專利名稱：：具有冰結(jié)合活性的多肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種具有冰結(jié)合能力的新型多肽，其產(chǎn)生減少或抑制冰晶體形成和/或生長的活性。本發(fā)明還公開了這種多肽的生產(chǎn)和應(yīng)用方法。
背景技術(shù)：
：生活在極地水中的海洋真骨魚類的體溫與周圍海洋的溫度是平衡的，因此冬季或者比如在南極水中，其全年都處于接近-1.8°c的溫度。海洋真骨魚類的血液對(duì)海水是低滲透性的，其融點(diǎn)預(yù)計(jì)約為-0.7°C。因此極地真骨魚類過冷，并且在不適應(yīng)這種嚴(yán)酷的氣候條件的情況下，致命的凍結(jié)也在預(yù)料之中。類似的觀察報(bào)告也適用于各種適應(yīng)寒冷的陸生生物，包括節(jié)肢動(dòng)物、植物、真菌和細(xì)菌，不過這些生物中許多都能經(jīng)受比海洋魚類低得多的溫度。嗜冷(喜冷)生物已成功地適應(yīng)地球上所有永久性寒冷地區(qū)可以在深海、冰山頂以及甚至溫度低到-60°C的極低區(qū)發(fā)現(xiàn)它們。盡管有這些致命的條件，但這些生物克服了永久性寒冷環(huán)境固有的關(guān)鍵障礙。這些障礙包括酶活性降低，膜流動(dòng)性減小，營養(yǎng)素和廢物的運(yùn)輸改變，轉(zhuǎn)錄、翻譯和細(xì)胞分化的速率減小，多肽冷變性，不恰當(dāng)?shù)亩嚯恼郫B和細(xì)胞內(nèi)的冰形成。對(duì)某些生物在零下溫度下的生存機(jī)制的研究顯示，它們依賴于至少兩種策略通過抑制冰生長或通過產(chǎn)生受控制的冰晶體形成來降低水的冰點(diǎn)(依數(shù)性地通過低分子量物質(zhì)的合成和非依數(shù)性地通過特有多肽的合成)。人們認(rèn)為，抗凍多肽(AFP)和低分子量物質(zhì)，如多元醇、游離氨基酸和糖負(fù)責(zé)前面的過程，而冰核多肽(INP)負(fù)責(zé)后者。抗凍多肽(AFP，在一些出版物上也被稱作熱滯后多肽THP，或冰結(jié)構(gòu)多肽ISP)大大降低溶液的冰點(diǎn)，而預(yù)測(cè)的融點(diǎn)僅適度地降低。這意味著雖然冰點(diǎn)顯著降低，但溶液的融點(diǎn)可通過依數(shù)性的融點(diǎn)降低來預(yù)測(cè)，對(duì)于存在冰的溶液來說確實(shí)如此。關(guān)于抗凍多肽是否能夠降低無冰溶液的過冷點(diǎn)，這一問題很大程度上未得到解決。凍結(jié)溫度的偏移是有限的，并且快速的冰生長將在足夠低的溫度下發(fā)生。融化和凍結(jié)溫度的分隔通常稱作熱滯后(TH)(Knightetal.1991，RaymondandDeVries1977，Wilson1993)，冰生長的溫度稱作滯后冰點(diǎn)。融點(diǎn)和滯后冰點(diǎn)之間的差異稱作滯后作用或抗凍活性。AFP的第二個(gè)功能是處于凍結(jié)狀態(tài)時(shí)，它們顯示冰再結(jié)晶抑制作用(RI)。AFP在高于再結(jié)晶溫度的溫度下以小晶體作為代價(jià)抑制大晶體的形成(Knightetal.1984,1995，KnightandDuman1986，RamI0vetal.1996)。抑制冰形成的機(jī)制抗凍多肽抑制冰生長的機(jī)制仍然在調(diào)查研究中。AFP似乎都是兩性分子。這意味5著它們分子的一部分比其余部分更具疏水性。迄今為止，對(duì)于它們活性的解釋是它們親水性的一側(cè)與冰晶體結(jié)合。然而，這一觀點(diǎn)在過去十年已受到挑戰(zhàn)，因?yàn)楫?dāng)觀察冰/水時(shí)，人們會(huì)有充分的理由問根據(jù)定義哪個(gè)是最親水的-冰還是水。AFP經(jīng)由它們的疏水性一側(cè)/區(qū)域與水結(jié)合的多種證據(jù)正在顯現(xiàn)出來，但就目前所有證據(jù)來看，確切的結(jié)合機(jī)制仍是未知的。然而，最終在這點(diǎn)上的一致意見是，根據(jù)抗凍多肽的類型(以及同工型)，抗凍多肽識(shí)別并結(jié)合多種冰表面平面。在抗凍多肽結(jié)合的地方停止冰生長，但在抗凍分子之間一定程度上繼續(xù)冰生長(RaymondandDeVries1977，DeLucaetal.1998，Marshalletal.2004)。當(dāng)抗凍多肽分子之間的冰生長曲率變得足夠大(或彎曲)時(shí)，冰生長停止，因?yàn)閺澢砻娴谋砻鎻埩υ龃?稱為凱爾文效應(yīng)(AtkinsandDePaula2002，Wilson1994，2005，Kristiansen2005))。這時(shí)，對(duì)水分子來說，結(jié)合彎曲的冰表面在能量上是不利的。因此，滯后冰點(diǎn)是水分子與冰結(jié)合在能量上又變得有利并且冰生長繼續(xù)爆發(fā)性進(jìn)行時(shí)的溫度(Knightetal.1991，RaymondandDeVries1977，Wilsonl993)。在大多數(shù)魚抗凍溶液中，在滯后冰點(diǎn)時(shí)可看到針骨狀冰生長。據(jù)推測(cè)這是由于魚抗凍多肽與冰晶體上的棱柱平面結(jié)合，而不是與基面結(jié)合。在這種情況下，滯后冰點(diǎn)時(shí)的生長是由于水分子與基面的結(jié)合(附加)，此時(shí)在棱柱平面上的生長受到抑制，因此冰晶體像長矛(針骨狀)一樣生長。在含有來自昆蟲的抗凍多肽的溶液中，滯后冰點(diǎn)時(shí)的生長模式更為隨機(jī)，有人提出這是因?yàn)槔ハx抗凍多肽也與基平面結(jié)合(也產(chǎn)生從這些動(dòng)物的溶液中觀察到的高得多的抗凍活性)，因此一旦溫度足夠低(滯后冰點(diǎn))，生長就在冰晶體的任意面上發(fā)生。當(dāng)在昆蟲抗凍多肽的存在下于滯后冰點(diǎn)下發(fā)生冰生長時(shí)，冰生長模式是菜花狀，而不是針骨狀。因此熱滯后取決于至少兩個(gè)參數(shù)1)抗凍多肽的類型(取決于生物體、同工型)；和2)濃度，即便該濃度依賴性顯示飽和(DeVries1983，Kaoetal.1985，Schragetal.1982)。顯然，抗凍多肽分子的大小和觀察到的滯后量之間存在正相關(guān)性(Kaoetal.1985，Schragetal.1982，Wuetal.2001)。除了以上提到的確定抗凍效應(yīng)的參數(shù)以外，抗凍活性和冰晶體碎片之間為倒數(shù)關(guān)系(當(dāng)冰晶體處于滯后間隔內(nèi)時(shí))。這種效應(yīng)在昆蟲抗凍多肽中最明顯(Zachariassenetal.2002)。來自昆蟲的抗凍多肽在昆蟲中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了幾種AFP。這可能是因?yàn)槔ハx暴露的溫度比魚碰到的溫度低得多(海水的冰點(diǎn)約為_1.8°C)。迄今為止，解釋了三種昆蟲AFP的結(jié)構(gòu)大黃粉蟲(Tenebriomolitor)、云杉卷葉蛾(Choristoneurafumiferana)和加拿大擬步甲蟲(DendroidesCanadensis)。來自昆蟲的這三種特色AFP中的兩種(來自T.molitor和D.canadensis)有許多共有的結(jié)構(gòu)，可能是因?yàn)樗鼈兌紒碜约紫x，而C.fumiferana是蛾蟲。一種充分表征的昆蟲AFP的實(shí)例是來自甲蟲TenebriomoIitor的AFP。在非常相似的至少9種同工型中發(fā)現(xiàn)該多肽，長度為84，96至120個(gè)氨基酸(Liouetal.1999)。在所有9種已知的同工型中，發(fā)現(xiàn)了12個(gè)氨基酸的重復(fù)序列T/A-C-T-X-S-X-X-C-X-X-A-X。該序列在這些AFP中重復(fù)了6至9次。TmAFP是重復(fù)的氨基酸序列的右旋β螺旋結(jié)構(gòu)。平β層上的蘇氨酸殘基的高度規(guī)則排列被認(rèn)為是與水/冰相互作用，因?yàn)轭A(yù)測(cè)蘇氨酸殘基之間的距離恰好符合冰格結(jié)構(gòu)的水分子中氧原子的位置。該AFP有非常規(guī)則的結(jié)構(gòu)以及預(yù)測(cè)的高結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，是由大量半胱氨酸-半胱氨酸硫橋提供的；每隔六個(gè)氨基酸即為半胱氨酸。從D.canadensis分離出不同長度和重量(7.3-12.3kDa)的13種同工型(AndorferandDuman2000，Dumanetal.2002)。這些AFP中的重復(fù)序列與Τ.molitor中發(fā)現(xiàn)的相同，即便13種氨基酸有時(shí)出現(xiàn)在這些重復(fù)序列的某一些中(Duman1998,Lietal.1998a，1998b)。半胱氨酸恰好位于在T.molitor的AFP中的相同位置(Lietal.1998a,1998b)。來自C.fumiferana的AFP的氨基酸序列與其他兩種昆蟲的AFP氨基酸序列是非同源的。然而，每15個(gè)氨基酸就能發(fā)現(xiàn)序列T-X-T，唯獨(dú)最后的蘇氨酸保持不變；在很多情況下，第一個(gè)蘇氨酸被纈氨酸(V)、精氨酸(R)或異亮氨酸(I)取代。來自C.fumiferana的AFP還包含比其他兩種昆蟲AFP更少的半胱氨酸(Doucetetal.2000)。然而，半胱氨酸全部參與二硫化物結(jié)合(Gauthieretal.1998)。顯然，來自C.fumiferana的AFP包含一疏水核心，而且該多肽被網(wǎng)狀的氫鍵和二硫橋穩(wěn)定，它們同時(shí)穩(wěn)定了該結(jié)構(gòu)(Graetheretal.2000,2003，Leinalaetal.2002)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明一方面涉及抗凍多肽及其片段，包括由某些天?？?Cerambycid)樹皮甲蟲產(chǎn)生并且含有多個(gè)冰結(jié)合位點(diǎn)的抗凍多肽。以下更詳細(xì)描述的用于制備和使用這類多肽的方法也屬于本發(fā)明的范圍。天?？茦淦ぜ紫x松皮天牛(Rhagiuminquisitor)和密毛皮花天牛(Rhagiummordax)，二者在它們的成年和幼年期都能經(jīng)受低至-30°C的溫度，并仍然在斯堪的那維亞北部樹樁的樹皮下過冬。這兩個(gè)物種都屬于被稱作“逃避凍結(jié)者”的耐寒動(dòng)物的類別，意味著它們能在極低的溫度下生存，而在它們的組織中不形成冰。它們可以被視為能適應(yīng)超冷(或過冷)條件很長的時(shí)間。過冷狀態(tài)對(duì)Cerambycid樹皮甲蟲可能是致命的，因?yàn)楸纬稍瓌t上會(huì)在亞穩(wěn)態(tài)、超冷液體中出現(xiàn)，這是由于隨機(jī)的成核現(xiàn)象或者由周圍環(huán)境中的冰接種導(dǎo)致。Cerambycid樹皮甲蟲難能在這種冰形成中幸免于難。因此，R.inquisitor和R.mordax二者都適應(yīng)這種氣候條件，并且它們能夠在低溫下生存更長的時(shí)間。這使得Cerambycid樹皮甲蟲作為抗凍多肽(AFP)源特別引人注意。在R.inquisitor中，對(duì)低溫的適應(yīng)包括在血淋巴區(qū)域積累防冷凍的甘油，從體液中消除潛在的冰成核劑(產(chǎn)生更高可能性的超冷現(xiàn)象)，以及在冬季來臨前合成大量抗凍多肽。目前，在R.inquisitor中發(fā)現(xiàn)的抗凍多肽的抗凍活性(7°C)被視為已知的最高值。R.mordax幼蟲能夠在差不多像R.inquisitor一樣冷的溫度下生存-盡管積累的防冷凍化合物非常有限。根據(jù)目前優(yōu)選的一種假設(shè)，Rhagiummordax忍受低溫的能力幾乎可以完全歸因于冬季來臨前的一種或多種抗凍多肽(AFP)的合成與積累。意外地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的抗凍多肽具有比目前已知的其他昆蟲AFP明顯較少數(shù)量的半胱氨酸殘基。這個(gè)特征，與本發(fā)明的多肽具有比許多最新式昆蟲抗凍多肽更少的重復(fù)序列這一事實(shí)一起，使它們成為異源宿主生物體中更好的表達(dá)候選者。在目前優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗凍多肽及其顯示抗凍活性的功能片段，優(yōu)選地具有少于4個(gè)半胱氨酸殘基，例如少于3個(gè)半胱氨酸殘基，例如2個(gè)半胱氨酸殘基。正如以下清楚描述的那樣，本發(fā)明的抗凍多肽具有多種不同的用途和工業(yè)應(yīng)用領(lǐng)域。多肽或編碼該多肽的基因，可以以各種不同的方式用于抑制冰晶體生長。多肽可被直接引入，或者將它們作為基因引入，該基因在適宜的表達(dá)信號(hào)控制下在宿主細(xì)胞中表達(dá)以產(chǎn)生多肽。抗凍多肽的適宜濃度會(huì)根據(jù)用途而改變，但典型地是在約一億分之一份至約一千分之一份(即，約1μg/1至約lrng/1)。在本發(fā)明的一個(gè)方面，將多肽引入食用產(chǎn)品中，或使其與食用產(chǎn)品接觸，以便在例如冷凍條件下，在可食用產(chǎn)品的生產(chǎn)和/或儲(chǔ)存期間，減少或抑制冰晶體生長和/或形成。意外地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的多肽提供的冰結(jié)晶明顯不同于在其他已知的抗凍多肽存在下獲得的晶體。尤其發(fā)現(xiàn)，在本發(fā)明多肽的存在下，獲得了小的球形結(jié)構(gòu)的晶體，而已知的抗凍多肽，如US6，914，043中提到的抗凍蛋白III型HPLC12或US6，312，733中提到的冰晶體生長抑制劑，提供了針骨狀結(jié)構(gòu)的晶體。因此，本發(fā)明的一個(gè)主要的優(yōu)勢(shì)在于，當(dāng)本發(fā)明的多肽摻入比如冰淇淋時(shí)，可以獲得改進(jìn)的口感，因?yàn)樵谏a(chǎn)和儲(chǔ)存期間，冰淇淋中形成的晶體會(huì)有非常小的球形結(jié)構(gòu)，相比之下當(dāng)使用已知的上述III型抗凍多肽時(shí)，得到的是粗糙的針骨狀晶體。包括蔬菜在內(nèi)的冰凍食用產(chǎn)品的質(zhì)地、味道以及有用的保存期限，都可以因本發(fā)明多肽的作用而大大改善。例如，冰凍蔬菜，如芹菜、土豆、蘆筍、豌豆、胡蘿卜、豆類、西蘭花、甜玉米、菠菜等的質(zhì)地、味道和有用的保存期限都將得到改善。類似地，各種冰凍水果的質(zhì)地、味道和有用的保存期限也將被增強(qiáng)，包括草莓、藍(lán)莓、覆盆子、柑橘類水果、香蕉、葡萄、獼猴桃、桃子、菠蘿、李子、櫻桃、西紅柿和芒果。例如，引入到蔬菜和其他食用產(chǎn)品可通過將適當(dāng)?shù)亩嗪塑账嵋肽繕?biāo)生物的基因引入法來實(shí)現(xiàn)。多核苷酸的表達(dá)，無論組成性還是誘導(dǎo)性，在食品加工開始之前或在收獲和加工開始之后，都產(chǎn)生足夠高水平的本發(fā)明多肽，以有效地保護(hù)包括食品在內(nèi)的食用產(chǎn)品，比如按質(zhì)量計(jì)高達(dá)總植物多肽約0.1%。表達(dá)也可以建立在組織特異性基礎(chǔ)上。例如，與水果中的成熟基因連接可能產(chǎn)生表達(dá)，甚至是在從產(chǎn)品植物中收獲之后。在本發(fā)明的一個(gè)重要方面，多肽可添加到食品中，人們希望該食品直到消費(fèi)、甚至在消費(fèi)期間都保持凍結(jié)_尤其是以凍結(jié)或冷凍態(tài)消費(fèi)的食用產(chǎn)品。許多冷凍食品都是為了在凍結(jié)或冷凍態(tài)下消費(fèi)，例如冰淇淋、冷凍酸奶、冰牛奶、果子露、冰棍、冷凍奶油、冷凍奶油餡餅、冷凍布丁等。尤其是，大的冰晶體的形成貫穿整個(gè)凍融循環(huán)，使質(zhì)地和口味受到不利的影響，這發(fā)生在大多數(shù)家用無霜冰箱中或持續(xù)保存于冷凍態(tài)時(shí)。這種冰晶體生長過程可通過使用本發(fā)明的多肽來減少甚至完全防止，或者至少是盡可能地減少。本發(fā)明的抗凍多肽可摻入到整個(gè)食用產(chǎn)品，和/或比如它們可以選擇性地涂在食用產(chǎn)品的表面，這里是冷凝和冰晶體形成預(yù)計(jì)最容易發(fā)生的地方。本發(fā)明的另一個(gè)重要方面涉及含有編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸的酵母，包括面包酵母。涉及該方面的方法包括用編碼這些多肽的多核苷酸轉(zhuǎn)化面團(tuán)酵母的方法。當(dāng)該多核苷酸摻入酵母和表達(dá)，并且在冷凍面團(tuán)中使用這些酵母時(shí)，面團(tuán)一解凍就會(huì)自然發(fā)酵，因?yàn)榻湍干婺芰υ诮鈨鰰r(shí)會(huì)保持很高。因?yàn)樵谶@些抗凍多肽的存在下，保存期間積累的損害較少，還因?yàn)槿诨臉悠窌?huì)具有高活力的酵母細(xì)胞，所以冷凍態(tài)下有可能保存較長的時(shí)間，或者較小的面團(tuán)樣品都需要保存。將抗凍多肽摻入冷凍的、發(fā)酵的食用產(chǎn)品的一種替換方式是讓生物體負(fù)責(zé)發(fā)酵過程，在發(fā)酵食品時(shí)產(chǎn)生抗凍多肽。因此，本發(fā)明還包括制備冷凍發(fā)酵食用產(chǎn)品的方法。該方法包括步驟a)將食品與能夠分泌本發(fā)明多肽的微生物接觸，其中該微生物能夠使該食品發(fā)酵，以生產(chǎn)發(fā)酵食品，b)用微生物在發(fā)酵進(jìn)行的條件下培養(yǎng)該食品，以便生產(chǎn)含有本發(fā)明抗凍多肽的發(fā)酵食品，所述多肽存在的量有效地抑制冰晶體生長和/或形成；和c)在優(yōu)選低于_5°C的溫度下冷凍該發(fā)酵食品，以便生產(chǎn)冷凍發(fā)酵食品。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及將本發(fā)明的抗凍多肽引入指定要冷藏的生物細(xì)胞或其提取物中。例如，含有本發(fā)明抗凍多肽的細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、植物細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞具有增強(qiáng)的細(xì)胞或組織生存能力，最小限度地或沒有因?yàn)槔鋬鯻融化過程而失去固有特性。亞細(xì)胞樣品或細(xì)胞提取物可能對(duì)冷凍具有相似的敏感性，尤其是在長期保存時(shí)。典型的實(shí)例是體外多肽翻譯系統(tǒng)、酶制備、以及含有敏感性膜組分的特定樣品，如葉綠體或線粒體的膜制備。具體地，當(dāng)添加本發(fā)明的抗凍多肽時(shí)，包含細(xì)胞器的樣品就可顯示增強(qiáng)的抗凍害能力。當(dāng)在該多肽的存在下冷凍時(shí)，動(dòng)物軟組織顯示出較少的損害，并且當(dāng)冷凍和隨后解凍時(shí)，細(xì)胞完整性很重要或者是為了組織培養(yǎng)保藏所需要時(shí)，本發(fā)明多肽的添加對(duì)這些情況也是有利的。因此，指定要冷凍保存的樣本，如細(xì)胞或組織保藏，通常都可在其中加入本發(fā)明的多肽。生物細(xì)胞類型中通常保存的是細(xì)菌、真菌(包括酵母)、尤其是高等真核細(xì)胞(如雜交瘤株及組織培養(yǎng)細(xì)胞系)的基因變體。本發(fā)明另一方面涉及非專門針對(duì)食品領(lǐng)域的用途。目前，本發(fā)明多肽的一種非食品應(yīng)用是保護(hù)農(nóng)作物和植物免受嚴(yán)寒氣候條件的侵襲。本發(fā)明的抗凍多肽可通過表達(dá)引入的基因來內(nèi)部地?fù)饺爰?xì)胞質(zhì)中，或者該多肽可外部地涂在植物上_如通過噴涂或其他方式。因此外部應(yīng)用可通過將多肽直接涂在植物上或者通過外部沉積在分泌該多肽的植物上來實(shí)現(xiàn)。這些引入的相同替換方式也適用于其他用途。另一種實(shí)施方式是將抗凍多肽引入包圍器官、組織或其他生物樣本的液體中。一種具體的用途是為了移植手術(shù)或?yàn)榱吮４婺康霓D(zhuǎn)移到醫(yī)院期間。本發(fā)明的抗凍多肽目前可短期或長期保存在零下溫度下，從而使固有的代謝或消化減至最小，但冰晶體生長導(dǎo)致的細(xì)胞損傷顯著減少。其他醫(yī)學(xué)上重要的溫度敏感性生物樣品是血液和血液制品、治療藥物、多肽藥物、生物檢測(cè)試劑和疫苗。本發(fā)明還提供含有本發(fā)明多肽的化妝品或皮膚病制劑。本發(fā)明的多肽在化妝品或局部皮膚病制劑中的應(yīng)用可能提供有效的治療，還能預(yù)防因寒冷引起的皮膚的結(jié)構(gòu)性和細(xì)胞性損傷。伴隨明顯氣候或天氣引起的溫度下降，寒冷損傷通過失去細(xì)胞酶的最適溫度，導(dǎo)致細(xì)胞中或細(xì)胞外空間的細(xì)胞生理學(xué)發(fā)生變化，例如由寒冷、風(fēng)和/或紫外線，引起皮膚損傷、皮膚發(fā)紅或皮膚緊繃感以及感官敏感性增加、溫度敏感性皮膚，由環(huán)境壓力(由溫度變化和紫外線、吸煙、煙霧、活性氧簇、自由基)引起的皮膚、嘴唇、鼻子和口腔中的黏膜以及外皮附屬物的消極變化。本發(fā)明還包括組合物及用途，其基于本發(fā)明的抗凍多肽與本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的現(xiàn)有技術(shù)的穩(wěn)定劑、乳化劑和表面活性劑以及其他添加劑而成的混合物。這些化合物可用來抑制腐爛、抑制氧化、防止變色、抑制微生物生長、穩(wěn)定乳液等。從上述內(nèi)容可以明白，本發(fā)明一方面涉及能夠抑制和/或減少冰晶體形成的多肽，該冰晶體形成與物體或物質(zhì)(包括食用產(chǎn)品)的凍結(jié)或超冷現(xiàn)象相關(guān)。超冷條件是使物質(zhì)冷卻到通常發(fā)生狀態(tài)變化(即從水相變?yōu)楸?的溫度以下，而未出現(xiàn)狀態(tài)的變化。因此，液體冷卻到它的冰點(diǎn)以下而未發(fā)生凍結(jié)就構(gòu)成了超冷現(xiàn)象，并產(chǎn)生一種亞穩(wěn)態(tài)。本發(fā)明的多肽在整個(gè)說明書中可由抗凍多肽和簡稱的多肽互換表示。在一個(gè)方面，提供的一種選自SEQIDNO:1至SEQIDNO8的多肽。除非另有說明，注釋SEQIDNO:1至SEQIDNO:8、以及其他類似的表示一系列序列識(shí)別數(shù)字的起始數(shù)和結(jié)尾數(shù)的注解，用在本文中時(shí)都表示所述序列識(shí)別數(shù)中的每個(gè)或各個(gè)，例如以上引用的實(shí)例中，指序列識(shí)別數(shù)SEQIDN0:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO-J禾口SEQIDNO:8。包含SEQIDNO:1至SEQIDNO:8的多肽，或者由SEQIDNO:1至SEQIDNO8任一項(xiàng)組成的多肽或其具有抗凍活性的片段，或者與SEQIDNO1至SEQIDNO8任一項(xiàng)或其片段具有至少約75%同源性的變體，都屬于本發(fā)明的范圍。具體地，本發(fā)明還公開了一種包含或者由SEQIDNO:1至SEQIDNO8任一項(xiàng)組成的多肽的片段，其具有至少20個(gè)氨基酸和冰結(jié)合位點(diǎn)以及抗凍活性。該片段優(yōu)選地具有少于200個(gè)氨基酸，例如優(yōu)選地少于150個(gè)氨基酸，例如優(yōu)選地少于100個(gè)氨基酸，例如80個(gè)氨基酸，例如60個(gè)氨基酸。本發(fā)明還涉及包括本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)“冰結(jié)合位點(diǎn)”(IBS)的多肽，例如包含SEQIDNO9至SEQIDNO72的任意一個(gè)或多個(gè)的多肽-共64個(gè)特異性“冰結(jié)合位點(diǎn)”(IBS)，如圖3所示。本發(fā)明尤其涉及以下多肽一種多肽，含有選自SEQIDNO9至SEQIDNO:16的4個(gè)或多個(gè)序列，例如5個(gè)或更多序列，例如6個(gè)或更多序列，例如7個(gè)或所有序列。一種多肽，含有選自SEQIDN0:17至SEQIDNO或更多序列，例如6個(gè)或更多序列，例如7個(gè)或所有序列。一種多肽，含有選自SEQIDN0:25至SEQIDNO或更多序列，例如6個(gè)或更多序列，例如7個(gè)或所有序列。一種多肽，含有選自SEQIDN0:33至SEQIDNO或更多序列，例如6個(gè)或更多序列，例如7個(gè)或所有序列。一種多肽，含有選自SEQIDN0:41至SEQIDNO或更多序列，例如6個(gè)或更多序列，例如7個(gè)或所有序列。一種多肽，含有選自SEQIDN0:49至SEQIDNO或更多序列，例如6個(gè)或更多序列，例如7個(gè)或所有序列。一種多肽，含有選自SEQIDN0:57至SEQIDNO或更多序列，例如6個(gè)或更多序列，例如7個(gè)或所有序列。一種多肽，含有選自SEQIDN0:65至SEQIDNO或更多序列，例如6個(gè)或更多序列，例如7個(gè)或所有序列。本發(fā)明還提供含有SEQIDNO73至80的一個(gè)或多個(gè)序列的多肽，例如含有4個(gè)24的4個(gè)或多個(gè)序列，例如5個(gè)32的4個(gè)或多個(gè)序列，例如5個(gè)40的4個(gè)或多個(gè)序列，例如5個(gè)48的4個(gè)或多個(gè)序列，例如5個(gè)56的4個(gè)或多個(gè)序列，例如5個(gè)64的4個(gè)或多個(gè)序列，例如5個(gè)72的4個(gè)或多個(gè)序列，例如5個(gè)或多個(gè)序列，例如5個(gè)或更多序列，例如6個(gè)或更多序列，例如7個(gè)或SEQIDNO73至SEQIDNO80的所有序列-以保守的“冰結(jié)合域”(IBD)的形式。SEQIDNO:81至89涉及進(jìn)一步的保守域，其可在本發(fā)明的多肽中單個(gè)地或以任意組合存在。本發(fā)明還涉及通用冰結(jié)合域形式的SEQIDNO:90，其可在本發(fā)明的多肽中多次出現(xiàn)，例如2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、8次以上并優(yōu)選地小于30次。相同的序列可以多次出現(xiàn)，或者SEQIDNO:90的變種可以多次出現(xiàn)，如本文以下本發(fā)明的部分列舉項(xiàng)目中所述。下表1中列出了包含成對(duì)組合的冰結(jié)合域的多肽。列出共計(jì)64個(gè)不同組合-本文SEQIDN0:73至SEQIDNO:80公開的8個(gè)冰結(jié)合域(IBD)的任意各個(gè)或每個(gè)成對(duì)和獨(dú)立的組合形式。本發(fā)明還涉及一種多肽，其含有選自SEQIDNO73至SEQIDNO:80的4個(gè)或更多序列，例如5個(gè)或更多序列，例如6個(gè)或更多序列，例如7個(gè)或所有序列。另一方面，本發(fā)明提供了一種多肽，其含有序列SEQIDNO90的4個(gè)或更多個(gè)拷貝，例如5個(gè)或更多拷貝，例如6個(gè)或更多拷貝，例如7個(gè)或更多拷貝，例如8個(gè)或更多拷貝，并且優(yōu)選少于20個(gè)拷貝。如本文以上所述，本發(fā)明一方面涉及包含不同冰結(jié)合位點(diǎn)(IBD)的組合的多肽，所述組合包括任意組合的2個(gè)IBD的至少1種組合，例如至少2種組合，選自本文下方表1列出的64種成對(duì)冰結(jié)合域序列組合。所述多肽優(yōu)選地具有少于20個(gè)由SEQIDNO:90定義的通用冰結(jié)合域，例如少于15個(gè)通用冰結(jié)合域，例如少于12個(gè)通用冰結(jié)合域，例如少于10個(gè)通用冰結(jié)合域。^1IBDIIBDIIBDIIIIBDIVIBDVIBDVIIBDVIIIBDVIIIIBDIAlA2A3A4A5A6A7A8IBDIIBlB2B3B4B5B6B7B8IBDIIIClC2C3C4C5C6C7C8IBDIVDlD2D3D4D5D6D7D8IBDVElE2E3E4E5E6E7E8IBDVIFlF2F3F4F5F6F7F8IBDVIIGlG2G3G4G5G6G7G8IBDVIIIHlH2H3H4H5H6H7H8IBD冰結(jié)合域SEQIDNO:1至SEQIDNO:8的每個(gè)序列都包括一共8個(gè)IBD，在本文上表1中表示為I、II、III、IV、V、VI、VII和VIII。在表1中，IBDI代表SEQIDNO73，IBDII代表SEQIDNO74，IBDIII代表SEQIDNO75，IBDIV代表SEQIDNO76，IBDV代表SEQIDNO77，IBDVI代表SEQIDNO78，IBDVII代表SEQIDNO79，IBDVIII代表SEQIDNO80。本文上表1列出的矩陣中出現(xiàn)的各個(gè)獨(dú)立的字母/數(shù)字組合是相互交叉結(jié)合的，以產(chǎn)生本文下表2列出的組合。舉例說明，組合AlAl來源于兩個(gè)IBDI域與另兩個(gè)IBDI11域的組合，而組合B3A6來源于一個(gè)IBDII和一個(gè)IBDIII與一個(gè)IBDI和一個(gè)IBDVI的組合。由此所得的多肽包含以下多肽冰結(jié)合域IBDI、IBDII、IBDIII和IBDVI。因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供包含不同冰結(jié)合域(IBD)組合的多肽，所述組合包括至少1種組合，例如至少2種組合，例如任意4個(gè)IBD的組合中的3種組合，該4個(gè)IBD選自本文下表2顯示的任意4個(gè)冰結(jié)合域序列的4096種組合，所述多肽優(yōu)選地具有少于20個(gè)由SEQIDNO90限定的通用冰結(jié)合域，例如少于15個(gè)通用冰結(jié)合域，例如少于12個(gè)通用冰結(jié)合域，例如少于10個(gè)通用冰結(jié)合域。為了進(jìn)一步說明表2，組合來源于64X64矩陣，AlAl是兩個(gè)IBDI域與另兩個(gè)IBDI域的組合，而組合B3A6來源于一個(gè)IBDII和一個(gè)IBDIII域與一個(gè)IBDI和一個(gè)IBDVI域的組合。因此后者包含以下多肽域IBDI,IBDII,IBDIII和IBDVI。0083]表20084]AlAlA7A6B6A3C4A8D3A5E2A20085]A1A2A7A7B6A4C5A1D3A6E2A30086]A1A3A7A8B6A5C5A2D3A7E2A40087]A1A4A8A1B6A6C5A3D3A8E2A50088]A1A5A8A2B6A7C5A4D4A1E2A60089]A1A6A8A3B6A8C5A5D4A2E2A70090]A1A7A8A4B7A1C5A6D4A3E2A80091]A1A8A8A5B7A2C5A7D4A4E3A10092]A2A1A8A6B7A3C5A8D4A5E3A20093]A2A2A8A7B7A4C6A1D4A6E3A30094]A2A3A8A8B7A5C6A2D4A7E3A40095]A2A4BlAlB7A6C6A3D4A8E3A50096]A2A5B1A2B7A7C6A4D5A1E3A60097]A2A6B1A3B7A8C6A5D5A2E3A70098]A2A7B1A4B8A1C6A6D5A3E3A80099]A2A8B1A5B8A2C6A7D5A4E4A10100]A3A1B1A6B8A3C6A8D5A5E4A20101]A3A2B1A7B8A4C7A1D5A6E4A30102]A3A3B1A8B8A5C7A2D5A7E4A40103]A3A4B2A1B8A6C7A3D5A8E4A50104]A3A5B2A2B8A7C7A4D6A1E4A60105]A3A6B2A3B8A8C7A5D6A2E4A70106]A3A7B2A4ClAlC7A6D6A3E4A80107]A3A8B2A5C1A2C7A7D6A4E5A10108]A4A1B2A6C1A3C7A8D6A5E5A20109]A4A2B2A7C1A4C8A1D6A6E5A30110]A4A3B2A8C1A5C8A2D6A7E5A40111]A4A4B3A1C1A6C8A3D6A8E5A5A4A5B3A2C1A7C8A4D7A1E5A6A4A6B3A3C1A8C8A5D7A2E5A7A4A7B3A4C2A1C8A6D7A3E5A8A4A8B3A5C2A2C8A7D7A4E6A1A5A1B3A6C2A3C8A8D7A5E6A2A5A2B3A7C2A4DlAlD7A6E6A3A5A3B3A8C2A5D1A2D7A7E6A4A5A4B4A1C2A6D1A3D7A8E6A5A5A5B4A2C2A7D1A4D8A1E6A6A5A6B4A3C2A8D1A5D8A2E6A7A5A7B4A4C3A1D1A6D8A3E6A8A5A8B4A5C3A2D1A7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D6H3E4H2F2H1F7H8G5H7H3H6D6H4E4H3F2H2F8H1G5H8H3H7D6H5E4H4F2H3F8H2G6H1H3H8D6H6E4H5F2H4F8H3G6H2H4H1D6H7E4H6F2H5F8H4G6H3H4H2D6H8E4H7F2H6F8H5G6H4H4H3D7H1E4H8F2H7F8H6G6H5H4H4D7H2E5H1F2H8F8H7G6H6H4H5D7H3E5H2F3H1F8H8G6H7H4H6D7H4E5H3F3H2GlHlG6H8H4H7D7H5E5H4F3H3G1H2G7H1H4H8D7H6E5H5F3H4G1H3G7H2H5H1D7H7E5H6F3H5G1H4G7H3H5H2D7H8E5H7F3H6G1H5G7H4H5H328D8H1E5H8F3H7G1H6G7H5H5H4D8H2E6H1F3H8G1H7G7H6H5H5D8H3E6H2F4H1G1H8G7H7H5H6D8H4E6H3F4H2G2H1G7H8H5H7D8H5E6H4F4H3G2H2G8H1H5H8D8H6E6H5F4H4G2H3G8H2H6H1D8H7E6H6F4H5G2H4G8H3H6H2D8H8E6H7F4H6G2H5G8H4H6H3ElHlE6H8F4H7G2H6G8H5H6H4E1H2E7H1F4H8G2H7G8H6H6H5E1H3E7H2F5H1G2H8G8H7H6H6E1H4E7H3F5H2G3H1G8H8H6H7E1H5E7H4F5H3G3H2HlHlH6H8E1H6E7H5F5H4G3H3H1H2H7H1E1H7E7H6F5H5G3H4H1H3H7H2E1H8E7H7F5H6G3H5H1H4H7H3E2H1E7H8F5H7G3H6H1H5H7H4E2H2E8H1F5H8G3H7H1H6H7H5E2H3E8H2F6H1G3H8H1H7H7H6E2H4E8H3F6H2G4H1H1H8H7H7E2H5E8H4F6H3G4H2H2H1H7H8E2H6E8H5F6H4G4H3H2H2H8H1E2H7E8H6F6H5G4H4H2H3H8H2E2H8E8H7F6H6G4H5H2H4H8H3E3H1E8H8F6H7G4H6H2H5H8H4E3H2FlHlF6H8G4H7H2H6H8H5E3H3F1H2F7H1G4H8H2H7H8H6E3H4F1H3F7H2G5H1H2H8H8H7E3H5F1H4F7H3G5H2H3H1H8H8E3H6F1H5F7H4G5H3H3H2E3H7F1H6F7H5G5H4H3H3上述多肽可以進(jìn)一步含有選自SEQIDNO81至89的一個(gè)或多個(gè)序列。本發(fā)明還提供一種組合物，包含本文以上限定的多個(gè)相同或不同的多肽和生理學(xué)上可接受的載體。該組合物可以是干燥組合物，并且該干燥組合物可以是凍干形式或噴霧干燥形式。在進(jìn)一步方面，本發(fā)明涉及一種具有冰結(jié)合活性并且能夠減少或抑制冰晶體的生長和/或形成的多肽，其中所述多肽含有序列X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(SEQIDNO:90)，其中，&選自氨基酸殘基S、A、G和D；29父2選自氨基酸殘基A、V、I、T和S；X3選自非大體積氨基酸殘基；X4選自氨基酸殘基S、I、T和V;父5選自氨基酸殘基S、A、I和T；X6選自氨基酸殘基S、T和V；X7選自非大體積氨基酸殘基；X8選自氨基酸殘基S、T和V；X9選自氨基酸殘基S、A和G；并且其中SEQIDNO1的X2、X4、X6和X8中至少一個(gè)殘基是T或V；以及其中該多肽的氨基酸殘基的總數(shù)小于250。序列X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(SEQIDNO90)在本文中指通用“冰結(jié)合域”。所述域是直接參與冰結(jié)合還是僅間接地參與冰結(jié)合(即需要它來使多肽具有冰結(jié)合活性)對(duì)于該定義是不重要的。本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種多肽，其包含多個(gè)通用“冰結(jié)合域”，例如具有與SEQIDNO:90基本同源/一致的序列。在這方面，與SEQIDNO:90基本同源應(yīng)包括與SEQIDNO:90的序列相比，X1,X2,X3>X4>X5>X6、X7、X8和X9僅一個(gè)或最多兩個(gè)位置不同的任意序列。此處使用的多個(gè)應(yīng)該包括整數(shù)2、3、4、5、6、7、8、8、9，例如小于10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20，例如小于25，其中所述多個(gè)通用“冰結(jié)合域”中的任一個(gè)可以與SEQIDNO90相同或基本相同或基本同源。本發(fā)明還涉及本發(fā)明多肽的修飾物和衍生物，其含有SEQIDN0:90的一個(gè)或多個(gè)副本，并且可選擇地進(jìn)一步含有SEQIDNO:90的一個(gè)或多個(gè)拷貝或與其基本相同或基本同源的序列。術(shù)語“分離的多肽”表明本發(fā)明的多肽至少本質(zhì)上沒有受到與該多肽自然相關(guān)的細(xì)胞成分的污染。本發(fā)明的多肽可以表達(dá)為融合多肽。這種融合多肽可以發(fā)揮很多功能，例如輔助多肽在活性構(gòu)象中的純化和/或生產(chǎn)。融合多肽的一個(gè)實(shí)例是本發(fā)明的多肽與親和標(biāo)簽融合。融合多肽還可以形成本文定義的補(bǔ)體/抗補(bǔ)體對(duì)的一部分，但這個(gè)術(shù)語不是僅限于多肽。多肽的變化，如本文定義的剪接變體、等位基因變體、直系同源體和旁系同源體也屬于本發(fā)明的范圍。融合多肽的實(shí)例在下文將有更詳細(xì)的描述。本發(fā)明的多肽可以用可檢測(cè)的標(biāo)記物標(biāo)記，例如熒光檢測(cè)標(biāo)記。這可以幫助實(shí)踐者分離或鑒別本發(fā)明的多肽。本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸；多核苷酸構(gòu)建體，如含有所述核苷酸的線性或環(huán)形形式的載體；用所述多核苷酸或含有所述核苷酸的載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞；以及含有所述宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因生物。除非另有說明，多核苷酸可以與“核酸”和“核酸分子”相互交換使用。原則上，本發(fā)明可以使用這種多肽或該多肽的補(bǔ)體，例如cDNA或“反義寡核苷酸”的形式。所述多肽可以是個(gè)別核苷酸的簡并序列，只要該多核苷酸編碼本發(fā)明的多肽。該多核苷酸不需要包含從自然宿主生物中分離的天然基因的所有單個(gè)核苷酸。那些天然基因的任意截?cái)?，包括與天然基因有至少75%同源或相同的序列，例如至少80%同源或相同，例如至少85%同源或相同，例如至少90%同源或相同，例如至少91%同源或相同，例如至少92%同源或相同，例如至少93%同源或相同，例如至少94%同源或相同，例如至少95%同源或相同，例如至少96%同源或相同，例如至少97%同源或相同，例如至少98%同源或相同，例如至少99%同源或相同，例如至少99.5%同源或相同，都應(yīng)被本發(fā)明涵蓋。天然基因的任意此類功能性截?cái)啵ㄋ哪軌蛟谶m當(dāng)?shù)乃拗魃镏斜磉_(dá)的任意衍生或修飾，都應(yīng)表示“結(jié)構(gòu)基因”。例如，當(dāng)多核苷酸序列在克隆載體中克隆或者將表達(dá)載體引入宿主生物并表達(dá)時(shí)，就可以實(shí)現(xiàn)表達(dá)。表達(dá)適當(dāng)?shù)厥艿秸{(diào)控序列的指示，調(diào)控序列通常含有啟動(dòng)子，啟動(dòng)子可能又含有一些元件，例如核心啟動(dòng)子以及一個(gè)或多個(gè)調(diào)控元件，包括表達(dá)的增強(qiáng)子。宿主生物通常是重組宿主，S卩非天然地具有待表達(dá)的多核苷酸序列的宿主、或非天然地含有可操作地連接天然表達(dá)信號(hào)的待表達(dá)的多核苷酸序列的宿主。當(dāng)處于分泌信號(hào)序列之后時(shí)，本發(fā)明的多肽進(jìn)行分泌_不管這種分泌是否需要發(fā)生。為了清楚闡明，本發(fā)明的多肽將稱為“分離的”多肽，以便與天然環(huán)境中的相同或相關(guān)的多肽進(jìn)行區(qū)分。類似地，本文定義的術(shù)語“異源多核苷酸”表示一種多核苷酸或多核苷酸構(gòu)建體，其不同于本發(fā)明多肽的天然形式。本發(fā)明的多肽在染色體上可以是整合或游離的。本發(fā)明還提供特異性針對(duì)本發(fā)明多肽的抗體或其結(jié)合片段。該抗體可以通過任意現(xiàn)有方法來生產(chǎn)，并且該抗體可以是例如裸抗體、抗體的結(jié)合片段、抗體成分、抗獨(dú)特型抗體、嵌合抗體和人源化抗體。本發(fā)明的范圍內(nèi)還提供用于生產(chǎn)和使用a)本發(fā)明的多核苷酸、b)本發(fā)明的多肽、以及c)本發(fā)明的特異性針對(duì)所述多肽的抗體的方法。本發(fā)明的抗體可用于從大量多肽中識(shí)別或劃分本文定義的“目標(biāo)多肽”或“目標(biāo)肽”?！澳繕?biāo)肽”可以是本文定義的抗原肽。在進(jìn)一步方面，本發(fā)明提供含有本發(fā)明的多肽和/或抗體的固體載體，以及制備和使用這種固體載體的方法。附圖簡要說明圖1說明了R.InquisitorAFP的片段的氨基酸序列。推定的冰結(jié)合基序(motif)用黑框標(biāo)示。正向(F)和反向(R)引物都提供了序列，多肽的部分的來源也已標(biāo)示。該氨基酸序列具有代表或隱藏冰結(jié)合(IB)基序的域(一致的A/G-Q/R-G-T-A-T-T-T-A-T-G-X-A/G)，其重復(fù)X次并且被1-8個(gè)氨基酸殘基隔開。圖2說明R.mordaX.的AFPs1_8的全長cDNA序列。劃線的是推定的信號(hào)肽的編碼序列。與這些cDNA對(duì)應(yīng)的AFP(AFP1-8)主要在它們的N-端部分有差異，其中AFP4似乎沒有信號(hào)序列。這些AFP各自含有8個(gè)重復(fù)的氨基酸序列，核心一致的序列為T-A-T-T-T-A-T。這與R.inquisitor同樣觀察到的推定IB-基序部分相匹配(圖1)，并且可以設(shè)想這代表R.mordax的IB基序、或至少是它的一部分。圖3:Rhagiummordax的AFP1-8的全長氨基酸序列。這些序列分別表示為SEQIDNO:1至SEQIDNO:8。推定的信號(hào)序列用下劃線標(biāo)示，并且推定的冰結(jié)合基序用框標(biāo)示。圖4顯示具有克隆到表達(dá)載體pET26B(+)的全長cDNA的E.coli細(xì)胞。IPTG可以用來誘導(dǎo)相關(guān)的AFP的合成。起初我們?cè)贓.coli中誘導(dǎo)AFPl的合成。結(jié)果表明E.coli中產(chǎn)生的AFPl賦予了E.coli細(xì)胞耐凍能力。圖5說明野生型(wt)同工型RmAFPl和缺失變體(Δ2-9,WC(Trp-Cys))的SDS-PAGE凝膠。RmAFP變體構(gòu)建為RmAFPl(Δ2-Δ9)的C-端的冰結(jié)合域缺失，每次一個(gè)(例如Δ4表明推定的冰結(jié)合域4-9(見圖2)已經(jīng)缺失)，而在C-端(WC)含有Trp和Cys殘基的變體。將這些克隆到PGEX載體系統(tǒng)(GEHealthcare)并在Ε.coli(菌株0rigami，BL21)中轉(zhuǎn)化。蛋白質(zhì)被表達(dá)為谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)融合蛋白，其在GST與RmAFP之間含有凝血酶裂解位點(diǎn)。圖6顯示“冰生長-激增”的進(jìn)展，其在滯后冰點(diǎn)時(shí)出現(xiàn)在DRmAFPl的溶液中和2)粘魚類Zoarcesviviparous(帶有3型AFP的丹麥魚)的血清中。在這兩種情況下，在溫度降低前小的冰晶體可以在溶液中退火。當(dāng)降低RmAFP溶液的溫度時(shí)，最初的冰晶體(箭頭1A)在滯后冰點(diǎn)到達(dá)前沒有生長或改變形狀。在滯后冰點(diǎn)(IB)時(shí)，冰晶體爆發(fā)，并且溶液因超冷的環(huán)境而凍結(jié)。請(qǐng)注意，在這種情況下，滯后冰點(diǎn)下的冰生長模式是菜花狀(1B，1C)。這與冷卻時(shí)冰晶體緩慢變形并變?yōu)閹в辛腔?2A)的雙棱錐的情形(見2)(Z.viviparus血清)形成對(duì)比。在滯后冰點(diǎn)下，冰生長是針骨狀(2B)，并且所有的冰在溶液中以針骨狀生長(2C)。圖7顯示克隆和純化的RhagiummordaxAFPl的分子量測(cè)定。圖8顯示rRmAFPl的二聚化。A在原生條件下，rRmAFP表現(xiàn)為二聚體，因?yàn)楫?dāng)它通過體積排阻柱(Superdex75,10/30,GEHealthcare)時(shí)，它具有比其他相同Mw范圍的蛋白更短的保留時(shí)間。當(dāng)Superdex75用牛血清白蛋白(68KDa，BSA)、胰蛋白酶(25KDa)和人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C(13KDa)校準(zhǔn)時(shí)，從SEC評(píng)估rRmAFPl的Mw為28KDa。B類似地，RmAFP表現(xiàn)為二聚體，當(dāng)在跑SDSPAGE時(shí)得到預(yù)估的28KDa的Mw。第一泳道1牛血清白蛋白(BSA)；2胰蛋白酶；3=RNAseA；4半胱氨酸蛋白酶抑制劑C；5溶菌酶；6=RmAFPl；7谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)。圖9顯示本發(fā)明的多肽的圓二色光譜(⑶)。圖10顯示在溫度范圍6-100°C中RmAFPl的溫度穩(wěn)定性，接著在溫度范圍6_70°C進(jìn)行11次掃描。圖11顯示pH對(duì)RmAFPl的活性和穩(wěn)定性的影響。定義通過與冰晶體結(jié)合并抑制晶體生長，抗凍蛋白非依數(shù)性地降低了溶液的凍結(jié)溫度，但該蛋白僅通過依數(shù)性效應(yīng)改變?nèi)芤旱娜诨瘻囟?。這種熱滯后(凍結(jié)和融化溫度之間的差異)是通過觀察溫度對(duì)單冰晶體生長的影響來確定。當(dāng)冰晶體的面變成圓形時(shí)，發(fā)生融化；當(dāng)冰晶體沿著其C-軸伸長時(shí)，發(fā)生凍結(jié)。因此，術(shù)語“抗凍活性”指融化和凍結(jié)溫度之間的分隔。它也指融點(diǎn)和冰點(diǎn)之間的差異。它進(jìn)一步指在高于再結(jié)晶溫度的溫度下以小晶體為代價(jià)，抑制大晶體的形成。術(shù)語抗凍活性可以與熱滯后互換使用。本文使用的“核酸”或“核酸分子”指多核苷酸，例如脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)、寡核苷酸、通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)產(chǎn)生的片段、以及通過任意連接、裂解、核酸內(nèi)切酶作用和核酸外切酶作用產(chǎn)生的片段。多核苷酸分子可以由天然產(chǎn)生的核苷酸單體(例如DNA和RNA)、或天然產(chǎn)生的核苷酸的類似物(如天然產(chǎn)生的核苷酸的α-對(duì)映體形式)、或兩者的結(jié)合來構(gòu)成。修飾的核苷酸可以在糖基和/或嘧啶或嘌呤堿基基團(tuán)中變化。例如，糖修飾包括用鹵素、烷基、胺基和疊氮基取代一個(gè)或多個(gè)羥基，或者糖可以官能化為醚或酯、此外，整個(gè)糖基團(tuán)可以用空間位阻和電子上類似的結(jié)構(gòu)取代，如氮雜糖和碳環(huán)糖類似物。堿基基團(tuán)修飾的實(shí)例包括烷基化的嘌呤和嘧啶、?；泥堰屎袜奏?、或其他眾所周知的雜環(huán)取代。多核苷酸單體可以通過磷酸二酯鍵或這些鍵的類似物來連接。磷酸二酯連接的類似物包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸鹽(phosphoroselenoate)、phosphorodiselenoate、phosphoroaniIothioate>phosphoranilidate、氛基憐酸酉旨等。術(shù)語“核酸分子”還包括所謂的“肽多核苷酸”，其包含天然形成的或修飾的與聚酰胺骨架相連的多核苷酸基。多核苷酸可以是單鏈或雙鏈的。術(shù)語“多核苷酸分子的補(bǔ)體”指與參考核苷酸序列相比具有互補(bǔ)核苷酸序列并且反轉(zhuǎn)方向的多核苷酸分子。例如，序列5'ATGCACGGG3'與5'CCCGTGCAT3'互補(bǔ)。術(shù)語“簡并核苷酸序列”表示與編碼該多肽的參考多核苷酸分子相比，含有一個(gè)或多個(gè)簡并密碼子的核苷酸序列。簡并密碼子包含不同的核苷酸三連體，但編碼相同的氨基酸殘基(即GAU和GAC三連密碼子各自編碼Asp)。術(shù)語“結(jié)構(gòu)基因”指轉(zhuǎn)錄到信使RNA(mRNA)中的多核苷酸分子，然后被翻譯成特定多肽性質(zhì)的氨基酸序列。“分離的多核苷酸分子”是沒有被整合在生物基因組DNA中的多核苷酸分子。例如，編碼從細(xì)胞基因組DNA中分離出來的生長因子的DNA分子就是一種分離的DNA分子。分離的多核苷酸分子的另一個(gè)實(shí)例是未整合到生物的基因組中的化學(xué)合成的多核苷酸分子。從具體物種中分離的多核苷酸分子小于來自該物種的染色體的完整DNA分子?！昂怂岱肿訕?gòu)建體”是單鏈或雙鏈的多核苷酸分子，其通過人工干預(yù)進(jìn)行修飾，以便含有以自然界不存在的排列方式進(jìn)行組合和并列的多核苷酸的片段?！熬€性DNA”表示具有游離5'端和3'端的非環(huán)狀DNA分子。線性DNA可以由閉合的環(huán)狀DNA分子(例如質(zhì)粒)通過酶消化或物理中斷來制備?！盎パa(bǔ)DNA(cDNA)”是由mRNA模板通過逆轉(zhuǎn)錄酶形成的單鏈DNA分子。通常，采用與部分mRNA互補(bǔ)的引物來引發(fā)逆轉(zhuǎn)錄。本領(lǐng)域的技術(shù)人員也用術(shù)語“cDNA”表示由這種單鏈DNA分子與它的互補(bǔ)DNA鏈組成的雙鏈。術(shù)語“cDNA”還表示由RNA模板合成的cDNA分子的克隆體?！皢?dòng)子”是引導(dǎo)結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列。通常，啟動(dòng)子位于基因的5’非編碼區(qū)，接近結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。在轉(zhuǎn)錄起始中發(fā)揮作用的啟動(dòng)子中的序列元件通常特點(diǎn)是有一致的核苷酸序列。這些啟動(dòng)子元件包括RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)、TATA序列、CAAT序列、分化-特異性元件(DSE；McGeheeetal.，Mol.Endocrinol.7:551(1993))、環(huán)磷酸腺反應(yīng)元件(CRE)、血清反應(yīng)元件(SRE；Treisman,SeminarsinCancerBiol.1:47(1990))、糖皮質(zhì)激素反應(yīng)元件(GRE)、以及用于其他轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，如CRE/ATF(0'Reillyetal.，J.Biol.Chem.26719938(1992))、AP2(Yeetal.，J.Biol.Chem.26925728(1994))、SPUcAMP反應(yīng)元件結(jié)合多肽(CREB；Loeken,GeneExpr.3=253(1993))以及八聚體因子(總體見Watsonetal.,eds.,MolecularBiologyoftheGene,4thed.(TheBenjamin/CummingsPub1ishingCompany,Inc.1987)禾口LemaigreandRousseau,Biochem.J.3031(1994))。如果啟動(dòng)子是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，則作為對(duì)誘導(dǎo)劑的響應(yīng)，轉(zhuǎn)錄的速率增加。相反，如果啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子，則轉(zhuǎn)錄的速率不能通過誘導(dǎo)劑調(diào)控。阻抑型啟動(dòng)子也是已知的。“核心啟動(dòng)子”含有啟動(dòng)子功能(包括TATA盒和開始轉(zhuǎn)錄)的基本核苷酸序列。通過這個(gè)定義，在缺乏特定序列的情況下，核心啟動(dòng)子可能具有或不具有檢測(cè)活性，特定序列可增強(qiáng)該活性或賦予組織特異性活性?！罢{(diào)控元件”是調(diào)節(jié)核心啟動(dòng)子活性的核苷酸序列。例如，調(diào)控元件可包括與細(xì)胞因子結(jié)合的核苷酸序列，使轉(zhuǎn)錄能夠?qū)ｉT地或優(yōu)選地在特定的細(xì)胞、組織或細(xì)胞器中進(jìn)行。這些類型的調(diào)控元件通常與以“細(xì)胞_特異性”、“組織_特異性”或“細(xì)胞器_特異性”方式表達(dá)的基因有關(guān)?！霸鰪?qiáng)子”是一類可以增加轉(zhuǎn)錄效率的調(diào)控元件，不管增強(qiáng)子相對(duì)于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的距離或方向如何。“異源性DNA”指在給定的宿主細(xì)胞內(nèi)非天然存在的DNA分子、或DNA分子群。特定宿主細(xì)胞的異源性DNA分子可能含有來源于宿主細(xì)胞物種的DNA(即內(nèi)源性DNA)，只要宿主DNA與非宿主DNA(即外源性DNA)結(jié)合。例如，編碼多肽的非宿主DNA片段可操作地與含有轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子的宿主DNA片段連接，則含有該非宿主DNA片段的DNA分子視為異源性DNA分子。反過來說，異源性DNA分子可以含有與外源性啟動(dòng)子可操作地連接的外源性基因。再舉個(gè)例子，如果將DNA分子引入缺少野生型基因的突變細(xì)胞中，則含有源于野生型細(xì)胞的基因的DNA分子視為異源性DNA?！岸嚯摹笔莾?yōu)選地僅通過肽鍵連接的氨基酸殘基的聚合體，或天然產(chǎn)生或者合成產(chǎn)生。通過非宿主DNA分子的表達(dá)而產(chǎn)生的多肽是“異源性”肽或多肽?！鞍被釟埢笨梢允桥c肽鍵或不同于肽鍵的鍵相連的天然或非天然的氨基酸殘基。氨基酸殘基可以是D-構(gòu)型或L-構(gòu)型?！熬畚铩笔峭ㄟ^將幾個(gè)相似的多肽添加到一原始多肽中而組成的多肽，由此將相同多肽的多個(gè)拷貝形成為一個(gè)較大的多肽?！半s聚物”是通過將幾個(gè)不同的多肽添加到一原始多肽中而組成的多肽，由此將不同多肽的多個(gè)拷貝形成為一個(gè)較大的多肽?！胺谴篌w積氨基酸殘基”優(yōu)選地是天然氨基酸，不包括具有環(huán)狀(脂肪族或芳香族)側(cè)鏈的氨基酸，如Pro、Phe,Trp,Tyr和His，或者有長的或分支的脂肪族側(cè)鏈的氨基酸，如Arg、Lys,Leu、lie、Met和Val，或者更一般地說，大體積氨基酸具有至少含3個(gè)碳原子的側(cè)鏈，這些碳原子連接并形成分支或無分支的側(cè)鏈。目前“非大體積氨基酸”的優(yōu)選實(shí)例包括Gly、Ala和Ser?！氨景l(fā)明的多肽”是指本專利申請(qǐng)或在本專利申請(qǐng)權(quán)利要求基礎(chǔ)上的授權(quán)專利的權(quán)利要求中引用的任意多肽?！氨景l(fā)明的多核苷酸”或“本發(fā)明的核苷酸”是任意的編碼“本發(fā)明的多肽”的多核苷酸，該多肽包括本專利申請(qǐng)或在本專利申請(qǐng)權(quán)利要求基礎(chǔ)上的授權(quán)專利的權(quán)利要求中引用的任意多肽?！罢系倪z傳元件”是通過人工操作將元件引入宿主細(xì)胞后，摻入宿主細(xì)胞染色體中的DNA片段。在本發(fā)明中，整合的基因元件最常見的是來源于經(jīng)由電穿孔或其他技術(shù)引入細(xì)胞的線形質(zhì)粒。整合的遺傳元件從原始宿主細(xì)胞傳給它的后代?！翱寺≥d體”是一種在宿主細(xì)胞中具有自主復(fù)制能力的多核苷酸分子，例如質(zhì)粒、粘粒、或噬菌體?？寺≥d體通常包含一個(gè)或少數(shù)限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，其使多核苷酸分子以確定的方式插入，而不損失載體的重要生理功能；以及編碼標(biāo)記基因的核苷酸序列，該標(biāo)記基因適用于識(shí)別和篩選用該克隆載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。標(biāo)記基因通常包括提供四環(huán)素抗性或氨芐西林抗性的基因?！氨磉_(dá)載體”是編碼在宿主細(xì)胞中表達(dá)的基因的多核苷酸分子。通常，表達(dá)載體包括轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、基因和轉(zhuǎn)錄終止子。基因表達(dá)通常是位于控制啟動(dòng)子下游。所述基因被認(rèn)為是“可操作地連接到”該啟動(dòng)子。類似地，如果調(diào)控元件調(diào)節(jié)核心啟動(dòng)子的活性，則調(diào)控元件和核心啟動(dòng)子可操作地連接。“重組宿主”是含有異源性多核苷酸分子(如克隆載體或表達(dá)載體)的細(xì)胞?！罢系霓D(zhuǎn)化體”是重組的宿主細(xì)胞，其中異源性DNA已經(jīng)被整合到該細(xì)胞的基因組DNA中。“融合多肽”是由含有至少兩種基因的核苷酸序列的多核苷酸分子表達(dá)的雜交多肽。例如，融合多肽可以包括至少部分本發(fā)明的多肽與結(jié)合親和基質(zhì)的多肽相融合。這種融合多肽提供一種采用親和層析來分離大量本發(fā)明的多肽的手段。術(shù)語“分泌信號(hào)序列”表示編碼一種肽(“分泌肽”)的DNA序列，其作為更大多肽的一個(gè)組成部分，指導(dǎo)更大的多肽通過細(xì)胞中合成的分泌途徑。在運(yùn)輸穿過該分泌途徑期間，該更大的多肽常常被分切以除去分泌肽?！胺蛛x的多肽”是基本沒有受到細(xì)胞成分，例如碳水化合物、脂質(zhì)或其他與天然多肽有關(guān)的多肽類雜質(zhì)污染的多肽。通常，制備分離的多肽包括高純度形式的多肽，即至少約80%純度，至少約90%純度，至少約95%純度，大于95%純度，或大于99%純度。一種顯示特定多肽制劑含有分離的多肽的方式是多肽制劑的十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳以及凝膠的考馬斯亮藍(lán)染色中顯示單條帶。然而，術(shù)語“分離的”不排除相同多肽以替換的物理形式出現(xiàn)，例如二聚體或替代的糖基化或衍生化的形式。術(shù)語“氨基-末端”和“羧基-末端”在本文用于表示多肽中的位置。在上下文允許的情況下，這些術(shù)語是針對(duì)多肽的特定序列或部分使用，以表示接近或相對(duì)的位置。例如，位于多肽中參考序列羧基端的某一序列就是位于接近該參考序列的羧基端，但不一定是在整個(gè)多肽的羧基端。術(shù)語“表達(dá)”指基因產(chǎn)品的生物合成。例如，以結(jié)構(gòu)基因?yàn)槔?，表達(dá)包括將結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄到mRNA以及將mRNA翻譯成一個(gè)或多個(gè)多肽。術(shù)語“剪接變體”在本文中用來表示從一種基因轉(zhuǎn)錄的RNA的替換形式。通過使用轉(zhuǎn)錄的RNA分子內(nèi)的、或者較少見的是獨(dú)立轉(zhuǎn)錄的RNA分子之間的替換剪接位點(diǎn)，剪接變異自然地產(chǎn)生。剪接變體可編碼含有改變的氨基酸序列的多肽。術(shù)語剪接變體在本文中還用來表示由轉(zhuǎn)錄自一種基因的mRNA的剪接變體所編碼的多肽。術(shù)語“補(bǔ)體/抗補(bǔ)體對(duì)”表示在適當(dāng)條件下形成非共價(jià)連接的穩(wěn)定對(duì)的非同一的基團(tuán)。例如，生物素和親合素(或鏈親合素)是補(bǔ)體/抗補(bǔ)體對(duì)的原型成員。其他示范性的補(bǔ)體/抗補(bǔ)體對(duì)包括受體/配體對(duì)、抗體/抗原(或半抗原或表位)對(duì)、正義/反義多核苷酸對(duì)，等等。當(dāng)需要隨后分離補(bǔ)體/抗補(bǔ)體對(duì)時(shí)，該補(bǔ)體/抗補(bǔ)體對(duì)優(yōu)選地具有小于IO9M-1的結(jié)合親和度?！翱躬?dú)特型抗體”是與免疫球蛋白的可變區(qū)域相結(jié)合的抗體。在本說明書中，抗獨(dú)特型抗體與抗_抗體的可變區(qū)結(jié)合，因此，抗獨(dú)特型抗體類似于本發(fā)明多肽的表位。“抗體片段”是抗體的一部分，如F(ab')2、F(ab)2、Fab‘、Fab等。無論結(jié)構(gòu)如何，抗體片段與完整抗體識(shí)別的相同抗原相結(jié)合。例如，抗_(本發(fā)明多肽)單克隆抗體片段結(jié)合本發(fā)明多肽的表位。術(shù)語“抗體片段”還包括與特異性抗原結(jié)合的合成的或基因工程多肽，例如由輕鏈可變區(qū)組成的多肽，由輕鏈和重鏈的可變區(qū)、重組單鏈多肽分子組成的“Fv”片段，其中重鏈和輕鏈通過肽連接頭(“scFv多肽”)相連，以及由類似于高變區(qū)的氨基酸殘基組成的最小識(shí)別單位?！扒逗峡贵w”是一種重組多肽，其含有來自鼠抗體的可變域和互補(bǔ)決定區(qū)，而抗體分子的其余部分來自人抗體?！叭嗽椿贵w”是一種重組多肽，其中單克隆抗體的鼠互補(bǔ)決定區(qū)已經(jīng)從鼠免疫球蛋白的重鏈和輕鏈可變區(qū)轉(zhuǎn)移至人可變域?！皺z測(cè)標(biāo)記”是一種分子或原子，其可以與抗體基團(tuán)偶聯(lián)以產(chǎn)生對(duì)診斷有用的分子。檢測(cè)標(biāo)記的實(shí)例包括螯合劑、光活性劑、放射性同位素、熒光劑、順磁離子或其他標(biāo)記基團(tuán)。術(shù)語“親和標(biāo)簽”在本文中用于表示可以連接到第二多肽上的多肽片段，以為第二多肽的純化或檢測(cè)做好準(zhǔn)備，或者為第二多肽與底物的連接提供位點(diǎn)。原則上，抗體或其他特定結(jié)合劑可得的任意肽或多肽都可用作親和標(biāo)簽。親和標(biāo)簽包括聚組氨酸道、多IiA(Nilssonetal.，EMBOJ.41075(1985)；Nilssonetal.，MethodsEnzymol.1983(1991))、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(SmithandJohnson,Gene67:31(1988))、Glu_Glu親和標(biāo)簽(Grussenmeyeretal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:7952(1985))、P物質(zhì)、FLAG肽(Hoppetal.，Biotechnology61204(1988))、鏈親和素結(jié)合肽、或其他抗原表位或結(jié)合域?？傮w見Fordetal.,polypeptideExpressionandPurification2:95(1991)。編石馬親禾口標(biāo)簽的DNA可從商業(yè)供應(yīng)商獲得(如PharmaciaBiotech,Piscataway,N.J.)?！奥憧贵w”是一種與抗體片段形成對(duì)照的完整抗體，其不與治療劑偶聯(lián)。裸抗體包括多克隆和單克隆抗體，以及某些重組抗體，如嵌合抗體和人源化抗體。本文使用的術(shù)語“抗體成分”包括整個(gè)抗體和抗體片段。“目標(biāo)多肽”或“目標(biāo)肽”是包括至少一個(gè)表位并且在靶細(xì)胞(如腫瘤細(xì)胞)或攜帶傳染原抗原的細(xì)胞上表達(dá)的氨基酸序列。T細(xì)胞識(shí)別目標(biāo)多肽或目標(biāo)肽的主要組織相容性復(fù)合體分子提呈的表位，并通常溶解靶細(xì)胞或?qū)⑵渌庖呒?xì)胞吸收到靶細(xì)胞的位點(diǎn)，由此殺滅該靶細(xì)胞?！翱乖摹笔且环N肽，它與主要組織相容性復(fù)合體分子結(jié)合以形成由T細(xì)胞識(shí)別的MHC-肽復(fù)合物，從而在提呈給T細(xì)胞時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞應(yīng)答。因此，抗原肽能夠結(jié)合適宜的主要組織相容性復(fù)合體分子并誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答，例如針對(duì)靶細(xì)胞的細(xì)胞溶解或特定細(xì)胞因子釋放，該靶細(xì)胞結(jié)合或表達(dá)抗原。在I類或II類主要組織相容性復(fù)合體分子的背景下，抗原肽可以結(jié)合在抗原提呈細(xì)胞或靶細(xì)胞上。在真核生物中，RNA聚合酶II催化結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄以生成mRNA。多核苷酸分子可以設(shè)計(jì)為含有RNA聚合酶II模板，其中RNA轉(zhuǎn)錄具有與特定mRNA互補(bǔ)的序列。RNA轉(zhuǎn)錄稱作“反義RNA”，編碼該反義RNA的多核苷酸分子稱為“反義基因”。反義RNA分子能夠與mRNA分子結(jié)合，產(chǎn)生對(duì)mRNA翻譯的抑制。“特異性針對(duì)編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸的反義寡核苷酸”是指具有序列(a)能夠用編碼本發(fā)明多肽的部分基因形成穩(wěn)定的三重體，或(b)能夠用該基因的部分mRNA轉(zhuǎn)錄形成穩(wěn)定的二重體的寡核苷酸。術(shù)語“變異基因”指編碼多肽的多核苷酸分子，該多肽具有本發(fā)明多肽修飾后的氨基酸序列。這些變體包括本發(fā)明基因的自然發(fā)生的多形性，以及含有本發(fā)明多肽的氨基酸序列的保守氨基酸替換的合成基因。另外的基因變異形式是含有本文所述核苷酸序列的插入或缺失的多核苷酸分子。本發(fā)明的變異基因可以通過確定該基因在嚴(yán)格條件下是否與本發(fā)明多肽的核苷酸序列的多核苷酸分子、或其補(bǔ)體進(jìn)行雜交來鑒別。此外，變異基因可以通過序列比對(duì)來鑒別。如果對(duì)齊時(shí)兩個(gè)氨基酸序列的氨基酸殘基相同達(dá)到最大的一致性，則兩個(gè)氨基酸序列具有“100%氨基酸序列同一性”。類似地，如果對(duì)齊時(shí)兩個(gè)核苷酸序列的核苷酸殘基相同達(dá)到最大的一致性，則兩個(gè)核苷酸序列具有“100%核苷酸同一性”。序列比對(duì)可以通過標(biāo)準(zhǔn)軟件程序來完成，例如由DNASTAR(Madison，Wis.)生產(chǎn)的LASERGENE生物信息學(xué)計(jì)算套件中包含的那種程序。其他的通過確定最佳比對(duì)來比較兩個(gè)核苷酸或氨基酸序列的方法也是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(例如，見PeruskiandPeruski,TheInternetandtheNewBiology:ToolsforGenomicandMolecularResearch(ASMPress,Inc.1997),Wuetal.(eds.),"InformationSuperhighwayandComputerDatabasesofpolynucleotidesandpolypeptides,"MethodsinGeneBiotechnology,pages123-151(CRCPress,Inc.1997),Bishop(ed·),GuidetoHumanGenomeComputing,2ndEdition(AcademicPress,Inc.1998))。以下描述確定序列同一性的具體方法。與識(shí)別變異基因的具體方法無關(guān)，變異基因編碼一種多肽，該多肽的特征在于它能夠與抗_(本發(fā)明的多肽)抗體特異性地結(jié)合。術(shù)語“等位變體”在本文用于表示占據(jù)相同染色體位點(diǎn)的基因的任意兩種或多種替換形式。等位變體通過突變自然地產(chǎn)生，并且可導(dǎo)致種群內(nèi)的表型多態(tài)形?；蛲蛔兛梢允浅聊?編碼的多肽沒發(fā)生變化)，或可能編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。術(shù)語等位變體在本文中也用于表示由基因的等位變體編碼的多肽。術(shù)語“直系同源體”表示一種多肽或來自一種物種的多肽，其功能性對(duì)應(yīng)于一種多肽或來自不同物種的多肽。直系同源體之間的序列差異是物種形成的結(jié)果。“旁系同源體”是由生物體制得的明顯不同的、但結(jié)構(gòu)上有關(guān)的多肽。旁系同源體被認(rèn)為是通過基因復(fù)制產(chǎn)生。例如，α-球蛋白、β-球蛋白和肌紅蛋白互為旁系同源體。由于標(biāo)準(zhǔn)分析方法的不精確性，聚合體的分子量和長度理解為近似值。當(dāng)這些值表述為“約”X或“近似”X時(shí)，所稱的X值應(yīng)理解為精確到+/-20%，例如+/-10%，例如+/-5%ο發(fā)明詳細(xì)說明本發(fā)明在一種實(shí)施方式中提供分離的多肽，該多肽含有或者其組成為選自SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO7和SEQIDNO:8的氨基酸殘基序列，或者與所述序列任一項(xiàng)有至少75%同一性的序列，其中所述多肽能夠減少或抑制冰晶體的形成和/或生長，或其片段能夠減少或抑制冰晶體的形成和/或生長。本發(fā)明還提供一種含有編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列的分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸可以進(jìn)一步含有表達(dá)信號(hào)，該表達(dá)信號(hào)能夠在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中指導(dǎo)編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列的表達(dá)。本發(fā)明還提供一種含有本發(fā)明的多核苷酸的載體，該多核苷酸能夠表達(dá)本發(fā)明的多肽。一種分離的重組細(xì)胞，可以含有本發(fā)明的多核苷酸或本發(fā)明的載體或本發(fā)明的多肽。本發(fā)明還提供一種含有本發(fā)明的多肽的食用產(chǎn)品，其中該食用產(chǎn)品可以是凍結(jié)的，或者是冷凍甜食產(chǎn)品的形式，例如冰淇淋產(chǎn)品、或面包。本發(fā)明提供的非食品應(yīng)用的實(shí)例是含有本發(fā)明的多肽的固體載體材料。本發(fā)明還涉及制備或使用本發(fā)明的多肽的方法，在一種實(shí)施方式中包括生產(chǎn)本發(fā)明的多肽的方法，所述方法包括步驟i)提供本發(fā)明的多核苷酸或本發(fā)明的載體，ii)通過步驟i)中提供的多核苷酸的重組表達(dá)，提供適用于生產(chǎn)本發(fā)明的多肽的宿主細(xì)胞，iii)生產(chǎn)本發(fā)明的多肽，以及可選地iv)純化和/或分離所述多肽。當(dāng)原位生產(chǎn)本發(fā)明的多肽時(shí)，本發(fā)明提供一種方法，包括步驟i)提供可發(fā)酵的起始原料，ii)提供微生物，其能夠使所述可發(fā)酵的食品起始原料發(fā)酵，并且發(fā)酵所述可發(fā)酵的食品起始原料時(shí)能夠在適宜條件下產(chǎn)生本發(fā)明的多肽，iii)在所述微生物的存在下發(fā)酵所述食品起始原料，由此產(chǎn)生發(fā)酵的食用產(chǎn)品，其中所述發(fā)酵的食用產(chǎn)品含有本發(fā)明的多肽。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供以下方法一種減少或抑制冷凍食用產(chǎn)品中冰晶體形成的方法，所述方法包括步驟i)提供冷凍的食用產(chǎn)品，或生產(chǎn)該產(chǎn)品所需要的一種或多種成分，和ii)視情況而定，在生產(chǎn)該產(chǎn)品之前、之后或生產(chǎn)期間，使所述產(chǎn)品和/或所述成分與本發(fā)明的多肽接觸，由此減少或抑制該冷凍食用產(chǎn)品中的冰晶體形成。一種減少或抑制冷凍食用產(chǎn)品中冰晶體生長的方法，所述方法包括步驟i)提供冷凍的食用產(chǎn)品，或生產(chǎn)該產(chǎn)品所需要的一種或多種成分，和ii)視情況而定，在生產(chǎn)該產(chǎn)品之前、之后或生產(chǎn)期間，使所述產(chǎn)品和/或所述成分與本發(fā)明的多肽接觸，由此減少或抑制該冷凍食用產(chǎn)品中的冰晶體生長。一種在冷凍食用產(chǎn)品中構(gòu)建冰晶體的方法，所述方法包括步驟i)提供冷凍的食用產(chǎn)品，或生產(chǎn)該產(chǎn)品所需要的一種或多種成分，和ii)視情況而定，在生產(chǎn)該產(chǎn)品之前、之后或生產(chǎn)期間，使所述產(chǎn)品和/或所述成分與本發(fā)明的多肽接觸，由此在該冷凍食用產(chǎn)品中構(gòu)建冰晶體。38一種調(diào)節(jié)冷凍食用產(chǎn)品的質(zhì)地或感官性質(zhì)的方法，所述方法包括步驟i)提供冷凍的食用產(chǎn)品，或生產(chǎn)該產(chǎn)品所需要的一種或多種成分，和ii)視情況而定，在生產(chǎn)該產(chǎn)品之前、之后或生產(chǎn)期間，使所述產(chǎn)品和/或所述成分與本發(fā)明的多肽接觸，由此調(diào)節(jié)冷凍食用產(chǎn)品的質(zhì)地或感官性質(zhì)。一種監(jiān)測(cè)冷凍食用產(chǎn)品的生產(chǎn)或儲(chǔ)存期間的冰晶體形成的方法，所述方法包括步驟i)提供冷凍的食用產(chǎn)品，或生產(chǎn)該產(chǎn)品所需要的一種或多種成分，和ii)視情況而定，在生產(chǎn)該產(chǎn)品之前、之后或生產(chǎn)期間，使所述產(chǎn)品和/或所述成分與本發(fā)明的多肽接觸，iii)監(jiān)測(cè)該冷凍食用產(chǎn)品的生產(chǎn)或儲(chǔ)存期間的不同時(shí)間點(diǎn)的冰晶體形成。一種在雌性個(gè)體中進(jìn)行體外受精(IVF)處理的方法，所述方法包括步驟從雌性個(gè)體中移取一個(gè)或多個(gè)卵細(xì)胞，可選擇地連同包含卵泡液的生物樣本一起移取；在本發(fā)明多肽的存在下，冷凍該一個(gè)或多個(gè)卵細(xì)胞，可選擇地連同生物樣本一起冷凍；使一個(gè)或多個(gè)移取的卵細(xì)胞在體外受精；以及將一個(gè)或多個(gè)受精的卵細(xì)胞植入該雌性個(gè)體中。一種增加雌性個(gè)體懷孕的可能性或幾率的方法，所述方法包括步驟從雌性個(gè)體中移取一個(gè)或多個(gè)卵細(xì)胞，可選擇地連同含有卵泡液的生物樣本一起移??；在本發(fā)明多肽的存在下，冷凍該一個(gè)或多個(gè)卵細(xì)胞，可選擇地連同該生物樣本一起冷凍；使一個(gè)或多個(gè)移取的卵細(xì)胞在體外受精；以及將一個(gè)或多個(gè)受精的卵細(xì)胞植入該雌性個(gè)體中，其中在本發(fā)明多肽的存在下冷凍該一個(gè)或多個(gè)卵細(xì)胞減少了冰晶體在卵細(xì)胞上或者卵細(xì)胞存在的環(huán)境中的生長和/或形成，從而增加懷孕的可能性或機(jī)率。該樣本可以進(jìn)一步包含顆粒黃體細(xì)胞或卵泡細(xì)胞，并且可選擇地還有其他來自雌性個(gè)體卵巢的卵巢細(xì)胞。在一種實(shí)施方式中，該樣本進(jìn)一步包含來自卵細(xì)胞環(huán)境的冷凍細(xì)胞。本發(fā)明在進(jìn)一步實(shí)施方式中涉及一種多肽，其具有冰結(jié)合活性并且含有序列X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(SEQIDNO:90)的一個(gè)或多個(gè)拷貝，例如通用冰結(jié)合域SEQIDNO90的2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)單獨(dú)選擇的拷貝，其中Xl選自氨基酸殘基S、A、G和D；父2選自氨基酸殘基A、V、I、T和S；X3選自非大體積氨基酸殘基；X4選自氨基酸殘基S、I、T和V;父5選自氨基酸殘基S、A、I和T；X6選自氨基酸殘基S、T和V；X7選自非大體積氨基酸殘基；X8選自氨基酸殘基S、T和V；X9選自氨基酸殘基S、A和G；并且其中SEQIDNO:90的殘基X2、X4、X6和X8中至少一個(gè)是T或V；禾口其中該多肽的氨基酸殘基的最大數(shù)目小于1000。本發(fā)明多肽的氨基酸殘基的最大數(shù)目優(yōu)選小于500，例如小于400，例如小于300，例如小于250，例如小于240，例如小于230，例如小于220，例如小于210，例如小于200，例如小于190，例如小于180，例如小于150，例如小于140，例如小于130，例如小于120，例如小于110，例如小于100，例如小于95，例如小于90，例如小于85，例如小于80，例如小于75，例如小于70，例如小于65，例如小于60，例如小于55，例如小于50，例如小于45，例如小于40，例如小于30，例如小于20，例如小于15。在與上述列舉的限制大小的多肽進(jìn)行功能性偶聯(lián)中，本發(fā)明多肽的氨基酸殘基的最小數(shù)目可以是10或更多，例如12或更多，例如14或更多，例如16或更多，例如18或更多，例如20或更多，例如22或更多，例如24或更多，例如26或更多，例如28或更多，例如30或更多，例如32或更多，例如34或更多，例如36或更多，例如38或更多，例如40或更多，例如42或更多，例如44或更多，例如46或更多，例如48或更多，例如50或更多，例如55或更多，例如60或更多，例如65或更多，例如70或更多，例如75或更多，例如80或更多，例如85或更多，例如90或更多，例如95或更多，例如100或更多，其中任意最大數(shù)或最小數(shù)是成對(duì)的，最大數(shù)目大于最小數(shù)目。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的多肽包含多個(gè)通用冰結(jié)合域，每個(gè)都含有序列SEQIDNO90或如本文其他地方所述的其變體或衍生物或修飾物，并且優(yōu)選地最多具有250個(gè)氨基酸殘基。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種包含第二序列的多肽序列，該序列是SEQIDNO:90的另外的獨(dú)立選擇的拷貝的形式，其中SEQIDNO:90的另外的拷貝與SEQIDNO:90的第一拷貝不重疊。本發(fā)明在另一種實(shí)施方式中涉及一種另外含有SEQIDN0:90的第三拷貝的多肽(即該多肽含有SEQIDNO:90的三個(gè)獨(dú)立選擇的拷貝)，并且在進(jìn)一步實(shí)施方式中，該多肽另外含有SEQIDNO90的第四拷貝(即該多肽包含SEQIDNO90的三個(gè)獨(dú)立選擇的拷貝)。SEQIDNO:90的獨(dú)立選擇的拷貝可以是相同或不同的，正如本文其他地方所述。SEQIDNO90的拷貝相互可以以任意序列存在，并且任意兩個(gè)序列可以被至少2個(gè)氨基酸殘基隔開，例如至少3個(gè)氨基酸殘基，例如至少4個(gè)氨基酸殘基，例如至少5個(gè)氨基酸殘基，例如至少6個(gè)氨基酸殘基，例如至少7個(gè)氨基酸殘基，例如至少8個(gè)氨基酸殘基，例如至少9個(gè)氨基酸殘基，例如至少10個(gè)氨基酸殘基，例如至少11個(gè)氨基酸殘基，例如至少12個(gè)氨基酸殘基，例如至少13個(gè)氨基酸殘基，例如至少14個(gè)氨基酸殘基，例如至少15個(gè)氨基酸殘基，例如至少16個(gè)氨基酸殘基，例如至少17個(gè)氨基酸殘基，例如至少18個(gè)氨基酸殘基，例如至少19個(gè)氨基酸殘基，例如至少20個(gè)氨基酸殘基，例如至少21個(gè)氨基酸殘基，例如至少22個(gè)氨基酸殘基，例如至少23個(gè)氨基酸殘基，例如至少24個(gè)氨基酸殘基，例如至少25個(gè)氨基酸殘基，例如至少26個(gè)氨基酸殘基，例如至少27個(gè)氨基酸殘基，例如至少28個(gè)氨基酸殘基，例如至少29個(gè)氨基酸殘基，例如至少30個(gè)氨基酸殘基。本發(fā)明的多肽可以與載體連接，例如固體載體或半固體載體。該多肽可以共價(jià)或非共價(jià)地連接任意的這類載體，例如合意地陳列本發(fā)明多肽的材料的表面。本發(fā)明進(jìn)一步涉及與親和標(biāo)簽融合的本發(fā)明的多肽。這類親和標(biāo)簽的實(shí)例是文獻(xiàn)已知的，并且可以選自以下實(shí)例，例如HiS-tag、多肽A標(biāo)記、親合素/鏈親合素、多肽G、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶、二氫葉酸還原酶(DHFR)、綠色熒光多肽(GFP)、聚精氨酸、聚胱氨酸、c-myc、鈣調(diào)素結(jié)合多肽、流感病毒血凝素、麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)(HA)。40本發(fā)明還包括其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被修飾的多肽，其中所述一個(gè)或多個(gè)修飾優(yōu)選地選自體內(nèi)或體外化學(xué)衍生作用，如乙酰化或羧基化；糖基化作用，例如將多肽暴露于酶中引起的糖基化作用，該酶影響糖基化作用，如哺乳動(dòng)物的糖基化或去糖基化酶；磷酸化作用，如產(chǎn)生磷酸化氨基酸殘基的氨基酸殘基的修飾，例如磷酸酪氨酸、磷酸絲氨酸和磷酸蘇氨酸。本發(fā)明的多肽可以含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸，獨(dú)立地選自天然產(chǎn)生的L-氨基酸、天然產(chǎn)生的D-氨基酸以及非天然產(chǎn)生的合成氨基酸。本發(fā)明還涉及引入了保護(hù)基團(tuán)的本發(fā)明的多肽，以便保護(hù)和/或穩(wěn)定該多肽的N-和/或C-端，避免遭受不需要的退化。這種保護(hù)基團(tuán)可選自分支或未分支的烷基和酰基，例如甲酰或乙?；?，及其取代形式，例如乙酰氨甲基。本發(fā)明進(jìn)一步涉及本發(fā)明多肽的修飾物和衍生物，編碼所述多肽的核苷酸，含有所述核苷酸的載體，用所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞以及含有所述細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因生物。根據(jù)布汰佩斯條約的專利保藏以下菌株已經(jīng)根據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定于2007年6月4日保藏在德國微生物菌種保藏中心(DSMZ)。EscherichiacoliAL03231DSM19401含有質(zhì)粒pGEM-T-Easy-RmAFP1的E.coli菌株JM109EscherichiacoliAL03232DSM19402含有質(zhì)粒pGEM-T_Easy-RmAFP2的E.coli菌株JM109EscherichiacoliAL03233DSM19403含有質(zhì)粒pGEM-T_Easy-RmAFP3的E.coli菌株JM109EscherichiacoliAL03234DSM19404含有質(zhì)粒pGEM-T_Easy-RmAFP4的E.coli菌株JM109EscherichiacoliAL03235DSM19405含有質(zhì)粒pGEM-T_Easy-RmAFP5的E.coli菌株JM109EscherichiacoliAL03236DSM19406含有質(zhì)粒pGEM-T_Easy-RmAFP6的E.coli菌株JM109EscherichiacoliAL03237DSM19407含有質(zhì)粒pGEM-T_Easy-RmAFP7的E.coli菌株JM109EscherichiacoliAL03238DSM19408含有質(zhì)粒pGEM-T_Easy-RmAFP8的E.coli菌株JM109針對(duì)下述地區(qū)和國家就上述DSMZ保藏號(hào)作出以下聲明。ΕΡ0:本申請(qǐng)人特此要求，直至歐洲專利授權(quán)通知公布，或者直至本申請(qǐng)被駁回或撤回或視為撤回，自申請(qǐng)日起20年內(nèi)，EPC細(xì)則28(3)規(guī)定的本生物材料向公眾的公開只能通過向由請(qǐng)求人指定的專家提供樣品的形式完成。澳大利亞本申請(qǐng)人據(jù)此聲明，微生物樣本的發(fā)放僅在專利授權(quán)之前、或者本申請(qǐng)失效、駁回或撤回之前有效，提供給對(duì)本申請(qǐng)無利害關(guān)系的技術(shù)人員(澳大利亞專利法條例3.25(3))。加拿大本申請(qǐng)人請(qǐng)求，直至在本申請(qǐng)的基礎(chǔ)上授予加拿大專利或者本申請(qǐng)被駁回、或放棄且不再恢復(fù)、或撤回，專利委員會(huì)委員只能批準(zhǔn)本申請(qǐng)?zhí)岬降谋２厣锊牧系臉悠钒l(fā)放給委員指定的獨(dú)立專家?？肆_地亞本申請(qǐng)人特此要求，在本申請(qǐng)公開和專利授權(quán)之間，本樣品僅根據(jù)請(qǐng)求提供給獨(dú)立專家。丹麥本申請(qǐng)人特此要求，直至本申請(qǐng)已經(jīng)(由丹麥專利局)向公眾公開，或最終由丹麥專利局決定未向公眾公開，本申請(qǐng)中提到的保藏的生物材料樣品僅提供給本領(lǐng)域的專家。芬蘭本申請(qǐng)人特此要求，直至本申請(qǐng)已經(jīng)(由國家專利注冊(cè)委員會(huì))向公眾公開，或最終由國家專利注冊(cè)委員會(huì)決定未向公眾公開，本申請(qǐng)中提到的保藏的生物材料樣品僅提供給本領(lǐng)域的專家。德國本申請(qǐng)人特此要求，直至專利授權(quán)或者直至本申請(qǐng)被駁回或撤回，自申請(qǐng)日起20年內(nèi)，樣本只能發(fā)放給請(qǐng)求人指定的獨(dú)立專家。冰島本申請(qǐng)人特此要求，直至專利授權(quán)或者冰島專利局關(guān)于本申請(qǐng)作出沒有授權(quán)的最終決定，本申請(qǐng)?zhí)岬降谋２厣锊牧系臉悠穬H提供給本領(lǐng)域的專家。挪威本申請(qǐng)人特此要求，直至本申請(qǐng)已經(jīng)(由挪威專利局)向公眾公開，或最終由挪威專利局決定未向公眾公開，本申請(qǐng)中提到的保藏的生物材料樣品僅提供給本領(lǐng)域的專家。新加坡本申請(qǐng)人特此要求，本申請(qǐng)中提到的保藏的生物材料樣品僅提供給專家。西班牙本申請(qǐng)人特此要求，直至西班牙專利授權(quán)通知公布，或者本申請(qǐng)被駁回或撤回，自本申請(qǐng)日起20年內(nèi)，SPL45條規(guī)定的本申請(qǐng)保藏生物材料向公眾的公開只能通過向獨(dú)立專家發(fā)放樣品的形式完成。瑞典本申請(qǐng)人特此要求，直至本申請(qǐng)已經(jīng)(由瑞典專利局)向公眾公開，或最終由瑞典專利局決定未向公眾公開，本申請(qǐng)中提到的保藏生物材料的樣品僅提供給本領(lǐng)域的專家。英國本申請(qǐng)人特此要求，本申請(qǐng)中提到的保藏生物材料的樣品僅提供給專家。序列同源性和同一性的確定本發(fā)明一方面還提供一種分離的多肽，它與本發(fā)明多肽，如SEQIDNO:1至SEQIDNO8的任一項(xiàng)或它們的直系同源體，具有基本相似的序列同一性。術(shù)語“基本相似的序列同一性”在本文用于表示與SEQIDNO:1至SEQIDNO8的任意序列、或它們的直系同源體具有至少70%序列同一性的多肽，例如至少72%，例如至少74%，例如至少76%，例如至少78%，例如至少80%，例如至少82%，例如至少84%,例如至少86%，例如至少88%，例如至少90%，例如至少91%，例如至少92%，例如至少93%，例如至少94%，例如至少95%，例如至少96%，例如至少97%，例如至少98%，例如至少99%，或者大于99%。本發(fā)明還考慮到變異的多核苷酸分子，其可以用兩種標(biāo)準(zhǔn)來識(shí)別a)測(cè)定具有序列SEQIDNO:1至SEQIDNO8的任意氨基酸序列的多肽與上述(多核苷酸分子)之間的同一性或相似性，和b)在嚴(yán)格條件下進(jìn)行雜交試驗(yàn)。例如，某些基因變體包含多核苷酸，該多核苷酸保持與本發(fā)明的多核苷酸如SEQIDNO:1至SEQIDNO:8的任意序列雜交，或者與這些多核苷酸的互補(bǔ)序列雜交，接著在嚴(yán)格的沖洗條件下沖洗，其中沖洗嚴(yán)格度相當(dāng)于42以0.5X2XSSC，0.SDS在55°C65°C下進(jìn)行?；蛘撸儺惢蚩梢远ㄐ詾槎嗪塑账岱肿?，其保持與編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸如SEQIDNO:1至SEQIDNO:8的任意序列雜交，或者與這些多核苷酸的互補(bǔ)序列雜交，接著在嚴(yán)格的沖洗條件下沖洗，其中沖洗嚴(yán)格度相當(dāng)于以0.IX0.2XSSC,0.1%SDS在55°C65°C下進(jìn)行。序列同一性的百分比可通過常規(guī)方法確定。例如，參見Altschuletal.,Bull.Math.Bio.48603(1986)禾口HenikoffandHenikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915(1992)。簡言之，將兩個(gè)氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，用空位開放罰分10、空位延伸罰分1，以及HenikoffandHenikoff(同前)的〃BL0SUM62"得分矩陣來優(yōu)化比對(duì)評(píng)分。同一性百分?jǐn)?shù)計(jì)算為[(相同配對(duì)的總數(shù))/較長序列長度X為了比對(duì)兩序列而向該較長序列引入的空位數(shù)]X(100)本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以理解，許多建立的算法可以用來比對(duì)兩個(gè)氨基酸序列。Pearson和Lipman的“FASTA”相似性搜索算法是合適的多肽比對(duì)方法，用于檢查本文公開的氨基酸序列與推定的或變體的氨基酸序列共有的同源性水平。FASTA算法在PearsonandLipman,Proc.Nat'1Acad.Sci.USA852444(1988)禾口Pearson，Meth.Enzymo1.18363(1990)中都有描述。簡言之，F(xiàn)ASTA首先通過識(shí)別查詢序列(例如SEQIDNO:1至SEQIDNO8的任意序列)和測(cè)試序列共享的區(qū)域來定性序列相似度，這些區(qū)域具有最高的同源性密度(如果ktup變量是1)或者同源對(duì)(如果ktup=2)，而不考慮保守氨基酸替代、插入或缺失。然后通過利用氨基酸替代矩陣比較所有成對(duì)的氨基酸的相似性，將有最高同一性密度的十個(gè)區(qū)重新打分，并且這些區(qū)域的末端被“修整”以便僅含有那些對(duì)最高評(píng)分作出貢獻(xiàn)的殘基。如果有幾個(gè)區(qū)域的評(píng)分高于“臨界”值(基于序列長度和ktup值，通過預(yù)定的公式計(jì)算)，然后檢驗(yàn)修整的起始區(qū)以確定是否這些區(qū)可以接合以形成有差距的近似對(duì)齊。最后，用修改的Needleman-Wunsch-Sellers算法，將兩個(gè)氨基酸序列的最高評(píng)分區(qū)對(duì)齊(Needlemanandffunsch,J.Mol.Biol.48444(1970)；Sellers,SIAMJ.Appl.Math.26:787(1974))，其允許有氨基酸插入和缺失。FASTA分析的優(yōu)選參數(shù)是ktup=1，空位開放罰分=10，空位延伸罰分=1，替代矩陣=BL0SUM62。通過修改得分矩陣文件("SMATRIX")，可以將這些參數(shù)引入FASTA程序，正如Pearson，Meth.Enzymol.18363(1990)的附錄2所解釋的那樣。利用如上所公開的比率，F(xiàn)ASTA還可以用于確定多核苷酸分子的序列同一性。對(duì)核苷酸序列比對(duì)來說，ktup值可以是在1至6之間，優(yōu)選3至6，并且最優(yōu)選為3。其他參數(shù)可以設(shè)定為空位開放罰分=10，空位延伸罰分=1。本發(fā)明還針對(duì)與SEQIDNO1至SEQIDNO8的任意序列的氨基酸序列相比，具有一個(gè)或多個(gè)保守氨基酸替代的多肽以及編碼具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸替代的多肽的多核苷酸。也就是說，可以獲得含有SEQIDNO:1至SEQIDNO:8的任意序列的一個(gè)或多個(gè)氨基酸替代的變體。變體包括以下序列其中烷基氨基酸替代烷基氨基酸，其中芳香族氨基酸替代芳香族氨基酸，其中含硫氨基酸替代含硫氨基酸，其中含羥基氨基酸替代含羥基氨基酸，其中酸性氨基酸替代酸性氨基酸，堿性氨基酸替代堿性氨基酸，或者其中二鹽基一羧氨基酸替代二鹽基一羧氨基酸。例如，在常見氨基酸中，“保守的氨基酸替代”也可以通過以下各組中的氨基酸之間的替換來解釋(1)甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸，(2)苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸，(3)絲氨酸和蘇氨酸，(4)天冬氨酸和谷氨酸，(5)谷氨酰胺和天冬酰胺，以及(6)賴氨酸，精氨酸和組氨酸。BL0SUM62表是多肽序列片段的約2000局部多重比對(duì)得到的氨基酸替代矩陣，代表500多組相關(guān)多肽的高度保守區(qū)域(HenikoffandHenikoff,Proc.Nat'1Acad.Sci.USA89:10915(1992))。相應(yīng)地，BL0SUM62替代頻率可用于限定可引入本發(fā)明氨基酸序列的保守氨基酸替代。雖然可能僅基于化學(xué)性質(zhì)來設(shè)計(jì)氨基酸替代(如上所討論)，“保守氨基酸替代”的表述優(yōu)選地指大于-1的BL0SUM62值所表示的替代。例如，如果替代是以0、1、2，或3的BL0SUM62值為特征，則氨基酸替代是保守的。根據(jù)該系統(tǒng)，優(yōu)選的保守氨基酸替代的特征是至少為1(如1、2或3)的BL0SUM62值，而更優(yōu)選的保守氨基酸替代的特征是至少為2(如2或3)的BL0SUM62值。例如，當(dāng)氨基酸序列中的變化是由于一個(gè)或多個(gè)保守氨基酸替代引起時(shí)，具體的多肽變體的特征在于，與本文公開的相應(yīng)氨基酸序列(即SEQIDNO:1至SEQIDNO:8的任意序列)有至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或大于95%的序列同源性。氨基酸序列的變體，例如“保守氨基酸”變體，可以通過寡核苷酸指導(dǎo)的誘變、連接體掃描誘變，用聚合酶鏈反應(yīng)的誘變等獲得(見Ausubel(1995)，pages810-822；和McPherson(ed.),DirectedMutagenesis:APracticalApproach(IRLPress1991))。本發(fā)明的多肽還可以包括非自然產(chǎn)生的氨基酸殘基。例如，非自然產(chǎn)生的氨基酸殘基包括但不限于反式-3-甲基脯氨酸、2，4_甲醇基脯氨酸、順式-4-羥脯氨酸、反式-4-羥脯氨酸、N-甲基甘氨酸、別蘇氨酸、甲基蘇氨酸、羥基半胱乙酯、羥乙基同型半胱氨酸、硝基谷氨酸、同型谷氨酸、哌啶酸、噻唑烷羧酸、脫氫脯氨酸、3-以及4-甲基脯氨酸、3，3-二甲基脯氨酸、叔亮氨酸、戊氨酸、2-氮雜苯丙氨酸、3-氮雜苯丙氨酸、4-氮雜苯丙氨酸和4-氟苯丙氨酸。本領(lǐng)域中已知有幾種方法可用于將非自然產(chǎn)生的氨基酸殘基摻入多肽。例如，可以采用體外培養(yǎng)系統(tǒng)，其中無義突變可用化學(xué)氨基?；种苿﹖RNA來抑制。合成氨基酸和氨基?；痶RNA的方法是本領(lǐng)域中已知的。含有無義突變的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄和翻譯通常可在包含E.coliS30提取物和商業(yè)可得的酶和其他試劑的無細(xì)胞體系中進(jìn)行。多肽可通過層析法純化。例如，見Robertsonetal.,J.Am.Chem.Soc.1132722(1991),Ellmanetal.，MethodsEnzymol.202301(1991),Chungetal.，Science259:806(1993)和Chungetal.，Proc.Nat‘1Acad.Sci.USA9010145(1993)。多個(gè)氨基酸取代可用已知的誘變和篩選的方法來進(jìn)行和測(cè)試，例如Reidhaar-OlsonandSauer(Science241:53(1988))或BowieandSauer(Proc.Nat'IAcad.Sci.USA86:2152(1989))公開的那些。簡言之，這些作者公開了一些方法，用于同時(shí)使多肽中的兩個(gè)或多個(gè)位置隨機(jī)化，選擇功能多肽，然后測(cè)序該誘變的多肽以確定每個(gè)位置的允許替代物的光譜。可以使用的其他方法包括噬菌體展示法(例如，Lowmanetal.,Biochem.3010832(1991),Ladneretal.，U.S.Pat.No.5，223，409，Huse，國際公布No.WO92/06204和定位突變(Derbyshireetal.,Gene46145(1986)和Neretal.，DNA7:127，(1988))。本發(fā)明公開的核苷酸和多肽序列的變體還可以通過DNA改組來生成，如Stemmer，Nature370389(1994),Stemmer,Proc.Nat'1Acad.Sci.USA9110747(1994)和國際公布No.WO97Λ0078所述。簡言之，變體DNA分子是通過體外同源重組，通過親代DNA的隨機(jī)分裂接著用PCR重新裝配而生成，得到隨機(jī)引入的點(diǎn)突變。該技術(shù)可以用親代DNA分子的家族，比如來自不同物種的等位基因變體或DNA分子來改造，以將另外的變異引入該過程。選擇或篩選所需要的活性，接著進(jìn)行額外的反復(fù)誘變和分析，通過選擇所需要的變異，同時(shí)針對(duì)不利的變化進(jìn)行選擇，提供序列的快速“進(jìn)化”。本文公開的誘變方法可以和高通量自動(dòng)化篩選方法結(jié)合，以檢測(cè)宿主細(xì)胞中克隆的誘變多肽的活性。可以將編碼生物活性多肽或與特異性抗體結(jié)合的多肽的誘變DNA分子從宿主細(xì)胞中除去，并且用現(xiàn)有設(shè)備快速測(cè)序。這些方法可以快速確定所關(guān)注的多肽中個(gè)別氨基酸殘基的重要性，并且可以適用于未知結(jié)構(gòu)的多肽。本發(fā)明多肽的片段本發(fā)明還包括多肽的“功能性片段”以及編碼這些功能性片段的本發(fā)明的多核苷酸分子?？梢赃M(jìn)行多核苷酸分子的常規(guī)缺失分析，以獲得編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸分子的功能性片段。例如，編碼SEQIDNO:1至SEQIDNO8的任意序列的DNA分子可以用Bal31核酸酶消化，以獲得一系列嵌套缺失。然后將該片段在適當(dāng)?shù)拈喿x框內(nèi)插入表達(dá)載體中，分離出表達(dá)的多肽并測(cè)試其與抗體特異性結(jié)合的能力。核酸外切酶消化的一種替換方式是用寡核苷酸指導(dǎo)的誘變來引入缺失或終止密碼子，以詳細(xì)說明特異性片段的產(chǎn)生?；蛘?，本發(fā)明的基因的特定片段可以用聚合酶鏈反應(yīng)合成。SEQIDNO:1至SEQIDNO:8的片段優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)冰結(jié)合位點(diǎn)，用本文其他地方所述的SEQIDNO:9至SEQIDN0:72表示。本發(fā)明還提供了嵌合多肽和多肽片段。以下片段GSYSCRAVGVDASTVTDVQGTCHAKATGPGAVASGTSVDGSTSTATATGSC來源于全長序列SEQIDNOUSEQIDNO2,SEQNO7和SEQIDN08，并且在C-末端含有替換的殘基C，在N-末端含有GS。用于識(shí)別功能域的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。例如，對(duì)干擾素的一個(gè)或兩個(gè)端點(diǎn)的截取研究已被HorisbergerandDiMarco，Pharmac.Ther.66:507(1995)概括總結(jié)。此外，用于多肽的功能性分析的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)已經(jīng)有描述，例如Treuteretal.,Molec.Gen.Genet.240113(1993),Contentetal.,“Expressionandpreliminarydeletionanalysisofthe42kDa25Asynthetaseinducedbyhumaninterferon,"BiologicalInterferonSystems,ProceedingsofISIR-TNOMeetingonlnterferonSystems,Cantell(ed.),pages65-72(Nijhoff1987),Herschman,"TheEGFReceptor,"ControlofAnimalCellProliferation,Vol.1,Boyntonetal.,(eds.)pages169199(AcademicPress1985),Coumailleauetal.,J.Biol.Chem.27029270(1995)；Fukunagaetal.,J.Biol.Chem.27025291(1995)；Yamaguchietal.，Biochem.Pharmacol.501295(1995)以及Meiseletal.，PlantMolec.Biol.301(1996)。本發(fā)明還考慮了本發(fā)明多肽的功能性片段，其與SEQIDNO:1至SEQIDNO8任意45序列的氨基酸序列相比有氨基酸變化。變體多肽可以通過用本文公開的具體氨基酸序列根據(jù)結(jié)構(gòu)確定同一性的水平來識(shí)別。根據(jù)結(jié)構(gòu)識(shí)別變體多肽的另一種替換方法是確定是否編碼潛在變體多肽的多核苷酸分子能夠與具有SEQIDNO:1至SEQIDNO:8任意序列的核苷酸序列的多核苷酸雜交。本發(fā)明還提供多肽片段或肽，其含有本文所述的本發(fā)明多肽的表位承載部分。這種片段或肽可含有“免疫表位”，這是當(dāng)整個(gè)多肽用作免疫原時(shí)，引出抗體應(yīng)答的多肽的一部分。免疫原的表位承載肽可以用標(biāo)準(zhǔn)方法識(shí)別(例如，見Geysenetal.，Proc.Nat'1Acad.Sci.USA813998(1983))。與此相反，多肽片段或肽可含有“抗原表位”，其是抗體能夠與之特異性結(jié)合的多肽分子的一個(gè)區(qū)域。某些表位包括線性或連續(xù)延伸的氨基酸，并且這種表位的抗原性不受變性劑的干擾。本領(lǐng)域知道，能夠模擬多肽表位的相對(duì)短的合成肽可以用于刺激針對(duì)該多肽的抗體的產(chǎn)生(例如，見Sutcliffeetal.，Science219:660(1983))。因此，本發(fā)明的抗原表位承載肽和多肽可用于產(chǎn)生與本文所述多肽相結(jié)合的抗體。承載抗原表位的肽和多肽可以含有SEQIDNO:1至SEQIDNO:8任意序列的至少4至10個(gè)氨基酸，例如至少10至15個(gè)氨基酸，例如約15至約30個(gè)氨基酸。這種承載抗原表位的肽和多肽可以通過本文所述的將本發(fā)明的多肽裂解或者化學(xué)肽合成來生產(chǎn)。此外，表位可以通過隨機(jī)肽庫的噬菌體展示來選擇(例如，見LaneandStephen,Curr.Opin.Immunol.5268(1993),Corteseetal.,Curr.Opin.Biotechnol.7616(1996))。用于識(shí)別表位以及由含上述表位的小肽生產(chǎn)抗體的標(biāo)準(zhǔn)方法已有描述，例如Mole，“EpitopeMapping”，MethodsinMolecularBiology,Vol.10，Manson(ed·)，pages105116(TheHumanaPress,Inc.1992),Price,"ProductionandCharacterizationofSyntheticPeptide-DerivedAntibodies”，MonoclonalAntibodiesProduction,Engineering，andClinicalApplication，RitterandLadyman(eds.),pages6084(CambridgeUniversityPress1995)，Coliganetal.(eds.),CurrentProtocolsinImmunology,pages9·3·19.3·5禾口pages9.4.19.4.11(JohnWiley&Sons1997)0與本發(fā)明的變異基因的具體核苷酸序列無關(guān)，該基因編碼一種多肽，該多肽的特征在于它能夠與一抗體特異性結(jié)合，該抗體能夠與SEQIDNO:1至SEQIDNO8的任意序列特異性結(jié)合。^^mmmm^mm^w.^mm^mm^mt本發(fā)明還包括抗凍融合多肽。本發(fā)明的抗凍融合多肽可能針對(duì)特定的細(xì)胞區(qū)室或細(xì)胞外間隙，針對(duì)特定的細(xì)胞或特定的細(xì)胞類型。通過將指定或確定目標(biāo)的多肽片段連接到細(xì)胞區(qū)室，抗凍片段可能針對(duì)特定的細(xì)胞器。肽不僅針對(duì)該細(xì)胞器，而且被其他肽片段包圍時(shí)抗凍功能仍發(fā)揮作用。通過與抗體或者結(jié)合中具有細(xì)胞特異性的其他分子融合，冷凍時(shí)對(duì)細(xì)胞損傷的抗性可以賦予這些細(xì)胞類型。該技術(shù)在器官方面也是有用的。以下列出可以與本發(fā)明的多肽相結(jié)合的多肽融合到(蛋白質(zhì))融合的優(yōu)勢(shì)_蛋白質(zhì)A檢測(cè)性，分泌自GRAM-陽性菌，純化，易于切開以產(chǎn)生游離態(tài)46β-半乳糖苷酶β-內(nèi)酰胺酶通過酶分析法測(cè)定，WesternBlots上的可檢測(cè)性WesternBlots上的檢測(cè)性，分泌至GRAM-陰性菌的外周胞質(zhì)氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶WesternBlots上的檢測(cè)性，在植物提取物中通過酶分析法測(cè)定與病原相關(guān)的多肽從雙子葉植物中分泌因此，含有本發(fā)明多肽的融合多肽可用于在重組宿主中表達(dá)本發(fā)明的多肽，并分離表達(dá)的多肽。融合多肽的一種類型包括從重組宿主細(xì)胞中引導(dǎo)本發(fā)明的多肽的肽。為了將本發(fā)明的多肽引入真核宿主細(xì)胞的分泌途徑，將分泌信號(hào)序列(也稱作信號(hào)肽、引導(dǎo)序列、前導(dǎo)序列或前序列)設(shè)置在適宜的表達(dá)載體中。分泌信號(hào)序列可能來源于本發(fā)明的多肽，適宜的信號(hào)序列也可能源于另一分泌多肽或者重新合成。該分泌信號(hào)序列可操作地與編碼本發(fā)明序列的基因連接，使得兩個(gè)序列在恰當(dāng)?shù)拈喿x框中接合并定位，以引導(dǎo)新合成的多肽進(jìn)入宿主細(xì)胞的分泌途徑。分泌信號(hào)序列通常位于編碼所關(guān)注的多肽的核苷酸序列的5'，然而某些分泌信號(hào)序列可能位于所關(guān)注的核苷酸序列的其他位置(例如，見Welchetal.，U.S.Pat.No.5，037，743；Hollandetal.，U.S.Pat.No.5，143，830)。雖然本發(fā)明基因的分泌信號(hào)序列或由哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生的其他多肽(例如，U.S.Pat.No.5，641，655中所述的組織型纖溶酶原激活信號(hào)序)可用于在重組哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的基因，但對(duì)于酵母細(xì)胞中表達(dá)來說，酵母信號(hào)序列是優(yōu)選的。適宜的酵母信號(hào)序列的實(shí)例包括來源于酵母交配信息素α-因子(由MF-α基因編碼)、轉(zhuǎn)化酶(由SUC2基因編碼)或酸性磷酸酶(由PH05基因編碼)的那些。例如，見Romanosetal.,“ExpressionofClonedGenesinYeast,"DNACloning2:APracticalApproach,2.sup.ndEdition,GloverandHames(eds.),pages123167(OxfordUniversityPress在細(xì)菌細(xì)胞中，人們常常希望將異源性多肽表達(dá)為融合多肽以降低毒性，增加穩(wěn)定性，以及提高表達(dá)多肽的回收。例如，本發(fā)明的多肽可以表達(dá)為含有谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶多肽的融合多肽。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶融合多肽通常是水溶性的，并且易于在固定的谷胱甘肽柱上從E.coli溶解物中提純。以類似的方式，本發(fā)明含有麥芽糖結(jié)合多肽的融合多肽可以用直連淀粉樹脂柱分離，而含有截?cái)嗟亩嚯腁基因的C-末端的融合多肽可以用IgG-Sepharose純化。已經(jīng)建立的用于將異源性多肽在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)為融合多肽的技術(shù)已有描述，例如Williamsetal.,“ExpressionofForeignpolypeptidesinΕ.coliUsingPlasmidVectorsandPurificationofSpecificPolyclonalAntibodies,"DNACloning2:APracticalApproach,2.sup.ndEdition,GloverandHames(Eds.),pagesα-淀粉酶植物血球凝集素RuBPCASE小亞基菜豆蛋白乙醇脫氫酶α-交配因子熒光素酶從單子葉植物中分泌針對(duì)植物中的液泡針對(duì)植物中的葉綠體在種子中積聚在酵母中表達(dá)從酵母中分泌通過光發(fā)射檢測(cè)1995)。1558(OxfordUniversityPress1995)。此外，商用表達(dá)系統(tǒng)是可以購買的。例如，PINPOINTXa多肽純化系統(tǒng)(PromegaCorporation；Madison,Wis.)提供一種分離融合多肽的方法，該融合多肽含有一種在用含親合素的樹脂表達(dá)期間被生物素化的多肽。用于通過原核或真核細(xì)胞表達(dá)來分離異源性多肽的肽標(biāo)簽包括聚組氨酸標(biāo)簽(其對(duì)鎳螯合樹脂具有親和力)、c-myc標(biāo)簽、鈣調(diào)素結(jié)合多肽(用鈣調(diào)素親和層析法分離)、P物質(zhì)、RYIRS標(biāo)簽(其與抗-RYIRS抗體結(jié)合)、Glu-Glu標(biāo)簽以及FLAG標(biāo)簽(其與抗-FLAG抗體結(jié)合)。例如，見Luoetal.，Arch.Biochem.Biophys.329215(1996)，Morgantietal.,Biotechnol.Appl.Biochem.2367(1996)禾口Zhengetal.,Gene18655(1997)。編碼這些肽標(biāo)記的多核苷酸分子是可購買的，例如購自Sigma-Aldrich公司(St.Louis,Mo.)ο另一種形式的融合多肽含有本發(fā)明的多肽和免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)(通常為Fc片段)，其含有兩個(gè)恒定區(qū)域和一個(gè)鉸鏈區(qū)，但沒有可變區(qū)。例如，Changetal.,U.S.Pat.No.5，723，125描述了一種含人干擾素和人免疫球蛋白Fc片段的融合多肽。干擾素的C-端通過肽連接頭基團(tuán)連接到Fc片段的N-端。肽連接頭的一個(gè)實(shí)例是主要含有T細(xì)胞惰性序列的肽，其屬于免疫惰性。一種示范性的肽連接頭具有氨基酸序列GGSGGSGGGGSGGGGS(SEQIDNO:91)。在該融合多肽中，優(yōu)選的Fc基團(tuán)是人γ4鏈，它在溶液中是穩(wěn)定的并且?guī)缀趸蚋緵]有補(bǔ)體激活活性。因此，本發(fā)明考慮的融合多肽，其含有本發(fā)明的多肽或其片段，以及人Fc片段，其中本發(fā)明的多肽或其片段的C-端經(jīng)由肽連接頭連接到Fc片段的N-端。在另一變種中，含有本發(fā)明多肽的融合多肽進(jìn)一步含有IgG序列。本發(fā)明的多肽基團(tuán)共價(jià)地連接IgG序列的氨基末端和信號(hào)肽，該信號(hào)肽共價(jià)地連接本發(fā)明多肽的氨基端，其中IgG序列包括或者由以下元件按下列順序組成鉸鏈區(qū)、CH2域、以及CH3域。相應(yīng)地，IgG沒有CH1域。本發(fā)明的多肽基團(tuán)顯示出冰結(jié)合活性。生產(chǎn)含有抗體和非抗體部分的融合多肽的以上常用方法在LaRochelleetal.，EP742830(WO95/21258)中已有描述。融合多肽可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法通過制備融合多肽的各個(gè)組分并且將它們化學(xué)地偶聯(lián)來制備?；蛘?，編碼該融合多肽的兩組分的多核苷酸用已知技術(shù)在恰當(dāng)?shù)拈喿x框中生成，并且用本文描述的方法來表達(dá)。融合多肽的酶和化學(xué)裂解的通用方法已有描述，例如Ausubel(1995)，pages1619-1625。牛產(chǎn)本發(fā)明的多肽及其片段的通用方法本發(fā)明的抗凍多肽的合成可以兩種形式進(jìn)行，或者生物學(xué)的或者合成的。生物學(xué)方法是通過表達(dá)編碼序列或基因的多核苷酸；合成方法是通過化學(xué)合成多肽。優(yōu)選的合成方法利用固相肽合成，例如由Merrifield開發(fā)的那種(J.Am.Chem.Soc.，(1963)85=2149-2156)0該方法尤其用于測(cè)試特定的組合物或配方的抗凍活性。為了大規(guī)模生產(chǎn)，生物學(xué)表達(dá)通常是優(yōu)選的。編碼多核苷酸或基因可以是帶有重組修飾的天然基因或者完全合成的序列，其是在適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。將天然序列片段插入適當(dāng)?shù)妮d體中的方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的，見Maniatisorffu,etal.(1987)MethodsinEnzymology,Vol.153,AcademicPress,NewYork,N.Y。合成的序列可以通過亞磷酰胺化學(xué)法合成，以制備該序列的特定部分(BeaucageandCarruthers,(1981)Tet.Letters,22:1859_1862)?？梢院铣芍丿B部分然后將其連接在一起以產(chǎn)生較大的基因。最后，通過選擇抗凍片段的特定序列，可以引入限制性酶切位點(diǎn)，其可以提供便利的片段，它們易于連在一起或插入以生成串聯(lián)重復(fù)序列，對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說是顯而易見的?？箖龆嚯牡募兓梢杂枚嚯募兓I(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行。標(biāo)準(zhǔn)純化技術(shù)可以是細(xì)胞裂解液，或者培養(yǎng)基(如果該多肽被分泌)。典型的方法是柱色譜法、硫酸銨鹽沉淀法、抗體親和柱層析法及其他。天然產(chǎn)生的多肽(例如，在魚中產(chǎn)生)，優(yōu)選的純化方法在DeVriesetal.(1977)BiochemBiophys.Acta495:388_392中已有描述。優(yōu)選地，抗凍多肽被純化至基本同質(zhì)，通常至少約70%至80%純度，優(yōu)選地約90-95%純度，最優(yōu)選99%或更純。通常，該多肽基本上是無污染物的天然相關(guān)的魚化合物(fishcompounts)ο從以上所述清楚地看出，本發(fā)明的多肽，包括全長多肽、功能性片段以及融合多肽，能夠方便地按以下常規(guī)技術(shù)在重組宿主細(xì)胞中生產(chǎn)。為了表達(dá)本發(fā)明的基因，編碼多肽的多核苷酸必須可操作地與調(diào)控序列連接，然后再引入宿主細(xì)胞內(nèi)，該調(diào)控序列控制表達(dá)載體中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。除了轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，例如啟動(dòng)子和增強(qiáng)子，表達(dá)載體可以含有翻譯調(diào)控序列和標(biāo)記基因，標(biāo)記基因適用于篩選攜帶表達(dá)載體的基因。適用于在真核細(xì)胞中生產(chǎn)外源性多肽的表達(dá)載體通常含有(1)編碼細(xì)菌復(fù)制起源和抗生素抗性標(biāo)記的原核DNA元件，為表達(dá)載體在細(xì)菌宿主中的生長和選擇做準(zhǔn)備；(2)控制轉(zhuǎn)錄起始的真核DNA元件，如啟動(dòng)子；和(3)控制轉(zhuǎn)錄進(jìn)展的DNA元件，如轉(zhuǎn)錄終止/聚腺苷化序列。如上所討論，表達(dá)載體還可以包括編碼分泌序列的核苷酸序列，其指導(dǎo)異源性多肽進(jìn)入宿主細(xì)胞的分泌途徑。例如，表達(dá)載體可包含本發(fā)明的基因和來自所述基因或其他分泌基因的分泌序列。通常用于細(xì)菌的載體的實(shí)例包括pET系列(Novagen)、pGEX系列(GeHealthcare)、pBAD-系列(Invitrogen)。酵母中的載體的實(shí)例是用于畢赤酵母屬的pPic(Invitrogen)、來自KluyveromycesIactis的pKlac體系(NewEnglandbiolabs)、S.cereviseae載體(Patel,0.,Fearnley,R.,andMacreadie,I..3002.Saccharomycescerevisiaeexpressionvectorswiththrombin-c1eavab1eN-andC-terminal6x(His)tags.BiotechnolLett.200325(4):331_334)，以及用于S.cereviseae的pYes體系(Invitrogen)。真菌中使用的載體的實(shí)例是pBAR系列(在Pall，M.L.andJ.Brunelli.1993.Aseriesofsixcompactfungaltransformationvectorscontainingpolylinkerswithuniquerestrictionssites.FungalGeneticsNewsletter40:59_61中有描述)?；赑lEx質(zhì)粒的系統(tǒng)(Merck)或基于桿狀病毒的系統(tǒng)(Merck)是用于昆蟲細(xì)胞的系統(tǒng)的兩個(gè)實(shí)例。類似的產(chǎn)品可購買自其他公司。昆蟲細(xì)胞中使用的載體的實(shí)例包括四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)pTet和pTre、基于腺病毒的系統(tǒng)Adeno-X、基于逆轉(zhuǎn)錄酶病毒的系統(tǒng)Rethro-X(全部來自Clontech)以及pcDNA載體(Invitrogen)。此外，還有更多的實(shí)例并且在市場上有售。[1026]本發(fā)明的多肽可在哺乳細(xì)胞中表達(dá)。適宜的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的實(shí)例包括非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero;ATCCCRL1587)、人胚胎腎細(xì)胞(293-HEK；ATCCCRL1573)、幼倉鼠腎細(xì)胞(BHK-21,BHK-570；ATCCCRL8544，ATCCCRL10314)、犬腎細(xì)胞(MDCK；ATCCCCL34)、中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CH0-K1;ATCCCCL61；CHODG44[Chasinetal.,Som.Cell.Molec.Genet.12:5551986])、大鼠垂體細(xì)胞(GHl；ATCCCCL82)、HeLaS3細(xì)胞(ATCCCCL2.2)、大鼠肝癌細(xì)胞(H-4-II-E；ATCCCRL1548)、SV40-轉(zhuǎn)化的猴腎細(xì)胞(C0S-1；ATCCCRL1650)以及小鼠胚胎細(xì)胞(NIH-3T3；ATCCCRL1658)。對(duì)于哺乳動(dòng)物宿主來說，轉(zhuǎn)錄的和翻譯的調(diào)控信號(hào)可來源于病毒源，例如腺病毒、牛乳頭狀瘤病毒、猴病毒等，其中調(diào)控信號(hào)與特定的具有高表達(dá)水平的基因相關(guān)。適宜的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列還可以從哺乳動(dòng)物基因獲得，例如肌動(dòng)蛋白、膠原蛋白、肌球蛋白和金屬硫蛋白基因。轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列包含足以指導(dǎo)RNA開始合成的啟動(dòng)子區(qū)。適宜的真核啟動(dòng)子包括小鼠金屬硫蛋白I基因的啟動(dòng)子(Hameretal.，J.Molec.Appl.Genet.1:273(1982))、皰疹病毒的TK啟動(dòng)子(McKnight，Cell31:355(1982))、SV40早期啟動(dòng)子(Benoistetal.，Nature290:304(1981))、勞氏肉瘤病毒啟動(dòng)子(Gormanetal.,Proc.Nat'1Acad.Sci.USA79:6777(1982))、巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子(Foeckingetal.,Gene45:101(1980))以及小鼠乳房月中瘤啟動(dòng)子(總體見Etcheverry，“ExpressionofEngineeredpolypeptidesinMammalianCellCulture,"polypeptideEngineeringPrinciplesandPractice,Clelandetal.(eds.),pages163181(JohnWiley&Sons，Inc.1996))。或者，如果該原核啟動(dòng)子被真核啟動(dòng)子調(diào)控，則原核啟動(dòng)子，如噬菌體T3RNA聚合酶啟動(dòng)子，可以用于控制哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的基因表達(dá)(Zhouetal.，Mol.Cell.Biol.104529(1990),Kaufmanetal.,Nucl.AcidsRes.19:4485(1991))。表達(dá)載體可以用各種標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)引入宿主細(xì)胞中，包括磷酸鈣轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、微粒介導(dǎo)的傳遞、電穿孔等。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可以被選擇和繁殖以提供含有該表達(dá)載體的重組宿主細(xì)胞，該表達(dá)載體穩(wěn)定地整合在該宿主細(xì)胞基因組中。用于將載體引入真核細(xì)胞中的技術(shù)以及用顯性可選標(biāo)記選擇那些穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體的技術(shù)己有描述，例如Ausubel(1995)以及Murray(ed.)，GeneTransferandExpressionProtocols(HumanaPress1991)。因此本發(fā)明的基因可在更高級(jí)的真核生物中表達(dá)，例如禽類、真菌、昆蟲、酵母菌及植物細(xì)胞。例如，一種穩(wěn)定的可選標(biāo)記是對(duì)抗生素新霉素提供抗性的基因。在這種情況下，選擇是在新霉素類藥物的存在下進(jìn)行，例如G-418或諸如此類。選擇體系還可用于增加所關(guān)注的基因的表達(dá)水平，一種稱為“擴(kuò)增”的過程。擴(kuò)增是通過在低水平選擇劑的存在下培養(yǎng)轉(zhuǎn)染子，然后增加選擇劑的量以篩選細(xì)胞，這些細(xì)胞產(chǎn)生高水平的引入基因的產(chǎn)物。適宜的擴(kuò)增可選標(biāo)記是二氫葉酸還原酶，其對(duì)甲氨喋呤具有抗性。其他藥物抗性基因(如潮霉素抗性、多藥物抗性、嘌呤霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶)也可以使用?；蛘?，引入改變表型的標(biāo)記物，例如綠色熒光多肽，或細(xì)胞表面多肽，如⑶4、⑶8、ClassIMHC、胎盤堿性磷酸酶，都可用于從未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中通過如FACS分選或磁珠分離技術(shù)等手段來分選轉(zhuǎn)染細(xì)胞。還可以利用病毒傳遞系統(tǒng)，通過培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞來生產(chǎn)本發(fā)明的多肽。用于此目的的示范性病毒包括重組腺病毒、皰疹病毒、牛痘病毒和腺-相關(guān)病毒(AAV)。腺病毒，一種雙鏈DNA病毒，是目前研究的最好的基因，用于傳遞異源性多核苷酸的基因轉(zhuǎn)移載體(參見Beckeretal.，Meth.CellBiol.43161(1994)和DouglasandCuriel,Science&Medicine4:44(1997))。腺病毒系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)包括相對(duì)較大的DNA插入物的適應(yīng)性，增長到高滴度的能力，感染廣泛的哺乳動(dòng)物細(xì)胞類型的能力，以及允許使用大量可得的含有不同啟動(dòng)子的載體的靈活性。通過刪除腺病毒基因組的一部分，可以容納較大的異源性DNA插入物(高達(dá)7kb)。這些插入物可以通過直接連接或通過與共轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒的同源重組來摻入病毒DNA中。一種選擇是從病毒載體中刪除基本的El基因，這導(dǎo)致復(fù)制不能進(jìn)行，除非由宿主細(xì)胞提供El基因。例如感染腺病毒載體的人293細(xì)胞(ATCCNo.CRL_1573、45504、45505)可以生長為粘附細(xì)胞或者在相對(duì)高細(xì)胞濃度下懸浮培養(yǎng)以生產(chǎn)大量多肽(見Garnieretal.,Cytotechnol.15:145(1994))。生成轉(zhuǎn)基因生物的方法是本領(lǐng)域已知的，參見表3細(xì)菌、酵母和真菌簡單地通過引入相關(guān)的表達(dá)質(zhì)粒來獲得轉(zhuǎn)基因生物。本文其他地方1038]列出了此類方法。1039]昆蟲LiW,JinL,AnL2003.Constructionoftargetingvectorandexpression1040]ofgreenfluorescentpolypeptideinthesilkworm,Antheraeapernyi.1041]DNACellBiol.22441-6.YamaoM,KatayamaN,NakazawaH,1042]YamakawaM,HayashiY,HaraS,KameiK,MoriH.1999.1043]Genetargetinginthesilkwormbyuseofabaculovirus.GenesDev.1044]13:511-6.AllenML,SchollPJ.2005.Qualityoftransgeniclaboratory1045]strainsofCochliomyiahominivorax(Diptera:Calliphoridae).JEcon1046]Entomo1.98:2301-6.1047]植物見專利第47頁(Horschetal.，Science2271229(1985)，Kleinet1048]al.,Biotechnology10:268(1992)，以及Mikietal.，“Proceduresfor1049]IntroducingForeignDNAintoPlants,"MethodsinPlantMolecular1050]BiologyandBiotechnology,Glicketal.(eds.),pages6788(CRC1051]Press,1993).1052]feRemboldM,LahiriK,FoulkesNS,WittbrodtJ.2006.Transgenesisin1053]fish:efficientselectionoftransgenicfishbyco-injectionwitha1054]fluorescentreporterconstruct.NatureProtocols11133-91055]RahmanMA,MakR,AyadH,SmithA,MacleanN.1998.Expressionof1056]anovelpiscinegrowthhormonegeneresultsingrowthenhancementin1057]transgenictilapia(Oreochromisniloticus).TransgenicRes.7:357_69.1058]UzbekovaS,ChybJ,FerriereF,BailhacheT,PrunetP,AlestromP,1059]BretonB.2000.TransgenicrainbowtroutexpressedsGnRH—antisense1060]RNAunderthecontrolofsGnRHpromoterofAtlanticsalmon.1061]JMolEndocrinol.25:337-50.1062]云力·NagashimaH,FujimuraΤ,TakahagiY,KuromeΜ,WakoN,OchiaiΤ,[1063]EsakiR,KanoK,SaitoS,OkabeM,MurakamiH.2003.Developmentofefficientstrategiesfortheproductionofgeneticallymodifiedpigs.Theriogenology.59:95_106LaiL,PratherRS.2003.Creatinggeneticallymodifiedpigsbyusingnucleartransfer.ReprodBiolEndocrinol.1:82HofmannA,KesslerB,EwerlingS,WeppertM,VoggB,LudwigH,StojkovicM,BoelhauveM,BremG,WolfE,PfeiferA.2003.Efficienttransgenesisinfarmanimalsbylentiviralvectors.EMBORep.41054-60.DNA顯微注射(Gordon,J.W.andRuddle,F.E1981.Integrationandstablegerailinetransformationofgenesinjectedintomousepronuclei.Science2141244-1246),胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)的Transgenesisbymeansofblastocyst-derivedembryonicstemcellline.基因轉(zhuǎn)移Proc.Natl.Acad.Sci.83:9065-9069)逆轉(zhuǎn)錄酶病毒介導(dǎo)Jaenisch,R.1976.GermlineintegrationandMendeliantransmissionof的基因轉(zhuǎn)移theexogenousMoloneyleukemiavirus.Rroc.Natl.Acad.Sci.73:1260_1264)桿狀病毒系統(tǒng)提供有效的手段以將本發(fā)明克隆的基因引入昆蟲細(xì)胞中。適宜的表達(dá)載體是基于苜蓿銀紋夜蛾多核型多角體病毒(AcMNPV)，并且含有眾所周知的啟動(dòng)子，如果蠅熱休克多肽(hsp)70啟動(dòng)子、苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒即刻早期基因啟動(dòng)子(ie-Ι)和延遲早期39K啟動(dòng)子、桿狀病毒PlO啟動(dòng)子以及果蠅金屬硫蛋白啟動(dòng)子。用于制備重組桿狀病毒的第二種方法采用了Luckow描述的基于轉(zhuǎn)座子的系統(tǒng)(Luckow,etal.，J.Virol.67:4566(1993))。使用轉(zhuǎn)移載體的這種系統(tǒng)是以BAC-to-BAC試劑盒銷售(LifeTechnologies,Rockville,Md.)。該系統(tǒng)使用含有Tn7轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)移載體，PFASTBAC(LiveTechnologies)，以將編碼本發(fā)明多肽的DNA移動(dòng)到保持在E.coli中的桿狀病毒基因組內(nèi)，成為一種大的稱作“桿?！钡馁|(zhì)粒。見Hill-PerkinsandPossee,J.Gen.Virol.71971(1990),Bonning,etal.,J.Gen.Virol.751551(1994)和Chazenbalk，andRapoport,J.Biol.Chem.270:1543(1995)。此外，轉(zhuǎn)移載體可以包括與DNA的框內(nèi)融合，該DNA編碼本發(fā)明的表達(dá)多肽的C-或N-端的表位標(biāo)記，如Glu-Glu表位標(biāo)記(Grussenmeyeretal.,Proc.Nat'1Acad.Sci.82:7952(1985))。使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)，將含有本發(fā)明基因的轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)化到E.coli,并篩選桿粒，該桿粒含有指示重組桿狀病毒的中斷IacZ基因。然后用常規(guī)技術(shù)分離含有重組桿狀病毒基因組的桿粒DNA。該說明性的PFASTBAC載體可以在很大程度上被修飾。例如，多角體啟動(dòng)子可以被除去并用桿狀病毒基本多肽啟動(dòng)子替代(也稱作Pcor、p6.9或MP啟動(dòng)子)，其在桿狀病毒感染中較早表達(dá)，并且顯示對(duì)表達(dá)分泌多肽是有利的(例如，見Hill-PerkinsandPossee,J.Gen.Virol.71971(1990)，Bonning,etal.，J.Gen.Virol.751551(1994)和ChazenbalkandRapoport,J.Biol.Chem.270:1543(1995))。在這種轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建體中，可52以使用基本多肽啟動(dòng)子的短或長的形式。而且，可以構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體，其用來自昆蟲多肽的分泌信號(hào)序列代替本發(fā)明多肽的天然分泌信號(hào)序列。例如，來自蛻皮激素葡糖基轉(zhuǎn)移酶(EGT)的分泌信號(hào)序列、蜜蜂蜂毒肽(InvitrogenCorporation；Carlsbad,Calif.)、或桿狀病毒gp67(PharMingen=SanDiego,Calif.)都可用于構(gòu)建體中以代替天然分泌信號(hào)序列。將重組病毒或桿粒用于轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。適宜的昆蟲宿主細(xì)胞包括來源于IPLB-Sf-21的細(xì)胞系，一種草地夜蛾蛹卵巢細(xì)胞系，例如Sf9(ATCCCRL1711)、Sf2IAE和Sf21(InvitrogenCorporation；SanDiego,Calif.)，以及果蠅Schneider-2細(xì)胞、來源于粉紋夜蛾(T.ni)的HIGHFIVEO細(xì)胞系(Invitrogen)(U.S.Pat.No.5，300，435)。商業(yè)購買的無血清培養(yǎng)基可以用于培養(yǎng)和維持這些細(xì)胞。適宜的培養(yǎng)基是用于Sf9細(xì)胞的Sf900II(LifeTechnologies)或ESF921(ExpressionSystems)；以及用于T.ni細(xì)胞的Ex-cell0405(JRHBiosciences,Lenexa,Kans.)或ExpressFiveO(LifeTechnologies)。當(dāng)使用重組病毒時(shí)，細(xì)胞通常從約25XIO5細(xì)胞的接種密度生長到12XIO6細(xì)胞，屆時(shí)在感染復(fù)數(shù)(MOI)為0.1至10，更典型地在接近3時(shí)，添加重組病毒保存株。已建立的用于在桿狀病毒系統(tǒng)中生產(chǎn)重組多肽的技術(shù)由Baileyetal.,“ManipulationofBaculovirusVectors,“在MethodsinMolecularBiology,Volume7:GeneTransferandExpressionProtocols,Murray(ed·),pages147168(TheHumanaPress,Inc.1991)；Pateletal.,"Thebaculovirusexpressionsystem,"DNACloning2:ExpressionSystems,2ndEdition,Gloveretal.(eds.),pages205244(OxfordUniversityPress1995)；Ausubel(1995)^tpages1637M1657；Richardson(ed.),BaculovirusExpressionProtocols(TheHumanaPress,Inc.1995),以及Lucknow,"InsectCellExpressionTechnology,“在polypeptideEngineeringPrinciplesandPractice,Clelandetal.(eds.),pages183218(JohnWiley&Sons，Inc.1996)提供。真菌細(xì)胞，包括酵母細(xì)胞，也可以用于表達(dá)本文所描述的基因。在這方面尤其關(guān)注的酵母種類包括釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)和甲醇畢赤酵母(Pichiamethanolica)。適宜的在酵母中表達(dá)的啟動(dòng)子包括GALl(半乳糖)、PGK(磷酸甘油酸激酶)、ADH(乙醇脫氫酶)、A0X1(乙醇氧化酶)、HIS4(組氨醇脫氫酶)等的啟動(dòng)子。許多酵母克隆載體已經(jīng)被設(shè)計(jì)出并且易于得到。這些載體包括基于YIp的載體，如YIp5；YRp載體，如YRp17；Yep載體，如YEp13；以及YCp載體，如YCpl9。用外源DNA轉(zhuǎn)化釀酒酵母細(xì)胞的方法以及由其生產(chǎn)重組多肽的方法已被公開，例如Kawasaki,U.S.Pat.No.4，599，311，Kawasakietal.，U.S.Pat.No.4，931，373，Brake,U.S.Pat.No.4，870，008，Welchetal.，U.S.Pat.No.5，037，743，以及Murrayetal.，U.S.Pat.No.4，845，075。通過可選標(biāo)記確定的表型、常見的藥物抗性或者在缺乏特定營養(yǎng)素(如，亮氨酸)時(shí)的生長能力，來選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞。在釀酒酵母中使用的適宜載體系統(tǒng)是Kawasaki等人(U.S.Pat.No.4,931,373)公開的POTl載體系統(tǒng)，其可以通過在含葡萄糖的培養(yǎng)基中的生長來選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞。酵母中使用的其他適宜的啟動(dòng)子和終止子包括來自糖酵解酶基因(例如，見Kawasaki，U.S.Pat.No.4，599，311，Kingsmanetal.，U.S.Pat.No.4，615，974和Bitter,U.S.Pat.No.4，977，092)和乙醇脫氫酶基因的那些。又見U.S.Pat.No.4，990，446,5,063，154,5,139，936和4，661，454。適用于酵母的常用和/或商業(yè)可得的載體的其他實(shí)例是PPic系列(Invitrogen)，來自KluyveromycesIactis^pKlac系統(tǒng)(NewEnglandBiolabs),以及用于S.cerevisae的S.cerevisae載體(Pateletal.,Biotechnologyletters2003vol25(4):331_334)禾口pYes系統(tǒng)(Invitrogen)。在真菌中可以使用PBAR系列(Palletal.,1993vol.4059-61,FunctionalGeneticsNewsletter)。其他酵母的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)都是本領(lǐng)域已知的，包括多形漢遜酵母(Hansenulapolymorpha)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis)、脆壁克魯維酵母(Kluyveromycesfragilis)、玉蜀黍黑粉菌(Ustilagomaydis)、巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)、甲醇畢赤酵母(Pichiamethanolica)、季也蒙畢赤酵母(Pichiaguillermondii)和麥牙糖念珠菌(Candidamaltosa)。例如，見Gleesonetal.，J.Gen.Microbiol.132:3459(1986)和Cregg，U.S.Pat.No.4，882，279。根據(jù)McKnightetal.，U.S.Pat.No.4，935，349的方法，可使用曲霉細(xì)胞。Suminoetal.，U.S.Pat.No.5，162，228公開用于轉(zhuǎn)化產(chǎn)黃頭孢霉的方法。Lambowitz,U.S.Pat.No.4，486，533公開了用于轉(zhuǎn)化脈孢菌屬的方法。例如，甲醇畢赤酵母作為宿主生產(chǎn)重組多肽的用途被Raymond，U.S.Pat.No.5，716，808、Raymond,U.S.Pat.No.5，736，383、Raymondetal.，Yeast14:1123(1998)以及國際公布No.WO97/17450，WO97/17451，WO98/02536和WO98/02565公開。在轉(zhuǎn)化P.methanolica中使用的DNA分子通常被制備為雙鏈、環(huán)狀質(zhì)粒，其可以在轉(zhuǎn)化之前被線性化。對(duì)于在P.methanolica中生產(chǎn)多肽來說，質(zhì)粒中的啟動(dòng)子和終止子可以是P.methanolica基因的那些，如P.methanolica乙醇利用基因(AUG1或AUG2)。其他有用的啟動(dòng)子包括二羥丙酮合成酶(DHAS)、甲酸脫氫酶(FMD)和過氧化氫酶(CAT)基因的那些。為了促進(jìn)DNA在宿主染色體中的整合，優(yōu)選的是使質(zhì)粒的整個(gè)表達(dá)片段位于宿主DNA序列兩端的側(cè)翼。在甲醇畢赤酵母中使用的適宜的可選標(biāo)記是P.methanolicaADE2基因，其編碼磷酸核糖-5-氨基咪唑羧化胸(AIRC；EC4.1.1.21)，并且能夠使ADE2宿主細(xì)胞在缺乏腺嘌呤的情況下生長。對(duì)于希望甲醇用量最小的大規(guī)模工業(yè)處理來說，有可能使用兩種甲醇利用基因(AUG1和AUG2)都缺失的宿主細(xì)胞。對(duì)于分泌多肽的生產(chǎn)，可以使用缺少液泡蛋白酶基因(PEP4和PRB1)的宿主細(xì)胞?？衫秒姶┛讈韼椭鷮①|(zhì)粒引入P.methanolica細(xì)胞，該質(zhì)粒含有編碼所關(guān)注多肽的DNA。P.methanolica細(xì)胞可以通過電穿孔來轉(zhuǎn)化，使用場強(qiáng)度為2.5至4.5kV/cm的指數(shù)衰減脈沖電場，優(yōu)選約3.75kV/cm,時(shí)間常數(shù)為1至40毫秒，最優(yōu)選約20毫秒。表達(dá)載體也可以引入植物原生質(zhì)體、完整的植物組織、或分離的植物細(xì)胞中。將表達(dá)載體引入植物組織的方法包括用根癌農(nóng)桿菌、基因槍法介導(dǎo)的傳遞、DNA注入、電穿孔等直接侵染或共培養(yǎng)植物組織。例如，見Horschetal.，Science2271229(1985)，Kleinetal.,Biotechnology10:268(1992)禾口Mikietal.,“ProceduresforIntroducingForeignDNAintoPlants,"MethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnology,Glicketal.(eds.),pages6788(CRCPress,1993)?；蛘?，本發(fā)明的基因可以在原核宿主細(xì)胞中表達(dá)?？梢杂糜谠谠思?xì)胞中表達(dá)本發(fā)明多肽的適宜的啟動(dòng)子是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，包括能夠識(shí)別T4、T3、Sp6和T7聚合酶的啟動(dòng)子，噬菌體λ的Pk與Pl啟動(dòng)子，Ε.coli的trp、recA、熱擊、lacUV5、tac、lpp-lacSpr、phoA和IacZ啟動(dòng)子，B.subtilis的啟動(dòng)子，芽孢桿菌的噬菌體的啟動(dòng)子，鏈54霉菌啟動(dòng)子，噬菌體λ的int啟動(dòng)子，pBR322的bla啟動(dòng)子，以及氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的CAT啟動(dòng)子。原核啟動(dòng)子在Glick，J.Ind.Microbiol.1:277(1987)，Watsonetal.，MolecularBiologyoftheGene,4thEd.(BenjaminCummins1987)禾口Ausubeletal.(1995)中已有評(píng)論。適宜的原核宿主包括Ε.coli和芽孢桿菌屬。適宜的Ε.coli菌株包括BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、BL21(DE3)pLysE、DHl、DH4I、DH5、DH5I、DH5IF、DH5IMCR、DH10B、DH10B/p3、DH11S、C600、HB101、JM101、JM105、JM109、JM110、K38、RR1、Y1088、Y1089、CSH18、ER1451和ER1647(例如，見Brown(ed.),MolecularBiologyLabfax(AcademicPress1991))。適宜的芽孢桿菌屬菌株包括BR151、YB886、MI119、MI120和B170(例如，見Hardy，“BacillusCloningMethods,“DNACloning:APracticalApproach,Glover(ed.)(IRLPress1985))。當(dāng)在細(xì)菌如E.coli中表達(dá)本發(fā)明的多肽時(shí)，該多肽可保留在細(xì)胞質(zhì)中，通常為不溶性顆粒，或者可被細(xì)菌分泌序列引導(dǎo)至周質(zhì)間隙。在前一種情況下，將細(xì)胞溶解，并且用如異硫氰酸胍或尿素來回收顆粒并使其變性。然后通過稀釋該變性劑，例如通過透析尿素的溶液以及還原與氧化的谷胱甘肽的組合物，接著透析緩沖鹽溶液，該變性的多肽可以被重折疊和二聚化。在后一種情況下，通過破壞細(xì)胞(例如，通過超聲處理或滲透性沖擊)以釋放周質(zhì)間隙的內(nèi)容物并回收多肽，該多肽可以從周質(zhì)間隙以可溶的和功能性的方式被回收，從而省卻了變性和重折疊。在原核宿主中表達(dá)多肽的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(例如，見Williamsetal.，“ExpressionofforeignpolypeptidesinΕ.coliusingplasmidvectorsandpurificationofspecificpolyclonalantibodies,"DNACloning2-ExpressionSystems,2ndEdition,Gloveretal.(eds.),page15(OxfordUniversityPress1995),Wardetal.,"GeneticManipulationandExpressionofAntibodies,"MonoclonalAntibodies:PrinciplesandApplications,page137(ffiley-Liss,Inc.1995)禾口Georgiou,"ExpressionofpolypeptidesinBacteria,"poIypeptideEngineering-PrinciplesandPractice,Clelandetal.(eds.),page101(Johnffiley&Sons,Inc.1996))。將載體引入細(xì)菌、酵母、昆蟲和植物細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)方法已有提供，例如Ausubel(1995)。表達(dá)和回收由哺乳動(dòng)物細(xì)胞體系產(chǎn)生的外源多肽的一般方法已有提供，例如Etcheverry,”ExpressionofEngineeredpolypeptidesinMammalianCellCulture,〃polypeptideEngineeringPrinciplesandPractice,Clelandetal.(eds.),pages163(Wiley-Liss，Inc.1996)。回收由細(xì)菌體系產(chǎn)生的多肽的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)已有提供，例如Grisshammeretal.，“Purificationofover-producedpolypeptidesfromΕ.colicells，“DNACloning2-ExpressionSystems,2ndEdition，Gloveretal.(eds.),pages5992(OxfordUniversityPress1995)。已建立的從桿狀病毒體系中分離重組多月太的方法由Richardson(ed.),BaculovirusExpressionProtocols(TheHumanaPress,Inc.1995)公幵。另外，本發(fā)明的多肽可以通過專門的固相合成、部分固相法、片段縮合或經(jīng)典溶55液合成法來合成。這些合成方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(例如，見Merrifield，J.Am.Chem.Soc.852149(1963),Stewartetal.,“SolidPhasePeptideSynthesis“(2ndEdition)，(PierceChemicalCo.1984)，BayerandRapp,Chem.Pept.Prot.33(1986)，Athertonetal.,SolidPhasePeptideSynthesis:APracticalApproach(IRLPress1989)，F(xiàn)ieldsandColowick，“Solid-PhasePeptideSynthesis,“MethodsinEnzymologyVolume289(AcademicPress1997)禾口Lloyd-Williamsetal.，ChemicalApproachestotheSynthesisofPeptidesandpolypeptides(CRCPress,Inc.1997))0化學(xué)合成總策略的變化，如“自然化學(xué)連接”和“表達(dá)多肽連接”都是標(biāo)準(zhǔn)的(例如，見Dawsonetal.,Science266:776(1994),Hackengetal.,Proc.Nat‘1Acad.Sci.USA94:7845(1997)，Dawson，MethodsEnzymol.28734(1997),Muiretal,Proc.Nat‘1Acad.Sci.USA956705(1998)和SeverinovandMuir,J.Biol.Chem.27316205(1998))。本發(fā)明涉及含有本文所述的肽或多肽的組合物。這些組合物可以進(jìn)一步包含載體。載體可以是常規(guī)的有機(jī)或無機(jī)載體。載體的實(shí)例包括水、緩沖液、乙醇、丙二醇、聚乙二醇、麻油、玉米油等。本發(fā)明多肽的分離就污染大分子，尤其是其他多肽和多核苷酸來說，本發(fā)明的多肽可以純化到至少約80%純度、至少約90%純度、至少約95%純度、甚至大于95%純度，并且不含傳染性和高熱的物質(zhì)。本發(fā)明的多肽還可以純化到大于99.9%純度的藥學(xué)純態(tài)。在特定制備中，純的多肽基本沒有其他多肽，尤其是其他動(dòng)物源多肽。分級(jí)分離和/或常規(guī)純化方法可以用于從天然源中提純獲得本發(fā)明多肽的制劑，從重組宿主細(xì)胞中提純獲得本發(fā)明的重組多肽以及本發(fā)明的融合多肽。一般地，硫酸銨沉淀以及酸或離液劑提取可用于樣本的分級(jí)分離。示范性的純化步驟可包括羥磷灰石、體積排阻、FPLC和反相高效液相色譜法。適宜的色譜介質(zhì)包括衍生右旋糖酐、瓊脂糖、纖維素、聚丙烯酰胺、特色硅酸鹽等。PEI、DEAE、QAE和Q衍生物是優(yōu)選的。示范性的色譜介質(zhì)包括以苯基、丁基、辛基衍生的那些，如苯基-瓊脂糖凝膠FF(Pharmacia)、Toyopearlbutyl650(TosoHaas,Montgomeryville,Pa.)、辛基-瓊脂糖凝膠(Pharmacia)等；或聚丙烯樹脂，如AmberchromCG71(TosoHaas)等。適宜的固體載體包括玻璃珠、硅基樹脂、纖維素樹脂、瓊脂糖珠、交聯(lián)瓊脂糖珠、聚苯乙烯珠、交聯(lián)聚丙烯酰胺樹脂等，它們?cè)谑褂脳l件下是不溶的。這些載體可用反應(yīng)基團(tuán)修飾，使多肽被氨基、羧基、巰基、羥基和/或碳水化合物基團(tuán)連接起來。偶聯(lián)化學(xué)物質(zhì)的實(shí)例包括溴化氰活化、N-羥基琥珀酰亞胺活化、環(huán)氧活化、巰基活化、酰胼活化、以及碳二亞胺偶聯(lián)化學(xué)物的羧基和氨基衍生物。這些及其他固體媒介是本領(lǐng)域熟知和廣泛使用的，并且可以從商業(yè)供應(yīng)商購得。多肽分離和純化的具體方法的選擇是常規(guī)設(shè)計(jì)方面的問題，并且在某種程度上是由所選載體的性質(zhì)來確定。例如，見AffinityChromatography:Principles&Methods(PharmaciaLKBBiotechnology1988)禾口Doonan，polypeptidePurificationProtocols(TheHumanaPress1996)。本發(fā)明多肽的分離和純化中的額外變化可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員進(jìn)行設(shè)計(jì)。例如，識(shí)別如下所得的本發(fā)明多肽及其片段的特異性抗體，可以用于通過免疫親和純化法來分離大量多肽。[1102]本發(fā)明的多肽還可以通過采用特定屬性來分離。例如，固定化金屬離子吸附(IMAC)色譜可以用于純化富組氨酸的多肽，包括那些含有聚組氨酸標(biāo)記的多肽。簡言之，凝膠首先帶上二價(jià)金屬離子以形成螯合物(Sulkowski,TrendsinBiochem.31(1985))。富組氨酸的多肽會(huì)根據(jù)所用的金屬離子，以不同的親和力吸附到該基質(zhì)上，并且通過競爭性洗脫或使用強(qiáng)螯合劑來洗脫，降低PH。其他純化方法包括用凝集素親和色譜和離子交換色譜法純化糖基化多肽(M.Deutscher,(ed.)，Meth.Enzymol.182=529(1990))在本發(fā)明另外的實(shí)施方式中，可以構(gòu)建所關(guān)注多肽與親和標(biāo)簽(如麥芽糖結(jié)合多肽、免疫球蛋白域)的融合物，以促進(jìn)純化。如上所述，本發(fā)明的多肽及其片段還可以通過化學(xué)合成來制備。本發(fā)明的多肽可以是單體或多聚體；糖基化的或非糖基化的；聚乙二醇化的或非聚乙二醇化的；并且可包括或不包括最初的蛋氨酸氨基酸殘基。本發(fā)明多肽的特異件抗體的牛產(chǎn)本發(fā)明的冰結(jié)合多肽及其片段的抗體可以通過在適宜的宿主生物中將含有本發(fā)明基因的表達(dá)載體所產(chǎn)生的產(chǎn)物作為抗原來獲得，或者通過使用從天然源中分離的或用任意常規(guī)固相合成法合成的本發(fā)明的多肽來獲得，尤其有用的抗體與本發(fā)明的多肽“特異性結(jié)合”。如果抗體表現(xiàn)出以下兩個(gè)性質(zhì)中的至少一個(gè)，則該抗體視為特異性結(jié)合(1)抗體以結(jié)合活性的閾值水平與本發(fā)明的多肽結(jié)合，和(2)抗體與那些和本文以下限定的本發(fā)明多肽相關(guān)的多肽沒有明顯地交叉反應(yīng)。至于第一個(gè)特征，如果抗體結(jié)合多肽、肽或表位的結(jié)合親和度(Ka)為IO6M-1或更高，則抗體為特異性結(jié)合，優(yōu)選ΙΟ、—1或更高，更優(yōu)選IO8M-1或更高，最優(yōu)選ΚΑΤ1或更高。該抗體的結(jié)合親和力可以被本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員很容易地測(cè)定，例如通過Scatchard分析(Scatchard，Ann.NYAcad.Sci.51:660(1949))。至于第二個(gè)特征，例如，在標(biāo)準(zhǔn)的Westernblot分析中，如果抗體檢測(cè)到本發(fā)明的多肽，但沒有檢測(cè)到以相似或相同量加入的已知多肽，則抗體沒有與相關(guān)的多肽分子顯著地交叉反應(yīng)。本發(fā)明的抗體可以利用承載抗原表位的肽或多肽來生產(chǎn)。本發(fā)明的承載抗原表位的肽和多肽優(yōu)選地含有任意SEQIDNO:5至12中包含的至少4個(gè)，或15至約30個(gè)氨基酸序列。然而，包含本發(fā)明氨基端序列中較大部分的肽或多肽，如包含30至50個(gè)氨基酸，或任意長度的達(dá)到及包含本發(fā)明多肽的整個(gè)氨基酸序列，也可以用于誘導(dǎo)與本發(fā)明的多肽相結(jié)合的抗體。人們希望的是，選擇表位承載肽的氨基酸序列，以提供在水性溶劑中的大的溶解性(即，該序列含有相對(duì)親水的殘基，而疏水的殘基優(yōu)選地被消除)。此外，也可能需要含有脯氨酸殘基的氨基酸序列用于抗體生產(chǎn)。例如，可用Jameson-Wolf法識(shí)別(JamesonandWolf,CABIOS4:181，(1988))，按照LASERGENE(DNASTAR;Madison，Wis.)的PROTEAN程序(3.14版)鑒定本發(fā)明多肽的潛在抗原位點(diǎn)。該分析中使用缺省參數(shù)。通過將用于多肽結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的六個(gè)主要子程序相結(jié)合，Jameson-Wolf法預(yù)測(cè)了潛在的抗原決定簇。簡言之，首先，用Hopp-Woods方法(Hoppetal.，Proc.Nat‘1Acad.Sci.USA78:3824(1981))識(shí)別代表最大的局部親水區(qū)域的氨基酸序列(參數(shù)平均7個(gè)殘基)。在第二步，用Emini的方法(Eminietal.，J.Virology55:836(1985))計(jì)算表面概率(參數(shù)表面判定閾值(0.6)=1)。第三，用Karplus-Schultz法(KarplusandSchultz,Naturwissenschaften72=212(1985))預(yù)測(cè)主鏈靈活性(參數(shù)靈活性閾值(0.2)=1)。在分析的第四和第五步中，將二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)應(yīng)用到該數(shù)據(jù)中，用Chou-Fasman法預(yù)測(cè)多肽結(jié)構(gòu)和多肽構(gòu)象的原則(Chou,“PredictionofpolypeptideStructuralClassesfromAminoAcidComposition,"PredictionofpolypeptideStructureandthePrinciplesofpolypeptideConformation,Fasman(ed.),pages549586(PlenumPress1990)禾口Garnier-Robson，Garnieretal.，J.Mol.Biol.12097(1978))(Chou-Fasman#數(shù)構(gòu)象表=64種多肽；α區(qū)閾值=103；β區(qū)閾值=105；Garnier-Robson參數(shù)α和β決定常數(shù)=0)。在第六個(gè)子程序中，將彈性參數(shù)和親水性/溶解可接觸性因素結(jié)合起來以確定表面輪廓值，指定為“抗原指數(shù)”。最后，將峰值擴(kuò)大功能應(yīng)用于該抗原指數(shù)，其擴(kuò)展主要表面峰，使各個(gè)峰值增加20、40、60或80%，以說明相對(duì)內(nèi)部區(qū)域而言，來自表面區(qū)域的移動(dòng)性的額外自由能。然而，該計(jì)算并不適用于任何保留在螺旋區(qū)的主要峰，因?yàn)槁菪齾^(qū)往往不太靈活。針對(duì)重組多肽或從天然源分離的多肽的多克隆抗體可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法制備，例如，見Greenetal.，“ProductionofPolyclonalAntisera,“ImmunochemicalProtocols(Manson,ed.),pagesIto5(HumanaPress1992)禾口Williamsetal.,"ExpressionofforeignpolypeptidesinE.coliusingplasmidvectorsandpurificationofspecificpolyclonalantibodies,“在DNACloning2:ExpressionSystems,2ndEdition,Gloveretal.(eds.),page15(OxfordUniversityPress1995)?？梢酝ㄟ^使用佐劑來增加多肽的免疫原性，如鋁(氫氧化鋁)或Freund's完全或不完全佐劑。用于免疫的多肽還包括融合多肽，例如，本發(fā)明的多肽或其部分與免疫球蛋白多肽，或者與麥芽糖結(jié)合蛋白的融合物。該多肽免疫原可以是全長分子或其部分。如果多肽部分是“半抗原樣”，則這個(gè)部分可有利地接合或連接到用于免疫的大分子載體上(鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)，牛血清白蛋白(BSA)或破傷風(fēng)類毒素)。雖然多克隆抗體典型地出現(xiàn)在動(dòng)物，如馬、牛、狗、雞、大鼠、小鼠、兔、豚鼠、山羊或綿羊中，但特異性針對(duì)本發(fā)明多肽的抗體也可能來源于非人靈長類動(dòng)物抗體。例如，在狒狒中培養(yǎng)對(duì)診斷和治療有用的抗體的通用技術(shù)可以在Goldenbergetal.，國際專利公布No.WO91/11465和Losmanetal。Int.J.Cancer46:310(1990)中找到。此外，可以生成特異性針對(duì)本發(fā)明多肽的單克隆抗體。特異性抗原的鼠類單克隆抗體可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來獲得(例如，見Kohleretal.,Nature256495(1975),Coliganetal.(eds·),CurrentProtocolsinImmunology,Vol.1,pages2.5.12.6.7(Johnffiley&Sons1991)[“Coligan"],Picksleyetal.，〃ProductionofmonoclonalantibodiesagainstpolypeptidesexpressedinE.coli,“在DMCloning2:ExpressionSystems,2ndEdition,Gloveretal.(eds.),page93(OxfordUniversityPress1995))。簡言之，單克隆抗體可以通過以下方法獲得用含有基因產(chǎn)品的組合物注射小鼠，通過抽取血清樣品證實(shí)抗體產(chǎn)品的存在，摘除脾臟以獲得B淋巴細(xì)胞，將該B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合以產(chǎn)生雜交瘤，克隆該雜交瘤，選擇產(chǎn)生抗原抗體的陽性克隆體，培養(yǎng)產(chǎn)生抗原抗體的該克隆體，并從雜交瘤培養(yǎng)物中分離該抗體。另外，特異性針對(duì)本發(fā)明多肽的抗體可來源于人單克隆抗體。人單克隆抗體獲取自轉(zhuǎn)基因小鼠，該小鼠經(jīng)工程設(shè)計(jì)以產(chǎn)生對(duì)抗原激發(fā)作出應(yīng)答的特異性人抗體。在這項(xiàng)技術(shù)中，將人重鏈和輕鏈基因座的元件引入小鼠品系中，該品系來源于含有靶向斷裂的內(nèi)源性重鏈和輕鏈基因座的胚胎干細(xì)胞系。轉(zhuǎn)基因小鼠可以合成特異性針對(duì)人抗原的人抗體，并且該小鼠可以用于生產(chǎn)人類分泌抗體的雜交瘤。從轉(zhuǎn)基因小鼠中獲得人抗體的方法已有描述，例如Greenetal.,NatureGenet.713(1994),Lonbergetal.,Nature368856(1994)和Tayloretal.，Int.Immun.6579(1994)。單克隆抗體可以通過各種完善技術(shù)從雜交瘤培養(yǎng)物中分離和純化。這些分離技術(shù)包括蛋白-A瓊脂糖凝膠的親和色譜法，體積排阻色譜法，和離子交換色譜法(例如，見Coligan,pages2.7.12.7.12禾口pages2.9.12.9.3；Bainesetal.，〃PurificationofImmunoglobulinG(IgG)，“MethodsinMolecularBiology,Vol.10，pages79104(TheHumanaPress，Inc.1992))。對(duì)于具體應(yīng)用來說，可能需要制備特異性針對(duì)本發(fā)明多肽的抗體片段。例如，這種抗體片段可以通過抗體的蛋白酶水解來獲得。抗體片段可以通過常規(guī)方法由胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化整個(gè)抗體來獲得。例如，抗體片段可以通過用胃蛋白酶進(jìn)行抗體的酶裂解來生產(chǎn)，以提供一種表示F(ab'片段。該片段可以進(jìn)一步用巰基還原劑裂解，以生產(chǎn)3.5SFab'單價(jià)片段。可選擇地，該裂解反應(yīng)可以用雙硫鍵裂解產(chǎn)生的硫氫基的保護(hù)基來進(jìn)行。作為替代方案，使用胃蛋白酶的酶裂解直接產(chǎn)生兩個(gè)單價(jià)Fab片段和一個(gè)Fc片段。這些方法已有描述，例如Goldenberg，U.S.Pat.No.4，331，647；Nisonoffetal.，ArchBiochem.Biophys.89230(1960)；Porter,Biochem.J.73119(1959)禾口Edelmanetal.Coligan,二者均見MethodsinEnzymologyVol.1,(AcademicPress1967)。裂解抗體的其他方法，例如分離重鏈以形成單價(jià)輕-重鏈片段，片段的進(jìn)一步裂解，或其他酶、化學(xué)或基因技術(shù)也可使用，只要該片段與完整抗體識(shí)別的抗原相結(jié)合。例如，F(xiàn)v片段包括￥11和八鏈的結(jié)合。該結(jié)合可以是非共價(jià)的，正如Inbaretal.,Proc.Nat'1Acad.Sci.USA69=2659(1972)所述?；蛘?，不同的鏈可以通過分子間二硫鍵連接或通過化學(xué)物質(zhì)如戊二醛連接(例如，見Sandhu，Crit.Rev.Biotech.12:437(1992))。Fv片段可包含由肽接頭連接的V1^Pt鏈。這些單鏈抗原結(jié)合蛋白(scFv)可以通過構(gòu)建包含由寡核苷酸連接的編碼域的DNA序列的結(jié)構(gòu)基因來制備。將該結(jié)構(gòu)基因插入表達(dá)載體，接著將其引入宿主細(xì)胞，如E.coli。該重組宿主細(xì)胞合成單一的多肽鏈，用連接肽橋接這兩個(gè)V域。用于生產(chǎn)scFvs的方法已有描述，例如Whitlowetal.,MethodsACompaniontoMethodsinEnzymology297(1991)(又見，Birdetal.,Science242:423(1988)，Ladner等，美國專利No.4，946，778，Packetal.,Bio/Technology11:1271(1993)和Sandhu,上文)。例如，scFV可以通過在體外將淋巴細(xì)胞暴露于多肽中，并在噬菌體或類似載體中選擇抗體展示庫(如，通過使用固定的或標(biāo)記的多肽或肽)來獲得。編碼有潛在多肽結(jié)合域的多肽的基因可以通過篩選展示在噬菌體(噬菌體展示)或細(xì)菌(如E.coli)上的隨機(jī)肽庫來獲得。編碼該多肽的核苷酸序列可以以多種方式獲得，例如通過隨機(jī)突變和隨機(jī)多核苷酸合成。這些隨機(jī)肽展示庫可用于篩選與已知目標(biāo)相互作用的肽，該目標(biāo)可以是多肽或多肽，例如配體或受體，生物的或合成的大分子，或有機(jī)或無機(jī)物。用于創(chuàng)建和篩選這些隨機(jī)肽展示庫的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的(Ladneretal.，U.S.Pat.No.5，223，409，Ladneretal.,U.S.Pat.No.4,946,778,Ladneretal.,U.S.Pat.No.5,403,484,Ladneretal.,U.S.Pat.No.5,571,698,禾口Kayetal.,PhageDisplayofPeptidesandpolypeptides(AcademicPress,Inc.1996))，并且隨機(jī)肽展示庫和用于篩選這些庫的試劑盒都是商業(yè)可得的，例如購自CLONTECHLaboratories,Inc.(PaloAlto,Calif.),InvitrogenInc.(SanDiego,Calif.),NewEnglandBiolabs,Inc.(Beverly,Mass.)禾口PharmaciaLKBBiotechnologyInc.(Piscataway,N.J.)。隨機(jī)肽展示庫可用本文公開的序列篩選，以識(shí)別與其相結(jié)合的多肽?？贵w片段的另一種形式是編碼單互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的肽。CDR肽(“最小識(shí)別單位”)可以通過構(gòu)建編碼感興趣的抗體⑶R的基因來獲得。例如，這些基因可利用聚合酶鏈反應(yīng)制備，由抗體生成細(xì)胞的RNA合成可變區(qū)(例如，見Larricketal.，MethodsACompaniontoMethodsinEnzymology2106(1991),Courtenay-Luck,"GeneticManipulationofMonoclonalAntibodies,"MonoclonalAntibodiesProduction,EngineeringandClinicalApplication,Ritteretal.(eds.),page166(CambridgeUniversityPress1995)禾口Wardetal.,"GeneticManipulationandExpressionofAntibodies,“在MonoclonalAntibodiesPrinciplesandApplications,Birchetal.,(eds.)，page137(ffiley-Liss,Inc.1995))?；蛘?，特異性針對(duì)本發(fā)明多肽的抗體可來源于“人源化”單克隆抗體。人源化單克隆抗體可以通過將來自小鼠免疫球蛋白的重鏈和輕鏈可變區(qū)的小鼠互補(bǔ)決定區(qū)轉(zhuǎn)入人可變區(qū)來生產(chǎn)。然后人抗體的典型殘基在小鼠對(duì)應(yīng)物的框架區(qū)內(nèi)被取代。來源于人源化單克隆抗體的抗體成分的應(yīng)用排除了與小鼠恒定區(qū)的免疫原性有關(guān)的潛在問題。用于克隆小鼠免疫球蛋白可變域的通用技術(shù)已有描述，例如Orlandietal.,Proc.Nat‘1Acad.Sci.USA86:3833(1989)。用于生產(chǎn)人源化單克隆抗體的技術(shù)已有描述，例如Jonesetal.,Nature321:522(1986)，Carteretal.,Proc.Nat‘1Acad.Sci.USA89:4285(1992),Sandhu,Crit.Rev.Biotech.12437(1992),Singeretal.，J.Immun.1502844(1993),Sudhir(ed.),AntibodyEngineeringProtocols(HumanaPress,Inc.1995)，Kelley,"EngineeringTherapeuticAntibodies,"polypeptideEngineeringPrinciplesandPractice,Clelandetal.(eds.),pages399434(JohnWiley&Sons，Inc.1996)以及Queenetal.，U.S.Pat.No.5，693，762(1997)。通過采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，用特異性針對(duì)本發(fā)明多肽的抗體或抗體片段免疫動(dòng)物，可以制備多克隆抗獨(dú)特型抗體。例如，見Greenetal.，“ProductionofPolyclonalAntisera,“MethodsInMolecularBiologyImmunochemicalProtocols,Manson(ed.),pages1-12(HumanaPress1992)。又見Coligan，pages241-247?；蛘撸瑔慰寺】躬?dú)特型抗體可以用特異性針對(duì)本發(fā)明多肽的抗體或抗體片段作為免疫源，用如上所述的技術(shù)來制備。另一種替代方案，可以用上述技術(shù)制備人源化抗獨(dú)特型抗體或非人靈長類動(dòng)物抗獨(dú)特型抗體。用于生產(chǎn)抗獨(dú)特型抗體的方法已有描述，例如Irie,U.S.Pat.No.5,208,146，Greene,et.al.,U.S.Pat.No.5,637,677禾口VarthakaviandMinocha,J.Gen.Virol.771875(1996)。宿主細(xì)胞及其相關(guān)用途含有本發(fā)明多肽的宿主細(xì)胞可以舉例為動(dòng)物細(xì)胞、哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、魚細(xì)胞、真菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞和植物細(xì)胞。天然的或合成的編碼本發(fā)明抗凍多肽的核酸片段可并入多核苷酸結(jié)構(gòu)中，該結(jié)構(gòu)能夠引入最終的靶向表達(dá)細(xì)胞中和/或在最終的靶向表達(dá)細(xì)胞中表達(dá)。通常，該多核苷酸構(gòu)建體適合在單細(xì)胞或多細(xì)胞宿主(例如酵母或細(xì)菌)中復(fù)制，但也可用于引入和整合在培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物或其他真核細(xì)胞系的基因組中，尤其是植物。制備的用于引入細(xì)菌或酵母的多核苷酸構(gòu)建體包括被宿主識(shí)別的復(fù)制體系，編碼所需要的抗凍多肽產(chǎn)物的多核苷酸片段，與編碼抗凍多肽的多核苷酸序列的5'端相連的轉(zhuǎn)錄及翻譯起始調(diào)控序列，以及與該序列的3'端相連的轉(zhuǎn)錄及翻譯終止調(diào)控序列。轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列包括被宿主識(shí)別的異源啟動(dòng)子。方便地，可采用現(xiàn)成可用的表達(dá)載體，其包含復(fù)制體系、轉(zhuǎn)錄及翻譯調(diào)控序列、以及抗凍多肽編碼序列的插入位點(diǎn)。該基因?qū)我獾暮锌箖龆嚯牡木幋a序列的多核苷酸片段。通常，該基因包含所述編碼序列加上上游和下游相關(guān)序列，尤其是任意的增強(qiáng)子、啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)或轉(zhuǎn)錄起始標(biāo)記。下游片段對(duì)信息聚腺苷酸化和處理而言也可能很重要，因此在通常情況下都考慮在內(nèi)。將基因引入細(xì)胞或細(xì)胞組中進(jìn)行表達(dá)是通常將多肽引到關(guān)注的樣本內(nèi)的另一種方法。轉(zhuǎn)化的終產(chǎn)物也應(yīng)納入作為本發(fā)明的產(chǎn)物，并且術(shù)語“轉(zhuǎn)化細(xì)胞”包括實(shí)際轉(zhuǎn)化的細(xì)胞以及該細(xì)胞的所有子代。在典型的情況下，最終生物包含的每個(gè)細(xì)胞中都含有該基因。標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)化程序適用于細(xì)菌(Maniatis)、真菌(Shermanetal.(1986)，在LaboratoryCourseManualforMethodsinYeastGeneticsCSH)、才直·(vandenElzenetal.(1985)PlantMol.Biol.，5:149-154)和動(dòng)物(Hanahan，(1988)Ann.Rev.Genetics,22:479_519)。酵母和真菌宿主細(xì)胞適用于本發(fā)明的酵母宿主細(xì)胞的非限制性實(shí)例包括來自酵母菌科家族的酵母，包括Saccharomyces和Candida屬的成員。優(yōu)選的實(shí)例包括但不限于脆壁#母(Saccharomycesfragilis)>IIM##(Saccharomycescervisae)>ILSl##(Saccharomyceslactis)、{為胃(Candidapseudotropicalis)。MM.細(xì)菌細(xì)胞可用作本發(fā)明的宿主細(xì)胞，用于生產(chǎn)本發(fā)明的多肽。細(xì)菌，如乳酸桿菌以及許多酵母菌和霉菌，在發(fā)酵食品，如奶酪、醬菜、醬油、泡菜、醋、酒和酸奶的制備中已經(jīng)使用了幾千年。本發(fā)明的抗凍多肽可用于保持制備那些食品所用的微生物的生存能力，并用于制備益生元和益生菌食用組合物，包括動(dòng)物飼料組合物和供人類消費(fèi)的食品。與本發(fā)明相關(guān)且適合作為本發(fā)明宿主細(xì)胞的優(yōu)選的細(xì)菌實(shí)例有大腸桿菌(Escherichiacoli)、乳月旨鏈球菌(Streptococcuscremoris)>乳酸鏈球菌(Streptococcuslactis)、嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)、梓膠鏈球菌(Leuconostoccitrovorum)、腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)、乳酸乳桿菌(Lactobacilluslactis)、保加利亞乳桿菌(Lactobacillusbulgaricus)、兩歧雙歧桿菌(Bifidobacteriumbifidum)、短雙歧桿菌(Bifidobacteriumbreve)、德氏乳酸桿菌屬保加利亞乳酸桿菌(Lactobacillusdelbrueckiissp.bulgaricus)、嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)、嗜酸乳桿菌61(Lactobacillusacidophilus)、雙歧桿菌(Bifidobacteria)、干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)、干酪乳桿菌(Lactobacillus,casei)和長雙歧桿菌(Bifidobacteriumlongum)。細(xì)菌還可以作為殺蟲劑的替代品用在生物蟲害控制計(jì)劃中。本發(fā)明在一種實(shí)施方式中尤其適用于這種用途，并且提供含有本發(fā)明多肽及產(chǎn)生本發(fā)明多肽的重組微生物，其能夠用作環(huán)保的生物殺蟲劑。一個(gè)實(shí)例是蘇云金桿菌(Bacillusthuringiensis)，一種革蘭氏陽性土壤細(xì)菌。適合本發(fā)明使用的細(xì)菌宿主細(xì)胞的進(jìn)一步非限制性的實(shí)例包括革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌。優(yōu)選的細(xì)菌細(xì)胞也可以選自革蘭氏陽性球菌、革蘭氏陽性桿菌、革蘭氏陰性球菌和革蘭氏陰性桿菌。適合本發(fā)明使用的細(xì)菌宿主細(xì)胞的實(shí)例包括但不限于選自以下屬的細(xì)菌Acaricomes、Acetitomaculum、Acetivibrio、AcetobacterΛAcetobacterium、AcetobacteroidesλAcetohalobium、Acetomicrobium、AcetomonasΛAcetonemaΛAchromobacterλAcidaminobacter、Acidaminococcus、Acidicaldus、AcidimicrobiumΛAcidiphilium、Acidithiobaci1IusΛAcidobacterium、Acidocaldus、Acidocella、Acidomonas、Acidovorax、Acinetobacter、Acrocarpospora、ActinacidiphiIusΛActinoacidiphiIusλActinoalIoteichus、Actinobaci1IusΛActinobaculum、Actinobifida、Actinobispora、Actinocatenispora、Actinocorallia、Actinokineospora、Actinomadura、Actinomyces、Actinoplanes、Actinopolyspora、Actinopycnidium、Actinospica、Actinosporangium、Actinostreptospora、ActinosynnemaΛActinotalea、Actinotelluria、Adhaeribacter、Aequorivita、Aerobacter、AerococcusΛAerococcus-IikeOrganism、Aeromicrobium、AeromonasΛAestuariibacter、Afipia、Agarbacterium、Aggregatibacter、Agitococcus、Agreia、Agrobacterium、Agrococcus、Agromonas、Agromyces、Ahrensia、Albidovulum、Alcaligenes、Alcanivorax、AlgibacterΛAlgicola、Algoriphagus、Alicycliphilus、Alicyclobacillus、Alishewanella、Alistipes、Alkalibacillus、AlkalibacterΛAlkalibacterium、Alkalilimnicola、Alkalispirillum、Alkanindiges、Allisonella、Allobaculum、Allochromatium、Allofustis、Alteromonas、Alysiella、AminobacterΛAminobacterium、Aminomonas、AmmonifθΧλAmmoniphiIusλAmoebobacter、Amorphosporangium、Amphibacillus、Ampullariella、Amycolata、Amycolatopsis、Anaeroarcus、Anaerobacter、Anaerobaculum、Anaerobiospiri1lum、Anaerobranca、Anaerocellum、Anaerococcus、Anaerofilum、Anaerofustis、Anaerolinea、Anaeromusa、AnaerophagaΛAnaeroplasmaΛAnaerosinus、Anaerostipes、Anaerotruncus、Anaerovibrio、Anaerovirgula、Anaerovorax、AncalomicrobiumλAncylobacterΛAneurinibacilIusΛAngiococcus、AngulomicrobiumΛAnoxybacillus、Antarctobacter、AquabacterΛAquabacterium、Aquamicrobium、Aquaspiri1lum、Aquicella、Aquifex、Aquiflexum、Aquimarina、Aquimonas、ArcanobacteriumλArchangium、Arcicella、Arcobacter、Arenibacter、ArhodomonasΛArizona、Arsenicicoccus、Arsenophonus、Arthrobacter、Asanoa、Asiosporangium、Asticcacaulis、Astrosporangium、Atopobium、Atopococcus、Atopostipes、Aurantimonas、AureobacteriumλAvibacterium、Axonoporis、Azoarcus、AzohydromonasΛAzomonasΛAzorhizobium、Azorhizophilus、Azospira、Azospirillum、AzotobacterBacillus、BacteriovoraxλBacterium、Bacteroides、Balnearium、Balneatrix、Barnesiella、Bartonella、Bdellovibrio、Beggiatoa、Beijerinckia、Belliella、Belnapia、Beneckea、Bergeriella、Betabacterium、Beutenbergia、Bifidobacterium、Bilophila、Blastobacter、Blastochloris、Blastococcus、BlastomonasΛBlastopirellula、Bogoriella、Bordete11a、Borrelia、Bosea、Brachybacterium、Brachymonas、Brachyspira、Brackie1la、Bradyrhizobium、Branhame11a、Brenneria、BrevibacilIus、Brevibacterium、Brevigemma、BrevundimonasΛBrochothrix、Brucella、Bryantella、Budvicia、Bulleidia、Burkholderia、Buttiauxella、Butyribacterium、ButyrivibrioΛByssovorax、CaenibacteriumλCaldanaerobacter、Caldicellulosiruptor、Caldilinea、Caldithrix、Caldocellum、CaloramatorΛCaloranaerobacter、Caminibacillus、Caminibacter、Caminicella、Campylobacter、Capnocytophaga、Carbophilus、Carboxydocella、Carboxydothermus、Cardiobacterium、Carnobacterium、Caryophanon、CaseobacterΛCastellaniella、CatScratchDiseaseBacillus、Catellatospor已、CatellibacterυπΛCatellicoccus、Catenibacterium、Catenococcus、Catenulispora、CatenuloplanesΛCatenulospora、Caulobacter、CdcEntericGroup36/37、CdcGroupVd、Cedecea、Cellulomonas、Cellulophaga、Cellulosimicrobium、Cellvibrio、Centipeda、Cerasibaci1IusΛChainia、ChelatobacterΛChelatococcus、ChitinibacterΛChitinimonas、Chitinophaga、Chlorobaculum、Chlorobium、Chloroflexus、Chondrococcus、Chondromyces、Chromatium、Chromobacterium、Chromohalobacter、ChryseobacteriumλChryseomonas、Chrysiogenes、Citreicella、Citricoccus、Citrobacter、Clavibacter、Clavisporangium、CloGroupType2、Clostridium、Cobetia、Cohnella、Col1imonasΛCollinsella、Colwellia、ComamonasΛConchiformibiusΛConexibacterλCoprothermobacterΛCorallococcus、Coriobacterium、CorynebacteriumΛCouchioplanes、Crossiella、Cryobacterium、CryptanaerobacterΛCryptobacteriumΛCryptosporangium、Cupriavidus、Curtobacterium、CurvibacterΛCyclobacterium、CystobacterλCytophaga、Dactylosporangium、Dechloromonas、Dechlorosoma、Deefgea、DeferribacterλDefluvibacterΛDehalobacterΛDehalospirilIumΛDeinococcus、Deleya、Delftia、Demetria、Dendrosporobacter、Denitrovibrio、Dermabacter、Dermacoccus、Dermatophilus、Derxia、Desemzia、Desulfacinum、Desulfarculus、Desulfatibacillum、Desu1fitobacterium、Desu1foarcu1us、Desu1fobacca、Desulfobacter、DesulfobacteriumλDesulfobacula、Desulfobulbus、Desulfocapsa、Desulfocella、Desulfococcus、Desulfofaba、Desulfofrigus、Desulfofustis、Desulfohalobium、DesulfomicrobiumλDesulfomonile、DesulfonatronovibrioΛDesulfonatronum、DesulfonauticusλDesulfonema、Desulfonispora、Desulfopila、Desulforegula、Desulforhabdus、Desulforhopalus、Desulfosarcina、Desulfospira、Desulfosporosinus、Desulfotalea、Desulfothermus、Desulfotignum、Desulfotomaculum、Desulfovermicuius、Desulfovibrio、DesulfovirgaΛDesulfovirgula、Desulfurella、DesulfurobacteriumΛDesulfuromonasλDesulfuromusa、Dethiosulfovibrio、Devosia、Dialister、DiaphorobacterλDichelobacterΛDichotomicrobium、Dickeya、Dictyoglomus、Dietzia、Diplococcus、Dokdoa、Dokdonella、Dokdonia、Dolosicoccus、Donghaeana、Dorea、Duganella、Dyadobacter、Dyella、Eberthella、Ectothiorhodospira、Edwardsiella、Eggerthella、Eikenella、Elizabethkingia、Elytrosporangium、Empedobacter、Enhygromyxa、EnsiferΛEnterobacterΛEnterococcus、Enterovibrio、Epilithonimonas、EremococcusλErwinia、Erysipelothrix、Erythrobacter、Erythromicrobium、Escherichia、Ethano1igenens、Eubacterium、Ewingella、Exce11οspora、ExiguobacteriumλΛFaecalibacterium、Faenia、Falcivibrio、Fastidiosipila、FerribacterλFerrimonas、Ferrobacillus、Fervidobacterium、FilibacterΛFilifactorΛFilobaci1Ius、FiIomicrobium、Finego1dia、Flammeovirga、Flavimonas、Flavobacterium、Flectobacillus、FlexibacterΛFlexistipes、Flexithrix、FluoribacterΛFluviicola、Formivibrio、Francisella、Frankia、Frateuria、FriedmanniellaΛFrigoribacterium、Fulvimarina、Fulvimonas、Fusibacter、Fusobacterium、Gaetbulibacter、Gaffkya、Gal1ibacterium、Gallicola、Garciella、Gardnerella、Gariaella、Gelidibacter、Gemella、Gemmata、Gemmatimonas、GemmobacterΛGeoalkalibacterΛGeobacillus、GeobacterλGeodermatophiIusΛGeopsychrobacter、Georgenia、Geosinus、Geospirillum、Geothermobacter、Geothrix、Geovibrio、Giesbergeria、Gillisia、Glaciecola、Globicatella、GluconacetobacterΛGluconoacetobacterΛGluconobacterΛGlycomyces、Goodfellowia、Gordona、Gordonia、GracilibacilIusΛGracilibacterΛGranulicatella、GranulobacterλGrimontia、GroupIiD、Guggenheimella、GulosibacterΛHaemophilus、Hafnia、Hahella、HalanaerobacterΛHalanaerobium、Haliangium、Haliscomenobacter、Haloactinomyces、Haloanaerobacter、Haloanaerobium、Halobacillus、Halobacteroides、Haloce11a、Halochromatium、Halococcus、HalolactibacilIus、Halomonas、Halonatronum、HalorhodospiraλHalothermothrixΛHalothiobacilIusΛHelcococcus、Helicobacter、Heliobacillus、Heliobacterium、Heliophilum、Heliorestis、Herbaspiri1lum、Herbidospora、Herminiimonas、Herpetosiphon、Hespellia、Hippea、Hirschia、Hoeflea、Holdemania、HolophagaΛHongiella、Hordeomyces、Hyalangium、Hydrocarboniphaga、Hydrogenivirga、HydrogenobacterΛHydrogenobaculumΛHydrogenomonas、HydrogenophagaλHydrogenophiIus、HydrogenothermophiIus、HydrogenothermusΛHydrogenovibrioλHylemonella、Hymenobacter、HyphomicrobiumΛHyphomonasΛI(xiàn)diomarina、Ignatzschineria、Ignavigranum、IlyobacterΛI(xiàn)nflabilis、Inquilinus、IntrasporangiumλIodobacter、Isobaculum、Isochromatium、Isoptericola、Jahnia、JanibacterΛJannaschia、JanthinobacteriumΛJensenia、Jeotgalibaci1Ius、Jeotgalicoccus、Jiangella、Jonesia、、Kangiella、Kerstersia、KibdelIosporangiumΛKibdelosporangiumλKineococcus、KineosphaeraΛKineosporia、Kingella、Kitasatoa、Kitasatospora、Kitasatosporia、Klebsiella、Kluyvera、Knoellia、Kocuria、Kofleria、Koserella、Kozakia、Kribbella、Ktedobacter、Ktedonobacter、Kurthia、Kutzneria、Kytococcus、Labrys、Laceyella、Lachnobacterium、Lachnospira、Lactobacillus、Lactobacterium、Lactococcus、Lactonifactor、Lamprocystis、Lampropedia、Laribacter、Lautropia、Leadbe11ere11a、Lebetimonas、Lecheva1ieria、Leclercia、Leeuwenhoekiella、Legionella、Leifsonia、Leisingera、Leminorella、Lentibacillus、Lentzea、Leptospirillum、Leptothrix、Leptotrichia、Leucobacter、Leuconostoc、Leucothrix、Levilinea、Levinea、Limnobacter、List、Listeria、Listone11a、Loktane11a、Lonepinella、Longispora、Lophomonas、Luteibacter、Luteimonas、Luteococcus、LysobacterλMacrococcusΛMacromonasΛMagnetospiri1lum、Mahella、Malikia、MalonomonasλManjusharmella、Mannheimia、MaribacterΛMaricaulis、Marichromatium、Marinibacillus、Marinilabilia、MarinilactibacilIusΛMarinithermus、MarinitogaΛMarinobacter、Marinobacterium、Marinococcus、Marinomonas、Marinospiri1lum、Marinovum、Marmoricola、Massilia、Mechercharimyces、MechercharomycesΛMegamonasΛMegasphaera、Meiothermus、Melittangium、Mesonia、Mesophilobacter、Mesorhizobium、MethanomonasλMethylobacilIusΛMethylobacter、Methylobacterium、Methylocapsa、Methylocella、Methylocystis、Methylomicrobium、Methylomonas、Methylophaga、Methylophilus、Methylopila、Methylosarcina、Methylotenera、Methylovorus、Microbacterium、Microbispora、Microbulbifer、Microce11a、Micrococcus、MicrocycIus、MicroechinosporaλMicroellobosporia、Microlunatus、Micromonas、Micromonospora、MicropolysporaλMicropruina、Microscilla、Microstreptospora、Microtetraspora、Microvirgula、Millisia、Mima、Mitsuokella、Mobiluncus、Modestobacter、Moellerella、Mogibacterium、Moorella、Moraxella、Moraxella(Branhamella)、Moraxella(Moraxella)、Morganella、Moritella、Muricauda、MuricoccusΛMyceligeneransλMycetocola、Mycobacterium、Mycoplana、Myroides、MyxobacterΛMyxococcus、、Nakamurella、Nannocystis、Natroniella、Natronincola、Nautilia、Naxibacter、Neisseria、Nereida、Nesterenkonia、Nevskia、NicoIete11a、NihGroup12、Nitratifractor、NitratireductorΛNitratiruptor、NitrobacterΛNocardia、Nocardioides、Nocardiopsis、Nonomuraea、Novosphingobium、Obesumbacterium、Oceanibulbus、Oceanicau1is、Oceanicola、OceanimonasΛOceanithermus、Oceanobacillus、Oceanobacter、Oceanomonas、Oceanospiri1lum、Ochrobactrum、Octadecabacter、Odontomyces、Oenococcus、Oerskovia、OleiphilusΛOleispira、Oligella、Oligotropha、Olsenella、Opitutus、Orenia、Oribacterium、OrnithinicoccusΛOrnithinimicrobiumλOrnithobacteriumΛOryzihumus、OttoWia、Oxalicibacterium、OxalobacterλOxalophagus、OxobacterΛPaenibacillus、PaludibacterΛPandoraea、PannonibacterλPantoe已、Papi11ibacterΛParabacteroides、ParacoccusΛParacoIobactrumλParalactobaci1IusΛiob&ci1Ius、P&r&sc&rdovi&、ParasporobacteriumλParvibaculum、Parvimonas、ParvopolysporaΛPasteurella、Pasteuri已、PatulibacterΛPaucibacterΛPaucimonas、PaucisalibacilIusΛPectinatus、PectobacteriumλPediococcus、Pedobacter、Pelczaria、PelobacterΛPelodictyon、Pelomonas、Pelosinus、Pelospora、Pelotomaculum、Peptococcus、Peptoniphilus、PeptostreptococcusλPeredibacter、Persephonella、PersicivirgaΛPersicobacter、Petrimonas、Petrobacter、Petrotoga、Phaeobacter、Phaeοspiri11um、Phascolarctobacterium、Phenylobacterium、Phocoenobacter、Photobacterium、Photorhabdus、Phy1lobacterium、Phytomonas、Pigmentiphaga、Pilimelia、Pimelobacter、Pirellula、Planctomyces、Planifilum、PlanobisporaΛPlanococcus、Planomicrobium、Planomonospora、Planosporangium、Planotetraspora、PlantibacterΛPleomorphomonas、Plesiocystis、Plesiomonas、Podangium、Polaribacter、Polaromonas、Polyangium、PolymorphosporaλPontibaci1IusΛPorphyrobacter、Porphyromonas、Pragia、Prauserella、Prevotella、Proactinomyces、Promicromonospora、PromyxobacteriumΛPropionibacterium、Propionicimonas、PropioniferaxΛPropionigenium、Propionimicrobium、Propionispira、Propionispora、Propionivibrio、Prosthecobacter、ProsthecochlorisλProsthecomicrobium、Protaminobacter、polyPeptideiphilum、Proteus、Providencia、Pseudaminobacter、PseudoalteromonasΛPseudoamycoIataΛPseudobutyrivibrio、Pseudoclavibacter、PseudomonasΛPseudonocardiaΛPseudoramibacter、Pseudorhodobacter、Pseudospiri1lum、Pseudoxanthomonas、Psychrobacter、Psychroflexus、PsychromonasΛPsychroserpensΛPullulanibacilIusΛPusillimonas、Pyxicoccus、QuadrisphaeraRahnella、Ralstonia、Ramibacterium、RamiibacterλRaoultella、RarobacterΛRathayibacter、Reinekea、Renibacterium、RenobacterλRhabdochromatium、Rheinheimera、RhizobacterΛRhizobium、Rhizomonas、Rhodanobacter、Rhodobacter、Rhodobium、Rhodoblastus、Rhodocista、Rhodococcus、Rhodocyclus、RhodoferaxΛRhodomicrobiumΛRhodonellum、Rhodopila、Rhodopirellula、Rhodoplanes、RhodopseudomonasΛRhodospirillum、RhodothalassiumΛRhodothermusΛRhodovibrio、Rhodovulum、Riemerella、Rikenella、Robiginitalea、Roseateles、Roseburia、Roseiflexus、Roseinatronobacter、RoseobacterΛRoseococcus、Roseospira、Roseospirillum、Roseovarius、Rothia、Rubritepida、RubrivivaxΛRubrobacterΛRuegeria、Ruminobacter、Ruminococcus、Runella、、SaccharibacterΛSaccharococcusΛSaccharomonosporaλSaccharophagusΛSaccharopolyspor已、Saccharothrix、Sagittul已、Salana、SalegentibacterλSalinibacterλSalinibacteriumλSalinicoccus、Salinimonas、Salinispora、Salinivibrio、Salinospora、Salipiger、Salmonella、Samsonia、Sanguibacter、Saprospir已、Sarcin已、Sarraceniospor已、Scardovi已、Schlegelel1已、Schwartzia、Sebekia、SedimentibacterΛSedimenticola、Segniliparus、Seinonella、Sejongia、Selenomonas、Seliberia、Serinicoccus、Serratia、Shewanella、Shigella、Shinella、ShuttleworthiaΛSilanimonas、Silvimonas、Simonsiella、Simplicispira、Simsoniella、Sinococcus、Sinorhizobium、Skermania、Slackia、SmaragdicoccusΛSmithella、SodalisΛSoehngenia、Sorangium、Sphaerobacter、Sphaerophorus、SphaerosporangiumλSphaerotilus、SphingobacteriumΛSphingobium、Sphingomonas、Sphingopyxis、Sphingosinicella、Spirilliplanes、Spirillospora、Spirillum、Spirochaeta、Spirosoma、Sporacetigenium、Sporanaerobacter、Sporichthya、SporobacterλSporobacteriumΛSporocytophagaΛSporohalobacterΛSporolactobaci1IusΛSporomusa、Sporosarcina、Sporotalea、SporotomaculumΛStackebrandtia、Staleya、StaphylococcusλStappia、Starkeya、Stella、StenotrophomonasΛSterolibacteriumΛStigmatella、StreptacidiphiIusΛStreptimonospora、Streptoallomorpha、StreptoalloteichusλStreptobaci1Ius、Streptobacterium、Streptococcus、StreptomonosporaλStreptomyces、Streptomycetοides、Streptomycoides、StreptosporangiumλStreptovertici11ium、Subdo1igranulum、Subtercola、Succiniclasticum、Succinimonas、Succinispira、Succinivibrio、Sulfitobacter、Su1fobaci11us、Su1furicurvum、Sulfurihydrogenibium、Su1furimonas、SulfurospiriIlumλSutterella、Suttonella、Syntrophobacter、SyntrophobotulusΛSyntrophococcusλSyntrophomonasΛSyntrophothermusΛSyntrophus、、Tatlockia、Tatumella、TaxeobacterΛTaylorella、Teichococcus、Telluria、Tenacibaculum、TepidanaerobacterλTepidibacter、Tepidimicrobium、Tepidimonas、Tepidiphilus、Terasakiella、TerrabacterΛTerracoccus、Terribacillus、Terrimonas、Tessaracoccus、Tetragenococcus、Tetrasphaera、Tetrathiobacter、Thalassobacillus、Thalassobacter、Thalassobius、Thalassolituus、Th&l&ssomon&s、ThalassospiraΛThauera、ThaxteraΛThermacetogenium、Thermaerobacter、Thermanaeromonas、Thermanaerovibrio、Thermicanus、Thermincola、Thermithiobaci11us、Thermoactinomyces、ThermoanaerobacterλThermoanaerobacteriumΛThermoanaerobium、Thermoanaerolinea、ThermobacteriumλThermobacteroides、Thermobifida、Thermobispora、Thermobrachium、Thermochromatium、ThermocrinisΛThermocrispum、Thermodesulfatator、Thermodesulfobacterium、Thermodesulfobium、Thermodesulforhabdus、ThermodesulfovibrioλThermoflavimicrobiumλThermohydrogenium、Thermolithobacter、ThermomicrobiumλThermomonas、ThermomonosporaΛThermonema、ThermonosporaΛThermopolyspora、Thermosediminibacter、Thermosiculum、Thermosinus、Thermosipho、Thermosyntropha、Thermotoga、Thermovenabulum、Thermovibrio、Thermovirga、Thermus、Thetysia、Thialkalimicrobium、Thialkalivibrio、ThioalkalimicrobiumΛThioalkalivibrioλThiobaca、Thiobacius、ThiobacterΛThiocapsa、Thiococcus、Thiocystis、Thiodictyon、Thiohalocapsa、Thiolamprovum、Thiomicrospira、ThiomonasΛThiopedia、Thioreductor、Thiorhodoccocus、ThiorhodococcusΛThiorhodovibrioΛThiosphaera、Thiothrix、Thorsellia、Tindallia、Tissierella、TolumonasΛTrabulsiella、Treponema、Trichococcus、TrichotomosporaΛTruepera、Tsukamurella、Tuberibaci1IusΛTuricella、Turicibacter、、Unclassified、Ureibaci1Ius、Uruburuella、、Vagococcus、Varibaculum、VariovoraxΛVeillonella、Verrucomicrobium、Verrucosispora、Vibrio、Victivallis、Virgibacillus、Virgisporangium、Vitreoscilia、Vogesella、Volcaniella、Volucribacter、Vulcanibacillus、Vulcanithermus、、Waksmania、Wautersia、Weeksella、Weissella、Williamsia、Wolinella、Woodsholea、Xanthobacter、Xanthomonas、XenophiIus、Xenorhabdus、Xylanibacter、Xylanibacterium、XylanimicrobiumλXylanimonas、Xylella、Xylophilus、Yania、Yersinia、Yokenella、、Zavarzinia、Zimmermannella、Zobellia、Zoogloea、Zooshikella、ZymobacterΛZymobacterium、Zymomonas以及Zymophilus0[1138]含有本發(fā)明多肽的棺物67[1139]當(dāng)氣候條件不是作物生產(chǎn)的最佳條件時(shí)，本發(fā)明的多核苷酸和多肽在植物宿主細(xì)胞和其他轉(zhuǎn)基因生物中的應(yīng)用可以防止有價(jià)值的作物的損失。具體地，本發(fā)明提供新穎和創(chuàng)新的轉(zhuǎn)基因植物和作物，它們能夠經(jīng)受現(xiàn)有植物和作物難以忍受的氣候條件。本發(fā)明的包含多核苷酸并生產(chǎn)本發(fā)明的多肽的植物宿主細(xì)胞形式的作物實(shí)例是葡萄、油籽植物、如油菜籽、谷物(燕麥、大麥、黑麥等)，柑橘類水果和甘蔗。本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明多肽的轉(zhuǎn)基因水果和蔬菜。含有本發(fā)明多肽的轉(zhuǎn)基因水果和蔬菜能夠經(jīng)受更低的溫度，比如在儲(chǔ)存和/或運(yùn)輸期間。實(shí)例包括草莓、藍(lán)莓、覆盆子、柑橘類水果、香蕉、葡萄、獼猴桃、桃子、菠蘿、李子、櫻桃、西紅柿和芒果。含有本發(fā)明多肽的花本發(fā)明涉及的冷凍花包括郁金香、玫瑰、百合等。魚適用于本發(fā)明的魚的實(shí)例為長鰭金槍魚(Thurmusalalunga)、劍齒鰈魚(Atheresthesstomias)、大西洋鱈魚(Gadusmorhua)、大西洋刀魚(Trichiuruslepturus)、大西洋鮭魚(Salmosalar)、大西洋狼魚(Anarhichaslupus)、多須石首魚(Pogoniascromis)、烏魚昌(Parastromateusniger)、漂脊t匕目魚(Sole，Pleuronectesamericanus)ΛSftfS(Carcharhinuslimbatus)、Itfe(Ictalurusfurcatus)ΛMfi(Callinectessapidus)、^fe(Makairanigricans)Λ胃fe(Sebastesauriculatus)Λ可月豕(Sphoeroidesannulatus)、舍由fe(Scorpaenaguttata)、倉盧(Semicossyphuspulcher)、巖魚(Sebastespinniger)、鋼魚(Lutjanuspurpureus)、！t魚(Ictaluruspunctatus)、巖魚(Sebastesgoodei，Sebastesnebulosus)、奇努克(Oncorhynchustshawytscha)、魚青魚(Scomberjaponicas)、銀Ii魚(銀，中紅)(Oncorhynchuskisutch)、長尾·(Alopiasvulpinus)、石斑魚(Epinephelusfulva)、單鰭鍾(Brosmebrosme)、鎮(zhèn)嫩魚(Coryphaenahippurus)、鰨魚(Microstomuspacificus)、鰨魚(Pleuronectesvetulus)、玉梭魚(Lepidocybiumflavobrunneum)、海魚方(Zeusfaber)、大洋倉盧(Sebastesnorvegicus)、鋼魚(Lutianusgriseus)、觸魚(t匕目魚)(Glyptocephaluscynoglossus)、梭魚(Sphyraenabarracuda)、漂線鍾(Melanogrammusaeglefinus)、金槍魚(Euthynnusaffinis)、H魚(Lutjanussynagris)、蛇If(Ophiodonelongates)、遮巨魚(Chanoschanos)、羅非魚(Tilapiamossambica)、尼羅羅非魚(Tilapianilotica)、河豚(Sphoeroidesmaculates)、方頭魚(Caulolatilusprinceps)、油魚(Ruvettuspretiosus)、禮連鰭鮭(Hoplostethusatlanticus)、梭魚(Sphyraenaargentea)、松魚(Sardachiliensis)、鍾魚(太平洋鍾，Gadusmacrocephalus)、杰克魚(Caranxcaninus)、杰克魚(Seleneperuviana)、大洋S盧(Sebastesalutus)、魚青魚(Scomberscombrus)、馬較魚(Scomberomorussierra)、鋼魚(Lutjanusperu)、巴塔哥尼亞齒魚(Dissostichuseleginoides)、鰨魚(比目魚，Eopsettajordanl)、粉紅鮭(弓背)、(Oncorhynchusgorbuscha)、青鱈(Pollachiusvirens)、巖魚(Sebastesmaliger)、鱒魚、虹鱒(鋼頭)(Oncorhynchusmykiss)、紅鼓魚(雄鮭)(Sciaenopsocellatus)、棘霞魚(Chrysophrysauratus)、H魚(Lutjanuscampechanus)、巖魚(Sebastesproriger)、翅魚(t匕目魚，Errexzachirus)、笛H(Lutjanusapodus)、紅倉盧(Archosargusprobatocephalus)、S魚、灰魚青g(Isurusoxyrinchus)、H魚(Lutjanusvivanus)λ^P(Pampusargenteus)Λ68巖魚(Sebastesbrevispinis)、醒魚(Katsuwonuspelamis)、剌足魚(Siganusjavus)、白花魚或石首魚(Roncadorstearnsi)、t匕目魚(Platichthysstellatus)、槍魚(Tetrapturusaudax)、S盧魚(Moronechrysopsχsaxatilis)、方萁魚(Xiphiasgladius)、鯉魚(Barbodesschwanefeldl)、青鱈(阿拉斯力口青鱈，Theragrachalcogramma)、海鱈(Urophycistenuis)、巖魚(Sebastesentomelas)、比目魚(Scophthalmusaquosus)、石首魚(黃魚、Pseudosciaenamanchurica)、巖魚(Sebastesruberrimus)、金槍魚(Thunnusalbacores)、黃條紋餘(Selaroidesleptolepis)、黃尾魚(Seriolalalandel)、比目魚(Limandaferruginea)、巖魚(Sebastesflavidus)禾口鯛魚(Ocyuruschrysurus)、紅點(diǎn)鮭(Salvelinusalpines)、多寶魚、格林蘭鰈(Reinhartdiushippoglossoides)、大比目魚(Hippoglossushippoglossus)0冷凍的食品和食用產(chǎn)品冷凍食品(包括冷凍蔬菜)的再結(jié)晶導(dǎo)致這類食品的口味和質(zhì)地變差。本發(fā)明的抗凍多肽可以用于處理冷凍食品或待冷凍的食品，以防止發(fā)生再結(jié)晶。用本發(fā)明處理的食品實(shí)例包括但不限于冰淇淋、冷凍酸奶、湯、布丁、雪酪、雪糕、冷凍甜點(diǎn)如奶油凍、布丁等，以及其他需冷凍的液體或半液體。冷凍蔬菜，如芹菜、土豆、蘆筍、豌豆、胡蘿卜、豆子、花椰菜、甜玉米、菠菜、綠豆等也都屬于本發(fā)明的考慮范圍。本發(fā)明的多肽還可影響乳糖晶體的形成。因此，在不受任意具體理論的約束的情況下，可以認(rèn)為本發(fā)明的多肽抑制乳糖晶體的結(jié)晶和/或生長。眾所周知，在冰淇淋冷凍期間，所有物質(zhì)(包括乳糖)的含量都越來越濃縮。液態(tài)水的含量除外，它是遞減的。當(dāng)乳糖的含量達(dá)到一定水平時(shí)，乳糖晶體開始結(jié)晶。這種結(jié)晶是一個(gè)緩慢的過程，其發(fā)生在-20°C。通常，冰淇淋儲(chǔ)存在約-20°C。然而，在許多情況下，冰淇淋并非儲(chǔ)存在穩(wěn)定和恒定的溫度下，但溫度在約-20°C波動(dòng)。因此，在溫度高于-20°C的期間，乳糖的晶體將會(huì)生長并且形成新晶體。所以，冰淇淋的口感會(huì)變得更粗糙，而大多數(shù)人覺得這種口感不太好?，F(xiàn)在意外地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)本發(fā)明的多肽在冰淇淋冷凍之前加到冰淇淋中時(shí)，明顯地減少了乳糖晶體的形成，并且在約-20°C儲(chǔ)存時(shí)明顯防止了新晶體的形成。因此，儲(chǔ)存的冰淇淋產(chǎn)品的質(zhì)量明顯提尚ο本發(fā)明的冷凍食用產(chǎn)品的實(shí)例在本文以下有更詳細(xì)的描述。含有本發(fā)明多肽的冷凍發(fā)酵產(chǎn)品冷凍或冷藏食品是目前發(fā)達(dá)國家人類飲食中的主要部分。因此食品科學(xué)家已經(jīng)和正在進(jìn)行廣泛研究，以確保為消費(fèi)者提供高質(zhì)量的產(chǎn)品。對(duì)于冷凍蔬菜及冷凍甜食(如冰淇淋和酸奶)來說尤其如此。冷凍甜食，如冰淇淋或酸奶，通常是在冷凍狀態(tài)下食用。因此，對(duì)消費(fèi)者來說，冷凍產(chǎn)品的質(zhì)地及其口味都很重要。質(zhì)地在很大程度上是由冰晶體的大小決定的。這些冷凍甜食的程序耗費(fèi)了相當(dāng)多的精力和費(fèi)用來保證產(chǎn)品有爽滑的質(zhì)地。然而，在冷凍儲(chǔ)存期間，冰晶體會(huì)生長并因此變粗糙和破壞這種質(zhì)地。冰晶體在冷凍儲(chǔ)存期間的生長稱作再結(jié)晶。當(dāng)冷凍儲(chǔ)存條件不夠理想時(shí)，這個(gè)問題尤其常見，例如運(yùn)輸或在現(xiàn)代無霜家用冰箱儲(chǔ)存期間。在零上溫度(即o°c以上)、甚至在持久的冷凍溫度下，由于冰再結(jié)晶過程，冷凍食品會(huì)在相對(duì)短時(shí)間后就變得不可口，甚至不適合人食用。將抗凍多肽摻入冷凍發(fā)酵食品的理想方法是讓生物負(fù)責(zé)發(fā)酵過程，在發(fā)酵食品時(shí)產(chǎn)生抗凍多肽。因此，本發(fā)明包括制備冷凍發(fā)酵食品的方法。該方法包括步驟(a)使食品與能夠分泌本發(fā)明多肽的微生物接觸，其中該微生物能夠發(fā)酵該食品，以產(chǎn)生發(fā)酵食品，(b)在發(fā)酵進(jìn)行的條件下用微生物培養(yǎng)該食品，使得產(chǎn)生具有抗凍多肽的發(fā)酵食品，抗凍多肽是以有效抑制該產(chǎn)品再結(jié)晶的量存在；和(C)在_5°C下冷凍該發(fā)酵食品，以便產(chǎn)生冷凍的發(fā)酵食品。在一種實(shí)施方式中，該食品可以是奶制品(如牛奶)，其可以發(fā)酵來生產(chǎn)酸奶、脫脂奶或奶酪。本發(fā)明的微生物通常是細(xì)菌(即保加利亞乳桿菌、乳酪鏈球菌、乳鏈球菌、兩岐雙岐桿菌、長雙歧桿菌)，還可以是真菌，如酵母菌(即脆壁酵母、釀酒酵母、乳酸酵母及其他)。根據(jù)本發(fā)明，這些微生物經(jīng)基因工程處理，使得它們能夠分泌本發(fā)明的多肽。在最優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明包括用能夠發(fā)酵牛奶產(chǎn)生酸奶并且能夠分泌抗凍多肽的細(xì)菌物種保加利亞乳桿菌和乳鏈球菌培養(yǎng)牛奶，這些細(xì)菌物種能夠發(fā)酵牛奶以生產(chǎn)酸奶并且能夠分泌抗凍多肽；在生產(chǎn)酸奶的條件下培養(yǎng)該細(xì)菌和牛奶；以及在低于_5°C的溫度下冷凍酸奶，以生產(chǎn)冷凍酸奶。本發(fā)明還提供一種包含酸奶和微生物的組合物，其中微生物含有編碼本發(fā)明的多肽的基因。本文使用的“發(fā)酵”指食品中的碳水化合物或多肽通過使用微生物而發(fā)生的化學(xué)轉(zhuǎn)化。在該過程中，碳水化合物通常轉(zhuǎn)化為乳酸。本文使用的“發(fā)酵食品”指通過用包括微生物發(fā)酵的工藝制備的食用產(chǎn)品。本文使用的“酸奶”指通過微生物的作用，由乳酸發(fā)酵的牛奶生產(chǎn)的奶制品。本文使用的“重組產(chǎn)生的多肽”指用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)的多肽。重組DNA技術(shù)是眾所周知的，其特征在于將非天然連接的至少兩個(gè)DNA片段連接起來(例如，細(xì)菌啟動(dòng)子和多肽編碼序列)。參考序列可能比全長的天然形成的多肽或多核苷酸序列短，但對(duì)多肽來說至少為12個(gè)殘基長，而對(duì)多核苷酸來說為至少36個(gè)堿基長。本發(fā)明還提供通過加入微生物制備冷凍發(fā)酵食品的方法，該微生物能夠發(fā)酵食品以生產(chǎn)發(fā)酵的食品，并且還能分泌本發(fā)明的多肽。分泌本發(fā)明的多肽并使食品發(fā)酵的微生物的應(yīng)用相對(duì)于影響冰晶體形成和凍結(jié)溫度的其他方法而言具有幾個(gè)優(yōu)勢(shì)。例如，該方法避免了在加入到食品中之前純化本發(fā)明多肽的花費(fèi)需要，此外，這會(huì)消除純化過程以及與外來微生物相關(guān)的發(fā)熱引起的任意可能的污染。而且，因?yàn)楸景l(fā)明的多肽是通過發(fā)酵本發(fā)明提出的微生物而分泌得到，所以該過程需要的步驟比其他方法少。本發(fā)明的食品通常是牛奶，但也可以使用其他的食品，這些食品可以發(fā)酵以生產(chǎn)食用發(fā)酵食品。實(shí)例包括卷心菜(可發(fā)酵來生產(chǎn)泡菜)、黃瓜(可發(fā)酵來生產(chǎn)腌菜)以及大豆(可發(fā)酵來生產(chǎn)味噌和其他食品)。在本發(fā)明的一個(gè)步驟中，將食品與能發(fā)酵該食品的微生物接觸或混合。食品發(fā)酵中可用的微生物的實(shí)例是眾所周知的(例如，見vandeGuchte，1992，F(xiàn)EMSMicrobiologyReviews,88:73_92)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，食品是奶類(例如來自奶牛(即牛)、母羊、母馬或山羊)。根據(jù)選擇的細(xì)菌和孵化的條件，微生物(通常為細(xì)菌)對(duì)奶制品的發(fā)酵作用產(chǎn)生酸奶、酪乳或某些奶酪。在最優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法用于由奶類生產(chǎn)酸奶。酸奶在世界各地有各種不同的名稱。以下列出常見的酸奶品種的名稱和原產(chǎn)國產(chǎn)品名稱原產(chǎn)地[1168]Jugurt/Eyran/Ayran土耳其等[1169]Busa土耳其斯坦[1170]KisselMleka爾干半島[1171]Urgotnic爾干山脈[1172]Leban/Laban黎巴嫩/阿拉伯國家[1173]Zabady(Zabbady)埃及/蘇丹[1174]Mast/Dough伊朗/阿富汗[1175]Roba伊拉克[1176]Dahi/Dadhi/Dahee印度[1177]Mazun/Matzoon/Matsun/Matsoni美尼亞[1178]Katyk外高加索[1179]Tiaourti希臘[1180]Cieddu意大利[1181]Mezzoradu西西里島[1182]Gioddu撒丁島[1183]Biokys捷克斯洛伐克[1184]Karmdinka波蘭[1185]Tarho匈牙利[1186]Tykmaelk/Ymer匈牙利[1187]Villi(Fiili)芬蘭[1188]Filmjolk/Fillbunke/Surmelk/Taettemjolk/Tettemelk斯堪的那維亞[1189]Iogurte巴西/葡萄牙[1190]Proghurt智利[1191]Skyr冰島[1192]Gruzovina南斯拉夫[1193]Kefir/Donskaya/Varentes(前)蘇聯(lián)[1194]Kurunga/Koumiss/Ryazhenka/Guslyanka[1195]Tarag蒙古[1196]Shosim/Sho/Thara尼泊爾[1197]生產(chǎn)酸奶的方法可以在NakazawaandHosono,1992年編的FunctionsofFermentedMilk中找到，由ElsevierAppliedScience出片反，London-NewYork，p.32，將其在此納入作為參考。在美國，酸奶是由奶牛的全脂或脫脂奶生產(chǎn)。奶被標(biāo)準(zhǔn)化為10.5-11.5%固體物，加熱至90°C以上(30至60分鐘)，以破壞任意污染微生物，然后再冷卻。然后將該物質(zhì)用11比例的嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌的混合培養(yǎng)物接種。通常需要這兩種生物的結(jié)合作用以獲得產(chǎn)品中所需要的風(fēng)味和酸。在其他情況下，還可以使用其他高發(fā)酵細(xì)菌，包括保加利亞細(xì)菌、L.jugarti、L.acidophilus、雙歧桿菌屬酵母和乳酸真菌。以下列出的是用于牛奶發(fā)酵以生產(chǎn)酸奶的細(xì)菌和其他生物的實(shí)例Iactis種屬Streptococcus3LeuconostocbLactobacillusc習(xí)性發(fā)酵球菌鏈同型球菌對(duì)異型桿狀同型主要物種S.cremoris,lactis,thermophilusL.citrovorum,mesenteroidesL.acidophilus,bulgaricus,casei,jugurti,Bifidobacterium桿狀異型B.bifidum,breve,longum其他酵母(Torulopsisholmil；Saccharomycesfragilis，cerevisiae，lactis；Candidapseudotropicalis^)真菌(Geotrichumcandidum)醋酸菌(Acetobacteraceti，rasens)a目前的Lactococcuslactissubsp.cremoris,Lac,lactissubsp.lactis禾口S.thermophilus。b目前的L.mesenteroidessubsp.cremoris禾口L.mesenteroidessubsp.mesenteroides0c巨前的L.acidophilus,L.delbrueckiisubsp.bulgaricus,L.caseisubsp.casei,L.helveticusbiovar.Jugurti禾口L·delbrueckiisubsp.Iactis0可以對(duì)這些微生物進(jìn)行基因工程設(shè)計(jì)(即，采用重組DNA技術(shù))，以便它們能夠分泌本發(fā)明的多肽。已經(jīng)建立了改造能夠表達(dá)和分泌異源性多肽的細(xì)菌和真菌的方法(例如，見Maniatisetal.(1982),MolecularCloning,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarbor,N.Y.；BergerandKimmel,GuidetoMolecularCloningTechniques,MethodsinEnzymology152(AcademicPress,Inc.,SanDiego,Calif.)；Simonetal.,1986,App1.Environ.Microbiol.52:394_395；vonffrighteta.,1985,App1.Environ.Microbiol.50:1100_1102，將其全部引入作為參考)。能夠表達(dá)和分泌AFP的微生物的生產(chǎn)可以用普通技術(shù)人員知道的各種方法完成。編碼AFP的DNA序列優(yōu)選地被可操縱地連接(即，被定位以確保其功能)到操縱子，其使DNA轉(zhuǎn)錄(成為RNA轉(zhuǎn)錄本)并在微生物中翻譯成多肽。用于細(xì)菌和真菌的啟動(dòng)子都是本領(lǐng)域眾所周知的。優(yōu)選用于在乳酸菌中表達(dá)的操縱子包括S.thermophilus的乳糖操縱子、L.lactic的IacAB⑶FEGX操縱子，因?yàn)樗鼈円呀?jīng)成功地用于驅(qū)動(dòng)宿主中的外源基因表達(dá)(例如，見Simonsetal.,1993,J.Bact.1755186-5175；Molletetal.，1993，J.Bact.1754315-4324)。本發(fā)明的多肽可表達(dá)為融合多肽，以便增強(qiáng)穩(wěn)定性或其他有益性質(zhì)。此外，通過修改編碼多肽的基因可以修飾本發(fā)明的多肽。一般地，基因的修飾可以用各種眾所周知的技術(shù)完成，例如定向誘變(例如，見GillmanandSmith,1979,Gene8:81_97andRobertsetal.，1987，Nature328:731_734)。本發(fā)明的微生物能夠分泌本發(fā)明的多肽。因此，本發(fā)明的多肽優(yōu)選與信號(hào)肽序列連結(jié)。適宜的信號(hào)肽序列包括選自L.IactisssplactisMG1363的usp45基因以及L.IactissspcremorisSKll細(xì)胞壁相關(guān)的蛋白酶基因(vanAsseldonketal.，1990，Gene95155—160;Devosetal.,1989,J.DairySci.72:3398_3405)。對(duì)于細(xì)菌，如L.lactis來說，優(yōu)選的是usp45信號(hào)肽，因?yàn)樗鼇碜酝瑯拥乃拗?。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的多肽基因與轉(zhuǎn)錄終止序列連接，以確保本發(fā)明多肽的轉(zhuǎn)錄在宿主系統(tǒng)中正確終止。用質(zhì)粒如pUC19、pNZ18和pDBm83作為載體，構(gòu)建包含上述元件的基因構(gòu)建體(Solaimanetal.,1992,Plasmid,28:25_36)。用同源重組技術(shù)，將該基因構(gòu)建體并入乳酸菌物種的基因組中(Molletetal.，1993，J.Bact.，175:4315_4324)。乳酸菌和E.coli菌ttRJ^MManiatisetal.,MolecularCloning,ALaboratoryMbhubI，Jlt^PChBgriBridetal.，1992，Can.J.Microbiol.38:67_74的推薦來保存。含有本發(fā)明多肽的微生物可以通過任意常規(guī)方法應(yīng)用到食品中。在產(chǎn)品，如牛奶中，細(xì)菌或者真菌可以在初始與待發(fā)酵和冷凍的食品混合。本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道，有時(shí)用不同微生物的混合物來生產(chǎn)所需的產(chǎn)品。例如，在制備酸奶時(shí)，通常一起使用S.thermophilus禾口L.bulgaricus。添加到食品中的FAE微生物的數(shù)量取決于該微生物和食品的性質(zhì)。一般而言，乳酸FAE啟動(dòng)細(xì)菌(IOici-IOiiAiI)以1_5%培養(yǎng)進(jìn)入殺菌并冷卻的牛奶中，使得這種比例使本發(fā)明多肽在產(chǎn)品中為合適的量。產(chǎn)品中AFP的量應(yīng)該是有效防止和抑制冰再結(jié)晶的量(l-100mg/L奶)。這可以按照Knightetal.(1988)Cryobiology，vol.25，pp.55-60的描述用急冷分析法來確定。該方法的另一個(gè)步驟中，發(fā)酵食品是用傳統(tǒng)的冷凍機(jī)操作進(jìn)行冷凍，如氣流冷凍機(jī)(-20至40°C)或接觸平板凍結(jié)機(jī)(-300到40°C)或真空冷凍干燥機(jī)。對(duì)普通技術(shù)人員來說顯而易見的是，上述實(shí)施方式可能有多種變化。含有本發(fā)明的多肽的冰淇淋另一方面，本發(fā)明提供了一種含有本發(fā)明多肽的冰淇淋產(chǎn)品。該冰淇淋產(chǎn)品還可以含有伴隨本發(fā)明多肽的乳化體系。該乳化體系可以是技術(shù)人員知道的任意體系。然而，特別優(yōu)選的是包含1，2_丙二醇的單酯和脂肪酸的體系，如US2005/0163902或WO2008/064675中描述的那些。在按本文以下描述生產(chǎn)的冰淇淋中，本發(fā)明的多肽可以作為純化多肽添加，在冰淇淋的生產(chǎn)期間與其他成分混合，或者本發(fā)明的多肽可以作為用于發(fā)酵牛奶的微生物的分泌物存在。以下是一種制備本發(fā)明的冰淇淋的方法。在第一步中，將食品中間體與上述乳化劑體系接觸。本文使用的術(shù)語“食品中間體”表示適合制備冰淇淋的成分的混合物。適于制備冰淇淋的成分可包括水、脂肪，如乳脂或植物油、非脂性乳固體(MSNF)、甜味劑、穩(wěn)定劑、香料和色素。此外，本發(fā)明的多肽可能已經(jīng)存在于乳固體中，或者可以作為單獨(dú)的成分加到混合物中。優(yōu)選地，食品中間體包含脂肪。優(yōu)選地脂肪是高月桂酸脂肪或乳脂。術(shù)語“高月桂酸脂肪”是指其中主要脂肪酸為月桂酸的脂肪。高月桂酸脂肪，如棕櫚仁油硬化和硬化椰子油是β‘穩(wěn)定性的。因此，食物中間體優(yōu)選地包含β‘穩(wěn)定性脂肪。在第一步接觸步驟之后，將選擇的成分混合在一起。通常先將液體成分混合，隨后添加干燥成分。液體成分可以是冷的或者可加熱至約60°C?；旌弦罂焖贁噭?dòng)以便摻入粉末，并且通常使用高速混合機(jī)。如果使用黃油/乳脂油或植物脂肪，理想的應(yīng)該是單獨(dú)融化，并在40°C添加混合中，或者通過計(jì)量泵的方式在勻漿器的入口處經(jīng)由靜止混合器混合。該混合物隨后被巴氏滅菌。進(jìn)行巴氏滅菌是為了消滅致病細(xì)菌和變質(zhì)生物，如嗜冷生物。巴氏滅菌有三個(gè)不同的階段巴氏滅菌、均化和冷卻。進(jìn)行混合物的勻化是為了通過將脂肪球的尺寸分解或降低到小于1μm，而形成脂肪乳劑。巴氏滅菌可以通過連續(xù)巴氏滅菌或者分批巴氏滅菌來進(jìn)行。目前用的最常見的巴氏滅菌原理是連續(xù)巴氏滅菌，其中通常將冰淇淋混合物在平板熱交換器中于80-90°C溫度范圍加熱最少16秒。通常在一個(gè)大絕緣物料罐中混合成份，隨后在高溫短時(shí)(HTST)熱交換器中進(jìn)行連續(xù)巴氏滅菌。為了成份的增溶，有時(shí)可能需要預(yù)熱至30°C至40°C。HTST系統(tǒng)配備有加熱段、冷卻段和再生段。分批巴氏滅菌是一種老方法，其中所有的混合物成份在配備有熱水套的桶內(nèi)緩慢加熱。為避免在罐的底部和側(cè)面沉積污垢，加熱過程必須溫和，在混合物和加熱介質(zhì)之間有低的溫度差(ΔΤ)。當(dāng)ΔT必須較低并且混合體積/罐表面的比率通常較高時(shí)，這必然要花費(fèi)幾分鐘時(shí)間以使混合物加熱至60°C的溫度。為了提高熱從罐表面至混合物的轉(zhuǎn)移，需要有效的攪拌混合物。分批巴氏滅菌的能量消耗非常高，與連續(xù)巴氏滅菌不同，其不存在熱回收。巴氏滅菌后，混合物通過高壓方式均化。均化通常在約80°C的溫度下進(jìn)行，并且在溫度為65-75°C下，均化壓力可以是90巴(1300psi)至250巴(3600psi)。分批灌通常一前一后地運(yùn)作，使得一個(gè)在保壓時(shí)其他的在準(zhǔn)備。自動(dòng)計(jì)時(shí)器和閥門確保滿足合適的保壓時(shí)間。勻化可以在巴氏滅菌之前或之后進(jìn)行。接著通過使混合物通過熱交換器(板或雙重或三重管)，將該混合物冷卻至冷藏溫度(4°C)?；旌衔锢鋮s至約為4°C的老化溫度。然后，混合物老化最少4小時(shí)，但優(yōu)選隔夜。這留出時(shí)間使脂肪結(jié)晶，并使多肽和多糖充分水合。在老化之后，混合物被吸入調(diào)味罐，其中添加了任意液體調(diào)味料、果醬或色素。然后該混合物進(jìn)入動(dòng)態(tài)凍結(jié)過程，其冷凍部分水并攪動(dòng)空氣進(jìn)入該冷凍混合物中。冷凍可以通過連續(xù)冷凍過程或分批冷凍/攪動(dòng)進(jìn)行。連續(xù)凍結(jié)可以在桶式冷凍機(jī)中進(jìn)行。桶式冷凍機(jī)是一種刮板式、管狀熱交換器，其上套有沸騰致冷劑，如氨或氟利昂。該混合物被泵入桶式冷凍機(jī)，并在約30秒至3分鐘內(nèi)從另一末端排出。就分批冷凍機(jī)來說，這一過程需要10至15分鐘。當(dāng)混合物從另一末端排出時(shí)，其中約50%的水被凍結(jié)。桶式冷凍機(jī)內(nèi)部有轉(zhuǎn)動(dòng)葉片，其保持冰從冷凍機(jī)的表面刮離。在機(jī)器內(nèi)部也有攪拌裝置，其有助于攪動(dòng)混合物并摻入空氣。冰淇淋含有大量的空氣，通常高達(dá)其體積的一半。這使得產(chǎn)品具有輕質(zhì)的性質(zhì)?？諝夂勘环Q為膨脹率(overrun)。當(dāng)冰淇淋吸取的水約一半凍結(jié)時(shí)，可以向該半凍結(jié)漿體中加入顆粒物，如果粒、堅(jiān)果或餅干。然后將冰淇淋包裝并置于-30°C至-40°C的氣流冷凍機(jī)中，在此將大部分殘留水凍結(jié)。硬化包括在氣流冷凍機(jī)中靜態(tài)(安靜、無聲)凍結(jié)包裝好的產(chǎn)品。凍結(jié)速度最好應(yīng)該是快速的，因此凍結(jié)技術(shù)包含帶有加強(qiáng)的對(duì)流(帶壓縮風(fēng)機(jī)的凍結(jié)管)或加強(qiáng)的傳導(dǎo)(平板凍結(jié)機(jī))的低溫(-40°C)。除了傳統(tǒng)的硬化過程，冰淇淋可以從冰淇淋冷凍中泵入低溫?cái)D壓機(jī)中(單或雙螺桿擠壓機(jī))，將冰淇淋的溫度調(diào)低到_12°C至-18°C。在填充或者擠壓之后，冰淇淋可直接送入冷藏器中。硬化的冰淇淋應(yīng)該在低于_25°C儲(chǔ)存。低于約_25°C，冰淇淋長時(shí)間保存相當(dāng)穩(wěn)定，不存在快速冰晶生長的危害。如前所述，本發(fā)明的過程包括將食品中間體與乳化劑體系接觸的步驟。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，該過程包括將乳化劑體系溶解在水中的步驟。在該實(shí)施方式中，乳化劑體系可溶解在水中，然后食品中間體再與水接觸。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，該過程包括將乳化劑體系溶解在脂肪中的步驟。在該實(shí)施方式中，乳化劑體系可溶解在脂肪中，然后食品中間體再與脂肪接觸。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，該過程包括動(dòng)態(tài)凍結(jié)步驟。本文定義的術(shù)語“動(dòng)態(tài)凍結(jié)步驟”是指使食品中間體經(jīng)受凍結(jié)條件，同時(shí)攪拌該食品中間體。這與靜態(tài)凍結(jié)步驟是相反的，靜態(tài)凍結(jié)步驟中食品中間體經(jīng)受凍結(jié)條件，同時(shí)保持靜止。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，該過程包括凍結(jié)步驟。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，該步驟包括以低于_4°C的冷凍機(jī)回火溫度進(jìn)行凍結(jié)的步驟。回火溫度優(yōu)選為約_40C至-7。C,優(yōu)選約-50C至-7°C，更優(yōu)選約-50C至-6°C，更優(yōu)選約-6°C?；鼗饻囟仁侵鸽x開冷凍機(jī)時(shí)的冰淇淋的溫度。含有本發(fā)明多肽的充氣食品本發(fā)明還提供一種含有本發(fā)明多肽的充氣食品。冰淇淋、果子露、雪酪和冷凍酸奶可以作為食品的實(shí)例，可定性為充氣產(chǎn)品。術(shù)語“充氣(的)”是指氣體被有目的地?fù)饺牖旌衔镏?，例如通過機(jī)械手段。氣體可以是任意氣體，但是在食品方面優(yōu)選地是食品級(jí)氣體，如空氣、氮?dú)狻⒀趸瘉喌蚨趸?。本發(fā)明的充氣食品包含大量氣泡，其中至少65%的氣泡的具有低于20μπι的直徑。優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%的氣泡具有低于20μm的直徑。優(yōu)選至少50%，更優(yōu)選至少60%，最優(yōu)選至少75%的氣泡具有低于10μm的直徑。充氣量通常稱作“膨脹率”。在本發(fā)明中，％膨脹率是根據(jù)充氣產(chǎn)品的體積和未充氣混合物的體積進(jìn)行定義(最終充氣產(chǎn)品的體積-未充氣的混合物的體積)XlOO膨脹率=未充氣的混合物的體積膨脹率是在大氣壓力下測(cè)定。產(chǎn)品中存在的膨脹率的量會(huì)根據(jù)所需產(chǎn)品的性質(zhì)而變化。優(yōu)選地食品具有至少20%的膨脹率，更優(yōu)選至少50%，最優(yōu)選最少80%。優(yōu)選地食品具有最多400%的膨脹率，更優(yōu)選最多200%，最優(yōu)選最多120%。充氣食品可由本領(lǐng)域已知的任意方法制備。例如，使用預(yù)充氣途徑，這是從未充氣混合物開始生產(chǎn)含大量小氣泡的充氣食品的過程。在預(yù)充氣途徑中，包含本發(fā)明多肽并可選地含有其他成分的混合物(即，水溶液和/或懸浮液)進(jìn)行充氣步驟。該充氣步驟必須有足夠高的“強(qiáng)度”，以便產(chǎn)生大量的非常小的氣泡(直徑小于20μπι)。充氣過程的強(qiáng)度取決于很多因素，最重要的是充氣步驟中能量損耗的速率，混合物和氣泡在充氣步驟中經(jīng)歷的流動(dòng)的性質(zhì)，以及混合物的粘度和溫度。此外，充氣步驟應(yīng)該足夠長，以便達(dá)到理想的充氣程度(即，膨脹率)。機(jī)械充氣裝置通常以切割混合物的轉(zhuǎn)子為基礎(chǔ)。能量消耗的速率是該裝置轉(zhuǎn)速的函數(shù)。一般而言，需要高速的能量消耗(因此高轉(zhuǎn)速)以產(chǎn)生小氣泡(例如，見“ChemicalEngineeringfortheFoodIndustry",Fryer,PyleandRielly,Blackie,London,1997)。充氣步驟的有效性還取決于充氣裝置中流動(dòng)的性質(zhì)。一般通過初始摻入相對(duì)大的氣泡，隨后分裂成較小的氣泡來實(shí)現(xiàn)充氣。人們已經(jīng)知道，與簡單的剪切流相比，拉伸流或伸長流對(duì)分裂氣泡特別有效(見Rallinson，J.Μ.Ann.Rev.FluidMech.16，pp45-66，1984)。適宜的可以提供至少一部分拉伸流的高剪切充氣過程及裝置包括在轉(zhuǎn)子_定子裝置中連續(xù)振蕩，如Oakes混合器(Ε.T.OakesCorp)、Megatron混合器(KinematicaAG)、Mondo混合器(Haas-MondomixBV)或Silverson混合器(SilversonMachinesInc)；氣體注入后接著在連續(xù)流體裝置中進(jìn)行混合和分散，如刮面式換熱器；分批振蕩包含氣體的表面夾帶，例如用Hobartwhisk混合器(HobartUK)、KenwoodChef混合器(KenwoodLtd)、Ultra-Turrax混合器(IKAWerkeGmbH&Co.KG)或電動(dòng)手持式混合器，如Brevillekitchen手持?jǐn)嚢杵?。充氣步驟的有效性還取決于混合物的粘度和/或溫度。通過增加混合物的粘度和/或降低溫度，充氣裝置對(duì)氣泡尺寸減小的影響被增強(qiáng)。此外，充氣步驟的效果還取決于混合物的配方。盡管充氣步驟的效果取決于所用的工藝和裝置以及正充氣的混合物的具體細(xì)節(jié)，通過考慮上述因素，本領(lǐng)域技術(shù)人員通過考慮上述因素，在具體情況下確定合適的工藝條件也屬于本發(fā)明的范圍。具體地，可以通過增加消耗的能量和/或通過增加拉伸流部分和/或增加混合物的粘度和/或通過降低混合物的溫度，都可以增加非常小的氣泡的比例。例如，如果終產(chǎn)品是冷凍充氣產(chǎn)品，如冰淇淋或雪酪，充氣混合物可選擇地在充氣期間和/或之后進(jìn)行冷凍。冷凍可以與充氣同步進(jìn)行，比如在刮面式換熱器中。同步凍結(jié)和充氣可以有助于形成非常小的氣泡，因?yàn)楸纬蓵r(shí)混合物的粘度增加。優(yōu)選的是凍結(jié)在充氣后進(jìn)行，使得很少或者沒有進(jìn)一步摻入氣體。通過隨后的冷凍操作可以進(jìn)一步增加冰含量，例如低溫?cái)D壓，將充氣的混合物置于模具中，該模具浸在冷液體浴中，如鹽水或乙二醇；將部分充氣混合物直接滴入低溫液體浴中，如液體氮?dú)?，或者將包含充氣混合物的容器置于冷環(huán)境中，如冷凍機(jī)、氣流冷凍器或冷藏庫中。隨后的凍結(jié)步驟優(yōu)選地是在低剪切或零剪切下進(jìn)行，使得很少或者沒有進(jìn)一步摻入氣體。[1266]除了本發(fā)明的多肽，本發(fā)明的充氣食品(以及制備它們的混合物)可包含食品中常規(guī)存在的其他成分，如脂肪、奶或奶油；油或脂肪，特別是乳化相的形式；糖、鹽、水果和/或蔬菜原料、提取物、果汁、增稠劑，如多糖、穩(wěn)定劑、色素、調(diào)味劑，化學(xué)乳化劑，如單甘油酯；酸和防腐劑。優(yōu)選的食品包括冰淇淋、雪酪、慕斯、生奶油、充氣飲料，如奶昔和沙冰、低脂肪的糊狀食品(如脂肪含量0-60wt%)、調(diào)料和調(diào)味汁。優(yōu)選地，食品是冷凍或冷藏的充氣甜食，如冰淇淋、冰糕或慕斯。本發(fā)明冷凍充氣甜食包含本發(fā)明的多肽，并可選地有一種或多種本發(fā)明多肽以外的抗凍多肽。在充氣產(chǎn)品中，抗凍多肽的總量通常為至少約0.OOOlwt%，更優(yōu)選至少0.0005wt%，最優(yōu)選至少0.001wt%?？箖龆嚯目梢院艿偷臐舛仁褂?，因此優(yōu)選地甜食含有小于0.05wt%的抗凍多肽。優(yōu)選的范圍是約0.001-0.Olwt%?？箖龆嚯目梢詥为?dú)使用，或者與本領(lǐng)域已知的其他抗凍多肽聯(lián)合使用。冷凍充氣產(chǎn)品可選擇地包含包衣，如巧克力層、或糖皮和/或內(nèi)含物，如堅(jiān)果、水果、太妃糖或巧克力片。在這種情況下，冷凍充氣甜食中的脂肪含量不包括存在于包衣或內(nèi)含物中的脂肪。在一種實(shí)施方式中，冷凍充氣甜食包含3襯％或更少的脂肪。優(yōu)選2襯％或更少，更優(yōu)選1襯％或更少。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，甜食是無脂肪的，意思是甜食基本上不包含脂肪(即，低于0.lwt%)o包含本發(fā)明的多肽以及疏水蛋白和表面活性劑的充氣食品本發(fā)明還提供一種包含本發(fā)明的多肽以及疏水蛋白和表面活性劑的冷凍充氣食品，如甜食。優(yōu)選地，該充氣食品包含大量氣泡，其中至少65%的氣泡具有低于20μm的直徑。冷凍充氣甜食中存在的疏水蛋白的量一般會(huì)隨甜食配方和氣相的體積而變化。通常，甜食含有至少0.OOlwt%的疏水蛋白，更優(yōu)選至少0.005或0.Olwt%。通常，甜食含有低于的疏水蛋白。疏水蛋白可以是單一源或多源的形式，例如，疏水蛋白可以是兩種或多種不同疏水蛋白多肽的混合物。疏水蛋白是以可以穩(wěn)定氣相的形式和量添加。術(shù)語“添加”是指疏水蛋白有意地引入甜食中，目的在于利用其穩(wěn)定泡沫的性質(zhì)。所以，當(dāng)存在或添加含有真菌污染物的成分，其可能含有疏水蛋白多肽時(shí)，這并不構(gòu)成本發(fā)明上下文所指的添加疏水蛋白。疏水蛋白通常以一種形式添加到甜食中，使得它能夠在氣-液表面自我組裝。疏水蛋白通常以分離的形式添加到本發(fā)明的甜食中。通常至少部分被純化，比如基于固體重量，至少10%的純度?！耙苑蛛x的形式添加”是指疏水蛋白不是作為天然產(chǎn)生的有機(jī)體被添加，例如天然地表達(dá)疏水蛋白的蘑菇。相反，疏水蛋白通常提取自天然產(chǎn)生源，或者通過在宿主有機(jī)體中重組表達(dá)來獲得。在一種實(shí)施方式中，疏水蛋白是以單體、二聚體和/或寡聚體(S卩，由10個(gè)或更少的單體單元組成)添加到甜食中。優(yōu)選地，添加的疏水蛋白的至少50襯％是這些形式中的至少一種，更優(yōu)選至少75%、80%、85%或90wt%。一旦加入，疏水蛋白通常將在氣體、液體界面進(jìn)行組裝，因此單體、二聚體和寡聚體的量預(yù)計(jì)將減少。本文使用的術(shù)語“表面活性劑”(或“表面活化劑”)表示降低介質(zhì)的表面張力的物質(zhì)，其中該物質(zhì)溶解于介質(zhì)中，并因此積極吸附在液/氣界面。[1278]該術(shù)語包括通過在液體表面自發(fā)擴(kuò)散，降低液體表面張力的難溶性物質(zhì)。在本發(fā)明上下文中，術(shù)語“表面活性劑”不包括疏水蛋白。術(shù)語“表面活性劑”不包括可能以非常低的量存在于其他(非表面活性)成分中的微量表面活性成分，例如穩(wěn)定劑，如果膠、刺槐豆膠和瓜爾豆膠。在這種情況下，表面活性劑的量通常低于食品重量的0.05%。表面活性劑通常是充氣食品中使用的成分，因?yàn)樗鼘?duì)口味和/或質(zhì)地有有益作用。這種表面活性劑包括(但不限于)乳多肽如酪蛋白，乳清(及其多肽片段)、酪蛋白鈉、酪蛋白鈣和水解乳清多肽；其他多肽，如明膠、雞蛋多肽、大豆多肽；飽和或不飽和脂肪酸的單甘油酯和雙甘油酯，如單甘油棕櫚酸酯；六元醇(通常為山梨醇)、乙二醇、乙二醇酯、聚甘油酯、山梨醇酐酯、硬脂酰乳酸、醋酸酯、乳酸酯、檸檬酸酯、乙酰單酸甘油乙酯、雙乙酰酒石酸酯、聚氧乙烯山梨醇酐酯(如聚山梨醇酯80)的聚氧乙烯衍生物；非-離子表面活性劑，如烷基聚(環(huán)氧乙烷)、脂肪醇和蔗糖酯；磷脂、磷脂類(如卵磷脂)混合物；以及上述任意混合物。優(yōu)選地，表面活性劑的量是產(chǎn)品重量的至少0.05%，更優(yōu)選至少0.1%。優(yōu)選地，表面活性劑為多肽，更優(yōu)選乳多肽，并且是以食品重量的至少0.5%的量存在，更優(yōu)選至少1%。優(yōu)選地，表面活性劑是以食品重量的最多20%的量存在，更優(yōu)選最多10%，最優(yōu)選最多5%。本發(fā)明的充氣食品可以用“預(yù)充氣”途徑來生產(chǎn)(上述公開了進(jìn)一步的細(xì)節(jié))，這是一種從含有疏水蛋白和表面活性劑的未充氣混合物開始，生產(chǎn)含大量小氣泡的充氣食品的過程。另一種途徑稱作“后添加”，提供了一種在充氣之后添加表面活性劑的過程。后添加途徑提供一種方式，其中疏水蛋白的量可以增加，這與氣泡形成時(shí)的表面活性劑的量有關(guān)，但充氣發(fā)生之后添加表面活性劑時(shí)，它在終產(chǎn)品中保持不變。由此，將包含疏水蛋白而不含表面活性劑的混合物充氣；隨后將含有表面活性劑的第二混合物與該充氣混合物合并。第二混合物經(jīng)配方設(shè)計(jì)，使得合并的混合物具有令人滿意的終產(chǎn)品配方?；旌喜襟E可以用于改善合并混合物的均勻性?；旌喜襟E優(yōu)選在相對(duì)低剪切和短時(shí)間下進(jìn)行，使得很少或幾乎沒有摻入氣體(即，混合步驟膨脹率增加不超過10%)。適宜的混合裝置包括靜態(tài)混合器；直列式動(dòng)態(tài)混合器，如螺絲鉆、攪拌機(jī)或加果機(jī)；分批混合裝置，如攪拌容器。在批處理中，第二(含表面活性劑的)混合物通常會(huì)在接近處理周期的末尾時(shí)注入。該混合步驟可以以連續(xù)過程進(jìn)行，比如在刮面式換熱器中，或者螺旋擠壓機(jī)中，在產(chǎn)物快要排出的時(shí)刻，將第二混合物注入刮面式換熱器或者螺旋擠壓機(jī)的桶內(nèi)。例如，假如成品是冷凍充氣產(chǎn)品，如冰淇淋或雪酪，充氣混合物可選擇地可以在充氣之前和/或之后進(jìn)行冷凍。冷凍可以與充氣同步進(jìn)行，比如在刮面式換熱器中。同步冷凍和充氣可以有助于形成小氣泡，因?yàn)楫?dāng)冰形成時(shí)混合物粘度增加。當(dāng)冷凍在充氣之后進(jìn)行時(shí)，優(yōu)選地是這樣進(jìn)行，使得很少或沒有進(jìn)一步摻入氣體。當(dāng)表面活性劑在充氣之后加入時(shí)(即，后加入途徑)，冷凍可以在混合步驟之前和/或混合期間進(jìn)行。表面活性劑流可在混合之前變冷或部分冷凍。含有本發(fā)明多肽的冷凍水甜食[1292]冷凍水甜食通常相對(duì)較小，例如平均體積小于1ml，更優(yōu)選小于0.5ml。舉例來說，5mm至10mm直徑的珠的體積會(huì)在約0.065ml至約0.5ml。通常離散的冷凍甜食具有最小的平均體積，使得各甜食能夠容易地被消費(fèi)者區(qū)分。例如，離散的冷凍甜食優(yōu)選地具有至少約0.02ml的最小平均體積。離散冷凍水甜食可以制成任意形狀，比如立方體或球體。優(yōu)選的是，冷凍甜食基本上是球體。冷凍水甜食可以是復(fù)合產(chǎn)品的形式，其中該產(chǎn)品的至少一部分或區(qū)域，比如核或?qū)?，不含有本發(fā)明的多肽。這種情況的一個(gè)實(shí)例是含有冰淇淋核的產(chǎn)品，該冰淇淋核不含本發(fā)明的多肽，涂上一層含有本發(fā)明多肽的水冰。優(yōu)選地，基本上復(fù)合甜食的外層含有本發(fā)明的多肽，即會(huì)接觸到其他離散的冷凍甜食的區(qū)域?？梢岳斫獾氖牵瑢?duì)于復(fù)合產(chǎn)品來說，加到甜食中的本發(fā)明多肽的量的計(jì)算僅與含有本發(fā)明多肽的甜食組分有關(guān)，而與完整的產(chǎn)品無關(guān)。冷凍水甜食可以是充氣或未充氣的。未充氣是指膨脹率小于20%的冷凍甜食，優(yōu)選小于10%。未充氣的冷凍甜食不進(jìn)行有意的步驟，比如振蕩以增加氣體含量。然而，可以理解的是，在未充氣冷凍甜食的制備期間，低水平的氣體，如空氣，可能摻入該產(chǎn)品中。水冰甜食通常含有糖、水、色素、果酸或其他酸化劑，水果或水果調(diào)味劑和穩(wěn)定劑。優(yōu)選地，總固體含量為至少6wt%，更優(yōu)選至少8wt%，或至少10、12、15或20wt%，并且可高達(dá)約35wt%。優(yōu)選地總固體含量小于35wt%，更優(yōu)選小于25wt%。水冰可以是充氣或未充氣的。如果充氣，膨脹率通常小于約50%，比如約25%至30%。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的水冰甜食是未充氣的。水冰甜食優(yōu)選地包含低于2wt%的人造甜味劑，更優(yōu)選小于。在高度優(yōu)選的實(shí)施方式中，水冰甜食中不存在人造甜味劑，如阿斯巴甜或安賽蜜。本發(fā)明的冷凍水甜食通常包含一種或多種穩(wěn)定劑，例如選自樹膠、瓊脂、藻酸鹽及其衍生物、明膠、果膠、卵磷脂、羧甲基纖維素鈉、卡拉膠和紅藻膠的一種或多種穩(wěn)定劑。優(yōu)選使用穩(wěn)定劑的混合物，如樹膠和卡拉膠的混合物。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，冷凍甜食包含0.l_lwt%的穩(wěn)定劑。本發(fā)明冷凍水甜食通常包含至少約0.0005wt%的本發(fā)明多肽。本發(fā)明多肽可以以非常低的濃度使用，因此甜食優(yōu)選地包含小于0.05襯％的本發(fā)明多肽。優(yōu)選的范圍是約0.001-0.01wt%。本發(fā)明冷凍水甜食可以用本領(lǐng)域內(nèi)已知的多種技術(shù)來生產(chǎn)。例如，通過將液體混合物分配滴加至液氮的冷藏室內(nèi)制備自由流動(dòng)的珠子(見W096/29896)。通過模制技術(shù)可以生產(chǎn)其他形狀，例如通過將液體預(yù)混合料引入冷卻的模具中。模制產(chǎn)品可包含復(fù)雜的形狀，并且具有高度的表面定義。含冰淇淋的產(chǎn)品及類似產(chǎn)品不需要進(jìn)行低于-20°C至_25°C的冷硬化步驟，不過視需要也可以用到該步驟，尤其當(dāng)產(chǎn)品是具有不含本發(fā)明多肽的層或核心的復(fù)合產(chǎn)品。本發(fā)明冷凍水甜食產(chǎn)品可以包裝在容器中作為獨(dú)立的單元向消費(fèi)者出售。這種容器的體積通常為100ml至1000ml，例如200ml至500ml。然而，該產(chǎn)品也可以包裝在較大的容器中用于零售目的，在零售條件下將產(chǎn)品分散到較小的容器中，比如在快餐店，或者作為混合選擇模式，此時(shí)消費(fèi)者可以從本發(fā)明具79有不同形狀、味道和/或顏色的冷凍甜食中進(jìn)行選擇。例如這些較大的容器具有大于約1000ml的體積，如至少2000ml或5000ml。含有本發(fā)明多肽的離散冷凍乳制品甜食本發(fā)明還提供冷凍甜食產(chǎn)品，包含多種離散未充氣的乳制品冷凍甜食，它們能夠直接接觸產(chǎn)品中的其他離散冷凍甜食。冰甜食是用于以冷凍狀態(tài)(即，在食品溫度小于0°C的條件下，并且優(yōu)選地在食品包含大量冰的條件下)消費(fèi)的甜味加工食品。本發(fā)明的冰甜食包含1_8襯％的脂肪，并且總固體含量為10-25wt%。脂肪和總固體的這些量，與水溶性充氣氣體以及本發(fā)明的多肽一起，使產(chǎn)品具有令人滿意的質(zhì)地和外觀。典型的水冰配方(不含脂肪)和標(biāo)準(zhǔn)冰淇淋配方(總固體含量至少約30wt%)不屬于離散冷凍乳制品甜食的定義。本發(fā)明的冰甜食優(yōu)選地包含2_6wt%，更優(yōu)選2.5_5襯％的脂肪。脂肪可以來自任意適宜的來源，如乳脂、椰子油、棕櫚油、可可油、葵花籽油、橄欖油或菜油、及其混合物或餾分。冰甜食總固體含量是甜食的干重，即除去水之外的所有成分的總重，表示為總重量的百分比。它是按照IceCream,6thEdition,p296中的描述來測(cè)定。本發(fā)明的冰甜食具有的總固體含量為冰甜食的10-25wt%?？偣腆w含量優(yōu)選地為至少12%，更優(yōu)選至少15%，最優(yōu)選至少18%?？偣腆w量優(yōu)選地最多為24%，更優(yōu)選最多22%。本發(fā)明的冰甜食含有冰。因?yàn)榭偣腆w含量是10_25wt%，水含量相應(yīng)地為90-75wt%。在-18°C的溫度下，大部分而不是全部的水被凍結(jié)。本發(fā)明的冰甜食通常包含至少約0.0001wt%的本發(fā)明多肽，更優(yōu)選至少0.0005wt%。本發(fā)明的多肽可以在非常低的濃度下使用，因此優(yōu)選地甜食包含低于0.本發(fā)明多肽。優(yōu)選的范圍是約0.001-0.0^^%，更優(yōu)選0.005-0.01wt%。充氣劑是指因?yàn)槠渚哂械谋砻婊钚院?或粘度而有助于形成小氣泡并且抵制氣泡合并和分離的任意成分。充氣劑應(yīng)理解為不包含充氣的氣體。充氣劑優(yōu)選地是多肽基充氣劑，例如水解的乳多肽，如Hygel和Hyfoama(購自KerryBiosciences)；或者水解的大豆多月太，如Versawhip(購自KerryBiosciences)，禾口D-100TM(購自GunterIndustries)?；蛘?，充氣劑可以是非蛋白基的，例如單甘油酯，如Myverol18_04K(由植物油制備的經(jīng)蒸餾的95%單甘油酯，購自QuestInternational)，或聚甘油酯，如PGE55(脂肪酸的聚甘油脂，購自Danisco)。甜食中的充氣劑的量為至少0.，優(yōu)選至少0.15wt%。優(yōu)選地，充氣劑的量小于0.5wt%，優(yōu)選小于0.4wt%，更優(yōu)選小于0.25wt%。本發(fā)明的冰甜食可包含穩(wěn)定劑。穩(wěn)定劑包括多肽，如明膠；植物壓出物，如阿拉伯樹膠、茄替膠、刺梧桐樹膠、黃蓍膠；種子膠，如刺槐豆膠、瓜爾豆膠、塔拉膠、洋車前子種子膠、溫悖種子膠或羅望子種子膠；魔芋甘露聚糖；海藻提取物，如瓊脂、海藻酸、卡拉膠或紅藻膠；果膠，如低甲氧基或高甲氧基型果膠；纖維素衍生物，如羧甲基纖維素鈉、微晶纖維素、甲基纖維素和甲基乙基纖維素、或羥丙基纖維素和羥丙基甲基纖維素；以及微生物膠，如葡聚糖、黃原膠或3-1，3_葡聚糖。穩(wěn)定劑可以是單一穩(wěn)定劑，或者兩種或多種穩(wěn)定劑的混合物。優(yōu)選地，穩(wěn)定劑是刺槐豆膠。穩(wěn)定劑的量優(yōu)選為最多0.3wt%，更優(yōu)選最多為0.25wt%0例如，穩(wěn)定劑的量通常為0-0.2wt%0本發(fā)明的冰甜食可包含多肽(除任意的多肽基充氣劑之外)，優(yōu)選地是至少lwt%的量，更優(yōu)選至少1.5wt%。包含至少上述量多肽的冰甜食被認(rèn)為是乳冰型產(chǎn)品，與大量不含多肽的冰甜食相比更吸引眾多消費(fèi)者。優(yōu)選地，多肽含量小于8wt%，更優(yōu)選小于6wt%，最優(yōu)選小于3wt%。用于本發(fā)明的適宜的多肽包括乳多肽、蛋多肽和膠質(zhì)以及蔬菜多肽，如大豆多肽。尤其優(yōu)選的是乳多肽，因?yàn)樗鼈冇懈玫奈兜篮蜔岱€(wěn)定性。乳多肽的適宜來源包括牛奶、濃縮奶、奶粉、乳清、乳清粉和乳清多肽濃縮分離物。本發(fā)明的冰甜食通常包含糖，如蔗糖、果糖、葡萄糖、乳糖、玉米糖漿、糖醇；它們還可包括其他成分，如色素和調(diào)味品。冰甜食優(yōu)選地具有至少20%的膨脹率，更優(yōu)選至少40%，最優(yōu)選至少60%。優(yōu)選地，膨脹率為最多150%，更優(yōu)選最多120%，最優(yōu)選最多120%?！盎旌衔铩敝赋錃馇?或融化的冰甜食除氣后)的未充氣混合物。膨脹率是在大氣壓力下測(cè)定。本發(fā)明的冰甜食可構(gòu)成整個(gè)產(chǎn)品或可為復(fù)合產(chǎn)品的一個(gè)組分。在復(fù)合產(chǎn)品中，本發(fā)明的冰甜食提供的質(zhì)地和外觀與產(chǎn)品其他組分形成對(duì)照。優(yōu)選地，這種復(fù)合產(chǎn)品包含冰甜食作為其結(jié)構(gòu)中的離散元素。例如，相對(duì)軟的冰淇淋核可以包覆一層冰甜食，以提供包圍冰淇淋核的硬質(zhì)酥脆層。另一個(gè)實(shí)例是摻入冰甜食作為內(nèi)含物?；蛘?，冰甜食可以在至少一個(gè)表面上設(shè)置有比如冰衣、未充氣的水冰或巧克力的連續(xù)或部分包衣。在復(fù)合產(chǎn)品中，總固體和脂肪、充氣劑、冰結(jié)構(gòu)多肽、穩(wěn)定劑以及多肽含量的測(cè)定僅考慮冰甜食，而不考慮復(fù)合產(chǎn)品其他組分。含有本發(fā)明多肽的離散冷凍乳制品甜食可用本領(lǐng)域已知的任意適宜的方法來制備，然而，離散乳制品甜食優(yōu)選地通過以下方法制備，包含步驟(a)制備成分的混合物；然后(b)巴氏殺菌并勻化該混合物；然后(c)添加本發(fā)明的多肽；(d)同時(shí)使該混合物冷凍并用充氣氣體對(duì)該混合物充氣，充氣氣體含有至少50%體積的二氧化碳、氧化亞氮或其混合物，以生產(chǎn)冰甜食(例如在冰淇淋冷凍機(jī)中)；(e)冷加工硬化該冰甜食，其中步驟(c)可以在步驟(b)期間或之前、之后進(jìn)行。混合物用氣體充氣，該氣體含有至少約50%體積的二氧化碳、氧化亞氮或其混合物，優(yōu)選至少約70%，更優(yōu)選100%。充氣氣體的剩余部分通常為含氮?dú)獾臍怏w，如空氣。充氣氣體最優(yōu)選地是100%二氧化碳。冷凍后，得到的冰甜食可以在冷硬化步驟之前，比如通過擠壓，隨后切割或模制來成型。冰甜食優(yōu)選地是在4°C至-1.5°C的溫度下擠壓，更優(yōu)選-2.5°C至-1.5°C。相對(duì)高的擠壓溫度產(chǎn)生相當(dāng)好的泡沫狀外觀。冷硬化步驟優(yōu)選地在約-25°C或更低的溫度下進(jìn)行，例如通過鼓風(fēng)冷凍。在冷硬化之后，冰甜食優(yōu)選地儲(chǔ)存在_25°C至-10°C溫度下，通常約-18°C。含有本發(fā)明多肽的低脂肪乳制品本發(fā)明還提供冷凍的低脂肪乳制品。冷凍乳制品甜食是通常含有乳或乳固體的甜食，如冰淇淋、奶冰、冷凍酸奶和果子露。術(shù)語“乳”包括乳替代品，如大豆乳，但優(yōu)選的是哺乳動(dòng)物的奶。冷凍乳制品甜食優(yōu)選地是冰淇淋或奶冰。本發(fā)明的低脂肪產(chǎn)品優(yōu)選包含3wt%或更少的脂肪，優(yōu)選2wt%或更少，更優(yōu)選小81于2wt%，或lwt%或更少。在一種實(shí)施方式中，該產(chǎn)品是不含脂肪的，意思是該產(chǎn)品中基本不含脂肪(即低于0.lwt%)。當(dāng)產(chǎn)品包覆有非乳成分，如巧克力或糖皮層時(shí)，該產(chǎn)品脂肪量的測(cè)定應(yīng)該排除包衣。含乳的冷凍甜食優(yōu)選包含至少約3wt%的無脂乳固體(MSNF)，更優(yōu)選約5襯％至約25wt%&MSNF。穩(wěn)定劑可存在于本發(fā)明的冷凍產(chǎn)品中，但應(yīng)該注意的是，本發(fā)明多肽的穩(wěn)定作用在某些情況下可以代替穩(wěn)定劑。然而，在某些產(chǎn)品配方中，比如含有低于脂肪的極低脂肪產(chǎn)品，除了本發(fā)明的多肽之外，仍可能需要大量的穩(wěn)定劑，以產(chǎn)生令人滿意的產(chǎn)品穩(wěn)定性。然而，所得產(chǎn)品較以前的產(chǎn)品有所改進(jìn)。因?yàn)楸景l(fā)明的多肽降低或改善了穩(wěn)定劑對(duì)質(zhì)地和味道的不良效果。適宜的穩(wěn)定劑包括藻酸鹽、明膠、阿拉伯樹膠、瓜爾豆膠、刺梧桐樹膠、刺槐豆膠、卡拉膠及其鹽、黃樹膠、微晶纖維素、纖維素醚或其混合物。按重量計(jì)，穩(wěn)定劑的量優(yōu)選地為1.5%或更少，更優(yōu)選或更少，如0.1-0.8wt%。在一種實(shí)施方式中，產(chǎn)品包含至少0.5wt%的穩(wěn)定劑，如至少0.7wt%的穩(wěn)定劑。這種產(chǎn)品中的脂肪水平優(yōu)選地為小于2襯％或lwt%。在另一種實(shí)施方式中，產(chǎn)品包含小于0.5wt%的穩(wěn)定劑。這種產(chǎn)品中的脂肪水平優(yōu)選地為至少或更多，更優(yōu)選至少2wt%。本發(fā)明的冷凍甜食通常包含至少約0.0001wt%的本發(fā)明的多肽。更優(yōu)選至少0.0005wt%。本發(fā)明的多肽可以在非常低的濃度下使用，因此甜食優(yōu)選地包含小于0.05wt%的本發(fā)明的多肽。優(yōu)選的范圍是約0.001-0.01wt%，更優(yōu)選0.005-0.01wt%o冷凍甜食可以是充氣或未充氣的，優(yōu)選充氣。未充氣是指冷凍甜食具有小于20%的膨脹率，優(yōu)選小于10%。未充氣的冷凍甜食不進(jìn)行有意的步驟，如振蕩以增加氣體含量。然而，可以理解的是，在未充氣冷凍甜食的制備期間，低水平的氣體，如空氣，可能摻入該產(chǎn)品中。充氣產(chǎn)品中存在的膨脹率的量會(huì)根據(jù)所需的產(chǎn)品性質(zhì)而變化。例如，冰淇淋中膨脹率的量通常為70-100%，甜食如慕斯中的膨脹率可以高達(dá)200-250wt%，而奶冰中的膨脹率為25-30%。充氣冷凍甜食優(yōu)選地具有30%至200%的膨脹率，更優(yōu)選50%至150%。本發(fā)明的冷凍甜食可以用本領(lǐng)域內(nèi)已知的各種技術(shù)來制備。產(chǎn)品通常靜止或者使用攪拌冷凍，比如在刮面式換熱器中。產(chǎn)品可以是模制的。產(chǎn)品可以包含復(fù)雜形狀，并具有高度的表面定義，因?yàn)楸景l(fā)明多肽的添加保持了這種形狀和結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。本發(fā)明的多肽可以在產(chǎn)品冷凍之前、期間或之后添加。如果在冷凍之后添加，則這將在產(chǎn)品仍可塑時(shí)進(jìn)行，以便本發(fā)明的多肽可以被混合，例如在從刮面式換熱器擠壓后以及在硬化之前。冰淇淋產(chǎn)品及其類似品可以進(jìn)行可選的低于-20°C至_25°C的冷硬化步驟。本發(fā)明還包括用于生產(chǎn)本發(fā)明的低脂肪冷凍甜食產(chǎn)品的組合物，該組合物包含本發(fā)明的多肽，優(yōu)選至少0.005wt%的本發(fā)明多肽。這種組合物包括液體預(yù)混合物和干燥混合物，比如粉末，其中向干燥混合物中添加水液，比如奶或水。設(shè)計(jì)用于在微波中解凍的冷凍食品，所述食品含有本發(fā)明的多肽冷凍是用于貯存食品的非常常見的技術(shù)。除了某些明顯的例外，冷凍食品通常在使用之前或者進(jìn)一步處理之前解凍(如，烹飪)。通過將冷凍食品置于室溫下圓滿地完成解凍。然而，即使在家用規(guī)模上，完成令人滿意的解凍所耗費(fèi)的時(shí)間長也是相當(dāng)大的。在工業(yè)82規(guī)模上，解凍還通過對(duì)冷凍食品應(yīng)用傳導(dǎo)或?qū)α鳠醽硗瓿?。然而，需要完成這種解凍的設(shè)備對(duì)于消費(fèi)者不容易獲得。微波爐正日益廣泛地用于工業(yè)和家庭背景。它們其中的一個(gè)用途是解凍冷凍食品。微波解凍比在室溫下解凍更快速。它也具有許多缺點(diǎn)■冷凍食品的低熱擴(kuò)散需要使用脈沖微波，以允許建立溫度平衡；■液體水比冰更容易吸收微波能量，往往導(dǎo)致“熱點(diǎn)”及不平衡的解凍。■與大小和形狀相關(guān)的食品的幾何學(xué)必須是適宜的；■因?yàn)楸仨氈挥瞄g歇的微波脈沖，解凍食品的時(shí)間是相當(dāng)可觀的。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，如果將含有中間相的水、乳化劑以及本發(fā)明多肽的組合物摻入食品中，以及如果至少水的量是作為未凍結(jié)水存在于冷凍食品中，則獲得了改進(jìn)的食品。此處詞匯“中間相”同時(shí)包括層狀結(jié)構(gòu)和傳統(tǒng)的中間相，即片狀、立方體、六角形(1和2)，L2和L1也分散的中間相，即脂質(zhì)體、立方晶和六角相。此外，它包括形成膠束，該膠束也會(huì)形成這類表面。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過應(yīng)用直接的微波能量可以均勻并快速地解凍上述冷凍食品，而沒有必要使用間歇或脈沖微波?？梢韵嘈诺氖?，本發(fā)明系統(tǒng)保持冷凍食品中存在的部分未凍結(jié)水的能力是因?yàn)榻M合物形成中間相的能力。中間相是一種結(jié)構(gòu)，其中極性乳化劑和水根據(jù)它們的極性排列在清晰的結(jié)構(gòu)中。乳化劑的極性端基與水相接觸。相信存在許多不同的中間相結(jié)構(gòu)。與乳化劑的極性端基接近的水是以一種免于凍結(jié)的方式進(jìn)行組織排列。本發(fā)明組合物中水與乳化劑的比率取決于使用的乳化劑，以及組合物的具體應(yīng)用。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，對(duì)于任意具體的乳化劑/水系統(tǒng)，低于0°C存在的液體水的量(“未凍結(jié)水”)往往隨水的比例增加直至最大值。達(dá)到該最大點(diǎn)時(shí)，基本上系統(tǒng)內(nèi)所有的水被認(rèn)為是未凍結(jié)的。超過該點(diǎn)時(shí)，存在的水的固定量是未凍結(jié)的，與凍結(jié)相平衡。優(yōu)選地，當(dāng)存在于_15°C或者更低溫度下的冷凍食品中時(shí)，本發(fā)明的組合物包含至少一定量的未凍結(jié)水。優(yōu)選地，當(dāng)存在于-20°C或者更低溫度下的冷凍食品中時(shí)，本發(fā)明的組合物包含至少一定量的未凍結(jié)水。優(yōu)選地，當(dāng)存在于約_25°C或者更低溫度下的冷凍食品中時(shí)，本發(fā)明的組合物包含至少一定量的未凍結(jié)水。優(yōu)選地，當(dāng)存在于約-40°C或者更低溫度下的冷凍食品中時(shí)，本發(fā)明的組合物包含至少一定量的未凍結(jié)水。當(dāng)存在于冷凍產(chǎn)品中時(shí)，本發(fā)明的組合物優(yōu)選包含一定量的未凍結(jié)水，該未凍結(jié)水在低于o°c溫度下是熱力學(xué)穩(wěn)定的。優(yōu)選地，水組分是以基于組合物總重量的至少0.的量存在。優(yōu)選地，水組分是以基于組合物總重量的至少的量存在。優(yōu)選地，水組分是以基于組合物總重量的至少2%的量存在。優(yōu)選地，水組分是以基于組合物總重量的至少3%的量存在。優(yōu)選地，水組分是以基于組合物總重量的至少5%的量存在。優(yōu)選地，水組分是以基于組合物總重量的至少10%的量存在。優(yōu)選地，水組分是以基于組合物總重量的最多99.9%的量存在。優(yōu)選地，水組分83是以基于組合物總重量的最多50%的量存在。優(yōu)選地，水組分是以基于組合物總重量的最多40%的量存在。優(yōu)選地，水組分是以基于組合物總重量的最多30%的量存在。優(yōu)選地，水組分是以基于組合物總重量的最多25%的量存在。優(yōu)選地，水組分是以基于組合物總重量的0.1-99.9%之間的量存在。更優(yōu)選地，水組分是以基于組合物總重量的1-25%之間的量存在。優(yōu)選地，乳化劑是以基于組合物總重量的至少0.的量存在。優(yōu)選地，乳化劑是以基于組合物總重量的至少50%的量存在。優(yōu)選地，乳化劑是以基于組合物總重量的至少60%的量存在。優(yōu)選地，乳化劑是以基于組合物總重量的至少70%的量存在。優(yōu)選地，乳化劑是以基于組合物總重量的至少80%的量存在。優(yōu)選地，乳化劑是以基于組合物總重量的至少99.0%的量存在。優(yōu)選地，乳化劑是以基于組合物總重量的至少99.9%的量存在。優(yōu)選地，乳化劑是以基于組合物總重量的多至99.9%的量存在。優(yōu)選地，乳化劑是以基于組合物總重量的多至99%的量存在。優(yōu)選地，乳化劑是以基于組合物總重量的多至97%的量存在。優(yōu)選地，乳化劑是以基于組合物總重量的多至95%的量存在。優(yōu)選地，乳化劑是以基于組合物總重量的多至90%的量存在。優(yōu)選地，乳化劑是以基于組合物總重量的0.1-99.9%之間的量存在。更優(yōu)選地，乳化劑是以基于組合物總重量的75-90%之間的量存在。優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽是以基于組合物總重量的至少0.001%的量存在。優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽是以基于組合物總重量的至少0.01%的量存在。優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽是以基于組合物總重量的至少0.1%的量存在。優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽是以基于組合物總重量的至少的量存在。優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽是以基于組合物總重量的至少5%的量存在。優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽是以基于組合物總重量的至少10%的量存在。優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽是以基于組合物總重量的最多90%的量存在。優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽是以基于組合物總重量的最多50%的量存在。優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽是以基于組合物總重量的最多25%的量存在。優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽是以基于組合物總重量的最多15%的量存在。優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽是以基于組合物總重量的最多10%的量存在。優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽是以基于組合物總重量的0.001-90%之間的量存在。更優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽是以基于組合物總重量的0.01-10%之間的量存在。在一個(gè)優(yōu)選的方面，組合物包含低于25%w/w的油。更優(yōu)選地，組合物包含低于10%w/w的油。更優(yōu)選地，組合物包含低于5%w/w的油。更優(yōu)選地，組合物包含低于1%w/w的油。更優(yōu)選地，組合物包含低于0.1%w/w的油。最優(yōu)選地，組合物基本不包含油。其余組分也可存在于本發(fā)明的組合物中，只要它們?cè)诶鋬鍪称分写嬖跁r(shí)不影響保留至少一部分未凍結(jié)水的能力。進(jìn)行結(jié)合技術(shù)的一個(gè)實(shí)例是混合。將水與本發(fā)明的多肽和乳化劑混合可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的任意一種方法來實(shí)現(xiàn)。在電動(dòng)混合器中混合就是一個(gè)實(shí)例。如果組合物中存在除本發(fā)明的多肽、乳化劑和水以外的成分，那么這些成分可以在任意合適的階段摻入。優(yōu)選地，食品包含足夠量的組合物，以便食品中作為整體形式存在的未凍結(jié)水的量使均勻和快速的微波解凍成為可能。實(shí)際上，這相當(dāng)于食品中作為整體存在的未凍結(jié)水的量為至少0.w/w。[1372]用量水平取決于具體的食品、應(yīng)用以及在冷凍后需要多少水來保持食品質(zhì)地?？偖a(chǎn)品的低至約0.的非凍結(jié)水的量使產(chǎn)品在微波爐中加熱時(shí)快速并均勻地解凍。這種爐解凍使產(chǎn)品具有改進(jìn)的結(jié)構(gòu)性質(zhì)。為得到本發(fā)明0.1%的未凍水，需要用大約0.20%的PGE。準(zhǔn)確的乳化劑的量取決于乳化劑的性質(zhì)，并且可由本領(lǐng)域技術(shù)人員快速確定。例如，0.14%的DimodanM090或0.14%的GrindstedPGE070(Danisco,Denmark)會(huì)產(chǎn)生相同的效果。優(yōu)選地，食品包含至少0.的本發(fā)明的組合物。優(yōu)選地，食品包含至少0.2%W/V的本發(fā)明的組合物。優(yōu)選地，食品包含至少0.3%w/w的本發(fā)明的組合物。優(yōu)選地，食品包含至少0.4%w/w的本發(fā)明的組合物。優(yōu)選地，食品包含至少0.5%w/w的本發(fā)明的組合物。優(yōu)選地，食品包含小于10%w/w的本發(fā)明的組合物。優(yōu)選地，食品包含小于5%w/w的本發(fā)明的組合物。優(yōu)選地，食品包含小于4%w/w的本發(fā)明的組合物。優(yōu)選地，食品包含小于3%w/w的本發(fā)明的組合物。優(yōu)選地，食品包含0.1-5%w/w的本發(fā)明的組合物，更優(yōu)選0.5-3%w/w。本發(fā)明組合物的應(yīng)用模式取決于所討論食品的性質(zhì)。例如，如果食品在室溫下是液體或者半液體，則該組合物可以簡單地通過將其與食品混合而摻入。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，水、本發(fā)明的多肽和乳化劑可以分別添加到食品中。本發(fā)明的多肽和乳化劑可以在加水之后加入?；蛘?，水可在加入本發(fā)明的多肽和乳化劑之后加入。優(yōu)選的是，本發(fā)明的多肽、乳化劑和水在添加到食品之前合并。或者，該組合物可以在食品制備工藝的任意時(shí)刻摻入。例如，組合物可以噴在食品的表面。組合物可以注入食品中(如，就禽、肉或魚而言)。技術(shù)人員可以判斷何時(shí)最佳實(shí)現(xiàn)這種納入。優(yōu)選地，食品選自低脂肪涂布的蛋黃醬、酸奶、面包餡料、人造黃油、重組水果、果醬、水果配料、水果餡、奶粉(ripple)、水果醬、燉水果、咖啡奶精、即時(shí)水果甜食、甜食(如棉花糖)，土豆基食品(如炸土豆條、炸薯?xiàng)l和炸丸子)，配制的餐食(如砂鍋和燉菜)，以及精制食品(如調(diào)料，包括沙拉調(diào)料；番茄醬、油醬汁和湯)。該食品可以是飲料類、生的，經(jīng)過處理或巴氏滅菌的食品，包括生肉、熟肉、生的家禽產(chǎn)品、熟的家禽產(chǎn)品、生的海鮮產(chǎn)品、熟的海鮮產(chǎn)品、[生或熟肉、禽和海鮮產(chǎn)品]、臘腸、香腸、易于吃掉的餐食、通心粉醬、巴氏滅菌的湯、腌泡汁、水油包乳劑、油包水乳劑、涂抹干酪、加工奶酪、乳制品甜食、調(diào)味乳、奶油、發(fā)酵乳制品、奶酪、黃油、煉乳制品、涂抹干酪、巴氏滅菌雞蛋液、冰淇淋混合物、大豆制品、巴氏滅菌液體蛋、糕點(diǎn)產(chǎn)品、水果產(chǎn)品，以及帶有脂肪基或含水填料的食品。食品可以是焙烤食品，如面包、蛋糕、精面包和生面團(tuán)。本發(fā)明的化妝品和皮膚病治療的組合物本發(fā)明還提供一種化妝品或皮膚科制劑，其包含本發(fā)明多肽-可選擇地聯(lián)合有一種或多種選自抗凍多肽或抗凍糖蛋白的另外多肽。這種制劑可僅包含本發(fā)明的多肽，或者該制劑可包含至少一種另外的抗凍多肽。而且，該組合物可包含至少一種抗凍糖蛋白以及本發(fā)明的多肽。在制備時(shí)，本發(fā)明的多肽在制劑中可以基于該制劑的總重量的0.0001%至50%重量的濃度存在，例如0.001%至50%重量，例如0.1%至10%重量，例如0.1%至1%重量的濃度。在一些情況下，當(dāng)選自抗凍多肽和抗凍糖蛋白的一種或多種另外多肽與本發(fā)明的多肽一起也存在于該制劑中時(shí)，多肽的總量是基于該制劑總重量的0.0001%至50%重量，例如0.001%至50%重量，例如0.至10%重量，例如0.至重量的濃度。優(yōu)選地，所述至少一種另外的抗凍多肽可包含至少一種選自AFP1、AFP2、AFP3和AFP4的多肽，例如，至少一種AFP1型多肽，該多肽是由pseudopluronectesamericanus>myoxocephalusscorpius、myoxocephalusaenaeus禾口/myoxocephalusscorpiodes合成；至少一禾中AFP2型多妝，該多妝是由hemitripterusamericanus、osmerusmordax禾口/或clupeaharengusharengus合成；至少一種AFP3型多肽，該多肽是由macrozoarcesamericanus>rhigophiladearbomilycodespolaris禾口/“各良||/，；和/或至少一種AFP4型多肽,該多肽是由myoxocephalusoctodecimspinosis合成。優(yōu)選地，所述至少一種抗凍糖蛋白可包含至少一種多肽，該多肽是由rematomasborgrevinki、dissostichusmawsoni>boreogadussaida禾口/gadusmorhua^fj^。本發(fā)明的一個(gè)方面，將制劑中一種或多種多肽的至少一部分裝入膠囊。本發(fā)明還提供一種化妝品或者皮膚科制劑，其包含本發(fā)明的多肽以及一種或多種選自抗凍多肽或抗凍糖蛋白的多肽，該多肽由pseudopluronectesamericanus、myoxocephalusscorpius、myoxocephalusaenaeus、myoxocephalusscorpiodes、hemitripterusamericanus、osmerusmordax、clupeaharengusharengus、macrozoarcesamericanus>rhigophiladearborni>lycodespo1aris>anarhichaslupus^myoxocephalusoctodecimspinosis>trematomasborgrevinki>dissostichusmawsoni>boreogadussaida禾口gadusmorhua中的至少一種合成。優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽在所述化妝品和皮膚科制劑中的總量是基于所述制劑的總重量的0.001%至50%重量，例如，濃度為0.至10%的重量。優(yōu)選地，多肽在化妝品或皮膚科制劑中的總量可以是基于所述制劑的總重量的0.001%至50%重量，例如濃度為0.至10%的重量。本發(fā)明還提供一種化妝品或皮膚科產(chǎn)品，它是o/w型乳膏、w/o型乳膏、w/o/w型乳膏、o型乳膏、w/o型乳劑、水分散劑、凝膠狀乳霜、w/o型棒或o型棒，并且它包含本發(fā)明的制劑，包括其各種形式。本發(fā)明還提供一種治療或預(yù)防不良皮膚狀況的方法。該方法包括將本發(fā)明的多肽以及可選地一種或多種多肽施予至少部分皮膚，所述一種或多種多肽選自抗凍多肽和抗凍糖蛋白。一方面，不良皮膚狀況包括皮膚炎癥、色素失調(diào)、外在和內(nèi)在的皮膚老化的癥狀和/或紫外線輻射造成的皮膚損傷。在化妝品和皮膚科制劑的
技術(shù)領(lǐng)域：
，術(shù)語“抗凍多肽”用于描述使機(jī)體即使在極端的條件下仍能保持重要的細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能活性的多肽。考慮到它們的功能，“抗凍多肽”從這種意義上講還代表細(xì)胞水平上的“防凍保護(hù)化合物”。本領(lǐng)域的技術(shù)人員不能預(yù)見到的是，本發(fā)明的制劑比現(xiàn)有技術(shù)的制劑更好地預(yù)防皮膚由于寒冷造成的結(jié)構(gòu)和細(xì)胞損壞，更好地維持或恢復(fù)皮膚的阻隔性能，更好地對(duì)抗皮86膚的干燥行為，更好地對(duì)抗皮膚變色行為，更好地克服發(fā)炎的皮膚狀況，更好地對(duì)抗皮膚老化，以及更好地保護(hù)皮膚對(duì)抗周圍環(huán)境的影響。本發(fā)明的多肽可選地與另外的抗凍多肽(AFP)和/或抗凍糖蛋白(AFGP)—起使用，或者帶有有效量的、可選地與另外的AFP和/或AFGP—起的本發(fā)明多肽的化妝品或局部皮膚科制劑，不但使有效的治療成為可能，而且能預(yù)防皮膚由于寒冷造成的結(jié)構(gòu)和細(xì)胞損傷，這種損傷伴隨明顯的氣候和天氣引起的溫度下降，通過損失細(xì)胞酶的最佳溫度引起細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外間隙的生理學(xué)變化、皮膚損害、皮膚發(fā)紅和皮膚緊繃感、以及增加的感官敏感度，例如由寒冷、風(fēng)和/或紫外線引起的溫度敏感皮膚，由環(huán)境壓力引起的(由溫度變化和紫外線、吸煙、煙霧、活性氧簇、自由基引起)皮膚、嘴唇、鼻和口腔粘膜以及外皮的附著物的負(fù)面變化。本發(fā)明的多肽可選地與另外的AFP和/或AFGP—起使用，或者帶有有效量的、可選地與另外的AFP和/或AFGP—起的本發(fā)明多肽的化妝品或局部皮膚科制劑的使用，有效地治療及預(yù)防缺陷的、敏感的或活動(dòng)力低下的皮膚狀況，或者顯示皮膚過早老化的外皮附屬物(如皺紋、老年性角化癥、毛細(xì)血管擴(kuò)張)或環(huán)境(吸煙、煙霧、活性氧簇、自由基)引起的外皮附屬物的缺陷、敏感或活動(dòng)力低下狀況，尤其是光引起的皮膚和外皮附屬物的負(fù)面變化，光引起的皮膚損傷，色素失調(diào)，敏感、刺激及瘙癢的皮膚，干燥的皮膚狀況以及角質(zhì)層屏障的紊亂，脫發(fā)及為了促進(jìn)頭發(fā)生長，皮膚老化的跡象，如皺紋、減少的皮膚再生，炎癥皮膚狀況和異位性濕疹、脂溢性濕疹、多形性光照性皮膚病、牛皮癬、白斑病，用以舒緩過敏或者刺激性皮膚，以刺激膠原、透明質(zhì)酸和彈性蛋白的合成，健康皮膚正常的透明質(zhì)酸和糖胺多糖的變化，以刺激皮膚神經(jīng)酰胺的合成，以刺激細(xì)胞內(nèi)DNA的合成，尤其是對(duì)于有缺陷或活動(dòng)低下的皮膚狀況，以增加細(xì)胞更新和皮膚再生，以增加皮膚自身保護(hù)和修復(fù)機(jī)制(比如，功能失調(diào)的酶、DNA、脂質(zhì)和多肽)，缺陷、敏感或者活動(dòng)低下的皮膚狀況或缺陷、敏感或者活動(dòng)低下的皮膚附屬物中的細(xì)胞-細(xì)胞交流的減少，健康皮膚的神經(jīng)酰胺、脂質(zhì)和能量機(jī)制的變化，脂質(zhì)和多肽過氧化反應(yīng)的變化，生理性經(jīng)皮水分散失的變化，皮膚保濕度的下降，皮膚水分含量正常的滲透調(diào)節(jié)和下降，天然保濕因子含量的變化，DNA損傷以及內(nèi)源性DNA修復(fù)機(jī)制的下降，金屬蛋白酶和/或其他蛋白酶的激活，或這些酶對(duì)應(yīng)的內(nèi)源性抑制劑的抑制，健康皮膚的結(jié)締組織翻譯后修飾的偏差，在頭發(fā)和發(fā)區(qū)形成頭皮屑，皮膚的脆性，喪失彈性和皮膚疲勞，正常角化細(xì)胞增殖的增加，減少皮膚和頭發(fā)的天然再生和結(jié)構(gòu)的下降，用在局部應(yīng)用的激光和磨蝕處理的前處理和后處理中，比如，以減少皮膚皺紋和疤痕，以抵消形成的皮膚刺激并促進(jìn)損傷皮膚的再生過程。因此，本發(fā)明的多肽，可選地與另外的AFP和/或AFGP的共同使用，用于預(yù)防和治療炎癥皮膚狀況_和異位性濕疹_和/或傾向于敏感和干燥的皮膚情況中的皮膚保護(hù)，也屬于本發(fā)明的范圍。因此，該化妝品或皮膚科制劑的用途，用于生產(chǎn)化妝品和護(hù)膚品制劑，用于治療和/或預(yù)防色素失調(diào)也屬于本發(fā)明的范圍。因此，該制劑的用于生產(chǎn)化妝品或皮膚科制劑的用途，用于治療和/或預(yù)防內(nèi)部和/或外部皮膚老化癥狀以及用于治療和預(yù)防紫外線輻射對(duì)皮膚的不良影響也屬于本發(fā)明的范圍。因此，本發(fā)明的多肽，可選地與另外的AFP和/或AFGP的共同使用，用于生產(chǎn)化妝品或皮膚科制劑，以便增加神經(jīng)酰胺生物的合成也是本發(fā)明的一個(gè)方面。此外，AFP和/或AFGP在制備化妝品或皮膚科制劑以便增強(qiáng)皮膚屏障功能中的應(yīng)用，也是本發(fā)明的另一個(gè)方面?；谥苿┑闹亓浚景l(fā)明的化妝品或皮膚科制劑優(yōu)選地包含基于該制劑的總重量的0.0001%至50%重量的本發(fā)明的多肽，尤其優(yōu)選0.01%至10%重量，可選擇地，本發(fā)明的多肽與另外的AFP和/或AFGP或所述AFP和/或AFGP的兩種或多種的組合一起使用。根據(jù)本發(fā)明，常規(guī)抗氧劑可以用于本發(fā)明的包含活性物質(zhì)結(jié)合物的制劑。有益的是，抗氧劑選自氨基酸(如甘氨酸、組氨酸、酪氨酸、色氨酸、3_丙氨酸)及其衍生物；咪唑類(如咪唑丙烯酸)及其衍生物；肽類，如D，L-肌肽，D-肌肽，L-肌肽及其衍生物(如鵝肌肽)；類胡蘿卜素、胡蘿卜素(如a-胡蘿卜素、胡蘿卜素、番茄紅素)及其衍生物；硫辛酸及其衍生物(如二氫硫辛酸)；金硫葡萄糖、丙基硫尿嘧啶和其他硫醇(如硫氧還蛋白、谷胱甘肽、半胱氨酸、胱氨酸、胱胺和糖基、N-乙?；⒓谆?、乙基、丙基、戊烷基、丁基和十二烷基、櫚?；⒂拖┗?、Y-吲哚基、膽留醇和甘油基酯)及其鹽；硫代二丙酸月桂酯、二硫代丙酸二硬脂酰酯、硫二丙酸及其衍生物(酯、醚、肽、脂質(zhì)、核苷酸、核苷和鹽)和以非常低耐受劑量(如pmol-ymol/kg)的亞砜亞胺化合物(如丁硫氨酸亞砜亞胺、巰基丁氨酸亞砜亞胺、五_、六-和七-硫堇亞砜亞胺)；還有(金屬)螯合劑(如a-羥基脂肪酸、棕櫚酸、植酸、乳鐵蛋白)；a-羥基酸(如檸檬酸、乳酸和蘋果酸)、腐殖酸、膽汁酸、膽汁提取物、膽紅素、膽綠素、EDTA、EGTA及其衍生物；不飽和脂肪酸及其衍生物(如亞麻酸、亞油酸、油酸)；葉酸及其衍生物；丙氨酸二乙酸、類黃酮、多酚、兒茶酚、維生素C及其衍生物(如抗壞血酸棕櫚酸酯、Mg-抗壞血酸磷酸酯、抗壞血酸醋酸酯)；維生素E及其衍生物(如維生素E醋酸酯)；以及安息香樹脂的苯甲酸松脂、蕓香亭酸及其衍生物；阿魏酸及其衍生物；丁基羥基甲苯、丁基羥基苯甲醚、去甲二氫愈創(chuàng)木脂酸、去甲二氫愈創(chuàng)木酸、三羥基苯丁酮、尿酸及其衍生物；甘露糖及其衍生物；鋅及其衍生物(如ZnO、ZnS04)；硒及其衍生物(如硒代蛋氨酸)；芪類及其衍生物(如二苯乙烯氧化物、反式二苯乙烯氧化物)以及上述提及的本發(fā)明適用的活性成分的衍生物(鹽、酯、醚、糖、核苷酸、核苷、肽和脂質(zhì))。制劑中抗氧化劑(一種或多種化合物)的量優(yōu)選地為基于制劑總重量的0.001%至30%的重量，尤其優(yōu)選0.05%至20%的重量，尤其優(yōu)選1%至10%的重量。此外，有益的是將本發(fā)明活性成分用熔蠟封裝，就像所稱的固體脂質(zhì)納米微粒一樣。熔蠟可選自但不限于蠟酯、甘油三酯蠟或烴蠟。而且，有益的是將本發(fā)明的活性成分封裝在聚合物中，比如封裝在基于高度交聯(lián)聚甲基丙烯酸樹脂和/或纖維三醋酸酯的顆粒中和/或作為芯/殼顆粒，該顆粒帶有由聚甲醛、尼龍、聚酰胺、聚氨酯、聚酯、膠質(zhì)和聚烯烴制成。用本發(fā)明的活性成分或者以本發(fā)明使用的活性成分作為有效內(nèi)容物的化妝品或局部皮膚科制劑進(jìn)行的預(yù)防或化妝品或皮膚科治療，可以以常規(guī)的方式完成，即通過將本發(fā)明使用的活性成分或者以本發(fā)明使用的活性成分作為有效內(nèi)容物的化妝品或局部皮膚科制劑施予皮膚疫區(qū)。本發(fā)明使用的活性成分可以有利地?fù)饺氤Ｒ?guī)化妝品和皮膚科制劑中，它們可以呈現(xiàn)不同的形式。例如，它們可以是溶液、油包水(W/0)型或水包油(0/W)型的乳劑、或者復(fù)合乳劑，如水包油包水(w/0/w)型或油包水包油型(0/W/0)、水分散劑或油分散劑、凝膠、Pickering乳液、固體棒或噴霧劑。為了本發(fā)明的目的，本發(fā)明的乳劑，比如乳霜、洗液、護(hù)膚乳的形式是有益的，并且可包含可能包括脂肪、油、蠟和/或其他油性物質(zhì)和水，以及這類配方常規(guī)使用的一種或多種乳化劑。為了本發(fā)明的目的，還可能有益地將本發(fā)明使用的活性成分摻入水體系或表面活性劑制劑中，用于清潔或處理皮膚和頭發(fā)。當(dāng)然，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以意識(shí)到，要求嚴(yán)格的化妝品組分在不含常規(guī)的輔劑和添加劑時(shí)是難以想象的。輔劑和添加劑的實(shí)例包括增潔劑、填料、香料、染料、乳化劑、附加的有效成分，如維生素或多肽、光保護(hù)劑、穩(wěn)定劑、殺蟲劑、乙醇、水、鹽，以及抗微生物的、蛋白分解的或促角質(zhì)層分離的活性物質(zhì)等。相應(yīng)的要求通過必要的變更可適用于藥品制劑配方。用于本發(fā)明目的的局部藥用成分通常包括有效濃度的一種或多種藥物。為簡單起見，為明確區(qū)別化妝品和藥物應(yīng)用以及相應(yīng)的產(chǎn)品，可參考德意志聯(lián)邦共和國的法律規(guī)定(如化妝品指令、食品和藥品法案)。在這一方面，同樣有益的是將本發(fā)明使用的活性成分作為添加劑添加到用于其他目的的已經(jīng)包含其他活性成分的制劑中。因此，為了本發(fā)明的目的，化妝品或局部皮膚科組分可以根據(jù)其配方用作護(hù)膚霜、潔膚乳、防曬乳液、營養(yǎng)霜、日霜或晚霜、護(hù)唇膏、鼻噴霧劑等。在某些情況下，可能有益的是將本發(fā)明的組合物用作藥物配方的基礎(chǔ)。為了本發(fā)明的目的，同樣有益的是提供一種化妝品和皮膚科制劑，它們的主要目的不是防曬，但是仍然含有一定量的UV防護(hù)物質(zhì)。因此，如UVA和/或UVB過濾物通常包含在日霜或者面膜產(chǎn)品中。同時(shí)UV防護(hù)物質(zhì)，視需要還有抗氧劑和防腐劑，都能有效保護(hù)制劑防止其變質(zhì)。此外，遮光劑的形式的化妝品和皮膚科制劑也是有利的。因此，本發(fā)明的制劑，除本發(fā)明的一種或多種活性成分組合外，優(yōu)選地可額外地包含至少一種UVA過濾物質(zhì)和/或UVB過濾物質(zhì)。盡管不是必須的，該配方也可以選擇性地包含一種或多種有機(jī)和/或無機(jī)色素作為UV過濾物質(zhì)，該物質(zhì)可以存在于水相和/或油相中。優(yōu)選的無機(jī)色素是在水中不溶或難溶的金屬氧化物和/其他金屬化合物，尤其是二氧化鈦(Ti02)、氧化鋅(ZnO)、氧化鐵(如Fe203)、氧化鋯(&02)、氧化硅(Si02)、氧化錳(如MnO)、氧化鋁(A1203)、鈰(如Ce203)、相應(yīng)金屬的混合氧化物，以及這些氧化物的混合物。根據(jù)本發(fā)明，這些色素可以有利地進(jìn)行表面處理(“包衣”)，比如，由此形成或保留了這些色素的親水或疏水性質(zhì)。這種表面處理可以包括通過已知的方法為色素本身提供一個(gè)薄的疏水層。根據(jù)本發(fā)明，例如以辛基硅醇包衣的二氧化鈦色素是有利的。適宜的二氧化鈦顆?？少徸訢egussa公司，商品名為T805。此外，以硬脂酸鋁包衣的Ti02色素是尤其有利的，例如購自TAYCA公司，商品名MT100T。無機(jī)色素進(jìn)一步有利的包衣包括二甲基亞砜(又叫DMS0)，用三甲基硅氧基單元進(jìn)行末端保護(hù)的完全甲基化的、線性硅氧烷聚合物的混合物。為了本發(fā)明的目的，尤其有利的色素是以這種方法包衣的氧化鋅色素。另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是用二甲基聚硅氧烷(尤其是平均鏈長為200至350個(gè)二甲基硅氧烷單位的二甲基聚硅氧烷)和硅膠的混合物包衣的無機(jī)色素，硅膠也稱作二甲基硅油。尤其有利的是無機(jī)色素已經(jīng)另外用氧化鋁或水合氧化鋁(也叫礬土，CASNo.1333-84-2)包衣。尤其有利的是被二甲基硅油和氧化鋁包衣的氧化鈦，該包衣也可能包含水。它的一個(gè)實(shí)例是購自merk公司、商品名為EusolexT2000的二氧化鈦。為了本發(fā)明的目的，一種有利的有機(jī)色素包括2，2'-次甲基雙_(6-(2H-苯并三氮唑-2-基)-4-(1，1，3，3_四甲基丁基)苯酚)[INCI雙辛基三氮唑]，其可購自CIBAChemikalienGmbH公司，商品名為Tinosorb(R)M。有利的是，本發(fā)明的制劑含有吸收UVA和/或UVB范圍內(nèi)的UV輻射的物質(zhì)，例如，該過濾物質(zhì)的總量是基于制劑總重量的0.重量至30%重量，優(yōu)選0.5-20%重量，尤其是1.0-15%的重量，以便提供保護(hù)頭發(fā)或皮膚抵御整個(gè)范圍紫外線輻射的化妝品制劑。它們也可以用作頭發(fā)或皮膚的遮光劑。為了本發(fā)明的目的，進(jìn)一步有利的UVA過濾物質(zhì)包括二苯甲酰甲烷衍生物，尤其是4-(叔丁基)-4'-甲氧基二苯酰甲烷(CASNo.70356-09-1)，由Givaudan公司銷售，商品名Parsol1789以及由merk公司銷售，商品名Eusolex9020。進(jìn)一步有利的UVA過濾物質(zhì)包括亞苯基-1，4_二-(2-苯并咪唑)_3，3'，5，5'-四磺酸及其鹽，尤其是相應(yīng)的鈉鹽、鉀鹽或三乙醇銨鹽；尤其是亞苯基-1，4-二(2-苯并咪唑)_3，3‘,5,5‘-四磺酸二鈉鹽，INCI名為Bisimidazylate，可以購自Haarmann&Reimer公司，商品名NeoHeliopanAP。1，4_二(2-氧代-10-硫-3-bornylidenemethyl)苯及其鹽(尤其是相應(yīng)的10-硫酸根合化合物，尤其是相應(yīng)的鈉鹽、鉀鹽或三乙醇銨鹽)也是有利的，它也被稱為苯基-1，4-二(2-氧-3-bornylidenemethyl-10-磺酸。為了本發(fā)明的目的，有利的UV過濾物質(zhì)也是所謂的寬帶過濾器，即同時(shí)吸收UVA和UVB輻射的過濾物質(zhì)。例如，有利的寬帶過濾器或者UVB過濾物質(zhì)包括bis-resorcinyltriazine衍生物。尤其優(yōu)選的是2，4_二{[4-(2_乙基己氧基)_2_羥基苯基}-6-(4_甲氧基苯基)-1，3，5-三嗪(INCI:AnisoTriazine)，可購自CIBA-ChemikalienGmbH，商品名TinosorbS。為了本發(fā)明的目的，尤其有利的制劑的特征是具有高或很高的UVA保護(hù)，優(yōu)選包含幾種UVA和/或?qū)拵н^濾物，尤其是單獨(dú)或者相互任意結(jié)合的二苯甲酰甲烷衍生物[如，4-(叔丁基)-4'甲氧基二苯甲酰甲烷]、苯并三唑衍生物[如，2，2'亞甲基-二-(6-(2H-苯并三氮唑-2-基)-4-(1，1，3，3_四甲基丁基)-苯酚]、亞苯基-1，4-二(2-苯并咪唑基)-3，3',5,5‘-四磺酸和/或其鹽、1，4_二(2-氧代-10-硫基-3-bornylidenemethyl)苯和/或其鹽，和/或2，4_二{[4-(2-乙基己氧基)_2_羥基苯基}-6-(4_甲氧苯基)-1，3，5-三嗪。本發(fā)明有利地使用的另一種光保護(hù)過濾物質(zhì)是乙基己基-2-腈基-3，3_二苯基丙烯酸酯(氰雙苯丙烯酸辛酯)，其可購自BASF公司，商品名UvinulN539。另外相當(dāng)有利的是，在本發(fā)明的制劑中使用聚合物束或聚合物UV過濾物質(zhì)，尤其是TO-A-92/20690中描述的那些。90[1435]此外，還可能有利的是將進(jìn)一步的UVA和/或UVB過濾物納入本發(fā)明的化妝品或皮膚科制劑中，例如某些水楊酸衍生物，如4-異丙基芐基水楊酸酯、2-乙基己基水楊酸酯(_辛基水楊酸鹽)以及原膜散酯。當(dāng)然，上述列出的可以用于本發(fā)明目的的UV過濾物并不是對(duì)本發(fā)明的限制。本發(fā)明的制劑有利地包含可以吸收UVA和/或UVB范圍中的UV輻射的物質(zhì)。例如，它們是基于制劑的總重量的0.重量至30%重量，優(yōu)選0.5%至20%重量，尤其是1.0%至15%重量，以便制備可獲得的化妝品制劑，其可以保護(hù)頭發(fā)或皮膚免受整個(gè)范圍的紫外線輻射。它們還可以用作頭發(fā)和皮膚的遮光劑。本發(fā)明的化妝品和皮膚科制劑可以包括化妝品活性成分，這種制劑中常規(guī)使用的輔助劑和添加劑，例如抗氧化劑、防腐齊IJ、殺菌齊IJ、香料、消泡齊IJ、染料、著色顏料、增稠齊IJ、表面活性劑、乳化劑、潤膚劑、保濕劑和/或潤濕劑、脂肪、油、蠟和其他常規(guī)的化妝品或皮膚科制劑組分，如醇、多元醇、聚合物、泡沫穩(wěn)定劑、電解質(zhì)、有機(jī)溶劑或有機(jī)硅衍生物。如果本發(fā)明的化妝品或皮膚科制劑是以溶液或乳劑或分散劑的形式存在，則以下可用作溶劑水或水溶液；油，如癸酸或辛酸的甘油三酯，優(yōu)選蓖麻油；脂肪、蠟以及其他天然和合成脂質(zhì)，優(yōu)選脂肪酸與低碳(C)數(shù)的醇形成的酯，例如異丙醇、丙二醇或甘油，或脂肪醇與低碳數(shù)的烷酸或與脂肪酸形成的酯；低碳數(shù)的醇、二元醇或多元醇及其醚，優(yōu)選乙醇、異丙醇、丙二醇、甘油、乙二醇、乙二醇單乙醚或單丁醚、丙二醇單甲醚或單乙醚或單丁醚、二乙二醇單乙醚或單乙醚，以及類似產(chǎn)品。尤其可使用上述溶劑的混合物。在醇溶劑的情況下，水可以是進(jìn)一步的組分。本發(fā)明的乳化劑、油凝膠或水_或酯_分散劑的油相有利地選自飽和和/或不飽和、分支和/或無分支的鏈長度為3至30個(gè)碳原子的烷基羧酸與飽和和/或不飽和、分支和/或無分支的鏈長度為3至30個(gè)碳原子的醇所形成的酯，選自芳香羧酸與飽和和/或不飽和、分支和/或無分支的鏈長度為3至30個(gè)碳原子形成的酯。在這種情況下，這種酯油可有利地選自肉豆蔻酸異丙酯、棕櫚酸異丙酯、硬脂酸異丙酯、油酸異丙酯、硬脂酸正丁酯、月桂酸正己酯、油酸正癸酯、硬脂酸異辛酯、硬脂酸異壬酯、異壬酸異壬酯、2-乙基己基棕櫚酸酯、2-乙基己基月桂酸酯、2-己基癸醇硬脂酸酯、2-辛基十二醇棕櫚酸酯、油酸油酯、芥酸油酯、瓢兒菜醇油酸酯、瓢兒菜醇芥酸酯，以及這些酯的合成、半合成和天然的混合物，如霍霍巴油。而且，油相可有利地選自分支和無分支的烴和烴蠟、硅油、二烷基醚；飽和或不飽和的、分支或無分支的醇和脂肪酸甘油三酯，即，飽和和/或不飽和的、分支和/或不分支的鏈長度為8至24，尤其為12至18個(gè)碳原子的烷基羧酸的甘油三酯。例如，脂肪酸甘油三酯可有利地選自合成、半合成和天然的油，如橄欖油、葵花籽油、大豆油、花生油、菜籽油、杏仁油、棕櫚油、椰子油、棕櫚仁油等。這種油和蠟組分的任意混合物也可有利地用于本發(fā)明。如果合適，也可能有利地使用蠟，如十六酸鯨蠟酯，作為油相的唯一脂質(zhì)組分。油相可有利地選自2-乙基己基異硬脂酸酯、辛基十二烷醇、異十三烷醇異壬酸酯、異二十烷、2-乙基己基椰油酸、C12_15烷基安息香酸酯、辛酸/癸酸甘油三酯、二辛基醚。尤其有利的混合物是C12_15烷基安息香酸酯與2-乙基己基椰油酸的混合物、C12_15烷基安息香酸酯和異十三烷醇異壬酸酯的混合物、以及C12_15烷基安息香酸酯、2-乙基己基91椰油酸和異十三烷醇異壬酸酯的混合物。在碳?xì)浠衔镏校后w石蠟、角鯊?fù)楹徒酋徬┛捎欣赜糜诒景l(fā)明。油相可進(jìn)一步有利地包括環(huán)狀或線性硅油、或者完全由這些油組成，但優(yōu)選的是除了硅油之外，使用額外含量的其他油相組分。環(huán)二甲基硅酮(八甲基環(huán)四硅氧烷)可有利地作為硅油用于本發(fā)明。然而，其他硅油也可有利地用于本發(fā)明，例如六甲基環(huán)丙硅氧烷、聚二甲硅氧烷和聚甲基苯基硅醚。此外尤其有利的混合物是環(huán)二甲基硅酮與異十三醇異壬酸酯的混合物以及環(huán)二甲基硅酮與2-乙基己基異硬脂酸酯的混合物。如果合適，本發(fā)明的制劑的水相可有利地包括低碳數(shù)的醇、二醇或聚醇、及其醚，優(yōu)選乙醇、異丙醇、丙二醇、甘油、乙二醇、乙二醇單乙醚或單丁醚、丙二醇單甲醚、單乙醚或單丁醚、二乙二醇單甲醚或單乙醚，及其類似產(chǎn)品；還有低碳數(shù)的醇，如乙醇、異丙醇、1，2_丙二醇、甘油；尤其，一種或多種增稠劑，其可有利地選自二氧化硅、鋁硅酸鹽、多糖及其衍生物，例如透明質(zhì)酸、黃原膠、羥丙基甲基纖維素，尤其有利地選自聚丙烯酸酯，優(yōu)選地選自稱作Carbopol的聚丙烯酸，如型號(hào)980、981、1382、2984和5984Carbopol；它們?cè)诿糠N情況下均單獨(dú)或者結(jié)合使用。本發(fā)明可使用的凝膠通常包括低碳數(shù)的醇，如乙醇、異丙醇、1，2_丙二醇，甘油和水，或者在增稠劑存在的情況下包括上述油類。就油-酒精凝膠而言，增稠劑優(yōu)選地為二氧化硅或者鋁硅酸鹽，就水-酒精或酒精凝膠而言，增稠劑優(yōu)選地為聚丙烯酸酯。例如，固體棒可包括天然或合成的蠟、脂肪醇或脂肪酸酯。適用于本發(fā)明的化妝棒的常規(guī)基本材料包括液體油(如液體石蠟、蓖麻油、豆蔻酸異丙酯)、半固體組分(如凡士林、羊毛脂)、固體組分(如蜂蠟、純白地蠟和微結(jié)晶蠟或地蠟)以及高熔點(diǎn)的蠟(如巴西棕櫚蠟和小燭石)。適用于本發(fā)明的化妝品和/或皮膚科制劑的推進(jìn)劑是常規(guī)已知的易揮發(fā)的液化推進(jìn)劑，其可由噴霧劑容器噴出，例如碳?xì)浠衔?丙烷、丁烷、異丁烷)，它們可以單獨(dú)或者相互混合使用。加壓空氣也可以被有利地使用。當(dāng)然，本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知，有些無毒推進(jìn)劑原則上以氣霧劑的形式適用于本發(fā)明；然而，建議不要使用這些物質(zhì)，尤其是氟代烴和氟氯烴(FCHC)，因?yàn)樗鼈儗?duì)環(huán)境或者其他相關(guān)情況產(chǎn)生不良作用。本發(fā)明的化妝品制劑可采用凝膠的形式，其不僅包含本發(fā)明的有效量的活性成分以及常規(guī)使用的溶劑，優(yōu)選地為水，而且包含有機(jī)增稠劑，如阿拉伯膠、黃原膠；海藻酸鈉；纖維素衍生物，優(yōu)選甲基纖維素、羥甲基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素；或者無機(jī)增稠劑，如鋁硅酸鹽，如膨潤土；或者聚二乙醇與聚二乙醇硬脂酸酯或聚二乙醇二硬脂酸酯的混合物。凝膠包括增稠劑，例如為0.至30%重量，優(yōu)選0.5%至15%重量。對(duì)本發(fā)明的目的尤其有益的是，本發(fā)明的化妝品或皮膚科制劑包含進(jìn)一步的活性成分，尤其是天然活性物質(zhì)和/或其衍生物，如a-硫辛酸、八氫番茄紅素、D-生物素、輔酶Q10、a-葡萄糖蘆丁、肉堿、肌肽、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、三葉草提取物、啤酒花提取物或啤酒花-麥芽提取物?；钚猿煞?一種或多種物質(zhì))的濃度有利地是基于制劑總重量的0.0001%至9230%的重量。本發(fā)明的化妝品或皮膚科制劑可以本領(lǐng)域已知的任意方法制備。器官和組織樣品的處理用包含本發(fā)明抗凍多肽的組合物灌注器官或組織樣品，使得有可能在較低的溫度下儲(chǔ)存這類器官和組織樣品、或其他生物材料，從而防止樣品變質(zhì)或降解，而所述組織、器官、細(xì)胞或其他生物材料不會(huì)產(chǎn)生凍傷的風(fēng)險(xiǎn)。在許多情況下，對(duì)器官和生物組織的損害主要不是由所討論的器官或組織產(chǎn)生的冷凍狀態(tài)引起，而是由可能發(fā)生的再結(jié)晶引起的。生物材料、器官和組織樣品的實(shí)例包括但不限于例如，含有一種或多種多肽的樣品；含有一種或多種微粒體或微團(tuán)的樣品，該微粒體或微團(tuán)含有一種或多種多肽；包含全血的樣品；包含血漿的樣品；包含血小板的樣品；包含紅血細(xì)胞的樣品；包含精液的樣品，包含配子的樣品。組織培養(yǎng)樣品可以包括任意形式的生物細(xì)胞，包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞，如動(dòng)物和人體細(xì)胞，鼠細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞。例如，待處理的器官可以是腎、肺、心臟、脾臟或肝臟。因此，本發(fā)明提供一種用于抑制器官或生物樣品的再結(jié)晶的方法，所述方法包括步驟在多肽能防止器官或生物樣品再結(jié)晶的條件下，將器官或生物樣品與本發(fā)明的多肽接觸。本發(fā)明還提供一種用于改善器官或生物樣品保存的方法，所述方法包括步驟在多肽能接觸所討論的器官或生物樣品的條件下，將器官或生物樣品與本發(fā)明的多肽接觸，從而這種待儲(chǔ)存的器官或生物樣品與未處理的器官或生物樣品相比能夠在亞冷凍溫度下儲(chǔ)存。近來開發(fā)了一種基于玻璃化的新方法。然而，該方法遇到的實(shí)際情況是，配子、胚胎或干細(xì)胞解凍期間發(fā)生了松弛，這意味著有冰晶體形成。在解凍過程中，這些冰晶體由于再結(jié)晶而生長。我們認(rèn)為，如果配子、胚胎或干細(xì)胞所在的溶劑中存在本發(fā)明的一種或多種多肽，則在玻璃化過程中，晶體形成以及晶體生長將顯著減少甚至可被防止。本發(fā)明多肽的進(jìn)一步冷凍保護(hù)用途將在下文更詳細(xì)地公開。在一個(gè)單獨(dú)的方面，本發(fā)明涉及一種保護(hù)細(xì)胞及其膜免受暴露于非生理?xiàng)l件時(shí)所遭遇的損害的方法。例如，溫度不正常，包括高溫、低溫和零下溫度。在不包含冰形成的廣泛條件下，包括高于凍結(jié)范圍的溫度和在玻璃化條件下低于凍結(jié)范圍的溫度，觀察到細(xì)胞存活率提高。迄今為止，這些多肽的唯一已知的性質(zhì)是它們能夠與冰晶體相互作用。在冰晶體形成的條件下進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，多肽與人體細(xì)胞一起以它們?cè)谠瓷矬w中天然產(chǎn)生的濃度使用，導(dǎo)致細(xì)胞的損害加重而不是減輕，但是當(dāng)使用低濃度時(shí)，損害緩解并且存活率提高。這樣，多肽在細(xì)胞懸浮液、組織和整個(gè)器官的保存和改善中提供了有益作用。我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，多肽具有阻斷哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜的離子通道的能力，從而在治療病情方面提供進(jìn)一步的用途。本發(fā)明利用了已識(shí)別但未使用的抗凍多肽的性質(zhì)以及它們與細(xì)胞和細(xì)胞膜相互作用的能力。這種與細(xì)胞膜的相互作用發(fā)生在廣泛的結(jié)構(gòu)中，如細(xì)胞懸浮液中的個(gè)別細(xì)胞，組織和器官中的相連的細(xì)胞團(tuán)，以及遍布血管系統(tǒng)的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。這種相互作用是有利的，為細(xì)胞膜以及包含這些膜的結(jié)構(gòu)提供了各種益處，包括改善細(xì)胞活性和存活率，延長功能性、穩(wěn)定性以及細(xì)胞和細(xì)胞組織的結(jié)構(gòu)完整性，降低在不利條件下對(duì)膜和細(xì)胞結(jié)構(gòu)損害的發(fā)生率，以及控制離子跨細(xì)胞膜的運(yùn)輸。相互作用的不同類型與這些多肽對(duì)冰晶增殖的已知作用是不相關(guān)的，因?yàn)檫@些相互作用的有益作用是在根本沒有冰晶形成的條件下觀察到的，除了它們?cè)诒Т嬖诘那闆r下出現(xiàn)以外。例如，從低溫至遠(yuǎn)高于生理溫度的溫度范圍內(nèi)觀察到這些益處。本發(fā)明因此延伸到涉及生理?xiàng)l件和非生理?xiàng)l件的情形，以及涉及存在冰晶體的和完全不存在冰晶體的情形。在非生理?xiàng)l件下觀察到了對(duì)活細(xì)胞和細(xì)胞膜的有益作用，因此非生理?xiàng)l件包括(i)溫?zé)釛l件，由高于水的正常冰點(diǎn)(0°C)且低于細(xì)胞的生理溫度的溫度定義，因此不可能形成冰晶體；(ii)玻璃化條件，由玻璃形成(或玻璃相變)時(shí)或低于玻璃形成的溫度定義，例如從150K降至約4K；或者由玻璃化劑的存在定義，該玻璃化劑促進(jìn)玻璃化并抑制結(jié)晶化；(iii)冷凍條件，如從水的正常冰點(diǎn)降至約4K，其允許冰晶體形成；(iv)過熱條件，由高于細(xì)胞生理溫度的溫度定義，例如從生理溫度上升至高于生理溫度約10°C的溫度范圍；以及(v)由化學(xué)環(huán)境定義的條件，其不同于細(xì)胞的生理化學(xué)環(huán)境，例如非生理pH條件和生理化學(xué)組成的其他變化，以及與非生理溫度條件相結(jié)合的那些條件。本發(fā)明目標(biāo)的適用性擴(kuò)展到非正常的生理?xiàng)l件，例如與細(xì)胞膜的不穩(wěn)定性相關(guān)的疾病，以及與細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外間隙之間的離子不平衡、導(dǎo)致跨細(xì)胞膜的離子轉(zhuǎn)運(yùn)不正常相關(guān)的疾病。這種行為的意外性質(zhì)通過一次發(fā)現(xiàn)而變得顯著，即，離子通道的阻斷得以實(shí)現(xiàn)，如上皮細(xì)胞的鈣離子和鉀離子，而未干擾細(xì)胞的其他代謝功能，包括ATP離子泵以及與碳酰膽堿的相互作用。進(jìn)一步，本發(fā)明提供了對(duì)正常生理?xiàng)l件下的細(xì)胞的益處，比如通過使用那些設(shè)計(jì)用于恢復(fù)、保存或修復(fù)表皮組織的化妝品或藥物。本發(fā)明對(duì)廣泛的肝臟細(xì)胞具有適應(yīng)性，包括動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞。然而，與本發(fā)明相關(guān)的尤其不尋常和有意義的發(fā)現(xiàn)在于抗凍多肽在處理和保存哺乳動(dòng)物細(xì)胞、組織和器官中的用途。在它們的天然形式下，這些多肽僅存在于非哺乳動(dòng)物物種中。這些物種和哺乳動(dòng)物在細(xì)胞和細(xì)胞膜，以及在血液和細(xì)胞質(zhì)組成方面的差異，使得當(dāng)前發(fā)現(xiàn)的益處是令人驚訝和意料不到的。因此，當(dāng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞、組織和器官和生物體暴露在不同于哺乳動(dòng)物正常生理?xiàng)l件下時(shí)，將本發(fā)明用于它們將具有特別的意義和用途。本發(fā)明適用的細(xì)胞的實(shí)例是哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞、肝細(xì)胞、紅細(xì)胞和白細(xì)胞，以及各種類型的植物細(xì)胞。組織和器官的實(shí)例是肝臟、心臟和腎臟的組織，以及器官自身。生物體的實(shí)例是胚胎、自給自立的整個(gè)動(dòng)物、植物種子和整棵植物。本發(fā)明產(chǎn)生的額外益處是多方面的，其中包括在凍結(jié)至低溫期間不再需要維持快速冷卻速率，在比已知的細(xì)胞凍結(jié)劑明顯較低的濃度下多肽具有提高溶液粘度的能力，以及多肽保存冷凍食物的能力。從下面的描述可以明顯看出本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)、益處以及用途。在低溫儲(chǔ)藏的
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，以下使用的術(shù)語定義如下細(xì)胞、組織、器官或生物體的“異常”或“非生理?xiàng)l件”是指不同于正常生理?xiàng)l件的條件。異常或非生理?xiàng)l件包括但不限于溫度顯著高于或低于健康生物體的正常生理溫度，其中健康有機(jī)體的細(xì)胞、組織或器官是與生俱來的，或者為生物體本身；二氧化碳、氧氣、無機(jī)鹽或有機(jī)化合物的量超過或低于正常；PH值顯著高于或低于正常生物體的pH，以及這些條件的結(jié)合?！翱箖龆嚯摹?anti-freezepolypeptides,AFPS)、“抗凍糖蛋白”和“抗凍糖肽”(AFGP)指在一些動(dòng)物的體液中發(fā)現(xiàn)的大分子，其具有普遍已知的性質(zhì)，即它們非依數(shù)性地降低水的冰點(diǎn)?？箖龆嚯?、多肽、糖蛋白和糖肽也稱為“熱滯多肽”，因?yàn)楸绕鹑我庖罃?shù)性質(zhì)的多肽所產(chǎn)生的程度來說，發(fā)生凍結(jié)的溫度在更大程度上降低。然而在融化被削弱期間，冰融化的溫度明顯較低，僅與依數(shù)行為一致?！暗蜏販囟取?cryogenictemperature)指低于0°C的溫度。“冷凍”是指從液相水到固相水的轉(zhuǎn)變。“過熱的”是指高于細(xì)胞、組織、器官或生物體的正常生理溫度，如從生理溫度輕微上升高出生理溫度約20°C，優(yōu)選高出約10°C，更優(yōu)選高出約5°C?！暗蜏氐摹笔侵傅陀诩?xì)胞、組織、器官或微生物的正常生理溫度，但是并沒有低到足以引起相轉(zhuǎn)變?yōu)楣滔?。“分離的和純化的”指分子種類，它們是從天然產(chǎn)生的有機(jī)體中提取，并通過常規(guī)的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)來濃縮，如色譜法，優(yōu)選濃縮至至少約85%的濃度，更優(yōu)選至少約95%。本發(fā)明進(jìn)一步延伸到另一類分子，它們具有的分子結(jié)構(gòu)與前述天然產(chǎn)生的分子形式相同、高度相似或者同源，并且它們可通過化學(xué)手段或通過DNA重組技術(shù)來合成?！安溉閯?dòng)物”和該術(shù)語通常用在生物學(xué)上一樣，指豬、牛、兔、馬和人等?！皹O地魚類”是指冷血水生動(dòng)物，尤其是脊椎動(dòng)物，它們生活在地球極地區(qū)域的水中，包括北極和南極圈內(nèi)的區(qū)域。尤其與本發(fā)明相關(guān)的極地魚類是那些在滿是冰的水中仍能生活的魚類?！搬樄恰焙汀搬樄菭睢笔侵副w和冰晶體生長，其中晶體增殖的主要方向是沿C"軸，即與基平面垂直，以形成針狀的晶體。“能生存的”指在正常生理?xiàng)l件下或者返回到正常生理?xiàng)l件下能夠生存、能夠存活和發(fā)展，或在正常的有利于發(fā)芽的條件下能夠發(fā)芽?！安ＡЩ敝冈诘蜏叵鹿袒?，以這種方式形成玻璃相，S卩非晶態(tài)固體，與結(jié)晶的冰形成對(duì)照?！巴庥^玻璃化”是指在顯微鏡下通過目視觀察確定的玻璃化。一般通過向材料中引入任意一種防冷凍劑或“玻璃化”劑，包括多元醇，如甘油和丙二醇，或者引入其他化合物，如二甲基亞砜，來實(shí)現(xiàn)生物材料的玻璃化。玻璃化試劑的引入常常伴有相對(duì)高的冷卻速率。每種情況下的最佳速率隨系統(tǒng)的組分和熱動(dòng)力學(xué)而變化。對(duì)于無組織的小細(xì)胞，如卵子、精子和胚胎，以及器官而言，大多數(shù)情況下的典型冷卻速度一般是在約100°c/min至約2，000°C/min的范圍內(nèi)下降，優(yōu)選約200°C/min至約1，750°C/min，更優(yōu)選700°C/min至約1，750°C/min。通常使用的是約1500°C/min的速率。在本發(fā)明的實(shí)踐中，本發(fā)明的抗凍多肽一般是以液體溶液的形式使用，優(yōu)選水相溶液。本發(fā)明的抗凍多肽可以單獨(dú)使用或者與其他多肽聯(lián)合使用。當(dāng)聯(lián)合使用多肽時(shí)，最便捷的是使用源物種中天然出現(xiàn)的生理組合的多肽，即多肽種類的混合物和比例與從魚類、昆蟲或其他生物體的液體中提取發(fā)現(xiàn)的相同；但從液體的其他組分中分離，并且再次溶解于不同的溶劑或溶液中，可能總濃度不同于該混合物在自然環(huán)境中存在的濃度。然而，在某些情況下，通過分餾源混合物中的多肽，并以最佳的方式選擇和重組餾分，可以使活性和有效性得到改善。在本發(fā)明使用的液體溶液中，本發(fā)明抗凍多肽的濃度可能有很大不同，但在某些情況下，改善的結(jié)果是在一定濃度范圍內(nèi)和一定情況下獲得的，該濃度必須限制在一定范圍，以避免多肽自身產(chǎn)生的損害。然而一般而言，多肽的使用濃度為約0.01mg/mL至約9580mg/mL，優(yōu)選約0.lmg/mL至約60mg/mL，更優(yōu)選約lmg/mL至約40mg/mL，最優(yōu)選約lmg/mL至約20mg/mL。當(dāng)與人體細(xì)胞使用時(shí)，尤其是在低于細(xì)胞的生理溫度時(shí)，優(yōu)選的濃度是約0.lmg/mL至約40mg/mL，更優(yōu)選約0.lmg/mL至約3mg/mL。當(dāng)多肽用于在溫度低于組織的生理溫度時(shí)保護(hù)該組織時(shí)，優(yōu)選的濃度是約0.lmg/mL至約50mg/mL，而且當(dāng)組織是人體組織時(shí)，優(yōu)選的濃度是約0.lmg/mL至約3mg/mL。在溫度一般低于細(xì)胞的生理溫度但高于細(xì)胞的凍結(jié)溫度，或者低于細(xì)胞的凍結(jié)溫度但是在玻璃化劑或其他非肽類防冷凍劑存在時(shí)，多肽用于保護(hù)該細(xì)胞時(shí)，優(yōu)選的濃度是約0.01mg/mL至約60mg/mL，更優(yōu)選的濃度范圍從約lmg/mL至約40mg/mL。當(dāng)多肽用于阻斷跨細(xì)胞膜的離子通道時(shí)，優(yōu)選的濃度是至少約0.Olmg/mL,更優(yōu)選至少約0.lmg/mL,最優(yōu)選約0.5mg/mL至約40mg/mL。當(dāng)溶液包含不同抗凍多肽的混合物時(shí)，抗凍多肽的所有濃度都表示為單個(gè)抗凍多肽濃度的總和。用于本發(fā)明的抗凍多肽的水溶液可進(jìn)一步含有任意的各種鹽、糖、離子和其他營養(yǎng)素的混合物，它們被包含在本領(lǐng)域已知的電解質(zhì)溶液中，用于保存生物制劑，這包括組織培養(yǎng)基、器官灌注液等。電解質(zhì)溶液尤其用于增強(qiáng)多肽的生物相容性。本領(lǐng)域已知的許多電解質(zhì)溶液的實(shí)例是生理鹽水，其中NaCl濃度為0.9%或0.95%Ringer's注身寸液(U.S.),列于FactsandComparisons,p.50,LippincottPublishingCo.,St.Louis,Mo.(1981.10)，哺乳動(dòng)物Ringer‘s溶液(U.K.&Canada)，列于BestandTaylor,BasisofMedicalPractice,6thed.，Baltimore(1950)，乳酸鹽Ringer's溶液(U.S.),列于FactsandComparisons,p.50,LippincottPublishingCo.,St.Louis,Mo.(1981.10),乳酸鹽Ringer's溶液(Hartmann)，列于Hartmann,A.F.，J.Am.Med.Assoc.1031349-1354(1934)，醋酸Ringer's溶液，列于Fox,C.L.，etal.，J.Am.Med.Assoc.148:825_833(1952)，Locke's溶液，列于Locke,F.S.，Zbl.Physiol.8166(1894)；14670(1900)；15490(1901),Tyrode's溶液，列于Tyrode，M.J.，Arch.Int.Pharmacodyn.20205(1910),KrebsHenseleit溶液，列于Krebs,H.A.,etal.,Hoppe-Seyle'sZ.Physiol.Chem.21033-66(1932),KrebsRinger磷酸鹽溶液，列于Krebs,H.A.，Hoppe-Seyle'sZ.Physiol.Chem.217:193(1933)，Krebs血清替代溶液，列于Krebs,H.A.，Biochem.Biophys.Acta4:249_269(1950)，Krebs改進(jìn)的RingerII溶液，列于Krebs,H.A.，Biochem.Biophys.Acta4:249_269(1950)，Krebs改進(jìn)的RingerIII溶液，列于Krebs，H.A.，Biochem.Biophys.Acta4:249_269(1950)，含有牛血清白蛋白和紅細(xì)胞的Krebs肝臟灌注液，列于Hem，R.，etal.，Biochem.J.101284(1966),Schimassek肝臟灌注液，列于Schimassek,H.，etal.，Biochem.Z.336，440(1963)，Krebs腎臟灌注液，歹ljTNishiitsutsuji-Uwo,J.，etal.，Biochem.J.103852-862(1967)，HepatocyteM化液，列于Crow,K.E.，etal.，Biochem.J.172=29-36(1978)，Bahlman腎臟灌注液，列于Bahlman,J.，etal.，Am.J.Physiol.212:77(1967)，F(xiàn)ulgraff腎臟灌注液，列于Fulgraff，etal.,Arch.Int.Pharmacodyn.17249(1972)。對(duì)于任意具體應(yīng)用來說，電解質(zhì)溶液的最佳選擇會(huì)隨著應(yīng)用而變化，例如即將用抗凍多肽處理或保護(hù)的細(xì)胞的形式(是否該細(xì)胞存在為細(xì)胞懸浮液、組織或器官)，產(chǎn)生該細(xì)胞的動(dòng)物的形式，以及細(xì)胞已經(jīng)或?qū)⒁┞兜臈l件。在本發(fā)明的涉及玻璃化條件的實(shí)施方式中，抗凍多肽與玻璃化劑聯(lián)合使用，當(dāng)冷卻至冰點(diǎn)以下的溫度時(shí)，玻璃化劑在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外液體的固化期間防止或抑制冰晶體的形成。各種的玻璃化劑是本領(lǐng)域已知的，可以單獨(dú)使用或者與其他玻璃化劑或生物相容性溶質(zhì)一起使用。玻璃化劑的實(shí)例是甘油、二甲亞砜、乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、葡萄糖、蔗糖、丙二醇、丁二醇和羧甲基纖維素。多元醇是一類有用的玻璃化劑。突出的實(shí)例是甘油、乙二醇、丙二醇、丁二醇和丁三醇。玻璃化劑的濃度可能變化很大，取決于體系中其他組分的濃度、冷卻速率和達(dá)到的最低溫度。一般而言，以約5%至約35%重量的濃度可以獲得最好的結(jié)果。玻璃化一般以快速冷凍速率進(jìn)行，例如超過100°C/min的速率，優(yōu)選超過1，000°C/mirio在涉及使用非肽類防凍劑，不一定避免冰晶體的形成的實(shí)施方式中，也需要進(jìn)行許多相同的考慮。以上列出的作為玻璃化劑實(shí)例的試劑在類似濃度范圍內(nèi)也起著防凍劑的作用。抗凍多肽對(duì)細(xì)胞和/或細(xì)胞膜的有益作用是通過將多肽與細(xì)胞接觸實(shí)現(xiàn)，并且在暴露于其他有害條件時(shí)的整個(gè)或大部分期間保持這種接觸而實(shí)現(xiàn)的。當(dāng)細(xì)胞是細(xì)胞懸浮液的形式，簡單地向懸浮液中添加這種多肽就實(shí)現(xiàn)了這種接觸。當(dāng)細(xì)胞是組織或器官的形式，通過將組織或器官浸入多肽溶液中來實(shí)現(xiàn)接觸。當(dāng)細(xì)胞是含有血管系統(tǒng)的組織或器官的形式，通過將多肽溶液注滿該血管系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)接觸，并且一旦注滿，在整個(gè)儲(chǔ)藏、保存或暴露在有害條件期間都使多肽保持在血管系統(tǒng)中。灌注的方法是生理學(xué)和外科程序的技術(shù)人員熟知的?？梢詮谋景l(fā)明抗凍多肽處理中受益的細(xì)胞包括各種類型。實(shí)例是卵細(xì)胞、胚胎、白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板、胰島和肝細(xì)胞。可以從本發(fā)明受益的器官也是廣泛的。實(shí)例包括肝、腎、心、腦、肺、胰、脾、卵巢和胃?？梢詮谋景l(fā)明受益的組織包括這些器官的任意組織，以及皮膚組織、骨髓組織、角膜組織以及其他各種組織。本發(fā)明一般適用于哺乳動(dòng)物，并且在人類細(xì)胞、組織和器官方面尤其具有意義和效用。本發(fā)明的抗凍多肽在抑制跨膜離子轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用可延伸到各種離子，尤其是Ca++、K+和Na+離子，以及這些離子的兩種或多種的結(jié)合。由于過度的離子運(yùn)輸是一種伴隨低溫的生理效應(yīng)，本發(fā)明抗凍多肽抑制離子轉(zhuǎn)運(yùn)的能力可能與該多肽在低溫條件下增強(qiáng)細(xì)胞活力的能力相關(guān)。因此，為實(shí)現(xiàn)該離子轉(zhuǎn)運(yùn)的抑制作用所施予的多肽的量和濃度一般與低溫暴露下用于增強(qiáng)活力時(shí)所用的量相似。多肽抑制離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的能力也使該多肽可用于治療存在過量跨膜離子轉(zhuǎn)運(yùn)的疾病和異常生理狀況。這種疾病和狀況的實(shí)例是囊性纖維變性、Kartagener綜合癥、尿崩癥、糖尿病、抗利尿激素異常。用于該作用的多肽的施予可通過注射、血管注射、局部應(yīng)用以及其他手段來實(shí)現(xiàn)。其他手段是用其他藥物和治療劑治療或處理這些疾病和狀況時(shí)，通常使用的手段。而且，得到有益結(jié)果時(shí)的濃度一般與上述提及的濃度相同，并且用藥的劑量或頻率由所處理的狀況已進(jìn)展的程度以及觀察到的對(duì)處理的反應(yīng)來決定。含有本發(fā)明多肽的抗凍多肽的應(yīng)用還延伸到該多肽在具有細(xì)胞結(jié)構(gòu)的食物儲(chǔ)藏中的應(yīng)用。尤其適用該應(yīng)用的食物是肉類和肉制品，但對(duì)其他類型的食品也是有益的。對(duì)于本發(fā)明的該目的，肉類和肉制品包括鮮肉和禽肉，以及冷凍的、罐裝的和干的肉和家禽肉。在運(yùn)輸或儲(chǔ)藏期間，冷凍避免變質(zhì)的許多這種食物往往失去飽滿性、新鮮感和其他有助于味道、口感和一般訴求的品質(zhì)。通過用本發(fā)明的多肽溶液處理這些食物，可以保存這些品質(zhì)。處理模式對(duì)一種類型的食物和另一種會(huì)有變化，但是一般來說涉及溶液中食物與多肽的平衡，無論是通過浸沒、灌注，還是任意其他類型的吸收或?qū)崿F(xiàn)延長接觸的其他手段。上述涉及本發(fā)明其他用途方面的溶液類型、浸沒和灌注方法在此處也是適用的。含有本發(fā)明多肽的流體本發(fā)明提供了本發(fā)明的抗凍多肽作為流體和液體(如制冷劑)以及許多不同類型水溶液的添加劑的用途，以便防止制冷劑或水溶液的凍結(jié)。這種防止溶液凍結(jié)的特征在許多不同的
技術(shù)領(lǐng)域：
中都是有益的。與本發(fā)明多肽連接的載體和固體載體本發(fā)明的多肽可以與載體連接，如固體載體或半固體載體。多肽可以共價(jià)或非共價(jià)地連接到任意載體，例如理想地展示本發(fā)明多肽的材料的表面。本發(fā)明的表面和固體載體可以含有本發(fā)明的一種或多種多肽，或其展示抗凍活性的功能片段，它們可直接或間接地連接到表面，如固體或半固體載體上。連接原則上包括用于將多肽共價(jià)或非共價(jià)連接在表面的所有現(xiàn)有先進(jìn)技術(shù)，例如通過接頭殘基直接包封籠狀結(jié)構(gòu)中的多肽，其保留多肽與表面的反應(yīng)接觸；或者將本發(fā)明多肽與固體或半固體載體接觸的其他方式?？衫枚喾N技術(shù)將多肽連接到固體或半固體載體。多肽與固體表面的連接已有公開，例如Cordeketal.1999，Anal.Chem.，711529-1533，Blasietal.2005，EnzymeandMicrobialTech.,36:818_823；Parradoetal.(1995),Proc.Chem.,30(8)735-741；Yakovlevaetal.(2003),BiosensorsandBioelectronics,19:21_34；Cao,L.,Carrier-boundImmobilizedEnzymes.Principles,ApplicationsandDesign,ffi1ey-VCH,2005；ImmobilizationofEnzymesandCells(MethodsinBiotechnology),Birkerstaff,G.F.，eds.，HumanaPress,1997。其他技術(shù)也可以采用，并且是技術(shù)人員所熟知的。在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種包含本發(fā)明的一種或多種多肽的包衣組合物。包衣組合物可以進(jìn)一步包含一種或多種其他成分，包括色素和樹脂，下文將更詳細(xì)地說明。應(yīng)集中注意的是生物分子(包括多肽)在由溶膠凝膠形成的硅酸鹽玻璃中的固定化(Eggersetal.，ProteinSci.2001，10，250-261)。該過程包括水解醇鹽以產(chǎn)生溶膠，其然后再進(jìn)行縮聚作用形成凝膠。在溶膠_凝膠轉(zhuǎn)變期間，生物分子被包封在凝膠中而固定。溶膠_凝膠材料比傳統(tǒng)用于生物分子包封的有機(jī)聚合物更具優(yōu)勢(shì)，因?yàn)檫@些材料具有增加的機(jī)械強(qiáng)度、化學(xué)穩(wěn)定性、生物兼容性以及對(duì)微生物攻擊的抵抗力。本發(fā)明多肽的溶膠-凝膠包封可以使用基于多元醇硅酸鹽和多元醇硅氧烷的前體來完成，尤其是來自甘油的那些。聚甘油硅酸鹽(PGS)可以制備并用于多肽的溶膠-凝膠生物包封，該方式以高度生物相容性以及溫和的包封條件而著稱，并且可能使硅石內(nèi)的多肽再生且有效隔離。以上公開的方法可以延伸至金屬硅酸鹽、烷基硅氧烷、功能化的硅氧烷，以及各種復(fù)合溶膠-凝膠，從而可以構(gòu)建體理化學(xué)上多樣的含有本發(fā)明抗凍多肽的生物摻雜聚合物。本發(fā)明的雜合材料優(yōu)選地顯示與游離抗凍多肽相近的活力，以及表征溶膠_凝膠生物陶瓷的高度穩(wěn)定性和堅(jiān)固性。在本發(fā)明的一個(gè)方面，使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的溶膠-凝膠工藝，將本發(fā)明的多肽連接到固體或半固體載體。這種溶膠-凝膠工藝是常規(guī)的，并且通常產(chǎn)生一種溶98膠-凝膠玻璃，這是由透明的無定性硅膠或硅酸鹽材料產(chǎn)生，通過在粘度增加的情況下在膠體亞微米顆粒的網(wǎng)絡(luò)中形成相互連接，直至該網(wǎng)絡(luò)變得完全堅(jiān)硬而制成，其密度約為玻璃的一半。因此，含有本發(fā)明一種或多種多肽的溶膠-凝膠玻璃也請(qǐng)求保護(hù)。其中特別參考GillandBallesteros,J.Am.Chem.Soc.1998，120，8587-8598。溶液聚合以形成交聯(lián)顆粒的溶膠已被如US5，863，996公開，可以將其與本發(fā)明結(jié)合使用。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，包衣組合物優(yōu)選地包含與本發(fā)明多肽相容的樹脂，即在形成包衣組合物的一部分時(shí)，允許所述多肽發(fā)揮抗凍活性。樹脂是本領(lǐng)域眾所周知的，多肽相容的樹脂在現(xiàn)有技術(shù)中也已公開。例如，見W001/72911和US5，998，200。本發(fā)明還提供一種包含具有三維納米結(jié)構(gòu)的介孔氣凝膠的組合物，該氣凝膠含有本發(fā)明的多肽。三維納米結(jié)構(gòu)優(yōu)選包含一種包封抗凍多肽生物復(fù)合超級(jí)結(jié)構(gòu)的膠態(tài)金屬，該膠態(tài)金屬在其中被納米膠合。因此，本發(fā)明還提供一種制備帶有膠態(tài)金屬的三維納米結(jié)構(gòu)的介孔氣凝膠的方法，其中包封抗凍多肽生物復(fù)合物的膠態(tài)金屬被納米膠化，所述方法包括步驟通過將本發(fā)明所述一種或多種抗凍多肽與所述的膠態(tài)金屬混合，形成包封抗凍多肽生物復(fù)合物的金屬；通過將催化劑和醇鹽(如硅醇鹽)混合，形成溶膠，如硅溶膠；通過將所述溶膠(如硅溶膠)與所述生物復(fù)合材料混合并使所述溶膠變化至凝膠，形成凝膠；以及用C02提取并超臨界干燥所述膠體，以形成所述氣凝膠，其中包封抗凍多肽生物復(fù)合物超級(jí)結(jié)構(gòu)的金屬被納米膠化。在一種實(shí)施方式中，介孔氣凝膠是介孔二氧化硅氣凝膠，參考US2004/0209338。本發(fā)明的多肽在抑制氣體水合物的形成中的用途本發(fā)明的多肽還可以用于抑制海洋中的氣體水合物的形成。眾所周知，氣體水合物是冰狀結(jié)晶分子復(fù)合物，它由水與適宜大小的“寄生(guest)”氣體分子的混合物形成。水分子(寄主，host)根據(jù)氫鍵形成帶有幾個(gè)空隙腔體的格狀結(jié)構(gòu)。寄生的氣體分子可以占據(jù)格狀腔體，并且當(dāng)最小量的腔體被填滿時(shí)，晶體結(jié)構(gòu)將變得穩(wěn)定，甚至在明顯高于水冰的熔點(diǎn)的溫度時(shí)，形成固體氣體水合物。當(dāng)氣體水合物分離(融化)時(shí)，晶格分解成液態(tài)水(或者，在低于水的冰點(diǎn)條件下變成冰)，并且釋放出氣體。商業(yè)上，氣體可以用于能源生產(chǎn)。然而，在該氣體以非控制的方式逸出的情況下，該現(xiàn)象不代表環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)。這可能存在于地球不時(shí)干裂的地區(qū)。眾所周知，關(guān)于氣體水合物形成的問題也出現(xiàn)在海洋底部的管道中。然而，因?yàn)楸景l(fā)明多肽的抑制冰晶體形成的性質(zhì)，可以相信的是所述多肽的存在可以抑制氣體水合物的形成，因?yàn)檫@些水合物與冰晶體的結(jié)構(gòu)非常相似。下文公開本發(fā)明所選擇的條目1、一種含有多個(gè)連續(xù)相連的氨基酸殘基的多肽，所述多肽包括序列Xi-X^Xa^-Xg-Xe-X^Xg-Xg(SEQIDN0:90)，其中父丨選自氨基酸殘基S、A、G和D；父2選自氨基酸殘基A、V、I、T和S；X3選自非大體積的氨基酸殘基；父4選自氨基酸殘基S、I、T和V;父5選自氨基酸殘基S、A、I和T；X6選自氨基酸殘基S、T和V；99[1524]X7選自非大體積氨基酸殘基；&選自氨基酸殘基S、T和V;^選自氨基酸殘基5、々和6;其中SEQID而90的殘基&、乂4、乂6和乂8中的至少一個(gè)是1或乂;其中多肽的氨基酸殘基的總數(shù)小于250；和其中多肽具有冰結(jié)合能力。2.條目1的多肽，其中&是5。3.條目1的多肽，其中&是八。4.條目1的多肽，其中&是6。5.條目1的多肽，其中&是0。6.條目1的多肽，其中&是八。7.條目1的多肽，其中父2是乂。8.條目1的多肽，其中父2是1。9.條目1的多肽，其中父2是丁。1538]10.條目的多肽，其中x2是So1539]11.條目的多肽，其中x3不包含環(huán)狀脂肪側(cè)鏈或者芳香側(cè)鏈。1540]12.條目的多肽，其中X4是So1541]13.條目的多肽，其中X4是I。1542]14.條目的多肽，其中X4是T。1543]15.條目的多肽，其中X4是V。1544]16.條目的多肽，其中X5是So1545]17.條目的多肽，其中X5是A。1546]18.條目的多肽，其中X5是I。1547]19.條目的多肽，其中X5是T。1548]20.條目的多肽，其中X6是So1549]21.條目的多肽，其中X6是T。1550]22.條目的多肽，其中X6是V。1551]23.條目的多肽，其中x7不包含環(huán)狀脂肪側(cè)鏈或者芳香側(cè)鏈。1552]24.條目的多肽，其中X8是So1553]25.條目的多肽，其中X8是T。1554]26.條目的多肽，其中X8是V。1555]27.條目的多肽，其中X9是So1556]28.條目的多肽，其中X9是A。1557]29.條目的多肽，其中X9是Go1558]30.條目的多肽，其中SEQIDNO90的殘基X2、X4、X6和X8中的至少一個(gè)是T。1559]31.條目的多肽，其中SEQIDNO90的殘基X2、X4、X6和&中的至少兩個(gè)是T。1560]32.條目的多肽，其中SEQIDNO90的殘基X2、X4、X6和X8中的至少三個(gè)是T。1561]33.條目的多肽，其中SEQIDNO90的殘基X2、X4、X6和X8中的四個(gè)都是T。1562]34.條目的多肽，其中SEQIDNO90的殘基X2、X4、X6和X8中的至少一個(gè)是V。100[1563]35.條目1的多肽，其中SEQIDNO90的殘基X2、X4、X6和X8中的至少兩個(gè)是V。36.條目1的多肽，其中SEQIDNO90的殘基X2、X4、X6和X8中的至少三個(gè)是V。37.條目1的多肽，其中SEQIDNO:90的殘基X2、X4、X6和X8中的四個(gè)都是V。38.條目1的多肽，其中所述多肽的氨基酸殘基的最大數(shù)量少于240，例如少于230，例如少于220，例如少于210，例如少于200，例如少于190，例如少于180，例如少于150，例如少于140，例如少于130，例如少于120，例如少于110，例如少于100，例如少于95，例如少于90，例如少于85，例如少于80，例如少于75，例如少于70，例如少于65，例如少于60，例如少于55，例如少于50，例如少于45，例如少于40，例如少于30，例如少于20，例如少于15。39.條目1的多肽，其中所述多肽的氨基酸殘基的最小數(shù)量為10或更多，例如12或更多，例如14或更多，例如16或更多，例如18或更多，例如20或更多，例如22或更多，例如24或更多，例如26或更多，例如28或更多，例如30或更多，例如32或更多，例如34或更多，例如36或更多，例如38或更多，例如40或更多，例如42或更多，例如44或更多，例如46或更多，例如48或更多，例如50或更多，例如55或更多，例如60或更多，例如65或更多，例如70或更多，例如75或更多，例如80或更多，例如85或更多，例如90或更多，例如95或更多，例如100或更多。40.條目1的多肽，進(jìn)一步含有SEQIDNO:90第二拷貝，其與SEQIDNO:90第一拷貝不重疊，其中SEQIDNO90的第二拷貝含有序列Xa-Xb-Xc-Xd-Xe-Xf-Xg-Xh-Xi(SEQIDNO90),其中&選自氨基酸殘基S、A、G和D；Xb選自氨基酸殘基A、V、I、T和S；X。選自非大體積的氨基酸殘基；&選自氨基酸殘基S、I、T和V;人選自氨基酸殘基S、A、I和T；父￡選自氨基酸殘基S、T和V;Xg選自非大體積氨基酸殘基；Xh選自氨基酸殘基S、T和V;Xi選自氨基酸殘基S、A和G；其中SEQIDNO:90的殘基Xb、Xd、Xf和Xg中的至少一個(gè)是T或V。41.條目40的多肽，其中&是S。42.條目40的多肽，其中Xa是八。43.條目40的多肽，其中Xa是6。44.條目40的多肽，其中Xa是0。45.條目40的多肽，其中Xb是A。46.條目40的多肽，其中Xb是V。47.條目40的多肽，其中Xb是I。48.條目40的多肽，其中Xb是T。49.條目40的多肽，其中Xb是S。[1590]50.條目40的多肽，其中Xc不包含環(huán)狀脂肪側(cè)鏈或者芳香側(cè)鏈。[1591]51.條目40的多肽，其中Xd是So[1592]52.條目40的多肽，其中Xd是I。[1593]53.條目40的多肽，其中Xd是T。[1594]54.條目40的多肽，其中Xd是V。[1595]55.條目40的多肽，其中Xe是So[1596]56.條目40的多肽，其中Xe是A。[1597]57.條目40的多肽，其中Xe是I。[1598]58.條目40的多肽，其中Xe是T。[1599]59.條目40的多肽，其中Xf是So[1600]60.條目40的多肽，其中Xf是T。[1601]61.條目40的多肽，其中Xf是V。[1602]62.條目40的多肽，其中Xg不包含環(huán)狀脂肪側(cè)鏈或者芳香側(cè)鏈。[1603]63.條目40的多肽，其中Xh是So[1604]64.條目40的多肽，其中Xh是T。[1605]65.條目40的多肽，其中Xh是V。[1606]66.條目40的多肽，其中Xi是So[1607]67.條目40的多肽，其中Xi是A。[1608]68.條目40的多肽，其中Xi是G0[1609]69.條目40的多肽，其中SEQIDNO90的殘基Xb、Xd、Xf和Xh中的至少一個(gè)是T。[1610]70.條目40的多肽，其中SEQIDNO90的殘基Xb、Xd、Xf和Xh中的至少兩個(gè)是T。[1611]71.條目40的多肽，其中SEQIDNO90的殘基Xb、Xd、Xf和Xh中的至少三個(gè)是T。[1612]72.條目40的多肽，其中SEQIDNO90的殘基Xb、Xd、Xf和Xh中的四個(gè)都是Τ。[1613]73.條目40的多肽，其中SEQIDNO90的殘基Xb、Xd、Xf和Xh中的至少一個(gè)是V。[1614]74.條目40的多肽，其中SEQIDNO90的殘基Xb、Xd、Xf和Xh中的至少兩個(gè)是V。[1615]75.條目40的多肽，其中SEQIDNO90的殘基Xb、Xd、Xf和Xh中的至少三個(gè)是V。[1616]76.條目40的多肽，其中SEQIDNO90的殘基Xb、Xd、Xf和Xh中的四個(gè)都是V。[1617]77.條目40的多肽，其中SEQIDNO90的第一拷貝和第二拷貝被一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基隔開。[1618]78.條目40的多肽，其中SEQIDNO90的第一和第二拷貝被2個(gè)氨基酸殘基隔開，例如3個(gè)氨基酸殘基，例如4個(gè)氨基酸殘基，例如5個(gè)氨基酸殘基，例如6個(gè)氨基酸殘基，例如7個(gè)氨基酸殘基，例如8個(gè)氨基酸殘基，例如9個(gè)氨基酸殘基，例如10個(gè)氨基酸殘基，例如11個(gè)氨基酸殘基，例如12個(gè)氨基酸殘基，例如13個(gè)氨基酸殘基，例如14個(gè)氨基酸殘基，例如15個(gè)氨基酸殘基，例如16個(gè)氨基酸殘基，例如17個(gè)氨基酸殘基，例如18個(gè)氨基酸殘基，例如19個(gè)氨基酸殘基，例如20個(gè)氨基酸殘基，例如21個(gè)氨基酸殘基，例如22個(gè)氨基酸殘基，例如23個(gè)氨基酸殘基，例如24個(gè)氨基酸殘基，例如25個(gè)氨基酸殘基，例如26個(gè)氨基酸殘基，例如27個(gè)氨基酸殘基，例如28個(gè)氨基酸殘基，例如29個(gè)氨基酸殘基，例如30個(gè)氨基酸殘基。79.條目40的多肽，其中SEQIDNO90的第一拷貝和第二拷貝被至少2個(gè)氨基102酸殘基隔開，例如至少3個(gè)氨基酸殘基，例如至少4個(gè)氨基酸殘基，例如至少5個(gè)氨基酸殘基，例如至少6個(gè)氨基酸殘基，例如至少7個(gè)氨基酸殘基，例如至少8個(gè)氨基酸殘基，例如至少9個(gè)氨基酸殘基，例如至少10個(gè)氨基酸殘基，例如至少11個(gè)氨基酸殘基，例如至少12個(gè)氨基酸殘基，例如至少13個(gè)氨基酸殘基，例如至少14個(gè)氨基酸殘基，例如至少15個(gè)氨基酸殘基，例如至少16個(gè)氨基酸殘基，例如至少17個(gè)氨基酸殘基，例如至少18個(gè)氨基酸殘基，例如至少19個(gè)氨基酸殘基，例如至少20個(gè)氨基酸殘基，例如至少21個(gè)氨基酸殘基，例如至少22個(gè)氨基酸殘基，例如至少23個(gè)氨基酸殘基，例如至少24個(gè)氨基酸殘基，例如至少25個(gè)氨基酸殘基，例如至少26個(gè)氨基酸殘基，例如至少27個(gè)氨基酸殘基，例如至少28個(gè)氨基酸殘基，例如至少29個(gè)氨基酸殘基，例如至少30個(gè)氨基酸殘基。80.條目40的多肽，其中SEQIDNO90第一和第二拷貝被少于100個(gè)氨基酸殘基隔開，例如少于95個(gè)氨基酸殘基，例如少于90個(gè)氨基酸殘基，例如少于85個(gè)氨基酸殘基，例如少于80個(gè)氨基酸殘基，例如少于75個(gè)氨基酸殘基，例如少于70個(gè)氨基酸殘基，例如少于65個(gè)氨基酸殘基，例如少于60個(gè)氨基酸殘基，例如少于55個(gè)氨基酸殘基，例如少于50個(gè)氨基酸殘基，例如少于45個(gè)氨基酸殘基，例如少于40個(gè)氨基酸殘基，例如少于35個(gè)氨基酸殘基，例如少于30個(gè)氨基酸殘基，例如少于25個(gè)氨基酸殘基，例如少于24個(gè)氨基酸殘基，例如少于23個(gè)氨基酸殘基，例如少于22個(gè)氨基酸殘基，例如少于21個(gè)氨基酸殘基，例如少于20個(gè)氨基酸殘基，例如少于19個(gè)氨基酸殘基，例如少于18個(gè)氨基酸殘基，例如少于17個(gè)氨基酸殘基，例如少于16個(gè)氨基酸殘基，例如少于15個(gè)氨基酸殘基，例如少于14個(gè)氨基酸殘基，例如少于13個(gè)氨基酸殘基，例如少于12個(gè)氨基酸殘基，例如少于11個(gè)氨基酸殘基，例如少于10個(gè)氨基酸殘基，例如少于9個(gè)氨基酸殘基，例如少于8個(gè)氨基酸殘基，例如少于7個(gè)氨基酸殘基，例如少于6個(gè)氨基酸殘基，例如少于5個(gè)氨基酸殘基。81.條目40的多肽，其中SEQIDNO90的第一拷貝位于SEQIDNO90的第二拷貝的N-端。82.條目40的多肽，其中SEQIDNO90的第二拷貝位于SEQIDNO90的第一拷貝的N-端。83.條目40的多肽，進(jìn)一步含有SEQIDNO90的第三拷貝，其與SEQIDNO90的第一和第二拷貝不重疊，其中SEQIDNO90的第三拷貝含有序列Xaa-Xba-Xca-Xda-Xea-Xfa-Xga-Xha-Xia(SEQIDNO90)，其中父⑽選自氨基酸殘基S、A、G和D;父^選自氨基酸殘基A、V、I、T和S;X。a選自非大體積的氨基酸殘基；Xda選自氨基酸殘基S、I、T和V;1選自氨基酸殘基3、々、1和11;[1631]Xfa選自氨基酸殘基S、T和V；Xga選自非大體積氨基酸殘基；Xha選自氨基酸殘基S、T和V；、選自氨基酸殘基S、A和G;其中SEQIDNO90的殘基Xba、Xda,Xfa和Xga中的至少一個(gè)是T或V。[1636]84.條目83的多肽，其中Xaa是So[1637]85.條目83的多肽，其中Xaa是A。[1638]86.條目83的多肽，其中Xaa是G0[1639]87.條目83的多肽，其中Xaa是D。[1640]88.條目83的多肽，其中Xba是A。[1641]89.條目83的多肽，其中Xba是V。[1642]90.條目83的多肽，其中Xba是I。[1643]91.條目83的多肽，其中Xba是T。[1644]92.條目83的多肽，其中Xba是So[1645]93.條目83的多肽，其中Xca不包含環(huán)狀脂肪側(cè)鏈或者芳香側(cè)鏈[1646]94.條目83的多肽，其中Xda是So[1647]95.條目83的多肽，其中Xda是I。[1648]96.條目83的多肽，其中Xda是T。[1649]97.條目83的多肽，其中Xda是V。[1650]98.條目83的多肽，其中Xea是So[1651]99.條目83的多肽，其中Xea是A。100.條目83的多肽，其中Xea是I。101.條目83的多肽，其中Xea是丁。102.條目83的多肽，其中Xfa是S。103.條目83的多肽，其中Xfa是丁。104.條目83的多肽，其中Xfa是V。105.條目83的多肽，其中Xga不包含環(huán)狀脂肪側(cè)鏈或者芳香側(cè)鏈。106.條目83的多肽，其中Xha是S。107.條目83的多肽，其中Xha是丁。108.條目83的多肽，其中Xha是V。109.條目83的多肽，其中Xia是S。110.條目83的多肽，其中父“是八。111.條目83的多肽，其中父4是6。112.條目83的多肽，其中SEQIDNO是T。113.條目83的多肽，其中SEQIDNO是T。114.條目83的多肽，其中SEQIDNO是T。115.條目83的多肽，其中SEQIDNOT。116.條目83的多肽，其中SEQIDNO是V。117.條目83的多肽，其中SEQIDNO90的殘基Xba,Xda、Xfa和Xha中的至少一個(gè):90的殘基Xba>Xda、Xfa和Xha中的至少兩個(gè)90的殘基Xba,Xda、Xfa和Xha中的至少三個(gè):90的殘基Xba>Xda、Xfa和Xha中的四個(gè)都是90的殘基Xba,Xda、Xfa和Xha中的至少一個(gè):90的殘基Xba>Xda、Xfa和Xha中的至少兩個(gè)104是V。118.條目83的多肽，其中SEQIDNO90的殘基Xba、Xda>Xfa和Xha中的至少三個(gè)是V。119.條目83的多肽，其中SEQIDNO90的殘基Xba、Xda、Xfa和Xha中的四個(gè)都是V。120.條目83的多肽，其中SEQIDNO90的不同拷貝被一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基隔開。121.條目83的多肽，其中SEQIDNO90的第二和第三拷貝被一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基隔開。122.條目83的多肽，其中SEQIDNO:90的第一拷貝和SEQIDN0:90的第三拷貝被2個(gè)氨基酸殘基隔開，例如3個(gè)氨基酸殘基，例如4個(gè)氨基酸殘基，例如5個(gè)氨基酸殘基，例如6個(gè)氨基酸殘基，例如7個(gè)氨基酸殘基，例如8個(gè)氨基酸殘基，例如9個(gè)氨基酸殘基，例如10個(gè)氨基酸殘基，例如11個(gè)氨基酸殘基，例如12個(gè)氨基酸殘基，例如13個(gè)氨基酸殘基，例如14個(gè)氨基酸殘基，例如15個(gè)氨基酸殘基，例如16個(gè)氨基酸殘基，例如17個(gè)氨基酸殘基，例如18個(gè)氨基酸殘基，例如19個(gè)氨基酸殘基，例如20個(gè)氨基酸殘基，例如21個(gè)氨基酸殘基，例如22個(gè)氨基酸殘基，例如23個(gè)氨基酸殘基，例如24個(gè)氨基酸殘基，例如25個(gè)氨基酸殘基，例如26個(gè)氨基酸殘基，例如27個(gè)氨基酸殘基，例如28個(gè)氨基酸殘基，例如29個(gè)氨基酸殘基，例如30個(gè)氨基酸殘基。123.條目83的多肽，其中SEQIDNO90的第一拷貝和SEQIDNO90的第三拷貝被至少2個(gè)氨基酸殘基隔開，例如至少3個(gè)氨基酸殘基，例如至少4個(gè)氨基酸殘基，例如至少5個(gè)氨基酸殘基，例如至少6個(gè)氨基酸殘基，例如至少7個(gè)氨基酸殘基，例如至少8個(gè)氨基酸殘基，例如至少9個(gè)氨基酸殘基，例如至少10個(gè)氨基酸殘基，例如至少11個(gè)氨基酸殘基，例如至少12個(gè)氨基酸殘基，例如至少13個(gè)氨基酸殘基，例如至少14個(gè)氨基酸殘基，例如至少15個(gè)氨基酸殘基，例如至少16個(gè)氨基酸殘基，例如至少17個(gè)氨基酸殘基，例如至少18個(gè)氨基酸殘基，例如至少19個(gè)氨基酸殘基，例如至少20個(gè)氨基酸殘基，例如至少21個(gè)氨基酸殘基，例如至少22個(gè)氨基酸殘基，例如至少23個(gè)氨基酸殘基，例如至少24個(gè)氨基酸殘基，例如至少25個(gè)氨基酸殘基，例如至少26個(gè)氨基酸殘基，例如至少27個(gè)氨基酸殘基，例如至少28個(gè)氨基酸殘基，例如至少29個(gè)氨基酸殘基，例如至少30個(gè)氨基酸殘基。124.條目83的多肽，其中SEQIDNO:90的第二拷貝和SEQIDN0:90的第三拷貝被2個(gè)氨基酸殘基隔開，例如3個(gè)氨基酸殘基，例如4個(gè)氨基酸殘基，例如5個(gè)氨基酸殘基，例如6個(gè)氨基酸殘基，例如7個(gè)氨基酸殘基，例如8個(gè)氨基酸殘基，例如9個(gè)氨基酸殘基，例如10個(gè)氨基酸殘基，例如11個(gè)氨基酸殘基，例如12個(gè)氨基酸殘基，例如13個(gè)氨基酸殘基，例如14個(gè)氨基酸殘基，例如15個(gè)氨基酸殘基，例如16個(gè)氨基酸殘基，例如17個(gè)氨基酸殘基，例如18個(gè)氨基酸殘基，例如19個(gè)氨基酸殘基，例如20個(gè)氨基酸殘基，例如21個(gè)氨基酸殘基，例如22個(gè)氨基酸殘基，例如23個(gè)氨基酸殘基，例如24個(gè)氨基酸殘基，例如25個(gè)氨基酸殘基，例如26個(gè)氨基酸殘基，例如27個(gè)氨基酸殘基，例如28個(gè)氨基酸殘基，例如29個(gè)氨基酸殘基，例如30個(gè)氨基酸殘基。125.條目83的多肽，其中SEQIDNO90的第二拷貝和SEQIDNO90的第三拷貝被至少2個(gè)氨基酸殘基隔開，例如至少3個(gè)氨基酸殘基，例如至少4個(gè)氨基酸殘基，例如至少5個(gè)氨基酸殘基，例如至少6個(gè)氨基酸殘基，例如至少7個(gè)氨基酸殘基，例如至少8個(gè)氨基酸殘基，例如至少9個(gè)氨基酸殘基，例如至少10個(gè)氨基酸殘基，例如至少11個(gè)氨基酸殘基，例如至少12個(gè)氨基酸殘基，例如至少13個(gè)氨基酸殘基，例如至少14個(gè)氨基酸殘基，例如至少15個(gè)氨基酸殘基，例如至少16個(gè)氨基酸殘基，例如至少17個(gè)氨基酸殘基，例如至少18個(gè)氨基酸殘基，例如至少19個(gè)氨基酸殘基，例如至少20個(gè)氨基酸殘基，例如至少21個(gè)氨基酸殘基，例如至少22個(gè)氨基酸殘基，例如至少23個(gè)氨基酸殘基，例如至少24個(gè)氨基酸殘基，例如至少25個(gè)氨基酸殘基，例如至少26個(gè)氨基酸殘基，例如至少27個(gè)氨基酸殘基，例如至少28個(gè)氨基酸殘基，例如至少29個(gè)氨基酸殘基，例如至少30個(gè)氨基酸殘基。126.條目83的多肽，其中SEQIDNO:90的第一拷貝和SEQIDN0:90的第三拷貝被少于100個(gè)氨基酸殘基隔開，例如少于95個(gè)氨基酸殘基，例如少于90個(gè)氨基酸殘基，例如少于85個(gè)氨基酸殘基，例如少于80個(gè)氨基酸殘基，例如少于75個(gè)氨基酸殘基，例如少于70個(gè)氨基酸殘基，例如少于65個(gè)氨基酸殘基，例如少于60個(gè)氨基酸殘基，例如少于55個(gè)氨基酸殘基，例如少于50個(gè)氨基酸殘基，例如少于45個(gè)氨基酸殘基，例如少于40個(gè)氨基酸殘基，例如少于35個(gè)氨基酸殘基，例如少于30個(gè)氨基酸殘基，例如少于25個(gè)氨基酸殘基，例如少于24個(gè)氨基酸殘基，例如少于23個(gè)氨基酸殘基，例如少于22個(gè)氨基酸殘基，例如少于21個(gè)氨基酸殘基，例如少于20個(gè)氨基酸殘基，例如少于19個(gè)氨基酸殘基，例如少于18個(gè)氨基酸殘基，例如少于17個(gè)氨基酸殘基，例如少于16個(gè)氨基酸殘基，例如少于15個(gè)氨基酸殘基，例如少于14個(gè)氨基酸殘基，例如少于13個(gè)氨基酸殘基，例如少于12個(gè)氨基酸殘基，例如少于11個(gè)氨基酸殘基，例如少于10個(gè)氨基酸殘基，例如少于9個(gè)氨基酸殘基，例如少于8個(gè)氨基酸殘基，例如少于7個(gè)氨基酸殘基，例如少于6個(gè)氨基酸殘基，例如少于5個(gè)氨基酸殘基。127.條目83的多肽，其中SEQIDNO:90的第二拷貝和SEQIDN0:90的第三拷貝被少于100個(gè)氨基酸殘基隔開，例如少于95個(gè)氨基酸殘基，例如少于90個(gè)氨基酸殘基，例如少于85個(gè)氨基酸殘基，例如少于80個(gè)氨基酸殘基，例如少于75個(gè)氨基酸殘基，例如少于70個(gè)氨基酸殘基，例如少于65個(gè)氨基酸殘基，例如少于60個(gè)氨基酸殘基，例如少于55個(gè)氨基酸殘基，例如少于50個(gè)氨基酸殘基，例如少于45個(gè)氨基酸殘基，例如少于40個(gè)氨基酸殘基，例如少于35個(gè)氨基酸殘基，例如少于30個(gè)氨基酸殘基，例如少于25個(gè)氨基酸殘基，例如少于24個(gè)氨基酸殘基，例如少于23個(gè)氨基酸殘基，例如少于22個(gè)氨基酸殘基，例如少于21個(gè)氨基酸殘基，例如少于20個(gè)氨基酸殘基，例如少于19個(gè)氨基酸殘基，例如少于18個(gè)氨基酸殘基，例如少于17個(gè)氨基酸殘基，例如少于16個(gè)氨基酸殘基，例如少于15個(gè)氨基酸殘基，例如少于14個(gè)氨基酸殘基，例如少于13個(gè)氨基酸殘基，例如少于12個(gè)氨基酸殘基，例如少于11個(gè)氨基酸殘基，例如少于10個(gè)氨基酸殘基，例如少于9個(gè)氨基酸殘基，例如少于8個(gè)氨基酸殘基，例如少于7個(gè)氨基酸殘基，例如少于6個(gè)氨基酸殘基，例如少于5個(gè)氨基酸殘基。128.條目83的多肽，其中SEQIDNO90的第三拷貝位于SEQIDNO90的第一拷貝和SEQIDNO90的第二拷貝的N-端。129.條目83的多肽，其中SEQIDNO90的第三拷貝位于SEQIDNO90的第一拷貝的N-端以及SEQIDNO:90的第二拷貝的C-端。130.條目83的多肽，其中SEQIDNO90的第三拷貝位于SEQIDNO90的第二106拷貝的N-端以及SEQIDNO:90的第一拷貝的C-端。131.條目83的多肽，其中SEQIDNO90的第一拷貝位于SEQIDNO90的第一拷貝和SEQIDNO90的第二拷貝的C-端。132.條目83的多肽，進(jìn)一步含有SEQIDNO:90的第四拷貝，其與SEQIDNO90的第一、第二和第三拷貝不重疊，其中SEQIDNO90的第四拷貝含有序列Xab-Xbb-Xcb-Xdb-Xeb-Xfb-Xgb-Xhb-Xib(SEQIDNO90)，其中父曲選自氨基酸殘基S、A、G和D;父^選自氨基酸殘基A、V、I、T和S;X。b選自非大體積的氨基酸殘基；Xtlb選自氨基酸殘基S、I、T和V;父&選自氨基酸殘基3、4、1和丁;父^選自氨基酸殘基S、T和V;Xgb選自非大體積氨基酸殘基；Xtt選自氨基酸殘基S、T和V;乂&選自氨基酸殘基S、A和G;1696]其中SEQIDNO90的殘基Xbb、Xdb,Xfb和Xgb中的至少一個(gè)是T或V。133.條目83的多肽，其中Xab是So[1698]134.條目83的多肽，其中Xab是A。[1699]135.條目83的多肽，其中Xab是G0[1700]136.條目83的多肽，其中Xab是D。[1701]137.條目83的多肽，其中Xbb是A。[1702]138.條目83的多肽，其中Xbb是V。[1703]139.條目83的多肽，其中Xbb是I。[1704]140.條目83的多肽，其中Xbb是T。[1705]141.條目83的多肽，其中Xbb是So[1706]142.條目83的多肽，其中Xcb不包含環(huán)狀脂肪側(cè)鏈或者芳香側(cè)鏈。[1707]143.條目83的多肽，其中Xdb是So[1708]144.條目83的多肽，其中Xdb是I。[1709]145.條目83的多肽，其中Xdb是T。[1710]146.條目83的多肽，其中Xdb是V。[1711]147.條目83的多肽，其中Xeb是So[1712]148.條目83的多肽，其中Xeb是A。[1713]149.條目83的多肽，其中Xeb是I。[1714]150.條目83的多肽，其中Xeb是T。[1715]151.條目83的多肽，其中Xfb是So[1716]152.條目83的多肽，其中Xfb是T。[1717]153.條目83的多肽，其中Xfb是V。[1718]154.條目83的多肽，其中XRb不包含環(huán)狀脂肪側(cè)鏈或者芳香側(cè)鏈。[1719]是T。是T。是T。T。是V。是V。是V。V。155.條目83的多肽，其中Xhb是S。156.條目83的多肽，其中Xhb是T。157.條目83的多肽，其中Xhb是V。158.條目83的多肽，其中Xib是S。159.條目83的多肽，其中Xib是A0160.條目83的多肽，其中Xib是G0161.條目83的多肽，其中SEQIDNO162.條目83的多肽，其中SEQIDNO163.條目83的多肽，其中SEQIDNO164.條目83的多肽，其中SEQIDNO165.條目83的多肽，其中SEQIDNO166.條目83的多肽，其中SEQIDNO167.條目83的多肽，其中SEQIDNO168.條目83的多肽，其中SEQIDNO90的殘基Xbb、Xdb、Xfb和Xhb中的至少一個(gè)90的殘基Xbb、Xdb、Xfb和Xhb中的至少兩個(gè)90的殘基Xbb、Xdb,Xfb和Xhb中的至少三個(gè)90的殘基Xbb、Xdb、Xfb和Xhb中的四個(gè)都是90的殘基Xbb、Xdb、Xfb和Xhb中的至少一個(gè)90的殘基Xbb、Xdb、Xfb和Xhb中的至少兩個(gè)90的殘基Xbb、Xdb,Xfb和Xhb中的至少三個(gè)90的殘基Xbb、Xdb、Xfb和Xhb中的四個(gè)都是169.條目83的多肽，其中SEQIDNO90的第一拷貝和第四拷貝被一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基隔開。170.條目83的多肽，其中SEQIDNO90的第二拷貝和SEQIDNO90的第四拷貝被一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基隔開。171.條目83的多肽，其中SEQIDNO90的第三拷貝和SEQIDNO90的第四拷貝被一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基隔開。172.條目83的多肽，其中SEQIDNO:90的第一拷貝和SEQIDN0:90的第四拷貝被2個(gè)氨基酸殘基隔開，例如3個(gè)氨基酸殘基，例如4個(gè)氨基酸殘基，例如5個(gè)氨基酸殘基，例如6個(gè)氨基酸殘基，例如7個(gè)氨基酸殘基，例如8個(gè)氨基酸殘基，例如9個(gè)氨基酸殘基，例如10個(gè)氨基酸殘基，例如11個(gè)氨基酸殘基，例如12個(gè)氨基酸殘基，例如13個(gè)氨基酸殘基，例如14個(gè)氨基酸殘基，例如15個(gè)氨基酸殘基，例如16個(gè)氨基酸殘基，例如17個(gè)氨基酸殘基，例如18個(gè)氨基酸殘基，例如19個(gè)氨基酸殘基，例如20個(gè)氨基酸殘基，例如21個(gè)氨基酸殘基，例如22個(gè)氨基酸殘基，例如23個(gè)氨基酸殘基，例如24個(gè)氨基酸殘基，例如25個(gè)氨基酸殘基，例如26個(gè)氨基酸殘基，例如27個(gè)氨基酸殘基，例如28個(gè)氨基酸殘基，例如29個(gè)氨基酸殘基，例如30個(gè)氨基酸殘基。173.條目83的多肽，其中SEQIDNO:90的第二拷貝和SEQIDN0:90的第四拷貝被2個(gè)氨基酸殘基隔開，例如3個(gè)氨基酸殘基，例如4個(gè)氨基酸殘基，例如5個(gè)氨基酸殘基，108例如6個(gè)氨基酸殘基，例如7個(gè)氨基酸殘基，例如8個(gè)氨基酸殘基，例如9個(gè)氨基酸殘基，例如10個(gè)氨基酸殘基，例如11個(gè)氨基酸殘基，例如12個(gè)氨基酸殘基，例如13個(gè)氨基酸殘基，例如14個(gè)氨基酸殘基，例如15個(gè)氨基酸殘基，例如16個(gè)氨基酸殘基，例如17個(gè)氨基酸殘基，例如18個(gè)氨基酸殘基，例如19個(gè)氨基酸殘基，例如20個(gè)氨基酸殘基，例如21個(gè)氨基酸殘基，例如22個(gè)氨基酸殘基，例如23個(gè)氨基酸殘基，例如24個(gè)氨基酸殘基，例如25個(gè)氨基酸殘基，例如26個(gè)氨基酸殘基，例如27個(gè)氨基酸殘基，例如28個(gè)氨基酸殘基，例如29個(gè)氨基酸殘基，例如30個(gè)氨基酸殘基。174.條目83的多肽，其中SEQIDNO:90的第三拷貝和SEQIDN0:90的第四拷貝被2個(gè)氨基酸殘基隔開，例如3個(gè)氨基酸殘基，例如4個(gè)氨基酸殘基，例如5個(gè)氨基酸殘基，例如6個(gè)氨基酸殘基，例如7個(gè)氨基酸殘基，例如8個(gè)氨基酸殘基，例如9個(gè)氨基酸殘基，例如10個(gè)氨基酸殘基，例如11個(gè)氨基酸殘基，例如12個(gè)氨基酸殘基，例如13個(gè)氨基酸殘基，例如14個(gè)氨基酸殘基，例如15個(gè)氨基酸殘基，例如16個(gè)氨基酸殘基，例如17個(gè)氨基酸殘基，例如18個(gè)氨基酸殘基，例如19個(gè)氨基酸殘基，例如20個(gè)氨基酸殘基，例如21個(gè)氨基酸殘基，例如22個(gè)氨基酸殘基，例如23個(gè)氨基酸殘基，例如24個(gè)氨基酸殘基，例如25個(gè)氨基酸殘基，例如26個(gè)氨基酸殘基，例如27個(gè)氨基酸殘基，例如28個(gè)氨基酸殘基，例如29個(gè)氨基酸殘基，例如30個(gè)氨基酸殘基。175.條目83的多肽，其中SEQIDNO90的第一拷貝和SEQIDNO90的第四拷貝被至少2個(gè)氨基酸殘基隔開，例如至少3個(gè)氨基酸殘基，例如至少4個(gè)氨基酸殘基，例如至少5個(gè)氨基酸殘基，例如至少6個(gè)氨基酸殘基，例如至少7個(gè)氨基酸殘基，例如至少8個(gè)氨基酸殘基，例如至少9個(gè)氨基酸殘基，例如至少10個(gè)氨基酸殘基，例如至少11個(gè)氨基酸殘基，例如至少12個(gè)氨基酸殘基，例如至少13個(gè)氨基酸殘基，例如至少14個(gè)氨基酸殘基，例如至少15個(gè)氨基酸殘基，例如至少16個(gè)氨基酸殘基，例如至少17個(gè)氨基酸殘基，例如至少18個(gè)氨基酸殘基，例如至少19個(gè)氨基酸殘基，例如至少20個(gè)氨基酸殘基，例如至少21個(gè)氨基酸殘基，例如至少22個(gè)氨基酸殘基，例如至少23個(gè)氨基酸殘基，例如至少24個(gè)氨基酸殘基，例如至少25個(gè)氨基酸殘基，例如至少26個(gè)氨基酸殘基，例如至少27個(gè)氨基酸殘基，例如至少28個(gè)氨基酸殘基，例如至少29個(gè)氨基酸殘基，例如至少30個(gè)氨基酸殘基。176.條目83的多肽，其中SEQIDNO90的第二拷貝和SEQIDNO90的第四拷貝被至少2個(gè)氨基酸殘基隔開，例如至少3個(gè)氨基酸殘基，例如至少4個(gè)氨基酸殘基，例如至少5個(gè)氨基酸殘基，例如至少6個(gè)氨基酸殘基，例如至少7個(gè)氨基酸殘基，例如至少8個(gè)氨基酸殘基，例如至少9個(gè)氨基酸殘基，例如至少10個(gè)氨基酸殘基，例如至少11個(gè)氨基酸殘基，例如至少12個(gè)氨基酸殘基，例如至少13個(gè)氨基酸殘基，例如至少14個(gè)氨基酸殘基，例如至少15個(gè)氨基酸殘基，例如至少16個(gè)氨基酸殘基，例如至少17個(gè)氨基酸殘基，例如至少18個(gè)氨基酸殘基，例如至少19個(gè)氨基酸殘基，例如至少20個(gè)氨基酸殘基，例如至少21個(gè)氨基酸殘基，例如至少22個(gè)氨基酸殘基，例如至少23個(gè)氨基酸殘基，例如至少24個(gè)氨基酸殘基，例如至少25個(gè)氨基酸殘基，例如至少26個(gè)氨基酸殘基，例如至少27個(gè)氨基酸殘基，例如至少28個(gè)氨基酸殘基，例如至少29個(gè)氨基酸殘基，例如至少30個(gè)氨基酸殘基。177.條目83的多肽，其中SEQIDNO90的第三拷貝和SEQIDNO90的第四拷貝被至少2個(gè)氨基酸殘基隔開，例如至少3個(gè)氨基酸殘基，例如至少4個(gè)氨基酸殘基，例如至少5個(gè)氨基酸殘基，例如至少6個(gè)氨基酸殘基，例如至少7個(gè)氨基酸殘基，例如至少8個(gè)109氨基酸殘基，例如至少9個(gè)氨基酸殘基，例如至少10個(gè)氨基酸殘基，例如至少11個(gè)氨基酸殘基，例如至少12個(gè)氨基酸殘基，例如至少13個(gè)氨基酸殘基，例如至少14個(gè)氨基酸殘基，例如至少15個(gè)氨基酸殘基，例如至少16個(gè)氨基酸殘基，例如至少17個(gè)氨基酸殘基，例如至少18個(gè)氨基酸殘基，例如至少19個(gè)氨基酸殘基，例如至少20個(gè)氨基酸殘基，例如至少21個(gè)氨基酸殘基，例如至少22個(gè)氨基酸殘基，例如至少23個(gè)氨基酸殘基，例如至少24個(gè)氨基酸殘基，例如至少25個(gè)氨基酸殘基，例如至少26個(gè)氨基酸殘基，例如至少27個(gè)氨基酸殘基，例如至少28個(gè)氨基酸殘基，例如至少29個(gè)氨基酸殘基，例如至少30個(gè)氨基酸殘基。178.條目83的多肽，其中SEQIDNO:90的第一拷貝和SEQIDN0:90的第四拷貝被少于100個(gè)氨基酸殘基隔開，例如少于95個(gè)氨基酸殘基，例如少于90個(gè)氨基酸殘基，例如少于85個(gè)氨基酸殘基，例如少于80個(gè)氨基酸殘基，例如少于75個(gè)氨基酸殘基，例如少于70個(gè)氨基酸殘基，例如少于65個(gè)氨基酸殘基，例如少于60個(gè)氨基酸殘基，例如少于55個(gè)氨基酸殘基，例如少于50個(gè)氨基酸殘基，例如少于45個(gè)氨基酸殘基，例如少于40個(gè)氨基酸殘基，例如少于35個(gè)氨基酸殘基，例如少于30個(gè)氨基酸殘基，例如少于25個(gè)氨基酸殘基，例如少于24個(gè)氨基酸殘基，例如少于23個(gè)氨基酸殘基，例如少于22個(gè)氨基酸殘基，例如少于21個(gè)氨基酸殘基，例如少于20個(gè)氨基酸殘基，例如少于19個(gè)氨基酸殘基，例如少于18個(gè)氨基酸殘基，例如少于17個(gè)氨基酸殘基，例如少于16個(gè)氨基酸殘基，例如少于15個(gè)氨基酸殘基，例如少于14個(gè)氨基酸殘基，例如少于13個(gè)氨基酸殘基，例如少于12個(gè)氨基酸殘基，例如少于11個(gè)氨基酸殘基，例如少于10個(gè)氨基酸殘基，例如少于9個(gè)氨基酸殘基，例如少于8個(gè)氨基酸殘基，例如少于7個(gè)氨基酸殘基，例如少于6個(gè)氨基酸殘基，例如少于5個(gè)氨基酸殘基。179.條目83的多肽，其中SEQIDNO:90的第二拷貝和SEQIDN0:90的第四拷貝被少于100個(gè)氨基酸殘基隔開，例如少于95個(gè)氨基酸殘基，例如少于90個(gè)氨基酸殘基，例如少于85個(gè)氨基酸殘基，例如少于80個(gè)氨基酸殘基，例如少于75個(gè)氨基酸殘基，例如少于70個(gè)氨基酸殘基，例如少于65個(gè)氨基酸殘基，例如少于60個(gè)氨基酸殘基，例如少于55個(gè)氨基酸殘基，例如少于50個(gè)氨基酸殘基，例如少于45個(gè)氨基酸殘基，例如少于40個(gè)氨基酸殘基，例如少于35個(gè)氨基酸殘基，例如少于30個(gè)氨基酸殘基，例如少于25個(gè)氨基酸殘基，例如少于24個(gè)氨基酸殘基，例如少于23個(gè)氨基酸殘基，例如少于22個(gè)氨基酸殘基，例如少于21個(gè)氨基酸殘基，例如少于20個(gè)氨基酸殘基，例如少于19個(gè)氨基酸殘基，例如少于18個(gè)氨基酸殘基，例如少于17個(gè)氨基酸殘基，例如少于16個(gè)氨基酸殘基，例如少于15個(gè)氨基酸殘基，例如少于14個(gè)氨基酸殘基，例如少于13個(gè)氨基酸殘基，例如少于12個(gè)氨基酸殘基，例如少于11個(gè)氨基酸殘基，例如少于10個(gè)氨基酸殘基，例如少于9個(gè)氨基酸殘基，例如少于8個(gè)氨基酸殘基，例如少于7個(gè)氨基酸殘基，例如少于6個(gè)氨基酸殘基，例如少于5個(gè)氨基酸殘基。180.條目83的多肽，其中SEQIDNO:90的第三拷貝和SEQIDN0:90的第四拷貝被少于100個(gè)氨基酸殘基隔開，例如少于95個(gè)氨基酸殘基，例如少于90個(gè)氨基酸殘基，例如少于85個(gè)氨基酸殘基，例如少于80個(gè)氨基酸殘基，例如少于75個(gè)氨基酸殘基，例如少于70個(gè)氨基酸殘基，例如少于65個(gè)氨基酸殘基，例如少于60個(gè)氨基酸殘基，例如少于55個(gè)氨基酸殘基，例如少于50個(gè)氨基酸殘基，例如少于45個(gè)氨基酸殘基，例如少于40個(gè)氨基酸殘基，例如少于35個(gè)氨基酸殘基，例如少于30個(gè)氨基酸殘基，例如少于25個(gè)氨基酸殘基，例如少于24個(gè)氨基酸殘基，例如少于23個(gè)氨基酸殘基，例如少于22個(gè)氨基酸殘基，例如少于21個(gè)氨基酸殘基，例如少于20個(gè)氨基酸殘基，例如少于19個(gè)氨基酸殘基，例如少于18個(gè)氨基酸殘基，例如少于17個(gè)氨基酸殘基，例如少于16個(gè)氨基酸殘基，例如少于15個(gè)氨基酸殘基，例如少于14個(gè)氨基酸殘基，例如少于13個(gè)氨基酸殘基，例如少于12個(gè)氨基酸殘基，例如少于11個(gè)氨基酸殘基，例如少于10個(gè)氨基酸殘基，例如少于9個(gè)氨基酸殘基，例如少于8個(gè)氨基酸殘基，例如少于7個(gè)氨基酸殘基，例如少于6個(gè)氨基酸殘基，例如少于5個(gè)氨基酸殘基。181.條目83的多肽，其中SEQIDNO90的第四拷貝位于SEQIDNO90的第一拷貝的N-端。182.條目83的多肽，其中SEQIDNO90的第四拷貝位于SEQIDNO90的第一拷貝的C-端。183.條目83的多肽，其中SEQIDNO90的第四拷貝位于SEQIDNO90的第二拷貝的N-端。184.條目83的多肽，其中SEQIDNO90的第四拷貝位于SEQIDNO90的第二拷貝的C-端。185.條目83的多肽，其中SEQIDNO90的第四拷貝位于SEQIDNO90的第三拷貝的N-端。186.條目83的多肽，其中SEQIDNO90的第四拷貝位于SEQIDNO90的第三拷貝的C-端。187.條目1至186任一項(xiàng)的多肽與載體相連。188.條目187的多肽，其中所述載體包含親合素基團(tuán)，如鏈親合素，其可選擇地被生物素化。189.條目1至186任一項(xiàng)所述的多肽，其與固體載體或半固體載體相連，例如通過共價(jià)結(jié)合。190.條目1至186任一項(xiàng)所述的多肽可操作地與親和標(biāo)簽融合，如組氨酸標(biāo)記。191.一種融合多肽，含有可操作地與N-端側(cè)翼序列融合的條目1至186任一項(xiàng)所述的多肽。192.一種融合多肽，含有可操作地與C-端側(cè)翼序列融合的條目1至186任一項(xiàng)所述的多肽。193.條目1至186任一項(xiàng)所述的多肽，其可操作地與信號(hào)肽融合。194.條目1至186任一項(xiàng)所述的多肽，其可操作地與前區(qū)段(pro-region)融合。195.條目1至186任一項(xiàng)所述的多肽，其可操作地與預(yù)前區(qū)段(pre-pro-region)融合。196.條目1至186任一項(xiàng)所述的多肽，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被修飾，所述修飾優(yōu)選地選自由體內(nèi)或體外的化學(xué)衍生作用，如乙?；饔没螋然饔茫腔饔?，例如由將多肽暴露于影響糖基化的酶所產(chǎn)生的糖基化作用，例如哺乳動(dòng)物糖基化或者去糖基化酶；磷酸化作用，如導(dǎo)致磷酸化氨基酸殘基的氨基酸殘基修飾，如磷酸酪氨酸、磷酸絲氨酸和磷酸蘇氨酸。197.條目1至186任一項(xiàng)的多肽，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被修飾，以便優(yōu)選地提高對(duì)于蛋白質(zhì)降解的抵抗力和穩(wěn)定性，或者優(yōu)化溶解性能，或者使多肽更適宜作為一種治療劑。198.條目197的多肽，含有除天然產(chǎn)生的L-氨基酸殘基以外的氨基酸殘基。199.條目198的多肽，含有D-氨基酸殘基。200.條目198的多肽，含有非天然產(chǎn)生的合成氨基酸。201.條目197的多肽，包含一個(gè)或多個(gè)阻斷基團(tuán)，優(yōu)選地是化學(xué)取代基的形式，適用于在不良的降解條件下保護(hù)和/或穩(wěn)定該多肽的N-和C-端。202.條目201的多肽，其中所述一個(gè)或多個(gè)阻斷基團(tuán)包括保護(hù)基，其對(duì)多肽在體內(nèi)的活性沒有不利影響。203.條目201的多肽，其中所述一個(gè)或多個(gè)阻斷基團(tuán)是由N-末端的烷基化或酰基化作用引入。204.條目201的多肽，其中所述一個(gè)或多個(gè)阻斷基團(tuán)組選自N-端阻斷基團(tuán)，包括Cl至C5分支或無分支的烷基和?；缂柞；鸵阴；捌淙〈问?，如乙酰氨基甲基(Acm)ο205.條目201的多肽，其中所述一個(gè)或多個(gè)阻斷基團(tuán)選自N-端阻斷基團(tuán)，包括氨基酸的去氨基類似物，其與肽的N-端連接或者用于代替N-端氨基酸殘基。206.條目201的多肽，其中所述一個(gè)或多個(gè)阻斷基團(tuán)選自C-端阻斷基團(tuán)，其中C-端的羧基被納入或者不納入，例如酯、酮和氨基化合物，以及去羧酸化的氨基酸類似物。207.條目201的多肽，其中所述一個(gè)或多個(gè)阻斷基團(tuán)選自C-端阻斷基團(tuán)，包括形成酯或酮的烷基，如低烷基(C1至C6)，如甲基、乙基和丙基；以及形成酰胺的氨基，如伯氨(-NH2)、單-和雙-烷基氨基，如甲氨、乙氨、二甲氨、二乙氨、甲乙氨等。208.條目201的多肽，其中N-端的游離氨基和末端的游離羧基可以完全從多肽中移去，以產(chǎn)生去氨基和去羧酸的形式，而基本不影響多肽的生物活性。209.條目1至208任一項(xiàng)所述的多肽的酸式鹽，所述鹽可通過用無機(jī)酸，如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等；或有機(jī)酸，如乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、蘋果酸、丙二酸、丁二酸、馬來酸、富馬酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、P-甲苯磺酸或水楊酸處理所述多肽而得，以提供該多肽的水溶性鹽。210.一種生產(chǎn)條目1至208任一項(xiàng)所述多肽的方法，所述方法包括步驟提供編碼所述多肽的多核苷酸，并在適宜的宿主生物中的體外或體內(nèi)表達(dá)所述多核苷酸，從而生產(chǎn)條目1至208任一項(xiàng)所述的多肽。211.編碼條目1至208任一項(xiàng)所述多肽的多肽部分的多核苷酸。212.含有條目211所述的多核苷酸的表達(dá)載體，所述多核苷酸可選擇地被可操作地連接到調(diào)控序列，該調(diào)控序列控制所述多核苷酸在適宜宿主細(xì)胞中的表達(dá)。213.一種重組或轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞，含有條目1至208任一項(xiàng)所述的多肽、或者條目211所述的多核苷酸、或者條目212所述的表達(dá)載體。214.一種生成重組或轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞的方法，所述方法包含步驟提供編碼條目1至208任一項(xiàng)所述多肽的多核苷酸，將所述多核苷酸引入所述重組或轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞，從而生成一種產(chǎn)生所述多肽的重組或轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞。215.含有條目213所述的宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物生物體。[1780]216.條目215的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物生物體，其中所述哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞是動(dòng)物細(xì)胞，選自單系群兩側(cè)對(duì)稱動(dòng)物，包括屬于后口動(dòng)物(Deuterostomes)、蛻皮動(dòng)物(Ecdysozoa)、扁蟲動(dòng)物(Platyzoa)、冠輪動(dòng)物(Lophotrochozoa)的任意四個(gè)主要家系的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。217.條目215的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物生物體，其中所述哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞是選自卵裂球細(xì)胞、卵細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、紅血球、纖維原細(xì)胞、肝細(xì)胞、成肌細(xì)胞、肌小管、神經(jīng)細(xì)胞、卵母細(xì)胞、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、精子細(xì)胞、T細(xì)胞和受精卵的動(dòng)物細(xì)胞。218.一種生成轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的方法，所述方法包括步驟提供編碼條目1至208任一項(xiàng)所述多肽的多核苷酸，將所述多核苷酸引入所述重組或轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞，并且可選地，在所述轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的宿主細(xì)胞中表達(dá)所述多核苷酸，從而生成一種產(chǎn)生所述多肽的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞。219.轉(zhuǎn)基因魚，含有條目1至208任一項(xiàng)所述的多肽，或條目211所述的多核苷酸，和/或條目212所述的表達(dá)載體。220.條目219的轉(zhuǎn)基因魚，其中所述魚是鮭魚。221.條目219的轉(zhuǎn)基因魚，其中所述魚是比目魚。222.條目219的轉(zhuǎn)基因魚，其中所述魚是鱈魚。223.條目219的轉(zhuǎn)基因魚，其中所述魚是青魚224.含有條目213所述的宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因植物。225.條目224的轉(zhuǎn)基因植物宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是分類單元Embryophyta或Viridiplantae或Chlorobionta的植物細(xì)胞，優(yōu)選地選自湖粉細(xì)胞、厚角組織細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、胚乳細(xì)胞、表皮細(xì)胞、葉肉細(xì)胞、分生組織細(xì)胞、柵欄細(xì)胞、薄壁細(xì)胞、韌皮部篩管細(xì)胞、花粉生成細(xì)胞、花粉營養(yǎng)細(xì)胞、厚壁組織細(xì)胞、管胞細(xì)胞、木質(zhì)部導(dǎo)管細(xì)胞和受精卵細(xì)胞。226.條目224的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物是馬鈴薯植物。227.條目224的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物是番茄植物。228.條目224的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物是葡萄藤。229.條目224的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物是黃瓜植物。230.條目224的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物是小麥。231.條目224的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物是大麥。232.條目224的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物是黑麥。233.條目224的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物是燕麥。234.條目224的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物是煙葉。235.條目224的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物是柑橘類植物。236.條目224的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物是蘋果植物。237.條目224的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物是草莓植物。238.條目224的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物是樹莓植物。239.一種生成轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包括步驟提供編碼條目1至208任一項(xiàng)所述多肽的多核苷酸，將所述多核苷酸引入所述植物，并且可選地，在所述植物中表達(dá)所述多核苷酸，從而生成一種產(chǎn)生所述多肽的轉(zhuǎn)基因植物。113[1804]240.一種重組細(xì)菌宿主細(xì)胞，含有條目1至208任一項(xiàng)所述的多肽，和/或條目211所述的多核苷酸，和/或條目212所述的載體。241.條目240的細(xì)菌宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)菌宿主細(xì)胞選自革蘭氏陽性細(xì)菌宿主細(xì)胞和革蘭氏陰性細(xì)菌宿主細(xì)胞。242.條目240的細(xì)菌宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)菌細(xì)胞是Lactobacillus菌株。243.條目240的細(xì)菌宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)菌細(xì)胞是Str印tococcus菌株。244.條目240的細(xì)菌宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)菌細(xì)胞是Bifidobacterium菌株。245.一種產(chǎn)生重組細(xì)菌細(xì)胞的方法，所述方法包括步驟提供編碼條目1至208任一項(xiàng)所述多肽的多核苷酸，將所述多核苷酸引入所述細(xì)菌細(xì)胞，并且可選地，在所述細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)所述多核苷酸，從而生成一種產(chǎn)生所述多肽的重組細(xì)菌細(xì)胞。246.一種重組酵母細(xì)胞，含有條目1至208任一項(xiàng)所述的多肽，和/或條目211所述的多核苷酸，和/或條目212所述的載體。247.條目246的酵母宿主細(xì)胞，其中所述酵母宿主細(xì)胞屬于Saccharomyces、Scizosacchomyces或Pichia屬。248.條目246的酵母宿主細(xì)胞，其中所述酵母是Saccharomycescerevisiae.249.條目246的酵母宿主細(xì)胞，其中所述酵母是Scizosacchomycespompe.250.條目246的酵母宿主細(xì)胞，其中所述酵母是Pichiapastoris。251.一種生成重組酵母細(xì)胞的方法，所述方法包括步驟提供編碼條目1至208任一項(xiàng)所述多肽的多核苷酸，將所述多核苷酸引入所述酵母細(xì)胞，并且可選地，在所述酵母細(xì)胞中表達(dá)所述多核苷酸，從而生成一種產(chǎn)生所述多肽的重組酵母細(xì)胞。252.一種重組真菌細(xì)胞，含有條目1至208任一項(xiàng)所述的多肽，和/或條目211所述的多核苷酸，和/或條目212所述的載體。253.條目252的真菌宿主細(xì)胞，其中所述真菌屬于Aspergillus屬。254.一種生成重組真菌細(xì)胞的方法，所述方法包括步驟提供編碼條目1至208任一項(xiàng)所述多肽的多核苷酸，將所述多核苷酸引入所述真菌細(xì)胞，并且可選地，在所述真菌細(xì)胞中表達(dá)所述多核苷酸，從而生成一種產(chǎn)生所述多肽的重組真菌細(xì)胞。255.一種特異性針對(duì)條目1至208任一項(xiàng)所述多肽的抗體或其結(jié)合片段。256.條目255的抗體，其中所述抗體是多克隆的。257.條目255的抗體，其中所述抗體是單克隆的。258.條目255的抗體片段，其中所述抗體片段包含抗體的一部分，選自F(ab')2、F(ab)2、Fab'禾口Fab。259.條目255的抗體片段，其中所述抗體片段是與特異性抗原結(jié)合的合成或者基因工程化的多肽。260.條目255的抗體片段，其中所述抗體片段選自包含或由輕鏈可變區(qū)組成的抗體片段；包含或由“Fv”片段組成的抗體片段，F(xiàn)v片段由可變區(qū)域的重鏈和輕鏈組成；包含或由重組單鏈多肽分子組成的抗體片段，重組單鏈多肽分子中的輕可變區(qū)和重可變區(qū)通過肽連接頭連接("scFv多肽")，以及包含或由最小識(shí)別單元組成的抗體片段，最少識(shí)別單元組成模仿高變區(qū)的氨基酸殘基。261.條目255的抗體，其中所述抗體是重組多肽形式的嵌合抗體，其含有來自鼠抗體的可變區(qū)和互補(bǔ)決定區(qū)，而抗體分子的剩余部分來自人抗體。262.條目255的抗體，其中所述抗體是重組多肽形式的人源化抗體，其中單克隆抗體的鼠互補(bǔ)決定區(qū)已經(jīng)由小鼠免疫球蛋白的重和輕可變鏈轉(zhuǎn)移至人可變域。263.條目255至262任一項(xiàng)所述的抗體，進(jìn)一步包含或者連接可檢測(cè)的分子或原子的形式的標(biāo)記，所述標(biāo)記可以與抗體基團(tuán)偶聯(lián)，從而產(chǎn)生更容易檢測(cè)的基團(tuán)。264.條目263的抗體，其中標(biāo)記選自螯合劑，光活性劑，放射性同位素，熒光劑和順磁離子。265.一種生成特異性針對(duì)條目1至208任一項(xiàng)所述多肽的多克隆抗體或其結(jié)合片段的方法，所述方法包括步驟在引起抗體應(yīng)答的條件下用條目1至208任一項(xiàng)所述的多肽免疫哺乳動(dòng)物個(gè)體，識(shí)別與多肽特異性結(jié)合的抗體，并且可選地，從所述哺乳動(dòng)物個(gè)體中分離所述抗體或其結(jié)合片段。266.一種生成特異性針對(duì)條目1至208任一項(xiàng)所述多肽的單克隆抗體的方法，所述方法包括步驟在引起抗體應(yīng)答的條件下用條目1至208任一項(xiàng)所述的多肽免疫哺乳動(dòng)物個(gè)體，制備產(chǎn)生特異性針對(duì)條目1至208任一項(xiàng)所述多肽的抗體的雜交瘤，并且識(shí)別與多肽特異性結(jié)合的抗體。267.一種組合物，含有條目1至208任一項(xiàng)所述的多肽以及載體。268.一種冰排斥面，含有條目1至208任一項(xiàng)所述的多肽或條目267所述的組合物。1833]269.包含條目268所述的冰排斥面的冷藏室。1834]270.包含條目268所述的冰排斥面的冷凍器。1835]271.包含條目268所述的冰排斥面的櫥窗。1836]272.包含條目268所述的冰排斥面的風(fēng)車翼。1837]273.包含條目268所述的冰排斥面的無線電檢測(cè)和測(cè)距裝置。1838]274.包含條目268所述的冰排斥面的汽車。1839]275.包含條目268所述的冰排斥面的熱泵。1840]276.包含條目268所述的冰排斥面的帆船。1841]277.包含條目268所述的冰排斥面的路面。1842]278.一種轉(zhuǎn)移液體源(例如水)的管，所述管包含條目268所述的冰排斥面1843]279.條目278所述的管由塑料制成。1844]280.條目278所述的管由金屬制成。1845]281.包含條目268所述的冰排斥面的屋頂結(jié)構(gòu)。1846]282.包含條目268所述的冰排斥面的瓶子。1847]283.包含條目268所述的冰排斥面的罐頭。1848]284.包含條目268所述的冰排斥面的天線裝置。1849]285.包含條目268所述的冰排斥面的風(fēng)檔刮水器。1850]286.包含條目268所述的冰排斥面的橡膠輪胎。1851]287.包含條目268所述的冰排斥面的空調(diào)裝置。1852]288.包含條目268所述的冰排斥面的鐵軌。1853]289.包含條目268所述的冰排斥面的火車車輪。合物.[1856[1857[1858[1859[1860[1861[1862[1863[1864[1865[1866[1867[1868[1869[1870[1871[1872[1873[1874[1875[1876[1877[1878209任物的凝固點(diǎn)降低<290.291.292.293.294.295.296.297.298.299.300.301.302.303.304.305.306.307.308.309.310.311.312.313.314.包含條目268所述的冰排斥面的電纜。一種冰晶核表面，含有條目1至208任--項(xiàng)所述的多肽或條目267所述的組包含條目291所述的冰晶核表面的冷藏室。包含條目291所述的冰晶核表面的冷凍室。包含條目291所述的冰晶核表面的櫥窗。包含條目291所述的冰晶核表面的風(fēng)車翼。包含條目291所述的冰晶核表面的無線電檢測(cè)和測(cè)距裝置。包含條目291所述的冰晶核表面的汽車。包含條目291所述的冰晶核表面的熱泵。包含條目291所述的冰晶核表面的帆船。包含條目291所述的冰晶核表面的路面。一種轉(zhuǎn)移液體源(例如水)的管，所述管包含條目291所述的冰晶核表面。條目301所述的管由塑料制成。條目301所述的管由金屬制成。包含條目291所述的冰晶核表面的屋頂結(jié)構(gòu)。包含條目291所述的冰晶核表面的瓶子。包含條目291所述的冰晶核表面的罐頭。包含條目291所述的冰晶核表面的天線裝置。包含條目291所述的冰晶核表面的風(fēng)檔刮水器。包含條目291所述的冰晶核表面的橡膠輪胎包含條目291所述的冰晶核表面的空調(diào)裝置。包含條目291所述的冰晶核表面的鐵軌。包含條目291所述的冰晶核表面的火車車輪。包含條目291所述的冰晶核表面的電纜。一種降低水性液體組合物的凝固點(diǎn)的方法，所述方法包括步驟將條目1至-項(xiàng)所述的多肽與所述水性液體組合物接觸，其中所述接觸導(dǎo)致所述水性液體組合1879]315.條目314的方法，其中所述液體組合物包括涂料組合物。1880]316.條目314的方法，其中所述液體組合物包括冷凍器中使用的防凍劑。1881]317.條目314的方法，其中所述液體組合物包括冷藏室中使用的防凍劑。1882]318.條目314的方法，其中所述液體組合物包括發(fā)動(dòng)機(jī)中使用的防凍劑.1883]319.條目314的方法，其中所述液體組合物包括擋風(fēng)玻璃清洗劑。1884]320.條目314的方法，其中所述液體組合物包括硅樹脂。1885]321.條目314的方法，其中所述液體組合物包括涂料成分，如油漆、亮漆或清漆。1886]322.條目314的方法，其中所述液體組合物包括蠟。1887]323.條目314的方法，其中所述液體組合物包括油。1888]324.條目314的方法，其中所述液體組合物包括水泥。1889]325.條目314的方法，其中所述液體組合物包括混凝土。116[1890]326.條目314的方法，其中所述液體組合物包括肥皂。327.條目314的方法，其中所述液體組合物包括鎖中使用的防凍組合物。328.一種減少或消除水性液體組合物再結(jié)晶的方法，所述方法包括步驟在凍結(jié)之前將條目1至209任一項(xiàng)所述的多肽與水性液體組合物接觸，由此減少或消除水性液體組合物的再結(jié)晶。329.條目328的方法，其中所述液體組合物包括涂料組合物。330.條目328的方法，其中所述液體組合物包括冷凍器中使用的防凍劑。331.條目328的方法，其中所述液體組合物包括冷藏室中使用的防凍劑。332.條目328的方法，其中所述液體組合物包括發(fā)動(dòng)機(jī)中使用的防凍劑.333.條目328的方法，其中所述液體組合物包括擋風(fēng)玻璃清洗劑。334.條目314的方法，其中所述液體組合物包括硅樹脂。335.條目328的方法，其中所述液體組合物包括亮漆。336.條目328的方法，其中所述液體組合物包括蠟。337.條目328的方法，其中所述液體組合物包括油。338.條目328的方法，其中所述液體組合物包括水泥。339.條目328的方法，其中所述液體組合物包括混凝土。340.條目328的方法，其中所述液體組合物包括肥皂。341.條目328的方法，其中所述液體組合物包括鎖中使用的防凍組合物。342.一種保存和/或降低生物樣品或器官的凝固點(diǎn)的方法，通過將條目1至209任一項(xiàng)所述的多肽和生物樣品或器官接觸，由此可以在超冷條件或凍結(jié)條件下保存生物樣品或器官。343.條目342的方法，其中生物樣品包括多肽。344.條目342的方法，其中生物樣品包括微粒或膠束。345.條目342的方法，其中生物樣品包括全血。346.條目342的方法，其中生物樣品包括血漿。347.條目342的方法，其中生物樣品包括血小板。348.條目342的方法，其中生物樣品包括紅細(xì)胞。349.條目342的方法，其中生物樣品包括精液。350.條目342的方法，其中生物樣品包括配子。351.條目342的方法，其中生物樣品包括昆蟲細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物。352.條目342的方法，其中生物樣品包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物。353.條目352的方法，其中哺乳動(dòng)物細(xì)胞是鼠細(xì)胞。354.條目342的方法，其中哺乳動(dòng)物細(xì)胞是人細(xì)胞。355.條目342的方法，其中生物樣品包括或者由器官組成。356.條目355的方法，其中器官選自腎、肺、心臟、脾和肝。357.一種抑制生物樣品或器官在儲(chǔ)存期間再結(jié)晶的方法，通過將條目1至209任一項(xiàng)所述的多肽與生物樣品或器官接觸，從而抑制再結(jié)晶，并可以在超冷條件或冷藏條件下儲(chǔ)存生物樣品或器官。358.條目357的方法，其中生物樣品包括多肽。117[1923]359.條目357的方法，其中生物樣品包括微?；蚰z束。360.條目357的方法，其中生物樣品包括全血。361.條目357的方法，其中生物樣品包括血漿。362.條目357的方法，其中生物樣品包括血小板。363.條目357的方法，其中生物樣品包括紅細(xì)胞。364.條目357的方法，其中生物樣品包括精液。365.條目357的方法，其中生物樣品包括配子。366.條目357的方法，其中生物樣品包括昆蟲細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物。367.條目357的方法，其中生物樣品包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物。368.條目357的方法，其中哺乳動(dòng)物細(xì)胞是鼠細(xì)胞。369.條目357的方法，其中哺乳動(dòng)物細(xì)胞是人細(xì)胞。370.條目357的方法，其中生物樣品包括或者由器官組成。371.條目357的方法，其中器官選自腎、肺、心臟、脾和肝。372.一種保存食用或飲用組合物(如食品)的方法，通過將條目1至209任一項(xiàng)所述的多肽與食品接觸，從而可以改善或延長非冷凍態(tài)的食用或飲用組合物的儲(chǔ)存，否則食品在該非冷凍態(tài)的溫度下將成為凍結(jié)態(tài)。373.條目372的方法，其中組合物選自牛奶、發(fā)酵奶、奶酪、碎肉、碎魚、酸奶、雪酪、果子露、布丁、菜泥、果漿、生面團(tuán)、冰牛奶、奶油、刨冰、碎冰、冰沙、冰淇淋、冰糕、面糊和肉。374.一種減少或抑制食用或飲用組合物上的冰晶體再結(jié)晶的方法，通過將條目1至209任一項(xiàng)所述的多肽與食物接觸，從而減少或抑制儲(chǔ)存期間溫度下組合物上形成的冰晶體的再結(jié)晶，否則將在該溫度下形成冰晶體。375.條目374的方法，其中組合物選自牛奶、發(fā)酵奶、奶酪、碎肉、碎魚、酸奶、雪酪、果子露、布丁、菜泥、果漿、生面團(tuán)、冰牛奶、奶油、刨冰、碎冰、冰沙、冰淇淋、冰糕、面糊和肉。376.一種增加化妝品的耐寒性的方法，該化妝品能夠用于個(gè)體的皮膚，所述方法包括將條目1至209任一項(xiàng)所述的多肽與化妝品接觸的步驟，從而當(dāng)應(yīng)用于皮膚時(shí)增加化妝品的耐寒性。377.一種增加產(chǎn)品的水分含量的方法，該產(chǎn)品能夠吸水，所述方法包括接觸條目1至209任一項(xiàng)所述的多肽的步驟，從而增加產(chǎn)品的水分含量。378.一種通過手術(shù)限制腫瘤的方法，所述方法包括在所述腫瘤進(jìn)行冷凍步驟前，將條目1至209任一項(xiàng)所述的多肽注射進(jìn)腫瘤的步驟，從而增強(qiáng)對(duì)腫瘤的殺滅。379.一種通過手術(shù)可控制地除去脂肪組織的方法，所述方法包括在除去脂肪組織前，將條目1至209任一項(xiàng)所述的多肽注射進(jìn)脂肪組織的步驟。380.一種抑制原油產(chǎn)品中包合物形成的方法，所述方法包括將條目1至209任一項(xiàng)所述的多肽添加至原油產(chǎn)品的步驟，從而抑制包合物形成。381.一種在干燥期間或者在經(jīng)受高或低滲透壓期間穩(wěn)定生物樣品的方法，所述方法包括接觸條目1至209任一項(xiàng)所述的多肽的步驟，從而在干燥期間或者在經(jīng)受高或低滲透壓期間，穩(wěn)定生物樣品。[1946]382.條目381的方法，其中生物樣品包括一種或多種多肽、微粒體、膠束、全血、血漿、血小板、紅細(xì)胞、精液、配子。383.條目381的方法，其中生物樣品包括細(xì)胞培養(yǎng)物。384.條目383的方法，其中細(xì)胞培養(yǎng)物包括一種或多種昆蟲細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、鼠細(xì)胞和人細(xì)胞。385.一種從包含不同分子的組合物中純化一種或多種分子的方法，所述方法包括在含有條目1至209任一項(xiàng)所述多肽的組合物存在的情況下，進(jìn)行所述純化的步驟，從而可以在低于包含不同分子的組合物的凝固點(diǎn)的溫度下發(fā)生純化。386.條目385的方法，其中組合物的分子包括不同的分子，選自多肽、肽、氨基酸、糖、脂肪酸、DNA分子、RNA分子、磷脂、如線粒體、核糖體等細(xì)胞器、三磷酸腺苷。387.一種改善待脫水的組合物的脫水的方法，所述方法包括將所述組合物與條目1至209任一項(xiàng)所述的多肽接觸，以及使所述組合物脫水的步驟。388.一種含有條目1至209所述多肽的組合物。389.一種含有條目1至209所述多肽的組合物，其中多肽均勻或不均勻地在表面分布。390.一種含有條目1至209所述多肽的組合物，其中多肽均勻或不均勻地分布在整個(gè)組合物中。391.一種用于冷凍的含有條目1至209所述多肽的組合物，其中多肽是在冷凍前加入。392.一種用于冷凍的含有條目1至209所述多肽的組合物，其中多肽在冷凍后加入。393.含有條目1至209所述多肽的藥物成分。394.含有條目1至209所述多肽的表面，其中所述表面是冰排斥的。395.含有條目1至209所述多肽的表面，其中所述表面是冰結(jié)合的。396.含有條目1至209所述多肽的生物樣品。397.含有條目1至209所述多肽的食用組合物。398.含有條目1至209所述多肽的液體組合物。399.含有條目1至209所述多肽的固體組合物。400.含有條目1至209所述多肽的固體組合物，其中多肽在表面分布。401.含有條目1至209所述多肽的固體成分，其中多肽均勻或不均勻地分布在整個(gè)樣品中?，F(xiàn)通過描述來自Rhagiummordax的抗凍蛋白的重組表達(dá)、純化和特征，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說明。實(shí)施例采用兩種不同的方法鑒別和純化來自R.mordax的抗凍多肽。1)用Kristiansen等人(2005)發(fā)表的方法來純化該抗凍多肽。2)設(shè)計(jì)兩種簡并引物，以匹配R.InquisitorAFP的N-端和C-端區(qū)(圖1)。用它們?cè)诔Ｒ?guī)的RT-PCR反應(yīng)中擴(kuò)增R.mordaxRNA的cDNA區(qū)，R.mordaxRNA是從冬季采集的動(dòng)物中分離。這種cDNA編碼來自R.mordax推定的AFP’s的中心區(qū)。通過這種方法，得到多肽兩種類型(族)的中心部分的序列(99-108aa)。3)隨后獲得對(duì)9種同工型的全長AFP序列。通過使用ClontechSmartRACEcDNA擴(kuò)增試劑盒，將特異性針對(duì)編碼推定的AFP’s的cDNA各中心部分的引物與相關(guān)的5’端的擴(kuò)增結(jié)合使用。一旦獲得各cDNA的5’端，該序列將被用于獲得全長克隆。這是通過在R.mordaxRNA的RT-PCR反應(yīng)中，用匹配各cDNA末端5，端的引物與匹配mRNApoly-A尾的引物相結(jié)合來完成的?？傊?，獲得了編碼組IAFP’s的各種同工型的9種全長cDNA，并且推斷出編碼的多肽。表達(dá)和純化源自RhagiummordaxRmAFP的抗凍蛋白(AFP)的六種同工型被克隆。圖5顯示一種野生型(wt)同工型RmAFPl的SDS-PAGE凝膠，以及缺失變體(Δ2-9，WC(Trp-Cys))。將RmAFP變體構(gòu)建為缺失冰結(jié)合域，從RmAFPl的C-端開始每次缺失一個(gè)(Δ2-Δ9)(例如Δ4表示推定的冰結(jié)合域4-9缺失)，以及在C-端包含Trp和Cys殘基的變體(WC)。將它們克隆到PGEX載體系統(tǒng)中(GEHealthcare)并在Ε.coli(菌株0rigami，BL21)中轉(zhuǎn)化。這些蛋白表達(dá)為谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)融合蛋白，其在GST和RmAFP之間含有凝血酶裂解位點(diǎn)。然后，將細(xì)胞通過弗氏壓碎器溶解，并且使用與瓊脂糖珠共價(jià)連接的還原型谷胱甘肽，基于親和色譜以及體積排阻色譜進(jìn)行純化譜。圖5中的箭頭表示AFPl的缺失衍生物的位置?；钚詼y(cè)定利用納米-升滲壓計(jì)測(cè)試Rhagiummordax抗凍蛋白的野生型同工型及其變體的活性。結(jié)果顯示在下表4中。將RmAFP變體構(gòu)建為缺失冰結(jié)合域，從RmAFPl的C-端每次缺失一個(gè)；以及在C-端含有Trp和Cys殘基的變體。THapp是熱滯后，直接從分析中估計(jì)而不考慮AFP的濃度，被純化或在個(gè)別測(cè)試中作為融合蛋白或冰部分(fractionation)；星號(hào)標(biāo)記的TH除外，TH是通過THvs冰部分圖中的點(diǎn)，由直線外推法估計(jì)得出。η是測(cè)量的次數(shù)。尚不確定，但在進(jìn)行中(N.D)。我們發(fā)現(xiàn)，Δ5-9和Δ4-9中可檢測(cè)的活性表明含有4個(gè)和3個(gè)推定冰結(jié)合基團(tuán)的AFPl的截?cái)囿w分別保留了防止冰晶體生長的能力。缺失衍生物的特異性活性還沒有被確定，目前尚不知道它們與wt蛋白相關(guān)的活性。表4120[1978]RmAFP活性的目視檢查圖6說明“冰生長-激增”的進(jìn)展，其在熱滯后冰點(diǎn)下發(fā)生于DRmAFPl的溶液和2)粘魚Zoarcesviviparus(帶有3AFP的丹麥魚)的血清中。在兩種情況下，在溫度降低之前小冰晶可以在溶液中退火。當(dāng)降低RmAFP溶液的溫度時(shí)，在達(dá)到滯后冰點(diǎn)之前，初始的冰晶體(1A中的箭頭處)不再生長和改變形狀。在滯后冰點(diǎn)(IB)下冰晶體突然爆發(fā)，因?yàn)槿芤涸诔涞沫h(huán)境中凍結(jié)。請(qǐng)注意，在這種情況下，滯后冰點(diǎn)時(shí)的冰生長模式是菜花狀(1B、1C)。這與2)(Z.viviparus血清)中看到的情形相反，2)中冷卻時(shí)冰晶體緩慢變化形狀，并變?yōu)閹в辛切位娴碾p棱錐(2A)。在滯后冰點(diǎn)時(shí)，冰生長是針狀的(2B)，并且溶液中所有的冰生長為針狀體(2C)?？傊?，RmAFP能夠抑制所有的冰生長或者冰晶體形狀的變化(1)。這與魚的抗凍蛋白溶液顯著不同，魚的抗凍肽蛋白溶液一般遵循(2)中看到的模式。RmAFPl的物理化學(xué)性質(zhì)-質(zhì)譜(MALDI-ToF)克隆和純化的RhagiummordaxAFPl的分子測(cè)定如圖7顯示。純化重組rRmAFPl由Alphalyse(Odense，丹麥)通過MALDI-ToF分析完成純化重組rRmAFPl的質(zhì)譜分析。rRmAFPl的分子測(cè)定給出平均值為12555Da。這個(gè)差異性可能是由于校正儀器時(shí)使用外標(biāo)。體積排阻色譜本發(fā)明還研究了rRmAFPl的二聚化，結(jié)果如圖8所示。在自然條件下rRmAFP表現(xiàn)為二聚體，因?yàn)楫?dāng)其穿過體積排阻柱時(shí)(Superdex75，10/30，GEHealthcare)，它比相同Mw范圍的其他蛋白具有更短的保留時(shí)間。當(dāng)Superdex75用牛血清白蛋白(68KDa，BSA)、胰蛋白(25KDa)和人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C(13KDa)進(jìn)行校正時(shí)，從rRmAFPl的SEC估算Mw為28KDa。這些顯示在圖8A中。同樣，當(dāng)在SDSPAGE中運(yùn)行時(shí)，RmAFP也表現(xiàn)為二聚體，估計(jì)Mw為28KDa。第1泳道牛血清白蛋白(BSA)；2胰蛋白；3=RNAseA；4半胱氨酸蛋白酶抑制劑C；5溶菌酶；6=RmAFPl；7谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)。這顯示在圖8B中。圓二色光譜121[1986]在哥本哈根大學(xué)進(jìn)行圓二色光譜(⑶)。結(jié)果可見圖9。根據(jù)圖9A，遠(yuǎn)UV⑶光譜顯示重組蛋白具有確定的結(jié)構(gòu)。圖9B中顯示的近UV⑶光譜表明rRmAFP具有大量的β-片層結(jié)構(gòu)。差示掃描量熱法通過差示掃描量熱法(DSC；Seal,Moscow,Russia)研究溫度穩(wěn)定性。結(jié)果如圖10顯示。RmAFPl的轉(zhuǎn)變溫度Tm估計(jì)為47.7°C。在6-100°C溫度范圍內(nèi)進(jìn)行第一次掃描，在6-70°C溫度范圍內(nèi)進(jìn)行隨后的11次掃描。曲線的不對(duì)稱形狀表明了蛋白二聚體的分解，隨后單體的展開。由11次掃描產(chǎn)生的整體曲線相似性顯示RmAFP能夠在連續(xù)加熱/冷卻循環(huán)中多次變性和復(fù)性，而沒有任何物質(zhì)的損失。較低的線顯示了在緩沖控制器上進(jìn)行的類似熱循環(huán)的結(jié)果。隨后分析進(jìn)行了12次加熱/冷卻循環(huán)的樣品的活性，并且給出0.94°C時(shí)的熱滯后THapp，其與起始材料的活性沒有區(qū)別。這些研究表明一種溫和穩(wěn)定的蛋白，卻具有在變性后復(fù)原為生物活性分子的顯著特征。pH對(duì)活性和穩(wěn)定性的影響本發(fā)明還研究了pH對(duì)活性和穩(wěn)定性的影響。圖11顯示在標(biāo)示的pH值下預(yù)培養(yǎng)Ih時(shí)，對(duì)RmAFP的穩(wěn)定性的影響，穩(wěn)定性顯示為pH7.2時(shí)的TH。權(quán)利要求一種分離的多肽，包含一氨基酸殘基序列或者由一氨基酸殘基序列組成，所述氨基酸殘基序列選自SEQIDNO1、SEQIDNO2、SEQIDNO3、SEQIDNO4、SEQIDNO5、SEQIDNO6、SEQIDNO7和SEQIDNO8，其中所述多肽能夠減少或抑制冰晶體的形成和/或生長。2.權(quán)利要求1的多肽，其中所述序列為SEQIDNO1。3.權(quán)利要求1的多肽，其中所述序列為SEQIDNO2。4.權(quán)利要求1的多肽，其中所述序列為SEQIDNO3。5.權(quán)利要求1的多肽，其中所述序列為SEQIDNO4。6.權(quán)利要求1的多肽，其中所述序列為SEQIDNO5。7.權(quán)利要求1的多肽，其中所述序列為SEQIDNO6。8.權(quán)利要求1的多肽，其中所述序列為SEQIDNO7。9.權(quán)利要求1的多肽，其中所述序列為SEQIDNO8。10.一種分離的多核苷酸，含有編碼權(quán)利要求1至9任一項(xiàng)的多肽的核苷酸序列。11.權(quán)利要求10的多核苷酸，進(jìn)一步含有表達(dá)信號(hào)，該表達(dá)信號(hào)能夠引導(dǎo)編碼權(quán)利要求1至9任一項(xiàng)的多肽的核苷酸序列在適宜宿主細(xì)胞中的表達(dá)。12.含有權(quán)利要求10和11任一項(xiàng)的多核苷酸的載體。13.一種分離的重組細(xì)胞，含有權(quán)利要求10和11任一項(xiàng)的多核苷酸或權(quán)利要求12的載體或權(quán)利要求1至9任一項(xiàng)的多肽。14.一種食用產(chǎn)品，含有權(quán)利要求1至9任一項(xiàng)的多肽。15.如權(quán)利要求14的食用產(chǎn)品，其中所述食用產(chǎn)品是冷凍的。16.如權(quán)利要求14的食用產(chǎn)品，其中所述食用產(chǎn)品是冷凍的甜食類產(chǎn)品。17.如權(quán)利要求14的食用產(chǎn)品，其中所述食用產(chǎn)品是冰淇淋產(chǎn)品或面包。18.一種固體載體材料，含有權(quán)利要求1至9任一項(xiàng)的多肽。19.一種生產(chǎn)權(quán)利要求1至9任一項(xiàng)的多肽的方法，所述方法包括步驟i)提供權(quán)利要求10和11任一項(xiàng)的多核苷酸或權(quán)利要求12的載體；ii)通過步驟i)提供的多核苷酸的重組表達(dá)，提供適于生產(chǎn)權(quán)利要求1至9任一項(xiàng)的多肽的宿主細(xì)胞；iii)生產(chǎn)權(quán)利要求1至9任一項(xiàng)的多肽，以及可選地iv)純化和/或分離所述多肽。20.一種原位生產(chǎn)權(quán)利要求1至9任一項(xiàng)的多肽的方法，所述方法包括步驟i)提供可發(fā)酵的起始原料，)提供一種微生物，該微生物能夠發(fā)酵所述可發(fā)酵的起始原料，并且當(dāng)發(fā)酵所述可發(fā)酵的起始原料時(shí)，能夠在適宜的條件下產(chǎn)生權(quán)利要求1至9任一項(xiàng)的多肽，iii)在所述微生物存在下，發(fā)酵所述食品起始原料，由此生產(chǎn)發(fā)酵的食用產(chǎn)品，其中所述發(fā)酵的食用產(chǎn)品含有權(quán)利要求1至9任一項(xiàng)的多肽。21.一種減少或抑制冷凍食用產(chǎn)品中冰晶體形成的方法，所述方法包括步驟i)提供冷凍食用產(chǎn)品，或其生產(chǎn)所需的一種或多種成分，和)根據(jù)具體情況，在所述產(chǎn)品生產(chǎn)之前、之后或生產(chǎn)期間，使所述產(chǎn)品和/或所述成分與權(quán)利要求1至9任一項(xiàng)的多肽接觸，由此減少或抑制冷凍食用產(chǎn)品中的冰晶體形成。22.—種減少或抑制冷凍食用產(chǎn)品中冰晶體生長的方法，所述方法包括步驟i)提供冷凍食用產(chǎn)品，或其生產(chǎn)所需的一種或多種成分，和)根據(jù)具體情況，在所述產(chǎn)品生產(chǎn)之前、之后或生產(chǎn)期間，使所述產(chǎn)品和/或所述成分與權(quán)利要求1至9任一項(xiàng)的多肽接觸，由此減少或抑制冷凍食用產(chǎn)品中的冰晶體生長。23.—種在冷凍食用產(chǎn)品中構(gòu)造冰晶體的方法，所述方法包括步驟i)提供冷凍食用產(chǎn)品，或其生產(chǎn)所需的一種或多種成分，和)根據(jù)具體情況，在所述產(chǎn)品生產(chǎn)之前、之后或生產(chǎn)期間，使所述產(chǎn)品和/或所述成分與權(quán)利要求1至9任一項(xiàng)的多肽接觸，由此在冷凍食用產(chǎn)品中構(gòu)造冰晶體。24.一種調(diào)整冷凍食用產(chǎn)品的質(zhì)地或感官品質(zhì)的方法，所述方法包括步驟i)提供冷凍食用產(chǎn)品，或其生產(chǎn)所需的一種或多種成分，和)根據(jù)具體情況，在所述產(chǎn)品生產(chǎn)之前、之后或生產(chǎn)期間，使所述產(chǎn)品和/或所述成分與權(quán)利要求1至9任一項(xiàng)的多肽接觸，由此調(diào)整冷凍食用產(chǎn)品的質(zhì)地或感官品質(zhì)。25.—種監(jiān)測(cè)冷凍食用產(chǎn)品的生產(chǎn)或儲(chǔ)存期間的冰晶體形成的方法，所述方法包括步驟i)提供冷凍食用產(chǎn)品，或其生產(chǎn)所需的一種或多種成分，和)根據(jù)具體情況，在所述產(chǎn)品生產(chǎn)之前、之后或生產(chǎn)期間，使所述產(chǎn)品和/或所述成分與權(quán)利要求1至9任一項(xiàng)的多肽接觸，iii)在所述冷凍食用產(chǎn)品的生產(chǎn)或儲(chǔ)存期間，在不同時(shí)間點(diǎn)監(jiān)測(cè)冰晶體形成。26.—種在雌性個(gè)體中進(jìn)行體外受精處理的方法，所述方法包括步驟i)從雌性個(gè)體中移取一個(gè)或多個(gè)卵細(xì)胞，可選地，與含有卵泡液的生物樣本一起移?。?在權(quán)利要求1至9任一項(xiàng)的多肽存在下，冷凍所述一個(gè)或多個(gè)卵細(xì)胞，可選的是與所述生物樣本一起冷凍；iii)使所述一個(gè)或多個(gè)移取的卵細(xì)胞在體外受精；和iv)將所述一個(gè)或多個(gè)受精的卵細(xì)胞植入所述雌性個(gè)體內(nèi)。27.一種增強(qiáng)雌性個(gè)體的懷孕可能性或幾率的方法，所述方法包括步驟)從雌性個(gè)體中移取一個(gè)或多個(gè)卵細(xì)胞，可選的是與含有卵泡液的生物樣本一起移取；iii)在權(quán)利要求1至9任一項(xiàng)的多肽存在下，冷凍所述一個(gè)或多個(gè)卵細(xì)胞，可選的是與所述生物樣本一起冷凍；iv)使所述一個(gè)或多個(gè)移取的卵細(xì)胞在體外受精；和ν)將所述一個(gè)或多個(gè)受精的卵細(xì)胞植入所述雌性個(gè)體內(nèi)，其中在權(quán)利要求1至9任一項(xiàng)的多肽存在下，冷凍所述一個(gè)或多個(gè)卵細(xì)胞增加懷孕的可能性或幾率。28.如權(quán)利要求26和27任一項(xiàng)的方法，其中所述樣本進(jìn)一步包含顆粒黃體細(xì)胞或卵泡細(xì)胞，并且可選地還有從所述雌性個(gè)體的卵腺體移取的其他卵巢細(xì)胞。29.如權(quán)利要求28的方法，其中所述樣本進(jìn)一步包含來自卵細(xì)胞環(huán)境的冷凍細(xì)胞。全文摘要本發(fā)明涉及一種具有冰結(jié)合性能的新型多肽，其導(dǎo)致冰晶體形成和/或生長減小或抑制活性。本發(fā)明還涉及一種含有該新型多肽的食用產(chǎn)品和固體載體。此外，本發(fā)明還涉及生產(chǎn)該新型多肽的方法，以及該新型多肽的各種用途。文檔編號(hào)C07K14/435GK101918437SQ200880124622公開日2010年12月15日申請(qǐng)日期2008年11月21日優(yōu)先權(quán)日2007年11月21日發(fā)明者卡斯珀·威爾肯斯,安德斯·洛伯納-奧爾森,漢斯·拉姆勒烏申請(qǐng)人:羅斯基勒大學(xué)