專利名稱：功能性脂類構(gòu)造物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于使表達(dá)于細(xì)胞和多細(xì)胞結(jié)構(gòu)表面的功能基團(tuán)產(chǎn)生質(zhì)變和量變的 方法，以及在該方法中的應(yīng)用的功能性脂類構(gòu)造物。本發(fā)明尤其涉及功能性脂類構(gòu)造物以及它們?cè)谠\斷和治療應(yīng)用上的使用，包括血 清診斷法，其中功能性基團(tuán)為碳水化合物、肽、化學(xué)反應(yīng)基團(tuán)、結(jié)合體或者熒光團(tuán)。
背景技術(shù)：
使表達(dá)于脂質(zhì)體、細(xì)胞和多細(xì)胞結(jié)構(gòu)表面的功能基團(tuán)產(chǎn)生質(zhì)變和量變的能力具有 一系列的診斷和治療應(yīng)用。功能性基團(tuán)可以為碳水化合物、肽、化學(xué)反應(yīng)基團(tuán)(例如馬來(lái)酰 亞胺)、結(jié)合體(例如生物素)或者熒光團(tuán)(例如熒光素)。國(guó)際申請(qǐng)?zhí)朠CT/NZ2005/000052(公布號(hào)WO 2005/090368)的說(shuō)明書描述了一種 碳水化合物_脂類構(gòu)造物的制備，該碳水化合物_脂類構(gòu)造物用于使表達(dá)于細(xì)胞和多細(xì)胞 結(jié)構(gòu)表面的碳水化合物水平產(chǎn)生質(zhì)變和量變的方法。描述了該構(gòu)造物用于制備血液分組和 診斷用質(zhì)量控制細(xì)胞的用途。國(guó)際申請(qǐng)?zhí)朠CT/NZ2006/000245(公布號(hào)WO 2007/035116)的說(shuō)明書描述了另外 一種制備碳水化合物-脂類構(gòu)造物的方法，其中碳水化合物為透明質(zhì)酸聚合物。描述了該 構(gòu)造物修飾胚胎促進(jìn)其與子宮內(nèi)膜細(xì)胞連接的用途。國(guó)際申請(qǐng)?zhí)朠CT/NZ2007/000256(公布號(hào)WO 2008/030115)的說(shuō)明書描述了熒光 團(tuán)-脂類構(gòu)造物的制備。描述了該構(gòu)造物在熒光標(biāo)記細(xì)胞方法中的用途。使細(xì)胞表面表達(dá)的肽產(chǎn)生變化的已有技術(shù)包括基因調(diào)控、膜肽的化學(xué)修飾和使用 脂錨例如 GPI (Legler 等(2004)，McHugh 等(1995)，Medof 等(1996)，Metzner 等(2008)， Morandat 等(2OO2)，Premkumar 等(2OOl)，Ronzon 等(2004)，Skountzou 等(2OO7))的“細(xì) 胞表面染色”。在這些使內(nèi)源表達(dá)的肽產(chǎn)生變化的方法以外，內(nèi)源制備的肽可以利用生物素_親 和素結(jié)合作用結(jié)合到膜脂上。生物素結(jié)合到四聚體蛋白親和素，其解離常數(shù)(Kd)的數(shù)量級(jí) 為10_15mOl/L。這種強(qiáng)結(jié)合力得以開發(fā)于許多實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用中。在這些實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用中，生物素結(jié)合于分子例如碳水化合物或者結(jié)合于肽。除將肽 耦合到膜脂上外，生物素親和素結(jié)合的開發(fā)優(yōu)選于一些隔離和分離的應(yīng)用中。國(guó)際申請(qǐng)?zhí)朠CT/NZ02/00214(公布號(hào)WO 03/039074)的說(shuō)明書描述了將抗原例如 肽固定到細(xì)胞表面的“兩步法”。在該方法中，生物素化糖苷(BioG)與細(xì)胞懸浮液在一定的 溫度下接觸一定的時(shí)間，足以允許BioG分子通過(guò)它們的二?；步Y(jié)合到細(xì)胞的細(xì)胞膜。然后通過(guò)使肽接觸修飾細(xì)胞，將外源性制備的親和素化肽固定到BioG修飾細(xì)胞 的表面。另一種方法為，通過(guò)生物素_親和素橋?qū)⑼庠葱灾苽涞纳锼鼗墓潭ǖ叫揎椉?xì) 胞的表面?！皟刹椒ā敝械娜我灰环N內(nèi)，固定到修飾細(xì)胞表面的親和素化肽的量可以通過(guò)調(diào)控
11為提供修飾細(xì)胞，BioG分子接觸細(xì)胞懸浮液時(shí)的濃度、時(shí)間和溫度來(lái)控制。然而，這種方式 的利用受限于BioG在生物可溶介質(zhì)例如鹽水中的可獲得性和分散性。國(guó)際申請(qǐng)?zhí)朠CT/NZ2005/000052(公布號(hào)WO 2005/090368)的說(shuō)明書描述了 “一步 法”，將碳水化合物抗原固定到細(xì)胞表面。“一步法”利用了碳水化合物-脂類構(gòu)造物，其可 在生物相容性介質(zhì)內(nèi)分散并因此用于制備修飾細(xì)胞而無(wú)損活性。然而，未描述在生物相容 性介質(zhì)內(nèi)具有相對(duì)分散性的肽_脂類構(gòu)造物的制備方法和肽上的普通應(yīng)用方法。肽結(jié)合到自組裝的脂類構(gòu)造物例如脂質(zhì)體之前，作為獨(dú)立組分與磷脂的耦合這方 面，進(jìn)行的工作相對(duì)很少。然而，已有大量的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)對(duì)肽到脂質(zhì)體表面的共價(jià)耦合進(jìn)行了 描述。Martin等(1990)評(píng)論了使基團(tuán)包括肽結(jié)合到脂質(zhì)體表面的方法。Blume等(1993)描述了水溶性Glu-血漿酶原耦合到脂質(zhì)體上的由Kimg和 Redemann (1986)描述過(guò)的方法。在溫育活化脂質(zhì)體懸浮液和Glu-血漿酶原之前，用化學(xué)品 E⑶1(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽)活化脂質(zhì)體。得到了一種蛋白-PEG 包覆脂質(zhì)體，其中Glu-血漿酶原共價(jià)結(jié)合到二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE) -PEG-COOH的末 端。Haselgrubler等(1995)描述了一種異雙官能團(tuán)交聯(lián)劑，其用于促進(jìn)免疫脂質(zhì)體 的制備。該交聯(lián)劑由二胺衍生物聚(乙二醇)(PEG，平均分子量為800道爾頓(ISmer))合 成。該交聯(lián)劑具有功能基團(tuán)2-(卩比啶基硫代)丙?；?PDP)和N-羥基琥珀酸亞胺酯(NHS)。Ishida等(2001)描述了一種帶有聚乙二醇耦合轉(zhuǎn)鐵蛋白的脂質(zhì)體的制備方法。 轉(zhuǎn)鐵蛋白通過(guò)DSPE-PEG-C00H的末端羧基殘基結(jié)合。該脂質(zhì)體被認(rèn)為可用于活性細(xì)胞質(zhì) 內(nèi)，化學(xué)治療試劑或者質(zhì)粒DNA到靶細(xì)胞的靶向定位。Massaguer等(2001)描述了將一種肽序列(GGRGRS)和疏水衍生物結(jié)合到化學(xué)活 化的脂質(zhì)體表面的方法。該結(jié)合通過(guò)N-戊二酰二棕櫚酰磷脂酰膽堿(NGPE)末端的羧基基 團(tuán)進(jìn)行。Massaguer等(2001)指出，就體內(nèi)應(yīng)用上的可能性而論，無(wú)菌和簡(jiǎn)單是最重要的 要求，包括額外步驟，基于脂質(zhì)體表面化學(xué)反應(yīng)的制程，將更加難以在工業(yè)級(jí)水平放大。肽 序列的疏水衍生物被證實(shí)能提供結(jié)合到脂質(zhì)體表面的最佳特性。Chimg等(2004)描述了抗原決定簇對(duì)DOPE-PEG結(jié)合到細(xì)胞膜的屏蔽效果，并詳述 了有關(guān)脂類-PEG (n) (s)調(diào)節(jié)生物細(xì)胞反應(yīng)的可能性，并延續(xù)此概念到在PEG鏈末端引入功 能分子。Kato等(2004)描述了一種將超大分子蛋白質(zhì)錨定到活的哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜上的方 法。將親水聚(乙二醇)(PEG80)耦合的二油烯基磷脂酰乙醇胺(DOPE)衍生物用作合成膜 錨。肽通過(guò)該合成膜錨的具有氨基反應(yīng)活性的N-羥基琥珀酰亞胺衍生物結(jié)合到PEG基團(tuán) 末端。PEG80基團(tuán)促進(jìn)了合成膜錨在水中的溶解性。如Kato等(2004)所述，如果錨不能 溶于水，需要一個(gè)不理想的而且復(fù)雜的制程例如脂質(zhì)體制備和脂質(zhì)體與細(xì)胞膜的融合，將 結(jié)合體錨定到細(xì)胞膜上。Kato等(2004)還敘述了另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)，合成膜錨具有高親水-親脂平衡值(可歸功 于具有多數(shù)量氧乙烯單元的PEG間隔臂)，推定沒(méi)有細(xì)胞溶解活性。無(wú)論如何，在使用具有多數(shù)量氧乙烯單元的PEG間隔臂的合成膜錨的時(shí)候產(chǎn)生了困難首先，結(jié)合肽或者其他內(nèi)源細(xì)胞表面肽的表達(dá)可能被PEG間隔壁遮蓋。其次，具有 多數(shù)量氧乙烯單元的PEG間隔臂可能誘發(fā)蛋白質(zhì)的非特異性吸附(包括部分個(gè)體中的抗 體)和/或完全級(jí)聯(lián)的非特異性活化。Winger等(1996)描述了溴代乙?；疍SPE與硫醇末端化的十肽的結(jié) 合物，所述十肽包括了在它的C-末端的一種最小人類凝血酶-受體肽激動(dòng)劑 (HS-SerPheLeuLeuArgAsn)。Hashimoto等(1986)描述了碘代乙?；疍SPE和硫代化合物的結(jié)合物。存在一種需求，即一種制備肽_脂類構(gòu)造物的常規(guī)手段，該構(gòu)造物通過(guò)“一步法”， 在自組裝的脂類構(gòu)造物例如脂質(zhì)體上，作為獨(dú)立組分結(jié)合。該方法應(yīng)當(dāng)理想地提供肽_脂 類構(gòu)造物，其能在生物相容性介質(zhì)中容易地分散并且自發(fā)地結(jié)合到細(xì)胞和多細(xì)胞結(jié)構(gòu)的膜 上。具有這些特性的肽_脂類構(gòu)造物，除了制備功能化脂質(zhì)體外，預(yù)期在一系列治療 和診斷應(yīng)用上，尤其是血清診斷上都有效用。本發(fā)明的一個(gè)目的為提供一種能在生物相容性介質(zhì)中分散且自發(fā)地結(jié)合到細(xì)胞 和多細(xì)胞結(jié)構(gòu)的膜上的功能性_脂類構(gòu)造物。本發(fā)明的一個(gè)目的為提供功能性-脂類構(gòu)造物，其用于制備能在生物相容性介質(zhì) 中分散且自發(fā)地結(jié)合到細(xì)胞和多細(xì)胞結(jié)構(gòu)的膜上的肽_脂類構(gòu)造物。本發(fā)明的一個(gè)目的為提供一種能在生物相容性介質(zhì)中分散且自發(fā)地結(jié)合到細(xì)胞 和多細(xì)胞結(jié)構(gòu)的膜上的肽_脂類構(gòu)造物。這些目的應(yīng)該與至少給公眾提供一種有用的選擇的目的區(qū)分理解。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一方面為提供一種結(jié)構(gòu)為F-S-L的功能性脂類構(gòu)造物，其中F為功能 性基團(tuán)，L為二?；蛘叨N基脂類，S為共價(jià)鍵合F到L的隔離臂且包括亞結(jié)構(gòu)
權(quán)利要求
一種結(jié)構(gòu)為F S L的功能性脂類構(gòu)造物，其中F為功能性基團(tuán)，L為二?；蛘叨N基脂類，S為共價(jià)鍵合F到L的隔離臂且包括亞結(jié)構(gòu)其中g(shù)為整數(shù)1、2或3，M為單價(jià)陽(yáng)離子或者取代基，*為非H。FPA00001148407600011.tif
2.如權(quán)利要求1所述的功能性脂類構(gòu)造物，其中所述亞結(jié)構(gòu)為
3.如權(quán)利要求2所述的功能性脂類構(gòu)造物，其中g(shù)是整數(shù)2且h為整數(shù)1、2或4。
4.如權(quán)利要求3所述的功能性脂類構(gòu)造物，其中M為H或CH3。
5.如權(quán)利要求1所述的功能性脂類構(gòu)造物，其中L為二?；视土字?br> 6.如權(quán)利要求1所述的功能性脂類構(gòu)造物，其中L為磷脂酰乙醇胺。
7.如權(quán)利要求6所述的功能性脂類構(gòu)造物，其中所述功能性脂類構(gòu)造物的結(jié)構(gòu)包括以 下局部結(jié)構(gòu)
8.如權(quán)利要求7所述的功能性脂類構(gòu)造物，其中所述的功能性基團(tuán)F選自于由碳水化 合物、肽、化學(xué)反應(yīng)性基團(tuán)、結(jié)合物或者熒光團(tuán)組成的群組。
9.如權(quán)利要求8所述的功能性脂類構(gòu)造物，其結(jié)構(gòu)為
10.如權(quán)利要求8所述的功能性脂類構(gòu)造物，其結(jié)構(gòu)為
11.如權(quán)利要求8所述的功能性脂類構(gòu)造物，其結(jié)構(gòu)為
12.如權(quán)利要求8所述的功能性脂類構(gòu)造物，其結(jié)構(gòu)為
13.如權(quán)利要求8所述的功能性脂類構(gòu)造物，其結(jié)構(gòu)為
14.如權(quán)利要求8 13任一項(xiàng)所述的功能性脂類構(gòu)造物，其中所述的亞結(jié)構(gòu)為
15.—種水溶性的結(jié)構(gòu)為F-S-L的肽-脂類構(gòu)造物，其中S為通過(guò)硫化物鍵鏈接到F的隔離臂，并且包括亞結(jié)構(gòu)
16.如權(quán)利要求15所述的肽-脂類構(gòu)造物，其中所述亞結(jié)構(gòu)為
17.如權(quán)利要求16所述的肽-脂類構(gòu)造物，其中g(shù)和h為整數(shù)2。
18.如權(quán)利要求16所述的肽-脂類構(gòu)造物，其中M為H或者CH3。
19.如權(quán)利要求16所述的肽-脂類構(gòu)造物，其中L為二?；视土字?br> 20.如權(quán)利要求16所述的肽-脂類構(gòu)造物，其中L為磷脂酰乙醇胺。
21.如權(quán)利要求16所述的肽-脂類構(gòu)造物，其中所述肽-脂類構(gòu)造物的結(jié)構(gòu)包括以下 局部結(jié)構(gòu)
22.如權(quán)利要求21所述的肽-脂類構(gòu)造物，其中所述肽_脂類構(gòu)造物結(jié)構(gòu)為
23.如權(quán)利要求22所述的肽-脂類構(gòu)造物，其中所述肽-脂類構(gòu)造物結(jié)構(gòu)為
24.如權(quán)利要求23所述的肽-脂類構(gòu)造物，其中F為一種肽，其包括一種挑選的促進(jìn)肽 的溶解度的近末端序列(PTS)。
25.如權(quán)利要求24所述的肽-脂類構(gòu)造物，其中所述肽的PTS選自于下述群組 SerLysLysLysLysGlyAlaAlaAlaAla GlySerGlySerGly0
26.如權(quán)利要求22所述的肽_脂類構(gòu)造物，其中所述的Cys殘基為肽的末端Cys殘基 (Cys)。
27.如權(quán)利要求26所述的肽-脂類構(gòu)造物，其中所述肽的末端序列選自于下述群組GlyLysLysLysLysSerCysAlaAlaAlaAlaCys GlySerGlySerGlyCys CysSerLysLysLysLysGly CysAlaAlaAlaAla CysGlySerGlySerGlyο
28.如權(quán)利要求27所述的肽-脂類構(gòu)造物，其中所述Cys殘基為肽羧基-末端的肽末 端Cys殘基。
29.如權(quán)利要求15所述的肽-脂類構(gòu)造物，其中F為一種肽，其包括一種選自于由血型 糖蛋白A、血型糖蛋白B或者其變種(包括MNS血型系統(tǒng))組成群組的抗原表位。
30.一種如權(quán)利要求26所述的肽-脂類構(gòu)造物，其中F為一種選自肽清單的肽。
31.如權(quán)利要求30所述的肽-脂類構(gòu)造物，其中F為一種選自下列群組的肽 CysThrTyrProAlaHisThrAlaAsnGluGlnThrAsnAspLysHisLysArgAspThrTyrAlaAlaAlaAlaAlaCys GlnThrAsnAspLysHisLysArgAspThrTyrGlySerGlySerGlyCys GlnThrAsnAspMetHisLysArgAspThrTyrGlySerGlySerGlyCys SerSerGlnThrAsnAspLysHisLysArRAspThrTyrCys ThrTyrProAlaHisThrAlaAsnGluValCys ThrTyrProAlaHisThrAlaAsnGluCys ProAlaHisThrAlaAsnGluValCys SerGlnThrAsnAspLysHisLysArRAspCys。
32.如權(quán)利要求15所述的肽-脂類構(gòu)造物，其中L為一種甘油磷脂，其選自于由1， 2-0-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺(DOPE)和1，2_0_ 二硬酯酰-sn-甘油-3-磷脂酰 乙醇胺(DSPE)組成的群組。
33.一種檢測(cè)目標(biāo)血清中反應(yīng)性抗體的方法，包括以下步驟 血清樣品與細(xì)胞懸浮液接觸得到一種混合物，其中，該細(xì)胞經(jīng)過(guò)修飾結(jié)合了一種如 權(quán)利要求9、10或者15 32任一項(xiàng)所述的功能性脂類類構(gòu)造物(F-S-L)； 上述混合物在一定的溫度下經(jīng)一定的時(shí)間孵育，足以允許凝集；和 確定混合物中細(xì)胞的凝集程度； 其中F為碳水化合物或者肽，其包括反應(yīng)性抗體表位。
34.如權(quán)利要求33所述的方法，其中，所述方法還包括以下中間步驟 在確定混合物中細(xì)胞的凝集程度之前，加入一種抗目標(biāo)球蛋白抗體到混合物中。
35.如權(quán)利要求34所述的方法，其中所述的抗目標(biāo)球蛋白抗體為抗人球蛋白(AHG)抗體。
36.如權(quán)利要求33所述的方法，其中，F(xiàn)為肽且該方法還包括以下前置步驟 眷在血清樣品中加入一定量的肽；其中，所述肽的量足以中和非特異性凝集或者確定反應(yīng)性抗體的特異性。
37.一種如權(quán)利要求33所述的方法，其中，所述反應(yīng)性抗體對(duì)選自于由血型糖蛋白A、 血型糖蛋白B或者其變種(包括MNS血型系統(tǒng))組成的群組的抗原具有反應(yīng)性。
38.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述目標(biāo)為人類。
39.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述細(xì)胞為紅血球。
40.制備如權(quán)利要求33 39任一項(xiàng)所述肽-脂類構(gòu)造物的方法，包括以下步驟眷含有Cys殘基的肽與如權(quán)利要求11所述的功能性脂類構(gòu)造物反應(yīng)。
41.一種使表達(dá)于細(xì)胞和多細(xì)胞結(jié)構(gòu)表面的功能基團(tuán)產(chǎn)生質(zhì)變和量變方法，包括以下 步驟 細(xì)胞或多細(xì)胞結(jié)構(gòu)與如權(quán)利要求1 14任一項(xiàng)所述的功能性脂類構(gòu)造物溶液經(jīng)一 定的時(shí)間在一定的溫度下接觸，足以允許構(gòu)造物結(jié)合細(xì)胞或多細(xì)胞結(jié)構(gòu)。
42.一種固定一個(gè)或者多個(gè)細(xì)胞或多細(xì)胞結(jié)構(gòu)的方法，包括以下步驟 細(xì)胞或多細(xì)胞結(jié)構(gòu)與如權(quán)利要求12所述的構(gòu)造物溶液經(jīng)一定的時(shí)間在一定的溫度 下接觸，足以允許有效量的構(gòu)造物結(jié)合細(xì)胞或多細(xì)胞結(jié)構(gòu)，以提供修飾細(xì)胞或多細(xì)胞結(jié)構(gòu)； 和 修飾細(xì)胞或多細(xì)胞結(jié)構(gòu)與能可逆地固定到表面的親和素_包被底物接觸。
43.如權(quán)利要求42所述的方法，其中所述親和素-包被底物選自于由親和素_包被磁 珠構(gòu)成的群組。
44.如權(quán)利要求42所述的方法，其中所述可逆地固定到表面是通過(guò)磁場(chǎng)的應(yīng)用。
45.如權(quán)利要求44所述的方法，包括以下步驟 細(xì)胞或多細(xì)胞結(jié)構(gòu)與結(jié)構(gòu)如下的構(gòu)造物的分散體接觸
46.一種促進(jìn)細(xì)胞的第一和第二群體聚集的方法，包括以下步驟 細(xì)胞的第一群體與如權(quán)利要求12所述的的構(gòu)造物溶液在一定的溫度下經(jīng)一定的時(shí) 間接觸，足以允許有效量的構(gòu)造物結(jié)合到細(xì)胞上，以提供第一群體的修飾細(xì)胞； 細(xì)胞的第二群體與如權(quán)利要求12所述的的構(gòu)造物溶液在一定的溫度下經(jīng)一定的時(shí) 間接觸，足以允許有效量的構(gòu)造物結(jié)合到細(xì)胞上，以提供第一群體的修飾細(xì)胞； 任一一種群體的修飾細(xì)胞與過(guò)量的親和素接觸；和 眷第一群體和第二群體的修飾細(xì)胞接觸。
47.如權(quán)利要求46所述的方法，還包括以下步驟 細(xì)胞的第一群體與結(jié)構(gòu)如下的構(gòu)造物的溶液接觸
全文摘要
本發(fā)明涉及一種方法，用于使表達(dá)于細(xì)胞和多細(xì)胞結(jié)構(gòu)表面的功能基團(tuán)產(chǎn)生質(zhì)變和量變，本發(fā)明還涉及在該方法中應(yīng)用的功能性脂類構(gòu)造物。本發(fā)明尤其涉及功能性脂類構(gòu)造物以及它們?cè)谠\斷和治療應(yīng)用上的使用，包括血清診斷法，其中功能性基團(tuán)為碳水化合物、肽、化學(xué)反應(yīng)性基團(tuán)、結(jié)合體或者熒光團(tuán)。
文檔編號(hào)C07K7/06GK101970460SQ200880119473
公開日2011年2月9日 申請(qǐng)日期2008年10月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月12日
發(fā)明者亞歷山大·鮑里索維奇·圖濟(jì)科夫, 伊戈?duì)枴ち_季諾夫, 克里斯蒂娜-西蒙娜·溫伯格, 尼喬萊·博溫, 斯蒂芬·邁克爾·亨利 申請(qǐng)人:科德生物工程有限公司