專利名稱：選擇性富集翻譯后修飾的蛋白和/或肽的制作方法
選擇性富集翻譯后修飾的蛋白和/或肽發(fā)明主題本發(fā)明涉及通過使特定蛋白/肽標記方案與待分析 的翻譯后修飾的蛋白和/或肽 的特異性選擇進行組合，從復雜樣品中選擇性富集翻譯后修飾的蛋白和/或肽，其中所述 翻譯后修飾是糖基化。
背景技術：
從復雜樣品中鑒定、分離和分析特定蛋白或蛋白亞組對于揭示生物過程如何在分 子水平上發(fā)生、或者蛋白在各種細胞類型中或在生理狀態(tài)之間差異到何種程度是非常有價 值的。現(xiàn)代生物學中的主要挑戰(zhàn)涉及由生物編碼的整個蛋白組的表達、功能和調節(jié)的理 解，即通常稱為蛋白組學的技術領域。然而，因為不存在擴增蛋白的可能性，所以這個領域 中的研究一般是相當費力的，因為即使相對簡單的原核生物的細胞提取物也包含包括巨大 濃度范圍的多種蛋白。因此，此種任務超出任何目前簡單分析法的能力。因此，由于方法學限制，蛋白組分析不僅依賴于用于鑒定且定量蛋白的方法，還在 相當大的程度上也依賴于根據(jù)其結構和/或功能性質允許其精確和可靠分離的方法，其中 這些亞組隨后更易于進一步分析。蛋白組具有動態(tài)性質，響應細胞環(huán)境中的外界刺激或改變而具有蛋白合成、激活 和/或翻譯后修飾的改變。因此，蛋白組的固有復雜性超過細胞的基因組或轉錄組mRNA互 補序列的復雜性。由于在此種蛋白組學研究中待處理的非常大量的數(shù)據(jù)，所以蛋白/肽鑒定過程 需要巨大的分辨能力。通常用于分辨此種高度復雜混合物的兩種方法是二維凝膠電泳 (2D-GE;參見例如，0' Farrell, P. H. (1975) J. Biol. Chem. 250，4007-4021)和(二維) 液相層析((2D)-LC ；參見例如，Lipton，M.S.等人(2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99， 11049-11054)。通過2D-GE或2D-LC分離的肽和蛋白通常通過質譜法或通過測定氨基酸組 成和/或氨基酸序列進行鑒定。然而，盡管對于許多應用有用，但這些鑒定技術在要研究高度復雜樣品的蛋白質 組學研究方面具有主要缺點。例如，疏水膜蛋白質、高度堿性或酸性蛋白質、非常大或非常 小的蛋白質通常經(jīng)由2D-GE弱分辨。此外，這些方法的檢測(靈敏度)限制以及標記技術 中的缺陷不允許平行可靠分析多種樣品，例如用于比較不同疾病組、疾病的不同進展階段 之間，或疾病狀態(tài)與健康對照之間的相對蛋白水平或用于執(zhí)行高通量篩選分析。因此，高度希望開發(fā)克服上述局限性并且使得能夠平行處理多種復雜樣品的方 法。一般而言，特別是蛋白組學中，蛋白分析的另一個重要方面涉及研究翻譯后蛋白 修飾的可能性，翻譯后蛋白修飾可以影響蛋白的活性和結合并且改變其在細胞內的作用 (參見例如，Pandey，A.和 Mann，M. (2000)Nature 405,837-846)。例如，蛋白的(可逆)磷 酸化對于調節(jié)許多信號轉導級聯(lián)例如G蛋白偶聯(lián)的受體信號傳遞或磷酸-酪氨酸激酶信號 傳遞是關鍵的，蛋白糖基化在多細胞生物中的細胞/細胞和細胞/底物識別中起決定性作用，而遍在蛋白化對蛋白進行標記從而進行降解，等等。蛋白組學的獨特特征之一是翻譯后修飾可以在較總體的水平上進行研究，因此允 許分析包括特定修飾的整個蛋白亞組。單一基因的表達產物代表可能包含大量微異質性的 蛋白群體，每個不同狀態(tài)(即在翻譯后修飾的氨基酸殘基數(shù)目方面不同的類似蛋白)對那 種蛋白的表達概況增加大量多樣性。目前，存在幾種可用的技術，例如質譜法，由于特定修飾的存在或不存在，其在原 則上可以區(qū)分類似蛋白或肽。然而，由于有限的檢測靈敏度，這些改變通常在總體蛋白組學 研究中未觀察到。因此，為了研究特定翻譯后修飾，通常通過某些形式的親和純化而針對該 修飾富集樣品和/或從該樣品中分離富集的經(jīng)修飾的蛋白亞組將是有用的。然而，可用方 法一般受用合適親和標記物標記蛋白的需求或需要使用可能干擾進一步分析的特異性抗 體或其他試劑的阻遏。因此，基于親和純化的此種方法特別不適合于平行處理多種樣品。 此外，基于捕獲或親和純化方案來區(qū)分具有特定修飾的不同亞組的蛋白和/或肽 (例如，酪氨酸磷酸化的與絲氨酸/蘇氨酸磷酸化的蛋白或N-連接的糖蛋白與0-連接的糖 蛋白與糖基磷脂酰肌醇-錨著的蛋白)一般是麻煩的。蛋白糖基化的研究近年來已指數(shù)增長，這是由于來自各個學科的研究者已認識 至IJ，關鍵細胞功能受到此種類型的遍在翻譯后修飾類型的調節(jié)。重要的是，聚糖組成顯著反映細胞類型和狀態(tài)，例如物種、組織、發(fā)育階段等的差 異。此外，聚糖比核酸和蛋白具有高得多的發(fā)揮結構多樣性的潛能(Laine，R. Α. (1994) Glycobiology 4,759-767).糖組分的數(shù)目相對小，包括例如葡萄糖、N-乙酰葡糖胺、甘露 糖、半乳糖、N-乙酰半乳糖胺、L-巖藻糖、L-木糖、L-阿拉伯糖和N-乙酰神經(jīng)氨酸，但鍵和 分支的高度變化使糖基化可能是最復雜的翻譯后修飾。此外，顯示了細胞糖基化譜在腫瘤發(fā)生過程中顯著改變(例如在Caprioli， R.M. (2005) Cancer Res. 65，10642 10645中綜述)；因此，對可以作為腫瘤診斷的生物標記 物的腫瘤分泌的糖蛋白繼續(xù)進行研究。因此，持續(xù)需要關于允許從復雜樣品中選擇性富集翻譯后修飾的蛋白和/或肽的 方法。特別地，將希望提供不僅以高靈敏度還無需特定試劑的、用于分離和/或區(qū)分糖基化 蛋白和/或肽的方法。此外，還將希望提供允許進行多路分析的此種方法。發(fā)明目的和概述提供用于從復雜樣品中選擇性富集翻譯后修飾的肽和/或蛋白，特別是糖基化蛋 白和/或肽的新方法是本發(fā)明的一個目的。更具體而言，提供用于平行執(zhí)行多個此種分析 的方法是本發(fā)明的一個目的。提供允許使翻譯后修飾的蛋白和/或肽與其未經(jīng)修飾的對應物分離和/或區(qū)分這 些經(jīng)修飾的蛋白和/或肽的不同亞組是本發(fā)明的進一步目的。這些目的以及根據(jù)后續(xù)說明書將明確的其他目的通過獨立權利要求的主題實現(xiàn)。 本發(fā)明的一些優(yōu)選實施方案通過從屬權利要求的主題限定。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及用于從樣品選擇性富集和/或分離翻譯后修飾的 蛋白和/或肽的方法，包括(a)對樣品中包含的蛋白和/或肽進行單或雙化學標記；(b)捕獲翻譯后修飾的蛋白和/或肽的亞組，所述蛋白和/或肽的亞組包含要分析的特定翻譯后修飾；和(c)分離捕獲的翻譯后修飾的蛋白和/或肽的亞組，其中所述要分析的翻譯后修飾是糖基化。
在進一步的實施方案中，該方法進一步包括在進行步驟(a)之前和/或與進行步 驟(a)同時將蛋白切割成肽。在本發(fā)明方法的另一個優(yōu)選的實施方案中，雙化學標記包括同位素和同量異位素 標記。特別優(yōu)選地，在同量異位素標記前進行同位素標記。在一些實施方案中，在將蛋白切割成肽之前進行同位素標記。在分析糖基化蛋白和/或肽的情況下，步驟(b)典型地包括凝集素親和捕獲和糖 蛋白化學捕獲中的至少一種。在本發(fā)明方法的另一優(yōu)選實施方案中，步驟(C)包括從至少第一亞組的分離的翻 譯后修飾的蛋白和/或肽除去翻譯后修飾。典型地，化學或酶促除去翻譯后修飾。在進一步的優(yōu)選實施方案中，第一亞組的分離的翻譯后修飾的蛋白和/或肽包括 N-糖基化蛋白和/或肽。特別優(yōu)選地，通過肽N-糖苷酶F，從所述N-糖基化蛋白和/或 肽酶促除去糖基化。在本發(fā)明方法的另一實施方案中，在進行步驟(C)后，使蛋白分子的其余亞組進 行另外的步驟(a)-(c)的循環(huán)，并且其中步驟(c)包括從至少第二亞組的蛋白分子除去翻 譯后修飾。在一個特定實施方案中，第二亞組的分離的翻譯后修飾的蛋白和/或肽包括C-糖 基化蛋白和/或肽。在另一實施方案中，該方法進一步包括通過質譜分析分離的蛋白和/或肽。在一 些實施方案中，該方法以高通量形式進行。本發(fā)明的方法可以用于進行定性和/或定量蛋白組分析。根據(jù)下文詳述可以明確本發(fā)明的其他實施方案。圖例

圖1描述了選擇性糖基化肽(糖肽)的本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案的示例性說 明。首先，使用同位素親和標簽(Isotope-coded AffinityTag)技術(ICAT)對給定樣品中 包含的蛋白進行同位素標記，并且進行酶促消化。隨后，使用用于相對和絕對定量的同量異 位素標記(Isobaric Tag for Relative and Absolute Quantitation)技術(iTRAQ)對所 得到的肽進行同量異位素標記。合并標記的糖基化肽，通過陽離子交換色譜進行捕獲。最 后，將糖基化的ICAT/iTRAQ肽和糖基化的iTRAQ肽與它們的非糖基化對應物分離。圖2描繪了用于選擇性富集糖基化肽的本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案的示例性說 明。在16O-或18O-標記的水(同位素標記)存在下酶促消化樣品中包含的蛋白。然后用 iTRAQ對得到的肽的各個合并物進行同量異位素標記。合并標記的糖基化肽，通過陽離子 交換層析捕獲。最后，將糖基化的160/180_標記的/iTRAQ肽與它們的非糖基化的對應物分 罔。圖3描繪了用于選擇性富集糖基化肽的本發(fā)明的另-優(yōu)選實施方案的示例性說 明。使蛋白進行圖1描述的相同標記程序以及涉及ICAT-肽(即含半胱氨酸的肽)的親和 選擇的兩倍捕獲/選擇程序和圖1和2描述的陽離子交換層析。然后，將糖基化的ICAT/iTRAQ肽與它們的非糖基化的對應物分離。發(fā)明詳述本發(fā)明基于出乎意料的下述發(fā)現(xiàn)使特定蛋白/肽方案與要分析的翻譯后修飾的 蛋白和/或肽的特異性選擇組合，允許從復雜樣品中快速和高度選擇性富集和/或分離所 述修飾的蛋白。此外，通過適應反應條件，相同方法還適合于區(qū)分具有特定翻譯后修飾的不 同蛋白亞組。在下文中舉例說明性描述的本發(fā)明可以適當?shù)卦诓淮嬖诒疚奈淳唧w公開的任何 一種或多種要素、一種或多種限定條件的情況下進行實踐。本發(fā)明將針對特定實施方案且參考特定附圖進行描述，但本發(fā)明并不限于其，而 僅受權利要求限制。所述附圖僅是示意性的而不是限制性的。在附圖中，為了舉例說明性目的，某些要 素的大小可能是放大的而未按比例描繪。當術語“包括”在本說明書和權利要求中使用時，它不排除其他要素或步驟。為了
本發(fā)明的目的，術語“由......組成”視為術語“包括”的一個優(yōu)選實施方案。如果在下文
中組定義為包括至少特定數(shù)目的實施方案，那么這還應理解為公開優(yōu)選僅由這些實施方案 組成的組。當提及單數(shù)名詞使用不定冠詞或定冠詞例如“一個”或“一種”、“該”時，這包括那 個名詞的復數(shù)，除非具體陳述其他事物。在本發(fā)明上下文中的術語“約”指本領域技術人員應當理解仍確保所討論特征的 技術效果的準確度區(qū)間。該術語一般指示與所指出的數(shù)值士 10%、且優(yōu)選士5%的偏差。此外，說明書和權利要求中的術語第一、第二、第三等用于區(qū)分相似要素，并且不 一定用于描述順序或時間次序。應當理解如此使用的術語在合適情況下是可互換的，并且 本文描述的本發(fā)明的實施方案能夠以除本文所述或舉例說明外的其他順序操作。更多的術語定義將在下文中使用術語的上下文中給出。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及從樣品選擇性富集和/或分離翻譯后修飾的蛋白 和/或肽的方法，包括(a)對樣品中包含的蛋白和/或肽進行單或雙化學標記；(b)捕獲翻譯后修飾的蛋白和/或肽的亞組，所述蛋白和/或肽的亞組包含要分析 的特定翻譯后修飾；和(c)分離捕獲的翻譯后修飾的蛋白和/或肽的亞組，其中所述要分析的翻譯后修飾是糖基化。如本文所使用的，術語“蛋白”指包括經(jīng)由肽鍵連接的多個天然或修飾氨基酸的任 何天然存在或合成的(例如通過化學合成或重組DNA技術產生的)大分子。這種分子的長 度可以從2-數(shù)千個氨基酸(該術語因此也包括通常稱作寡肽的分子)。典型地，術語“蛋白”涉及長度超過20個氨基酸的分子。因此，要在本發(fā)明中分析 的蛋白可以具有約30至約2500個氨基酸、約50至約1000個氨基酸或約100至約1000個 氨基酸的長度。如本文所使用的，術語“肽”指上述“蛋白”在切割一個或多個肽鍵后獲得的任何 片段。如本發(fā)明中使用的肽不以任何方式在其大小或性質方面進行限制。典型地，要在本發(fā)明中分析的肽可以具有約2至約20個氨基酸、約3至約18個氨基酸或約5至約15個氨 基酸的長度。如本文所使用的，術語“翻譯后修飾”應當理解為不對蛋白和/或肽中包括的翻譯 后修飾的數(shù)目和/或類型進行限制。因此，給定蛋白在其序列中可以包括兩個或更多個糖 基化氨基酸，其可以是相同類型或不同類型(見下文)。
本文使用的術語“糖基化蛋白”(本文也稱作“糖蛋白”)和“糖基化肽”(本文也 稱作“糖肽”)是指任何在一級序列中包含一個或多個糖基化氨基酸殘基的蛋白和/或肽， 其中所述糖基化可以是N-糖基化、0-糖基化或糖基磷脂酰肌醇_錨著。本文使用的術語 “N-糖基化”(本文也稱作“N-連接的糖基化”)是指任何糖部分(即碳水化合物或糖部分， 包括單糖，如葡萄糖或半乳糖、二糖，如麥芽糖和蔗糖，以及寡糖或多糖)在天冬酰胺氨基 酸殘基的酰胺氮上的酶指導的和定點的添加，而本文使用的術語“0-糖基化”(本文也稱作 “0-連接的糖基化”)是指任何糖部分在絲氨酸或蘇氨酸氨基酸殘基的羥基氧上的酶指導 的和定點的添加。最后，本文使用的術語“糖基磷脂酰肌醇_錨著”(本文也稱作“GPI-錨 著”)是指在蛋白和/或肽的C-末端氨基酸上添加通過含碳水化合物的接頭(例如與磷酸 乙醇胺殘基連接的葡糖胺和甘露糖)連接的疏水磷脂酰肌醇基團，其中磷脂酰肌醇基團內 的兩個脂肪酸將蛋白錨著于細胞膜。在本發(fā)明的范圍內，通過翻譯后蛋白修飾可以體內發(fā) 生氨基酸糖基化，或通過采用特異性糖基轉移酶可以體外發(fā)生氨基酸糖基化。借助于本發(fā)明的方法從包括糖蛋白和/或糖肽的樣品，優(yōu)選從生物樣品富集和/ 或分離糖蛋白和/或糖肽。如本文所使用的，術語“樣品”不意指在執(zhí)行本發(fā)明的方法前必 須包括或排除任何處理步驟。樣品可以是未經(jīng)處理的(“粗”)樣品、提取的蛋白級分、純化 的蛋白級分等。例如，所采用的樣品可以通過一個或多個亞組的充足蛋白的免疫耗竭進行 預處理。合適樣品包括原核生物(例如細菌或病毒樣品)或真核生物來源(例如真菌、酵 母、植物、無脊椎動物、哺乳動物且特別是人樣品)的樣品。如本文所使用的，術語“復雜樣品，，指下述事實使用本發(fā)明的方法分析的樣品典 型地包括大量不同蛋白和/或肽(或此種蛋白和/或肽的不同變體)，其以不同濃度存在。 例如，本發(fā)明內的復雜樣品可以包括至少約500、至少約1000、至少約5000或至少約10000 種蛋白和/或肽。本發(fā)明中使用的典型復雜樣品尤其包括原核生物或真核生物來源的細胞 提取物或裂解物以及人或非人體液例如全血、血清、血漿樣品等。如本文所使用的，術語“化學標記”指一種或多種可檢測標記物(或“標記”)連 接于或摻入本發(fā)明中使用的蛋白和/或肽內。如本文所使用的，術語“可檢測標記物”指包 括一種或多種合適化學物質或酶的任何化合物，其在化學、物理或酶促反應中直接或間接 產生可檢測化合物或信號。如本文所使用的，該術語應當理解為包括像這樣的標記(即與 蛋白和/或肽結合的化合物或部分)以及標記試劑(即在與肽或蛋白結合前的化合物或部 分)。在本發(fā)明中使用的標記可以經(jīng)由共價或非共價鍵與蛋白和/或肽的氨基酸殘基連接。 典型地，鍵是共價鍵。標記可以選自同位素標記、同量異位素標記、酶標記、有色標記、熒光 標記、生色標記、發(fā)光標記、放射性標記、半抗原、生物素、金屬絡合物、金屬和膠體金等，其 中同位素標記和同量異位素標記是特別優(yōu)選的。所有這些類型的標記是本領域充分建立 的。如本文所使用的，術語“單標記”指蛋白和/或肽由僅一類標記，例如僅同量異位素標記的一個或多個可檢測標記物進行標記。如本文所使用的，術語“雙標記”指蛋白和/ 或肽由兩個不同類型標記，例如同位素標記和同量異位素標記的一個或多個可檢測標記物 進行標記。
在本發(fā)明方法的一個優(yōu)選實施方案中，蛋白和/或肽是雙標記的。特別優(yōu)選地， 蛋白和/或肽的雙標記包括同位素標記和同量異位素標記，即同位素標記和同量異位素標 記各自的一個或多個分別連接于或摻入要分析的蛋白和/或肽。在本發(fā)明的范圍內，兩個 標記步驟可以以任何按順序的次序或同時執(zhí)行。然而，在本發(fā)明方法的典型實施方案中，同 位素標記在同量異位素標記前?？梢岳缤ㄟ^生長細胞的代謝標記(例如使用可商購的 SILAC(在細胞培養(yǎng)中用氨基酸進行穩(wěn)定的同位素標記)技術)、完整蛋白的標記(如ICAT 標記)、標記(例如16O-或18O-標記的水)存在下的蛋白消化和消化的肽的標記(例如iTRAQ 標記)，將穩(wěn)定的標記在多個樣品制備階段引入蛋白和/或肽。如本文所使用的，術語“同位素標記”指使用一組兩個或更多個標記進行的標記事 件，所述標記具有相同化學式但在一個或多個原子存在的同位素數(shù)目和/或類型方面彼此 不同，導致可以例如經(jīng)由質譜法檢測的標記的蛋白和/或肽質量方面的差異。換言之，由不 同同位素標記進行標記的在其他方面等同的蛋白和/或肽可以因此基于質量方面的差異 進行區(qū)別。雖然同量異位素標記(參見下文)在原則上構成特定類型的同位素標記，但在 本發(fā)明的上下文中，術語同位素標記將用于指并非同量異位素但可以因此基于其分子量區(qū) 分的標記。根據(jù)本發(fā)明的同位素標記的例子包括16O-或18O標記的水或同位素親和標簽 (ICAT)標記等等(參見 Gygi，S. P.等人(1999) Nat. Biotechnol. 17，994-999)。ICAT 試劑使 用3種功能元件用于選擇性標記還原的半胱氨酸氨基酸殘基的硫醇反應基團，允許選擇 性分離標記的肽的生物素親和標記，和同位素標記，其以兩種同位素形式合成，即“輕”(非 同位素)和“重”(利用例如2H或13C)形式。在本發(fā)明的范圍內，同位素標記可以在肽水平 上(例如通過在16O-或18O標記的水的存在下切割要分析的樣品中包含的蛋白)、或例如通 過采用商購可得的ICAT試劑(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)直接在蛋白水 平上(即在切割前)進行。如本文所使用的，術語“同量異位素標記”指使用具有相同結構和相同質量的一組 兩個或更多個標記進行的標記事件，所述標記在斷裂后釋放由于同量異位素標記內同位素 的差異分布而具有相同結構但在質量方面不同的特定片段。同量異位素標記典型地包括在 質譜法分析中在碰撞誘導的解離(CID，即片段釋放)后產生強標志離子的報道基團、和包 括特定補償數(shù)目同位素的平衡基團，以便確保報道基團和平衡基團的組合質量對于不同同 量異位素標記是恒定的。平衡基團可以在CID后從標記中釋放或不釋放。根據(jù)本發(fā)明的同量異位素標記的例子包括用于相對和絕對定量標記的同量 異位素標記物(iTRAQ)等等(參見 Ross，P. L.等人(2004)Mol. Cell. Proteomics 3， 1154-1169)。這種方法采用4種不同的iTRAQ試劑，其各自包含報道基團、平衡基團和與伯 胺基團(例如，賴氨酸氨基酸殘基的ε氨基)反應的肽反應基團。依賴于每種試劑中12C/13C 和160/180的不同同位素組合，報道基團具有114、115、116或117Da的質量。平衡基團在質 量方面從31到28Da不等，以確保報道基團和平衡基團的組合質量對于4種試劑保持恒定 (145Da)。因此，相同肽由這些試劑中的每一種進行標記，得到這樣的肽其是同量異位的，并且因此例如在液相層析中共洗脫，并且因而彼此無法層析區(qū)別。然而，在質譜法過程中， 至少各自的報道基團在CID后釋放，顯示114至117Da的不同質量。這些片段的強度可以 用于在單次分析中對各個蛋白和/或肽進行定量。
本發(fā)明特別涉及組合使用同位素標記和同量異位素標記來進行多路蛋白分析， 艮口，用于平行進行多種分析，例如，2、4、8或16個平行樣品。特別地，所述組合的標記策略也 使得能夠比較不同樣品之間的相對蛋白水平。同位素和同量異位素標記的組合物可以具有 以下優(yōu)點即，僅僅需要例如通過MALDI-MS/MS分析或iTRAQ定量來特異性分析觀察到差異 表達水平的那些肽，由此得到更快和較不復雜的樣品分析。在優(yōu)選實施方案中，該方法進一步包括在標記蛋白和/或肽之前或同時，將蛋白 切割為肽。在一些實施方案中，在蛋白的同位素標記之后(但在同量異位素標記之前)進 行蛋白切割。此種蛋白切割可以用化學(例如，經(jīng)由酸或堿處理，其采用化學物質例如溴化 氰、2-(2'-硝基苯磺?；?-3-甲基-3-溴-假吲哚(BNPS)、甲酸、羥胺、碘苯甲酸和2-硝 基-5-硫代氰基苯甲酸)或經(jīng)由本領域眾所周知的蛋白酶(包括胰蛋白酶、胃蛋白酶、凝血 酶、木瓜蛋白酶和蛋白酶K等)酶促實現(xiàn)。本文使用的術語“捕獲”是指用于鑒定和隨后富集和/或選擇特定糖蛋白和/或 糖肽亞組的程序，所述糖蛋白和/或糖肽要通過將所述糖蛋白和/或糖肽亞組共價或非共 價連接(由此固定)于合適的結合成員(例如合適的基質或樹脂；參見下文)的方式進行 分析，所述結合成員使得能夠將捕獲的翻譯后修飾的蛋白和/或肽與它們的未標記的對應 物進一步分離。任選地，結合成員可以附著于固體支持物如表面(例如順磁聚苯乙烯顆粒 或乳膠珠的表面)，所述固定促進隨后分離捕獲的蛋白和/或肽亞組。典型地，捕獲步驟至少包括親和純化或親和層析步驟，即，將翻譯后修飾的蛋白和 /或肽亞組連接(即捕獲)于對要選擇的蛋白和/或肽亞組具有特異性結合活性的結合成 員。但是，捕獲步驟也可以依賴于離子交換層析、大小排阻層析、疏水相互作用層析和/或 反相排阻層析中的一種或多種。在本發(fā)明的范圍內，也可以將相同或不同類型的兩個或更 多個捕獲步驟，例如兩個親和層析步驟(使用相同類型或不同類型的基質)或親和純化步 驟和離子交換層析進行組合。在一個優(yōu)選實施方案中，捕獲步驟包括凝集素親和捕獲和糖蛋白化學捕獲中的至 少一種。本文使用的“凝集素親和捕獲”是指采用凝集素作為結合成員的捕獲方案。本文使 用的術語“凝集素”是指植物、細菌、真菌和動物中發(fā)現(xiàn)的一類蛋白，已知其結合特定寡糖部 分(綜述于Lis，H.，和Sharon，N. (1998) Chem. Rev. 98,637 674)。與抗原-抗體結合親和力 不同，單糖和寡糖與大多數(shù)凝集素結合的親和常數(shù)在低微摩爾范圍，但也可以在毫摩爾范 圍內。對于親和捕獲目的，寡糖和凝集素這兩者自身的多價性質使這些相互作用對層析分 離有用。合適的凝集素包括a-sarciruriziruconcavalin A和鈣連接蛋白，等等。用于凝 集素親和捕獲的一些方案是本領域已知的(參見例如Kaji等(2003)Nat. Biotechnol. 21， 667-672 ；Hirabayashi，J. (2004) Glycoconj. J. 21,35 40 ；Drake, R. R.等(2006)Mol. Cell. Proteomics 5，1957-1967)。本文使用的術語“糖蛋白化學捕獲”是指用于糖蛋白的任何化學捕獲程序，但不涉 及使用凝集素。很多這些程序涉及離子交換層析步驟。一些程序是本領域充分確立的(參 見例如 Zhang, H. et al. (2003) Nat. Biotechnol. 21，660—666 ；Sun, B. et al. (2007)Mol.Cell. Proteomics 6，141-149)。典型地，在這些化學捕獲程序中，要分析的蛋白是單或雙化學標記的，并且例如通 過使用胰蛋白酶或任何其它蛋白酶切割成肽。將消化的肽溶解于終濃度為2mg/100y 1緩 沖液的偶聯(lián)緩沖液(IOOmM醋酸鈉，150mM NaCl, pH 5. 5)中。通過離心除去任何未溶解的 固體。將上清液用于后面的反應。首先通過加入IOmM高碘酸鈉(終濃度)并且在顛倒旋 轉下在暗處在室溫下將樣品溫育30分鐘，將碳水化合物的順式二醇基團氧化為醛。隨后， 加入20mM亞硫酸鈉(終濃度)用于猝滅，并且在室溫下將樣品溫育10分鐘，以便滅活任何 過量的氧化劑。
然后，通過在猝滅的樣品中引入終濃度為20mg/ml的酰胼樹脂(商購珠的形式) 而起始偶聯(lián)反應。通過形成共價腙鍵，將碳水化合物的醛基團與酰胼樹脂偶聯(lián)。為了確保 固體與液體的比是1 5，在樣品中加入適量的偶聯(lián)緩沖液。在顛倒旋轉下在37°C進行偶 聯(lián)反應過夜。隨后，分別用milliQ-純凈水、1. 5M NaCl、甲醇和乙腈將樹脂徹底和按順序洗滌兩 次。洗滌后是緩沖液交換步驟(即陽離子交換層析步驟)，以調節(jié)IOOmM NH4HCO3的終濃度。最后，在使用磁珠的情況下，例如通過離心或磁力分離，從樣品分離捕獲的翻譯后 修飾的蛋白和/或肽(即連接于結合成員和任選連接于任何固體支持物的蛋白和/或肽)。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，分離步驟包括從至少第一亞組的分離的翻譯后 修飾的蛋白和/或肽除去翻譯后修飾，這促進進一步分離，并且也允許在分離的翻譯后修 飾的蛋白和/或肽的不同亞組之間進行區(qū)分，其中要除去的翻譯后修飾是糖基化。本文使用的術語“至少第一亞組的分離的翻譯后修飾的蛋白和/或肽”應以這樣 的方式理解即，它可以涉及存在的分離的翻譯后修飾的蛋白和/或肽的總數(shù)或涉及其特 定部分。本文使用的術語“除去”是指要分析的翻譯后修飾的完全消除，例如通過化學裂解 或酶作用(也參見下文的討論)。因此，從至少一個亞組的分離的翻譯后修飾的蛋白和/或 肽除去翻譯后修飾，也導致它們從結合成員(任選從固體支持物)的釋放。優(yōu)選地，通過特定糖苷酶，化學(例如經(jīng)β -消除)或酶促除去翻譯后修飾。在本發(fā)明方法的一個優(yōu)選實施方案中，至少第一亞組的分離的糖蛋白和/或糖肽 包括N-糖基化蛋白和/或肽。從蛋白和/或肽除去N-連接的糖基修飾優(yōu)選可以通過以下方法實現(xiàn)用濃度為 500U(1 μ l)PNGase F/2_6mg粗蛋白的肽N-糖苷酶F(PNGase F)在37°C下從糖基部分酶 促切割N-連接的肽過夜。PNGase F是一種酰胺酶，其在最內部的GIcNAC和天冬酰胺殘基 之間，從N-連接的糖蛋白切割出高甘露糖、雜合和復雜寡糖?？梢酝ㄟ^離心收集含釋放的 去糖基化肽的上清液。因此，該程序使得能夠選擇性區(qū)分N-糖基化的蛋白和/或肽與其它 類型的糖蛋白和/或糖肽(即分別是0-糖基化的和GPI錨著的蛋白和/或肽)。盡管PNGase F去糖基化從糖肽除去糖部分，仍然可以通過質譜分析檢測糖基化位 點，因為對于每個天冬酰胺，PNGase F去糖基化得到天冬氨酸(相應于+IDa的質量差異)。在另一個典型的實施方案中，本發(fā)明的方法，特別是分離步驟，進一步包括在進行 步驟(c)后使其余的蛋白分子亞組進行另外的步驟(a)-(c)的循環(huán)，其中步驟(c)包括從 至少第二亞組的蛋白分子除去翻譯后修飾。在本發(fā)明方法的另一優(yōu)選實施方案中，至少第二亞組的分離的糖蛋白和/或糖肽包括O-糖基化蛋白和/或肽?？梢酝ㄟ^采用特定0-糖苷酶的酶促裂解或化學方法例如通過β-消除(S卩，本領 域充分確立的一類消除反應，其中從底物的兩個相鄰原子除去原子或原子基團，同時形成 η鍵)，實現(xiàn)從蛋白和/或肽除去0-連接的糖基修飾。在其它實施方案中，該方法進一步包括通過質譜分析分離的翻譯后修飾的蛋白和 /或肽，質譜是一種用于測量離子的質量與電荷比的分析技術。采用的具體質譜分析可以取 決于不同樣品中確定的蛋白和/或肽表達的水平。在一些實施方案中，以高通量形式執(zhí)行 本發(fā)明的方法。在進一步的實施方案中，本發(fā)明涉及本文描述的方法用于進行定性和/或定量蛋 白組分析的用途。盡管針對某些優(yōu)選實施方案描述了上述發(fā)明，但這不以任何方式限制本發(fā)明的范 圍。本領域技術人員清楚地知道進一步的實施方案和關于先前所述實施方案的改變仍在本 發(fā)明的范圍內。
實施例 實施例1按照制造商的說明書，分別使用商購的試劑ICAT和iTRAQ進行要分析的樣品中包 含的蛋白的同位素和同量異位素標記。在進行ICAT標記后，在加入iTRAQ試劑前，將蛋白 酶促切割為肽?；蛘?，通過標記一半的樣品進行同位素標記步驟，所述標記是通過蛋白酶介 導的、將16O或18O摻入樣品中存在的肽的C末端中而進行的。隨后，使雙標記的肽進行糖肽捕獲程序。將干燥的胰蛋白酶消化的肽溶解于終濃 度為2mg/100y 1緩沖液的偶聯(lián)緩沖液(IOOmM醋酸鈉，150mM NaCl,pH 5. 5)中。通過離心 除去任何未溶解的固體。將上清液用于后面的反應。首先通過加入IOmM高碘酸鈉(終濃度)并且在顛倒旋轉下在暗處在室溫下將樣 品溫育30分鐘，將碳水化合物的順式二醇基團氧化為醛。隨后，加入20mM亞硫酸鈉(終濃 度)，并且在室溫下將樣品溫育10分鐘，以便滅活樣品中任何過量的氧化劑。通過在猝滅的樣品中引入終濃度為20mg/ml的商購酰胼樹脂(珠)而起始偶聯(lián)反 應。為了確保固體與液體的比是1 5，在樣品中加入適量的偶聯(lián)緩沖液。在顛倒旋轉下 在37°C進行偶聯(lián)反應過夜。隨后，分別用milliQ-純凈水、1. 5M NaCl、甲醇和乙腈將樹脂徹 底和按順序洗滌兩次。洗滌后是緩沖液交換步驟(即陽離子交換層析步驟)，以調節(jié)IOOmM NH4HCO3的終濃度。用濃度為500U(Iul)PNGase F/2_6mg粗蛋白的肽N-糖苷酶F(PNGase F)在37°C 下從糖基部分酶促切割N-連接的肽過夜。PNGase F是一種酰胺酶，其在最內部的GIcNAC 和天冬酰胺殘基之間，從N-連接的糖蛋白切割出高甘露糖、雜合和復雜寡糖。通過離心收 集含釋放的去糖基化肽的上清液，與80%乙腈洗滌的上清液合并。此后，干燥溶液，用0. 甲酸中的乙腈重配，并且進行質譜(MS)分析。該程 序僅僅選擇N-連接的糖肽。盡管PNGase F去糖基化從糖肽除去糖部分，仍然可以通過質 譜分析檢測糖基化位點，因為對于每個天冬酰胺，PNGase F去糖基化得到天冬氨酸?；蛘撸?可以通過特定0-糖苷酶或通過化學裂解，例如β -消除，選擇性切割0-連接的糖肽。
權利要求
用于從樣品選擇性富集和/或分離翻譯后修飾的蛋白和/或肽的方法，包括(a)對樣品中包含的蛋白和/或肽進行單或雙化學標記；(b)捕獲翻譯后修飾的蛋白和/或肽的亞組，所述蛋白和/或肽的亞組包含要分析的特定翻譯后修飾；和(c)分離捕獲的翻譯后修飾的蛋白和/或肽的亞組，其中所述要分析的翻譯后修飾是糖基化。
2.權利要求1的方法，進一步包括在進行步驟(a)之前和/或與進行步驟(a)同時 將蛋白切割成肽。
3.權利要求1或2的任一項的方法，其中雙標記包括同位素和同量異位素標記。
4.權利要求3的方法，其中在同量異位素標記之前進行同位素標記。
5.權利要求3或4的方法，其中在將蛋白切割成肽之前進行同位素標記。
6.權利要求1-5的任一項的方法，其中步驟(b)包括凝集素親和捕獲和糖蛋白化學捕 獲中的至少一種。
7.權利要求1-6的任一項的方法，其中步驟(c)包括從至少第一亞組的分離的翻譯后 修飾的蛋白和/或肽除去翻譯后修飾。
8.權利要求7的方法，其中化學或酶促除去翻譯后修飾。
9.權利要求7或8的方法，其中第一亞組的分離的翻譯后修飾的蛋白和/或肽包括 N-糖基化蛋白和/或肽。
10.權利要求9的方法，其中通過肽N-糖苷酶F，酶促除去糖基化。
11.權利要求7-10的任一項的方法，其中在進行步驟(c)后，使蛋白分子的其余亞組進 行另外的步驟(a)-(c)的循環(huán)，并且其中步驟(c)包括從至少第二亞組的蛋白分子除去翻 譯后修飾。
12.權利要求11的方法，其中第二亞組的分離的翻譯后修飾的蛋白和/或肽包括C-糖基化蛋白和/或肽。
13.權利要求1-12的任一項的方法，進一步包括通過質譜分析分離的蛋白和/或肽。
14.權利要求1-13的任一項的方法，其中該方法以高通量形式進行。
15.權利要求1-14的任一項的方法用于進行定性和/或定量蛋白組分析的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過使特定蛋白/肽標記方案與待分析的翻譯后修飾的蛋白和/或肽的特異性選擇進行組合，從復雜樣品中選擇性富集翻譯后修飾的蛋白和/或肽，其中所述翻譯后修飾是糖基化。
文檔編號C07K1/14GK101874037SQ200880117644
公開日2010年10月27日 申請日期2008年11月17日 優(yōu)先權日2007年11月26日
發(fā)明者E·P·羅米恩, H·M·維澤, R·霍夫曼 申請人:皇家飛利浦電子股份有限公司