專利名稱：生物分子的選擇性放射性標(biāo)記的制作方法
生物分子的選擇性放射性標(biāo)記
背景技術(shù)：
將氟原子，特別是放射性氟原子引入到包含氨基酸殘基的生物分子上的方法是相 當(dāng)令人感興趣的。但是，因?yàn)榉派湫苑?，例?8F,具有大約110分鐘的相當(dāng)短的壽命， 因此需要時(shí)間有效的方法來將放射性氟引入到生物分子上。一直需要一種有效的和位置特定的方法來將氟原子(包括放射性氟原子)引入到 生物分子上。

發(fā)明內(nèi)容
在一方面，公開了將氟原子引入到生物分子例如多肽上的方法。該方法可以包含 (i)提供連接劑，該連接劑包括硫醇反應(yīng)性末端和疊氮基/炔反應(yīng)性末端；(ii)將該連接劑 的硫醇反應(yīng)性末端與包含至少一個(gè)硫醇基團(tuán)或者其反應(yīng)性衍生物的生物分子進(jìn)行反應(yīng)；和 (iii)隨后將該連接劑的疊氮基/炔反應(yīng)性末端與氟取代的疊氮化物或者炔基分別進(jìn)行反應(yīng)。在另一方面，提供了一種將一個(gè)或多個(gè)氟原子引入到生物分子上的方法。該方法 包含⑴將Mal-炔雙官能連接劑例如N-(丁-3-炔)-3-(2，5_ 二氧-2，5-二氫-IH-吡 咯-1-基)丙酰胺連接劑(1)的硫醇反應(yīng)性基團(tuán)與包含至少一個(gè)硫醇基團(tuán)的生物分子進(jìn)行 反應(yīng)；和(ii)隨后將該連接劑的炔基與氟取代的疊氮化物進(jìn)行反應(yīng)。在仍然的另外一方面，提供了生物結(jié)合物(bioconjugate)，包含衍生自下面的結(jié) 構(gòu)單元(i)包含至少一個(gè)硫醇基團(tuán)的生物分子；和(ii)連接劑。該連接劑可以通過這樣 一種方法來制備的，該方法包含將包含疊氮基或者炔反應(yīng)性官能基團(tuán)的胺化合物與包含硫 醇反應(yīng)性官能基團(tuán)的羧酸或者活化的酯進(jìn)行反應(yīng)。在另一方面，該連接劑可以通過將包含 硫醇反應(yīng)性官能基團(tuán)的胺化合物與包含疊氮基或者炔反應(yīng)性官能基團(tuán)的羧酸或者活化的 酯化合物進(jìn)行反應(yīng)來制備。在仍然的另一方面，在本文中提供了使用所述方法制備的生物結(jié)合物，連接劑，和 生物分子。在另一方面，提供了連接劑的復(fù)合物(compositions)。


當(dāng)參考附圖來閱讀下面的詳細(xì)說明時(shí)，本發(fā)明的這些方面和優(yōu)點(diǎn)將變得更清楚， 在附圖中，同樣的附圖標(biāo)記在整個(gè)附圖中表示同樣的部件，其中圖1表示了非最優(yōu)化的系統(tǒng)的反應(yīng)混合物的HPLC分析，其表示了 18F click標(biāo)記 的抗-Her2親和體(27) (a,放射性通道；b, 280nm的UV通道)。圖2表示了含有2-[18F]氟乙基疊氮化物(11)的反應(yīng)混合物的HPLC分析，該分 析使用梯度I，216nm的UV (a，放射性通道，2-[18F]氟乙基疊氮化物(11)在3 :51min ；b, UV 通道)。蒸餾的產(chǎn)物顯示僅僅存在著2-[18F]氟乙基疊氮化物(11) (c，放射性通道；d，UV通 道)。
圖3表示了使用模塊化合物(16)和2_[18F]氟乙基疊氮化物(11)，在不同的炔 (16)濃度和溫度所形成的三唑產(chǎn)物(17)的放射化學(xué)產(chǎn)率的HPLC圖。圖4表示了炔基化的親和體(22)的MALDI-TOF MS數(shù)據(jù)。圖5表示了在炔基化的親和體(22)和Cy5標(biāo)記的疊氮基PEG(25a)之間的click 結(jié)合物的SDS-PAGE蛋白質(zhì)凝膠。當(dāng)存在Cu1源和還原劑時(shí)，在期望分子量的結(jié)合物產(chǎn)物 (26)時(shí)觀察到Cy5染料的熒光發(fā)射。在不存在任何這些的對(duì)照試驗(yàn)中，沒有觀察到結(jié)合的 產(chǎn)物的存在。
具體實(shí)施例方式下面的詳細(xì)說明是示例性的，目的并非限制本發(fā)明應(yīng)用和本發(fā)明的用途。此外，本 發(fā)明不受限于前述發(fā)明背景或者下面的詳細(xì)說明中所展示的任何理論。為了更清楚和簡(jiǎn)明的描述和指出所請(qǐng)求保護(hù)的本發(fā)明的主題，提供了下面的定義 來用于在下面的說明書及其附加的權(quán)利要求中所用的具體術(shù)語。除非另有明確的指示，單 數(shù)形式“一種(a/an)，，和“該/所述(the)，，包括復(fù)數(shù)指示。作為此處使用的，術(shù)語“活化基團(tuán)”指的是任何這樣的基團(tuán)，其使得羰基基團(tuán)朝著 親核試劑(nucleophiles)具有更大的反應(yīng)性，該親核試劑是例如N-羥基琥珀酰亞胺，磺 基-N-羥基琥珀酰亞胺，?；群碗逯虚g體。作為此處使用的，術(shù)語“疊氮基反應(yīng)性末端”和/或“疊氮基反應(yīng)性官能基團(tuán)”指 的是任何能夠與疊氮化物官能基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)的官能基團(tuán)。疊氮基反應(yīng)性官能基團(tuán)的一些例 子包括但不限于炔類(alkynes)，丙二烯類(allenes)和膦類(phosphines)。作為此處使用的，術(shù)語“炔反應(yīng)性末端”和/或“炔反應(yīng)性官能基團(tuán)”指的是任何能 夠與炔官能基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)的官能基團(tuán)。炔反應(yīng)性官能基團(tuán)的例子包括但不限于疊氮化物， 其能夠在Cu1源(包括但不限于Ci^Ci^Cu11)和還原性試劑(例如抗壞血酸鈉)的存在下 進(jìn)行反應(yīng)。作為此處使用的，術(shù)語“脂肪族基”或者”脂肪族基團(tuán)”通常指的是碳原子的陣列 (array)，其不是環(huán)狀的，并且具有sp3碳原子的連接點(diǎn)。該碳原子的陣列可以進(jìn)一步包含 SP3, Sp2或者sp雜化的碳原子的任意組合。此外，該碳原子的陣列可以是單價(jià)的，二價(jià)的或 者三價(jià)的。烷基基團(tuán)的例子包括甲基，乙基，正丙基，異丙基，正丁基，叔丁基，異辛基，芐基， 環(huán)己基甲基，和苯乙基，1'，1' - 二甲基芐基。作為此處使用的，術(shù)語“芳香族基”或/和“芳香族基團(tuán)”指的是SP2雜化碳原子和 共軛的碳_碳雙鍵的環(huán)狀陣列，并且具有在芳族SP2雜化碳原子處的連接點(diǎn)，其形成了該環(huán) 狀陣列碳原子的一部分。該芳香族基(團(tuán))可以具有從1到最大允許數(shù)目的取代基。芳族 基團(tuán)的例子包括苯基，取代的苯基，甲苯基，取代的甲苯基，二甲苯基，2，4，6_三甲苯基，氯 苯基，萘基，呋喃基，噻吩基，和吡咯基。作為此處使用的，術(shù)語“環(huán)烷基”或者“環(huán)烷基基團(tuán)”指的是環(huán)狀陣列的sp3雜化碳 原子，并且具有在SP3雜化碳原子處的連接點(diǎn)，其形成了該環(huán)狀陣列碳原子的一部分。該碳 原子陣列可以進(jìn)一步包含sp3，SP2或者SP雜化碳原子的任意組合。此外，該環(huán)狀陣列的碳 原子可以用1到最大允許數(shù)目的取代基進(jìn)行取代。此外，該陣列的環(huán)狀原子可以包含雜原 子，例如0，N，或者S。環(huán)烷基基團(tuán)的例子包括環(huán)己基，甲基環(huán)己基，三甲基環(huán)己基，苯基環(huán)己基，四氫吡喃基，4-硫雜環(huán)己基，和環(huán)辛基。術(shù)語“能夠與硫醇基團(tuán)進(jìn)行硫醇交換反應(yīng)的二硫化物基團(tuán)”指的是能夠與生物分 子的硫醇基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)的基團(tuán)。因此，二硫化物可以被認(rèn)為是硫醇反應(yīng)性基團(tuán)。吡啶基二 硫化物是這樣的二硫化物的一個(gè)例子。作為此處使用的，術(shù)語“氟取代的疊氮化物”表示具有至少一個(gè)氟取代基的包含疊 氮化物的化合物。此外，該氟取代基可以是任何的同位素變體，例如諸如18F和19F。在一種 實(shí)施方案中，該氟取代基是18F。該疊氮化物可以是脂肪族疊氮化物，脂環(huán)族疊氮化物或者 芳香族疊氮化物。此外，該脂環(huán)族疊氮化物和芳香族疊氮化物可以具有單環(huán)，雙環(huán)或者多環(huán) 結(jié)構(gòu)。作為此處使用的，術(shù)語“氟取代的炔”表示具有至少一個(gè)氟取代基的含有炔的化合 物。此外，該氟取代基可以是任何的同位素變體，例如諸如18F和19F。在一種實(shí)施方案中， 該氟取代基是18F。該炔可以是脂肪族炔，脂環(huán)族炔或者芳香族炔。此外，該脂環(huán)族炔和芳 香族炔可以具有單環(huán)，雙環(huán)或者多環(huán)結(jié)構(gòu)。作為此處使用的，術(shù)語“蛋白質(zhì)”，“肽”和“多肽”在此用來描述氨基酸的任何鏈， 而不管長(zhǎng)度或者翻譯后修飾例如糖基化或者磷酸化。因此，該術(shù)語可以在此交替的用來表 示氨基酸殘基的聚合物。該術(shù)語還用于這樣的氨基酸聚合物，在其中一種或多種氨基酸殘 基是相應(yīng)的天然存在的氨基酸的人工化學(xué)模擬品。因此，術(shù)語“多肽”包括全長(zhǎng)的天然存在 的蛋白質(zhì)以及重組的或者合成產(chǎn)生的多肽，其對(duì)應(yīng)于全長(zhǎng)的天然存在的蛋白質(zhì)或者對(duì)應(yīng)于 天然存在的蛋白質(zhì)的特定域或者部分。應(yīng)用于術(shù)語“烷基”，“脂肪族”，“脂環(huán)族”和“芳香族”的術(shù)語“基”和“基團(tuán)”在此
是交替使用的。作為此處使用的術(shù)語“硫醇反應(yīng)性末端”和/或“硫醇反應(yīng)性官能基團(tuán)”指的是能 夠與硫醇基團(tuán)(即，-SH基團(tuán))進(jìn)行反應(yīng)的官能基團(tuán)。硫醇反應(yīng)性官能基團(tuán)的例子包括但不 限于馬來酰亞胺基團(tuán)，鹵代脂肪族基團(tuán)，鹵代芳香族基團(tuán)，鹵代脂環(huán)族基團(tuán)，(鹵代乙?；? 烷基基團(tuán)，(鹵代乙?；?環(huán)烷基基團(tuán)，(鹵代乙?；?芳族基團(tuán)，α，β-不飽和砜基團(tuán)，乙 烯基砜基團(tuán)，α，β-不飽和羰基基團(tuán)，環(huán)氧基團(tuán)，氮丙啶基團(tuán)，和能夠與硫醇基團(tuán)進(jìn)行硫醇 交換反應(yīng)的二硫化物基團(tuán)。合適的馬來酰亞胺基團(tuán)包括母(未取代的)基團(tuán)以及衍生物，該衍生物包含脂肪 族，脂環(huán)族或者芳香族基團(tuán)作為取代基。合適的α，不飽和羰基基團(tuán)包括包含丙烯?；?團(tuán)的那些。合適的α，β-不飽和羰基基團(tuán)包括α，β-不飽和酯和α，β-不飽和砜。乙 烯基砜基團(tuán)是α，β-不飽和砜基團(tuán)的一個(gè)具體的例子。除非另有指示，否則在說明書和權(quán)利要求中的全部表示成分，性質(zhì)例如分子量，反 應(yīng)條件等等的量的數(shù)字被理解為在所有的情況中是用術(shù)語“大約”進(jìn)行修正的，因此除非另 有相反的指示，否則在下面的說明書和附加的權(quán)利要求中所述的數(shù)字參數(shù)是近似的，其可 以根據(jù)本發(fā)明所期望的獲得的性能來變化。最起碼的，并且目的并非是限制將等價(jià)的原則 應(yīng)用于權(quán)利要求的范圍，每個(gè)數(shù)字參數(shù)至少應(yīng)當(dāng)按照所報(bào)道的有效數(shù)字的數(shù)值和通過使用 通常的四舍五入技術(shù)來進(jìn)行解釋。本發(fā)明的方面涉及一種將氟原子引入到生物分子上的方法。該方法包括步驟(i)提供連接劑，該連接劑包括硫醇反應(yīng)性末端和疊氮基或者炔反應(yīng)性末端；
(ii)將該連接劑的硫醇反應(yīng)性末端與包含至少一個(gè)硫醇基團(tuán)或者其反應(yīng)性衍生 物的生物分子進(jìn)行反應(yīng)；和(iii)隨后將該連接劑的疊氮基或者炔反應(yīng)性末端與氟取代的疊氮化物或者炔基 分別進(jìn)行反應(yīng)。本發(fā)明的另一方面是提供一種生物結(jié)合物復(fù)合物(compositions)，其包含衍生自 下面的結(jié)構(gòu)單元包含至少一個(gè)硫醇基團(tuán)的生物分子和連接劑。該連接劑可以通過這樣一 種方法來制備，該方法包含將包含疊氮基或者炔反應(yīng)性官能基團(tuán)的胺化合物與包含硫醇反 應(yīng)性官能基團(tuán)的羧酸或者活化的酯進(jìn)行反應(yīng)。在另一方面，該連接劑可以通過將包含硫醇 反應(yīng)性官能基團(tuán)的胺化合物與包含疊氮基或者炔反應(yīng)性官能基團(tuán)的羧酸或者活化的酯化 合物進(jìn)行反應(yīng)來制備。生物分子作為此處使用的，術(shù)語“生物分子”指的是天然存在的或者工程化的分子，其包含 至少一個(gè)硫醇基團(tuán)(有時(shí)候也稱作“巰基”基團(tuán))或者其反應(yīng)性衍生物，用于與連接劑進(jìn)行 反應(yīng)。該硫醇基團(tuán)可以天然的存在于生物分子中或者可以使用標(biāo)準(zhǔn)生物學(xué)方法或者合適的 本領(lǐng)域公認(rèn)的方法而化學(xué)引入或者工程化。在一些實(shí)施方案中，該生物分子明確的排除具 有小于50個(gè)氨基酸殘基。這樣的生物分子可以在它們的天然狀態(tài)時(shí)具有一個(gè)或多個(gè)SH基團(tuán)，或者它們可 以是工程化的，例如使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物技術(shù)來工程化的。天然具有SH基團(tuán)的生物分子的例 子包括連接到一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸氨基酸的那些。術(shù)語“其反應(yīng)性衍生物”表示SH基團(tuán)的 衍生物，其被活化以便產(chǎn)生用于與連接劑化合物反應(yīng)的游離硫醇基團(tuán)。生物分子(其包含一個(gè)或多個(gè)天然硫醇基團(tuán)或者化學(xué)工程化的硫醇基團(tuán))的例子 包括肽，多肽，媒介物，脂質(zhì)，多糖，糖胺聚糖及其改性物，糖脂，糖蛋白，合成聚合物，細(xì)胞響 應(yīng)調(diào)節(jié)劑，(例如，生長(zhǎng)因子，趨化因子或者細(xì)胞因子)，酶，受體，神經(jīng)傳遞素，荷爾蒙，細(xì)胞 因子，疫苗，半抗原，毒素，干擾素和核酶。所公開的方法還可以應(yīng)用于這樣的分子，其不包 含硫醇基團(tuán)，但是共軛到包含硫醇基團(tuán)的分子上。生物分子另外的例子包括蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì) 片段，蛋白質(zhì)變體，支架基蛋白質(zhì)，工程化蛋白質(zhì)，核苷酸和相關(guān)分子，核酸，寡聚DNA或者 寡聚RNA肽結(jié)合物，抗體例如多克隆和單克隆抗體，和基于抗體的片段。因此，所公開的方 法能夠用于氟化核酸，包括脫氧核糖核酸(例如寡聚脫氧核苷酸，核酸探針，質(zhì)粒)，與含有 硫醇的分子(例如具有硫醇基團(tuán)的多肽)相關(guān)連的核糖核酸(例如siRNA)。該生物分子可以是具有至少一個(gè)硫醇基團(tuán)的任何天然存在的或者工程化的生物 分子。在全部的實(shí)施方案中，該生物分子可以包括天然存在和/或非天然的氨基酸殘基。在 另外一種實(shí)施方案中，該包含至少一個(gè)硫醇基團(tuán)的生物分子包含半胱氨酸殘基或者非天然 的基團(tuán)。術(shù)語“半胱氨酸殘基”是指在將半胱氨酸作為生物分子鏈一部分包括在內(nèi)之后產(chǎn) 生的除了硫醇基團(tuán)之外的結(jié)構(gòu)片段。在仍然的另外一種實(shí)施方案中，用于與連接劑反應(yīng)的 生物分子是具有工程化半胱氨酸殘基的分子，這意味著可以對(duì)合適的前體生物分子進(jìn)行化 學(xué)改性來產(chǎn)生具有硫醇基團(tuán)和半胱氨酸殘基的期望的生物分子。在一些情況中，生物分子可以用還原劑處理來產(chǎn)生反應(yīng)性硫醇基團(tuán)。例如，具有 二硫化物連接基的生物分子可以用合適的還原劑還原，來產(chǎn)生兩當(dāng)量的具有硫醇基團(tuán)的 生物分子。有用的還原劑的例子包括2-巰基乙醇，2-巰基乙醇胺，二硫蘇糖醇(DTT)和三-(2-羧乙基)膦(TCEP)。連接劑作為此處使用的，術(shù)語“連接劑”指的是雙官能化合物，其包含硫醇反應(yīng)性末端或 者其受保護(hù)的衍生物，和疊氮基或者炔反應(yīng)性末端或者其受保護(hù)的衍生物。該連接劑可以 用來通過硫醇反應(yīng)性末端在一端連接到含有硫醇的化合物，和分別通過疊氮基或者炔反應(yīng) 性末端在另一端連接到疊氮化物或者炔，特別是氟取代的疊氮化物或者炔。作為此處使 用的，術(shù)語“Mai-炔雙官能連接劑”指的是這樣的連接劑，其在第一末端具有馬來酰亞胺 基團(tuán)和在第二末端上具有炔基，例如N-(丁 -3-炔基)-3-(2，5- 二氧-2，5- 二氫-IH-吡 咯-1-基)丙酰胺連接劑(1)，“Mai-疊氮化物雙官能連接劑”指的是這樣的連接劑，其在 第一末端上具有馬來酰亞胺基團(tuán)和在第二末端上具有疊氮化物基團(tuán)，例如化合物(2)。連接 劑的一些非限定性的例子表示在結(jié)構(gòu)(1)_(6)中。
(6)在一些實(shí)施方案中，硫醇反應(yīng)性末端，疊氮基或者炔反應(yīng)性末端，或者硫醇反應(yīng)性 末端和疊氮基或者炔反應(yīng)性末端二者可以用前體衍生物來代替。該連接劑可以用來通過硫 醇反應(yīng)性末端在一端連接到含有硫醇的化合物，和/或分別通過疊氮基或者炔反應(yīng)性末端 在另一端連接到疊氮化物或者炔(例如氟取代的疊氮化物或者炔)。連接劑制備該連接劑可以通過任何這樣的方法來制備，該方法使得硫醇反應(yīng)性官能基團(tuán)和疊 氮基或者炔反應(yīng)性官能基團(tuán)能夠用于分別與(i)具有至少一個(gè)硫醇基團(tuán)的生物分子，和 (ii)氟取代的疊氮化物或者炔進(jìn)行反應(yīng)。在一種實(shí)施方案中，該連接劑是通過將包含疊氮 基或者炔反應(yīng)性官能基團(tuán)的胺化合物與包含硫醇反應(yīng)性官能基團(tuán)的羧酸或者活化的酯進(jìn) 行反應(yīng)來制備的?？梢允褂萌魏蔚木哂携B氮基或者炔反應(yīng)性官能基團(tuán)的胺化合物。在一種 實(shí)施方案中，該胺化合物包含結(jié)構(gòu)(7)，G-J-NHR1(7)
其中G是疊氮基或者炔反應(yīng)性官能基團(tuán)，J是連接單元，R1是H，脂肪族基團(tuán)，芳香 族基團(tuán)或者脂環(huán)族基團(tuán)。二價(jià)連接單元J的性質(zhì)可以設(shè)計(jì)來使得空間位阻最小，該位阻會(huì) 對(duì)硫醇反應(yīng)性和疊氮基或者炔反應(yīng)性官能基團(tuán)的反應(yīng)性產(chǎn)生不利影響。本方案的一個(gè)優(yōu)點(diǎn) 是連接單元可以設(shè)計(jì)調(diào)整來改變生物結(jié)合物的最終性能。因此，該連接劑可以在大小，極 性，電荷和化學(xué)成分方面進(jìn)行改變，來改變最終的結(jié)合物的性能，例如溶解性和藥物動(dòng)力學(xué) /藥效學(xué)(PK/PD)性能。此外，該連接劑可以包括用于基團(tuán)連接的另外的處理，這將提高目 標(biāo)性和/或溶解性。在其他的實(shí)施方案中，該連接劑可以將包含硫醇反應(yīng)性官能基團(tuán)的胺化合物與包 含疊氮基或者炔反應(yīng)性官能基團(tuán)的羧酸或者活化的酯化合物來制備。該羧酸或者活化的酯包含結(jié)構(gòu)(8)，L-M-COR2(8)其中L包含硫醇反應(yīng)性官能基團(tuán)，或者其受保護(hù)的衍生物；M是二價(jià)連接單元，R2 是OH或者活化基團(tuán)。該活化基團(tuán)R2促進(jìn)了具有疊氮基或者炔反應(yīng)性官能基團(tuán)的胺化合物 與結(jié)構(gòu)(8)的羰基碳原子的反應(yīng)。在另外一種實(shí)施方案中，該連接劑復(fù)合物(compositions)包含式L-M-CO-NH (R1) -J-G，其中L是硫醇反應(yīng)性官能基團(tuán)；M和J是雙官能單元/連接單元；R1是H，脂肪族基團(tuán)，芳香族基團(tuán)或者脂環(huán)族基團(tuán)；和G是疊氮基或者炔反應(yīng)性官能基團(tuán)在反應(yīng)方案1和2中表示了用于制備具有結(jié)構(gòu)(1)和(2)的連接劑的示例性合成方案。反應(yīng)方案1 在反應(yīng)方案1和2中，DMF代表了二甲基甲酰胺，DIEA代表了二-異丙基乙基胺。 能夠使用這些方法來制備的連接劑的一些例子表示在上面的結(jié)構(gòu)(1)_(6)中。生物結(jié)合物由連接劑與具有至少一個(gè)硫醇基團(tuán)的生物分子反應(yīng)而形成的產(chǎn)物被稱作生物結(jié) 合物。因此在一種實(shí)施方案中，該生物結(jié)合物包含衍生自下面的結(jié)構(gòu)單元(i)包含至少一 個(gè)硫醇基團(tuán)的生物分子；和(ii)連接劑；其中該連接劑是通過這樣的方法來制備的，該方 法包含將包含疊氮基或者炔反應(yīng)性官能基團(tuán)的胺化合物與包含硫醇反應(yīng)性官能基團(tuán)的羧 酸或者活化的酯進(jìn)行反應(yīng)。在另外一種實(shí)施方案中，該生物結(jié)合物包含衍生自下面的結(jié)構(gòu) 單元(i)包含至少一個(gè)硫醇基團(tuán)的生物分子；和(ii)連接劑；其中該連接劑是通過這樣 的方法來制備的，該方法包含將包含硫醇反應(yīng)性官能基團(tuán)的胺化合物與包含疊氮基或者炔 反應(yīng)性官能基團(tuán)的羧酸或者活化的酯進(jìn)行反應(yīng)。在另一方面，該連接劑可以通過將包含硫 醇反應(yīng)性官能基團(tuán)的胺化合物與包含疊氮基或者炔反應(yīng)性官能基團(tuán)的羧酸或者活化的酯 化合物進(jìn)行反應(yīng)來制備。氟化生物結(jié)合物的方法此處所述的方法能夠制備氟標(biāo)記的生物結(jié)合物，更具體的是放射性氟(例如18F)標(biāo)記的生物結(jié)合物。這些方法的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是連接劑可以選擇性連接到生物分子例如在非放 射性條件下的生物分子上，其中該生物分子的硫醇基團(tuán)能夠選擇性地與連接劑的硫醇反應(yīng) 性官能基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)，并且所形成的生物結(jié)合物可以在與18F或者通常的氟取代的疊氮化 物或者炔進(jìn)行反應(yīng)之前進(jìn)行凈化。另外一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是該放射性氟標(biāo)記可以在最后的步驟中選 擇性地加入，這消除了在制備最終的生物結(jié)合物之前另外的凈化步驟所需的時(shí)間消耗，特 別是在痕量水平時(shí)。此處所述的用于將氟引入到生物結(jié)合物上的方法可以用來產(chǎn)生任何長(zhǎng)度的氟化 的生物結(jié)合物。因此，在一些實(shí)施方案中，該生物結(jié)合物的生物分子包含了至少50個(gè)氨基 酸殘基或者至少100個(gè)氨基酸殘基。在一方面，公開了一種用于將一個(gè)或多個(gè)氟原子引入到生物分子上的方法。該方 法可以包含(i)提供連接劑，該連接劑包括硫醇反應(yīng)性末端和疊氮基或者炔反應(yīng)性末端； (ii)將該連接劑的硫醇反應(yīng)性末端與包含至少一個(gè)硫醇基團(tuán)或者其反應(yīng)性衍生物的生物 分子進(jìn)行反應(yīng)；和(iii)隨后將該連接劑的疊氮基或者炔反應(yīng)性末端與氟取代的疊氮化物 或者炔基分別進(jìn)行反應(yīng)。在該用于將氟原子引入到生物分子例如多肽上的方法的一些實(shí)施方案中，連接劑 的硫醇反應(yīng)性末端選自馬來酰亞胺基團(tuán)，鹵代脂肪族基團(tuán)，鹵代芳香族基團(tuán)，鹵代脂環(huán)族基 團(tuán)，(鹵代乙?；?烷基基團(tuán)，(鹵代乙?；?環(huán)烷基基團(tuán)，(鹵代乙?；?芳族基團(tuán)，乙烯 基砜基團(tuán)，丙烯酰基團(tuán)，環(huán)氧基團(tuán)，氮丙啶基團(tuán)和能夠與硫醇基團(tuán)進(jìn)行硫醇交換反應(yīng)的二硫 化物基團(tuán)。更具體的，此處所述的方法能夠用于使用Mal-炔雙官能連接劑例如N- (丁 _3_炔 基)-3-(2，5-二氧-2，5-二氫-IH-吡咯-1-基)丙酰胺⑴作為連接劑，來將一個(gè)或多個(gè) 氟原子引入到生物分子上。這樣的方法包含(i)將N-(丁 -3-炔基)-3-(2, 5- 二氧-2， 5-二氫-IH-吡咯-1-基)丙酰胺(1)的硫醇反應(yīng)性基團(tuán)與包含至少一個(gè)硫醇基團(tuán)的生物分 子進(jìn)行反應(yīng)；和(ii)隨后將步驟(i)所形成的中間體產(chǎn)物的炔基團(tuán)與氟取代的疊氮化物進(jìn) 行反應(yīng)。在另外一種實(shí)施方案中，該方法可以用于使用Mal-疊氮化物雙官能連接劑例如化 合物(2)作為連接劑，來將一個(gè)或多個(gè)氟原子引入到生物分子上。這樣的方法包含(i)將 化合物(2)的硫醇反應(yīng)性官能基團(tuán)與包含至少一個(gè)硫醇基團(tuán)的生物分子進(jìn)行反應(yīng)；和(ii) 隨后將步驟(i)所形成的中間體產(chǎn)物的疊氮化物基團(tuán)與氟取代的炔進(jìn)行反應(yīng)。連接劑的疊氮基或者炔反應(yīng)性末端與氟取代的疊氮化物或者炔的反應(yīng)可以在任 何的介質(zhì)中進(jìn)行，該介質(zhì)可以處于適度的酸性到適度堿性條件的范圍內(nèi)。在一種實(shí)施方案 中，該反應(yīng)可以在PH為大約6-大約9的介質(zhì)中進(jìn)行；和在另外一種實(shí)施方案中，在PH為大 約7-大約8的介質(zhì)中進(jìn)行。反應(yīng)溫度可以從環(huán)境溫度到大約70°C變化。反應(yīng)時(shí)間可以變 化，但是通?？梢允谴蠹s10分鐘-大約60分鐘。在一些實(shí)施方案中，反應(yīng)時(shí)間是從大約10 分鐘-大約30分鐘變化的。但是，也可以使用更長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間。該反應(yīng)可以在Cu1或者其 前體，包括但不限于Cu°，Cu1或者Cu11鹽的存在下，在還原劑例如但不限于抗壞血酸鈉的存 在下進(jìn)行。反應(yīng)方案3和4表示了用于制備氟標(biāo)記的生物結(jié)合物(9)和(10)的可能的方 案。反應(yīng)方案3反應(yīng)方案4 在一種方案中，含有炔或者疊氮化物的連接劑的前體可以首先與包含硫醇基團(tuán)的 多肽進(jìn)行反應(yīng)，將所形成的中間體轉(zhuǎn)化來產(chǎn)生期望的生物結(jié)合物?？蛇x擇的，含有炔或者疊 氮化物的連接劑的前體可以首先轉(zhuǎn)化來產(chǎn)生連接劑，其然后可以與包含硫醇基團(tuán)的多肽反 應(yīng)來產(chǎn)生產(chǎn)物。使用上述的技術(shù)，可以將氟或者放射性氟原子例如18F引入到生物分子上當(dāng)氟取 代的疊氮化物或者炔與生物結(jié)合物反應(yīng)時(shí)，產(chǎn)生了氟取代的生物結(jié)合物。當(dāng)放射性氟取代 的疊氮化物或者炔與該生物結(jié)合物反應(yīng)時(shí)，產(chǎn)生了放射性氟標(biāo)記的生物結(jié)合物。合適的氟 取代的疊氮化物/炔非限定性的例子表示在結(jié)構(gòu)(11)_(14)中。
(11)前述的具有至少一個(gè)硫醇基團(tuán)的任何的生物分子例如多肽可以用來制備生物結(jié) 合物。具有至少一個(gè)硫醇基團(tuán)的生物分子例如多肽，媒介物，支架基蛋白質(zhì)和工程化的結(jié) 合蛋白質(zhì)是特別有價(jià)值的，因?yàn)檫@樣的材料具有潛在的有價(jià)值的診斷和治療價(jià)值。因此在 一種實(shí)施方案中，生物結(jié)合物可以通過將支架基蛋白質(zhì)例如親和體與Mal-炔雙官能連接 劑例如N-(丁-3-炔基)-3-(2，5-二氧-2，5-二氫-IH-吡咯-1-基)丙酰胺連接劑(1) 反應(yīng)來生產(chǎn)。在另外一種實(shí)施方案中，生物結(jié)合物可以通過將支架基蛋白質(zhì)例如親和體與 Mal-疊氮化物雙官能連接劑例如化合物(2)反應(yīng)來生產(chǎn)。此外，有價(jià)值的氟標(biāo)記的生物結(jié) 合物可以通過將生物結(jié)合物與氟取代的疊氮化物或者炔反應(yīng)來生產(chǎn)。該氟標(biāo)記的生物結(jié)合物在診斷應(yīng)用方面是有價(jià)值的材料。使用本領(lǐng)域已知的成像 技術(shù)例如諸如PET (正電子發(fā)射斷層照相術(shù))技術(shù)能夠顯現(xiàn)18F標(biāo)記的生物結(jié)合物。雖然在此僅僅說明和描述了本發(fā)明的某些特征，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠想到許 多的改進(jìn)和變化。因此，應(yīng)當(dāng)理解附加的權(quán)利要求的目的是覆蓋全部這樣的屬于本發(fā)明主 旨中的改進(jìn)和變化。實(shí)施例本發(fā)明的實(shí)踐從下面的實(shí)施例中將能夠更充分的理解，其在此提出僅僅是用于說 明的目的，并且絕對(duì)不應(yīng)當(dāng)解釋為對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例部分中所用的縮寫解釋如下“mg” 毫克；“mL” 毫升；“mg/mL” 毫克每毫 升；"mmol"毫摩爾；"μ L” 微升；"KDa"千道爾頓；“MALDI-MS，，基質(zhì)輔助激光解吸電離 質(zhì)譜；“HPLC”:高壓液相色譜；“LC-MS”液相色譜質(zhì)譜，“ESI-MS”電噴電離質(zhì)譜，“MALDI-T0F MS”基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜，“TFA”:三氟乙酸；“DMS0”二甲基亞砜；“DTT”: 二硫蘇糖醇；“MeCN”乙腈，“PBS”:磷酸緩沖鹽水，“Mai”:馬來酰亞胺；“ppm”每百萬份的份 數(shù)，"MWC0 截留分子量；“冷條件”沒有放射性同位素；和“放射性化學(xué)產(chǎn)率”初始存在的 活性的分?jǐn)?shù)。除非另有指示，否則全部的試劑級(jí)化學(xué)品是市購直接使用的，并且微孔過濾的 水被用于全部水溶液的制備中。
實(shí)施例1 :2-[18F]氟乙基疊氮化物(11)的制備 反應(yīng)方案5[18F]-氟化物是使用具有富集的[180]H20靶的19MeV質(zhì)子輻射的180(p，n)18F核反 應(yīng)，通過回旋加速器來生產(chǎn)的。在該輻射之后，將Kryptofix (5mg，13. 3μπι01)，碳酸鉀 (lmg,7. 2ymol)和MeCN(ImL)的混合物加入到該18F-水(ImL)中。將溶劑通過在氮?dú)馕锪?(lOOmL/min)下在80°C加熱而除去。然后，加入MeCN(0. 5mL)，并且在加熱和氮?dú)馕锪飨抡?發(fā)。將這個(gè)程序重復(fù)兩次。在冷卻到室溫之后，加入甲苯磺酸-2-疊氮基乙基酯(15)在無 水MeCN(0. 2mL)中的溶液。將該反應(yīng)混合物在80°C攪拌15min。在加入MeCN(0. 3mL)之后， 將2-[18F]氟乙基疊氮化物(11)在130°C在氮?dú)饬?15mL/min)下蒸餾到含有MeCN(0. ImL) 的捕集瓶中。收集該化合物(11)，并且衰減校正的放射化學(xué)產(chǎn)率是54% (關(guān)于18F-氟化 物)，蒸餾效率是63%。圖2表示了反應(yīng)混合物的HPLC分析結(jié)果，該混合物含有2_[18F]氟乙基疊氮化物 (11)(其使用梯度I，216nm的UV (a,放射性通道，在3 :51min的2-[18F]氟乙基疊氮化物 (11) ；b，UV通道))和蒸餾產(chǎn)物2-[18F]氟乙基疊氮化物(11) (c，放射性通道；d，UV通道)。
實(shí)施例2 濃度研究，顯示了在不同濃度的小基物時(shí)三唑的形成t
(11)
反應(yīng)方案6 在該濃度研究中，將炔模塊(16) (1. 2-0. Olmg, 7. 5-0. 25 μ mol)溶解在 DMF(50 μ L)中，并且在氮?dú)庀屡c硫酸銅(II) (25 μ 1,2. 8mg，ll. 25 μ mol)和抗壞血酸鈉 (25yL,7. 5mg,37.5ymol)的水溶液進(jìn)行混合。在加入[18F]2-氟乙基疊氮化物(11)/ MeCN(IOOyl)并且在室溫放置15min之后，將該混合物通過HPLC進(jìn)行分析。將所述的小瓶 隨后加熱(15min，80°C )和再次分析。所形成的三唑產(chǎn)物(17)是以定量的產(chǎn)率，在室溫用3. HmM(IOOyg)的最小炔模 塊(16)濃度來獲得的。當(dāng)將反應(yīng)混合物在80°C加熱時(shí)，對(duì)于一定量產(chǎn)率的所形成的三唑 (17)而言，最小的炔模塊(16)濃度是1. 57mM(50yg)。圖3表示了在不同的炔(16)濃度和溫度，使用模塊化合物(16)和2_[18F]氟乙基 疊氮化物(11)所形成的三唑產(chǎn)物(17)的放射化學(xué)產(chǎn)率的HPLC圖。實(shí)施例3 在肽上形成三唑[18F] (S) -6-氨基-2- (2- {(S) _2_ [2_ ((S) _6_ 氨基 _2_ {[4_ (2_ 氟乙基)-[1，2，3] 三唑-1-羰基]-氨基} _己?；被?-乙酰基氨基]-3-苯基-丙?；被鶀-乙?；?基)_己酸(19)的制備 反應(yīng)方案7在氮?dú)庀?，向五水硫酸銅(II) (4. 3mg，17ymol)/水(50 μ L)溶液中加入抗壞血 酸鈉(3.4mg，17ymol)/水(50 μ L)溶液。在室溫大約1分鐘之后，加入炔肽前體(18)的 溶液(2π^，3.4μπι01，在磷酸鈉緩沖液中，ρΗ6.0,0. 5Μ，50 μ L)，隨后加入2_[18F]氟乙基疊 氮化物(11) (24-32MBq)/MeCN(50yL)溶液。將該混合物在室溫保持15分鐘，并且用HPLC 流動(dòng)相A(水，0. 1% TFA) (0. 3mL)稀釋。將該標(biāo)記的肽(19)使用半制備HPLC(在216nm的 UV, Rt = 6 24)進(jìn)行分離。實(shí)施例4 :Mal-炔雙官能連接劑(1)的合成 反應(yīng)方案8Ν-[β-馬來酰亞胺丙氧基]琥珀酰亞胺酯(50mg，1. 25當(dāng)量)溶解在1. OmL的無 7jC DMF中。將3- 丁炔-1-胺鹽酸鹽(16mg，1. 0當(dāng)量)溶解在0. 5mL的無水二甲基甲酰胺 (DMF)和26μ L的二異丙乙基胺(DIEA)中。將該胺溶液逐滴加入到琥珀酰亞胺酯中，同時(shí) 將該酯溶液保持在冰浴中。將該混合物在0°C攪拌lOmin。將該溶液升溫到室溫，并且攪拌 ISh0真空蒸發(fā)溶劑，殘留物溶解到5mL的CH2Cl2中。用鹽水(3x5mL)萃取該有機(jī)溶液，并 且用MgSO4干燥。減壓下除去溶劑，將粗料使用快速色譜法(二氧化硅，MeOH/CH2Cl2)進(jìn)行 凈化。產(chǎn)物(1)是如下來脫脂凈化的將該樣品溶解到最小量的CH2Cl2 (大約2mL)中，隨 后用己烷清洗三次。產(chǎn)物(1)是作為絨毛狀白色固體而沉淀的。使用1H-NMR來表征產(chǎn)物。 產(chǎn)率8. 2mg(25% )。IH-WR(500MHz，CDCl3) δ 2. 02 (s, 1)，2· 41 (t, J = 5Ηζ，2)，2· 57 (t,J = 5Hz，2)，3. 42 (td, J = 5Hz,2) ,3. 88 (t, J = 5Hz)，5. 90 (bs, 1)，6. 73 (s，2)。實(shí)施例5 2-氟乙基三唑-馬來酰亞胺(參考化合物)(21)的制備 反應(yīng)方案9將磷酸鈉緩沖液(20μl,250mM, pH6. 0)，DMF(50 μ 1)和銅粉(lOOmg, 40 目， Aldrich Cat. No. 26，608-6)的混合物用氮?dú)?10ml/min)吹掃5分鐘。在加入2-氟乙基疊 氮化物(20) (10ymol)/DMF(9. 2μ 1，如 Glaser 和人rstad2007 中所述來制備)和 3-(N-馬 來酰亞胺基)-N-(3-炔丙基)丙酰胺(1) (2. Img, 9. 5 μ mol)/DMF (20 μ 1)溶液之后，將該容 器在室溫?cái)嚢?小時(shí)。減壓下除去溶劑(lmbar，8(TC)。通過制備HPLC凈化來得到氟乙基 三唑(21)化合物(1. 2mg,41% )。HR ESI-MS =C13H16N5O3F (計(jì)算值 m/z = 310. 1310，實(shí)測(cè)值 m/z = 310.1314)。通過制備HPLC的凈化(梯度在15min的5-80%溶劑B，其中A = H20/0. 1%TFA, B = MeCN/0. 1 % TFA,流速15mL/min ；柱=Luna 5 μ mC18 (2) (Phenomenex)，75x30mm,探測(cè) UV 216nm。實(shí)施例6 親和體炔基化和與Mal-炔雙官能連接劑的反應(yīng)
(MkDa)PBS,rt,2h.反應(yīng)方案10將抗-Her-2親和體，14kDa(lmg,作為凍干粉末)溶解在460 μ L的磷酸鹽緩沖鹽 水(PBS)。將該溶液的ρΗ保持在7. 4。向該溶液中加入40 μ L的二硫蘇糖醇(DTT)的0. 5Μ 的PBS溶液；將ρΗ保持在7. 4。將所形成的混合物在室溫?cái)嚢?h。將該還原的親和體通過 凝膠過濾進(jìn)行凈化。向該純凈部分的還原親和體中加入12 μ L等分部分的Mal-炔雙官能 連接劑溶液(1) (0. 15Μ的DMSO溶液)。將該反應(yīng)混合物在室溫培養(yǎng)2h，并且適度攪拌。將 反應(yīng)混合物使用凝膠過濾進(jìn)行凈化，隨后使用離心超濾(Amicon)，MWCO 5kDa(Millipore) 來獲得凈化的炔基化親和體(22)。使用(MALDI-TOF-MS)和HPLC，隨后使用LC(ESI)-MS來表征所形成的凈化的炔基 化的親和體(22)。產(chǎn)率(％ ) 78 ；MS (MH+計(jì)算值14260，實(shí)測(cè)值14260)。圖4表示炔基 化的親和體(22)的MALDI-TOFMS數(shù)據(jù)。用于炔基化的親和體(22)的HPLC分析的標(biāo)準(zhǔn)條件^fCiraceVydac Protein C4柱 用于 HPLC 分析。溶劑 A 100% H20,0. 1% TFA，溶劑 B 100% MeCN, 0. 1% TFA ；探測(cè):UV216 和280nm ；流速lmL/min。溶劑濃度隨著時(shí)間的變化表示在下表1中。
表1 用于炔基化的親和體(22)的典型洗提時(shí)間是大約11分鐘t實(shí)施例7 在冷卻條件下在生物結(jié)合物上形成三唑。
(24)
CuSO4,抗壞血酸納 ^ O65 0C, 0.75 h
W0.1 MNa2HPO4, pH 8反應(yīng)方案11使用疊氮基_PEG(23)來標(biāo)記炔基化的親和體(22)。向36 μ L的磷酸鈉水溶液 (100mM,pH8)中加入3 μ L等分部分的儲(chǔ)備炔基化的親和體(22)溶液(0. 6mM, 8mg/mL的 磷酸鹽緩沖鹽水溶液，PH7. 4)。向該溶液中加入1 μ L等分部分的剛剛制備的ISmM的11-疊 氮基-3，6，9-三氧(trioxa) i^一烷-1-胺(疊氮基-PEG)溶液(23)(在IOOmM磷酸鈉中 稀釋，PH8)。然后向該溶液中加入5 μ L等分部分的剛剛制備的10mM(2mg/mL)抗壞血酸鈉 溶液(在IOOmM的磷酸鈉中，pH8)。最后，將5 μ L等分部分的剛剛制備的10mM(l. 6mg/mL) 的硫酸銅(II)懸浮液(在IOOmM的磷酸鈉中，pH8)加入到該反應(yīng)混合物中。這些添加因 此產(chǎn)生了下面的試劑和基物的最終濃度炔基化的親和體(22) (36 μ M)，疊氮基PEG(23) (360 μ Μ)，抗壞血酸鈉(ImM)和 CuSO4 (ImM)。將所形成的溶液在65°C和適度攪拌下混合0. 75h。然后將該反應(yīng)混合物立即在 純水(MilliQ)中稀釋到4mL，并且使用Amicon離心超濾裝置MWCO 5kDa(Millipore)濃 縮到<100yL。將該水稀釋濃度次序重復(fù)進(jìn)行另外兩次，目的是除去多余的試劑。使用 MALDI-T0F-MS和高性能液相色譜，隨后使用LC(ESI)-MS來表征所形成的凈化的結(jié)合物 (24)。產(chǎn)率(％) :42o MS (MH+計(jì)算值14478，實(shí)測(cè)值14492)。實(shí)施例8 使用Cy5_標(biāo)記的疊氮基PEG (25a)來標(biāo)記炔基化的親和體(22) 反應(yīng)方案12向36 μ L的磷酸鈉水溶液(lOOmM，pH8)中加入3 μ L等分部分的儲(chǔ)備炔基化的親 和體(22)溶液(0. 6mM, 8mg/mL的磷酸鹽緩沖鹽水，pH7. 4)。接著加入1 μ L等分部分的 剛剛制備的18mM的Cy5-標(biāo)記的疊氮基-PEG溶液(25a)(在IOOmM磷酸鈉中稀釋，pH8)。然 后向該溶液中加入5 μ L等分部分的剛剛制備的10mM(2mg/mL)抗壞血酸鈉溶液(在IOOmM 的磷酸鈉中，PH8)。最后，將5μ L等分部分的剛剛制備的10mM(l. 6mg/mL)的硫酸銅(II)懸 浮液(在IOOmM的磷酸鈉中，pH8)加入到該反應(yīng)混合物中。這些添加產(chǎn)生了下面的試劑和 基物的最終濃度炔基化的親和體(22) (36 μ Μ)，Cy5-標(biāo)記的疊氮基-PEG(25a) (360 μ Μ)， 抗壞血酸鈉(ImM)和CuSO4(ImM)。將所形成的溶液在65°C和適度攪拌下混合0. 75小時(shí)。然后將該反應(yīng)混合物立即 在純水(MilliQ)中稀釋到4mL，并且使用Amicon離心超濾裝置MWCO 5kDa(Millipore)濃 縮到<100yL。將該水稀釋濃度次序重復(fù)進(jìn)行另外兩次，目的是除去多余的試劑。使用 HPLC和監(jiān)控染料熒光發(fā)射的SDS-PAGE蛋白質(zhì)凝膠來表征所形成的凈化的結(jié)合物(26)(圖 5)。實(shí)施例9 在熱條件下在炔基化的親和體(22)上形成三唑 反應(yīng)方案13用18F標(biāo)記抗-Her2親和體(22)。將硫酸銅(II)水溶液(5 μ L，0. 0249mg, 0. 1 μ mol)與抗壞血酸鈉(0. 198mg, 1 μ mol) / 磷酸鈉緩沖液(5 μ L，IOOmM, ρΗ8· 0)和 炔基化的親和體(22) (50 μ g，3. 57nmol) /PBS (5 μ L)進(jìn)行混合。在加入2-[18F]氟 乙基疊氮化物(11) (264 μ Ci, 9. 8MBq,如 Glaser，M.，和 Arstad，Ε. (2007)，“Click labeling"with2-[18F]fluoroethylazide for Positron Emission Tomography. Bioconj. Chem. 18,989-993所述來制備，其在此引入作為參考)/MeCN(20 μ 1)之后，將該混合物在 60°C加熱30min。用2-[18F]氟乙基疊氮化物(11)標(biāo)記，反應(yīng)混合物的HPLC分析顯示了用 親和體(27)共洗提的放射性峰UV信號(hào)。用制備HPLC凈化(梯度在15min內(nèi)5-80%溶劑B，其中A = H20/0. 1% TFA, B=MeCN/0. 1 % TFA,流速lmL/min ；柱=Luna 3 μ mC18 (2) (Phenomenex)，50x4. 6mm,探測(cè) UV280nm。圖1表示了非最佳的系統(tǒng)的反應(yīng)混合物的HPLC分析，其表示了 18F click標(biāo)記的 抗-Her2親和體(27) (a,放射性通道；b, 280nm UV通道)。 本發(fā)明可以體現(xiàn)為其他具體的形式，而不脫離其主旨或者基本特征。前述的實(shí)施 方案因此被認(rèn)為在全部的方面中是示例性的，而非對(duì)此處所述的本發(fā)明的限制。本發(fā)明的 范圍因此是通過附加的權(quán)利要求來表述的，而非通過前述的說明書來表述，并且因此目的 是將處于與該權(quán)利要求等價(jià)的含義和范圍內(nèi)的全部的變化包含在其中。
權(quán)利要求
一種將氟原子引入到生物分子上的方法，其包含(i)提供連接劑，該連接劑包括硫醇反應(yīng)性末端和疊氮基或者炔反應(yīng)性末端；(ii)將該連接劑的硫醇反應(yīng)性末端與包含至少一個(gè)硫醇基團(tuán)或者其反應(yīng)性衍生物的生物分子進(jìn)行反應(yīng)；和(iii)隨后將該連接劑的疊氮基或者炔反應(yīng)性末端與氟取代的疊氮化物或者炔基進(jìn)行反應(yīng)。
2.權(quán)利要求1的方法，其中該生物分子具有大于50個(gè)的氨基酸殘基。
3.權(quán)利要求1或者2的方法，其中該生物分子是親和體。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的方法，其中該硫醇反應(yīng)性末端選自馬來酰亞胺基團(tuán)，鹵代 脂肪族基團(tuán)，鹵代芳香族基團(tuán)，鹵代脂環(huán)族基團(tuán)，(鹵代乙酰基)烷基基團(tuán)，(鹵代乙酰基) 環(huán)烷基基團(tuán)，(鹵代乙?；?芳族基團(tuán)，乙烯基砜基團(tuán)，丙烯酰基團(tuán)，環(huán)氧基團(tuán)，氮丙啶基團(tuán)， 和能夠與硫醇基團(tuán)進(jìn)行硫醇交換反應(yīng)的二硫化物基團(tuán)。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的方法，其中該至少一個(gè)硫醇基團(tuán)包括半胱氨酸殘基或者含 有硫醇的非天然氨基酸。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的方法，其中該連接劑的硫醇反應(yīng)性末端是馬來酰亞胺基團(tuán)。
7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的方法，其中該生物分子的反應(yīng)性衍生物是用還原劑處理該 生物分子來產(chǎn)生的。中任一項(xiàng)的方法，其中該連接劑選自
8.權(quán)利要求1-7
9.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的方法，其中該連接劑是通過這樣一種方法來生產(chǎn)的，該方 法包含將胺化合物與羧酸或者活化的酯化合物進(jìn)行反應(yīng)，來形成該連接劑；其中該胺化合物包括疊氮基或者炔反應(yīng)性官能基團(tuán)，該羧酸或者該活化的酯化合物包括硫醇反應(yīng)性官能基團(tuán)。
10.權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的方法，其中該氟取代的疊氮化物或者炔包含18F取代的疊 氮化物或者炔或者19F取代的疊氮化物或者炔，優(yōu)選18F取代的疊氮化物或者炔。
11.一種將氟原子引入到生物分子上的方法，其包含(i)將Mal-炔雙官能連接劑的硫醇反應(yīng)性末端與包括至少一個(gè)硫醇基團(tuán)的生物分子 進(jìn)行反應(yīng)；和( )隨后將所述炔基與氟取代的疊氮化物基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)。
12.一種將氟原子引入到生物分子上的方法，其包含(i)將Mal-疊氮化物雙官能連接劑的硫醇反應(yīng)性末端與包括至少一個(gè)硫醇基團(tuán)的生 物分子進(jìn)行反應(yīng)；和( )隨后將所述疊氮化物基團(tuán)與氟取代的炔基進(jìn)行反應(yīng)。
13.權(quán)利要求11的方法，其中該氟取代的疊氮化物基團(tuán)包含18F取代的疊氮化物或者 19F取代的疊氮化物基團(tuán)，優(yōu)選18F取代的疊氮化物基團(tuán)。
14.權(quán)利要求12的方法，其中該氟取代的炔基包含18F取代的炔或者19F取代的炔基， 優(yōu)選18F取代的炔。
15.一種生物結(jié)合物，其包含衍生自下面的結(jié)構(gòu)單元 (i)包含至少一個(gè)硫醇基團(tuán)的生物分子；和( )連接劑；其中該連接劑是通過這樣一種方法來制備的，該方法包含將包含疊氮基或者炔反應(yīng)性 官能基團(tuán)的胺化合物與包含硫醇反應(yīng)性官能基團(tuán)的羧酸或者活化的酯進(jìn)行反應(yīng)。
16.權(quán)利要求15的生物結(jié)合物，其中該活化的酯包含結(jié)構(gòu)=L-M-COR2；其中L包含硫醇 反應(yīng)性官能基團(tuán)，或者其受保護(hù)的衍生物；M是二價(jià)連接單元；和R2是OH或者活化基團(tuán)。
17.權(quán)利要求15的生物結(jié)合物，其中該胺化合物包含結(jié)構(gòu)=G-J-R1；其中G是胺，J是二 價(jià)連接單元，和R1是疊氮基或者炔反應(yīng)性官能基團(tuán)。
18.權(quán)利要求15的生物結(jié)合物，其中該生物分子是親和體。
19.權(quán)利要求17的生物結(jié)合物，其中該連接單元是通過這樣一種方法來制備的，該方 法包括將包含疊氮基或者炔反應(yīng)性官能基團(tuán)的胺化合物與包含硫醇反應(yīng)性官能基團(tuán)的羧 酸或者活化的酯化合物進(jìn)行反應(yīng)。
20.一種連接劑復(fù)合物，其包含式L-M-CO-NH(R1)-J-G, 其中L是硫醇反應(yīng)性官能基團(tuán)；M和J是二價(jià)連接單元；R1是H、脂肪族基團(tuán)、芳香族基團(tuán)或者脂環(huán)族基團(tuán)；和 G是疊氮基或者炔反應(yīng)性官能基團(tuán)。
21.權(quán)利要求20的連接劑復(fù)合物，其中該連接劑選自
全文摘要
本文中提供了一種將氟原子引入到生物分子上的方法，其包含(i)提供連接劑，該連接劑包含硫醇反應(yīng)性末端和疊氮基/炔反應(yīng)性末端；(ii)將該連接劑的硫醇反應(yīng)性末端與包含至少一個(gè)硫醇基團(tuán)或者其反應(yīng)性衍生物的生物分子進(jìn)行反應(yīng)；和(iii)隨后將該連接劑的疊氮基/炔反應(yīng)性末端分別與氟取代的疊氮化物或者炔進(jìn)行反應(yīng)。還提供了用于合成雙官能連接劑和生物結(jié)合物以及包含氟標(biāo)記的生物分子的放射性診斷劑的復(fù)合物和方法。
文檔編號(hào)C07B59/00GK101903047SQ200880121657
公開日2010年12月1日 申請(qǐng)日期2008年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月20日
發(fā)明者E·W·科瓦奇, E·阿斯塔, F·A·休德, M·E·格拉澤, O·L·帕迪拉德耶穌 申請(qǐng)人:通用電氣公司;哈默史密斯網(wǎng)上成像有限公司