專利名稱：通過陽離子交換層析進行的抗體純化的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一般而言，本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)純化。具體而言，本發(fā)明涉及一種使用陽離子交換層 析自包含抗體和至少一種污染物的組合物純化所述抗體的方法，其中在使用電導率升高的 洗脫緩沖液來洗脫期望抗體之前使用高PH清洗步驟來清除污染物。
背景技術(shù)：
大規(guī)模的、經(jīng)濟的蛋白質(zhì)純化日益成為生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的重要問題。一般而言，通過 細胞培養(yǎng)來生產(chǎn)蛋白質(zhì)，使用通過插入含有感興趣蛋白質(zhì)的基因的重組質(zhì)粒而改造成生成 該蛋白質(zhì)的真核或原核細胞系。由于通常所使用的細胞是活的有機體，因此必須給它們進 料含有糖、氨基酸、和生長因子(通常自動物血清的制備物來供應(yīng))的復(fù)合生長培養(yǎng)基。將 期望的蛋白質(zhì)與進料給細胞的化合物混合物及與細胞自身的副產(chǎn)物分開至足以用作人治 療劑的純度提出了艱難的挑戰(zhàn)。用于自細胞碎屑純化蛋白質(zhì)的規(guī)程首先取決于蛋白質(zhì)表達的部位。一些蛋白質(zhì)能 自細胞直接分泌入周圍的生長培養(yǎng)基中，其它蛋白質(zhì)是胞內(nèi)制備的。對于后一類蛋白質(zhì)，純 化過程的第一步涉及裂解細胞，這可以通過多種方法來進行，包括機械剪切、滲壓震擾、或 酶處理。此類破壞將細胞的整個內(nèi)含物釋放入勻漿中，而且另外生成由于尺寸小而難以清 除的亞細胞碎片。這些一般通過差速離心或通過過濾來清除。由于蛋白質(zhì)生成運行的過程 中細胞的天然死亡和胞內(nèi)宿主細胞蛋白質(zhì)的釋放，直接分泌的蛋白質(zhì)存在同樣的問題，只 是程度較小。—旦獲得含有感興趣蛋白質(zhì)的澄清溶液，通常使用不同層析技術(shù)的組合來試圖將 它與細胞生成的其它蛋白質(zhì)分開。這些技術(shù)基于蛋白質(zhì)的電荷、疏水性程度、或大小將蛋 白混合物分開。這些技術(shù)每一種可利用數(shù)種不同層析樹脂，從而容許為所涉及的具體蛋白 質(zhì)精確剪裁純化方案。這些分離方法每一種的本質(zhì)是能使蛋白質(zhì)以不同速率沿長柱向下移 動，從而實現(xiàn)隨它們沿柱進一步向下移動時增大的物理分離，或者是能使蛋白質(zhì)選擇性粘 附至分離介質(zhì)，然后用不同溶劑差異洗脫。在一些情況中，當雜質(zhì)特異性粘附至柱而感興趣 蛋白質(zhì)不粘附至柱時，將期望蛋白質(zhì)與雜質(zhì)分開，也就是說，感興趣的蛋白質(zhì)存在于“流出 液”中。離子交換層析是常用于純化蛋白質(zhì)的一種層析技術(shù)。在離子交換層析中，溶質(zhì)表 面上帶電荷的部分(patch)受到附著于層析基質(zhì)的相反電荷的吸引，前提是周圍緩沖液的 離子強度低。一般通過提高緩沖液的離子強度(即電導率)以與溶質(zhì)競爭離子交換基質(zhì)帶 電荷的位點來實現(xiàn)洗脫。改變PH，由此改變?nèi)苜|(zhì)的電荷是實現(xiàn)溶質(zhì)洗脫的另一種方式。電 導率或PH的變化可以是逐漸的(梯度洗脫)或逐步的(分步洗脫)。在過去，這些變化是 漸進的；即，PH或電導率以單一方向升高或降低。
美國專利No. 6，339，142 ;6，417，355 ;6，489，447 ；和 7，074，404 (Basey et al.)記載了用于純化多肽的離子交換層析。美國專利No. 6，127，526 ；6，333，398 ；和 6, 797, 814 (Blank, G)記載了通過蛋白A層析來純化蛋白質(zhì)，諸如抗HER2抗體。美國申請 公開No. 2004/0082047中記載了通過離子交換層析來純化蛋白質(zhì)(諸如抗體)的方法。美國專利No. 5，110，913涉及通過于第一 pH 4. 6使抗體結(jié)合至離子交換樹脂， 于第二 pH 5. 5清洗，并于pH 6. 5洗脫抗體來純化水溶液中的抗體，其中這三個步驟的 溶液的離子強度保持恒定。Zhang et al.涉及人抗體的Q膜、陰離子交換層析(Zhang et al. "Q Membrane Chromatography Application forHuman Antibody Purification Process, "Poster presented at BioProduction, Oct. 26-27. Munich, Germany, 2004)。其它 關(guān)注蛋白質(zhì)純化的出版物包括Barnthouse et al. J. Biotech. 66 125-136 (1998) ；Blank et al.Bioseparation 10:65-71 (2001) ；Follman and Fahrner J.Chromatog. 1024 79-85(2004) ；Iyer et al. BioPharm 15(1) 14-16，18，20，53(2002) ；US 2004/0082047A1 ； EP 333, 574 ；EP460, 426 Bl ；EP 556, 083 ；WO 89/05157 ；WO 92/22653 ；WO 93/06217 ； W095/22389 ；WO 96/33208 ；WO 96/40883 ；US 4，753，894 ；US 4，966，851 ；US5, 110，913 ；US
5,112, 951 ；US 5, 115, 101 ；US 5, 118, 796 ；US 5, 169, 774 ；US5, 196, 323 ；US 5, 256, 769 ； US 5, 279, 823 ；US 5, 429, 746 ；US 5, 451, 662 ；US5, 525, 338 ；US 5, 677, 171 ；US
6,005, 081 ；US 6, 054, 561 ；US 6, 127, 526 ；US6, 267, 958 ；US 6, 339, 142 ；US 6，417，335 ； US 6, 489, 447 ；Adachi et al., Journal ofChromatography. Α. 763(1-2) 57-63 (Feb 28， 1997) ；Gagnon, P. , PurificationTools for Monoclonal Antibodies, Tucson Validated Biosystems, Inc. , Chapter 4, pps.57-86 (1996) ；Graf et al. , Bioseparation 4(1) 7-20(Feb 1994) ；Mhatre et al., Journal of Chromatography A 707(2) :225_231(Jul 21,1995) ；Neidhardt et al. , Journal of Chromatography 590(2) :255_261(1992); Protein PurificationApplications-A Practical Approach, Harris and Angal, IRL Press pps. 151-156 (1995) ；Sofer et al. 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O ；(c)用pH小于所述第一清洗緩沖液的第二清洗緩沖液清洗所述陽離子交換材料； 并(d)用電導率顯著(substantially)大于所述第二清洗緩沖液的洗脫緩沖液自所述陽離子交換材料洗脫所述抗體。優(yōu)選的是，所述抗體結(jié)合人CD20，諸如利妥昔單抗(rituximab)，或結(jié)合人血管內(nèi) 皮生長因子(VEGF)，諸如貝伐單抗(bevacizumab)。依照一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明關(guān)注一種用于自包含結(jié)合人CH20的抗體和 一種或多種污染物的組合物純化所述抗體的方法，所述污染物選自下組中國倉鼠卵巢蛋 白質(zhì)(CHOP)、浸出的(leached)蛋白A、DNA、和聚集的CD20抗體，該方法包括下述按序步 驟(a)將所述組合物加載到陽離子交換材料上，其中所述組合物處于約4. 0至約6. 0 WpH；(b)用pH約6. 8至約9. 0的第一清洗緩沖液清洗所述陽離子交換材料，其中所述 第一清洗緩沖液的PH為約6. 8至約9. 0 ；(c)用pH約5. 0至約6. 0的第二清洗緩沖液清洗所述陽離子交換材料；并(d)用pH約5. 0至約6. 0且電導率約lOmS/cm至約lOOmS/cm的洗脫緩沖液自所 述陽離子交換材料洗脫所述抗體。優(yōu)選的是，所述⑶20抗體是利妥昔單抗。一種另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及一種用于自包含結(jié)合人血管內(nèi)皮生長 因子(VEGF)的抗體和一種或多種污染物的組合物純化所述抗體的方法，所述污染物選自 下組細胞培養(yǎng)基成分、硫酸慶大霉素(Garamycin)、中國倉鼠卵巢蛋白質(zhì)(CHOP)、DNA、病 毒污染物、和聚集的VEGF抗體，該方法包括下述按序步驟(a)將所述組合物加載到陽離子交換材料上，其中所述組合物處于約4. 0至約6. 0 WpH；(b)用pH約6. 8至約8. 0的第一清洗緩沖液清洗所述陽離子交換材料；(c)用pH約5. 0至約6. 0的第二清洗緩沖液清洗所述陽離子交換材料；并(d)用pH約5. 0至約6. 0且電導率約lOmS/cm至約lOOmS/cm的洗脫緩沖液自所 述陽離子交換材料洗脫所述抗體。優(yōu)選的是，所述VEGF抗體是貝伐單抗。本發(fā)明還關(guān)注一種組合物，其在包含約25mM HEPES, pH約7. 8的緩沖液中包含利 妥昔單抗。另外，本發(fā)明提供了一種組合物，其在包含約25mM MOPS、pH約7. 0的緩沖液中包 含貝伐單抗。附圖簡述圖IA和IB提供了利妥昔單抗的重鏈(SEQ ID No. 1)和輕鏈(SEQ ID No. 2)的氨 基酸序列。鑒定了每個可變區(qū)中的每個框架區(qū)(FR1-4)和每個⑶R區(qū)(⑶R1-3)，正如人伽 馬1重鏈恒定序列和人卡帕輕鏈恒定序列。重鏈可變區(qū)(VH)在SEQ ID No. 3中。輕鏈可變 區(qū)(VL)在 SEQ ID No. 4 中。CDR 的序列標識符為:CDR Hl (SEQ ID No. 5)，CDR H2 (SEQ ID No. 6)，CDR H3(SEQ IDNo. 7),CDR Ll (SEQ ID No. 8)，CDR L2(SEQ ID No. 9)，和 CDR L3 (SEQ IDNo. 10)。圖2A和2B提供了貝伐單抗的重鏈(SEQ ID No. 11)和輕鏈(SEQ ID No. 12)的氨 基酸序列。每個可變區(qū)的末端以I I標示。重鏈可變區(qū)(VH)在SEQ ID No. 13中。輕鏈可變區(qū)(VL)在SEQ ID No. 14中。每個可變區(qū)中的三個⑶R均標有下劃線。⑶R的序列標識 符為CDR Hl (SEQ ID No. 15)，CDR H2 (SEQ IDNo. 16)，CDR H3 (SEQ ID No. 17)，CDR Ll (SEQ ID No. 18)，CDR L2 (SEQID No. 19)，和 CDR L3 (SEQ ID No. 20)。圖3提供了改良的利妥昔單抗工藝與最初的工藝相比，陽離子交換層析過程對宿 主細胞蛋白質(zhì)的清除的并行比較。用新的工藝實現(xiàn)了卓越的CHOP清除。發(fā)明詳述定義在本文中，術(shù)語“約”之后的數(shù)值范圍或量明確包括精確的范圍或精確的數(shù)值量。本文中要純化的“組合物”包含感興趣的抗體和一種或多種污染物。所述組合物 可以是“部分純化的”(即已經(jīng)進行過一個或多個純化步驟)或者可以是自生成抗體的宿主 細胞或生物體直接獲得的(例如所述組合物可以包含收獲的細胞培養(yǎng)液)。在用于本文時，“多肽”通常指具有多于約十個氨基酸的肽和蛋白質(zhì)。優(yōu)選的是， 所述多肽是哺乳動物蛋白質(zhì)，其例子包括腎素；生長激素，包括人生長激素和牛生長激 素；生長激素釋放因子；甲狀旁腺素；促甲狀腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰島素A 鏈；胰島素B鏈；胰島素原；促卵泡激素；降鈣素；黃體生成素；胰高血糖素；凝血因子，諸如 因子VIIIC、因子IX、組織因子、和von Willebrands因子；抗凝血因子，諸如蛋白C ；心房 鈉尿因子；肺表面活性劑；纖溶酶原激活物，諸如尿激酶或人尿或組織型纖溶酶原激活物 (t-PA)；鈴蟾肽；凝血酶；造血生長因子；腫瘤壞死因子-α和-β ；腦啡肽酶；RANTES(在 激活后受到調(diào)節(jié)，正常情況下由T細胞表達和分泌)；人巨噬細胞炎性蛋白(MIP-1-α)； 血清清蛋白，諸如人血清清蛋白；Muellerian抑制性物質(zhì)；松弛素A鏈；松弛素B鏈；松弛 素原；小鼠促性腺素相關(guān)肽；微生物的蛋白質(zhì)，諸如β-內(nèi)酰胺酶；DNA酶；IgE ；細胞毒性 T-淋巴細胞相關(guān)抗原(CTLA)，諸如CTLA-4 ；抑制素；激活素；血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)；激 素的或生長因子的受體；蛋白A或D ；類風濕因子；神經(jīng)營養(yǎng)因子，諸如骨衍生的神經(jīng)營養(yǎng) 因子(BDNF)，神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-3、-4、-5或_6(ΝΤ_3、ΝΤ-4、ΝΤ-5或ΝΤ-6)，或神經(jīng)生長因子， 諸如NGF-β ；血小板衍生生長因子(PDGF)；成纖維細胞生長因子，諸如aFGF和bFGF;表 皮生長因子(EGF)；轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)，諸如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β 1、TGF-β 2、 TGF- β 3、TGF- β 4 或 TGF- β5;胰島素樣生長因子-I 和-II (IGF- I 和 IGF- II )； des (1-3)-IGF- I (腦IGF- I )，胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白(IGFBP)；⑶蛋白，諸如⑶3、 ⑶4、⑶8、⑶19和⑶20 ；(促)紅細胞生成素；骨誘導因子；免疫毒素；骨形態(tài)發(fā)生蛋白 (BMP)；干擾素，諸如干擾素-α、- β和-γ ；集落刺激因子(CSF)，例如M-CSF、GM-CSF和 G-CSF ；白介素(IL)，例如IL-I至IL-10 ；超氧化物歧化酶；T細胞受體；表面膜蛋白；衰變 加速因子；病毒抗原，諸如例如AIDS被膜的一部分；轉(zhuǎn)運蛋白；歸巢受體；地址素；調(diào)節(jié)蛋 白；整聯(lián)蛋白，諸如⑶11a、⑶lib、⑶11c、⑶18、ICAM、VLA-4和VCAM ；腫瘤相關(guān)抗原，諸如 HER2、HER3或HER4受體；及任何上文所列多肽的片段和/或變體，以及結(jié)合任何上文所列 多肽的抗體，包括抗體片段。一種優(yōu)選的多肽是結(jié)合人CD20的完整抗體或抗體片段，例如 利妥昔單抗；或者結(jié)合人血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的完整抗體或抗體片段，例如貝伐單 抗?！拔廴疚铩敝概c期望的抗體產(chǎn)物不同的物質(zhì)。污染物包括但不限于宿主細胞 物質(zhì)，諸如中國倉鼠卵巢蛋白質(zhì)(CHOP)；浸出的蛋白Α;核酸；期望抗體的變體、片段、聚集物或衍生物；其它多肽；內(nèi)毒素；病毒污染物；細胞培養(yǎng)基成分(例如硫酸慶大霉素； GENTAMYCIN )等。短語“陽離子交換材料”指如下的固相，其帶負電荷且有游離陽離子供與流過 該固相的水溶液中的陽離子交換。所述電荷可以通過將一種或多種帶電荷的配體附著 至所述固相(例如通過共價連接)來提供?；蛘?另外，所述電荷可以是所述固相的 內(nèi)在特性(例如在硅土的情況中，其具有總體負電荷)。商品化的陽離子交換材料包括 羧甲基纖維素、BAKERB0NDABX 、在瓊脂糖上固定化的磺丙基(SP)(例如GE Healthcare 的 SP-SEPHAROSEFAST FLOW 、 SP-SEPHAROSE FAST FLOW XL 或 SP-SEPHAROSEHIGH PERFORMANCE )、CAPTO S (GE Healthcare)、FRACT0GEL-S03 、FRACTOGEL-SE HICAP 、 和FRACTOPREP (EMDMerck)、和在瓊脂糖上固定化的磺?；?例如GE Healthcare的 S-SEPHAROSEFAST FLOW )、和 SUPER Sp (Tosoh Biosciences)。本文中一種優(yōu)選的陽離子 交換材料包括經(jīng)磺丙基官能化多羥基化聚合物包被的交聯(lián)聚(苯乙烯-二乙烯基苯)流 通顆粒(cross-linked poly(styrene-divinylbenzene)flow-throughparticles(solid phase)coated with a polyhydroxylated polymer functionalizedwith sulfapropyl groups)(固相)(例如P0R0S 50 HS .層析樹脂)。“固相”指一種或多種帶電荷的配體能粘附的非水性基質(zhì)。固相可以是純化柱(包 括但不限于擴張床和填充床柱(expanded bed and packed bedcolumns))、離散顆粒的不連 續(xù)相、膜、或濾器等。用于形成固相的材料的例子包括多糖(諸如瓊脂糖和纖維素)和其它 物理穩(wěn)定的基質(zhì)諸如硅土(例如受控孔徑玻璃)、聚(苯乙烯-二乙烯基苯)、聚丙烯酰胺、 陶瓷顆粒及上述任一項的衍生物。術(shù)語“載荷”在本文中指加載到陽離子交換材料上的組合物。優(yōu)選的是，在加載要 純化的組合物之前用平衡緩沖液平衡陽離子交換材料?！熬彌_液”指通過其酸-堿成對成分的作用來抵抗pH變化的溶液。Buffers. A Guide for the Preparation and Use of Buffers in Biological Systems, Gueffroy, D.，Ed. Calbiochem Corporation (1975)中記載了取決于例如期望的緩沖液pH而可采用的 多種緩沖液?！捌胶饩彌_液”指用于在將包含感興趣抗體和一種或多種污染物的組合物加載到 陽離子交換材料上之前平衡陽離子交換材料的緩沖液。優(yōu)選的是，本文中的平衡緩沖液的 pH在約5. 0至約6. 0的范圍中，優(yōu)選約5. 5。優(yōu)選的是，本文中的平衡緩沖液的電導率在約 1至約8mS/cm、優(yōu)選約4至約8mS/cm、和最優(yōu)選約5至約8mS/cm的范圍中。任選的是，平衡 緩沖液包含鹽，諸如NaCl，例如約40mM至約80mM、優(yōu)選約60mM NaCl的量。術(shù)語“清洗緩沖液”在本文中用于指在加載組合物之后且在洗脫感興趣蛋白質(zhì)之 前流過陽離子交換材料的緩沖液。清洗緩沖液可用于自陽離子交換材料清除一種或多種污 染物，基本上不洗脫期望抗體產(chǎn)物。依照本文中發(fā)明的優(yōu)選實施方案，使用“第一清洗緩沖 液”和“第二清洗緩沖液”。在本文中，表述“第一清洗緩沖液”指具有相對于加載緩沖液和/或平衡緩沖液的 PH升高的pH的清洗緩沖液。第一清洗緩沖液在本文中可用于自陽離子交換材料洗脫一種 或多種污染物，基本上不自其洗脫感興趣的抗體產(chǎn)物。術(shù)語“第一”不應(yīng)解釋為排除在加載 緩沖液與第一清洗緩沖液之間使用一種或多種別的清洗或其它緩沖液。優(yōu)選的是，本文中的第一清洗緩沖液的PH在約6. 8至約9. 0的范圍中、優(yōu)選約7. 0至約8. 0、和最優(yōu)選pH約 7. 0或pH約7. 8。優(yōu)選的是，本文中的第一清洗緩沖液的電導率在約0. 01至約5mS/cm、優(yōu) 選約0. 1至約3mS/cm、和最優(yōu)選約0. 2至約2mS/cm的范圍中。任選的是，第一清洗緩沖液 中基本上不含鹽(諸如NaCl)。表述“第二清洗緩沖液”就本申請而言指在第一清洗緩沖液之后用于使陽離子交 換材料準備好洗脫感興趣抗體的清洗緩沖液。術(shù)語“第二”不應(yīng)解釋為排除在第一清洗緩 沖液與第二清洗緩沖液之間使用一種或多種別的清洗緩沖液或其它緩沖液。優(yōu)選的是，本 文中的第二清洗緩沖液的PH在約5. 0至約6. 0、優(yōu)選約5. 5的范圍中、和最優(yōu)選pH 5. 5。 優(yōu)選的是，本文中的第二清洗緩沖液的電導率在約0. 01至約5mS/cm、優(yōu)選約0. 1至約3mS/ cm、和最優(yōu)選約0. 5至約3. OmS/cm的范圍中。“洗脫緩沖液”用于自固相洗脫感興趣抗體。在本文中，洗脫緩沖液具有相對于第 二清洗緩沖液顯著(substantially)升高的電導率，使得期望抗體產(chǎn)物自陽離子交換材料 洗脫。優(yōu)選的是，洗脫緩沖液的電導率顯著大于加載緩沖液和每一種在前緩沖液(即平衡 緩沖液、第一清洗緩沖液、和第二清洗緩沖液)的電導率?！帮@著更大的”電導率意味著例 如該緩沖液具有比與它比較的組合物或緩沖液的電導率大至少2、3、4、5或6個電導率單位 (mS/cm)的電導率。在一個實施方案中，洗脫緩沖液的pH與平衡緩沖液和/或第二清洗緩 沖液的pH基本上相同。優(yōu)選的是，本文中的洗脫緩沖液的pH在約5. 0至約6. 0的范圍中、 優(yōu)選約5. 5、和最優(yōu)選pH 5.5。優(yōu)選的是，本文中的洗脫緩沖液的電導率在約lOmS/cm至約 100mS/cm、優(yōu)選約12mS/cm至約30mS/cm、和最優(yōu)選約12至約20mS/cm的范圍中。電導率升 高可通過向洗脫緩沖液添加鹽(諸如氯化鈉、乙酸鈉、氯化鉀)來實現(xiàn)。優(yōu)選的是，洗脫緩 沖液包含約100至約300mM NaCl、優(yōu)選約150mM至約200mM NaCl、例如約175mM NaCl或約 160mM NaCl?！霸偕彌_液”可用于再生陽離子交換材料，使得它能再使用。再生緩沖液具有自 陽離子交換材料清除基本上所有污染物和感興趣抗體所要求的電導率和/或PH。術(shù)語“電導率”指水溶液在兩個電極之間傳導電流的能力。在溶液中，電流通過離 子運輸來流動。因此，隨著水溶液中存在的離子的量越來越多，溶液會具有更高的電導率。 電導率的度量的基本單位是西門子(或歐姆)、歐姆(mS/cm)，而且可以使用電導率計來測 量，諸如各種型號的Orion電導率計。因為電解電導率是溶液中的離子攜帶電流的能力，所 以溶液的電導率可以通過改變其中的離子濃度來改變。例如，可以改變?nèi)芤褐芯彌_劑的濃 度和/或鹽(例如氯化鈉、乙酸鈉、或氯化鉀)的濃度來實現(xiàn)期望的電導率。優(yōu)選的是，更 改各種緩沖液的鹽濃度來實現(xiàn)期望的電導率。自包含抗體和一種或多種污染物的組合物“純化”所述抗體指通過自所述組合物 清除(完全地或部分地)至少一種污染物來提高所述抗體在所述組合物中的純度?！凹兓?步驟”可以是產(chǎn)生“均質(zhì)”組合物的整個純化過程的一部分?！熬|(zhì)的”在本文中用于指包含 至少約70% (以重量計)感興趣抗體(基于組合物總重)、優(yōu)選至少約80% (以重量計)、 更優(yōu)選至少約90% (以重量計)、甚至更優(yōu)選至少約95% (以重量計)的組合物。使某分子“結(jié)合”至陽離子交換材料指在適宜條件(pH和/或電導率)下將所述 分子暴露于所述陽離子交換材料，使得所述分子依靠所述分子與所述陽離子交換材料的帶 電荷基團之間的離子相互作用在所述陽離子交換材料中或上可逆固定化。
“清洗”陽離子交換材料指使適宜的緩沖液流過陽離子交換材料。自陽離子交換材料“洗脫”某分子(例如抗體或污染物)指自其清除所述分子。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，本文中要純化的抗體是重組抗體。“重組抗體”指在 經(jīng)編碼所述抗體的核酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染或者因同源重組而生成所述抗體的宿主細胞中生成的 抗體?！稗D(zhuǎn)化”和“轉(zhuǎn)染”可互換使用，指將核酸導入細胞中的過程。轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染后，該核酸 可整合入宿主細胞基因組中，或者可作為染色體外元件存在?！八拗骷毎卑w外細胞培 養(yǎng)物中的細胞以及宿主動物內(nèi)的細胞。例如美國專利No. 5，534，615記載了用于重組生產(chǎn) 多肽的方法，通過述及明確收入本文。起始多肽的“變體”或“氨基酸序列變體”指包含與起始多肽不同的氨基酸序列 的多肽。一般而言，變體會與天然多肽擁有至少80%序列同一性，優(yōu)選至少90%序列同 一性，更優(yōu)選至少95%序列同一性，和最優(yōu)選至少98%序列同一性。百分比序列同一性 在比對序列以提供最大同源性后通過例如Fitch et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 1382-1386(1983)，Needleman et al.，J. Mol. Biol. 48 443-453 (1970)記載的算法版本來 確定。多肽的氨基酸序列變體可以通過將適宜的核苷酸變化引入編碼所述多肽的DNA或 者通過肽合成來制備。此類變體包括例如感興趣多肽的氨基酸序列內(nèi)的殘基刪除和/或 插入和/或替代。進行刪除、插入、和替代的任何組合來實現(xiàn)最終的構(gòu)建物，前提是所述最 終構(gòu)建物擁有期望的特征。氨基酸變化還可改變多肽的翻譯后加工，諸如改變糖基化位點 的數(shù)目或位置。其它翻譯后修飾包括脯氨酸和賴氨酸的羥基化，絲氨酰、蘇氨酰或酪氨酰 殘基的羥基的磷酸化，賴氨酸、精氨酸和組氨酸側(cè)鏈的a-氨基的甲基化(T. E. Creighton， Proteins Structure andMolecular Properties, ff. H. Freeman & Co. , San Francisco, PP. 79-86(1983))。例如美國專利No. 5，534，615記載了用于生成多肽氨基酸序列變體的方 法，通過述及明確收入本文。術(shù)語“抗體”以最廣義使用，明確覆蓋單克隆抗體(包括全長單克隆抗體)、多克隆 抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、及抗體片段，只要它們展現(xiàn)出期望的結(jié)合特異 性。本文中的抗體針對感興趣的“抗原”。優(yōu)選的是，所述抗原是在生物學上重要的多 肽，而且對患有疾病或病癥的哺乳動物施用所述抗體能在該哺乳動物中產(chǎn)生治療好處。然 而，還涵蓋針對非多肽抗原(諸如腫瘤相關(guān)糖脂抗原；參見美國專利5，091，178)的抗體。 在抗原是多肽的情況中，它可以是跨膜分子(例如受體)或配體(諸如生長因子)。例示性 的抗原包括上文討論的那些多肽。本發(fā)明所涵蓋的抗體的優(yōu)選分子靶物包括CD多肽，諸如 CD3、CD4、CD8、CD19、CD20 和 CD34 ；HER 受體家族的成員，諸如 EGF 受體(HER1)、HER2、HER3 或 HER4 受體；細胞粘附分子，諸如 LFA-l、Macl、pl50、95、VLA-4、ICAM-1、VCAM 禾P av/b3 整 聯(lián)蛋白包括其a或b亞基(例如抗⑶11a、抗⑶18或抗⑶lib抗體)；生長因子，諸如VEGF ； IgE ；血型抗原；flk2/flt3受體；肥胖癥(0B)受體；mpl受體；CTLA-4 ；多肽C等?？梢允褂?可溶性抗原或其片段(任選偶聯(lián)至其它分子)作為免疫原來生成抗體。對于跨膜分子，諸 如受體，可以使用這些的片段(例如受體的胞外域)作為免疫原?；蛘撸梢允褂帽磉_跨膜 分子的細胞作為免疫原。此類細胞可衍生自天然來源(例如癌細胞系)或者可以是已經(jīng)通 過重組技術(shù)轉(zhuǎn)化以表達跨膜分子的細胞。本文中要純化的抗體的例子包括但不限于HER2抗體，包括曲妥珠單抗(trastuzumab) (HERCEPTIN ) (Carter et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 4285-4289 (1992)，美國專利 No. 5，725，856)和帕妥珠單抗(pertuzumab) (OMNITARG ) (WOO 1/00245) ；CD20 抗體(見下文)；IL-8 抗體(St John et al. , Chest, 103 932(1993), 及國際公開No. W0 95/23865) ；VEGF或VEGF受體抗體，包括人源化的和/或親和力 成熟的VEGF抗體，諸如人源化VEGF抗體huA4. 6. 1貝伐單抗(AVASTIN )和攔你單 抗(ranibizumab) (LUCENTIS ) (Kim et al. , Growth Factors, 7 :53_64 (1992)， 國際公開 No. W0 96/30046，及 W0 98/45331,1998 年 10 月 15 日公布)；PSCA 抗體 (W001/40309) ；CDlla 抗體，包括依法利珠單抗(efalizumab) (RAPTIVA )(美國 專利 No. 5，622，700，W098/23761，St印pe et al. , Transplant Intl. 4 :3_7(1991)，及 Hourmant et al. , Transplantation 58 :377_380 (1994))；結(jié)合 IgE 的抗體，包括奧瑪珠 單抗(omalizumab) (XOLAIR ) (Presta et al.，J. Immunol. 151 :2623_2632 (1993)， 及國際公開No. W0 95/19181 ；美國專利No. 5，714，338，1998年2月3日公告或美國專 利No. 5,091, 313，1992年2月25日公告，W0 93/04173,1993年3月4日公布，或國際 申請 No. PCT/US98/13410,1998 年 6 月 30 日提交，美國專利 No. 5，714，338) ；CD18 抗體 (美國專利No. 5,622, 700,1997年4月22日公告，或W097/26912，1997年7月31日公 布)；Apo-2受體抗體抗體(W0 98/51793,1998年11月19日公布)；組織因子(TF)抗 體(歐洲專利No. 0 420 937 B1，1994年11月9日授權(quán))；a 4_ a 7整聯(lián)蛋白抗體(TO 98/06248，1998年2月19日公布)；EGFR抗體(例如嵌合的或人源化的225抗體，西 妥昔單抗(cetuximab)，ERBUTIX ，W096/40210，1996 年 12 月 19 日公布)；CD3 抗 體，諸如0KT3 (美國專利No. 4，515，893，1985年5月7日公告)；CD25或Tac抗體，諸 如 CHI-621 (SIMULECT )和 ZENAPAX (參見美國專利 No. 5，693，762，1997 年 12 月 2 日公告)；CD4 抗體，諸如 cM-7412 抗體(Choy et al. Arthritis Rheum 39(1) 52-56(1996)) ；CD52 抗體，諸如 CAMPATH_1H(ILEX/Berlex)(Riechmann et al. Nature 332 =323-337 (1988)) ；Fc 受體抗體，諸如針對 Fc y RI 的 M22 抗體(Graziano et al. J. Immunol. 155(10) =4996-5002 (1995))；癌胚抗原(CEA)抗體，諸如 hMN-14 (Sharkey et al. Cancer Res. 55 (23Suppl) :5935s_5945s (1995))；針對乳房上皮細胞的抗體，包 括 huBrE-3、hu-Mc 3 和 CHL6(Ceriani et al. Cancer Res.55(23) :5852s_5856s(1995); 及 Richman et al. Cancer Res. 55 (23Supp) :5916s_5920s (1995))；結(jié)合結(jié)腸癌細胞的 抗體，諸如 C242 (Litton et al. Eur J. Immunol. 26 (1) : 1-9 (1996)) ;CD38 抗體，例如 AT 13/5(Ellis et al. J. Immunol. 155(2) :925_937 (1995)) ；CD33 抗體，諸如 Hu M195(Jurcic et al. Cancer Res 55(23Suppl) :5908s_5910s (1995))和 CMA-676 或 CDP771 ;EpCAM 抗體，諸如17-1A (PANOREX )； GpIIb/IIIa抗體，諸如阿昔單抗(abciximab)或 c7E3Fab (REOPRO )； RSV 抗體，諸如 MEDI-493 (SYNAGIS ); CMV 抗體，諸如 PROTOVIR ； HIV抗體，諸如PR0542 ；肝炎抗體，諸如H印B抗體OSTAVIR ; CA 125 抗體OvaRex ；獨特型GD3表位抗體BEC2 ； a v 0 3抗體(例如VITAXIN ; Medimmune)；人 腎細胞癌抗體，諸如ch-G250 ；ING-1 ；抗人17-lAn抗體(3622W94)；抗人結(jié)腸直腸腫瘤抗體 (A33)；針對GD3神經(jīng)節(jié)苷脂的抗人黑素瘤抗體R24;抗人鱗狀細胞癌(SF-25)；人白細胞抗 原(HLA)抗體，諸如 Smart ID10 和抗 HLA DR 抗體 Oncolym(Lym-l) ；CD37 抗體，諸如 TRU016 (Trubion) ；IL-21 抗體(Zymogenetics/Novo Nordisk)；抗 B 細胞抗體(Impheron)； B 細胞靶向單抗(Immunogen/Aventis) ； 1D09C3 (Morphosys/GPC) ； LymphoRad 131 (HGS)； Lym-1 抗體，諸如 Lym-lY-90 (USC)或抗 Lym-10ncolym(USC/Peregrine) ；LIF226 (Enhanced Lifesci.) ；BAFF 抗體(例如 TO 03/33658) ；BAFF 受體抗體(參見例如 W0 02/24909)； BR3 抗體；Blys 抗體，諸如 belimumab ；LYMPH0STAT-B ；ISF 154 (UCSD/Roche/Tragen)； gomilixima(Idec 152 ；Biogen Idee) ；IL-6 受體抗體，諸如 atlizumab (ACTEMRA ;Chugai/ Roche) ；IL-15抗體，諸如HuMax-Il-15 (Genmab/Amgen)；趨化因子受體抗體，諸如CCR2抗 體(例如MLN1202 ；Millieneum)；抗補體抗體，諸如C5抗體(例如eculizumab，5G1. 1 ； Alexion)；人免疫球蛋白口服配制劑(例如 IgPO ;Protein Therapeutics) ；IL-12 抗體， 諸如 ABT-874 (CAT/Abbott) ；Teneliximab (BMS-224818 ；BMS) ；CD40 抗體，包括 S2C6 及 其人源化變體(W000/75348)和TNX 100 (Chiron/Tanox) ；TNF-a抗體，包括cA2或英夫 利昔單抗(inniximab) (REMICADE )、CDP571、MAK-195、阿達木單抗(adalimumab) (HUMIRA )、PEG 化 TNF-a 抗體片段，諸如 CDP-870 (Celltech)、D2E7 (Knoll)、抗 TNF-a 多克隆抗體(例如PassTNF ；Verigen) ；CD22抗體，諸如LL2或依帕珠單抗(印ratuzumab) (LYMPHOCIDE ; Immunomedics)，包括依帕珠單抗 Y-90 和依帕珠單抗 1-131、Abiogen 的 CD22 抗體(Abiogen, Italy)、CMC 544 (Wyeth/Celltech)、combotox (UT Soutwestern)、 BL22 (NIH)、和LympoScan Tc99 (Immunomedics)。優(yōu)選的是本文中純化的抗體是結(jié)合人CD20 的裸的、完整的抗體或結(jié)合人VEGF的裸的、完整的抗體。人“⑶20”抗原或“⑶20”是在超過90%來自外周血或淋巴樣器官的B細胞表面上 找到的約35kDa非糖基化磷蛋白。⑶20存在于正常B細胞以及惡性B細胞二者上，但在干 細胞上不表達。⑶20在文獻中的其它名稱包括“B淋巴細胞限制抗原”和“Bp35”。⑶20抗 原記載于例如 Clark et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82 :1766 (1985)。"CD20抗體拮抗劑”在本文中指在結(jié)合B細胞上的CD20后破壞或消減受試者中的 B細胞和/或干擾一項或多項B細胞功能的抗體，例如通過降低或阻止B細胞引發(fā)的體液應(yīng) 答?？贵w拮抗劑優(yōu)選能夠消減用它治療的受試者中的B細胞(即降低循環(huán)B細胞水平)。 這樣的消減可通過多種機制來實現(xiàn)，諸如抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)和/或補 體依賴性細胞毒性(CDC)、抑制B細胞增殖和/或誘導B細胞死亡(例如通過凋亡)。在用于本文時，“B細胞消減”指一般在藥物或抗體治療后，動物或人體中B細 胞水平與治療前水平相比的降低。B細胞消減可以是部分的或完全的。B細胞水平可 使用眾所周知的技術(shù)來測量，諸如Reff et al. , Blood 83:435-445(1994)或美國專利 No. 5, 736, 137 (Anderson et al.)中所記載的。舉例而言，可以用各種劑量的抗體或免疫粘 附素處理哺乳動物(例如正常的靈長類動物)，并可以測定外周B細胞濃度，例如通過對B 細胞計數(shù)的FACS方法。CD20抗體的例子包括“C2B8”，現(xiàn)在稱作“利妥昔單 抗”(rituximab) (RITUXAN )(美國專利 No. 5，736，137)；釔[90]標記的 2B8 鼠抗體， 稱作"Y2B8，，或"Ibritumomab Tiuxetan”(ZEVALIN )，可以從 IDEC Pharmaceuticals 公司購買(美國專利No. 5，736，137 ；2B8于1993年6月22日保藏于ATCC，編號HB11388)； 鼠IgG2a “B1，，，也稱作“Tositumomab”，任選用1311標記以產(chǎn)生“ 131I-B1 ”或“碘131 tositumomab”抗體(BEXXAR )，可以從Corixa購買(還可參見美國專利No. 5，595，721)；鼠單克隆抗體“1F5”(Press et al.，Blood69 (2) :584_591 (1987))及其變體，包括“框 架修補的”或人源化的 1F5 (W02003/002607, Leung, S. ； ATCC 保藏物 HB-96450)；鼠 2H7 和嵌合 2H7 抗體(美國專利 No. 5，677，180)；人源化 2H7(W0 2004/056312，Lowman et al.及下文所列)；2F2(HuMaX-⑶20)，一種完全人的高親和力抗體，靶向B細胞細胞膜中 的 CD20 分子(Genmab, Denmark ；參見例如 Glennie and van de ffinkel, DrugDiscovery Today 8 :503_510(2003) ；Cragg et al.，Blood 101 :1045_1052(2003) ；W0 2004/035607 ； US 2004/0167319) ；W0 2004/035607 和 US 2004/0167319 (Teeling et al.)中所列出的 人單克隆抗體；US 2004/0093621 (Shitara et al.)中所記載的Fc區(qū)結(jié)合有復(fù)雜N_糖 苷連接的糖鏈的抗體；諸如HB20-3、HB20-4、HB20-25和MB20-11的與CD20結(jié)合的單克 隆抗體和抗原結(jié)合片段(W02005/000901，Tedder et al.)；諸如AME系列抗體的CD20結(jié) 合分子，例如 W02004/103404 和 US 2005/0025764 (ffatkins et al.，Eli Lilly/Applied MolecularEvolution, AME)中所列出的 AME 33 抗體；諸如 US 2005/0025764 (ffatkins etal.)中所記載的CD20結(jié)合分子；A20抗體或其變體，諸如嵌合的或人源化的A20抗 體(分別是 cA20 和 hA20)或 IMMU-106 (US 2003/0219433，Immunomedics) ；CD20 結(jié)合 抗體，包括表位消減的Leu-16、1H4或2B8，任選偶聯(lián)有IL-2，如US 2005/0069545A1 和TO 2005/16969 (Carr et al.)中的；與CD22和CD20結(jié)合的雙特異性抗體，例如 hLL2xhA20 (W0 2005/14618，Changet al.)；單克隆抗體 L27、G28_2、93_1B3、B-C1 或 NU-B2，可以從國際白細胞分類研究組(International Leukocyte Typing Workshop)獲得 (Valentine et al.,于Leukocyte Typing III，McMichael 編，p. 440, Oxford University Press (1987) ； 1H4(Haisma et al.，Blood 92 184(1998))；抗 CD20 auristatin E 偶聯(lián) 物(SeattleGenetics)；抗 CD20-IL2 (EMD/Biovation/City of Hope)；抗 CD20 單抗療 法(EpiCyte)；抗CD20抗體TRU 015 (Trubion)。本文中優(yōu)選的CD20抗體是嵌合的、人源 化的或人的CD20抗體，更優(yōu)選利妥昔單抗、人源化2H7、2F2(Hu-Max-CD20)人CD20抗體 (Genmab)和人源化 A20 抗體或 IMMUN-106 抗體(Immunomedics)。為了本文中的目的，本文中的術(shù)語“利妥昔單抗”(rituximab)、“RITUXAN ’’、 和“C2B8”指一種結(jié)合人CD20抗原的重組嵌合抗體，如美國專利No. 5，736，137，Anderson et al中所記載的。此類抗體優(yōu)選包含如下的重鏈和輕鏈，所述重鏈包含⑶R HI (SEQ ID No. 5)、CDR H2 (SEQ ID No. 6)、CDR H3 (SEQ ID No. 7)，其中所述輕鏈優(yōu)選包含 CDR LI (SEQ ID No. 8)、CDR L2 (SEQ ID No. 9)、和 CDR L3 (SEQ ID No. 10)；優(yōu)選的是，所述重鏈包含如下 的重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)，所述重鏈可變區(qū)包含SEQID No. 3，而所述輕鏈可變 區(qū)包含SEQ ID No. 4 ；且最優(yōu)選包含如下的重鏈和輕鏈，所述重鏈包含SEQ ID No. 1 (有或 無C端賴氨酸殘基)，其中所述輕鏈優(yōu)選包含SEQ ID No. 2。這些術(shù)語明確包括變體形式， 諸如 Moorhouse et al. J. Pharm Biomed. Anal. 16 593-603 (1997)中所記載的。術(shù)語“人VEGF”在用于本文時指165個氨基酸的人血管內(nèi)皮細胞生長因子，及相關(guān) 的121個、189個和206個氨基酸的血管內(nèi)皮細胞生長因子，如Leunget al. , Science 246 1306(1989)；及 Houck et al.，Mol. Endocrin. 5 :1806 (1991)所述，及那些生長因子的天然 存在等位形式和加工形式。本發(fā)明提供了能夠抑制VEGF的一項或多項生物學活性(例如其促有絲分裂或血 管發(fā)生活性)的抗VEGF拮抗性抗體。VEGF的拮抗劑通過干擾VEGF結(jié)合細胞受體、通過使已經(jīng)被VEGF激活的細胞沒有能力或殺死已經(jīng)被VEGF激活的細胞、或通過干擾VEGF結(jié)合細 胞受體后血管內(nèi)皮細胞激活來起作用。為了本發(fā)明的目的，VEGF拮抗劑的所有這些干擾點 應(yīng)當視為等同的。為了本文中的目的，本文中的術(shù)語“貝伐單抗”(bevacizumab)、"AVASTIN "、 “F(ab)-12”和“rhuMAb VEGF”指一種結(jié)合人血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)抗原的重組人源 化單克隆抗體(rhuMAb VEGF)，如美國專利No. 7，169,901，Presta et al中所記載的。此 類抗體優(yōu)選包含如下的重鏈和輕鏈，所述重鏈包含⑶R HI (SEQ ID No. 15)、⑶R H2 (SEQ ID No. 16)、CDR H3 (SEQ ID No. 17)，其中所述輕鏈優(yōu)選包含 CDR LI (SEQ ID No. 18)、CDR L2 (SEQ ID No. 19)、和CDR L3 (SEQ ID No. 20)；最優(yōu)選的是，所述重鏈包含如下的重鏈可變 區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)，所述重鏈可變區(qū)包含SEQ ID No. 13，而所述輕鏈可變區(qū)包含 SEQ ID No. 14 ；且優(yōu)選包含如下的重鏈和輕鏈，所述重鏈包含SEQ ID No. 11 (有或無C端賴 氨酸殘基)，其中所述輕鏈優(yōu)選包含SEQ ID No. 12。這些術(shù)語明確包括重組抗體產(chǎn)物生產(chǎn) 期間形成的變體形式。術(shù)語“單克隆抗體”在用于本文時指從一群基本上同質(zhì)的抗體獲得的抗體，即構(gòu)成 群體的各個抗體相同，除了可能以極小量存在的可能的天然存在突變外。單克隆抗體是高 度特異性的，針對單一抗原性位點。此外，與典型的包含針對不同決定簇(表位)的不同抗 體的常規(guī)(多克隆)抗體制備物不同，每種單克隆抗體針對抗原上的單一決定簇。修飾語 “單克隆”指示抗體從基本上同質(zhì)的抗體群獲得的特征，不應(yīng)解釋為要求通過任何特定方法 來生成抗體。例如，要依照本發(fā)明使用的單克隆抗體可通過最初由Kohler et al. ,Nature 256 =495(1975)記載的雜交瘤方法來制備，或者可以通過重組DNA方法(參見例如美國專 利No. 4，816，567)來制備。在又一個實施方案中，可以從使用McCafferty et al. , Nature, 348:552-554(1990)所記載的技術(shù)構(gòu)建的噬菌體抗體庫分離“單克隆抗體”。Clackson et al.，Nature, 352 :624_628 (1991)和 Markset al.，J. Mol. Biol.，222 :581_597 (1991)分別 記載了使用噬菌體文庫分離鼠和人抗體。后續(xù)出版物記載了通過鏈改組(Marks et al., Bio/Technology, 10 :779_783 (1992))，以及組合感染和體內(nèi)重組作為構(gòu)建非常大的噬菌 體文庫的策略(ffaterhouse et al.，Nuc. Acids. Res. ,21 :2265_2266 (1993))，生成高親和 力(nM范圍)的人抗體。如此，這些技術(shù)是用于分離單克隆抗體的傳統(tǒng)單克隆抗體雜交瘤 技術(shù)的可行替代方法?；蛘?，現(xiàn)在有可能生成在缺乏內(nèi)源免疫球蛋白生成的情況下能夠在 免疫后生成人抗體完整全集的轉(zhuǎn)基因動物(例如小鼠)。例如，已經(jīng)記載了嵌合和種系突 變小鼠中抗體重鏈連接區(qū)(JH)基因的純合刪除導致內(nèi)源抗體生成的完全抑制。在此類種 系突變小鼠中轉(zhuǎn)移大量人種系免疫球蛋白基因?qū)е略诳乖艉笊扇丝贵w。參見例 如 Jakobovitset al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 2551 (1993) Jakobovits et al., Nature,362 255-258(1993) ；Bruggermann et al. , Year in Immuno. ,7 33(1993)；及 Duchosal et al. Nature 355:258(1992)。單克隆抗體在本文中明確包括“嵌合”抗體(免疫球蛋白)，其中重鏈和/或輕鏈的 一部分與衍生自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，而 鏈的剩余部分與衍生自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或 同源，以及此類抗體的片段，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學活性(美國專利No. 4，816，567 ； Morrison 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 :6851_6855 (1984))。
術(shù)語“高變區(qū)”在用于本文時指抗體中負責抗原結(jié)合的氨基酸殘基。高變區(qū)包含 來自“互補決定區(qū)”或“CDR”的氨基酸殘基(即輕鏈可變域中的殘基24-34(Ll)、50-56(L2) 和 89-97 (L3)及重鏈可變域中的殘基 31-35(H1)、50-65(H2)和 95-102 (H3) ； Kabat et al. , Sequences of Polypeptides of Immunologicallnterest,第 5 版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1991))和 / 或那些來自“高 變環(huán)”的殘基(即輕鏈可變域中的殘基26-32(Ll)、50-52(L2)和91_96(L3)及重鏈可變 域中的殘基 26-32(Hl)、53-55(H2)和 96_101(H3) ；Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196 901-917(1987))?！翱蚣堋被颉癋R”殘基指可變域中那些除此處定義的高變區(qū)殘基以外的殘 基。非人(例如鼠)抗體的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序 列的嵌合抗體。在極大程度上，人源化抗體指人免疫球蛋白(受體抗體)中的高變區(qū)殘基 用具有期望特異性、親和力和能力的非人物種(供體抗體)諸如小鼠、大鼠、兔或非人靈長 類動物的高變區(qū)殘基替換的免疫球蛋白。在有些情況中，將人免疫球蛋白的Fv框架區(qū)(FR) 殘基用相應(yīng)的非人殘基替換。此外，人源化抗體可包含在受體抗體中或在供體抗體中沒有 找到的殘基。進行這些修飾是為了進一步改進抗體的性能。一般而言，人源化抗體將包含 至少一個、通常兩個基本上整個如下的可變域，其中所有或基本上所有高變環(huán)對應(yīng)于非人 免疫球蛋白的高變環(huán)，且所有或基本上所有FR區(qū)是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗體任 選還將包含至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)。用于構(gòu)建人源化抗體的人可變域的選擇，包括輕鏈和重鏈二者，對于降低抗原性 非常重要。依照所謂的“最適”(best-fit)方法，用嚙齒類抗體的可變域序列對已知的人 可變域序列的整個文庫進行篩選。然后選擇與嚙齒類最接近的人序列作為人源化抗體的人 框架(FR) (Sims et al.，J. Immunol. 151 2296 (1993) ；Chothia et al.，J. Mol. Biol. 196 901(1987))。另一種方法使用由特定輕鏈或重鏈亞組的所有人抗體的共有序列衍生的特定框 架。同一框架可用于數(shù)種不同的人源化抗體(Carter et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 4285(1992) ；Presta et al.，J. Immunol. 151 :2623 (1993))。更為重要的是，抗體在人源化后保持對抗原的高親和力及其它有利的生物學特 性。為了實現(xiàn)這一目標，依照一種優(yōu)選的方法，通過使用親本和人源化序列的三維模型分析 親本序列和各種概念性人源化產(chǎn)物的方法來制備人源化抗體。三維免疫球蛋白模型是公眾 可獲得的，且為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉?？色@得圖解和顯示所選候選免疫球蛋白序列的可 能三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)的計算機程序。檢查這些顯示圖像容許分析殘基在候選免疫球蛋白序列行 使功能中的可能作用，即分析影響候選免疫球蛋白結(jié)合其抗原的能力的殘基。這樣，可從受 體和輸入序列中選出FR殘基并進行組合，從而獲得期望抗體特征，諸如對靶抗原的親和力 提高。一般而言，CDR殘基直接且最實質(zhì)地涉及對抗原結(jié)合的影響。“抗體片段”包含全長抗體的一部分，一般是其抗原結(jié)合或可變區(qū)?？贵w片段的 例子包括Fab、Fab'、F(ab‘ )2和Fv片段；雙抗體(diabody)；線性抗體；單鏈抗體分子； 及由抗體片段形成的多特異性抗體。已經(jīng)開發(fā)了用于生成抗體片段的多種技術(shù)。傳統(tǒng)上， 通過蛋白水解消化完整抗體來衍生這些片段(參見例如Morimoto et al. , Journal of Biochemical and Biophysical Methods24 :107—117(1992) ；Brennan et al. , Science229:81(1985))。然而，現(xiàn)在可直接由重組宿主細胞生成這些片段。例如，可從上文討論的 噬菌體抗體庫中分離抗體片段。或者，可直接從大腸桿菌回收Fab' _SH片段并化學偶聯(lián)以 形成 F(ab' )2 片段(Carter et al. , Bio/Technology 10:163-167(1992))。在另一個實 施方案中，使用亮氨酸拉鏈GCN4以促進F(ab' )2分子的裝配來形成F(ab‘ )2。依照另一 種方法，可直接從重組宿主細胞培養(yǎng)物分離F(ab' )2片段。用于生成抗體片段的其它技術(shù) 對于熟練從業(yè)人員將是顯而易見的。在其它實施方案中，所選擇的抗體是單鏈Fv片段(scFv)。參見W093/16185。“單 鏈Fv”或“sFv”抗體片段包含抗體的VH和\結(jié)構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu)域存在于一條多肽鏈上。 一般而言，F(xiàn)v多肽在VH與\結(jié)構(gòu)域之間進一步包含多肽接頭，其使得sFv能夠形成結(jié)合抗 原的期望結(jié)構(gòu)。關(guān)于scFv的綜述參見Pluckthun，于《The Pharmacology of Monoclonal Antibodies》，第 113 卷，Rosenburg 禾口 Moore 編，Springer-Verlag, New York,第 269-315 頁，1994。術(shù)語“雙抗體”指具有兩個抗原結(jié)合位點的小型抗體片段，該片段在同一條多肽鏈 (VH-VL)中包含相連的重鏈可變域(VH)和輕鏈可變域。通過使用過短的接頭使得同一條 鏈上的兩個結(jié)構(gòu)域之間不能配對，迫使這些結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補結(jié)構(gòu)域配對，從而產(chǎn) 生兩個抗原結(jié)合位點。雙抗體更完整的記載于例如EP 404, 097 ；W0 93/11161 Zollinger 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 =6444-6448 (1993)。表述“線性抗體”在遍及本申請使用時指Zapata et al. , Polypeptide Eng, 8(10) 1057-1062(1995)中所描述的抗體。簡言之，這些抗體包含一對串聯(lián)的Fd區(qū)段 (VH-CH1-VH-CH1)，其形成一對抗原結(jié)合區(qū)。線性抗體可以是雙特異性的或單特異性的?！岸嗵禺愋钥贵w”具有對至少兩種不同表位的特異性，其中所述表位通常來自不同 抗原。盡管此類分子通常只會結(jié)合兩種抗原(即雙特異性抗體，BsAb)，但是此表述在用于 本文時涵蓋具有額外特異性的抗體，諸如三特異性抗體。BsAb的例子包括一個臂針對腫瘤 細胞抗原而另一個臂針對細胞毒性觸發(fā)分子的BsAb，諸如抗Fc y RI/抗⑶15、抗pl85HEK2/ FcyRIII (CD16)、抗 CD3/ 抗惡性 B 細胞(1D10)、抗 CD3/ 抗 pl85HEK2、抗 CD3/ 抗 p97、抗 CD3/ 抗腎細胞癌、抗⑶3/抗0VCAR-3、抗⑶3/L-D1 (抗結(jié)腸癌)、抗⑶3/抗黑色素細胞刺激激素 類似物、抗EGF受體/抗⑶3、抗⑶3/抗CAMA1、抗⑶3/抗⑶19、抗⑶3/MoV18、抗神經(jīng)細胞 粘附分子(NCAM)/抗CD3、抗葉酸結(jié)合蛋白(FBP)/抗CD3、抗泛癌相關(guān)抗原(AM0C-31)/抗 CD3 ；一個臂特異性結(jié)合腫瘤抗原而另一個臂結(jié)合毒素的BsAb，諸如抗皂草素/抗Id-1、抗 ⑶22/抗皂草素、抗⑶7/抗皂草素、抗⑶38/抗皂草素、抗CEA/抗蓖麻毒蛋白A鏈、抗干擾 素-a (IFN-a)/抗雜交瘤獨特型、抗CEA/抗長春花生物堿類；用于轉(zhuǎn)變酶活化的前體藥物 的BsAb，諸如抗CD30/抗堿性磷酸酶(其催化磷酸絲裂霉素前體藥物轉(zhuǎn)變成絲裂霉素醇)； 可用作溶纖劑的BsAb，諸如抗血纖維蛋白/抗組織型纖溶酶原激活物(tPA)、抗血纖維蛋白 /抗尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)；用于將免疫復(fù)合物靶向細胞表面受體的BsAb，諸如抗 低密度脂蛋白(LDL)/抗Fc受體(例如FcyRI或FCYRIII)；用于傳染病治療的BsAb，諸 如抗⑶3/抗單純皰疹病毒(HSV)、抗T細胞受體CD3復(fù)合物/抗流感、抗Fc Y R/抗HIV ；用 于體外或體內(nèi)腫瘤檢測的BsAb，諸如抗CEA/抗E0TUBE、抗CEA/抗DPTA、抗pl85HEK2/抗半抗 原；作為疫苗佐劑的BsAb ；及作為診斷工具的BsAb，諸如抗家兔IgG/抗鐵蛋白、抗辣根過 氧化物酶(HRP) /抗激素、抗促生長素抑制素/抗物質(zhì)P、抗HRP/抗FITC、抗CEA/抗0 -半乳糖苷酶。三特異性抗體的例子包括抗⑶3/抗⑶4/抗⑶37、抗⑶3/抗⑶5/抗⑶37和抗 CD3/抗CD8/抗CD37。雙特異性抗體可以制備成全長抗體或抗體片段(例如F(ab’)2雙特 異性抗體)。涵蓋具有超過兩個效價的抗體。例如，可制備三特異性抗體。Tutt et al., J. Immunol. 147 60(1991)。為了本文中的目的，“裸抗體”或“裸露的抗體”指未偶聯(lián)細胞毒性模塊或放射性標 記物的抗體。“完整抗體”在本文中指包含兩個抗原結(jié)合區(qū)及Fc區(qū)的抗體。優(yōu)選的是，完整抗體 具有功能性Fc區(qū)?！爸委煛敝钢委熜蕴幚砗皖A(yù)防性或防范性措施二者。需要治療的受試者包括早就患 有病癥的受試者以及要預(yù)防病癥的受試者?！安“Y”指任何會受益于如本文所述純化的抗體治療的疾患。這包括慢性和急性這 兩類病癥和疾病，及那些使哺乳動物傾向于所討論病癥的病理狀況。術(shù)語“標記物”在用于本文時指與抗體直接或間接偶聯(lián)的可檢測化合物或組合物。 標記物自身可以是可檢測的(例如放射性同位素標記物或熒光標記物)，或者在酶標記物 的情況中，可催化可檢測的底物化合物或組合物的化學改變。術(shù)語“細胞毒劑”在用于本文時指抑制或阻止細胞功能和/或引起細胞破壞的物 質(zhì)。該術(shù)語意圖包括放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、p32和 Lu的放射性同位素)、化療劑、和毒素諸如小分子毒素或者細菌、真菌、植物或動物起源的 酶活毒素或其片段。本發(fā)明的實施方式本文中的發(fā)明提供了用于自包含抗體和一種或多種污染物的組合物(例如水溶 液)純化所述抗體的方法。所述組合物一般是源自抗體重組生產(chǎn)的組合物，但是可以是源 自通過肽合成(或其它合成手段)進行的抗體生產(chǎn)的組合物，或者可以自抗體的天然來源 純化所述抗體。優(yōu)選的是，所述抗體結(jié)合人CD20抗原，諸如利妥昔單抗，或者結(jié)合人VEGF 抗原，諸如貝伐單抗。抗體的重組生產(chǎn)為了重組生產(chǎn)抗體，分離編碼抗體的核酸，并插入可復(fù)制載體，用于進一步克隆 (DNA擴增)或表達。編碼抗體的DNA易于使用常規(guī)規(guī)程分離和測序(例如通過使用能夠與 編碼抗體重鏈和輕鏈的基因特異性結(jié)合的寡核苷酸探針)?？梢垣@得許多載體。載體構(gòu)件 通常包括但不限于下列一項或多項信號序列、復(fù)制起點、一種或多種標記基因、增強子元 件、啟動子、和轉(zhuǎn)錄終止序列(例如美國專利5，534，615中所記載的，通過述及明確收入本 文)。適于克隆或表達本文載體中的DNA的宿主細胞是原核生物、酵母或高等真核 細胞。適于此目的的原核生物包括真細菌，諸如革蘭氏陰性生物體或革蘭氏陽性生物 體，例如腸桿菌科，諸如埃希氏菌屬(Escherichia)例如大腸埃希氏菌(E. coli)、腸桿 菌屬(Enterobacter)、歐文氏菌屬(Erwinia)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、變形菌屬 (Proteus)、沙門氏菌屬(Salmonella)例如鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)、 沙雷氏菌屬(Serratia)例如粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescans)、志賀氏菌屬(Shigella)、以及芽孢桿菌屬(Bacilli)諸如枯草芽孢桿菌(B. subtilis)和地衣芽孢桿 菌(B. licheniformis)(例如1989年4月12日公布的DD 266，710中披露的地衣芽孢 桿菌41P)、假單胞菌屬(Pseudomonas)諸如銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)、和鏈霉菌屬 (Str印tomyces)。一種優(yōu)選的大腸桿菌克隆宿主是大腸桿菌294 (ATCC 31，446)，盡管其它 菌株諸如大腸桿菌B、大腸桿菌X1776(ATCC 31,537)和大腸桿菌W3110 (ATCC 27,325)也是 合適的。這些例子是例示性的，而不是限制性的。在原核生物以外，真核微生物諸如絲狀真菌或酵母也是編碼抗體的載體的合適 克隆或表達宿主。釀酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)或常用的面包酵母是最常 用的低等真核宿主微生物。然而，通?？色@得許多其它屬、種和菌株且可用于本發(fā)明，諸 如粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克魯維酵母屬(Kluyveromyces)宿 主，諸如例如乳酸克魯維酵母(K. lactis)、脆壁克魯維酵母(K. fragilis) (ATCC 12，424)、 保加利亞克魯維酵母(K. bulgaricus) (ATCC 16，045)、威克克魯維酵母(K. wickeramii) (ATCC 24，178)、K. waltii (ATCC 56，500)、果蠅克魯維酵母(K. drosophilarum) (ATCC 36， 906)、耐熱克魯維酵母(K. thermotolerans)和馬克思克魯維酵母(K. marxianus)；亞羅 酵母屬(Yarrowia) (EP 402, 226)；巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris) (EP 183,070)； 假絲酵母屬(Candida)；瑞氏木霉(Trichoderma reesia) (EP 244, 234)；粗糙脈孢菌 (Neurospora crassa)；許旺酵母屬(Schwanniomyces)，諸如許旺酵母(Schwanniomyces occidenralis)；和絲狀真菌，諸如例如脈孢菌屬(Neurospora)、青霉屬(Penicillium)、彎 頸霉屬(Tolypocladium)、和曲霉屬(Aspergillus)宿主諸如構(gòu)巢曲霉(A. nidulans)和黑 曲霉(A. niger)。適于表達糖基化抗體的宿主細胞衍生自多細胞生物體。無脊椎動物細胞的例子包 括植物和昆蟲細胞。已經(jīng)鑒定了許多桿狀病毒株和變體及相應(yīng)的允許昆蟲宿主細胞，它們 來自諸如草地夜蛾Spodoptera frugiperda(毛蟲)、埃及伊蚊Aedes aegypti (蚊子)、白紋 伊岐Aedes albopictus(岐子)、黑腹果也黽Drosophila melanogaster (果也黽)禾口家香Bombyx mori等宿主。公眾可獲得多種病毒株用于轉(zhuǎn)染，例如苜蓿尺蠖Autographa californica NPV的L-1變體和家蠶Bombyx mori NPV的Bm_5株，而且此類病毒可依照本發(fā)明用作本文 中的病毒，特別是用于轉(zhuǎn)染草地夜蛾細胞。還可利用棉、玉米、馬鈴薯、大豆、矮牽牛、番茄和 煙草的植物細胞培養(yǎng)物作為宿主。然而，脊椎動物細胞得到最多關(guān)注，而且培養(yǎng)(組織培養(yǎng))中脊椎動物細胞的繁殖 已經(jīng)成為常規(guī)規(guī)程。有用哺乳動物宿主細胞系的例子包括但不限于用SV40轉(zhuǎn)化的猴腎CV1 細胞(C0S-7，ATCC CRL 1651)；人胚腎細胞(293或為了在懸浮培養(yǎng)中生長而亞克隆的293 細胞，Graham et al. , J. Gen Virol. 36 :59 (1977))；幼倉鼠腎細胞(BHK，ATCC CCL 10)；中 國倉鼠卵巢細胞/-DHFR(CH0，Urlaub et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216(1980))； 小鼠塞托利(Sertoli)細胞(TM4, Mather, Biol. Reprod. 23 =243-251 (1980))；猴腎細胞 (CV1, ATCC CCL 70)；非洲綠猴腎細胞(VER0-76，ATCC CRL-1587)；人宮頸癌細胞(HELA， ATCC CCL 2)；犬腎細胞(MDCK, ATCC CCL 34)；牛鼠(buffalorat)肝細胞(BRL 3A, ATCC CRL 1442)；人肺細胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝細胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺腫 瘤(MMT 060562，ATCC CCL 51) ；TRI 細胞(Mather et al.，Annals N. Y. Acad. Sci. 383 44-68(1982) ；MRC5細胞；FS4細胞；和人肝瘤細胞Ofep G2)。通常，CH0細胞優(yōu)選用于表達抗體，而且可有利地用于生成依照本發(fā)明純化的抗體。用上文所述用于生產(chǎn)抗體的表達或克隆載體轉(zhuǎn)化宿主細胞，并在為了誘導啟動 子、選擇轉(zhuǎn)化子或擴增編碼期望序列的基因而適當更改的常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)?？梢栽诙喾N培養(yǎng)基中培養(yǎng)用于生產(chǎn)本發(fā)明抗體的宿主細胞。商品化培養(yǎng)基諸如 Ham 氏 F10 (Sigma)、極限必需培養(yǎng)基(MEM, Sigma)、RPMI-1640 (Sigma)、禾口 Dulbecco 氏改 良的Eagle氏培養(yǎng)基(DMEM，Sigma)適于培養(yǎng)宿主細胞。另外，可以使用下列文獻中記載 的任何培養(yǎng)基作為宿主細胞的培養(yǎng)基:Ham et al.，Meth. Enz. 58 44(1979) ；Barnes et al.，Anal. Biochem. 102 255 (1980)；美國專利 No. 4，767，704 ；4，657，866 ；4，927，762 ； 4，560, 655 ；或 5，122，469 ；W0 90/03430 ；W0 87/00195 ；或美國專利復(fù)審 30，985。任何這些 培養(yǎng)基可以根據(jù)需要補充激素和/或其它生長因子(諸如胰島素、運鐵蛋白或表皮生長因 子)、鹽(諸如氯化鈉、鈣、鎂和磷酸鹽)、緩沖劑(諸如HEPES)、核苷酸(諸如腺苷和胸苷)、 抗生素(諸如硫酸慶大霉素；GENTAMYCIN )、痕量元素(定義為通常以微摩爾范圍 的終濃度存在的無機化合物)、和葡萄糖或等效能源。還可以以適宜濃度包含本領(lǐng)域技術(shù)人 員知道的任何其它必需補充物。培養(yǎng)條件，諸如溫度、PH等，就是先前為表達而選擇用于宿 主細胞的，這對于普通技術(shù)人員而言是顯而易見的。在使用重組技術(shù)時，可以在細胞內(nèi)、在周質(zhì)空間中生成抗體，或者直接分泌到培養(yǎng) 基中。如果在細胞內(nèi)生成抗體，那么作為第一步，通過例如離心或超濾除去宿主細胞或裂解 細胞的微粒碎片(例如源自勻漿)。如果將抗體分泌到培養(yǎng)基中，那么可以使用商品化蛋白 質(zhì)濃縮濾器，例如Amicon或Millipore Pell icon超濾單元濃縮來自此類表達系統(tǒng)的上清 液。本發(fā)明的陽離子交換層析方法在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，要進行本文中純化方法的組合物是由中國倉鼠卵巢 (CH0)重組宿主細胞培養(yǎng)物表達的重組生產(chǎn)的抗體，優(yōu)選完整抗體。任選的是，所述組合物 在陽離子交換層析之前已經(jīng)進行過至少一個純化步驟。所述組合物含有感興趣的抗體和一 種或多種污染物，諸如中國倉鼠卵巢蛋白質(zhì)(CHOP)；浸出的蛋白A;核酸；期望抗體的變體、 片段、聚集物或衍生物；其它多肽；內(nèi)毒素；病毒污染物；細胞培養(yǎng)基成分(例如硫酸慶大 霉素；GENTAMYCIN )，等?？梢栽陉栯x子交換層析方法之前、期間、或之后實施的別的純化規(guī)程的例子包括 在疏水性相互作用層析(例如在PHENYL-SEPHAR0SE )上分級分離、乙醇沉淀、等電聚焦、反 相HPLC、在硅土上層析、在HEPARINSEPHAR0SE 上層析、陰離子交換層析、別的陽離子交換 層析、混合模式離子交換、層析聚焦、SDS-PAGE、硫酸銨沉淀、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透 析、hydrophic電荷誘導層析、和親和層析(例如使用蛋白A、蛋白G、抗體、或特異性底物、 配體或抗原作為捕捉試劑)。依照本發(fā)明，陽離子交換純化方案通常包括按序?qū)嵤┑南铝胁襟E(1)平衡陽離 子交換材料；(2)將要純化的組合物加載到陽離子交換材料上；(3)第一清洗步驟；(4)第 二清洗步驟；和(5)洗脫感興趣的抗體。通過在陽離子交換純化方案中包括至少兩個清洗步驟，其中至少第一個在高 pH(約pH 6. 8或更大)進行，能顯著提高純化功效。具體而言，使用pH在約6. 8至約9. 0 范圍中(例如約7. 0至8. 0)、諸如例如約pH 7. 8或約pH 7. 0的清洗緩沖液實施第一清洗步驟，比使用約5. 0至約5. 5的常規(guī)的更低的pH范圍，更加有效地清除上文所述污染物。結(jié) 果，自陽離子交換材料洗脫的包含抗體的組合物中宿主細胞蛋白質(zhì)含量通常低約200ppm， 在使用pH約5至5. 5的一個清洗步驟實現(xiàn)的大約500ppm的水平以下。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述陽離子交換材料包含經(jīng)磺丙基官能化多羥 基化聚合物包被的交聯(lián)聚(苯乙烯-二乙烯基苯)流通顆粒(固相)，例如自Applied Biosystems 可得的 P0R0S 50 HS 柱。通常，在將包含感興趣的抗體和一種或多種污染物的組合物加載到陽離子交換材 料上之前，使平衡緩沖液流過所述材料。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，平衡緩沖液具有約 5. 0至約6. 0的pH，例如約pH 5. 5。一種例示性的平衡緩沖液包含19mM MES,60mM NaCl, pH 5.50。另一種例示性的平衡緩沖液包含23mM MES,60mM NaCl, pH 5.50。平衡后，將包含感興趣的抗體和一種或多種污染物的水溶液加載到陽離子交換材 料上。任選的是，載荷的pH在約4.0至約6.0的范圍中，例如約pH 5.0或約pH 5.5。在 一個優(yōu)選的實施方案中，加載來自在先純化步驟的條件化產(chǎn)物集合。在一個實施方案中，將 來自在先蛋白A層析的蛋白A集合pH 5.0加載到陽離子交換材料上。在另一個實施方案 中，將條件化Q-SEPHAROSE 集合pH 5. 5加載到陽離子交換材料上。例示性的載荷密 度在約10至約100g/L樹脂的范圍，優(yōu)選約10至約60g/L樹脂，最優(yōu)選約15至約45g/L樹 脂。作為此加載步驟的結(jié)果，感興趣的抗體結(jié)合至陽離子交換材料。加載后，在第一清洗步驟中用第一清洗緩沖液清洗陽離子交換材料。在清洗過程 中，清洗緩沖液流過陽離子交換材料。清洗緩沖液的組成一般選擇成自樹脂洗脫盡可能多 的污染物，不洗脫實質(zhì)量的感興趣抗體。第一清洗緩沖液的PH —般高于平衡緩沖液和/或 所加載組合物的PH，例如高約2至約3個pH單位。優(yōu)選的是，第一清洗緩沖液的pH在約 pH 6. 8至約9. 0的范圍中，優(yōu)選約pH 6. 8至約8. 0，例如約pH 7. 8或約pH 7. 0。在此pH 范圍中緩沖的緩沖液的例子包括但不限于HEPES、MES、乙酸鈉、TRIS/HC1、鹽酸三乙醇胺/ NaOH、Bicine/HCl、Tricine/HCl 等。優(yōu)選的第一清洗緩沖液包含(l)25mM HEPES，pH7. 8 或 (2)25mM MOPS, pH 7. 0，或者由(l)25mM HEPES, pH 7. 8 或(2)25mMM0PS，pH 7. 0 組成。在這點上，本發(fā)明提供了在25mM HEPES,pH 7. 8中包含重組嵌合⑶20抗體(諸如 利妥昔單抗)的組合物。本發(fā)明還提供了在25mM MOPS, pH 7. 0中的重組人源化VEGF抗 體，諸如貝伐單抗。此類組合物作為在這些產(chǎn)物的純化中使用的中間組合物等是有用的。本文中的發(fā)明一般需要使用第二清洗緩沖液的至少另一或第二清洗步驟。第二清 洗緩沖液的PH優(yōu)選低于第一清洗緩沖液的pH，例如低約2至約3個pH單位。因此，例如， 第二清洗緩沖液的pH可以在約pH 5.0至約pH 6.0的范圍。優(yōu)選的是，第二清洗緩沖液的 pH為約5. 5。在此pH范圍中緩沖的緩沖液的例子包括但不限于MES、乙酸/乙酸鈉或NaOH、 NaH2P03/Na2HP04、Bis. Tris/HCl。MES, pH 5. 5是第二清洗的優(yōu)選緩沖液。在一個實施方案 中，第二清洗緩沖液包含 19mM MES, 10mM NaCl，pH 5. 50 或由 19mM MES, lOmM NaCl，pH 5. 50 組成。在另一個實施方案中，第二清洗緩沖液包含23mMMES，10mM NaCl，pH 5. 50或由23mM MES, 10mM NaCl, pH 5. 50 組成。雖然在洗脫期望抗體之前可采用別的清洗步驟，但是優(yōu)選只實施第一和第二清洗 步驟。在第一和/或第二清洗步驟期間自陽離子交換材料清除污染物(諸如上文所討論的 那些)。優(yōu)選的是，第一清洗步驟清除大多數(shù)污染物。
上文所述清洗步驟后，自陽離子交換材料洗脫期望的抗體?？贵w的洗脫可以通過 提高電導率或離子強度來實現(xiàn)。想要的是，洗脫緩沖液的電導率大于約lOmS/cm。升高的 電導率可通過在洗脫緩沖液中包括相對較高的鹽濃度來實現(xiàn)。用于此目的的例示性的鹽包 括但不限于乙酸鈉、氯化鈉(NaCl)、和氯化鉀(KC1)。在一個實施方案中，所述洗脫緩沖液 包含約100至約300mMNaCl。洗脫緩沖液一般會具有與第二清洗緩沖液大致相同的pH。一 種優(yōu)選的洗脫緩沖液包含19mM MES, 160mM NaCl, pH 5.5。另一種優(yōu)選的洗脫緩沖液包含 23mM MES, 175mM NaCl, pH 5. 5。洗脫優(yōu)選涉及逐步洗脫(與梯度洗脫不同)。雖然洗脫步驟之后任選有再生步驟，但是依照本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，這不是必 須的。雖然涵蓋別的步驟，但是優(yōu)選的是，本文中的陽離子交換純化方法只由下列步驟 組成平衡(例如使用PH約5. 5的平衡緩沖液)，加載包含抗體和污染物的組合物(例如 其中所加載的組合物的PH為約5.0或約5. 5)，用于洗脫污染物的第一清洗步驟(例如使用 pH約7. 8的第一清洗緩沖液或pH約7. 0的第一清洗緩沖液)，第二清洗步驟(例如使用pH 約5. 5的第二清洗緩沖液)，和洗脫(例如使用pH約5. 5且電導率相對于每一個在先步驟 升高的洗脫緩沖液，用于洗脫抗體)。如果必要，依照本文中的陽離子交換層析方法獲得的抗體制備物可進行別的純化 步驟。上文已經(jīng)討論了例示性的進一步純化步驟。任選的是，根據(jù)需要將所述抗體偶聯(lián)至一種或多種異源分子。所述異源分子可以 是例如延長抗體的血清半衰期的(例如聚乙二醇，PEG)，或者它可以是標記物(例如酶、 熒光標記物和/或放射性核素)、或細胞毒性分子(例如毒素、化療藥物、或放射性同位素
寸乂 0包含抗體(任選偶聯(lián)有異源分子的)的治療用配制劑可以通過將具有期望純度的 抗體與任選的藥學可接受載體、賦形劑或穩(wěn)定劑(Remington' sPharmaceutical Sciences 第16版，Osol, A.編(1980))混合來制備，采取凍干配制劑或水溶液的形式?！八帉W可接 受的”載體、賦形劑或穩(wěn)定劑在所采用的劑量和濃度對接受者是無毒的，而且包括緩沖劑， 諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽、組氨酸和其它有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐 劑(諸如氯化十八烷基二甲基芐基銨；氯化己烷雙胺；苯扎氯銨、苯索氯銨；酚、丁醇或苯 甲醇；對羥基苯甲酸烷基酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環(huán)己醇； 3_戊醇；和間甲酚)；低分子量(少于約10個殘基)多肽；蛋白質(zhì)，諸如血清清蛋白、明膠 或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，諸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬 酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精； 螯合劑，諸如EDTA;糖類，諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽相反離子，諸如鈉；金屬 復(fù)合物(例如Zn-蛋白質(zhì)復(fù)合物)；和/或非離子表面活性劑，諸如TWEENtm、PLURONICS 或 聚乙二醇(PEG)。活性成分還可包載入例如通過凝聚技術(shù)或通過界面聚合制備的微膠囊(例如分 別是羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)、膠狀藥物投遞系統(tǒng)(例 如脂質(zhì)體、清蛋白微球體、微乳劑、納米顆粒和納米膠囊)、或粗滴乳狀液。此類技術(shù)披露于 Remington' s Pharmaceutical Sciences 第 16 片反，Osol，A.編(1980)。用于體內(nèi)施用的配制劑必須是無菌的。這可容易地通過使用無菌濾膜過濾來實現(xiàn)?？芍苽涑掷m(xù)釋放制劑。持續(xù)釋放制劑的合適例子包括含有抗體變體的固體疏水性 聚合物半透性基質(zhì)，該基質(zhì)以定型產(chǎn)品的形式存在，例如薄膜或微膠囊。持續(xù)釋放基質(zhì)的例 子包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥乙基_甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美國 專利No. 3，773，919)、L_谷氨酸和Y _乙基_L_谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸 乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物諸如LUPRON DEPOT (由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮 丙瑞林構(gòu)成的可注射微球體)及聚-D- (-) -3-羥基丁酸。然后將如本文所述純化的抗體或包含所述抗體和藥學可接受載體的組合物用于 對此類抗體和組合物已知的各種診斷、治療或其它用途。例如，可以通過給哺乳動物施用 有效量的所述抗體來使用所述抗體治療哺乳動物中的病癥。在CD20抗體(諸如利妥昔單 抗)的情況中，可以用它來消減B細胞、治療淋巴瘤(例如非何杰金氏淋巴瘤，NHL)、或白血 病(例如慢性淋巴細胞性白血病，CLL)以及自身免疫性疾病諸如類風濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、多 發(fā)性硬化(MS)、狼瘡等。對于結(jié)合VEGF的抗體(諸如貝伐單抗)，可以用它來抑制血管發(fā) 生、治療癌癥、及治療黃斑變性、等。為了例示而非為了限制，提供下列實施例。通過述及將說明書中所有引文的公開 內(nèi)容明確收入本文。實施例1 ⑶20抗體的純化此實施例描述用于純化CD20抗體利妥昔單抗的改良陽離子交換層析工藝。利妥 昔單抗用于治療冊1^、0^、肌、1^、等。利妥昔單抗分子的結(jié)構(gòu)披露于5，736，137, Anderson et al.(通過述及明確收入本文)以及本文中

圖1A-1B。利妥昔單抗可自Genentech，Inc 購買得到。使用陽離子交換層析來進一步降低CHOP、DNA、浸出的蛋白A、硫酸慶大霉素 (GENTAMYCIN )、利妥昔單抗聚集物、和潛在病毒的水平。使利妥昔單抗在加載條件 下結(jié)合至柱。然后將柱清洗、洗脫、再生/清潔、并貯存，直至下次使用?？墒褂枚鄠€循環(huán)來 加工整個批次的親和集合(affinitypool)。陽離子交換集合可以于高至30°C的室溫保持 長達3天或于5°C保持長達7天。將陽離子交換樹脂(P0R0S50 HS ，Applied Biosystems)裝填入柱至 17_33cm 的床高度。在加載親和集合之前，用平衡緩沖液對陽離子交換柱清除掉貯存液。平衡后，將 親和集合加載到柱上。使產(chǎn)物在這些條件下結(jié)合至柱。然后用清洗1緩沖液，接著用清洗 2緩沖液清洗柱。使用高離子強度洗脫緩沖液自柱洗脫利妥昔單抗。下表提供了與初始(對照)工藝相比本發(fā)明工藝的條件的比較。表1 用于利妥昔單抗陽離子交換層析工藝的緩沖液的比較 下表提供了利妥昔單抗工藝中的載荷和緩沖液的期望pH、電導率和摩爾濃度范圍。表2 利妥昔單抗工藝的優(yōu)選pH、電導率和摩爾濃度范圍 *電導率值是用溫度補償測量的，基于20°C的溫度和1. 77的a值。通過能夠在清洗階段中更好地清除宿主細胞蛋白質(zhì)，利妥昔單抗純化的例示工藝 增強了宿主細胞蛋白質(zhì)清除的穩(wěn)健性(robustness)，導致產(chǎn)物集合(洗脫集合)中宿主細 胞蛋白質(zhì)水平更低并便于在后續(xù)下游步驟中清除雜質(zhì)。圖3圖示了本工藝在宿主細胞蛋白 質(zhì)清除方面的優(yōu)勢。實施例2 :VEGF抗體的純化此實施例描述用于純化重組人源化血管內(nèi)皮生長因子抗體(rhuMAbVEGF)貝伐單 抗的陽離子交換層析工藝。貝伐單抗分子的結(jié)構(gòu)披露于美國專利7，169，901，Presta et al.，通過述及明確收入本文。還可見本文中圖2A-2B。貝伐單抗可自Genentech，Inc購買 得到。此實施例總結(jié)了對改良貝伐單抗純化工藝的陽離子交換步驟實施的發(fā)展研究。 在這些研究中評估了三種陽離子交換樹脂CM SEPHAROSE FAST FLOW , SP SEPHAROSE FAST FLOW 和P0R0S 50HS 。關(guān)于下列各項評估了使用這三種樹脂的陽離子交換 純化工藝工藝性能(雜質(zhì)清除、逆轉(zhuǎn)錄病毒清除、和步驟產(chǎn)率)、產(chǎn)物質(zhì)量、工藝穩(wěn)健性 (process robustness)和在所有當前制造地的工藝適合性(process fit)?；谶@些研究 中產(chǎn)生的數(shù)據(jù)，P0R0S50HS 顯示卓越的工藝性能和穩(wěn)健性，而且被選擇為用于改良純化 工藝的陽離子交換樹脂。陽離子交換層析是純化工藝中的最終層析步驟。它用于清除細胞培養(yǎng)基成分(硫 酸慶大霉素)、宿主細胞衍生的雜質(zhì)(CHOP、和DNA)及聚集形式的貝伐單抗。它還發(fā)揮病毒 清除步驟的功能。以結(jié)合-洗脫模式操作柱，于環(huán)境溫度實施。所述柱使用陽離子交換樹脂 (POROS50HS )。該樹脂由偶聯(lián)有帶負電荷的官能基的多孔聚苯乙烯-二乙烯基苯床支 持物組成。通過用平衡緩沖液清洗，自貯存取出柱。用0.3個體積的注射用水(WFI)稀釋 病毒過濾集合以達到電導率限度< 5. 5mS/cm。然后將病毒過濾集合加載到經(jīng)過平衡的柱 上。產(chǎn)物結(jié)合至樹脂。加載后，用高PH緩沖液清洗柱，以沖洗載荷材料流過柱和清除CHOP 雜質(zhì)。然后用低鹽緩沖液清洗柱以降低PH和使柱準備好洗脫。使用高鹽緩沖液的逐步洗 脫用最多7個柱體積洗脫產(chǎn)物。洗脫后，用清潔液(0. 5N NaOH)清潔柱和臺架(skid)，之后 在貯存液(0. IN NaOH)中貯存，直至下次使用。下表提供了本文中的發(fā)明的貝伐單抗工藝條件的描述。表3:貝伐單抗工藝 下表提供了貝伐單抗工藝中的載荷和緩沖液的期望pH、電導率和摩爾濃度范圍。表4 貝伐單抗工藝的優(yōu)選pH、電導率和摩爾濃度范圍 發(fā)現(xiàn)此工藝優(yōu)于使用pH 5. 5的第一清洗緩沖液的初始貝伐單抗工藝。本文中的 新工藝能夠獲得具有更低CHOP水平的收集物(pool)，它實現(xiàn)了更高的步驟產(chǎn)率，并且該新 工藝在制造過程中運行總體更加穩(wěn)健。
權(quán)利要求
一種用于自包含抗體和至少一種污染物的組合物純化所述抗體的方法，該方法包括下述按序步驟(a)將所述組合物加載到陽離子交換材料上，其中所述組合物處于第一pH；(b)用pH大于(a)中所述組合物的第一清洗緩沖液清洗所述陽離子交換材料，其中所述第一清洗緩沖液的pH為約6.8至約9.0；(c)用pH小于所述第一清洗緩沖液的第二清洗緩沖液清洗所述陽離子交換材料；并(d)用電導率顯著大于所述第二清洗緩沖液的洗脫緩沖液自所述陽離子交換材料洗脫所述抗體。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述第二清洗緩沖液的PH和所述洗脫緩沖液的pH大致相同。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗體結(jié)合人CD20。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗體結(jié)合人血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)。
5.權(quán)利要求1的方法，其中(a)中所述組合物的pH為約4.O至約6. 0，所述第一清洗 緩沖液的PH為約6. 8至約8. 0，所述第二清洗緩沖液的pH為約5. 0至約6. 0，而所述洗脫 緩沖液的PH為約5. 0至約6. 0。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述洗脫緩沖液的電導率為約lOmS/cm至約lOOmS/cm。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述洗脫緩沖液包含約100至約300mMNaCl。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述陽離子交換材料包括經(jīng)磺丙基官能化多羥基化聚合物 包被的交聯(lián)聚(苯乙烯_ 二乙烯基苯)流通顆粒。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述污染物選自下組中國倉鼠卵巢蛋白質(zhì)(CHOP)、浸出的 蛋白A、DNA、聚集的抗體、細胞培養(yǎng)基成分、硫酸慶大霉素、和病毒污染物。
10.權(quán)利要求1的方法，進一步包括在步驟(a)至(d)之前、期間、或之后將包含所述抗 體的組合物進行一個或多個進一步的純化步驟以獲得所述抗體的均質(zhì)制備物。
11.權(quán)利要求10的方法，進一步包括將純化的抗體與異源分子偶聯(lián)。
12.權(quán)利要求10或11的方法，進一步包括通過組合所述抗體的均質(zhì)制備物或所述偶聯(lián) 的抗體與醫(yī)學可接受載體來制備藥物組合物。
13.一種用于自包含結(jié)合人CH20的抗體和一種或多種污染物的組合物純化所述抗體 的方法，所述污染物選自下組中國倉鼠卵巢蛋白質(zhì)(CHOP)、浸出的蛋白A、DNA、和聚集的 ⑶20抗體，該方法包括下述按序步驟(a)將所述組合物加載到陽離子交換材料上，其中所述組合物處于約4.0至約6. 0的pH；(b)用pH約6.8至約9. 0的第一清洗緩沖液清洗所述陽離子交換材料，其中所述第一 清洗緩沖液的PH為約6. 8至約9. 0 ；(c)用PH約5.0至約6. 0的第二清洗緩沖液清洗所述陽離子交換材料；并(d)用pH約5.0至約6. 0且電導率約lOmS/cm至約lOOmS/cm的洗脫緩沖液自所述陽 離子交換材料洗脫所述抗體。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述抗體是利妥昔單抗。
15.權(quán)利要求13的方法，其中所述洗脫緩沖液包含約100至約300mMNaCl。
16.一種用于自包含結(jié)合人血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的抗體和一種或多種污染物的組合物純化所述抗體的方法，所述污染物選自下組細胞培養(yǎng)基成分、硫酸慶大霉素、中國 倉鼠卵巢蛋白質(zhì)(CHOP)、DNA、病毒污染物、和聚集的VEGF抗體，該方法包括下述按序步驟(a)將所述組合物加載到陽離子交換材料上，其中所述組合物處于約4.0至約6. 0的pH；(b)用pH約6.8至約8. 0的第一清洗緩沖液清洗所述陽離子交換材料；(c)用PH約5.0至約6. 0的第二清洗緩沖液清洗所述陽離子交換材料；并(d)用pH約5.0至約6. 0且電導率約lOmS/cm至約lOOmS/cm的洗脫緩沖液自所述陽 離子交換材料洗脫所述抗體。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述抗體是貝伐單抗。
18.權(quán)利要求16的方法，其中所述洗脫緩沖液包含約100至約300mMNaCl。
19.一種組合物，其在包含約25mM HEPES、pH約7. 8的緩沖液中包含利妥昔單抗。
20.一種組合物，其在包含約25mM M0PS、pH約7. 0的緩沖液中包含貝伐單抗。
全文摘要
描述了一種通過陽離子交換層析來純化抗體的方法，其中在使用電導率升高的洗脫緩沖液來洗脫期望抗體之前使用高pH清洗步驟來清除污染物。
文檔編號C07K16/22GK101889025SQ200880119331
公開日2010年11月17日 申請日期2008年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月30日
發(fā)明者奧里莉亞·薩夫塔, 德博拉·A·奧康納, 曼達基尼·夏爾馬, 貝內(nèi)迪克特·A·勒布雷頓 申請人:健泰科生物技術(shù)公司