專利名稱：二價雙特異性抗體的制作方法
二價雙特異性抗體本發(fā)明涉及新型二價雙特異性抗體，其制備和應用。
背景技術：
改造的蛋白，諸如能夠結合兩種以上抗原的雙特異性或多特異性抗體是本領域中 已知的。這樣的多特異性結合蛋白可以利用細胞融合、化學綴合、或重組DNA技術產生。最近已經開發(fā)了廣泛多樣的重組雙特異性抗體形式，例如通過融合例如IgG抗體 形式和單鏈結構域的四價雙特異性抗體(參見例如C0l0ma，M· J.，等，Nature Biotech.(自 然生物技術)15(1997) 159-163 ；WO 2001077342 ；和 Morrison，S.，L.，Nature Biotech.(自 然生物技術)25 (2007) 1233-1234)。此外，開發(fā)了能夠結合兩種以上抗原的若干其他新型形式，其中抗體中心結 構(IgA，IgD, IgE, IgG或IgM)不再保持諸如雙抗體、三鏈抗體或四鏈抗體，微型抗體 (minibodies)，若干單鏈形式(scFv，雙-scFv) (Holliger, P.，等，Nature Biotech(自 然生物技術)23 (2005) 1126-1136 ；Fischer, N.，和 Leger, 0.，Pathobiology (病理 學)74 (2007) 3-14 ；Shen, J.，等，J. Immunol. Methods (免疫學方法雜志)318 (2007) 65-74 ； Wu，C.，等·，Nature Biotech (自然生物技術)25 (2007) 1290-1297)。所有這樣的形式使用連接體將抗體中心(IgA，IgD, IgE, IgG或IgM)與其他結 合蛋白(例如scFv)融合或融合例如兩個Fab片段或scFv (Fischer, N.，和Leger, 0.， Pathobiology (病理學)74 (2007) 3-14)。雖然連接體具有改造雙特異性抗體的優(yōu)勢是明顯 的，但是其也可能引起治療設置中的問題。實際上，這些外源肽可能引起針對連接體本身或 蛋白質和連接體之間連接的免疫反應。此外，這些肽的靈活的本質使得其更加傾向于蛋白 水解分裂，這潛在地導致弱抗體穩(wěn)定性、聚集和增高的免疫原性。另外，人們可能希望保留 效應子功能，諸如例如補體依賴性細胞毒性(CDC)或抗體依賴性細胞毒性(ADCC)，其通過 保持與天然存在抗體的高度相似性經由Fc部分來介導。因此，理想地，人們的目標應該是開發(fā)通用結構與天然存在抗體(如IgA，IgD, IgE, IgG或IgM)非常類似的雙特異性抗體，其與人序列具有最小的偏離。在一種方法中，利用細胞雜交瘤(quadroma)技術(見Milstein，C.和 A. C. Cuello, Nature (自然)，305 (1983) 537-40)生成了與天然抗體非常類似的雙特異 性抗體，所述細胞雜交瘤技術基于表達具有所需的雙特異性抗體特異性的鼠單克隆抗體 的兩種不同雜交瘤細胞系的體細胞融合。因為在產生的雜交-雜交瘤(或細胞雜交瘤) 細胞系中的兩個不同抗體重鏈和輕鏈的隨機配對，生成至多10種不同的抗體類型，其中 只有一種是所需的功能雙特異性抗體。由于存在錯配副產物和顯著降低的產率，其意味 著需要技術先進的純化程序(參見例如Morrison，S. L.，Nature Biotech(自然生物技 術)25 (2007) 1233-1234)。一般地，如果使用重組表達技術，則相同的錯配副產物問題仍存 在。用于避開錯配副產物問題的方法，稱為“杵-進入-臼(knobs-into-holes)”，其 目的在于通過將突變引入CH3結構域來迫使兩個不同抗體重鏈配對，以改變接觸界面。在 一條鏈上，大氨基酸被具有短側鏈的氨基酸替換，以形成“臼(holes)”。相反地，將具有大側鏈的氨基酸引入到另一個CH3結構域中，以形成“杵(knobs)”。通過共表達這兩條重鏈 (和兩條相同的輕鏈，其必須適合于這兩條重鏈)，觀察到與同型二聚體形式(‘臼-臼’或 ‘杵-杵’)相比，異型二聚體形式(‘杵-臼’)的高產率(Ridgway, J. B.，Protein Eng. (蛋白質工程)9 (1996) 617-621 ；和TO 96/027011)。異型二聚體的百分比可以通過利用噬 菌體展示法重建兩個CH3結構域的相互作用表面和引入二硫鍵來穩(wěn)定該異型二聚體而得 到進一步增加(Merchant A. M，等.，Nature Biotech (自然生物技術)I6 (I"8) 677_681 ； Atwell, S.，等.，J. Mol. Biol.(分子生物學雜志)270 (1997) 26-35)。關于杵-進入-臼技 術的新方法記述在例如EP 1870459A1中。盡管這種形式似乎非常吸引人，但是目前不存在 描述針對臨床的進展的數據。這種策略的一個重要的制約是兩個母體抗體的輕鏈必須相 同，以防止錯配和形成無活性的分子。因此，該技術不適合于容易地開發(fā)起始自針對第一和 第二抗原的兩種抗體的、針對兩種抗原的重組、二價雙特異性抗體，因為這些抗體的重鏈和 /或相同的輕鏈必須是最優(yōu)化的。WO 2006/093794涉及異型二聚體蛋白結合組合物。WO 99/37791描述了多用途抗 體衍生物。Morrison等J. Immunolog (免疫學雜志)，160 (1998) 2802-2808指出可變區(qū)結構 域交換對IgG的功能特性的影響。發(fā)明概述本發(fā)明涉及二價雙特異性抗體，其包括a)特異性結合第一抗原的抗體的輕鏈和重鏈；和b)特異性結合第二抗原的抗體的輕鏈和重鏈，其中可變結構域VL和VH相互替換，且其中恒定結構域CL和CHl相互替換。本發(fā)明的另一個實施方案是用于制備按照本發(fā)明的二價雙特異性抗體的方法，其 包括下列步驟a)用以下各項轉化宿主細胞，_載體，其包括編碼特異性結合第一抗原的抗體的輕鏈和重鏈的核酸分子，和-載體，其包括編碼特異性結合第二抗原的抗體的輕鏈和重鏈的核酸分子，其中可變結構域VL和VH相互替換，且其中恒定結構域CL和CHl相互替換；b)在容許合成所述抗體分子的條件下培養(yǎng)所述宿主細胞；和c)從所述培養(yǎng)物中回收所述抗體分子。本發(fā)明的另一個實施方案是宿主細胞，其包括_載體，其包括編碼特異性結合第一抗原的抗體的輕鏈和重鏈的核酸分子，和-載體，其包括編碼特異性結合第二抗原的抗體的輕鏈和重鏈的核酸分子，其中可變結構域VL和VH相互替換，且其中恒定結構域CL和CHl相互替換。本發(fā)明的另一個實施方案是按照本發(fā)明的抗體的組合物，優(yōu)選藥物或診斷組合物。本發(fā)明的另一個實施方案是藥物組合物，其包括按照本發(fā)明的抗體和至少一種藥 用賦形劑。本發(fā)明的另一個實施方案是用于治療需要治療的患者的方法，其特征在于向所述 患者施用治療有效量的按照本發(fā)明的抗體。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及二價雙特異性抗體，其包括a)特異性結合第一抗原的抗體的輕鏈和重鏈；和b)特異性結合第二抗原的抗體的輕鏈和重鏈，其中可變結構域VL和VH相互替換，且其中恒定結構域CL和CHl相互替換。因此，所述二價雙特異性抗體，包括a)特異性結合第一抗原的抗體的第一輕鏈和第一重鏈；和b)特異性結合第二抗原的抗體的第二輕鏈和第二重鏈，其中所述第二輕鏈和第二重鏈的可變結構域VL和VH相互替換，且其中所述第二輕鏈和第二重鏈的恒定結構域CL和CHl相互替換。因此，對于所述特異性結合第二抗原的抗體，以下各項適用在輕鏈中可變輕鏈結構域VL被所述抗體的可變重鏈結構域VH替換，且恒定輕鏈結構域CL 被所述抗體的恒定重鏈結構域CHl替換；且在重鏈中可變重鏈結構域VH被所述抗體的可變輕鏈結構域VL替換，且恒定重鏈結構域CHl 被所述抗體的恒定輕鏈結構域CL替換。術語“抗體”用于本文中時，指完整的單克隆抗體。所述完整抗體由兩對“輕 鏈”(LC)和“重鏈”(HC)(所述輕鏈(LC)/重鏈對縮寫為LC/HC)組成。所述抗體的輕鏈和 重鏈是由若干結構域組成的多肽。在完整抗體中，每條重鏈包括重鏈可變區(qū)(縮寫為HCVR 或VH)和重鏈恒定區(qū)。重鏈恒定區(qū)包括重鏈恒定結構域CHI、CH2和CH3(抗體類型IgA， IgD,和IgG)和任選地，重鏈恒定結構域CH4 (抗體類型IgE和IgM)。每條輕鏈包括輕鏈可 變結構域VL和輕鏈恒定結構域CL。一種天然存在的完整抗體，即IgG抗體的結構顯示在例 如圖1中?？勺兘Y構域VH和VL可以進一步再分為高變區(qū)，稱為互補性決定區(qū)(CDR)，它們 之間分布有更加保守的區(qū)域，稱為構架區(qū)(FR)。每個VH和VL由三個⑶R和四個FR組成， 以以下順序從氨基端向羧基端排列:FR1, CDRl，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4 ((Janeway, C. A.， Jr.等.，Immunobiology (免疫學)，第 5 版，加蘭出版社(Garland Publishing) (2001)；和 Woof J, Burton D Nat Rev Immunol (自然免疫學綜述)4 (2004) 89-99)。兩對重鏈和輕鏈 (HC/LC)能夠特異性結合相同抗原。因此所述完整抗體是二價、單特異性抗體。所述“抗體” 包括例如小鼠抗體、人抗體、嵌合抗體、人源化抗體和遺傳改造的抗體(變異或突變抗體)， 條件是保持它們的特有特性。特別優(yōu)選人或人源化抗體，尤其作為重組的人或人源化抗體。
存在5種由希臘字母表示的哺乳動物抗體重鏈類型α，δ, ε，Υ，和 μ (Janeway, C. Α.，Jr.，等.，Immunobiology (免疫學)，第 5 版，加蘭出版社(Garland Publishing) (2001))。存在的重鏈的類型定義抗體的類型；這些鏈分別存在于IgA，IgD, IgE, IgG，和 IgM 抗體中(Rhoades RA, Pflanzer RG (2002). Human Physiology (人體生理 學)，第4版，湯姆森知識(ThomsonLearning))。不同的重鏈在尺寸和組成上不同；α和γ 含有約450個氨基酸，而μ和ε具有約550個氨基酸。每條重鏈具有兩種區(qū)域，即恒定區(qū)和可變區(qū)。恒定區(qū)在相同同種型的所有抗體中 相同，但在不同同種型的抗體中不同。重鏈Y，α和δ具有由3個恒定結構域CHl、CH2和 CH3(處于一條線上)組成的恒定區(qū)和用于增加靈活性的鉸鏈區(qū)(Woof，J.，Burton D Nat Rev Immunol (自然免疫學綜述)4(2004)89-99)；重鏈μ和ε具有由4個恒定結構域CHI、 CH2、CH3 和 CH4 組成的恒定區(qū)(Janeway, C. A.，Jr.，等.，Immunobiology (免疫學)，第 5 版， 加蘭出版社(Garland Publishing) (2001))。重鏈的可變區(qū)在由不同B細胞產生的抗體中 不同，但對由單種B細胞或B細胞克隆產生的所有抗體都是相同的。每條重鏈的可變區(qū)長 約110個氨基酸且由單抗體結構域組成。在哺乳動物中，僅存在兩類輕鏈，其稱為λ和K。輕鏈具有兩個連續(xù)的結構域 一個恒定結構域CL和一個可變結構域VL。輕鏈的近似長度是211-217個氨基酸。優(yōu)選地， 輕鏈是κ輕鏈，且恒定結構域CL優(yōu)選是C κ。術語“單克隆抗體”或“單克隆抗體組合物”用于本文中時，指單氨基酸組成的抗 體分子制劑。按照本發(fā)明的“抗體”可以是任意類型(例如IgA，IgD, IgE, IgGjP IgM，優(yōu)選IgG 或IgE)，或亞型(例如IgGl, IgG2，IgG3，IgG4，IgAl和IgA2，優(yōu)選IgGl)，其中按照本發(fā)明 的二價雙特異性抗體所源自的兩種抗體具有相同亞型(例如IgGl，IgG4等，優(yōu)選IgGl)的 Fc部分，優(yōu)選相同同種異型的Fc部分(例如高加索人)?！翱贵w的Fc部分”是熟練的技術人員公知的術語，并基于抗體的木瓜蛋白酶裂解而 定義。按照本發(fā)明的抗體包含如Fc部分，優(yōu)選源自人來源的Fc部分和優(yōu)選人恒定區(qū)的全 部其他部分。抗體的Fc部分直接參與補體活化，Clq結合，C3活化和Fc受體結合。盡管 抗體對補體系統的影響取決于特定的條件，但是與Clq的結合由Fc部分中確定的結合位點 所導致。所述結合位點是現有技術中已知的且記述在例如Lukas，Τ. J.，等.，J. Immunol. (免疫學雜志)127(1981)2555-2560 ；Brunhouse, R.，和 Cebra，J. J.，Mol. Immunol.(分 子免疫學)16(1979)907-917 ；Burton, D. R.，等·，Nature (自然)288 (1980) 338-344 ； Thommesen, J. E.，等·，Mol. Immunol.(分子免疫學)37 (2000) 995-1004 ；Idusogie, Ε. E.， 等·，J. Immunol.(免疫學雜志)164 (2000) 4178-4184 ；Hezareh, M.，等·，J. Virol.(病毒 學雜志)75 (2001) 12161-12168 ；Morgan, Α.，等.，Immunology (免疫學)86 (1995) 319-324 ； 和 EP O 307 434 中。所述結合位點是例如 L234，L235，D270，N297，E318，K320，K322，P331 和P329(按照Kabat的EU目錄編號，見下)。亞型IgGl，IgG2和IgG3的抗體通常表現出 補體活化，Clq結合和C3活化，而IgG4不活化補體系統，不結合Clq且不活化C3。優(yōu)選地， Fc部分是人Fc部分。術語“嵌合抗體”指一種抗體，其包括來自一種來源或物種的可變區(qū)，即結合區(qū)，以 及源自不同來源或物種的恒定區(qū)的至少一部分，其通常通過重組DNA技術進行制備。優(yōu)選包括鼠可變區(qū)和人恒定區(qū)的嵌合抗體。本發(fā)明涵蓋的“嵌合抗體”的其它優(yōu)選形式是這樣 的那些，其中恒定區(qū)已經被從初始抗體的恒定區(qū)開始進行修飾或改變以產生按照本發(fā)明的 特性，特別是關于Clq結合和/或Fc受體(FcR)結合。也將這種“嵌合”抗體稱作“類別 轉換抗體”。嵌合抗體是被表達的免疫球蛋白基因的產物，所述免疫球蛋白基因包括編碼免 疫球蛋白可變區(qū)的DNA區(qū)段和編碼免疫球蛋白恒定區(qū)的DNA區(qū)段。制備嵌合抗體的方法 包括目前在本領域眾所周知的常規(guī)重組DNA和基因轉染技術。見，例如，Morrison，S. L.， 等，Proc. Natl. Acad Sci. USA (美國國家科學院學報)81 (1984) 6851-6855 ；US5, 202, 238 和 5，204，244。術語“人源化抗體”指這樣的抗體，其中的構架或“互補性決定區(qū)”(OTR)已 經被修飾為包括與親本免疫球蛋白的特異性相比特異性不同的免疫球蛋白的CDR。在 一個優(yōu)選實施方案中，將鼠CDR移植到人抗體的構架區(qū)以制備“人源化抗體”。見，例 如，Riechmann, L.，等，自然(Nature) 332 (1988) 323-327 ；和 Neuberger, M. S.，等，自然 (Nature) 314 (1985) 268-270。特別優(yōu)選的CDRs對應于識別以上關于嵌合抗體指出的抗原 的那些代表性序列。發(fā)明涵蓋的“人源化抗體”的其它形式是這樣的那些，其中恒定區(qū)已 經另外被從初始抗體的恒定區(qū)開始進行修飾或改變以產生按照本發(fā)明的特性，特別是關于 Clq結合和/或Fc受體(FcR)結合。用于本文時，術語“人抗體”意欲包括具有源自人種系免疫球蛋白序列的可變 區(qū)和恒定區(qū)的抗體。人抗體是現有技術中公知的(van Dijk，M.A.，和van de Winkel, J. G.，當前化學生物學觀點(Curr. Opin. in ChemicalBiology) 5 (2001) 368-374)。人抗 體還可以在轉基因動物(例如小鼠)中產生，所述轉基因動物在免疫時能夠在缺乏內源 免疫球蛋白生成的條件下產生全部或所選的人抗體成員。在所述種系突變小鼠中轉移 人種系免疫球蛋白基因陣列將導致在抗原攻擊時產生人抗體(見，例如Jakobovits，Α.， 等.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA(美國國家科學院學報)90 (1993) 2551-2555 Jakobovits, k.，等.，Nature (自然)362 (1993) 255-258 ；Bruggemann, M.，等·，Year Immunol.(免疫 學年度)7 (1993) 33-40)。人抗體還可以在噬菌體展示文庫中產生(Hoogenboom，H. R.， 和 Winter, G, J. Mol. Biol.(分子生物學雜志)227 (1992) 381-388 ；Marks, J. D.，等.， J. Mol. Biol.(分子生物學雜志)222 (1991) 581-597)。Cole, S. P. C.，等和 Boerner 等的 技術也可以用于制備人單克隆抗體(Cole，S. P. C.，等.，Monoclonal antibodies and CancerTherapy (單克隆抗體和癌癥治療)，Alan R. Liss, Inc.，紐約(1986)，第 77-96 頁； ^P Boerner, P.，等.，J. Immunol.(免疫學雜志)147 (1991) 86-95)。如已經對按照本發(fā)明的 嵌合抗體和人源化抗體所提及地，術語“人抗體”用于本文中時還包括這樣的抗體，其在恒 定區(qū)內進行修飾以產生按照本發(fā)明的特性，特別是關于Clq結合和/或FcR結合，例如通過 “類別轉換”即改變或突變Fc部分(例如由IgGl到IgG4和/或IgGl/IgG4突變)。用于本文時，術語“重組人抗體”意欲包括通過重組方法制備、表達、產生或分離的 所有人抗體，諸如分離自宿主細胞，諸如NSO或CHO細胞的抗體或分離自人免疫球蛋白基因 的轉基因動物(例如小鼠)的抗體，或利用轉染到宿主細胞中的重組表達載體表達的抗體。 這種重組人抗體具有處于重排形式的可變區(qū)和恒定區(qū)。按照本發(fā)明的重組人抗體已經經歷 了體內體細胞高變。因此，重組抗體的VH和VL區(qū)域的氨基酸序列是這樣的序列，所述序列 盡管源自人種系VH和VL序列并與之相關，但在體內可能不天然存在于人抗體種系所有組成成分中?！翱勺兘Y構域”(輕鏈(VL)的可變結構域，重鏈(VH)的可變區(qū))用于本文中時，表 示直接參與抗體與抗原結合的每對輕鏈和重鏈對?？勺內溯p鏈和重鏈的結構域具有相同 的通用結構且每個結構域包括4個構架(FR)區(qū)，所述構架區(qū)的序列普遍保守，其通過3個 “高變區(qū)”(或互補性決定區(qū)，⑶Rs)相連接。構架區(qū)采用β-折疊構象且⑶R可以形成連接 β-折疊結構的環(huán)。每條鏈中的CDR通過構架區(qū)保持其三維結構并與來自另一條鏈的CDR 一起形成抗原結合位點?？贵w重鏈和輕鏈CDR3區(qū)在按照本發(fā)明的抗體的結合特異性/親 和性方面起特別重要的作用，并因此提供本發(fā)明的另一個目的。用于本文時，術語“高變區(qū)”或“抗體的抗原結合部分”指負責抗原結合的抗體的氨 基酸殘基。高變區(qū)包括來自“互補性決定區(qū)”或“⑶Rs”的氨基酸殘基。“構架”或“FR”區(qū) 是除本文中定義的高變區(qū)殘基之外的那些可變結構域區(qū)域。因此，抗體的輕鏈和重鏈從N 端到C端包括結構域FRl，⑶Rl、FR2、⑶R2、FR3、⑶R3和FR4。各條鏈上的⑶R通過所述構 架氨基酸分開。特別地，重鏈的⑶R3是最有助于抗原結合的區(qū)域。按照Kabat E.A.等，免 疫目的的蛋白質序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest),第 5版，公眾 健康服務，國家健康研究所(PublicHealth Service, National Institutes of Health), Bethesda, MD. (1991))的標準定義確定CDR和FR區(qū)域。重鏈和輕鏈的“恒定結構域”不直接參與抗體與抗原的結合，但是表現出多種效應 子功能。根據其重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，抗體或免疫球蛋白被分為以下類型術語“二價雙特異性抗體”用于本文中時，指如上所述的抗體，其中兩對重鏈和輕 鏈(HC/LC)中的每對特異性結合不同的抗原，即第一重鏈和第一輕鏈(源自針對第一抗原 的抗體)特異性共同結合第一抗原，且第二重鏈和第二輕鏈(源自針對第二抗原的抗體) 特異性共同結合第二抗原(如圖2中所示)；所述二價雙特異性抗體能夠同時特異性結合 兩種不同的抗原，且不超過兩種抗原，與其相對照的是，一方面僅能夠結合一種抗原的單特 異性抗體和另一方面例如能夠同時結合四種抗原分子的四價、四特異性抗體。按照本發(fā)明，所需二價雙特異性抗體與不需要的副產物的比例可以通過替換僅一 對重鏈和輕鏈(HC/LC)中的某些結構域來提高。盡管兩對HC/LC對的第一對源自特異性結 合第一抗原的抗體且保持基本不變，而兩對HC/LC對的第二對源自特異性結合第二抗原的 抗體并通過以下替換來改變-輕鏈將可變輕鏈結構域VL替換為所述特異性結合第二抗原的抗體的可變重鏈 結構域VH，且將恒定輕鏈結構域CL替換為所述特異性結合第二抗原的抗體的恒定重鏈結 構域CHl，和-重鏈將可變重鏈結構域VH替換為所沭特異件結合第二抗原的抗體的可變輕鏈 結構域VL，且將恒定重鏈結構域CHl替換為所述特異性結合第二抗原的抗體的恒定輕鏈結 構域CL。因此，由此生成的二價雙特異性抗體是人造抗體，其包括a)特異性結合第一抗原的抗體的輕鏈和重鏈；和b)特異性結合第二抗原的抗體的輕鏈和重鏈，其中(特異性結合第二抗原的抗體的)所述輕鏈包括可變結構域VH而非VL和恒 定結構域CHl而非CL，
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其中(特異性結合第二抗原的抗體的)所述重鏈包括可變結構域VL而非VH和恒 定結構域CL而非CHl。在本發(fā)明的另一方面，這樣提高的所需二價雙特異性抗體與不需要的副產物的比 例可以通過以下兩種備選方案之一進一步提高A)第一備詵方案(見圖3)所述按照本發(fā)明的二價雙特異性抗體的CH3結構域可以通過“杵-進入臼”技 術改變，該技術以若干實例詳細記述在例如WO 96/027011，RidgwayJ. B.，等.，Protein Eng (蛋白質工程)9 (1996) 617-621 ；和 Merchant，Α. Μ.，等.，Nat Biotechnol (自然生物 技術)16 (1998) 677-681中。在該方法中，改變兩個CH3結構域的相互作用表面，以增加包 含這兩個CH3結構域的兩條重鏈的異型二聚化。(兩條重鏈的)兩個CH3結構域之一可 以是“杵”，而另一個是“臼”。引入二硫鍵穩(wěn)定該異型二聚體(Merchant，Α. M，等.，Nature Biotech(自然生物技術)16(1998)677-681 ;Atwell，S.，等.J. Mol. Biol.(分子生物學雜 志)270 (1997) 26-35)并增加產率。因此在優(yōu)選的實施方案中，二價雙特異性抗體的CH3結構域通過“杵-進入_臼” 技術改變，在所述二價雙特異性抗體中，第一 CH3結構域和第二 CH3結構域分別在包括 抗體CH3結構域之間的初始界面的界面處相接觸，所述“杵-進入-白”技術包括通過 將二硫鍵引入CH3結構域而進一步穩(wěn)定化(記述在WO 96/027011, Ridgway, J. B.，等.， Protein Eng (蛋白質工程)9 (1996) 617-621 ;Merchant，Α· Μ·，等，Nature Biotech (自 然生物技術)16 (1998) 677-681 ；和 Atwell, S.，等.，J. Mol. Biol.(分子生物學雜 志)270 (1997) 26-35中)以促進所述二價雙特異性抗體的形成。因此，在本發(fā)明的一個方面，所述二價雙特異性抗體的特征在于一條重鏈的CH3結構域和另一條重鏈的CH3結構域分別在包括抗體CH3結構域之 間的初始界面的界面處相接觸；其中改變所述界面以促進二價雙特異性抗體的形成，其中所述改變的特征在于a)改變一條重鏈的CH3結構域，由此，在與二價雙特異性抗體內的另一條重鏈的CH3結構域的初始界面相接觸的 一條重鏈的CH3結構域的初始界面內，氨基酸殘基被替換為具有較大側鏈體積的氨基酸殘基，由此在一條重鏈的CH3結 構域的界面內生成凸起，該凸起可以定位在另一條重鏈的CH3結構域的界面內的凹洞中且b)改變另一條重鏈的CH3結構域，由此，在與二價雙特異性抗體內的第一 CH3結構域的初始界面相接觸的第二 CH3 結構域的初始界面內，氨基酸殘基被替換為具有較小側鏈體積的氨基酸殘基，由此在第二 CH3結構域的 界面內生成凹洞，第一 CH3結構域的界面內的凸起可以定位在該凹洞中。優(yōu)選地，所述具有較大側鏈體積的氨基酸殘基選自由精氨酸(R)，苯丙氨酸(F)， 酪氨酸(Y)，色氨酸(W)組成的組。優(yōu)選地，所述具有較小側鏈體積的氨基酸殘基選自由丙氨酸(A)，絲氨酸(S)，蘇 氨酸(T)，纈氨酸(V)組成的組。
在本發(fā)明的一個方面中，進一步改變這兩個CH3結構域，引入半胱氨酸(C)作為每 個CH3結構域相應位置處的氨基酸，從而使得可以形成兩個CH3結構域之間的二硫鍵。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，通過使用關于杵殘基的殘基R409D; K370E(K409D)和關于白殘基的D399K ；E357K來改變兩個CH3結構域，其記述在例如EP 1870459A1 中。或B)第二備詵方案(見圖4)通過將一個恒定重鏈結構域CH3替換為恒定重鏈結構域CHl ；和將另一個恒定重 鏈結構域CH3替換為恒定輕鏈結構域CL。替換重鏈結構域CH3的恒定重鏈結構域CHl可以是任何Ig類型(例如IgA，IgD, IgE, IgG，和 IgM)，或亞型(例如，IgGl, IgG2，IgG3，IgG4，IgAl 和 IgA2)的。替換重鏈結構域CH3的恒定輕鏈結構域CL可以是λ或K型，優(yōu)選K型的。因此，本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案是二價雙特異性抗體，其包括a)特異性結合第一抗原的抗體的輕鏈和重鏈；和b)特異性結合第二抗原的抗體的輕鏈和重鏈，其中可變結構域VL和VH相互替換，且其中恒定結構域CL和CHl相互替換。且其中任選地，c) 一條重鏈的CH3結構域和另一條重鏈的CH3結構域分別在包括抗體CH3結構域 之間的初始界面的界面處相接觸；其中改變所述界面以促進二價雙特異性抗體的形成，其中所述改變的特征在于ca)改變一條重鏈的CH3結構域，由此，在與二價雙特異性抗體內的另一條重鏈的CH3結構域的初始界面相接觸的 一條重鏈的CH3結構域的初始界面內，氨基酸殘基被替換為具有較大側鏈體積的氨基酸殘基，由此在一條重鏈的CH3結 構域的界面內生成凸起，該凸起可以定位在另一條重鏈的CH3結構域的界面內的凹洞中且cb)改變另一條重鏈的CH3結構域，由此，在與二價雙特異性抗體內的第一 CH3結構域的初始界面相接觸的第二 CH3 結構域的初始界面內，氨基酸殘基被替換為具有較小側鏈體積的氨基酸殘基，由此在第二 CH3結構域的 界面內生成凹洞，第一 CH3結構域的界面內的凸起可以定位在該凹洞中；或d)一個恒定重鏈結構域CH3被恒定重鏈結構域CHl替換；且另一個恒定重鏈結構域 CH3被恒定輕鏈結構域CL替換。術語“抗原”或“抗原分子”用于本文中時，可交替使用并指能夠被抗體特異性結合 的所有分子。二價雙特異性抗體特異性結合第一抗原和第二不同抗原。術語“抗原”用于 本文中時，包括例如蛋白、蛋白上的不同表位(在本發(fā)明含義內作為不同抗原)和多糖。這
11主要包括細菌、病毒和其他微生物的部分(外殼、被膜、細胞壁、鞭毛、菌毛(fimbrae)和毒 素)。脂質和核酸僅在與蛋白和多糖組合時具有抗原性。非微生物外源(非自身)抗原可 以包括花粉、蛋清和來自被移植組織和器官的蛋白或在被輸血的血細胞表面上的蛋白。優(yōu) 選地，抗原選自由細胞因子、細胞表面蛋白、酶和受體細胞因子、細胞表面蛋白、酶和受體組 成的組。腫瘤抗原是由腫瘤細胞表面上的MHC I或MHC II分子呈遞的那些抗原。這些抗 原有時可以由腫瘤細胞來呈遞，且從來不由正常細胞來呈遞。由此，它們稱為腫瘤特異性抗 原(TSAs)且典型地由腫瘤特異性突變產生。更常見的是由腫瘤細胞和正常細胞呈遞的抗 原，且它們稱為腫瘤相關抗原(TAAs)。識別這些抗原的細胞毒性T淋巴細胞可能能夠在腫 瘤細胞增殖或轉移前破壞它們。腫瘤抗原還可以采用例如突變受體的形式存在于腫瘤表面 上，在這種情形中它們應該被B細胞識別。在一個優(yōu)選的實施方案中，二價雙特異性抗體特異性結合的兩種不同抗原(第一 和第二抗原)中的至少一種是腫瘤抗原。在另一個優(yōu)選的實施方案中，二價雙特異性抗體特異性結合的兩種不同抗原(第 一和第二抗原)均是腫瘤抗原；在該情形中，所述第一和第二抗原還可以是相同腫瘤特異 性蛋白上的兩種不同表位。在另一個優(yōu)選的實施方案中，二價雙特異性抗體特異性結合的兩種不同抗原(第 一和第二抗原)之一是腫瘤抗原且另一種是效應子細胞抗原，如例如T細胞受體、⑶3、⑶16寸。在另一個優(yōu)選的實施方案中，二價雙特異性抗體特異性結合的兩種不同抗原(第 一和第二抗原)之一是腫瘤抗原且另一種是抗癌物質諸如毒素或激酶抑制劑。用于本文中時，“特異性結合”或“與……特異性結合”指特異性結合抗原的抗體。 優(yōu)選地，特異性結合該抗原的抗體的結合親和性的KD-值是10_9mol/l以下(例如I(T1V)I/ 1)，優(yōu)選KD-值是lO.mol/l以下(例如10_12mol/l)。結合親和性使用標準結合測定法，諸 如表面等離振子共振技術(Biacore )來確定。術語“表位”包括能夠特異性結合抗體的任何多肽決定子。在某些實施方案中，表 位決定子包括分子化學活性表面分組，諸如氨基酸、糖側鏈、磷?；蚧酋；以谀承?施方案中，可以具有特定的三維結構特征，且或特定的帶電特性。表位是抗體結合的抗原區(qū) 域。在某些實施方案中，當抗體在蛋白和/或高分子的復雜混合物中優(yōu)選識別其靶抗原時， 認為該抗體與抗原特異性結合。本發(fā)明的另一個實施方案是用于制備按照本發(fā)明的二價雙特異性抗體的方法，其 包括a)用以下各項轉化宿主細胞，_載體，其包括編碼特異性結合第一抗原的抗體的輕鏈和重鏈的核酸分子，和-載體，其包括編碼特異性結合第二抗原的抗體的輕鏈和重鏈的核酸分子，其中可變結構域VL和VH相互替換，且其中恒定結構域CL和CHl相互替換；b)在容許合成所述抗體分子的條件下培養(yǎng)所述宿主細胞；和
c)從所述培養(yǎng)物中回收所述抗體分子。一般地，存在兩種編碼所述特異性結合第一抗原的抗體的輕鏈和重鏈的載體，和 另外兩種編碼所述特異性結合第二抗原的抗體的輕鏈和重鏈的載體。兩種載體之一編碼各 種輕鏈，且兩種載體中的另一種編碼各種重鏈。然而，在用于制備按照本發(fā)明的二價雙特異 性抗體的另一種方法中，可以使用僅一種編碼特異性結合第一抗原的抗體的輕鏈和重鏈的 第一載體和僅一種編碼特異性結合第二抗原的抗體的輕鏈和重鏈的第二載體來轉化宿主 細胞。本發(fā)明包括用于制備所述抗體的方法，其包括在容許合成所述抗體分子的條件下 培養(yǎng)相應的宿主細胞和從所述培養(yǎng)物中回收所述抗體，其例如通過表達以下各項來實現-第一核酸序列，其編碼特異性結合第一抗原的抗體的輕鏈；_第二核酸序列，其編碼所述特異性結合第一抗原的抗體的重鏈；-第三核酸序列，其編碼特異性結合第二抗原的抗體的輕鏈，其中可變輕鏈結構域 VL被替換為可變重鏈結構域VH，且其中恒定輕鏈結構域CL被替換為恒定重鏈結構域CHl ； 和-第四核酸序列，其編碼所述特異性結合第二抗原的抗體的重鏈，其中可變重鏈結 構域VH被替換為可變輕鏈結構域VL，且其中恒定重鏈結構域CHl被替換為恒定輕鏈結構域 CL。本發(fā)明的另一個實施方案是宿主細胞，其包括_載體，其包括編碼特異性結合第一抗原的抗體的輕鏈和重鏈的核酸分子，和-載體，其包括編碼特異性結合第二抗原的抗體的輕鏈和重鏈的核酸分子，其中可變結構域VL和VH相互替換，且其中恒定結構域CL和CHl相互替換。本發(fā)明的另一個實施方案是宿主細胞，其包括a)包括編碼特異性結合第一抗原的抗體的輕鏈的核酸分子的載體和包括編碼特 異性結合第一抗原的抗體的重鏈的核酸分子的載體，和b)包括編碼特異性結合第二抗原的抗體的輕鏈的核酸分子的載體和包括編碼特 異性結合第二抗原的抗體的重鏈的核酸分子的載體，其中可變結構域VL和VH相互替換，且其中恒定結構域CL和CHl相互替換。本發(fā)明的另一個實施方案是按照本發(fā)明的二價雙特異性抗體的組合物，優(yōu)選藥物 或診斷組合物。本發(fā)明的另一個實施方案是藥物組合物，其包括按照本發(fā)明的抗體和至少一種藥 用賦形劑。本發(fā)明的另一個實施方案是用于治療需要治療的患者的方法，其特征在于向所述 患者施用治療有效量的按照本發(fā)明的二價雙特異性抗體。術語“核酸或核酸分子”，用于本文中時，意欲包括DNA分子和RNA分子。核酸分子 可以是單鏈或雙鏈的，但優(yōu)選是雙鏈DNA。
用于本文中時，表述“細胞”、“細胞系，，和“細胞培養(yǎng)物，，可交替使用，且全部這些 名稱都包括后代。因此，詞語“轉化體”和“轉化的細胞”包括原代受試者細胞和由其來源 的培養(yǎng)物，而不考慮轉移數。還理解所有的后代的DNA含量可能不精確一致，這歸因于有意 或無意的突變。包括在最初轉化的細胞中篩選的具有相同功能或生物學活性的變異后代。 在意指不同名稱時，其將通過上下文而清楚。術語“轉化”用于本文中時，指將載體/核酸轉移到宿主細胞中的過程。如果將無 難以克服的細胞壁屏障的細胞用作宿主細胞，則轉染例如通過如Graham，F. L.，和van der Eb, A. J.，Virology (病毒學)52 (1973) 456-467所述的磷酸鈣沉淀法來進行。然而，還可以 使用其他將DNA引入細胞中的方法，諸如通過電穿孔、核染(nucleofection)、核注射或通 過原生質體融合。如果使用原核細胞或包含實質細胞壁結構的細胞，例如一種轉染方法是 利用氯化鈣的鈣處理，如Cohen, S. N，等，PNAS. 69 (1972) 2110-2114所述。利用轉化重組生成抗體是現有技術中公知的且記述在，例如，綜述文章Makrides， S. C. , Protein Expr · Pur if.(蛋白表達純化)17 (1999) 183-202 ；Geisse, S.，等· , Protein Expr. Purif.(蛋白表達純化)8 (1996) 271-282 ；Kaufman, R. J.，Mol. Biotechnol.(分子生 物技術)16 (2000) 151-160 ；Werner, R. G.，等·，Arzneimittelforschung 48 (1998) 870-880 中，以及 US 6，331，415 和 US 4，816，567 中。用于本文中時，“表達”指將核酸轉錄為mRNA的過程和/或將轉錄的mRNA(也稱 為轉錄物)隨后翻譯為肽、多肽或蛋白質的過程。轉錄物和所編碼的多肽共稱為基因產物。 如果多核苷酸源自基因組DNA，則在真核細胞中的表達可以包括mRNA的剪接?！拜d體”是核酸分子，特別是自我復制的，其將插入的核酸分子轉移到宿主細胞之 中和/或之間。該術語包括主要功能為將DNA或RNA插入細胞(例如，染色體整合)的載 體，主要功能是復制DNA或RNA的復制載體，和功能是轉錄和/或翻譯DNA或RNA的表達載 體。還包括提供多于一種上述功能的載體。“表達載體”是多核苷酸，其在引入合適的宿主細胞時能夠被轉錄和翻譯為多肽。 “表達系統”通常指包括表達載體的適當宿主細胞，所述表達載體可以起作用產生所需的表 達產物。按照本發(fā)明的二價雙特異性抗體優(yōu)選通過重組手段生成。所述方法是本領域中普 遍已知的，且包括在原核和真核細胞中的蛋白質表達及隨后分離抗體多肽和通常純化到藥 用純度。對于蛋白質表達，通過標準方法將編碼輕鏈和重鏈或其片段的核酸插入表達載體 中。表達在合適的原核或真核宿主細胞如CHO細胞，NSO細胞，SP2/0細胞，HEK293細胞， COS細胞，PER. C6細胞，酵母或大腸桿菌(E. coli)細胞中進行，且從所述細胞(溶胞后的 上清或細胞)中回收抗體。二價雙特異性抗體可以存在于完整細胞中、細胞溶解產物中或 以部分純化或基本純的形式存在。通過標準技術，包括堿/SDS處理，柱層析法和其他本領 域公知技術進行純化，從而消除其他細胞成分或其他污染物，例如其他細胞核酸或蛋白。參 BAusubel, F. . ,He, Current Protocols in Molecular Biology( ^m^^^^Tj 案)，Greene Publishing and Wiley Interscience, (1987)。在NSO細胞中的表達記述在，例如，Barnes, L. Μ.，等.，Cytotechnology (細胞 技術學)32 (2000) 109-123 ；和 Barnes，L. Μ.，等.，Biotech. Bioeng.(生物技術和生物工 程)73 (2001) 261-270 中。瞬時表達記述在，例如，Durocher，Y.，等·，Nucl. Acids. Res.(核酸研究)30 (2002)E9中。可變結構域的克隆記述在Orlandi，R.，等.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA(美國國家科學院學報)86 (1989) 3833-3837 ；Carter, P.，等.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (美國國家科學院學報)89 (1992) 4285-4289 ；和 Norderhaug，L.，等.，J. Immunol. Methods (免疫學方法雜志)204 (1997) 77-87中。優(yōu)選的瞬時表達系統(HEK 293)記述在 Schlaeger, E. -J.，和 Christensen, K.，在 Cytotechnology (細胞技術學)30 (1999) 71-83 中和 Schlaeger, E. -J.，在 J. Immunol. Methods (免疫學方法雜志)194 (1996) 191-199 中。適合于原核生物的控制序列，例如，包括啟動子，任選操縱子序列，和核糖體結合 位點。已知真核細胞利用啟動子、增強子和加A信號。當核酸在被置于與另一個核酸序列的功能關系中時，是“可操作地連接的”。例如， 前序列或分泌前導序列的DNA與多肽的DNA可操作地連接，條件是其表達為參與多肽分泌 的前蛋白；啟動子或增強子與編碼序列可操作地連接，條件是其影響序列的轉錄；或核糖 體結合位點與編碼序列可操作地連接，條件是其被定位為促進翻譯。一般地，“可操作地連 接的”意指被連接的DNA序列是連續(xù)的，且在分泌前導序列的情形中，是連續(xù)的且在閱讀框 中。然而，增強子不必須是連續(xù)的。連接通過在方便的限制性位點處的連接來實現。如果 不存在所述位點，則根據常規(guī)實踐使用合成的寡核苷酸接合體或連接體。通過常規(guī)免疫球蛋白純化程序，諸如例如，蛋白A-瓊脂糖，羥磷灰石層析法，凝膠 電泳，透析，或親合層析法，從培養(yǎng)基中適當分離二價雙特異性抗體。編碼單克隆抗體的DNA 和RNA容易利用常規(guī)程序分離和測序。雜交瘤細胞可以作為所述DNA和RNA的來源。一旦 分離后，可以將DNA插入到表達載體中，所述表達載體隨后轉染到不另外產生免疫球蛋白 的宿主細胞諸如HEK 293細胞、CHO細胞、或骨髓瘤細胞中，以在宿主細胞中獲得重組單克 隆抗體的合成。二價雙特異性抗體的氨基酸序列變體(或突變體)通過將適當的核苷酸改變引入 到抗體DNA中，或通過核苷酸合成來制備。然而，這樣的修飾僅能在非常有限的范圍內，例 如如上所述的范圍內進行。例如，所述修飾不改變上述抗體特征諸如IgG同種型和抗原結 合，但可以提高重組生產的產率、蛋白穩(wěn)定性或促進純化。提供以下實施例、序列表和附圖來幫助理解本發(fā)明，本發(fā)明的真正范圍在所附權 利要求中描述。應該理解在不偏離本發(fā)明精神的條件下可以對所述程序進行改變。序列表SEQ ID NO 1野生型<IGF_1R>抗體重鏈的氨基酸序列SEQ ID NO 2野生型<IGF_1R>抗體輕鏈的氨基酸序列SEQ ID NO :3<IGF-1R>VL-VH/CL_CH1交換抗體的重鏈*(HC*)的氨基酸序列，其中 重鏈結構域VH被替換為輕鏈結構域VL，且重鏈結構域CHl被替換為輕鏈結構域CL。SEQ ID NO :4<IGF-1R>VL-VH/CL_CH1交換抗體的輕鏈*(LC*)的氨基酸序列，其中 輕鏈結構域VL被替換為重鏈結構域VH，且輕鏈結構域CL被替換為重鏈結構域CHl。SEQ ID NO :5IGF_1R胞外域His-鏈霉親和素結合肽-標記物(IGF-IR-His-SBP ECD)的氨基酸序列SEQ ID NO 6野生型血管生成素_2<ANGPT2>抗體重鏈的氨基酸序列SEQ ID NO 7野生型血管生成素_2<ANGPT2>抗體輕鏈的氨基酸序列SEQ ID NO :8<ANGPT2>VL-VH/CL_CH1交換抗體的重鏈* (HC*)的氨基酸序列，其中重鏈結構域VH被替換為輕鏈結構域VL，且重鏈結構域CHl被替換為輕鏈結構域CL。SEQ ID NO :9<ANGPT2>VL-VH/CL_CH1交換抗體的輕鏈* (LC*)的氨基酸序列，其中 輕鏈結構域VL被替換為重鏈結構域VH，且輕鏈結構域CL被替換為重鏈結構域CHl。SEQ ID NO 10用于杵-進入-臼技術的具有T366W交換的CH3結構域(杵)的
氨基酸序列SEQ ID NO 11用于杵-進入-臼技術的具有T366S，L368A，Y407V交換的CH3結 構域(臼)的氨基酸序列SEQ ID NO 12野生型<VEGF>抗體重鏈的氨基酸序列SEQ ID NO 13和14具有和不具有前導序列的野生型<VEGF>抗體輕鏈的氨基酸 序列SEQ ID NO :15<ANGPT2>VL-VH/CL_CH1 交換抗體的重鏈 *(HC*)的氨基酸序列，其 中重鏈結構域VH被替換為輕鏈結構域VL，且重鏈結構域CHl被替換為輕鏈結構域CL，且 CH3結構域攜帶具有T366S，L368A，Y407V交換(臼)的氨基酸序列以用于杵-進入-臼技 術SEQ ID NO :16野生型<VEGF>抗體重鏈的氨基酸序列，其中CH3結構域攜帶具有 T366W(杵)交換的氨基酸序列以用于杵-進入-臼技術SEQ ID NO 17<ANGPT2>VL-VH/CL_CH1 交換抗體的重鏈(G)* (HC*)的氨基酸序列， 其中重鏈結構域VH被替換為輕鏈結構域VL，且重鏈結構域CHl被替換為具有另外的甘氨酸 插入的輕鏈結構域CL。SEQ ID NO 18<ANGPT2>VL-VH/CL_CH1 交換抗體的輕鏈(G)* (LC*)的氨基酸序列， 其中輕鏈結構域VL被替換為重鏈結構域VH，且輕鏈結構域CL被替換為具有另外的甘氨酸 插入的重鏈結構域CHl。


圖IIgG的示意圖，IgG即為天然存在的特異于一種抗原的完整抗體，其具有兩對 重鏈和輕鏈，所述重鏈和輕鏈具有處于典型順序的可變結構域和恒定結構域。圖2 二價雙特異性抗體的示意圖，所述二價雙特異性抗體包括a)特異性結合第 一抗原的抗體的輕鏈和重鏈；和b)特異性結合第二抗原的抗體的輕鏈和重鏈，其中可變結 構域VL和VH相互替換，且其中恒定結構域CL和CHl相互替換。圖3 二價雙特異性抗體的示意圖，所述二價雙特異性抗體包括a)特異性結合第 一抗原的抗體的輕鏈和重鏈；和b)特異性結合第二抗原的抗體的輕鏈和重鏈，其中可變結 構域VL和VH相互替換，且其中恒定結構域CL和CHl相互替換，且其中通過杵-進入-臼 技術改變兩條重鏈的CH3結構域。圖4 二價雙特異性抗體的示意圖，所述二價雙特異性抗體包括a)特異性結合第 一抗原的抗體的輕鏈和重鏈；和b)特異性結合第二抗原的抗體的輕鏈和重鏈，其中可變結 構域VL和VH相互替換，且其中恒定結構域CL和CHl相互替換，且其中兩條重鏈的恒定重 鏈結構域CH3之一被替換為恒定重鏈結構域CHl，且另一個獲恒定重鏈結構域CH3被替換為 恒定輕鏈結構域CL。圖5<IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交換抗體的重鏈*<IGF_lR>HO的蛋白序列圖
圖6<IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交換抗體的輕鏈*<IGF_lR>LO的蛋白序列7重鏈*<IGF_lR>HO表達載體pUC-HO-IGF-lR的質粒圖譜圖8輕鏈*<IGF-1R>LC*表達載體pUC-LO-IGF-lR的質粒圖譜圖94700-Hyg_0riP表達載體的質粒圖譜圖10具有HC*和LC*的單特異性二價<IGF-1R>VL-VH/CL_CH1交換抗體(IgGl*) 的SDS-PAGE，所述單特異性二價<IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交換抗體(IgGl*)是從瞬時轉染 HEK293E細胞后的細胞培養(yǎng)物上清中，通過使用蛋白質A瓊脂糖的免疫沉淀法分離的。圖11在基于ELISA的結合測定中，單特異性<IGF-1R>VL-VH/CL_CH1交換抗體和 野生型<IGF-1R>抗體與IGF-IR ECD的結合。圖12重鏈*<ANGPT2>HC*表達載體pUC-HO_ANGPT2>的質粒圖譜圖13輕鏈*<ANGPT2>LC*表達載體pUC-LC*_ANGPT2>的質粒圖譜圖14通過蛋白質A親合層析法及隨后的大小排阻層析法和濃縮，從細胞培養(yǎng) 物上清中純化的以下各項的混合物的還原SDS-PAGE的和非還原SDS-PAGE =A)單特異性 <IGF-1R>VL-VH/CL-CH1 交換抗體，B)雙特異性 <ANGPT2-IGF-1R>VL-VH/CL_CH1 交換抗體和 C) <ANGPT2>野生型抗體(“雙特異性VL-VH/CL-CH1交換混合物”)圖15對于124 IGF-IR表達細胞進行的用于檢測功能雙特異性 <ANGPT2-IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交換抗體的存在的細胞FACSIGF-1R-ANGPT2橋連測定的測 定原理。圖16對于I24IGF-1R表達細胞進行的用于檢測細胞培養(yǎng)物上清中存在功能雙特 異性<ANGPT2-IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交換抗體的細胞FACS IGF-1R-ANGPT2橋連測定的樣 品A-G的結果。
圖17對于124 IGF-IR表達細胞進行的用于檢測功能雙特異性 <ANGPT2-IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交換抗體的存在的細胞FACSIGF-1R-ANGPT2橋連測定的樣 品A-G的結果。 圖 18IGF-1R ECD 結合 ELISA 的示意19ANGPT2結合ELISA的示意 20VEGF-ANGPT2 橋連 ELISA 的示意21ANGPT2-VEGF橋連Biacore測定的示意22<IGF-1R>VL-VH/CL-CH1 交換抗體純化物的 SDS-PAGE，純化的 <IGF-1R>VL-VH/CL-CH1 交換抗體對應于濃縮的 SEC 庫；B)純化的 <IGF-1R>VL-VH/CL_CH1 交換抗體的大小排阻層析圖 23<ANGPT2>VL-VH/CL-CH1 交換抗體純化物的 SDS-PAGE，純化的 <ANPT2>VL_VH/ CL-CHl交換抗體對應于濃縮的SEC庫；B)純化的<ANGPT2>VL-VH/CL-CH1交換抗體的大小 排阻層析圖24在基于ELISA 的結合測定中，單特異性<ANGPt2>VL-VH/CL_CHl交換抗體和 野生型<ANGPt2>抗體與ANGPT2的結合。圖25單特異性<ANGPt2>VL-VH/CL-CHl交換抗體和野生型<ANGPt2>抗體與ANGPT2的結合的Biacore分析圖26來自雙特異性<VEGF-ANGPT2>VL-VH/CL-CH1交換抗體的大小排阻層析的洗 脫級分的還原SDS-PAGE和非還原SDS-PAGE圖27通過天然級分質譜法獲得的SDS-PAGE中的條帶分配。顯示通過質譜法鑒定 的蛋白在各種未還原SDS-PAGE中的位置圖 28 在 VEGF-ANGPT2 橋連 ELISA 中，來自雙特異性 <VEGF-ANGPT2>VL-VH/CL_CH1 交換抗體的大小排阻層析的洗脫級分5和9的分析。包括同時識別ANGPT2和VEGF的雙特 異性四價抗體TvG6-Ang23作為陽性對照。圖 29 在 VEGF-ANGPT2 橋連 Biacore 測定中，來自雙特異性 <VEGF-ANGPT2>VL_VH/ CL-CHl交換抗體的大小排阻層析的洗脫級分5和9的表面等離振子共振分析。包括同時識 別ANGPT2和VEGF的雙特異性四價抗體TvG6-Ang23作為陽性對照。圖30具有用于異型二聚化的杵-入-臼的雙特異性<VEGF-ANGPT2>VL-VH/CL-CH1 交換抗體的31單特異性<ANGPT2>VL-VH(G) /CL-CHl (G)交換抗體和野生型<ANGPT2>抗體 與ANGPT2的結合的Biacore分析。
實施例材料和一般方法關于人免疫球蛋白輕鏈和重鏈的核苷酸序列的一般信息在Kabat，Ε. Α.，等.，免 疫目的的蛋白質序列(Sequences of Proteins of Immunologicallnterest),第5版，公眾 健康服務，國家健康研究所(Public Health Service,National Institutes of Health), Bethesda,MD. (1991))中提供。按照EU編號對抗體鏈的氨基酸進行編號和提及(Edelman， G. Μ.，等.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA (美國國家科學院學報)63 (1969) 78-85 ；Kabat, Ε. A.， 等·，免疫目的的蛋白質序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest), 第5版，公眾健康服務，國家健康研究所(Public Health Service, National Institutes ofHealth)，Bethesda, MD. (1991))。重組DNA技術使用標準方法操作 DNA，如 Sambrook，J.等·，Molecular cloning :Alaboratory manual (分子克隆實驗室手冊)；Cold Spring Harbor LaboratoryPress (冷泉港實驗室 出版社)，Cold Spring Harbor (冷泉港)，紐約，1989中所述。分子生物學試劑按照供應商 說明使用。基因合成所需基因區(qū)段由通過化學合成制備的寡核苷酸制備。側連單限制性內切酶裂解 位點的600-1800bp長的基因區(qū)段通過包括PCR擴增的寡核苷酸的退火和連接來裝配，并 隨后通過所指出的限制位點例如KpnI/SacI或AscI/PacI克隆到基于pGA4的克隆載體的 pPCRScript (Stratagene)中。亞克隆的基因片段的DNA序列通過DNA測序驗證?；蚝铣?片段按照Geneart (Regensburg，德國)的提供的說明書來訂購。DNA序列確定DNA j^5 ^lJ it il ^ MediGenomix GmbH(Martinsried, H Bl ) $ SequiserveGmbH(Vaterstetten，德國)進行的雙鏈測序來確定。DNA和蛋白序列分析和序列數據管理GCG (Genetics Computer Group (遺傳學計算小組)，Madison，威斯康星)的軟件 包版本 10. 2 和 Infomax 載體 NTl 進展組版本 8. O (Infomax' s VectorNTl Advance suite version 8.0)用于序列構建、作圖、分析、注解和說明。表達載體為了表達所述抗體，應用用于基于具有CMV-內含子A啟動子的cDNA構造或基于 具有CMV啟動子的基因組構造的細胞中(例如在HEK293EBNA或HEK293-F中)瞬時表達的 表達質粒的變體。除抗體表達盒以外，所述載體包括-復制起點，其容許該質粒在大腸桿菌中復制和-β -內酰胺酶基因，其在大腸桿菌中賦予氨芐青霉素抗性?？贵w基因的轉錄單元由以下元件組成-5’末端處的特有限制性位點_來自人巨細胞病毒的即時早期增強子和啟動子，-在cDNA構造的情形中，隨后是內含子A序列，-人抗體基因的5’-非翻譯區(qū)，
-免疫球蛋白重鏈信號序列，-人抗體鏈(野生型或具有結構域交換)，其作為cDNA或作為具有免疫球蛋白外 顯子_內含子構造的基因組構造-具有加A信號序列的3’非翻譯區(qū)，和-3’末端處的特有限制性位點。如下所述的包括所述抗體鏈的融合基因通過PCR和/或基因合成產生，并使用已 知的重組方法和技術來裝配，所述重組方法和技術通過在各種載體中例如利用特有的限制 性位點來連接相應的核酸區(qū)段來實現。亞克隆的核酸序列通過DNA測序來驗證。為了瞬 時轉染，通過來自轉化的大腸桿菌培養(yǎng)物的質粒制備物來制備更大量的質粒(Nucleobond AX, Macherey-Nagel)。細胞培養(yǎng)技術使用如Current Protocols in Cell Biology (當前細胞生物學方案)(2000)， Bonifacino, J. S. , Dasso, Μ. , Harford, J. B. , Lippincott-Schwartz, J.禾口 Yamada, K. Μ.(編)，John Wiley & Sons，Inc中所述的標準細胞培養(yǎng)技術。通過在貼壁生長的HEK293-EBNA中或在懸浮生長的HEK29-F細胞中瞬時共轉染各 種表達質粒來表達雙特異性抗體，如下所述。HEK293-EBNA系統中的瞬時轉染雙特異性抗體通過在貼壁生長的HEK293-EBNA細胞(表達EB病毒核抗原的人胚 腎細胞系293 ；美國典型培養(yǎng)物中心，保藏號ATCC#CRL-10852，Lot. 959 218)中瞬時共轉 染各種表達質粒(例如編碼重鏈和修飾的重鏈，以及相應的輕鏈和修飾的輕鏈)來表達， 所述HEK293-EBNA細胞是在增補了 10%超低IgG FCS (胎牛血清，Gibco)，2mM L-谷氨酰 胺(Gibco)，和 250μ g/ml 遺傳霉素(geneticin) (Gibco)的 DMEM(Dulbecco，smodified
20Eagle’ s medium(Dulbecco 改良的 Eagle 培養(yǎng)基)，Gibco)中培養(yǎng)的。為了轉染，FuGENE 6轉染試劑(Roche Molecular Biochemicals (羅氏分子生物化學))按照FuGENE 試劑 (μ )與DNA(yg)的比例為4 1(在3 1 6 1的范圍內)來使用。利用編碼(修 飾的和野生型)輕鏈和重鏈的質粒的摩爾比為1 1(等摩爾)，其范圍是1 2 2 1， 分別由各種質粒來表達蛋白。在第3天，用L-谷氨酰胺加至4mM，葡萄糖[西格瑪(Sigma)] 和NAA[Gibco]飼養(yǎng)細胞。在在轉染后第5-11天通過離心收獲包含雙特異性抗體的細胞培 養(yǎng)物上清并保存在-20°C。關于人免疫球蛋白在例如HEK293細胞中的重組表達的一般信息 提供在 Meissner, P.等.，Biotechnol. Bioeng.(生物技術和生物工程)75 (2001) 197-203 中。HEK293-F系統中的瞬時轉染雙特異性抗體通過利用HEK293-F系統(Invitrogen)按照供應商的說明瞬時轉 染各種質粒(例如編碼重鏈和修飾的重鏈，以及相應的輕鏈和修飾的輕鏈)來生成。簡 言之，用四種表達質粒和293feCtin或fectin(Invitrogen)的混合物來轉染在搖瓶中 或在攪拌發(fā)酵器中在無血清FreeStyle 293表達培養(yǎng)基(Invitrogen)中懸浮生長的 HEK293-F (Invitrogen)。對于 2L 搖瓶(Coming)，HEK293-F 細胞以 1. 0E*6 細胞 /mL 的 密度接種在600mL中并以120rpm，8% C02溫育。第二天，用ca. 42mL的A)具有600 μ g 等摩爾比的分別編碼重鏈或修飾的重鏈，和相應輕鏈的總質粒DNA(1 μ g/mL)的2OmL Opti-MEM(Invitrogen)和 B) 20ml Opti-MEM+1. 2mL 293 fectin 或 fectin (2 μ 1/mL)的混 合物，以ca. 1.5E*6細胞/mL的細胞密度來轉染細胞。在發(fā)酵過程中根據葡萄糖的消耗，添 加葡萄糖溶液。在5-10天時收獲包含分泌的抗體的上清，并且直接由上清純化抗體，或冷 凍并保存上清。蛋白確定純化的抗體和衍生物的蛋白濃度通過利用基于氨基酸序列計算的摩爾消光系數 確定280nm處的光密度(OD)來確定，其依照Pace，C.N.，等，Protein Science (蛋白質科 學)，1995,4,2411-1423 進行。上清中抗體濃度的確定抗體和衍生物在細胞培養(yǎng)物上清中的濃度通過使用蛋白質A瓊脂糖-珠 (Roche(FS))的免疫沉淀法來估算。60yL蛋白質A瓊脂糖珠在TBS-NP40(50mM Tris, pH 7. 5,150mM NaCl，1 % Nonidet_P40)洗滌三次。隨后，將 l_15mL 細胞培養(yǎng)物上 清應用于在TBS-NP40中預平衡的蛋白質A瓊脂糖珠。室溫下溫育1小時后，將該珠在 Ultrafree-MC-過濾柱(Amicon)上用 0. 5mL TBS-NP40 洗滌 1 次，用 0. 5mL 2x 磷酸鹽緩沖 液(2xPBS，Roche (羅氏))洗滌2次并用0. 5mL IOOmM檸檬酸鈉pH 5，O簡單洗滌4次。通 過添加35 μ 1 NuPAGE LDS樣品緩沖液(Invitrogen)洗脫結合的抗體。樣品的一半分 別與NuPAGE 樣品還原劑混合或保持未還原，并在70°c加熱10分鐘。隨后，將5-30 μ 1 應用于 4-12%NuPAGE BiS-Tris SDS-PAGE(Invitrogen)(具有 MOPS 緩沖液，以用于非 還原的SDS-PAGE，且具有NuPAGE 抗氧化運行緩沖液添加劑(Invitrogen)的MES緩沖 液，以用于還原的SDS-PAGE)，并用考馬斯藍染色。抗體和衍生物在細胞培養(yǎng)物上清中的濃度通過親合HPLC層析法來定量測量。簡 言之，將包含結合蛋白質A的抗體和衍生物的細胞培養(yǎng)物上清應用于處于200mM KH2P04，
21IOOmM檸檬酸鈉，pH 7. 4中的應用生物系統(Applied Biosystems)Poros A/20柱，并在安 捷倫(Agilent)HPLC 1100系統上用200mM NaCl，IOOmM檸檬酸，pH 2,5由基質洗脫。洗脫 的蛋白通過UV吸光度和峰面積整合來量化。純化的標準IgGl抗體作為標準物。備選地，抗體和衍生物在細胞培養(yǎng)物上清中的濃度通過夾心式-IgG-ELISA來 測量。簡言之，將Str印taWell高結合鏈霉親和素A-96孔微量滴定板(Roche(FS)) 用100 μ L/孔生物素化的抗人IgG捕獲分子F (ab’)2<h_Fc γ >BI (Dianova)，以0· 1 μ g/ mL在室溫下包被1小時或備選地在4°C包被過夜，并隨后用200 μ L/孔PBS，0. 05 %吐 溫(PBST，Sigma(西格瑪))洗滌3次。將100 μ L/孔包含各種抗體的細胞培養(yǎng)物上清 在PBS(Sigma(西格瑪))中的稀釋物系列加入到孔中，并在微量滴定板搖動器上，以室 溫溫育1-2小時?？子?00 μ L/孔PBST洗滌三次，并且用100 μ 1濃度為0. 1 μ g/mL的 F(ab ‘)2<hFc y >P0D (Dianova)作為檢測抗體，在微量滴定板搖動器上，在室溫下檢測結合 的抗體1-2小時。未結合的檢測抗體用200 μ L/孔PBST洗滌三次洗掉，并且結合的檢測抗 體通過添加100 μ LABTS/孔來檢測。在Tecan Fluor分光計上，以405nm的測量波長(參 照波長492nm)來進行吸光度的確定。蛋白質純化參考標準流程，從過濾的細胞培養(yǎng)物上清中純化蛋白。簡言之，將抗體應用于蛋白 質A瓊脂糖柱(GE healthcare (GE健康護理))并用PBS洗滌。在pH 2. 8實現抗體洗脫， 并隨后立即中和樣品。在PBS中或在20mM組氨酸，150mM NaCl pH 6.0中，通過大小排阻 層析法(Superdex 200，GEhealthcare (GE健康護理))將聚集的蛋白質與單體抗體分開。 匯集單體抗體級分，如果需要，利用MILLIPORE Amicon Ultra(30MWC0)離心濃縮器濃縮，冷 凍和在-20°C或-80°C保存其。提供部分樣品進行隨后的蛋白質分析和分析表征，例如通過 SDS-PAGE、大小排阻層析法或質譜法進行。SDS-PAGENuPAGE 預制凝膠系統(Irwitrogen)按照供應商的說明來使用。具體地，使用 10%或 4-12%NuPAGE Novex Bis-TRIS 預制凝膠(pH 6. 4)和NuPAGE , MES (還 原的凝膠，具有NuPAGE 抗氧化運行緩沖液添加劑)或MOPS(未還原的凝膠)運行緩沖液。分析大小排阻層析法用于確定抗體聚集和低聚狀態(tài)的大小排阻層析法通過HPLC層析法來進行。簡言 之，將蛋白質A純化的抗體應用于安捷倫(Agilent)HPLC 1100系統上處于300mM NaCl, 50mM KH2P04/K2HP04, pH 7· 5 中的 TosohTSKgel G3000SW 柱或 Dionex HPLC-系統上處于 2x PBS中的Superdex200柱(GE healthcare (GE健康護理))。洗脫的蛋白通過UV吸光度 和峰面積的整合來量化。BioRad凝膠過濾標準151-1901作為標準物。質譜法交叉抗體的總去糖基化質量通過電噴射離子化質譜法(ESI-MS)來確定和驗證。 簡言之，用處于 IOOmM KH2P04/K2HP04, pH 7 中的 50mU N-糖苷酶 F(PNGaseF，ProZyme)在 37°C,以至多2mg/ml的蛋白質濃度，將100 μ g純化的抗體去糖基化12-24小時，并隨后在 Sephadex G25柱(GEhealthcare (GE健康護理))上通過HPLC來脫鹽。各種重鏈和輕鏈的質 量在去糖基化和還原后通過ESI-MS來確定。簡言之，處于115μ 1中的50yg抗體用60 μ 1IM TCEP和50 μ 1 8Μ鹽酸胍來溫育，并隨后脫鹽?？傎|量和還原的重鏈和輕鏈的質量通過 在裝配了 NanoMate源的Q-Star Elite MS系統上進行ESI-MS來確定。IGF-IR ECD 結合 ELISA產生的抗體的結合特性在使用IGF-IR胞外結構域(EOT)的ELISA測定中評估。 為了該目的，將IGF-IR的胞外結構域(殘基1-462)，其包括與N-端His-鏈霉親和素結合 肽-標記物(His-SBP)融合的α鏈(根據McKern等.，1997 ；Ward等.，2001)的人IGF-IR 胞外域的天然前導序列和LI-富含半胱氨酸-12結構域(Ll-cysteine rich-12 domain)， 克隆到pcDNA3載體衍生物中，并在HEK293F細胞中瞬時表達。IGF-IR-His-SBP ECD的蛋 白質序列在SEQ ID NO 5中給出。將Str印taWell高結合鏈霉親和素A-96孔微量滴定板 (Roche (羅氏))用100 μ L/孔含有可溶性IGF-IR-E⑶-SBP融合蛋白的細胞培養(yǎng)物上清在 4°C包被過夜，并用200 μ L/孔PBS，0.05%吐溫(PBST，Sigma (西格瑪))洗滌三次。隨后， 100 μ L/孔處于包含1%BSA(級分V，Roche (羅氏))的PBS (Sigma (西格瑪))中的各種抗 體的稀釋物系列和作為參照的野生型<IGF-1R>抗體加入到孔中，并在微量滴定板搖動器 上在室溫下溫育1-2小時。對于稀釋物系列，將等量的純化抗體作為參照或來自通過夾心 式-IgG-ELISA針對相同抗體濃度標準化的HEK293E (HEK293F)中的瞬時轉染的上清應用于 所述孔。該孔用200 μ L/孔PBST洗滌三次，并且結合的抗體用濃度為0. 1 μ g/mL的100 μ L/ 孔F (ab ‘)2<hFc y >P0D (Dianova)作為檢測抗體在微量滴定板搖動器上，在室溫下檢測1_2 小時。未結合的檢測抗體使用200 μ L/孔PBST洗滌三次洗掉，并且結合的檢測抗體通過添 加100 μ L ABTS/孔來檢測。在Tecan Fluor分光計上，以405nm的測量波長(參照波長 492nm)來進行吸光度的確定。IGF-IR ECD Biacore產生的抗體與人IGF-IR ECD的結合也通過利用BIACORE TlOO儀器(GE healthcare Biosciences AB (GE健康護理生物科學AB)，Uppsala，瑞典)的表面等離振子 共振來研究。簡言之，為了親合測量，通過用于呈遞針對Fc標記的人IGF-IR E⑶(human IGF-IR ECD-Fc tagged)的抗體的胺偶聯在CM5芯片上固定山羊-抗-人IgG，JIR 109-005-098 抗體。結合在 HBS 緩沖液(HBS_P(10mM HEPES, 150mM NaCl，0. 005%吐溫 20， ph 7.4)中，25°C測量。將IGF-IR E⑶(R&D系統或內部純化的)以不同濃度加入到溶液中。 締合通過IGF-IR E⑶注射80秒-3分鐘來測量；解離通過用HBS緩沖液洗滌芯片表面3_10 分鐘來測量，且KD值利用1 1朗繆爾結合模式(Langmuir binding model)來評估。由 于<IGF-1R>抗體的低負載密度和捕獲水平，獲得單價IGF-IR ECD結合。從樣品曲線中減 去陰性對照數據(例如緩沖液曲線)，以用于校正系統固有的基線漂移和用于噪音信號的 降低。使用Biacore TlOO評估軟件版本1. 1. 1來分析S曲線(sensorgrams)和用于計算 親合數據(圖18)。ANGPT2 結合 ELISA產生的抗體的結合特性在使用全長ANGPT2_His蛋白(R&D Systems (R&D系統)) 的ELISA測定中進行。為了該目的，將Falcon聚苯乙烯透明強化微量滴定板用處于PBS中 的100 μ 11 μ g/mL重組人ANGPT2 (R&DSystems (R&D系統)，無載體)在室溫下包被2小時 或在4°C包被過夜?？子?00 μ 1 PBST (0，2%吐溫20)洗滌3次，并用200 μ 1 2% BSA 0， 1 %吐溫20在室溫下封閉30分鐘，并隨后用300 μ 1 PBST洗滌3次。將100 μ L/孔處于PBS(Sigma(西格瑪))中的純化的<ANGPT2>VL-VH/CL_CH1交換抗體的稀釋物系列和作為 參照的野生型<ANGPT2>抗體加入到孔中，并在微量滴定板搖動器上在室溫下溫育1小時。 該孔用300μ1 PBST (0，2%吐溫20)洗滌3次，并且結合的抗體用處于2% BSA 0，1%吐溫 20 中的 100 μ L/ 孑L 0. 1 μ g/ml F (ab ‘)<hk>P0D (Biozol Cat. No. 206005)或 100 μ L/ 孔 0. 1 μ g/mlF (ab ‘)<hFc y >P0D (Immuno research (免疫研究))作為檢測抗體在微量滴定板 搖動器上在室溫下進行檢測1小時。未結合的檢測抗體使用300 μ L/孔PBST洗滌三次洗 掉，并且結合的檢測抗體通過添加100 μ L ABTS/孔來檢測。在Tecan Fluor分光計上，以 405nm的測量波長(參照波長492nm)來進行吸光度的確定。ANGPT2 結合 BIACORE產生的抗體與人ANGPT2的結合也通過利用BIACORE TlOO儀器(GEhealthcare Biosciences AB (GE健康護理生物科學AB)，Uppsala，瑞典)的表面等離振子共振來研 究。簡言之，為了親合測量，通過用于呈遞針對人ANGPT2的抗體的胺偶聯在CM5或CM4 芯片上固定山羊<hIgG-Fcg>多克隆抗體。結合在具有或不具有5mM Ca2+的HBS緩沖 液(HBS-P(1 OmMHEPES，150mM NaCl，0. 005%吐溫 20，ph 7.4)中，在 25°C測量。將純化的 ANGPT2-Hi (R&D系統或內部純化的)以不同濃度加入到溶液中。締合通過ANGPT2注射3分 鐘來測量；解離通過用HBS緩沖液洗滌芯片表面3-5分鐘來測量，且KD值利用1 1朗繆 爾結合模式來評估。由于ANGPT2制劑的異質性，不能觀察到1 1的結合；KD值因此僅是 相對的評估。從樣品曲線中減去陰性對照數據(例如緩沖液曲線)，以用于校正系統固有的 基線漂移和用于噪音信號的降低。使用Biacore TlOO評估軟件版本1. 1. 1來分析S曲線 和用于計算親合數據(圖19)。抑制hANGPT2 與 Tie-2-ECD 的結合(ELISA)為了測試ANGPT2抗體干擾Tie2結合的能力，設置以下ELISA。測試在384孔微量 滴定板(MicroCoat，DE，Cat. No. 464718)上，在RT下進行。每次溫育步驟后，用PBST洗滌板 3 次。開始時，用 0. 5μ g/ml Tie-2 蛋白(R&D Systems (R&D 系統)，英國，Cat. No. 313-TI) 包被板至少2小時(h)。其后，用增補了 0. 2%吐溫-20和2% BSA(Roche Diagnostics GmbH(羅氏診斷GmbH)，DE)的PBS封閉孔1小時。純化的抗體在PBS中的稀釋物與0. 2 μ g/ ml huANGPT2 (R&D Systems (R&D 系統)，UK, Cat. No. 623-AN) 一起在 RT 下溫育 1 小時。洗 滌后，添加 0. 5 μ g/ml 生物素化的抗-ANGPT2 克隆 BAM0981 (R&D Systems (R&D 系統)，UK) 和 1 3000 稀釋的鏈霉親和素 HRP (Roche Diagnostics GmbH(羅氏診斷 GmbH)，DE，Cat. No. 11089153001)的混合物1小時。其后，用PBST洗滌板6次。在RT下，用新鮮制備的 ABTS 試劑(Roche Diagnostics GmbH (羅氏診斷 GmbH)，DE，緩沖液 #204530 001，片劑 #11 112 422 001)對該板進行顯色30分鐘。在405nm處測量吸光度。ANGPT2-VEGF 橋連 ELISA產生的雙特異性抗體的結合特性在使用固定的全長VEGF165_Hi s蛋白(R&D Systems (R&D 系統))和人 ANGPT2_His 蛋白(R&D Systems (R&D 系統))的 ELISA 測定中進 行，以同時檢測結合的雙特異性抗體。只有雙特異性抗體能夠同時結合VEGF和ANGPT2并由 此橋連這兩種抗原，而單特異性“標準” IgGl抗體應該不能夠同時結合VEGF和ANGPT2。為 了該目的，將Falcon聚苯乙烯透明強化微量滴定板用處于PBS中的100 μ 1 2 μ g/mL重組 人VEGF165(R&D Systems (R&D系統))在室溫下包被2小時或在4°C包被過夜。孔用300 μ 1PBST (0，2%吐溫20)洗滌3次，并用200μ1 2% BSA 0，1 %吐溫20在室溫下封閉30分鐘， 并隨后用300 μ 1 PBST洗滌3次。將100 μ L/孔處于PBS (Sigma (西格瑪))中的純化的雙 特異性抗體和對照抗體的稀釋物系列加入到孔中并在微量滴定板搖動器上在室溫下溫育1 小時。該孔用300μ1 PBST (0，2%吐溫20)洗滌3次，并且結合的抗體通過添加處于PBS 中的 100 μ 1 0. 5 μ g/ml 人 ANGPT2-His (R&D Systems (R&D 系統))來檢測。該孔用 300 μ 1 PBST (0，2% 吐溫 20)洗滌 3 次，并且結合的 ANGPT2 用 100μ 1 0. 5 μ g/mL<ANGPT2>mIgGl_ 生 物素抗體(BAM0981，R&D Systems (R&D系統))在室溫下檢測1小時。未結合的檢測抗體使 用300μ1 PBST(0，2%吐溫20)洗滌三次洗掉，并且結合的抗體通過添加以1 4稀釋在封 閉緩沖液中的100 μ 1 1 2000鏈霉親和素-POD綴合物(Roche Diagnostics GmbH(羅氏 診斷GmbH)，Cat. No. 11089153)，在室溫下檢測1小時。未結合的鏈霉親和素-POD綴合物 用300 μ 1 PBST (0，2%吐溫20)洗滌3_6次洗掉，并且結合的鏈霉親和素-POD綴合物通過 添加100 μ LABTS/孔來檢測。在Tecan Fluor分光計上，以405nm的測量波長(參照波長 492nm)來進行吸光度的確定(圖20)。用于檢測雙特異性抗體同時結合VEGF和ANGPT2的Biacore測定為了進一步確證來自橋連ELISA的數據，按照以下流程，在BiacoreTlOO儀器上， 利用表面等離振子共振技術構建了另外的測定，以驗證與VEGF和ANGPT2的同時結合。數據 利用T100軟件包來分析ANGPT2通過經由胺偶聯(amincoupling)(無BSA)固定在CM5芯 片上的 5-His 抗體(5-His-Ab 無 BSA，Qiagen No. 34660)，以捕獲水平 2000-1700RU 來捕獲。 HBS-N緩沖液作為運行緩沖液，活化通過EDC/NHS混合物來進行。5-His_Ab無BSA捕獲抗體 在偶聯緩沖液NaAc，pH 4. 5，c = 30 μ g/mL中稀釋，最后通過注射IM Ethanolamin來封閉 仍然活化的羧基，檢測5000和17000RU的配體密度。濃度為500nM的ANGPT2通過用運行 緩沖液+lmg/mL BSA稀釋的5-His_Ab以5 μ L/分鐘的流速來捕獲。隨后，結合ANGPT2和 VEGF的雙特異性抗體通過用rhVEGF溫育來證明。為了該目的，雙特異性抗體與以50 μ L/分 鐘的流速、濃度為100-500ηΜ且用運行緩沖液+lmg/mL BSA稀釋的ANGPT2結合，并且同時的 結合通過用處于PBS+0.005% (ν/ν)吐溫20運行緩沖液+lmg/ml BSA中、流速為50 μ L/分 鐘且 VEGF 濃度為 IOO-I5OnM 的 VEGF (rhVEGF, R&D-Systems (R&D 系統)Cat. -No, 293-VE)溫 育來檢測。締合時間為120秒，解離時間為1200秒。再生以50 μ L/分鐘的流速，用2xl0mM 甘氨酸pH 2. 0和60秒的接觸時間來進行。S曲線利用常規(guī)雙參照(對照參照雙特異性抗 體和rhVEGF與捕獲分子5-His-Ab的結合)來校正。關于每種Ab的空白使用rhVEGF濃度 “0”來測量。Biacore測定圖顯示在圖21中。S曲線利用常規(guī)雙參照(對照參照雙特異 性抗體和rhVEGF與捕獲分子5-His-Ab的結合)來校正。關于每種Ab的空白使用rhVEGF 濃度“0”來測量。實施例1 制備、表達、純化和表征單特異性二價<IGF_1R>抗體，其中可變結構域VL和VH相 互替換，且其中恒定結構域CL和CHl相互替換(本文中縮寫為<IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交 換抗體)。實施例IA制備關于單特異性二價<IGF-1R>VL-VH/CL_CH1交換抗體的表達質粒包括本實施例中所述的各種前導序列的單特異性二價胰島素樣生長因子1受體<IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交換抗體的重鏈和輕鏈可變結構域的序列源自WO 2005/005635中 所述的野生型<IGF-1R>抗體重鏈(SEQ IDNO :1，質粒4843-pUC-HC-IGF-lR)和輕鏈(SEQ ID NO :2，質粒4842-pUC-LC-IGF-lR)，且重鏈和輕鏈恒定結構域源自人抗體(C-κ和IgGl)。編碼<IGF_1R>抗體前導序列、輕鏈可變結構域(VL)和人κ -輕鏈恒定結構域 (CL)的基因區(qū)段連接并與人、1-重鏈恒定結構域(鉸鏈-CH2-CH3)的Fc結構域的5’末 端融合。編碼通過用VL和CL結構域交換VH和CHl結構域獲得的各種融合蛋白的DNA通 過基因合成產生，并在以下表示為<IGF-1R>HC* (重鏈*) (SEQ ID NO 3)。<IGF-1R>抗體前導序列，重鏈可變結構域(VH)和人、1_重鏈恒定結構域(CHl) 的基因區(qū)段作為獨立的鏈連接。編碼通過用VH和CHl結構域交換VL和CL結構域獲得的各 種融合蛋白的DNA通過基因合成產生，并在以下表示為<IGF-1R>LC* (輕鏈)*(SEQ ID NO 4)。圖5和圖6顯示修飾的<IGF-1R>HC*重鏈*和修飾的<IGF-1R>LC*輕鏈*的蛋白 質序列的示意圖。以下，簡要描述各種表達載體載體DW047-pUC-HC*-IGF_lR 載體DW047-pUC-HO-IGF-lR是例如用于在HEK293 (EBNA)細胞中瞬時表達 <IGF-1R>重鏈*HC* (cDNA組織的表達盒；具有CMV-內含子A)或用于在CHO細胞中穩(wěn)定表 達的表達質粒.除<IGF-1R>HC*表達盒以外，該載體包含-來自載體pUC18的復制起點，其容許在大腸桿菌中復制該質粒，和-β -內酰胺酶基因，其在大腸桿菌中賦予氨芐青霉素抗性。<IGF-1R>HC*基因的轉錄單元由以下元件組成-5’末端處的特有的AscI限制性位點_來自人巨細胞病毒的即時早期增強子和啟動子，_隨后的內含子A序列，-人抗體基因的5’-非翻譯區(qū)，-免疫球蛋白輕鏈信號序列，-人<IGF_1R>成熟HC*鏈，其編碼與人、1-重鏈恒定結構域(鉸鏈-CH2-CH3)的 Fc結構域的5’末端融合的人輕鏈可變結構域(VL)和人κ _輕鏈恒定結構域(CL)的融合 體-具有加A信號序列的3’非翻譯區(qū)，和-3’末端處的特有限制性位點SgrAI。<IGF-lR>HO表達載體DW047-pUC-HO-IGF_lR的質粒圖譜顯示在圖7中。 <IGF-1R>HC*(包括信號序列)的氨基酸序列在SEQ ID NO 3中提供。載體DW048-pUC-LC*-IGF_lR載體DW048-pUC-LO-IGF-lR是例如用于在HEK293 (EBNA)細胞中瞬時表達VL-VH/ CL-CHl交換<IGF-1R>輕鏈*LC* (cDNA組織的表達盒；具有CMV-內含子A)或用于在CHO細 胞中穩(wěn)定表達的表達質粒.除<IGF-1R>LC*表達盒以外，該載體包含
-來自載體pUC18的復制起點，其容許在大腸桿菌中復制該質粒，和-β -內酰胺酶基因，其在大腸桿菌中賦予氨芐青霉素抗性。<IGF_1R>LC*基因的轉錄單元由以下元件組成-5’末端處的特有限制性位點Sse8387I_來自人巨細胞病毒的即時早期增強子和啟動子，_隨后的內含子A序列，_人抗體基因的5’ _非翻譯區(qū)，-免疫球蛋白重鏈信號序列，-人<IGF_1R>成熟LC*鏈，其編碼人重鏈可變結構域(VH)和人γ 1-重鏈恒定結構域(CHl)的融合體_具有加A信號序列的3’非翻譯區(qū)，和-3’末端處的特有限制性位點SalI和FseI。輕鏈<IGF-1R>LC*表達載體DW048-pUC-LO-IGF_lR的質粒圖譜顯示在圖8中。 <IGF-1R>LC*(包括信號序列)的氨基酸序列在SEQ ID NO :4中提供。質粒DW047-pUC-HO-IGF-lR 和 DW048-pUC-LO-IGF_lR 可以用于瞬時或穩(wěn)定共 轉染到例如HEK293，HEK293EBNA或CHO細胞(2-載體系統)中。為了比較的原因，野生型 <IGF-1R>抗體由與該實施例中所述的那些類似的質粒4842-pUC-LC-IGF-lR(SEQ ID NO 2) 和 4843-pUC-HC-IGF-lR(SEQ ID NO 1)瞬時表達。為了在HEK293EBNA細胞中獲得瞬時表達的較高表達水平，可以將<IGF_1R>HC*表 達盒經由AscI、SgrAI位點和將<IGF_1R>LC*表達盒經由Sse8387I和FseI位點亞克隆到 包含以下各項的4700pUC-Hyg_0riP表達載體中-OriP 元件，和-潮霉素抗性基因，作為選擇標記?？梢詫⒅劓満洼p鏈轉錄單元亞克隆到2個獨立的4700-pUC-Hyg_0riP載體中，從 而進行共轉染(2-載體系統)，或可以將它們克隆到一個共同的4700-pUC-Hyg-0riP載體 (1-載體系統)中，從而隨后用由此產生的載體進行瞬時或穩(wěn)定轉染。圖9顯示基礎載體 4700-pUC-0riP的質粒圖譜。實施例IB制備單特異性二價<IGF-1R>VL-VH/CL_CH1交換抗體表達質粒包括野生型<IGF_1R>抗體的交換的Fab序列的<IGF_1R>融合基因(HC*和LC* 融合基因)使用已知的重組方法和技術，通過連接相應的核酸區(qū)段來裝配。編碼IGF-IR HC*和LC*的核酸序列分別通過化學合成來合成，并隨后在 Geneart (Regensburg，德國)，克隆到基于 pPCRScript (Stratagene)的 pGA4 克隆載體中。 將編碼IGF-IR HC*的表達盒經由PvuII和BmgBI限制性位點連接到各種大腸桿菌質粒中， 以生成最終載體DW047-pUC-HC*-IGF-lR ；將編碼各種IGF-IR LC*的表達盒經由PvuII和 SalI限制性位點連接到各種大腸桿菌質粒中，以生成最終載體DW048-pUC-LC*-IGF-lR。亞 克隆的核酸序列通過DNA測序來驗證。為了瞬時和穩(wěn)定轉染，通過來自轉化的大腸桿菌培 養(yǎng)物的質粒制備物來制備更大量的質粒(Nucleobond AX，Macherey-Nagel)。實施例IC
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在HEK293 EBNA細胞中瞬時表達單特異性二價<IGF-1R>VL-VH/CL_CH1交換抗體重組<IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交換抗體通過在貼壁生長的HEK293EBNA細胞(表 達EB病毒核抗原的人胚腎細胞系293 ；美國典型培養(yǎng)物中心，保藏號ATCC#CRL-10852， Lot. 959 218)中瞬時共轉染質粒 DW047-pUC-HC*-IGF_lR 和 DW048-pUC-LC*-IGF_lR 來表達，所述HEK293EBNA細胞是在增補了 10%超低IgG FCS (胎牛血清，Gibco)，2mM L-谷氨酰胺(Gibco)，和 250 μ g/ml 遺傳霉素(Gibco)的 DMEM(Dulbecco，s modified Eagle，s medium, Gibco)中培養(yǎng)的。為了轉染，FuGENE 6 轉染試劑(Roche Molecular Biochemicals (羅氏分子生物化學))以FuGENE 試劑(μ 1)與DNA(y g)的比例為4 1(在 3 1 6 1的范圍內)來使用。編碼<IGF-1R>HC*和LC*的輕鏈和重鏈質粒(質粒 DW047-pUC-HO-IGF-lR 和 DW048-pUC-LO-IGF-lR)利用摩爾比例為 1 1 (等摩爾)的編 碼輕鏈和重鏈的質粒，其范圍是1 2 2 1，分別由兩種不同質粒來表達。在第3天， 用L-谷氨酰胺加至4mM，葡萄糖[西格瑪(Sigma)]和NAA[Gibco]飼養(yǎng)細胞。在轉染后 第5-11天通過離心收獲包含<IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交換抗體的細胞培養(yǎng)物上清并保存 在-20°C。關于人免疫球蛋白在例如HEK293細胞中的重組表達的一般信息在Meissner， P.等.，Biotechnol. Bioeng.(生物技術和生物工程)75 (2001) 197-203 中給出。實施例ID單特異性二價<IGF-1R>VL-VH/CL_CH1交換抗體的免疫沉淀單特異性二價<IGF-1R>VL-VH/CL_CH1交換抗體通過使用蛋白質A瓊脂糖-珠 (Roche(FS))的免疫沉淀法從胞培養(yǎng)物上清(實施例1C)中分離。60yL蛋白質A瓊脂 糖珠在TBS-NP40(50mM Tris,pH 7. 5,150mM NaCl, 1% Nonidet_P40)中洗滌三次。隨后，將 l-15mL細胞培養(yǎng)物上清應用于在TBS-NP40中預平衡的蛋白質A瓊脂糖珠。室溫下溫育1小 時后，將該珠在Ultrafree-MC-過濾柱(Amicon)上用0. 5mL TBS-NP40洗滌1次，用0. 5mL 2x磷酸鹽緩沖液(2xPBS，Roche (羅氏))洗滌2次并用0. 5mL IOOmM檸檬酸鈉pH 5，O簡 單洗滌4次。通過添加35 μ 1 NuPAGE LDS樣品緩沖液(Invitrogen)洗脫結合的抗體。 樣品的一半分別與NuPAGE 樣品還原劑混合或保持未還原，并在70°C加熱10分鐘。隨 后，將 20 μ 1 應用于 4-12%NuPAGE Bis-Tris SDS-PAGE(Invitrogen)(具有 MOPS 緩沖 液，以用于非還原的SDS-PAGE，和具有NuPAGE 抗氧化運行緩沖液添加劑(Invitrogen) 的MES緩沖液，以用于還原的SDS-PAGE)，并用考馬斯藍染色。圖10顯示來自典型免疫測定 實驗的SDS-PAGE。單特異性二價<IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交換抗體的行為如同典型的IgGl 抗體，具有對應于LC*輕鏈的ca. 25kDa條帶和對應于各自HC*重鏈的50kDa條帶。在未還 原的狀態(tài)中，對完整抗體可以觀察到ca. 150kDa的條帶。實施例IE純化單特異性二價<IGF-1R>VL-VH/CL_CH1交換抗體和通過質譜法確認性質按照已知的標準方法，通過蛋白質A親合層析法，由過濾的細胞培養(yǎng)物上清中 純化表達和分泌的單特異性二價<IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交換抗體。簡言之，來自瞬時 轉染的包含<IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交換抗體的細胞培養(yǎng)物上清通過離心(10，OOOg， 10分鐘)和經由0. 45 μ m濾器過濾來凈化，并應用于用PBS緩沖液(IOmM Na2HP04, ImM KH2P04，137mMNaCl 和 2. 7mM KCl, pH 7.4)平衡的蛋白質 A HiTrap MabSelect Xtra 柱 (GEhealthcare(GE健康護理))。用PBS平衡緩沖液及隨后的0. IM檸檬酸鈉緩沖液，pH5. 5洗出未結合的蛋白，并用PBS清洗。用IOOmM檸檬酸鈉，pH2，8實現<IGF-1R>VL_VH/ CL-CHl交換抗體的洗脫，隨后立即用300 μ 1 2MTris pH 9. (V2ml級分來中和樣品。在 20mM 組氨酸，150mM NaCl pH 6. 0 中，通過在 HiLoad 26/60Superdex 200 制備級柱(GE healthcare (GE健康護理))上進行的大小排阻層析法將聚集的蛋白質與單體抗體分開，且 隨后利用MILLIPORE Amicon Ultra_15離心濃縮器濃縮單體抗體級分。在_20°C或_80°C 下冷凍和保存<IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交換抗體。<IGF-1R>VL-VH/CL_CH1交換的完整性通 過存在和缺乏還原劑的SDS-PAGE和隨后用考馬斯亮藍染色來分析，如實施例ID中所述。 純化的<IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交換抗體的行為如同典型的IgGl抗體，具有對應于LC*輕 鏈的ca. 25kDa條帶和對應于各自HC*重鏈的50kDa條帶。在未還原的狀態(tài)中，對完整抗 體可以觀察到ca. 150kDa的條帶。<IGF-1R>VL-VH/CL_CH1交換抗體的聚集和低聚狀態(tài)通 過分析大小排阻層析法來分析，并顯示純化的Fab交叉抗體處于單體狀態(tài)。提供表征的樣 品，以進行隨后的蛋白質分析和功能表征。ESI質譜法驗證作為主要種類的完全去糖基化 的<IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交換抗體的理論分子量(在不具有重鏈C端賴氨酸殘基和具有 輕鏈C端焦谷氨酸殘基的條件下計算的)(圖22)。實施例IF在IGF-IR ECD結合ELISA中和通過Biacore分析單特異性二價<IGF-1R>VL_VH/ CL-CHl交換抗體的IGF-IR結合特性單特異性二價<IGF-1R>VL-VH/CL_CH1交換抗體的結合特性在使用如上所述的 IGF-IR胞外結構域(EOT)的ELISA測定中評估。圖11顯示來自HEK293E中瞬時轉染上清 的<IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交換抗體和野生型<IGF_1R>抗體通過夾心式-IgG-ELISA滴定 的標準化結果?？梢郧宄乜吹?lt;IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交換抗體是功能性的且表現出與 野生型<IGF-1R>抗體相當的結合特性，并因此似乎是完全功能性的。觀察到的微小差別在 該方法的誤差范圍內，并且可能是例如由蛋白質濃度的微小變化導致的。這些發(fā)現由關于各種純化的抗體的Biacore數據來確證，其顯示單特異性二價 <IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交換抗體在該方法的誤差范圍內，具有與初始野生型抗體相當的對 IGF-IR ECD的親和性和結合動力學。動力學數據在下表中給出 實施例IG通過使用IGF-IR過表達124細胞的FACS分析單特異性二價<IGF-1R>VL_VH/ CL-CHl交換抗體的IGF-IR結合特性為了驗證<IGF-1R>VL-VH/CL_CH1交換抗體的結合活性，通過FACS研究與在124 細胞(表達重組人IGF-IR的NIH3T3細胞，Roche(FS))表面上過表達的IGF-IR的結合。 簡言之，5xlOE5 124細胞/FACS管用純化的<IGF-1R>VL-VH/CL_CH1交換抗體和作為參照的野生型<IGF-1R>抗體的稀釋物來溫育，并在冰上溫育1小時。未結合的抗體用4ml冰冷 PBS(Gibco)+2% FCS(Gibco)洗去。隨后，離心細胞(5分鐘，400g)并且在避光條件下，用 F(ab ‘)2<hFcY>PE綴合物(Dianova)在冰上檢測結合的抗體1小時。未結合的檢測抗體 用4ml冰冷PBS(Gibco)+2% FCS(Gibco)洗去。隨后，對細胞進行離心(5分鐘，400g)，重新 懸浮在 300-500 μ L PBS 中，并且在 FACSCalibur 或 FACS Canto (BD (FL2 通道，10. 000 細胞 /獲得物)上量化結合的檢測抗體。在實驗過程中，包括各自的同種型對照，以排除任何非 特異性結合事件。<IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交換抗體和野生型<IGF_1R>參照抗體與124上 的IGF-IR的結合通過平均熒光強度的濃度依賴性移位來比較。另外的實驗顯示<IGF-1R>VL-VH/CL_CH1交換抗體也保持其在MCF7細胞上誘導 IGF-IR內在化的活性，并在DU145細胞上僅具有低ADCC活性，條件是用與野生型<IGF_1R> 抗體相當的人PBMC來溫育?？傊?，實施例1中的實驗顯示利用結構域交換，可以產生具有與野生型抗體相當 的特性的完全功能性抗體。在生物化學和細胞測定中保持所有功能性特性。這些具有結構 域交換的抗體形成用于生成如下所述雙特異性抗體的基礎。實施例2 生成、表達、純化和表征單特異性二價<ANGPT2>抗體，其中可變結構域VL和VH相 互替換，且其中恒定結構域CL和CHl相互替換(本文中縮寫為<ANGPT2>VL-VH/CL-CH1交 換抗體)。實施例2A制備關于單特異性二價<ANGPT2>VL-VH/CL_CH1交換抗體變體的表達質粒包括本實施例中所述的各種前導序列的單特異性二價血管生成 素-2<ANGPT2>VL-VH/CL-CH1交換抗體的重鏈和輕鏈可變結構域的序列源自WO 2006/045049中所述的人<ANGPT2>抗體重鏈(SEQ ID NO 6)和輕鏈(SEQ ID NO :7)，且重 鏈和輕鏈恒定結構域源自人抗體(C-κ和IgGl)。編碼<ANGPT2>抗體前導序列、輕鏈可變結構域(VL)和人κ -輕鏈恒定結構域 (CL)的基因區(qū)段連接并與人、1-重鏈恒定結構域(鉸鏈-CH2-CH3)的Fc結構域的5’末 端融合。編碼通過用VL和CL結構域交換VH和CHl結構域獲得的各種融合蛋白的DNA通 過基因合成產生，并在以下表示為<ANGPT2>HC* (重鏈*) (SEQ ID NO 8)。<ANGPT2>抗體前導序列，重鏈可變結構域(VH)和人γ 1_重鏈恒定結構域(CHl) 的基因區(qū)段作為獨立的鏈連接。編碼通過用VH和CHl結構域交換VL和CL結構域獲得的各 種融合蛋白的DNA通過基因合成產生，并在以下表示為<ANGPT2>LC* (輕鏈*) (SEQ ID NO 9)。各種表達載體與實施例IA中所述的那些類似。重鏈*<ANGPT2>HC*表達載體 pUC-HC*-ANGPT2>的質粒圖譜顯示在圖12中。<ANGPT2>HC* (包括信號序列)的氨基酸序 列在SEQ ID NO 8中提供。輕鏈<ANGPT2>LC*表達載體pUC_LC*-ANGPT2>的質粒圖譜顯示在圖13中。 <ANGPT2>LC* (包括信號序列)的氨基酸序列在SEQ ID NO :9中提供。質粒pUC-HC*-ANGPT2> 和pUC-LC*-ANGPT2>可以用于瞬時或穩(wěn)定共轉染到例如HEK293-F，HEK293EBNA或CHO細胞 (2-載體系統)中。
為了在HEK293EBNA細胞中獲得瞬時表達的較高表達水平，可以將<ANGPT2>HC*表 達盒經由AscI、SgrAI位點亞克隆和將<ANGPT2>LC*表達盒經由Sse8387I和FseI位點亞 克隆到如上實施例IA中所述的4700pUC-Hyg_0riP表達載體中?？梢詫⒅劓満洼p鏈轉錄單 元亞克隆到2個獨立的4700-pUC-Hyg-0riP載體中，從而進行共轉染(2-載體系統)，或可 以將它們經由Fsel，SgrAI, Sse8387I和AscI位點克隆到一個共同的4700-pUC_Hyg-0riP 載體(1-載體系統)中，從而隨后用由此產生的載體進行瞬時或穩(wěn)定轉染。將野生型<ANGPT2>抗體克隆到與本實施例以及以上實施例IA中所述的載體 類似的質粒 SB04-pUC-HC-ANGPT2 (SEQ ID NO 6)和 SB06-pUC-LC_ANGPT2 (SEQ ID NO 7)中。野生型<ANGPT2>抗體重鏈和輕鏈的轉錄單元由質粒SB04-pUC-HC-ANGPT2和 SB06-pUC-LC-ANGPT2基礎載體，經由Fsel，SgrAI, Sse8387I和AscI位點，亞克隆到質粒 SB07-pUC-Hyg-0riP-HC-ANGPT2 和 SB09-pUC-Hyg-0riP-LC_ANGPT2 中，從而在 HEK293E 細 胞中獲得較高的瞬時表達水平。為了比較的原因和為了共表達實驗(見實施例3)，野生型 <ANGPT2> 抗體由質粒 SB07-pUC-Hyg-0riP-HC-ANGPT2 和 SB 09-pUC-Hyg-0riP-LC-ANGPT2 或由質粒 SB 04-pUC-HC-ANGPT2 和 SB06-pUC-LC_ANGPT2 瞬時(共-)表達。實施例2B 制備單特異性二價<ANGPT2>VL-VH/CL_CH1交換抗體表達質粒包括野生型<ANGPT2>抗體的交換的Fab序列的<ANGPT2>VL-VH/CL_CH1交換抗體 融合基因(HC*和LC*融合基因)使用已知的重組方法和技術，通過連接相應的核酸區(qū)段來 裝配。編碼<ANGPT2>VL-VH/CL_CH1交換抗體HC*和LC*的核酸序列分別通過化學合成 來合成，并隨后在Geneart (Regensburg，德國)，克隆到基于pPCRScript (Stratagene)的 PGA4克隆載體中。將編碼<ANGPT2>VL-VH/CL-CH1交換抗體HC*的表達盒經由PstI和EcoNI 限制性位點連接到各種大腸桿菌質粒中，以生成最終載體pUC-HC*-<ANGPT2> ；將編碼各種 <ANGPT2>LC*的表達盒經由PvuII和FseI限制性位點連接到各種大腸桿菌質粒中，以生成 最終載體pUC-LC*-<ANGPT2>。亞克隆的核酸序列通過DNA測序來驗證。為了瞬時和穩(wěn)定轉 染，通過來自轉化的大腸桿菌培養(yǎng)物的質粒制備物來制備更大量的質粒(Nucleobond AX, Macherey-Nagel)。實施例2C在HEK293EBNA細胞中瞬時表達單特異性二價<ANGPT2>VL-VH/CL_CH1交換抗體重組<ANGPT2>VL-VH/CL-CH1交換抗體通過在貼壁生長的HEK293EBNA細胞(表 達EB病毒核抗原的人胚腎細胞系293 ；美國典型培養(yǎng)物中心，保藏號ATCC#CRL-10852， Lot. 959 218)中瞬時共轉染質粒pUC_HC*-ANGPT2>和pUC_LC*-ANGPT2>來表達，所述 HEK293 EBNA細胞是在增補了 10%超低IgG FCS (胎牛血清，Gibco)，2mM L-谷氨酰胺 (Gibco)，和 250 μ g/ml 遺傳霉素(Gibco)的 DMEM (Dulbecco，s modif iedEagle’ s medium, Gibco)中培養(yǎng)的。為了轉染，FuGENE 6 轉染試劑(RocheMolecular Biochemicals (羅氏 分子生物化學))以FuGENE 試劑(μ )與DNA(yg)的比例為4 1(在3 1 6 1 的范圍內)來使用。編碼<ANGPT2>HC*和LC*的輕鏈和重鏈質粒(質粒pUC_HC*-ANGPT2> 和pUC-LC*-ANGPT2>)利用摩爾比例為1 1 (等摩爾)的編碼輕鏈和重鏈的質粒，其范圍 是1 2 2 1，分別由兩種不同質粒來表達。在第3天，用L-谷氨酰胺加至4mM，葡萄
31糖[西格瑪(Sigma)]和NAA[Gibco]飼養(yǎng)細胞。在轉染后第5_11天通過離心收獲包含 <ANGPT2>VL-VH/CL-CH1交換抗體的細胞培養(yǎng)物上清并保存在_20°C。關于人免疫球蛋白在 例如HEK293細胞中的重組表達的一般信息在Meissner，P.等.，Biotechnol. Bioeng.(生 物技術和生物工程)75 (2001) 197-203中給出。實施例2D純化單特異性二價<ANGPT2>VL-VH/CL_CH1交換抗體和通過質譜法確認性質按照已知的標準方法，通過蛋白質A親合層析法，由過濾的細胞培養(yǎng)物上清中純 化表達和分泌的單特異性二價<ANGPT2>VL-VH/CL-CH1交換抗體。簡言之，來自瞬時轉染 的包含<ANGPT2>VL-VH/CL-CH1交換抗體的細胞培養(yǎng)物上清通過離心(10，OOOg, 10分鐘) 和經由0.45μπι濾器過濾來凈化，并應用于用PBS緩沖液(IOmM Na2HP04, ImM KH2P04， 137mM NaCl 和 2. 7mM KCl，pH 7. 4)平衡的蛋白質 A HiTrap MabSelect Xtra 柱(GE healthcare (GE健康護理))。用PBS平衡緩沖液及隨后的0. IM檸檬酸鈉緩沖液，pH 5. 5 洗出未結合的蛋白，并用PBS洗滌。用IOOmM檸檬酸鈉，pH 2，8實現VL-VH/CL-CH1交換 抗體的洗脫，隨后立即用300 μ 1 2MTris pH 9. 0/2ml級分來中和樣品。在20mM組氨酸， 150mM NaCl pH 6. 0 中，通過在 HiLoad 26/60 Superdex 200 制各級柱(GE healthcare (GE 健康護理))上進行的大小排阻層析法將聚集的蛋白質與單體抗體分開，且隨后利用 MILLIPORE Amicon Ultra_15離心濃縮器濃縮單體抗體級分。在-20°C或-80°C下冷凍和保 存<ANGPT2>VL-VH/CL-CH1交換抗體。<ANGPT2>VL-VH/CL_CH1交換抗體的完整性通過存在 和缺乏還原劑的SDS-PAGE和隨后用考馬斯亮藍染色來分析(圖23-A)。<ANGPT2>VL_VH/ CL-CHl交換抗體的聚集和低聚狀態(tài)通過分析大小排阻層析法來分析(圖23-B)。提供表征 的樣品，以進行隨后的蛋白質分析和功能表征。ESI質譜法驗證作為主要種類的完全去糖基 化的<ANGPT2>VL-VH/CL-CH1交換抗體的理論分子量。不能觀察到由抗體樣蛋白引起的污
^fe ο實施例在2F在<ANGPT2>結合ELISA中和通過Biacore分析單特異性二價<ANGPT2>VL_VH/ CL-CHl交換抗體的<ANGPT2>結合特性單特異性二價<ANGPT2>VL-VH/CL_CH1交換抗體的結合特性在使用如上所述全長 <ANGPT2>-His蛋白(R&D Systems (R&D系統))的ELISA測定中評估。圖24顯示來自在夾 心式結合ELISA中滴定純化的<IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交換抗體和野生型<IGF_1R>抗體的 結果?？梢郧宄乜吹?lt;ANGPT2>VL-VH/CL-CH1交換抗體是功能性的，且表現出與野生型 <ANGPT2>抗體相當的結合特性，并因此似乎是完全功能性的。觀察到的微小差別在該方法 的誤差范圍內，并且可能是例如由蛋白質濃度的微小變化導致的。這些發(fā)現用關于各種純化的抗體的Biacore數據來確證，其顯示單特異性二價 <ANGPT2>VL-VH/CL-CH1交換抗體，其KD值為13pM，在該方法的誤差范圍內，具有與初始野 生型<ANGPT2>抗體，其KD值為12pM相當的對ANGPT2的親和性和結合動力學。實施例2G分析單特異性二價<ANGPT2>VL-VH/CL_CH1交換抗體的功能特性為了顯示單特異性二價<ANGPT2>VL-VH/CL_CH1交換抗體具有與初始野生型 <ANGPT2>抗體相當的功能特性，在ELISA結合測定中比較兩種抗體干擾ANGPT2與其Tie2受體胞外結構域結合的能力，如上所述。在各個結合ELISA中，關于干擾人ANGPT2的結合， <ANGPT2>VL-VH/CL-CH1交換抗體具有135ng/ml的EC50值，這與野生型<ANGPT2>抗體的 145nM的EC50值相當。這些數據在使用在其表面上過表達Tie2的HEK293細胞的細胞配體 結合競爭測定中得到驗證，其中關于干擾人ANGPT2的結合，<ANGPT2>VL-VH/CL-CH1交換抗 體具有225ng/ml的EC50值，這與野生型<ANGPT2>抗體的205nM的EC50值相當(數據未 顯不)?？傊瑢嵤├?中的實驗顯示利用結構域交換，可以產生具有與野生型抗體相當 的特性的完全功能性抗體。在生物化學和細胞測定中保持所有功能性特性。這些具有結構 域交換的抗體形成用于生成如下在實施例3和4中所述雙特異性抗體的基礎。實施例2H具有結構域交換的抗體的分子建模分析揭示交換的結構域之間的位阻空間可以 限制折疊。因此，將構建體設計為這樣，其中分別在例如VL-CL和鉸鏈連接區(qū)之間的Fab的 交換結構域的C端或自由VH-CHl結構域的末端引入另外的甘氨酸殘基。各個單特異性二 價抗體在下文中表示為<ANGPT2>VL-VH(G)/CL-CHl (G)交換抗體。包括本實施例中所述的各種前導序列的單特異性二價血管生成 素-2<ANGPT2>VL-VH/CL-CH1交換抗體的重鏈和輕鏈可變結構域的序列源自WO 2006/045049中所述的人<ANGPT2>抗體重鏈(SEQ ID NO 6)和輕鏈(SEQ ID NO :7)，且重 鏈和輕鏈恒定結構域源自人抗體(C-κ和IgGl)。編碼<ANGPT2>抗體前導序列、輕鏈可變結構域(VL)和人κ -輕鏈恒定結構域 (CL)的基因區(qū)段連接并與人、1-重鏈恒定結構域(鉸鏈-CH2-CH3)的Fc結構域的5’末 端融合并包括另外的甘氨酸殘基。編碼通過用VL和CL結構域交換VH和CHl結構域獲得 的各種融合蛋白的DNA通過基因合成產生，并在以下表示為<ANGPT2>HC(G)* (重鏈*) (SEQ ID NO 17)。<ANGPT2>抗體前導序列，重鏈可變結構域(VH)和人γ 1_重鏈恒定結構域(CHl) 的基因區(qū)段作為包括另外的甘氨酸殘基的獨立的鏈連接。編碼通過用VH和CHl結構域 交換VL和CL結構域獲得的各種融合蛋白的DNA通過基因合成產生，并在以下表示為 <ANGPT2>LC (G) * (輕鏈 *) (SEQID NO 18)。各種表達載體與以上實施例2中所述的那些類似。隨后，使用這些表達載體在 HEK293-F細胞中瞬時共表達各種具有結構域交換的<ANGPT2>VL-VH(G)/CL-CHl (G)抗體。 各種<ANGPT2>VL-VH(G)/CL-CHl (G)交換抗體由如上所述的瞬時表達來純化，并用各種抗 體的SDS-PAGE、大小排阻層析法和質譜法來分析。蛋白表達產率是良好的，并與對上述常規(guī) VL-VH/CL-CH1交換抗體獲得的表達產率類似。研究的所有特性顯示沒有意外的發(fā)現，且與 各種〈ANGPT2野生型抗體基本相當。圖31在ANGPT2Biacore結合測定中證明<ANGPT2>野 生型抗體和<ANGPT2>VL-VH(G)/CL-CHl (G)抗體實質上相當的特性。在該方法的誤差范圍 內，這兩種抗體對人ANGPT2表現出相當的結合親和性，其評估的KD值(來自兩次確定的平 均值)關于<ANGPT2>野生型抗體為ca. 38pM和關于<ANGPT2>VL_VH(G) /CL-CHl (G)抗體為 ca. 45pM。ka[l/Ms] kd[l/s]K(D) [Μ]
野生型 <ANGPT2> 抗體5. 26E+05 2. OE-43. 79E-10
<ANGPT2>VL-VH(G)/CL-CHl(G) 5. 29E+06 2· 358E-3 4· 45E-09 交換抗體實施例3表達雙特異性二價<ANGPT2-IGF_1R>抗體，其中在特異性結合IGF-1R的重鏈和 輕鏈中，可變結構域VL和VH相互替換，且恒定結構域CL和CHl相互替換(本文中縮寫為 <ANGPT2-IGF-1R>VL-VH/CL-CH1 交換抗體)。實施例3A在HEK293EBNA細胞中瞬間共表達<ANGPT2>野生型抗體和<IGF-1R>VL-VH/CL-CH1 交換抗體以生成雙特異性<ANGPT2-IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交換抗體為了生成通過位于一側的<ANGPT2>野生型Fab區(qū)識別<ANGPT2>并通過位于另一 側的<IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交換抗體Fab區(qū)識別IGF-IR的功能性雙特異性抗體，將2個編 碼<IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交換抗體(實施例1A)的表達質粒與2個編碼<ANGPT2>野生型 抗體的表達質粒(實施例2A)共表達。假設野生型重鏈HC和Fab交叉重鏈HC*統計學關 聯，這導致雙特異性二價<ANGPT2-IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交換抗體的生成。在兩種抗體同 等充分表達并不考慮副產物的假設下，這應該導致比例為1 2 1的三種主要產物單特 異性 <IGF-1R>VL-VH/CL-CH1 交換抗體、雙特異性 <ANGPT2-IGF-1R>VL-VH/CL_CH1 交換抗體 和<ANGPT2>野生型抗體。另外，可以預期若干副產物諸如LC-LC*(Fab2片段)，HC_HC* (單 價抗體)和HC*-LC 二聚體。相反，當共表達兩個編碼<IGF_1R>野生型抗體(實施例1A)的表達質粒和2個 編碼作為參照的<ANGPT2>野生型抗體的表達質粒時，應該僅生成少量的功能性雙特異性 <IGF-1R-ANGPT2>抗體，這歸因于重鏈與來自<IGF_1R>和<ANGPT2>野生型抗體的兩條重鏈 統計學關聯，而輕鏈與來自<IGF-1R>和<ANGPT2>野生型抗體的兩條重鏈不受控關聯。為了生成主要產物A)單特異性<IGF-1R>VL-VH/CL_CH1交換抗體，B)雙特異 性<ANGPT2-IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交換抗體和C) <ANGPT2>野生型抗體的混合物，在貼 壁生長的HEK293-EBNA細胞(表達EB病毒核抗原的人胚腎細胞系293 ；美國典型培養(yǎng)物 中心，保藏號 ATCC#CRL-10852，Lot. 959 218)中共轉染四種質粒 DW047-pUC-HO-IGF_lR 禾口 DW048-pUC-LO-IGF-lR，以及質粒 SB07-pUC-Hyg-0riP-HC-ANGPT2 禾口 SB09-pUC-Hyg-0riP-LC-ANGPT2 (或質粒 SB04-pUC-HC_ANGPT2 和 SB06-pUC-LC_ANGPT2)， 所述HEK293-EBNA細胞是在增補了 10 %超低IgG FCS (胎牛血清，Gibco), 2mM L-谷 氨酰胺(Gibco)，和 250yg/ml 遺傳霉素(Gibco)的 DMEM(Dulbecco，s modified Eagle，s medium, Gibco)中培養(yǎng)的。為了轉染，FuGENE 6 轉染試劑(Roche Molecular Biochemicals (羅氏分子生物化學))以FuGENE 試劑(μ 1)與DNA(y g)的比例為4 1(在 3 1 6 1的范圍內)來使用。編碼<IGF-1R>HC*和LC*的輕鏈和重鏈質粒(質粒 DW047-pUC-HO-IGF-lR 和 DW048-pUC-LO-IGF_lR)和編碼 <ANGPT2>HC 和 LC 的輕鏈和重鏈質粒(分別地，質粒 SB07-pUC-Hyg-0riP-HC-ANGPT2 和 SB09-pUC-Hyg-0riP-LC_ANGPT2 或質粒SB04-pUC-HC-ANGPT2和SB06-pUC_LC_ANGPT2)利用摩爾比為1 1 (等摩爾)的 編碼輕鏈和重鏈的質粒由四種不同質粒來表達。在第3天，用L-谷氨酰胺加至4mM，葡萄 糖[西格瑪(Sigma)]和NAA[Gibco]飼養(yǎng)細胞。收獲的上清包含主要產物A)單特異性 <IGF-1R>VL-VH/CL-CH1 交換抗體、B)雙特異性 <ANGPT2-IGF-1R>VL-VH/CL_CH1 交換抗體 和C) <ANGPT2>野生型抗體，并表示為“雙特異性VL-VH/CL-CH1交換混合物”。在轉染后第 5-11天通過離心收獲包含雙特異性VL-VH/CL-CH1交換混合物的細胞培養(yǎng)物上清并保存 在-20"C。為了比較的原因，野生型<IGF-1R>抗體由HC和LC質粒(4842-pUC-LC-IGF-lR 和4843-pUC-HC-IGF-lR，實施例1A)和野生型<ANGPT2>HC和LC質粒(分別地， SB07-pUC-Hyg-0riP-HC-ANGPT2 和 SB09-pUC-Hyg-0riP-LC_ANGPT2 或 SB04-pUC-HC_ANGPT2 和SB06-pUC-LC-ANGPT2) —起瞬時共表達。在第3天，用L-谷氨酰胺加至4mM，葡萄糖[西 格瑪(Sigma)]和NAA[Gibco]飼養(yǎng)細胞。收集的上清包含單特異性，雙特異性或無結合能 力的不同<IGF-1R>和<ANGPT2>野生型抗體變體的混合物并表示為“野生型混合物”，所述 單特異性，雙特異性或無結合能力歸因于輕鏈與來自<IGF-1R>和<ANGPT2>野生型抗體的 兩條重鏈的不受控關聯，其導致錯誤的輕鏈關聯。包含野生型混合物的細胞培養(yǎng)物上清在 轉染后第5-11天通過離心收獲并保存在-20°C。由于<ANGPT2>野生型抗體顯示出比<IGF_1R>野生型和<IGF_lR>Fab交叉抗體顯 著更高的表達瞬時表達產率，所以<ANGPT2>野生型抗體質粒與<IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交 換抗體質粒的比例向著有利于<ANGPT2>野生型抗體表達的方向偏移。在將來的實驗中必 須調整質粒比例，以容許同等表達兩種特異性，從而導致不同抗體更加均等的分布。實施例3B雙特異性<ANGPT2-IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交換抗體的免疫沉淀主要產物A)單特異性<IGF-1R>VL-VH/CL_CH1交換抗體，B)雙特異性 <ANGPT2-IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交換抗體和C) <ANGPT2>野生型抗體的混合物(“雙特異 性VL-VH/CL-CH1交換混合物”)通過使用蛋白質A瓊脂糖-珠(Roche(FS))的免疫沉 淀法從胞培養(yǎng)物上清(實施例3A)中分離。60 μ L蛋白質A瓊脂糖珠在TBS-NP40 (50mM Tris, pH 7. 5，150mMNaCl，1 % Nonidet-P40)中洗滌三次。隨后，將 l_15mL 細胞培養(yǎng)物 上清應用于在TBS-NP40中預平衡的蛋白質A瓊脂糖珠。室溫下溫育1小時后，將該珠在 Ultrafree-MC-過濾柱(Amicon)上用 0. 5mL TBS-NP40 洗滌 1 次，用 0. 5mL 2x 磷酸鹽緩沖 液(2xPBS，Roche(FS))洗滌2次，并用0. 5mL100mM檸檬酸鈉pH 5，O簡單洗滌4次。通 過添加35μ 1NuPAGE LDS樣品緩沖液(Invitrogen)洗脫結合的抗體。樣品的一半分 別與NuPAGE 樣品還原劑混合或保持未還原，并在70°c加熱10分鐘。隨后，將20 μ 1應 用于 4-12%NuPAGE Bis-Tris SDS-PAGE(Invitrogen)(具有MOPS 緩沖液，以用于非還 原的SDS-PAGE，和具有NuPAGE 抗氧化運行緩沖液添加劑(Invitrogen)的MES緩沖液， 以用于還原的SDS-PAGE)并用考馬斯藍染色。在SDS-PAGE上不能觀察到三種抗體種類之 間的差異。所有抗體的行為如同典型的IgGl抗體，具有對應于輕鏈的ca. 25kDa條帶和對 應于各自重鏈的50kDa條帶。在未還原的狀態(tài)中，對完整抗體可以觀察到ca. 150kDa的條 帶。因此，為了證明功能性雙特異性<ANGPT2-IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交換抗體的存在，純化
35三種抗體種類的交叉混合物(實施例3C)并設計細胞FACS橋連測定法(實施例3D)。實施例3C純化雙特異性<ANGPT2-IGF-1R>VL-VH/CL_CH1 交換抗體按照已知的標準方法，通過蛋白質A親合層析法及隨后的大小排阻層析法，由 過濾的細胞培養(yǎng)物上清中純化來自實施例3A的主要產物A)單特異性<IGF-1R>VL-VH/ CL-CH 1 交換抗體，B)雙特異性 <ANGPT2-IGF-1R>VL-VH/CL-CH1 交換抗體和 C) <ANGPT2> 野生型抗體的混合物(“雙特異性VL-VH/CL-CH1交換混合物”)。簡言之，來自質粒 DW047-pUC-HC*-IGF-lR 和 DW048-pUC-LC*-IGF_lR 和 SB07-pUC-Hyg-0riP-HC_ANGPT2 和 SB09-pUC-Hyg-0riP-LC-ANGPT2的瞬時轉染的包含抗體混合物的細胞培養(yǎng)物上清通過離 心(10，000g，10分鐘)和經由0.45 μ m濾器過濾來凈化，并應用于用PBS緩沖液(IOmM Na2HP04, ImM KH2P04,137mM NaCl和2. 7mM KCl，pH 7.4)平衡的蛋白質AHiTrap MabSelect Xtra柱(GE healthcare (GE健康護理))。用PBS平衡緩沖液及隨后的0. IM檸檬酸鈉緩沖 液，PH 5.5洗出未結合的蛋白，并用PBS洗滌。用IOOmM檸檬酸鈉，pH 2，8實現雙特異性 <ANGPT2-IGF-1R>VL-VH/CL-CH1 交換抗體的洗脫，隨后立即用 300μ 1 2Μ Tris pH 9. 0/2ml 級分來中和樣品。在20mM組氨酸，150mM NaCl pH 6. 0中，通過在HiLoad 26/60Superdex 200制備級柱(GE healthcare (GE健康護理))上進行的大小排阻層析法將聚集的蛋白質 與單體抗體分開，且隨后利用MILLIPORE Amicon Ultra_15離心濃縮器濃縮單體抗體級 分。在-20°C或-80°C下冷凍和保存該VL-VH/CL-CH1交換抗體。該抗體種類的完整性通 過在存在和缺乏還原劑的SDS-PAGE和隨后用考馬斯亮藍染色來分析(見圖14)，如實施例 ID所述。該抗體混合物行為如同典型的IgGl抗體，具有對應于輕鏈的ca. 25kDa條帶和對 應于各自重鏈的50kDa條帶。在未還原的狀態(tài)中，對完整抗體可以觀察到ca. 150kDa的條 帶。蛋白質A純化后，由SDS-PAGE沒有觀察到明顯的副產物諸如單價抗體等。雙特異性 <ANGPT2-IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交換抗體的聚集和低聚狀態(tài)通過分析大小排阻層析法來分 析，并顯示純化的抗體種類處于單體狀態(tài)。提供表征的樣品，以進行隨后的蛋白質分析和功 能表征。為了證明功能性雙特異性<ANGPT2-IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交換抗體的存在，在細 胞FACS橋連測定中分析三種抗體種類的混合物(實施例3D)。為了比較的原因，由共表達野生型<IGF_1R>抗體HC和LC質粒 (4842-pUC-LC-IGF-lR 和 4843-pUC-HC-IGF-lR，實施例 1A)以及野生型 <ANGPT2>HC 和 LC 質粒(SB07-pUC-Hyg-0riP-HC-ANGPT2 和 SB09-pUC-Hyg-0riP-LC_ANGPT2)產生的野生型混 合物通過蛋白質A親合層析法及隨后的大小排阻層析法，按照所述程序，從過濾的細胞培 養(yǎng)物上清中純化，作為參照。實施例3D在針對I24IGF-1R表達細胞的細胞FACS橋連測定中檢測功能性雙特異性 <ANGPT2-IGF-1R>VL-VH/CL-CH1 交換抗體為了證實來自實施例3A中所述的瞬時共表達的主要產物A)單特異性 <IGF-1R>VL-VH/CL-CH1 交換抗體，B)雙特異性 <ANGPT2-IGF-1R>VL-VH/CL_CH1 交換抗體 和C) <ANGPT2>野生型抗體的“雙特異性VL-VH/CL-CH1交換混合物”中存在功能性雙特異 性 <ANGPT2-IGF-1R>VL-VH/CL-CH1 交換抗體，對 124 細胞(表達重組人 IGF-1R 的 NIH3T3 細胞，Roche(FS))進行細胞FACS IGF-1R-ANGPT2橋連測定。該測定的原理在圖15
36中描述。分別存在于上清中(實施例3A)或純化的抗體混合物中(實施例3C)的雙特異 性<ANGPT2-IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交換抗體能夠同時結合124細胞中的IGF-IR和結合 ANGPT2 ；且因此應該用兩個對置的Fab區(qū)橋連它的兩個靶抗原。簡言之，5xlOE5I24細胞/FACS管用50 μ L未稀釋的細胞培養(yǎng)物上清或160 μ g/ mL總純化抗體混合物的稀釋物來溫育，并在冰上溫育1小時。在第一種情形中，用來 自共表達交叉 <IGF-1R> 質粒(DW047-pUC-HO-IGF-lR 和 DW048-pUC-LC*-IGF_lR)和 野生型 <ANGPT2> 質粒(SB04-pUC-HC-ANGPT2> 和 SB06-pUC-LC_ANGPT2)的細胞培 養(yǎng)物上清，表示為“雙特異性VL-VH/CL-CH1交換混合物”或B)來自共表達野生型 <IGF-1R> 質粒(4842-pUC-LC-IGF-lR 和 4843-pUC-HC-IGF-lR)和野生型 <ANGPT2> 質 粒(SB04-pUC-HC-ANGPT2>和SB06-pUC-LC_ANGPT2)的細胞培養(yǎng)物上清，表示為“野生型 混合物”來溫育細胞(圖16)。在第二種情形中，將來自雙特異性VL-VH/CL-CH1交換混 合物或來自野生型混合物的各種純化抗體應用于124細胞(實施例3C，圖17)。未結合 的抗體用4ml冰冷PBS(Gibco)+2% FCS(Gibco)洗去，離心細胞(5分鐘，400g)并且用 50 μ 1 2 μ g/mL人血管生成素-2 (ANGPT2) (R&D Systems (R&D系統))在冰上檢測結合的 雙特異性抗體1小時。隨后，用4ml冰冷PBS(Gibco)+2% FCS(Gibco)洗滌一次(圖16) 或兩次(圖17)洗去未結合的血管生成素_2(ANGPT2)，離心細胞(5分鐘，400g)并且用 50 μ 1 5 μ g/mL<Ang-2>mIgGl-生物素抗體(BAM0981，R&D Systems (R&D 系統))在冰上檢 測結合的血管生成素_2 45分鐘；備選地，用50 μ 1 5 μ g/mL mlgG 1-生物素-同種型對 照(R&DSystems (R&D系統))溫育細胞。未結合的檢測抗體用4ml冰冷PBS (Gibco)+2 % FCS(Gibco)洗去，離心細胞(5分鐘，400g)并且在避光條件下，用50 μ 1 1 400鏈霉親和 素-PE綴合物(Invitrogen/Zymed)在冰上檢測結合的檢測抗體45分鐘。未結合的鏈霉親 和素-PE綴合物用4ml冰冷PBS (Gibco)+2% FCS(Gibco)洗去。隨后，對細胞進行離心(5 分鐘，400g)，重新懸浮在 300-500 μ L PBS 中，并且在 FACSCalibur 或 FACS Canto (BD (FL2 通道，10. 000細胞/獲得物)上量化結合的鏈霉親和素-PE綴合物。在實驗過程中，包括各 自的同種型對照，以排除任何非特異性結合事件。另外，包括純化的單特異性二價IgGl抗 體<IGF-1R>和<ANGPT2>作為對照。圖16顯示來自使用細胞培養(yǎng)物上清的針對124細胞的細胞FACS橋連測定的結 果；圖17顯示使用純化的抗體混合物的結果。在這兩種其中應用VL-VH/CL-CH1交換技術 的情形中，使用來自VL-VH/CL-CH1交換抗體和野生型抗體的共表達的上清或純化的抗體 “雙特異性VL-VH/CL-CH1交換混合物”導致熒光性的顯著偏移，這說明能夠同時結合124細 胞中的IGF-IR和結合ANGPT2的功能性雙特異性<ANGPT2-IGF-1R>VL-VH/CL_CH1交換抗體 的存在；并由此使用對置的Fab區(qū)橋連它的兩種靶抗原。與此相反且如對共表達兩種野生 型抗體所預測地，當應用來自野生型<IGF-1R>質粒和野生型<ANGPT2>質粒的共表達的細 胞培養(yǎng)物上清或純化的抗體“野生型混合物”時，僅形成非常少量的功能性雙特異性抗體， 這僅導致FACS橋連測定中熒光性的微小偏移，這說明僅存在少量部分的功能性雙特異性 <IGF-1R-ANGPT2> 野生型抗體。這些結果顯示，通過編碼<IGF_1R>抗體的VL-VH/CL-CHl交換質粒和編碼 <ANGPT2>抗體的野生型質粒的共表達可以容易地生成同時識別兩種不同靶標的功能性雙 特異性 <ANGPT2-IGF-1R>VL-VH/CL-CH1 交換抗體。相反，編碼 <IGF_1R> 和 <ANGPT2> 抗體的兩種野生型質粒的共表達導致形成的抗體的高度復雜性和僅小比例的功能性雙特異性 <IGF-1R-ANGPT2> 野生型抗體。實施例4生成具有修飾的CH3結構域(杵-進入-臼)的二價雙特異性 <VEGF-ANGPT2>VL-VH/CL-CH1 交換抗體(圖 30)如上實施例所示，編碼野生型抗體的質粒和編碼VL-VH/CL-CH1交換抗體的質粒 的共表達導致生成主要產物A)單特異性<IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交換抗體，B)雙特異性 VL-VH/CL-CH1交換抗體和C)野生型抗體的雙特異性VL-VH/CL-CH1交換混合物。為了進一 步提高雙特異性<VEGF-ANGPT2>VL-VH/CL-CH1交換抗體的產率，將杵-進入-臼技術應用 于<ANGPT2>VL-VH/CL-CH1交換抗體和野生型<VEGF>抗體的共表達，從而促進各種未修飾 的和修飾的重鏈(經由HC和HC*)的異型二聚化，并獲得更加同質的功能性雙特異性抗體 制備物。在該實施例中，生成如上所述的基于<VEGF>野生型抗體G6-31和VL-VH/CL-CH1 交換<ANGPT2>抗體Mab536的同時識別VEGF和ANGPT2的雙特異性抗體。如上所述，編碼<ANGPT2>抗體前導序列、輕鏈可變結構域(VL)和人κ -輕鏈恒定 結構域(CL)的基因區(qū)段連接并與人Yl-重鏈恒定結構域(鉸鏈-CH2-CH3)的Fc結構域 的5’末端融合。編碼通過用VL和CL結構域交換VH和CHl結構域獲得的各種融合蛋白的 DNA通過基因合成產生，并表示為<ANGPT2>HC* (重鏈*) (SEQ ID NO 8)。<ANGPT2>抗體前導序列，重鏈可變結構域(VH)和人gl_重鏈恒定結構域(CHl)的 基因區(qū)段作為獨立的鏈連接。編碼通過用VH和CHl結構域交換VL和CL結構域獲得的各 種融合蛋白的DNA通過基因合成產生，并在以下表示為<ANGPT2>LC* (輕鏈*) (SEQ ID NO 9)。包括該實施例中所述的各自前導序列的單特異性二價<VEGF>野生型抗體G6-31 的野生型重鏈和輕鏈可變結構域的序列源自人<VEGF>抗體G6-31的重鏈可變結構域SEQ ID NO :12和輕鏈可變結構域SEQ ID NO 13，這二者均源自人噬菌體展示來源的抗VEGF 抗體G6-31，其詳細記述在Liang等.，J Biol Chem.(生物化學雜志)2006年1月13日； 281(2) :951-61中和US 2007/0141065中，且重鏈和輕鏈恒定結構域源自人抗體(C-κ和 IgGl)。為了該目的，編碼<VEGF>野生型抗體G6-31的重鏈的質粒通過將由基因合成生 成的并編碼SEQ ID N0:10的杵殘基T366W的CH3基因區(qū)段引入到各自的<VEGF>野生型 抗體G6-31重鏈的CH3結構域中來進行修飾，從而形成SEQ ID NO 16 ；相反，編碼VL-VH/ CL-CHl交換<ANGPT2>抗體Mab536的重鏈*HC*的質粒通過將由基因合成生成的并編碼SEQ IDNO 11的臼殘基T366S，L368A, Y407V的CH3基因區(qū)段引入到各自的VL-VH/CL-CH1交換 <ANGPT2>抗體Mab536重鏈*HC*的CH3結構域中來進行修飾，從而形成SEQ ID NO 15。在 該情形中，編碼野生型<VEGF>杵抗體G6-31的質粒組成基因組載體，而用于VL-VH/CL-CH1 交換<ANGPT2>抗體Mab536的質粒組成內含子A_cDNA載體。隨后，在Quad發(fā)酵桶中以2. 6L的規(guī)模，如上所述通過在HEK293-F系統中瞬時轉 染，以等摩爾比例來共表達各自四種質粒，即編碼具有杵的<VEGF>G6-31重鏈HC SEQ ID NO :16和野生型輕鏈LC SEQ ID NO :14，和修飾的具有臼的VL-VH/CL-CH1交換<ANGPT>重鏈 *HC*SEQ IDNO 15 和修飾的輕鏈 *LC*(SEQ ID NO 8)的質粒?？贵w經由 HiTrapMabSelect柱(GE)及隨后在如上所述的HiLoad Superdex 200 26/60柱(GE)上進行的大小排阻層析 法來純化。SEC后的產率在來自2L瞬時表達的ca. 38mg純化抗體級分的范圍內。圖26顯 示在純化過程中獲得的尺寸排阻級分的還原和非還原SDS-PAGE。在還原的SDS-PAGE上， 可以觀察到均勻地合成和純化了各自的野生型和修飾的重鏈和輕鏈。然而，在非還原的 SDS-PAGE上，顯然仍存在若干抗體種類。 以下，獲得的尺寸排阻級分通過質譜法來分析(去糖基化但不還原或去糖基化且 還原)。通過質譜法可以鑒別級分中的若干抗體種類并還可以為其分配在各自SDS-PAGE上 觀察到的條帶(圖27)。下表顯示可以鑒別的抗體種類 所需的用一個臂識別VEGF且用另一個臂識別ANGPT2的雙特異性 <VEGF-ANGPT2>VL-VH/CL-CH1交換抗體可以因此通過質譜法明確鑒別，且還可以在各自的 SDS-PAGE觀察到。所需的雙特異性<VEGF-ANGPT2>VL-VH/CL-CH1交換抗體的示意圖顯示在 圖30中?？梢栽诩壏?和6中發(fā)現最高濃度的這種所需的抗體，而其濃度在后來的級分中 減少。另外，能夠同時結合ANGPT2和VEGF的雙特異性<VEGF-ANGPT2>VL-VH/CL_CH1交 換抗體的存在通過上述ELISA橋連測定(圖28)和Biacore橋連測定(圖29)來證實，其 顯示所述雙特異性抗體能夠同時結合ANGPT2和VEGF。在這些測定中，四價雙特異性抗體 TvG6-Ang23起對照的作用。應該注意到，由于野生型<VEGF>抗體G6-31的相對過表達，例如由于編碼G6-31 衍生物的基因組載體的較好的表達產率，促進無活性副產物的形成，這導致過量的無活性 G6-31 二聚體和半抗體。為了獲得所需雙特異性<VEGF-ANGPT2>VL-VH/CL-CH1交換抗體的 最大產率，正在進行實現全部四種抗體鏈均勻表達并減少副產物形成的另外的研究。這些 研究包括i)最優(yōu)化用于共表達的4種質粒的等摩爾化學計量，其例如通過組合一種或兩種 質粒上的轉錄單元，引入各自的對照元件來實現；以及ii)最優(yōu)化異型二聚化，其例如通過 使用不同的杵_進入-臼技術諸如將另外的二硫鍵引入CH3結構域例如將Y349C引入“杵 鏈”和將D356C引入“白鏈”和/或結合由EP 1870459A1所述地對杵殘基使用殘基R409D ； K370E (K409D)和對白殘基使用D399K ；E357K來實現。
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權利要求
二價雙特異性抗體，其包括a)特異性結合第一抗原的抗體的輕鏈和重鏈；和b)特異性結合第二抗原的抗體的輕鏈和重鏈，其中可變結構域VL和VH相互替換，且其中恒定結構域CL和CH1相互替換。
2.按照權利要求1的抗體，其特征在于一條重鏈的CH3結構域和另一條重鏈的CH3結構域在包括抗體CH3結構域之間的初始 界面的界面處相接觸；其中所述界面被改變，以促進形成所述二價雙特異性抗體，其中所述改變的特征在于a)改變一條重鏈的CH3結構域，由此，在與所述二價雙特異性抗體內的另一條重鏈的CH3結構域的初始界面相接觸的 一條重鏈的CH3結構域的初始界面內，氨基酸殘基被替換為具有較大側鏈體積的氨基酸殘基，由此在一條重鏈的CH3結構域 的界面內生成凸起，所述凸起可以定位在另一條重鏈的CH3結構域的界面內的凹洞中 且b)改變另一條重鏈的CH3結構域，由此，在與所述二價雙特異性抗體內的第一 CH3結構域的初始界面相接觸的第二 CH3 結構域的初始界面內，氨基酸殘基被替換為具有較小側鏈體積的氨基酸殘基，由此在第二 CH3結構域的界面 內生成凹洞，在所述凹洞中可以定位第一 CH3結構域的界面內的凸起。
3.按照權利要求2的抗體，其特征在于所述具有較大側鏈體積的氨基酸殘基選自由精氨酸(R)，苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色 氨酸(W)組成的組。
4.按照權利要求2或3中任一項的抗體，其特征在于所述具有較小側鏈體積的氨基酸殘基選自由丙氨酸(A)，絲氨酸(S)，蘇氨酸(T)，纈氨 酸(V)組成的組。
5.按照權利要求2-4中任一項的抗體，其特征在于通過引入半胱氨酸(C)作為每個CH3結構域的相應位置處的氨基酸來進一步改變兩個 CH3結構域。
6.按照權利要求1的抗體，其特征在于兩條重鏈的恒定重鏈結構域CH3之一被替換為恒定重鏈結構域CHl ；且另一個恒定重 鏈結構域CH3被替換為恒定輕鏈結構域CL。
7.用于制備按照權利要求1的二價雙特異性抗體的方法，其包括下列步驟 a)用以下各項轉化宿主細胞，_載體，其包括編碼特異性結合第一抗原的抗體的輕鏈和重鏈的核酸分子，和 -載體，其包括編碼特異性結合第二抗原的抗體的輕鏈和重鏈的核酸分子， 其中可變結構域VL和VH相互替換，且其中恒定結構域CL和CHl相互替換；b)在容許合成所述抗體分子的條件下培養(yǎng)所述宿主細胞；和c)從所述培養(yǎng)物中回收所述抗體分子。
8.宿主細胞，其包括_載體，其包括編碼特異性結合第一抗原的抗體的輕鏈和重鏈的核酸分子，和 -載體，其包括編碼特異性結合第二抗原的抗體的輕鏈和重鏈的核酸分子， 其中可變結構域VL和VH相互替換， 且其中恒定結構域CL和CHl相互替換。
9.按照權利要求1-6的二價雙特異性抗體的組合物，優(yōu)選藥物或診斷組合物。
10.藥物組合物，其包括按照權利要求1-6的二價雙特異性抗體和至少一種藥用賦形
全文摘要
本發(fā)明涉及新型結構域交換、二價、雙特異性抗體，及其制備和應用。
文檔編號C07K16/46GK101896504SQ200880120258
公開日2010年11月24日 申請日期2008年12月16日 優(yōu)先權日2007年12月21日
發(fā)明者克里斯蒂安·克萊恩, 沃爾夫岡·謝弗 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司