)的混合物(107 andlOS)。通 過硅膠層析分離得到異構(gòu)體，化合物107。在Swern條件(草酰氯，DMSO，三乙胺，二氯甲烷) 下氧化化合物107得到酮，化合物109，該物質(zhì)隨后用甲基溴化鎂(Methyl Grignard)處理 得到甲基醇，化合物110和111的混合物。通過硅膠層析分離所需立體異構(gòu)體110，然后在 三氟甲磺酸苷/吡啶條件下形成三氟甲磺酸酯，并用氟化銫處理得到氟化物112?；蛘撸?TFEDMA處理110 —步得到化合物112。用DDQ除去Nap保護(hù)基，然后進(jìn)行三氟甲磺酸化，分 離，并在存在堿時(shí)用核堿基處理得到化合物113。用90%乙酸水溶液除去苯亞甲基得到化 合物114，用4，4-二甲氧基三苯甲基氯的吡啶溶液處理該物質(zhì)得到化合物115。進(jìn)行亞磷 酸酯化反應(yīng)得到亞磷酰胺，化合物116。實(shí)施例27
制備化合物129
<formula>formula see original document page 95</formula>
按照之前在Nucleosides，Nucleotides，and Nucleic Acids (2004)，23 (1&2)， 439-455中的描述，在存在咪唑和DMF時(shí)用叔丁基二甲基甲硅烷基氯處理化合物42(按照 實(shí)施例14所述方法制備)得到甲硅烷基化化合物117和118的混合物。硅膠層析之后在 Swern條件(草酰氯，DMS0，三乙胺，二氯甲烷)下氧化化合物117產(chǎn)生酮，化合物119。用 甲基溴化鎂處理得到醇，化合物120和121的混合物。通過硅膠層析分離，用四丁基氟化 銨處理分離的化合物120，然后在甲苯磺酰氯和吡啶條件下轉(zhuǎn)化成甲苯磺酸酯，得到化合物 122。如文獻(xiàn)中對類似化合物的記載(Bioorg. Med. Chem. Lett. 1996，6，1457)，用堿處理將甲 苯磺酸酯122轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的環(huán)氧化物，化合物123。在存在堿時(shí)使化合物123與選定的嘧啶 雜環(huán)(雜環(huán)堿基)反應(yīng)形成化合物124。用甲磺酰氯處理使羥基的立體化學(xué)反轉(zhuǎn)，然后水解 所得甲磺酸酯基，該過程經(jīng)過無水環(huán)狀中間體。在DBU/THF條件下用九氟丁烷磺酰氯進(jìn)行氟化得到氟化化合物126。用90%乙酸水溶液除去苯亞甲基得到化合物127，用4，4_ 二甲 氧基三苯甲基氯的吡啶溶液處理將其轉(zhuǎn)化成化合物128。進(jìn)行亞磷酸酯化反應(yīng)得到亞磷酰 胺，化合物129。實(shí)施例28制備化合物134<formula>formula see original document page 96</formula>
a)制備化合物130將化合物49 (按照實(shí)施例14所述方法制備，10. 8mmol, 4. 20g)和腺嘌呤 (54. 5mmol,7. 35g)懸浮于無水DMS0(80mL)。在該懸浮液中加入氫化鈉(54. 4mmol,2. 18g， 60%礦物油懸浮液)。將所得混合物加熱至55°C維持12小時(shí)，冷卻至室溫并倒入水中 (400mL)?；旌衔镉靡宜嵋阴?3X400mL)萃取，合并的有機(jī)萃取物用半飽和的NaCl水溶液 (3X500mL)洗滌。有機(jī)層用無水硫酸鈉干燥，過濾，并蒸發(fā)得到3. 93克(97%產(chǎn)率)棕色 固體。NMRCH和19F)和LCMS質(zhì)量分析與結(jié)構(gòu)一致。該材料無需進(jìn)一步純化即可使用。b)制備化合物131將化合物130 (10. 5mmol,3. 93g)溶于無水吡啶(50mL)。冷卻至0°C后溶液用苯甲 酰氯(16. 9mmol, 1. 97mL)處理。在0°C繼續(xù)攪拌15分鐘，此時(shí)將混合物升至室溫2. 5小時(shí)。 將混合物冷卻至0°C，用20mL H2O猝滅并攪拌15分鐘。用30分鐘在混合物中邊攪拌邊加 入濃氨水(20mL)。將混合物真空濃縮到約40mL并倒入乙酸乙酯(500mL)。混合物用半飽和 的NaCl水溶液(3X500mL)洗滌，用無水硫酸鈉干燥，過濾，并蒸發(fā)成淡棕色泡沫。通過硅膠 層析純化(1. 5%甲醇的二氯甲烷溶液)得到2. 33克化合物131，其為淡棕色泡沫。NMRCH 和19F)和LCMS分析與結(jié)構(gòu)一致。
c)制備化合物132將化合物131 (4. 84mmol,2. 30g)溶于70mL 90% (ν/ν)乙酸水溶液。將該溶液加 熱至80°C維持4小時(shí)，然后真空濃縮成粘稠的黃色的油。加入三乙胺(10滴)，然后加入 5mL甲醇和IOOmL乙酸乙酯。形成白色沉淀，沉淀通過過濾收集并用乙酸乙酯洗滌，然后真 空干燥過夜。最終得到1. 28克(69% )白色固體，化合物132。NMR(1H和19F)和LCMS分析 與化合物132的結(jié)構(gòu)一致。d)制備化合物133將化合物132 (3. 24mmol, 1. 25g)懸浮于無水吡啶(12mL)。將所得懸浮液冷卻至 0°C并邊攪拌邊用4，4-二甲氧基三苯甲基氯(5. 19mm0l，1.76g)。在0°C繼續(xù)攪拌15分鐘， 并在室溫?cái)嚢?小時(shí)，然后 用甲醇(2mL)猝滅混合物，并真空濃縮成粘稠的黃色油狀物。將 該油狀物溶于二氯甲烷(150mL)并用飽和的NaHCO3水溶液(IOOmL)和飽和的NaCl水溶液 (2 X IOOmL)洗滌。有機(jī)層用無水硫酸鈉干燥，過濾，并蒸發(fā)成黃色泡沫。通過硅膠層析純化 得到2. 05克(92%產(chǎn)率)化合物133，其為黃色泡沫。NMR分析(1H和19F)與結(jié)構(gòu)相符。e)制備化合物134將化合物133 (2. 59mmol, 1. 79g)溶于無水 DMF (6mL)，加入四唑(1. 56mmol, 109mg)，1-甲基咪唑(0. 65mmol,52 μ L)和四異丙基氨基_2_氰基乙基磷酰二胺 (3. 90mmol, 1. 24mL)。攪拌4. 5小時(shí)后加入三乙胺(10. 4mmol, 1. 45mL)猝滅反應(yīng)。將混合 物倒入乙酸乙酯(150mL)，用飽和的NaCl水溶液(4X IOOmL)洗滌，用無水硫酸鈉干燥，過 濾，并蒸發(fā)成淡黃色泡沫。將該固體重溶于乙酸乙酯(7mL)并被逐滴加入70mL己烷進(jìn)行沉 淀。硅膠純化(1 1己烷乙酸乙酯)所得沉淀得到1.92克(83%)化合物134，其為白 色泡沫。NMRCH、19F 和 31P)與結(jié)構(gòu)一致。31P NMR(CDCl3) δ ppm 151. 64，151. 58，150. 37， 150.33。實(shí)施例29制備化合物140<formula>formula see original document page 98</formula>a)制備化合物135將化合物49 (按照實(shí)施例14所述方法制備，7. 51mmol,2. 9g)和6_碘_2_氨基嘌 呤四丁基銨鹽(17. 6mmol,8. 5g，按照 J. Org. Chem. 1995，60，2902-2905 中的描述制備)溶 于無水HMPA(26mL)。將混合物室溫?cái)嚢?8小時(shí)，倒入乙酸乙酯，用水和飽和NaCl洗滌，用 無水硫酸鈉干燥，過濾并蒸發(fā)。通過硅膠層析純化(1 1己烷乙酸乙酯)得到2. 78克 (75%產(chǎn)率)化合物135。NMR(1H和19F)和LCMS分析與結(jié)構(gòu)一致。b)制備化合物136將化合物135 (0. 64mmol,0. 32g)溶于 1，4_ 二噁烷(9mL)，加入 9mL IMNaOH 水溶 液，并在55°C加熱18小時(shí)。將混合物冷卻，然后用IN HCl中和。將混合物真空濃縮，殘余 物通過硅膠層析(5%甲醇的二氯甲烷溶液)純化得到0.22克(88%產(chǎn)率)136。NMRCH和 19F)和LCMS分析與結(jié)構(gòu)一致。c)制備化合物137將化合物136(3. 23mmol, 1. 25g)溶于無水吡啶(13. 6mL)，冷卻至0°C，然后用異丁 酰氯(4.85mmol，0.51mL)處理。將混合物升至室溫并攪拌6小時(shí)。將混合物冷卻至0°C并 用濃氨水(3.2mL)攪拌處理30分鐘。將混合物倒入乙酸乙酯(IOOmL)，用水(200mL)和鹽 水(200mL)洗滌，用無水硫酸鈉干燥，過濾，并蒸發(fā)。通過硅膠層析純化(梯度為0-5%甲醇 的二氯甲烷溶液)得到1. 21克(82%產(chǎn)率)化合物137。NMR(1H和19F)和LCMS分析與結(jié) 構(gòu)一致。
d)制備化合物138將化合物137(0. 219mmol,0. 103g)溶于甲醇(IOmL)，在氫氣氣氛(氣球壓力)下 加入乙酸(0. 2mL)和Pd(OH)2/C(0. 44g)，攪拌14小時(shí)。將催化劑過濾除去，將所得濾液濃 縮并與乙腈一起研磨得到化合物138，其為白色固體。NMRCH和19F)和LCMS分析與結(jié)構(gòu)一
致。e)制備化合物139將化合物138(3. 83mmol，1.41g)溶于無水吡啶(32mL)，加入4，4_二甲氧基三苯甲 基氯(5.0mmOl，1.71g)并室溫?cái)嚢?小時(shí)，然后用甲醇(0. 5mL)猝滅。將溶液真空濃縮，然 后重溶于乙酸乙酯。有機(jī)溶液用飽和的NaHCOyK溶液和鹽水洗滌，用無水硫酸鈉干燥，過 濾，并蒸發(fā)。通過硅膠層析純化得到1.63克(70%產(chǎn)率)139。NMRCH和19F)分析與結(jié)構(gòu)相 符。f)制備化合物140將化合物139(1. 59mmol，1. 07g)溶于無水 DMF(4. 25mL)，加入四唑(1. 35mmol， 95mg)、l-甲基咪唑(0. 45mmol，35yL)和四異丙基_2_氰基乙基磷酰二胺(2. 25mmol, 0. 7ImL)。將混合物室溫?cái)嚢?小時(shí)，倒入乙酸乙酯并用飽和NaHCO3水溶液和鹽水洗滌。有 機(jī)層用無水硫酸鈉干燥，過濾，并蒸發(fā)。通過硅膠層析純化得到1.07克(78%產(chǎn)率)化合物 140。NMRd9F 禾口 31P)分析與結(jié)構(gòu)一致。31P NMR(CDCl3) δ ppm 151. 30，151. 24，148. 82， 148.78。實(shí)施例30制備有缺口的寡聚化合物用自動(dòng)固相分析來制備本發(fā)明使用的寡聚化合物。一種示例性的有缺口的寡聚化 合物是 ISIS-410131，其具有 SEQ ID NO :01 和結(jié)構(gòu)式5_CfUfTAGCACTGGCCfUf-3。各核苷間 連接基團(tuán)是硫代磷酸酯，沒有下標(biāo)f的T、A、G和C字母各自表示β -D-2-脫氧核糖核苷， 而Cf和Uf各為單體亞單元，其中，Bx分別代表雜環(huán)堿基胞嘧啶或尿嘧啶，且其中的單體亞 單元具有以下結(jié)構(gòu)式和構(gòu)型
<formula>formula see original document page 99</formula>410131的合成以40μπιΟ1的規(guī)模進(jìn)行，采用具有聚苯乙烯固體支持物的ΑΚΤΑ Oligopilot 10 (GE Healthcare)合成儀，加載200 μ mol/g通用接頭。包括化合物8和13在 內(nèi)的所有核苷亞磷酰胺制備成0. IM的無水乙腈溶液。在存在4，5-二氰基咪唑時(shí)用4摩爾 當(dāng)量各自的亞磷酰胺進(jìn)行偶聯(lián)，偶聯(lián)時(shí)間為14分鐘。在1 13-甲基吡啶乙腈中用0.2M 苯乙酰基硫化物處理將三價(jià)的磷硫化成硫代磷酸酯。所得有缺口的寡聚化合物用11三 乙胺乙腈去保護(hù)(室溫1小時(shí))，然后在55°C用濃氨水處理7小時(shí)。進(jìn)行離子交換純化， 然后進(jìn)行反向脫鹽得到9.8ymol(44mg)純化的寡核苷酸。通過LC/MS離子對層析進(jìn)行質(zhì) 量和純度分析，顯示UV純度為98. 5%, ESI質(zhì)量為4522. 8Da(計(jì)算值4523. 6Da)。實(shí)施例31
靶向PTEN的2-10-2有缺口的寡聚化合物體外研究 合成有缺口的寡聚化合物并檢測它們在一定劑量范圍內(nèi)降低PTEN表達(dá)的能力。采用 3 μ g/mL Lipofectin 在 OptiMEM 中的溶液，用劑量為 0. 3125,0. 625、1. 25,2. 5、5、10、 20或40nM的有缺口的寡聚化合物轉(zhuǎn)染bEND細(xì)胞4小時(shí)，之后用正常生長培養(yǎng)基(DMEM，高 葡萄糖，10% FBS，青霉素-鏈霉素)代替轉(zhuǎn)染混合物。1天后(大約在轉(zhuǎn)染開始后24小 時(shí))收獲RNA并用實(shí)時(shí)RT-PCR分析PTEN和親環(huán)蛋白A的RNA水平。數(shù)值代表根據(jù)親環(huán)蛋 白A水平標(biāo)準(zhǔn)化的PTEN RNA水平的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差(η = 3)。用所得的劑量反應(yīng)曲線來確定下面列出的IC5Q。Tm用4μΜ下面列出的修飾的寡 聚物禾口 4μ M 互補(bǔ) RNA AGGCCAGTGCTAAG(SEQ ID NO 7)在 IOOmM 磷酸緩沖液、0. ImM EDTA, ρΗ 7中在260nm確定。SEQ ID NO. 組成(5，至 3，)Tm(°C )IC50(nM)/ISIS NO.01/392753 CeUeTAGCACTGGCCeUe 51. 33701/410312 CmUmTAGCACTGGCCmUm 49. 22301/410131 CfUfTAGCACTGGCCfUf 50.016各核苷間連接基團(tuán)是硫代磷酸酯。有下標(biāo)的核苷定義如下，其中，Bx是雜環(huán)堿基
<formula>formula see original document page 100</formula>實(shí)施例32靶向PTEN的2-10-2有缺口的寡聚化合物體外研究合成有缺口的寡聚化合物并檢測它們在一定劑量范圍內(nèi)降低PTEN表達(dá)的能力。 采用 3 μ g/mL Lipofectin 在 OptiMEM 中的溶液，用劑量為 0. 3125,0. 625、1. 25,2. 5、5、10、 20或40nM的有缺口的寡聚化合物轉(zhuǎn)染bEND細(xì)胞4小時(shí)，之后用正常生長培養(yǎng)基(DMEM，高 葡萄糖，10% FBS，青霉素-鏈霉素)代替轉(zhuǎn)染混合物。1天后(大約在轉(zhuǎn)染開始后24小 時(shí))收獲RNA并用實(shí)時(shí)RT-PCR分析PTEN和親環(huán)蛋白A的RNA水平。數(shù)值代表根據(jù)親環(huán)蛋 白A水平標(biāo)準(zhǔn)化的PTEN RNA水平的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差(η = 3)。SEQ ID NO.組成(5，至 3，)/ISIS NO.02/392063MeC1T1TAGCACTGGCMeC1T101/410131CfUfTAGCACTGGCCfUf02/417999MeCf Tf TAGCACTGGCfeCf TfSEQ ID NO.% UTCi 劑量/ISIS NO. 0. 3125 0.625 1. 25 2. 5 5 10 20 4002/392063 868366 40 36 24 32 17
01/410131 787071 50 52 35 29 1702/417999 98108 77 72 68 43 33 20各核苷間連接基團(tuán)是硫代磷酸酯，上標(biāo)Me表示隨后的C是5-甲基C。有下標(biāo)的核 苷定義如下，其中，Bx是雜環(huán)堿基
<formula>formula see original document page 101</formula>實(shí)施例33靶向PTEN的2-10-2有缺口的寡聚化合物體內(nèi)研究給6 周齡 Balb/c 小鼠(Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)注射一次劑量為 20 或60mg/kg的靶向PTEN的有缺口的寡聚化合物。施用72小時(shí)后處死小鼠。將肝組織均質(zhì) 并按照本發(fā)明的描述用實(shí)時(shí)PCR量化mRNA水平，與未處理的對照水平進(jìn)行比較(％ UTC)。 進(jìn)行血漿化學(xué)分析。SEQID N0. 組成(5，至 3，)劑量 ％ UTC/ISIS NO.(mg/kg)鹽水Ν/Α 10001/392753 CeUeTAGCACTGGCCeUe 20 8401/392753 CeUeTAGCACTGGCCeUe 60 6801/410312 CmUmTAGCACTGGCCmUm 20 8301/410312 CmUmTAGCACTGGCCmUm 60 2701/410131 CfUfTAGCACTGGCCfUf 20 2601/410131 CfUfTAGCACTGGCCfUf 60 8各核苷間連接基團(tuán)是硫代磷酸酯。有下標(biāo)的核苷定義如下
<formula>formula see original document page 101</formula>下標(biāo)m，和下標(biāo)f。用這些有缺口的寡聚化合物處理后未觀察到ALT升高且對體重或器官重量沒有 顯著影響。實(shí)施例34靶向PTEN的有缺口的寡聚化合物體內(nèi)研究給6 周齡 Balb/c 小鼠(Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)每周注射兩次劑量為0. 47、1. 5、4. 7或15mg/kg的靶向PTEN的有缺口的寡聚化合物，持續(xù)3周。最后一次施 用48小時(shí)后處死小鼠。將肝組織均質(zhì)并按照本發(fā)明的描述用實(shí)時(shí)PCR量化mRNA水平，與 未處理的對照水平進(jìn)行比較(％ UTC)。進(jìn)行血漿化學(xué)分析。Tm用4μΜ下面列出的修飾的 寡聚物和 4 μ M 互補(bǔ) RNAAGGCCAGTGCTAAG (SEQ ID NO 7)在 IOOmM 磷酸緩沖液、0. ImM EDTA, ρΗ 7中在260nm確定。SEQ ID NO. 組成(5，至 3，)Tm(°C )/ISIS NO.01/410131 CfUfTAGCACTGGCCfUf50. 702/417999 MeCfTfTAGCACTGGCfeCfTf 52.6各核苷間連接基團(tuán)是硫代磷酸酯，上標(biāo)Me表示隨后的C是5_甲基C，有下標(biāo)f的 核苷定義如下，其中，Bx是雜環(huán)堿基
<formula>formula see original document page 102</formula>SEQ ID NO.% UTCi % UTCi% UTCi% UTCi/ISIS NO. 0.47mg/kg 1. 5mg/kg 4. 7mg/kg 15mg/kg01/4101311202/41799977 64 3110鹽水％ UTC = 100 (劑量 Ν/Α)相對于注射鹽水的小鼠，還測定了血清中肝轉(zhuǎn)氨酶，丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和天冬 氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)的水平。大致的肝轉(zhuǎn)氨酶水平列于下表。SEQ ID NO.ASTi ASTi ASTiASTi/ISIS NO.0.47mg/kg 1. 5mg/kg 4. 7mg/kg 15mg/kg01/410131- - 10602/41799951 90 8637鹽水82 (劑量 Ν/Α)SEQ ID NO.ALTi ALTi ALTiALTi/ISIS NO.0.47mg/kg 1. 5mg/kg 4. 7mg/kg 15mg/kg01/4101312702/41799928 31 4221鹽水34 (劑量 Ν/Α).實(shí)施例35靶向PTEN的有缺口的寡聚化合物體內(nèi)研究給 6 周齡 Balb/c 小鼠(Jackson Laboratory, Bar Harbor，ME)注射一次劑量 為3. 2、10、32或100mg/kg的靶向PTEN的有缺口的寡聚化合物。施用72小時(shí)后處死 小鼠。將肝組織均質(zhì)并按照本發(fā)明的描述用實(shí)時(shí)PCR量化mRNA水平，與未處理的對照水平進(jìn)行比較(％UTC)。進(jìn)行血漿化學(xué)分析。Tm用4μΜ下面列出的修飾的寡聚物以 及互補(bǔ) RNATCAAGGCCAGTGCTAAGAGT (SEQ ID NO 8)(對于 2/14/2 基序寡聚物)和互補(bǔ) RNAAGGCCAGTGCTAAG(SEQ ID NO 7)(對于 2/10/2 寡聚物)在 IOOmM 磷酸緩沖液、0. ImM EDTA，ρΗ 7 中在 260nm 確定。SEQ ID NO. 組成(5，至 3，)Tm(°C )基序/ISIS NO.03/411026 CfUfGCTAGCCTCTGGATUfUf 57. 12/14/204/418000 MeCfTfGCTAGCCTCTGGATTfTf 58. 52/14/25_CH3 翼01/410131 CfUfTAGCACTGGCCfUf50. 72/10/202/417999 MeCfTfTAGCACTGGCfeCfTf 52.62/10/25_CH3 翼02/392063 MeC1T1TAGCACTGGCMeC1T1 60. 52/10/25_CH3 翼各核苷間連接基團(tuán)是硫代磷酸酯，上標(biāo)Me表示隨后的C是5-甲基C。有下標(biāo)的核 苷定義如下，其中，Bx是雜環(huán)堿基
<formula>formula see original document page 103</formula>SEQIDN0.% UTCi % UTCi % UTCi % UTCi/ISIS NO.3. 2mg/kg 10mg/kg 32mg/kg lOOmg/kg02/3920639229 7 703/4110269252 12 704/41800010038 12 501/41013110059 9 302/4179999431 10 5鹽水％ UTC = 100相對于注射鹽水的小鼠，還測定了血清中肝轉(zhuǎn)氨酶，丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和天冬 氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)的水平。大致的肝轉(zhuǎn)氨酶水平列于下表。SEQ ID NO.ASTiASTi ASTiASTi/ISIS NO.3. 2mg/kg 10mg/kg 32mg/kg lOOmg/kg02/3920635786 812739903/41102616678 6913004/4180009094 8034501/4101314887 1875102/41799972126 9955SEQ IDN0.ALTiALTi ALTiALTi/ISIS NO.3. 2mg/kg lOmg/kg 32mg/kg lOOmg/kg
02/392063913101867003/41102625202611504/41800017334432101/4101311415221102/41799913221511.實(shí)施例36靶向PTEN的有缺口的寡聚化合物體內(nèi)研究給 6 周齡 Balb/c 小鼠(Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)注射一次劑量為 3. 2、10、32或100mg/kg的靶向PTEN的有缺口的寡聚化合物。施用72小時(shí)后處死小鼠。將 肝組織均質(zhì)并按照本發(fā)明的描述用實(shí)時(shí)PCR量化mRNA水平，與未處理的對照水平進(jìn)行比較 (% UTC)。用Graphpad Prism估算各種寡聚化合物的ED5tl，如下所示。SEQ ID N0. 組成(5，至 3，)ED5tl(mg/kg)/ISIS NO.02/417999 MeCfTfTAGCACTGGCfeCfTf 7. 502/425857 MeChThTAGCACTGGCMeChTh 14. 5各核苷間連接基團(tuán)是硫代磷酸酯，上標(biāo)Me表示隨后的C是5-甲基C。有下標(biāo)的核 苷定義如下，其中，Bx是雜環(huán)堿基
<formula>formula see original document page 104</formula>SEQ ID NO. % UTCi 劑量/ISIS NO. 3. 2mg/kg 10mgg/g 32mg/kg lOOmg/kg02/417999 77419502/425857 7672206鹽水100相對于注射鹽水的小鼠，還測定了血清中肝轉(zhuǎn)氨酶，丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和天冬 氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)的水平。大致的肝轉(zhuǎn)氨酶水平列于下表。SEQ ID NO.AST (IU/L) @ 劑量/ISIS N0.3. 2mg/kg 10mg/kg 32mg/kg lOOmg/kg02/417999 72126995502/425857 88647746鹽水77 (劑量n/a)SEQ ID NO.ALT (IU/L) @ 劑量/ISIS NO.3. 2mg/kg lOmg/kg 32mg/kglOOmg/kg02/417999 2624193102/425857 28262951
鹽水31 (劑量n/a).實(shí)施例37有缺口的寡聚化合物制備了具有含各種缺口和翼大小的有缺口的基序的寡聚化合物。Tm用4μΜ下面 列出的修飾的寡聚物以及互補(bǔ)RNATCAAGGCCAGTGCTAAGAGT(SEQ ID NO 8)(對于Tm1)或互 補(bǔ) RNAAGGCCAGTGCTAAG (SEQ ID NO 7)(對于 Tm2)在 IOOmM 磷酸緩沖液、0. ImM EDTA, pH 7 中在260nm確定。SEQ ID NO. 組成(5，至 3，)Tm1CC )缺口聚合物 設(shè)計(jì)/ISIS NO.02/417999 MeCfTfTAGCACTGGCfeCfTf59.42-10-202/425858 MeCfTfTfAGCACTGGMeCfMeCfTf67.43-8-305/425859 TfMeCfTfTAGCACTGGCfcCfTfTf65.03-10-305/425860 TfMeCfTfTfAGCACTGGMeCfMeCfTfTf70.44-8-406/425861 MeCfTfMeCfTfTfAGCACTGGMeCfMeCfTfTf 74. 35—8—4各核苷間連接基團(tuán)是硫代磷酸酯，上標(biāo)Me表示隨后的C是5-甲基C。有下標(biāo)的核 苷定義如下，其中，Bx是雜環(huán)堿基
<formula>formula see original document page 105</formula>實(shí)施例38靶向PTEN的半體體內(nèi)研究給 6 周齡 Balb/c 小鼠(Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)注射一次劑量為 1. 6、5、16或50mg/kg的靶向PTEN的有缺口的寡聚化合物。在最后一次施用72小時(shí)后處死 小鼠。將肝組織均質(zhì)并按照本發(fā)明的描述用實(shí)時(shí)PCR量化mRNA水平，與未處理的對照水平 進(jìn)行比較(％ UTC)。用Graphpad Prism估算各種寡聚化合物的ED50，如下所示。Tm用4 μ M 下面列出的修飾的寡聚物以及互補(bǔ)RNA TCAAGGCCAGTGCTAAGAGT (SEQ ID NO 8)(對于Tm1) 或互補(bǔ) RNA AGGCCAGTGCTAAG (SEQ ID NO 7)(對于 Tm2)在 IOOmM 磷酸緩沖液、0. ImM EDTA, pH 7中在260nm確定。SEQ ID NO. /ISIS NO. 組成(5，至 3，)Tm1Tm202/412471MeC1T1T1AGCACTGGCMeCT 65. 5 62. 502/429495MeCfTfTfAGCACTGGCfeCT 63.8 59.6各核苷間連接基團(tuán)是硫代磷酸酯，上標(biāo)Me表示隨后的C是5_甲基C，有下標(biāo)的核 苷定義如下，其中，Bx是雜環(huán)堿基<formula>formula see original document page 106</formula>
權(quán)利要求
一種四氫吡喃核苷類似物，其具有式XVI其中Bx是雜環(huán)堿基部分；T5是羥基保護(hù)基；L1是H、鹵素、C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基；Z1是O-或OE1；Z2是OH、OE1或N(E1)(E2)；E1和E2各自獨(dú)立地為烷基或取代的烷基；q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7各自獨(dú)立地為H、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基；其中，各取代的基團(tuán)包含一個(gè)或多個(gè)獨(dú)立地選自下組的任選被保護(hù)的取代基鹵素、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、OC(＝X)J1、OC(＝X)NJ1J2、NJ3C(＝X)NJ1J2和CN，其中，J1、J2和J3各自獨(dú)立地是H或C1-C6烷基，且X為O、S或NJ1。FPA00001096851800011.tif
2.如權(quán)利要求1所述的四氫吡喃核苷類似物，其中，^、％、^、^、％、％和q7各自是H。
3.如權(quán)利要求1所述的四氫吡喃核苷類似物，其中，qi>q2、q3、q4、q5、q6和q7中的至少 一個(gè)不是H。
4.如權(quán)利要求1或3任一項(xiàng)所述的四氫吡喃核苷類似物，其中，Q1> q2、q3、q4、q5、Q6和 %中的至少一個(gè)是甲基。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的四氫吡喃核苷類似物，其中，Bx是尿嘧啶、5-甲基 尿嘧啶、5-噻唑并-尿嘧啶、2-硫代-尿嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、胸腺嘧啶、2-硫代-胸 腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-噻唑并-胞嘧啶、5-丙炔基-胞嘧啶、腺嘌呤、鳥嘌呤、 2，6-二氨基嘌呤、IH-嘧啶并[5，4-b][l，4]苯并噁嗪2 (3H)-酮、IH-嘧啶并[5，4_b][l，4] 苯并噻嗪-2 (3H)_酮、9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并[5，4-b][l，4]苯并噁嗪_2 (3H)-酮、 2H-嘧啶并[4，5-b]吲哚-2-酮或H-吡啶并[3，2 :4，5]吡咯并[2，3_d]嘧啶-2-酮。
6.如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的四氫吡喃核苷類似物，其中，Bx是尿嘧啶、5-甲基 尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、2，6-二氨基嘌呤、腺嘌呤或鳥嘌呤。
7.如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的四氫吡喃核苷類似物，其中，T5是乙?；?、叔丁基、 叔丁氧基甲基、甲氧基甲基、四氫吡喃基、1-乙氧基乙基、1-(2_氯乙氧基)乙基、2-三甲 基甲硅烷基乙基、對_氯苯基、2，4_ 二硝基苯基、芐基、苯甲?；?苯基苯甲?；?、2， 6- 二氯芐基、二苯基甲基、對-硝基芐基、三苯基甲基(三苯甲基)、4_甲氧基三苯甲基、4， 4-二甲氧基三苯甲基、三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、三苯基甲硅烷基、三異丙基甲硅烷基、苯甲酰甲酸酯基、氯乙?；?、三氯乙 ?；?、三氟乙?；?、新戊酰基、9-芴基-甲基碳酸酯基、甲磺酸酯基、甲苯磺酸酯基、三氟甲 磺酸酯基、三苯甲基、單甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基、三甲氧基三苯甲基或取代的 9-苯基黃嘌呤-9-基。
8.如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的四氫吡喃核苷類似物，其中，T5是乙?；?、芐基、叔 丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基或二甲氧基三苯甲基。
9.如權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的四氫吡喃核苷類似物，其中，L1是F。
10.如權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的四氫吡喃核苷類似物，其中，L1是H。
11.如權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的四氫吡喃核苷類似物，其中，Z1是0_，且Z2是0扎
12.如權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的四氫吡喃核苷類似物，其中，Z1是O(CH2)2CN,Z2 是N[CH2 (CH3) 2] 2，且T5是4，4- 二甲氧基三苯甲基。
13.如權(quán)利要求1-8或10-12中任一項(xiàng)所述的四氫吡喃核苷類似物，其具有式XVII<formula>formula see original document page 3</formula>
14.如權(quán)利要求13所述的四氫吡喃核苷類似物，其中 Qi> Q2> Q3> Q4> Q5> Q6 禾口 ％ 各自是 H ；Bx是尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、2，6- 二氨基嘌呤、腺嘌 呤或鳥嘌呤；T5是4，4-二甲氧基三苯甲基； Z1 是 O(CH2)2CN ；禾口 Z2 是町012_2]2。
15.一種包含至少一個(gè)式X的四氫吡喃核苷類似物的寡聚化合物<formula>formula see original document page 3</formula>，其中，所述至少一個(gè)式X的四氫吡喃核苷類似物各自獨(dú)立地滿足 Bx是雜環(huán)堿基部分；T3和T4各自獨(dú)立地為將四氫吡喃核苷類似物連接到寡聚化合物的核苷間連接基團(tuán)； 或者T3和T4中的一個(gè)是將四氫吡喃核苷類似物連接到寡聚化合物的核苷間連接基團(tuán)，且T3和T4中的另一個(gè)是H、羥基保護(hù)基、連接的共軛基團(tuán)或者5或3-末端基團(tuán)；qi、q2、q3、q4、q5、q6和q7各自獨(dú)立地為H、CrC6烷基、取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、取 代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基；R1和&中的一個(gè)為氟，而R1和&中的另一個(gè)是H、鹵素、C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基；各取代的基團(tuán)包含一個(gè)或多個(gè)獨(dú)立地選自下組的任選被保護(hù)的取代基鹵素、0Λ、 NJ1J2、SJ1, N3> OC ( = Χ) Λ、OC ( = X) NJ1J2、NJ3C ( = X) NJ1J2 和 CN，其中，X 是 0、S 或 NJ1，且 J1、J2和J3各自獨(dú)立地是H或C1-C6烷基；和其中，所述寡聚化合物包含約8至約40個(gè)通過核苷間連接基團(tuán)連接的單體亞單元，且 至少一個(gè)核苷間連接基團(tuán)是硫代磷酸酯核苷間連接基團(tuán)。
16.如權(quán)利要求15所述的寡聚化合物，其包含至少兩個(gè)式X的四氫吡喃核苷類似物。
17.如權(quán)利要求15或16任一項(xiàng)所述的寡聚化合物，其包含至少兩個(gè)通過硫代磷酸酯核 苷間連接基團(tuán)連接的鄰近的式X的四氫吡喃核苷類似物。
18.如權(quán)利要求15-17中任一項(xiàng)所述的寡聚化合物，其包含至少一個(gè)β-D-2-脫氧-核 糖核苷。
19.如權(quán)利要求15-18中任一項(xiàng)所述的寡聚化合物，其中，至少一個(gè)β-D-2-脫氧-核 糖核苷通過硫代磷酸酯核苷間連接基團(tuán)連接到式X的四氫吡喃核苷類似物。
20.如權(quán)利要求15-19中任一項(xiàng)所述的寡聚化合物，其包含至少一個(gè)具有2至約5個(gè)鄰 近的式X的四氫吡喃核苷類似物的區(qū)域。
21.如權(quán)利要求20所述的寡聚化合物，其還包含至少一個(gè)具有除β-D-核糖核苷和 β -D-2-脫氧核糖核苷以外的1至約5個(gè)鄰近的單體亞單元的額外區(qū)域，其中，所述額外區(qū) 域通過至少一個(gè)β -D-2-脫氧核糖核苷與所述至少一個(gè)區(qū)域隔開。
22.如權(quán)利要求15所述的寡聚化合物，其包含至少兩個(gè)區(qū)域，各區(qū)域具有1至約5個(gè)鄰 近的式X的四氫吡喃核苷類似物，且其中所述兩個(gè)區(qū)域通過至少一個(gè)單體亞單元隔開，其 中，各單體亞單元獨(dú)立地為核苷或修飾的核苷。
23.如權(quán)利要求22所述的寡聚化合物，其包含有缺口的寡聚化合物，其中，所述具有鄰 近的式X的四氫吡喃核苷類似物的至少兩個(gè)區(qū)域中的一個(gè)位于5-端，而所述具有鄰近的式 X的四氫吡喃核苷類似物的至少兩個(gè)區(qū)域中的另一個(gè)位于3-端，且其中所述兩個(gè)區(qū)域通過 包含約6至約18個(gè)單體亞單元的內(nèi)部區(qū)域隔開，其中，各單體亞單元獨(dú)立地為核苷或修飾 的核苷。
24.如權(quán)利要求15-23中任一項(xiàng)所述的寡聚化合物，其中，至少一個(gè)核苷間連接基團(tuán)是 磷酸二酯核苷間連接基團(tuán)。
25.如權(quán)利要求15-23中任一項(xiàng)所述的寡聚化合物，其中，各核苷間連接基團(tuán)是硫代磷 酸酯核苷間連接基團(tuán)。
26.如權(quán)利要求15-25中任一項(xiàng)所述的寡聚化合物，其中，q1、 q2、q3、q4、q5、Q6和Q7各 自是H。
27.如權(quán)利要求15-25中任一項(xiàng)所述的寡聚化合物，其中，q1、 q2、q3、q4、q5、q6或q7中 的至少一個(gè)不是H。
28.如權(quán)利要求15-25或27-28中任一項(xiàng)所述的寡聚化合物，其中，q1、q2、q3、q4、q5、q6或％中的至少一個(gè)是甲基。
29.如權(quán)利要求15-28中任一項(xiàng)所述的寡聚化合物，其中，各式X的四氫吡喃核苷類似 物具有式XI的構(gòu)型<formula>formula see original document page 5</formula>
30.如權(quán)利要求15-26或29中任一項(xiàng)所述的寡聚化合物，其中，各四氫吡喃核苷類似物 具有式XII <formula>formula see original document page 5</formula>
31.如權(quán)利要求15-30中任一項(xiàng)所述的寡聚化合物，其包含約10至約21個(gè)單體亞單兀。
32.如權(quán)利要求15-30中任一項(xiàng)所述的寡聚化合物，其包含約10至約16個(gè)單體亞單兀。
33.如權(quán)利要求15-30中任一項(xiàng)所述的寡聚化合物，其包含約10至約14個(gè)單體亞單兀。
34.一種寡聚化合物，其包含至少兩個(gè)式XIII的四氫吡喃核苷類似物<formula>formula see original document page 5</formula>其中，所述式XIII的四氫吡喃核苷類似物各自獨(dú)立地滿足 Bx是雜環(huán)堿基部分；T3和T4各自獨(dú)立地為將四氫吡喃核苷類似物連接到寡聚化合物的核苷間連接基團(tuán)； 或者T3和T4中的一個(gè)是將四氫吡喃核苷類似物連接到寡聚化合物的核苷間連接基團(tuán)，且T3 和T4中的另一個(gè)是H、羥基保護(hù)基、連接的共軛基團(tuán)或者5或3-末端基團(tuán)；qi、q2、q3、q4、q5、q6和q7各自獨(dú)立地為H、CrC6烷基、取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、取 代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基；R3和R4各自獨(dú)立地為H、羥基、鹵素、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基或取代的C1-C6烷氧基；各取代的基團(tuán)包含一個(gè)或多個(gè)獨(dú)立地選自下組的任選被保護(hù)的取代基鹵素、0Λ、 NJ1J2、SJ1, N3> OC ( = Χ) Λ、OC ( = X) NJ1J2、NJ3C ( = X) NJ1J2 和 CN，其中，X 是 0、S 或 NJ1，且 J1、J2和J3各自獨(dú)立地是H或C1-C6烷基；其中所述寡聚化合物包含約8至約40個(gè)單體亞單元；和 至少兩個(gè)式XIII的四氫吡喃核苷類似物通過硫代磷酸酯核苷間連接基團(tuán)連接。
35.如權(quán)利要求34所述的寡聚化合物，其中，對于至少一個(gè)式XIII的四氫吡喃核苷類 似物而言，R3和R4之一是H，且R3和R4中的另一個(gè)是H、OCH3或F。
36.如權(quán)利要求34所述的寡聚化合物，其包含至少一個(gè)脫氧核糖核苷。
37.如權(quán)利要求34-36中任一項(xiàng)所述的寡聚化合物，其中，至少一個(gè)β-D-2-脫氧-核 糖核苷通過硫代磷酸酯核苷間連接基團(tuán)連接到式XIII的四氫吡喃核苷類似物。
38.如權(quán)利要求34-37中任一項(xiàng)所述的寡聚化合物，其包含至少一個(gè)具有2至約5個(gè)鄰 近的式XIII的四氫吡喃核苷類似物的區(qū)域。
39.如權(quán)利要求38所述的寡聚化合物，還包含至少一個(gè)具有除β-D-核糖核苷和 β -D-2-脫氧核糖核苷以外的1至約5個(gè)鄰近的單體亞單元的額外區(qū)域，其中，所述額外區(qū) 域通過至少一個(gè)β -D-2-脫氧核糖核苷與所述至少一個(gè)區(qū)域隔開。
40.如權(quán)利要求38所述的寡聚化合物，還包含至少一個(gè)具有1至約5個(gè)鄰近的式XIII 的四氫吡喃核苷類似物的額外區(qū)域，其中，所述至少一個(gè)具有2至約5個(gè)鄰近的式XIII的 四氫吡喃核苷類似物的區(qū)域通過至少一個(gè)核苷或修飾的核苷與所述具有1至約5個(gè)鄰近的 式XIII的四氫吡喃核苷類似物的額外區(qū)域隔開。如權(quán)利要求34-37中任一項(xiàng)所述的寡聚化合物，其包含至少兩個(gè)具有1至約5個(gè)鄰近 的式XIII的四氫吡喃核苷類似物的區(qū)域，所述區(qū)域通過至少一個(gè)核苷或修飾的核苷隔開。
41.如權(quán)利要求34-37或40中任一項(xiàng)所述的寡聚化合物，其包含有缺口的寡聚化合物， 其中，所述至少兩個(gè)具有鄰近的式XIII的四氫吡喃核苷類似物的區(qū)域中的一個(gè)位于5-端， 而所述至少兩個(gè)具有鄰近的式XIII的四氫吡喃核苷類似物的區(qū)域中的另一個(gè)位于3-端， 且其中所述兩個(gè)區(qū)域通過包含約6至約14個(gè)單體亞單元的內(nèi)部區(qū)域隔開，其中，各單體亞 單元獨(dú)立地為核苷或修飾的核苷。
42.如權(quán)利要求34-41中任一項(xiàng)所述的寡聚化合物，其中，至少一個(gè)核苷間連接基團(tuán)是 磷酸二酯核苷間連接基團(tuán)。
43.如權(quán)利要求34-41中任一項(xiàng)所述的寡聚化合物，其中，各核苷間連接基團(tuán)是硫代磷 酸酯核苷間連接基團(tuán)。
44.如權(quán)利要求34-43中任一項(xiàng)所述的寡聚化合物，其中，Q1> q2、q3、q4、q5、Q6和Q7各 自是H。
45.如權(quán)利要求34-43中任一項(xiàng)所述的寡聚化合物，其中，Q1> q2、q3、q4、q5、q6或q7中 的至少一個(gè)不是H。
46.如權(quán)利要求34-43或45中任一項(xiàng)所述的寡聚化合物，其中，Q1> q2、q3、q4、q5、Q6或 %中的至少一個(gè)是甲基。
47.如權(quán)利要求34-46中任一項(xiàng)所述的寡聚化合物，其中，各式XIII的四氫吡喃核苷類 似物具有式XIV的構(gòu)型<formula>formula see original document page 7</formula>
48.如權(quán)利要求34-44或47中任一項(xiàng)所述的寡聚化合物，其中，至少一個(gè)四氫吡喃核苷 類似物具有式XV:<formula>formula see original document page 7</formula>其中Bx是雜環(huán)堿基部分；和 R5 是 H、OCH3 或 F。
49.如權(quán)利要求34-44或47-48中任一項(xiàng)所述的寡聚化合物，其中，各四氫吡喃核苷類 似物具有式XV。
50.如權(quán)利要求49所述的寡聚化合物，其中，各R5是H。
51.如權(quán)利要求49所述的寡聚化合物，其中，各R5是0CH3。
52.如權(quán)利要求49所述的寡聚化合物，其中，各R5是F。
53.如權(quán)利要求34-52中任一項(xiàng)所述的寡聚化合物，其包含約10至約21個(gè)單體亞單元。
54.如權(quán)利要求34-52中任一項(xiàng)所述的寡聚化合物，其包含約10至約16個(gè)單體亞單元。
55.如權(quán)利要求34-52中任一項(xiàng)所述的寡聚化合物，其包含約10至約14個(gè)單體亞單元。
56.如權(quán)利要求15-55中任一項(xiàng)所述的寡聚化合物，所述化合物用于治療。
57.如權(quán)利要求56所述的寡聚化合物，其中，所述治療是治療以不希望的基因表達(dá)為 特征的疾病。
58.如權(quán)利要求56所述的寡聚化合物，其中，所述治療是通過抑制基因表達(dá)來治療疾病。
59.如權(quán)利要求56-58中任一項(xiàng)所述的寡聚化合物，其中，將動(dòng)物細(xì)胞與所述寡聚化合 物接觸。
60.如權(quán)利要求1-55中任一項(xiàng)所述的寡聚化合物在藥物制備中的應(yīng)用，所述藥物用于 治療以不希望的基因表達(dá)為特征的疾病。
61.如權(quán)利要求1-55中任一項(xiàng)所述的寡聚化合物在藥物制備中的應(yīng)用，所述藥物用于通過抑制基因表達(dá)來治療疾病。
62. 一種藥物組合物，所述藥物組合物包含如權(quán)利要求1-55中任一項(xiàng)所述的寡聚化合 物和藥學(xué)上可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明描述了四氫吡喃核苷類似物、由其制備的寡聚化合物以及使用該寡聚化合物的方法。更具體地，提供了具有一個(gè)或多個(gè)手性取代基的四氫吡喃核苷類似物，其可用于增強(qiáng)寡聚化合物的特性，包括核酸酶耐性和結(jié)合親和力。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的寡聚化合物與靶RNA的一部分雜交從而導(dǎo)致靶RNA喪失正常功能。
文檔編號C07H21/00GK101821277SQ200880111600
公開日2010年9月1日 申請日期2008年8月15日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月15日
發(fā)明者埃里克·E·斯威茲, 安德魯·M·西科夫斯基, 巴爾克利申·巴特, 撒扎·P·普拉卡什, 普內(nèi)特·P·塞思, 查爾斯·艾勒森 申請人:Isis藥物公司