專利名稱：產(chǎn)生無標(biāo)記物的轉(zhuǎn)基因植物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物轉(zhuǎn)化領(lǐng)域，以及產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞和植株的方法及產(chǎn)生無標(biāo)記 物的轉(zhuǎn)基因植物的方法。提供了使用根癌土壤桿菌(Agrbobacterium tumefaciens)或發(fā) 根土壤桿菌(Agrobacterium rhizogenes)菌株有效地共轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的方法。還提供了 適合于在這些方法中使用的土壤桿菌(Agrobacterium)菌株。
背景技術(shù)：
自20世紀(jì)80年代人們就開始開發(fā)遺傳修飾的或“轉(zhuǎn)基因的”植物以用于多種目 的，例如抵抗蟲害、除草劑或苛刻環(huán)境條件(所謂的“輸入性狀”，在作物生產(chǎn)中使農(nóng)民受 益)，還有提高營養(yǎng)或健康價(jià)值(例如黃金稻、低亞麻酸大豆等)(所謂的“產(chǎn)出性狀”，使消 費(fèi)者和加工工業(yè)受益)。雖然存在關(guān)于安全性的爭議，但新的轉(zhuǎn)基因植物正在被開發(fā)并且可 預(yù)計(jì)，在未來幾年具有價(jià)值增加的新性狀的轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品將會(huì)投放市場(chǎng)。篩選標(biāo)記基因的使用對(duì)于產(chǎn)生遺傳修飾植物是必不可少的以選擇導(dǎo)入了外源DNA 的植物細(xì)胞，但是在GM植物已產(chǎn)生后，所述篩選標(biāo)記基因(一般是抗生素抗性基因或除草 劑抗性基因)變得毫無用處。由于多種原因，在GM植物中繼續(xù)存在篩選標(biāo)記基因是不利 的。公眾關(guān)于遺傳修飾生物(GMO)的安全性的爭議已導(dǎo)致形成具有如下觀點(diǎn)的指導(dǎo)原則， 即認(rèn)為抗生素抗性的篩選標(biāo)記基因最好應(yīng)不存在于批準(zhǔn)的GMO中(EU directive 2001/18 EC)。對(duì)于希望以另外的目的基因(GOI)對(duì)現(xiàn)有GMO重新進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的情況，也要求不存 在篩選標(biāo)記基因(或者使用其他標(biāo)記基因，但這會(huì)導(dǎo)致基因堆積)，因此使得可以以同一個(gè) 篩選標(biāo)記物在新一輪轉(zhuǎn)化中進(jìn)行新一輪選擇。使選擇標(biāo)記物缺失的最直接方法是應(yīng)用被稱為共轉(zhuǎn)化的方法，其中將用于選擇轉(zhuǎn) 化植物細(xì)胞的篩選標(biāo)記物和目的基因(GOI)置于兩個(gè)不同的T-DNA(通常在兩個(gè)土壤桿菌 菌株中)上。將所述兩個(gè)T-DNA同時(shí)導(dǎo)入至植物細(xì)胞，但相互獨(dú)立地整合到所述植物核基 因組的不同位點(diǎn)。雜交后，兩基因隨后在下一代中分離，僅具有所述GOI的GM植物可被選 擇。然而，在該過程中，還得到了多種僅具有所述篩選標(biāo)記基因的植物，這是因?yàn)樵谥参镛D(zhuǎn) 化和再生過程中目的基因未被選擇。共轉(zhuǎn)化的難點(diǎn)是得到大百分比的包含這兩個(gè)基因的轉(zhuǎn) 化植物細(xì)胞(即同一植物細(xì)胞被這兩個(gè)基因“共轉(zhuǎn)化”)。用現(xiàn)有的共轉(zhuǎn)化方法，包含這兩 個(gè)基因的植物細(xì)胞的百分比(即共轉(zhuǎn)化效率)較低，因?yàn)樵S多細(xì)胞僅接受具有標(biāo)記基因的 T-DNA，不接受具有GOI的T-DNA。該效率為50%或更低。亦見圖4A。共轉(zhuǎn)化的更詳細(xì)信息亦參見De Block et al. (1991)Theoretical Applied Genetics 82:257-263), Depicker et al. (1985)Molecular General Genetics 201 477-484 ；Matthews et al. (2001)Mol. Breeding 7 195-202 ；Daley et al (1998) PlantCell R印· 17 :489_496 ；McKnight et al (1987)PlantMolecular Biol. 8 :439_445 ；和 De Framond et al(1986)Mol. Gen. Genet. 202 :125_131。一些提高土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化的共轉(zhuǎn)化效率的方法已有描述。例如，Japan Tobacco使用“超二元(superbinary) ”載體開發(fā)了一種特殊的方法來應(yīng)用共轉(zhuǎn)化原理，并且在煙草和稻中得到了 47%的共轉(zhuǎn)化植物(Komari et al. ,1996, Plant J. 10-165-174 ； US 5，731，179)。根特大學(xué)(University of Gent)的研究人員(De Buck et al.，1998， Mol. Plant. Microbe Interact 11 :449_457)報(bào)道了在中鼠耳芥屬(Arabidopsis)中的最 大50 %的共轉(zhuǎn)化，但還發(fā)現(xiàn)兩個(gè)T-DNA在相同座位經(jīng)常共整合。在所有這些情況下，共轉(zhuǎn)化 通過同時(shí)應(yīng)用兩種功能性土壤桿菌菌株進(jìn)行，即其中每種菌株都可以將T-DNA轉(zhuǎn)移至植物 細(xì)胞中，并且在單獨(dú)使用時(shí)有利于轉(zhuǎn)移并整合至植物核基因組。然而，總體效率仍然較低或 者不可預(yù)測(cè)，使得該方法工作量巨大且費(fèi)用很大。因此，本領(lǐng)域中通常使用其他轉(zhuǎn)化方法， 例如傳統(tǒng)方法，其中篩選標(biāo)記物和GOI物理地連接于T-DNA上并在同一段T-DNA上轉(zhuǎn)移至 植物細(xì)胞。因此，選擇具有所述標(biāo)記基因的所有轉(zhuǎn)化細(xì)胞還包含GOI，但除去所述標(biāo)記基因 更困難。隨后使用位點(diǎn)特異性重組(使用例如Cre-Iox或FLP-frt體系)通過切割從植物 基因組除去所述標(biāo)記基因(轉(zhuǎn)化后)。其他供選方案有例如使用轉(zhuǎn)座元件或者根本在無篩 選標(biāo)記的情況下轉(zhuǎn)化(EP1279737)。亦見De Vetten et al. (2003) Nature Biotechnol. 21 439-442。因此，仍存在對(duì)具有高共轉(zhuǎn)化效率(理想地，接近100% )的共轉(zhuǎn)化方法的需求。 本申請(qǐng)?zhí)峁┝诉@類超高效率的共轉(zhuǎn)化方法，同時(shí)提供了合適用于所述方法中的菌株。土壤桿菌菌株包含Ti質(zhì)粒，所述Ti質(zhì)粒包含冠癭堿(opine)合成區(qū)和冠癭堿分 解代謝區(qū)、編碼Vir蛋白的毒力區(qū)和T-DNA區(qū)。在土壤桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化中，傷口釋放化 學(xué)物質(zhì)例如酚類化合物和糖被土壤桿菌的VirA跨膜蛋白識(shí)別。然后，所述VirA蛋白磷酸 化VirG蛋白，VirG蛋白可活化所述vir區(qū)的其他毒力基因的轉(zhuǎn)錄。VirDl和VirD2蛋白切割所述邊界，并且VirD2保持共價(jià)地連接至右邊界(Right Border) (RB)。VirB和VirD4蛋白可形成纖毛(pili)，用于將T_DNA/VirD2復(fù)合體轉(zhuǎn)移至 植物細(xì)胞中。VirEl結(jié)合于VirE2蛋白并被一塊轉(zhuǎn)移(獨(dú)立于所述T復(fù)合體)至植物細(xì)胞 質(zhì)，所述VirEl蛋白在細(xì)胞質(zhì)中釋放所述VirE2蛋白。然后，所述VirE2蛋白包被單鏈(ss) T-DNA以保護(hù)T-DNA免受核酸酶作用。這樣，完整T復(fù)合體將被轉(zhuǎn)移至核，其中VirE2在核 膜中形成通道以使所述T復(fù)合體可以進(jìn)入至所述核中。在核中，VirD2參與到T-DNA整合 至植物基因組中。上述過程顯示于圖3中(Zhu et al，2000，Journal of Bacteriology 182(14) :3885-3895)。定義“轉(zhuǎn)化”和“轉(zhuǎn)化的”是指將DNA——一般是包含嵌合的目的基因(GOI)的DNA—— 轉(zhuǎn)移至植物細(xì)胞的核基因組，以形成包含轉(zhuǎn)基因的“轉(zhuǎn)基因”植物細(xì)胞和植物。由所謂的“順 式生成(cis-genesis)”——其中僅來自宿主自身的DNA序列被導(dǎo)入——形成所謂的“順 式基因(cis-genic)”植物也應(yīng)理解為是“轉(zhuǎn)化”。導(dǎo)入的DNA通常但非總是整合在宿主植 物基因組中。無DNA整合的情形出現(xiàn)在例如有使用反向重復(fù)構(gòu)建體產(chǎn)生用于基因沉默的雙 鏈RNA，或者使用編碼鋅指核酸酶或其他DNA修飾酶的DNA序列，所述DNA序列被臨時(shí)給予 植物細(xì)胞以獲得永久效應(yīng)。“轉(zhuǎn)染”和“進(jìn)行轉(zhuǎn)染”用于指T-DNA轉(zhuǎn)移至植物細(xì)胞中，即從植物細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至核 之前的步驟?！肮厕D(zhuǎn)化”在本文中指以兩種不同的T-DNA——一種包含GOI且另一種包含篩選標(biāo) 記基因——同時(shí)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明，所述兩種T-DNA分別存在于兩個(gè)不同的土壤
4桿菌菌株中?！肮厕D(zhuǎn)化效率”是指使用所述標(biāo)記基因選擇的、包含整合至核基因組中的所述兩種 T-DNA的再生轉(zhuǎn)化植株(轉(zhuǎn)化體)的百分比(數(shù)目％ )?！盁o(篩選)標(biāo)記物的植物”或“無標(biāo)記物的轉(zhuǎn)基因植物”在本文中是指包含整合 至細(xì)胞核基因組的G0I、但缺少植物篩選(或可記錄的)標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基 因植物已經(jīng)在所述轉(zhuǎn)化體后代中分離出來?！昂蟠?、“下代”或“子代”可以是通過自交或雜 交得到并保留所述嵌合基因(即G0I)的第一代或后面的代。“T-DNA”(或“轉(zhuǎn)移-DNA”)或者“人工或嵌合T-DNA”是指在任一端包含右邊界 (RB)和左邊界(LB)序列的單鏈或雙鏈DNA，或者對(duì)于用于轉(zhuǎn)移GOI的人工T-DNA，是指至少 包含RB序列的單鏈或雙鏈DNA。出現(xiàn)在土壤桿菌Ti質(zhì)粒中的“天然的”內(nèi)源性T-DNA區(qū)也 稱為T-DNA，但在右邊界和左邊界之間包含用于腫瘤誘導(dǎo)的基因。為了進(jìn)行植物轉(zhuǎn)化，使用 了“卸毒的(disarmed)”土壤桿菌菌株，其中這些腫瘤誘導(dǎo)基因(tms和tmr區(qū))被缺失、替 換或去功能。然后將待轉(zhuǎn)移至植物細(xì)胞中的T-DNA導(dǎo)入所述卸毒株，通常在質(zhì)?；蚱渌d 體上，例如在不整合到Ti質(zhì)粒中的二元載體上或在通過同源重組整合到所述(卸毒的)Ti 質(zhì)粒中的共整合載體上?；赥i質(zhì)粒的冠癭堿基因可將土壤桿菌菌株和Ti質(zhì)粒分成不同類型。Ti質(zhì)?？?包含冠癭堿合成基因(在T-DNA區(qū))和/或冠癭堿分解代謝基因(在Ti質(zhì)粒骨架)，例如 章魚堿(octopine)、胭脂堿(nopaline)或琥珀堿(succinamopine)合成和/或分解代謝基 因。因此存在不同的“冠癭堿型” Ti質(zhì)粒?！皏irE2輔助質(zhì)粒”在本發(fā)明的上下文中是指這樣的質(zhì)粒，即該質(zhì)粒可導(dǎo)入至土壤 桿菌菌株中且包含土壤桿菌Ti質(zhì)粒的至少一個(gè)virE2基因和/或至少一個(gè)完整VirE操縱 子，并且它會(huì)產(chǎn)生功能性virE2蛋白?！澳康幕颉?GOI)是指待整合到植物細(xì)胞核基因組中的嵌合基因。GOI可編碼目 的蛋白或者基因沉默構(gòu)建體?！皏irE2供體株”是指能夠產(chǎn)生功能性virE2蛋白并且其中導(dǎo)入有或可導(dǎo)入包含 GOI的T-DNA的土壤桿菌菌株。"virE2突變株”是指不能產(chǎn)生功能性virE2蛋白并且其中導(dǎo)入有或者可導(dǎo)入包含 篩選標(biāo)記基因的T-DNA的土壤桿菌菌株。該菌株在單獨(dú)使用時(shí)本身是無毒的(不能產(chǎn)生轉(zhuǎn) 化的植物細(xì)胞)，但在與(有毒力的)virE2供體株一起使用時(shí)能夠產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。 因此Ti質(zhì)粒上的內(nèi)源性virE2基因被修飾，從而不會(huì)產(chǎn)生功能性virE2蛋白?！百|(zhì)粒”和“載體”在本文中可互換使用，是指可包含某些功能元件的DNA分子， 所述功能元件例如在用于DNA操作和復(fù)制的土壤桿菌和/或其他細(xì)菌(例如大腸桿菌 (E. coli))中起作用的復(fù)制起點(diǎn)(ori)、一個(gè)或多個(gè)目的基因、用于在細(xì)菌宿主或植物宿主 等中進(jìn)行篩選的標(biāo)記基因等。用于植物轉(zhuǎn)化中的公知的質(zhì)粒有二元質(zhì)粒(它不整合到Ti 質(zhì)粒中且包含待轉(zhuǎn)移至植物中的T-DNA)、超二元載體、輔助質(zhì)粒、Ti質(zhì)粒、Ti輔助質(zhì)粒等?！癟i質(zhì)粒”是指出現(xiàn)在土壤桿菌菌種例如根癌土壤桿菌或發(fā)根土壤桿菌中的天 然Ti質(zhì)粒(在發(fā)根土壤桿菌中它們被稱為Ri質(zhì)粒，但為了簡便起見，在本文中使用Ti質(zhì) 粒指這兩種質(zhì)粒類型)，或者源自這些質(zhì)粒且通常用于植物轉(zhuǎn)化中的Ti質(zhì)粒，例如“卸毒 的”Ti質(zhì)粒，它們是非致瘤的(缺乏T-DNA的功能性腫瘤誘導(dǎo)基因)，但包含Ti質(zhì)粒的vir區(qū)。綜述參見 Hooykaas and Beijersbergen (Ann Rev Phytopathol 1994，32 157-179 或 W000/18939)。因此，天然Ti質(zhì)粒是出現(xiàn)在土壤桿菌菌株中的環(huán)狀大DNA分子，包含毒力 (vir)區(qū)和T-DNA區(qū)(所述T-DNA區(qū)的側(cè)翼為RB和LB序列，并包含腫瘤誘導(dǎo)區(qū)(含有導(dǎo)致 生長素和細(xì)胞分裂素產(chǎn)生以及腫瘤發(fā)生的基因)以及鄰接所述腫瘤誘導(dǎo)區(qū)的冠癭堿合成 區(qū))，并且還含有冠癭堿分解代謝區(qū)、復(fù)制起點(diǎn)和接合轉(zhuǎn)移區(qū)。內(nèi)源性Ti質(zhì)?！氨怀C正(cured)的”土壤桿菌菌株是其中自有的Ti質(zhì)粒已被除 去，并可將不同的Ti質(zhì)粒導(dǎo)入其中的菌株?！癓B”或“左邊界”以及“RB”或“右邊界”序列或者“T-DNA邊界”序列為約25bp的 短核苷酸序列，該序列在Ti質(zhì)粒的T-DNA區(qū)側(cè)翼，并確定出從土壤桿菌轉(zhuǎn)移至植物細(xì)胞中 的DNA的端點(diǎn)。邊界序列記載于Gielen et al. (1984,EMBO J 3,835-845) 可以將RB禾口 LB序列加入至包含標(biāo)記基因或GOI的人工T-DNA中，例如質(zhì)粒可以包含可操作地連接的如 下DNA序列RB-基因(例如標(biāo)記基因或GOI)-LB (任選)，這些序列可插入至質(zhì)粒中，進(jìn)而 插入至土壤桿菌菌株中，用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或植株。術(shù)語“核酸序列”(或核酸分子)是指單鏈或雙鏈形式的DNA或RNA分子。“分離的核酸序列”是指脫離了分離出它的天然環(huán)境的核酸序列，例如在細(xì)菌宿主 細(xì)胞中或者在植物核基因組中的核酸序列。術(shù)語“蛋白”或“多肽”可互換使用，指由氨基酸鏈組成的分子，不涉及具體的作用 模式、大小、三維結(jié)構(gòu)或來源。蛋白的“片段”或“部分”因此仍然可以稱為“蛋白”?！胺蛛x的 蛋白”用來指脫離了其天然環(huán)境的例如在體外或者在重組細(xì)菌或植物宿主細(xì)胞中的蛋白。術(shù)語“基因”意為包含這樣一個(gè)區(qū)域(轉(zhuǎn)錄區(qū)域)的DNA序列，該區(qū)域在細(xì)胞中被 轉(zhuǎn)錄成RNA分子(例如mRNA)，可操作地連接至合適的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域(例如啟動(dòng)子)。基因 因此可以包含幾個(gè)可操作地連接的序列例如啟動(dòng)子、包含例如參與翻譯起始的序列的5’非 翻譯前導(dǎo)序列(也被稱為5’ UTR,它對(duì)應(yīng)于翻譯起始密碼子上游的轉(zhuǎn)錄mRNA序列)、(蛋 白)編碼區(qū)(cDNA或基因組DNA)和包含例如轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)和多腺苷酸化位點(diǎn)(如AAUAAA 或其變體)的3’非翻譯序列(也被稱為3’非翻譯區(qū)或3’ UTR)?！扒逗匣颉?或重組基因)是指正常情況下并非天然存在于一個(gè)物種中的任何基 因，特別是核酸序列中存在在天然環(huán)境中彼此沒有關(guān)聯(lián)的一個(gè)或多個(gè)部分的基因。例如，啟 動(dòng)子在天然環(huán)境中與部分或全部的轉(zhuǎn)錄區(qū)域或者與另一調(diào)節(jié)區(qū)域沒有關(guān)聯(lián)。術(shù)語“嵌合基 因”可以理解為包括表達(dá)構(gòu)建體，其中的啟動(dòng)子或轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列可操作地連接至一條或多 條正義序列(例如編碼序列)或者連接至反義序列(正義鏈的反向互補(bǔ)序列)或反向重復(fù) 序列(正義序列和反義序列，由此所述RNA轉(zhuǎn)錄物在轉(zhuǎn)錄時(shí)形成雙鏈RNA)?！绊樖缴伞焙汀绊樖交颉笔侵府a(chǎn)生具有由轉(zhuǎn)化的植物物種的遺傳元件或密切相 關(guān)的(性別一致)物種的遺傳元件組成的基因的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞。順式基因包括其 內(nèi)含子，并且側(cè)翼是它的正常有義方向的天然啟動(dòng)子和終止子。順式基因植物可攜帶一個(gè) 或多個(gè)順式基因，但它們不包含任何嵌合基因。在本說明書通篇中清楚的是，不使用嵌合基 因而使用順式基因，或者除使用嵌合基因之外還可以使用順式基因，該實(shí)施方案囊括在本 文全文中?！胺词降亍笔侵复嬖谟诓煌腄NA分子上，而“順式地”是指存在于同一 DNA分子 上。例如，土壤桿菌vir基因相對(duì)于待轉(zhuǎn)移的T-DNA可以反式地存在于土壤桿菌菌株中，而T-DNA邊界序列相對(duì)于以它們?yōu)閭?cè)翼的目的基因是順式的?！?’ UTR"即“3’非翻譯序列”(也經(jīng)常被稱為3，非翻譯區(qū)或3，端)是指在基因 的編碼序列的下游存在的核酸序列，它包含例如轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)和(在大部分但非全部的真 核mRNA中的)多腺苷酸化信號(hào)(例如AAUAAA或其變體)。在轉(zhuǎn)錄終止后，可以切除所述 mRNA轉(zhuǎn)錄物下游的多腺苷酸化信號(hào)并且加上多腺苷酸尾，該尾參與到將mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞 質(zhì)(進(jìn)行翻譯的位置)?！盎虻谋磉_(dá)”是指如下的過程，即可操作地連接有合適的調(diào)節(jié)區(qū)域(特別是啟動(dòng) 子)的DNA區(qū)域被轉(zhuǎn)錄成有生物活性的RNA，即所述RNA能夠被翻譯成具有生物活性的蛋 白或肽(或活性肽片段)或者它自身具有活性(例如在轉(zhuǎn)錄后的基因沉默中或RNAi中具 有活性)?；钚缘鞍自谀承?shí)施方案中是指由于存在阻遏域而具有負(fù)顯性功能的蛋白。編 碼序列優(yōu)選為正義方向并編碼所需的、有生物活性的蛋白或肽或者活性肽片段(即由GOI 編碼的蛋白或肽)。在基因沉默方法中，DNA序列優(yōu)選以反義DNA或反向重復(fù)DNA的形式存 在，包含反義方向或正義和反義方向的靶基因的短序列(正義和反義RNA可相互雜交形成 dsRNA或莖環(huán)結(jié)構(gòu))?！爱愇槐磉_(dá)”是指基因在正常情況下不表達(dá)該基因的組織中表達(dá)。“轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列”在本文中被定義為能夠調(diào)節(jié)可操作地連接于所述轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列 的核酸序列的轉(zhuǎn)錄速度的核酸序列。本文定義的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列因此將包含啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄(啟動(dòng) 子元件)、維持和調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄(包括例如弱化子或增強(qiáng)子，也包括沉默子)必需的所有序列元 件。雖然提及的大部分是編碼序列上游(5’ )的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列，但是在編碼序列下游(3’ ) 存在的調(diào)節(jié)序列也囊括在該定義中。本文使用的術(shù)語“啟動(dòng)子”是指起到控制一個(gè)或多個(gè)基因轉(zhuǎn)錄的作用的核酸片段， 它位于基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)被標(biāo)示為序列的+1位置，相對(duì)于該位置的任何上游核 苷酸使用負(fù)數(shù)標(biāo)示)的轉(zhuǎn)錄方向的上游(5’)，并且在結(jié)構(gòu)上鑒定為存在DNA依賴的RNA聚 合酶結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和任何其他DNA結(jié)構(gòu)域(順式作用序列)，包括但不限于轉(zhuǎn)錄 因子結(jié)合位點(diǎn)、阻遏蛋白和激活蛋白結(jié)合位點(diǎn)以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知起到直接或間接調(diào) 節(jié)該啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄量的任何其他核苷酸序列。位于轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)(+1)上游的真核順式作用序 列的實(shí)例包括TATA盒(通常在轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)的大約-20至-30的位置)、CAAT盒(通常在相對(duì) 于轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)的大約-75的位置)、5’增強(qiáng)子或沉默子元件等?！敖M成型”啟動(dòng)子是大多數(shù)生 理和發(fā)育條件下在大多數(shù)組織(或器官)中都有活性的啟動(dòng)子。更優(yōu)選地，組成型啟動(dòng)子 在所有主要器官(例如至少葉、莖、根、種子、果實(shí)和花)的基本上所有的生理和發(fā)育條件下 都是有活性的。最優(yōu)選地，所述啟動(dòng)子在所有器官的大多數(shù)(優(yōu)選所有)生理和發(fā)育條件 下都是有活性的?！罢T導(dǎo)型”啟動(dòng)子是受生理調(diào)控的啟動(dòng)子(例如通過外部給予某些化合物)或受發(fā) 育調(diào)控的啟動(dòng)子?！敖M織特異的”啟動(dòng)子僅在特定類型的組織或細(xì)胞中有活性。本文使用的術(shù)語“可操作地連接”是指多核苷酸元件之間功能關(guān)系的連接。當(dāng)一核 酸與另一核酸序列有功能關(guān)系時(shí)，該核酸是“可操作地連接的”。例如，若啟動(dòng)子或轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié) 序列影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則它們可操作地連接至該編碼序列?？刹僮鞯剡B接意思是被連 接的DNA序列通常是鄰接的，并且在需要把兩個(gè)蛋白編碼區(qū)域連接在一起時(shí)，是鄰接的且 在閱讀框內(nèi)，從而產(chǎn)生“嵌合蛋白”?！扒逗系鞍住被颉半s合蛋白”是由多個(gè)蛋白“結(jié)構(gòu)域”(或 基序)構(gòu)成的蛋白，這類蛋白自身在自然界中并不存在，而是被連接形成的功能蛋白，它展
7現(xiàn)出被連接的結(jié)構(gòu)域(例如DNA結(jié)合域或引起負(fù)顯性功能的功能阻遏域)的功能性。嵌合 蛋白還可以是天然存在的兩種或多種蛋白的融合蛋白。本文使用的術(shù)語“結(jié)構(gòu)域”意思是 具有特定結(jié)構(gòu)或功能的蛋白的任何部分或結(jié)構(gòu)域，該蛋白的所述部分或結(jié)構(gòu)域可以被轉(zhuǎn)移 至另一種蛋白，用于提供至少具有所述結(jié)構(gòu)域的功能特征的新的雜合蛋白。術(shù)語“靶向肽”指把蛋白靶向至胞內(nèi)細(xì)胞器例如質(zhì)體(優(yōu)選葉綠體、線粒體)或者 靶向至細(xì)胞外間隙(分泌信號(hào)肽)的氨基酸序列。編碼靶向肽的核酸序列可以與編碼蛋白 氨基末端(N-末端)的核酸序列(在閱讀框內(nèi))融合。“核酸構(gòu)建體”、“載體”或“質(zhì)粒”在本文可理解為使用重組DNA技術(shù)產(chǎn)生并用于把 外源DNA送遞至宿主細(xì)胞的人造(通常為環(huán)狀)核酸分子。載體骨架可以是例如二元或超 二元載體(例如參見US 5，591，616、US2002138879和WO 95/06722)、共整合載體(它整合 至Ti質(zhì)粒中)或T-DNA載體(這是本領(lǐng)域已知的并且如本文其他部分所述)，其中整合有 嵌合基因，或者，若已存在合適的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列/啟動(dòng)子，則僅所需的核酸序列(如編碼序 列、反義序列或反向重復(fù)序列)被整合于該轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列/啟動(dòng)子的下游。載體通常包含有 利于將其用于分子克隆的另外的遺傳元件，例如篩選標(biāo)記物、多克隆位點(diǎn)等等(見下文)?！八拗骷?xì)胞”、“重組宿主細(xì)胞”或“轉(zhuǎn)化的細(xì)胞”是指將至少一種核酸分子引入細(xì) 胞后產(chǎn)生的新個(gè)體細(xì)胞(或生物體)的術(shù)語，所述至少一種核酸分子尤其包含編碼所需蛋 白的嵌合基因或者包含編碼在轉(zhuǎn)錄時(shí)產(chǎn)生沉默靶基因/基因家族的反義RNA或反向重復(fù) RNA (或發(fā)夾RNA)的核酸序列。所述宿主細(xì)胞優(yōu)選是植物細(xì)胞，但也可以是細(xì)菌細(xì)胞(例如 土壤桿菌菌株)、真菌細(xì)胞(包括酵母細(xì)胞)等等。所述宿主細(xì)胞可以包含作為染色體外 (附加型)復(fù)制分子的核酸構(gòu)建體，或者包含整合進(jìn)入宿主細(xì)胞核的嵌合基因。術(shù)語“篩選標(biāo)記物”或“可記錄標(biāo)記物”是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟悉的術(shù)語，并且 在本文用來描述當(dāng)其被表達(dá)的時(shí)候可以用于選出包含所述篩選標(biāo)記物的細(xì)胞的任何遺傳 實(shí)體，例如，“植物篩選標(biāo)記基因”可用于選出包含該基因的植物細(xì)胞。篩選標(biāo)記基因產(chǎn)物 賦予例如抗生素抗性或者更優(yōu)選除草劑抗性或其他可選擇的性狀，例如表型特征(例如色 素沉著的變化)或營養(yǎng)需求。術(shù)語“報(bào)告物”主要用于指可見的標(biāo)記物，例如綠色熒光蛋白 (GFP)、eGFP、螢光素酶、GUS等等。術(shù)語“同源的”和“異源的”是指核酸或氨基酸序列與其宿主細(xì)胞或生物體之間的 關(guān)系，特別是在轉(zhuǎn)基因生物體的情況下。因此，同源序列在宿主物種中天然存在(例如用番 茄基因轉(zhuǎn)化的番茄植株)，而異源序列不會(huì)在宿主細(xì)胞中天然存在(例如用馬鈴薯植物的 序列轉(zhuǎn)化的番茄植株)。在本文及權(quán)利要求書中，動(dòng)詞“包含”及其變化形式使用其非限制含義，意為包括 該詞之后接著的項(xiàng)目，但是并不排除沒有明確指出的項(xiàng)目。另外，用不定冠詞“a ( —)”或 "an ( 一種)”提及要素時(shí)并不排除存在超過一種/個(gè)所述要素的可能性，除非文中清楚地要 求有且僅有一種/個(gè)該要素。不定冠詞“a( — ) ”或“an (—種)，，因此通常指“至少一種/ 個(gè)”。還需要理解，如果在本文中提及“序列”，其通常是指具有亞單位(例如核酸或氨基酸) 的某個(gè)序列的現(xiàn)存的實(shí)體分子。每當(dāng)提及制備本發(fā)明的一種“植物”或“多種植物”(或數(shù)種植物)的時(shí)候，需要 理解的是，除非另外指出，否者在本文中還包括植物部分(細(xì)胞、組織或器官、種子、切除或 收獲的部分、葉、幼苗、花、花粉、果實(shí)、莖、根、愈傷組織、原生質(zhì)體等等)、保留親本區(qū)別特征(例如存在轉(zhuǎn)基因)的植物的子代或克隆繁殖物，例如通過自交或雜交獲得的種子(例如雜 種種子(通過兩個(gè)近交的親本系雜交獲得))、雜交植株及來源于它們的植物部分。術(shù)語“大體同一 ”、“大體同一性”、“基本相似”、“基本相似性，，或“變體，，是指兩條 肽序列或兩條核苷酸序列在例如通過使用默認(rèn)參數(shù)的程序GAP或BESTFIT進(jìn)行最佳比對(duì) 時(shí)，共享至少某百分?jǐn)?shù)的序列同一性。GAP使用Needleman和Wunsch全局比對(duì)算法在其整 個(gè)長度上比對(duì)兩條序列，它使匹配的數(shù)目最大化并使空位的數(shù)目最小化。通常使用GAP的 默認(rèn)參數(shù)，其空位產(chǎn)生罰分=50 (核苷酸)/8 (蛋白)，空位擴(kuò)展罰分=3 (核苷酸)/2 (蛋 白)。對(duì)核苷酸而言，使用的默認(rèn)打分矩陣是nwsgapdna，而對(duì)蛋白而言，默認(rèn)打分矩陣是 Blosum62 (Henikoff & Henikoff，1992，PNAS 89，915-919)。很清楚的是，當(dāng)稱 RNA 序列與 DNA序列基本相似或者具有某一程度的序列同一性時(shí)，所述DNA序列中的胸腺嘧啶(T)被認(rèn) 為等同于所述RNA序列中的尿嘧啶(U)。序列比對(duì)和序列同一性百分?jǐn)?shù)得分的確定可通過 以下方法實(shí)現(xiàn)使用計(jì)算機(jī)程序例如軟件包GCG Wisconsin (10. 3版，可從Accelrys Inc.， 9685 Scranton Road, San Diego, CA 92121-3752USA 獲得)，或者使用 EmbossWIN(2. 10.0 版)中的程序“needle”，使用與上文所述相同的GAP參數(shù)，或者使用空位開放罰分10. O和 空位擴(kuò)展罰分0. 5，使用DNAFULL作為矩陣。為了比較長度不近似序列之間的序列同一性， 優(yōu)選使用局部比對(duì)算法，例如，在例如EmbossWIN的程序“water”中使用的Smith Waterman 算法(Smith TF, Waterman MS (1981) J. Mol. Biol 147(1) ； 195-7)。默認(rèn)參數(shù)是空位開放罰 分10. O和空位擴(kuò)展罰分0. 5，對(duì)于蛋白使用矩陣BloSSum62，對(duì)于核酸使用矩陣DNAFULL。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供了一種超高效的共轉(zhuǎn)化方法，其具有超過50%的共轉(zhuǎn)化效率，特別是 等于或大于60%、70%、80%或90%的共轉(zhuǎn)化效率，尤其是有約100%的共轉(zhuǎn)化效率。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，兩株土壤桿菌——一株包含功能性virE2蛋白基因(virE2供體 株)，而一株不能產(chǎn)生功能性virE2蛋白(virE2突變株)——可用于實(shí)現(xiàn)很高的共轉(zhuǎn)化效 率。所述virE2突變株單獨(dú)使用能夠?qū)⑺约旱暮Y選標(biāo)記基因的T-DNA鏈運(yùn)輸至植物細(xì) 胞中(即轉(zhuǎn)染該細(xì)胞)，但它不能進(jìn)一步處理所述T-DNA，因此不能將所述T-DNA整合至所 述植物細(xì)胞的核基因組中，即不能制備含所述篩選標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞和植株。如果使用virE2供體株與所述virE2突變株一起共接種，那么所述供體株的virE2 蛋白和T-DNA(包含G0I)就被轉(zhuǎn)移至所述植物細(xì)胞中。由所述供體株產(chǎn)生的virE2蛋白進(jìn) 入所述植物細(xì)胞，并關(guān)聯(lián)于包含所述GOI的T-DNA和包含所述篩選標(biāo)記基因的T-DNA (從所 述virE2突變株導(dǎo)入)，從而能夠使此兩種T-DNA整合至同一植物細(xì)胞的核基因組中。因 此，僅那些由所述virE2供體株和所述virE2突變株二者共接種的植物細(xì)胞能夠?qū)⒋藘煞N T-DNA整合至所述核基因組中。對(duì)基于所表達(dá)的篩選標(biāo)記基因賦予的表型的選擇使得可選 擇出至少約60%或更高(最高至100%)的包含被同時(shí)整合至轉(zhuǎn)化體核基因組中的標(biāo)記基 因和GOI的轉(zhuǎn)化體。因?yàn)椴煌腡-DNA整合至基因組中的隨機(jī)位置，所以它們是遺傳獨(dú)立 的，并且隨后在所述轉(zhuǎn)化體的后代中會(huì)出現(xiàn)所述GOI和所述標(biāo)記基因的分離，從而使得標(biāo) 記基因與所述GOI能夠被篩選開(產(chǎn)生僅包含目的基因、不包含所述篩選標(biāo)記基因的無標(biāo) 記物植株)。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中提供了一種制備包含目的基因的(無標(biāo)記物)轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包括如下步驟a)提供2株土壤桿菌——包含編碼功能性virE2蛋白的基因的virE2供體株，以 及不能產(chǎn)生功能性virE2蛋白的virE2突變株，b)將包含目的基因的T-DNA導(dǎo)入所述virE2供體株，c)將包含篩選標(biāo)記基因的T-DNA導(dǎo)入所述virE2突變株，d)將植物細(xì)胞與兩菌株接觸(例如共接種或共感染)，以及e)利用由所述篩選標(biāo)記基因產(chǎn)物賦予的表型選擇植物細(xì)胞和/或再生的植株(或 小植株)，以及任選f)使所選的植株(或者來自所選的植物細(xì)胞的植株或小植株)雜交和/或自交以 產(chǎn)生后代，以及任選g)丟棄那些包含所述篩選標(biāo)記基因的后代并保留那些包含目的基因但缺少所述 篩選標(biāo)記基因的后代(即使所述標(biāo)記基因與目的基因分離開，以產(chǎn)生包含目的基因的無 標(biāo)記物的植株)。使用本領(lǐng)域中已知的方法，并與本發(fā)明的2株土壤桿菌相結(jié)合，任何可以以土壤 桿菌菌株轉(zhuǎn)化的植物宿主——即單子葉植物物種或雙子葉植物物種——均可依照本發(fā)明 進(jìn)行轉(zhuǎn)化。例如，參見 Fraley et al. (1983, Proc Natl Acad Sci USA 80 4803 ；Comai et al. (1994，Nature317 :741)，Shah et al. (1986，Science 233:478)以及有關(guān)土壤桿菌介導(dǎo) 的基因轉(zhuǎn)移的其他文獻(xiàn)。使用土壤桿菌來轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，然后從所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生 轉(zhuǎn)化植株，這可使用例如記載于EP O 116 718、EP O 270 822、PCT公開文本W(wǎng)O 84/02913 和公布的歐洲專利申請(qǐng)EP 0 242 246以及記載于Gould et al. (1991,Plant Physiol. 95， 426-434)中的步驟。用于土壤桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化的T-DNA載體的構(gòu)建是本領(lǐng)域中公知 的。所述T-DNA載體可以是如EP O 120 561和EP O 120 515中所述的二元載體，也可以 是如EP 0 116 718中所述的可通過同源重組整合至土壤桿菌Ti質(zhì)粒中的共整合載體。所述方法的步驟(a)涉及提供2株土壤桿菌——包含編碼功能性virE2蛋白的基 因的virE2供體株(virE2+株)，以及不能產(chǎn)生功能性virE2蛋白的virE2突變株(virE2° 株)。當(dāng)以此兩菌株共感染植物細(xì)胞時(shí)，所述virE2+株能夠補(bǔ)充所述virE2°株，并且所述 一個(gè)菌株提供的virE2蛋白會(huì)導(dǎo)致兩T-DNA(所述第一菌株和所述第二菌株轉(zhuǎn)染的T-DNA) 整合至所述轉(zhuǎn)染植物細(xì)胞的核基因組中。所述virE2蛋白可以不依賴于T-DNA鏈進(jìn)入植 物細(xì)胞這一事實(shí)本領(lǐng)域中已通過互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了證明，其中以2株土壤桿菌一一一株缺乏 T-DNA但包含功能性virE2，另一株缺乏virE2但包含T-DNA——共感染得到了包含整合于 基因組中的 T-DNA 的植物細(xì)胞(Otten et al. 1984 Mol Gen Genet 175,159-163 ；Dombek and Ream J of Bacteriol 1997，Vol. 79，1165-1173)。然而，迄今為止還不知道該發(fā)現(xiàn)結(jié) 果能夠被開發(fā)用于顯著地提高植物細(xì)胞的共轉(zhuǎn)化效率，并且尚無人將包含植物篩選標(biāo)記基 因的T-DNA導(dǎo)入virE2°株且將包含GOI的T-DNA導(dǎo)入virE2+株，并且將這兩菌株一起用于 植物細(xì)胞的共感染以產(chǎn)生無標(biāo)記物的植株。在Dombek and Ream(1997，見上文)中，提供所 述功能性virE2蛋白的菌株不含T-DNA并且也不包含目的基因，因?yàn)樵撐墨I(xiàn)中的想法是在 另一無效株中測(cè)試所述virE2蛋白是否在功能上補(bǔ)充所述virE2突變，以研究virE2的天 然功能。同時(shí)，所使用的突變株/無效株是致瘤的和非卸毒的，這會(huì)導(dǎo)致在功能性互補(bǔ)的情 況下的腫瘤發(fā)生。在本發(fā)明中優(yōu)選使用卸毒Ti質(zhì)粒，并因此使用卸毒土壤桿菌菌株。
此外，本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，在所述供體株中使用至少一個(gè)另外的virE2基因似 乎可提供這樣的virE2蛋白量，即該量足以用于使此兩種不同的T-DNA關(guān)聯(lián)起來，并足以 用于將它們轉(zhuǎn)移至同一植物細(xì)胞的核基因組中。因此，在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述 virE2供體株包含至少兩個(gè)virE2基因，每個(gè)基因均編碼功能性virE2蛋白。所述virE2基 因可整合至所述菌株內(nèi)基因組DNA、Ti質(zhì)粒和/或另外的質(zhì)粒中，并且無需(雖然它們可 以)存在于同一遺傳元件上。任選地，所述virE2供體株還可包含另外的virG基因，該基因編碼功能性virG 蛋白。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述菌株包含至少2個(gè)virE2基因和至少2個(gè)virG基 因，它們都編碼功能性蛋白。所述基因可以通過如下啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄天然啟動(dòng)子(即天然 virE2和virG啟動(dòng)子)或在土壤桿菌中有功能的不同啟動(dòng)子，例如誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、組成型 啟動(dòng)子、來自其他土壤桿菌菌株的virE2或virG的啟動(dòng)子，等等。來自多種菌株的根癌 土壤桿菌VirG核酸和蛋白序列在本領(lǐng)域中是可獲得的，參見例如Schrammeijer (Journal of Experimental Botany, Vol.51, No. 347, pp. 1167-1169，June 2000)或者 GenBank 登記號(hào) X62885(SEQ ID NO :4)、NP 059810、AAA91602 等。VirG 蛋白因此在與例如 SEQ ID NO :4(X62885)的蛋白或 EHA105 (pTiBo542)的 VirG (Chen，C. Y. et al. Mol. Gen. Genet. 230 (1-2)，302-309 (1991))比對(duì)時(shí)有例如至少 80 %、90 %、95 %、98 %、99 % 或更高 的氨基酸同一性。virE2 供體株合適的virE2供體株包括能夠天然感染植物細(xì)胞的任何土壤桿菌菌株，例如根癌 土壤桿菌菌株和發(fā)根土壤桿菌菌株。該菌株優(yōu)選包含攜帶天然(野生型)VirE操縱子，并 因此包含天然virE2基因的Ti質(zhì)粒(優(yōu)選卸毒的)。通常用于植物轉(zhuǎn)化方法中的任何土壤 桿菌菌株均是合適的，條件是所述菌株是有毒力的。所述菌株優(yōu)選是卸毒的，即出現(xiàn)于根癌 土壤桿菌的天然T-DNA區(qū)上的tmr和tms基因被除去或者去功能，使得在T-DNA轉(zhuǎn)移后不 形成植物腫瘤。可以將天然Ti質(zhì)粒的整個(gè)天然T-DNA區(qū)除去，以將所述菌株卸毒。所述Ti 質(zhì)粒和/或土壤桿菌菌株可以為任何冠癭堿類型，但在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中使用了琥珀 堿Ti質(zhì)粒，它包含用于琥珀堿分解代謝的基因。琥珀堿Ti質(zhì)粒在本領(lǐng)域中是可獲得的(例 如菌株EHA105)。應(yīng)理解，(卸毒的)Ti質(zhì)?？梢栽谕寥罈U菌之內(nèi)及之外操作，并且可導(dǎo)入 或轉(zhuǎn)移至任何土壤桿菌菌株中，例如矯正了其天然Ti質(zhì)粒的菌株。同樣，可將其他質(zhì)粒導(dǎo) 入土壤桿菌菌株，提供另外的功能，例如待導(dǎo)入所述植物細(xì)胞中的T-DNA、額外的virE2和/ 或virG基因等。另外，可將遺傳元件可導(dǎo)入至所述菌株的基因組DNA。因此，根據(jù)本發(fā)明， 可將本文中提到的遺傳元件導(dǎo)入至土壤桿菌菌株的一個(gè)或多個(gè)不同部分，例如一種或多種 Ti質(zhì)粒，一種或多種另外的質(zhì)粒，基因組DNA等?？v使這一點(diǎn)在本說明書中未被明確提及， 也應(yīng)理解它涵蓋在本文中。替代存在于所述(優(yōu)選卸毒的)Ti質(zhì)粒上的virE2基因的是，可將一個(gè)或多個(gè)另 外的virE2基因相對(duì)于如下所述的其他vir基因順式地或反式地提供，或者，除了存在于所 述(優(yōu)選卸毒的)Ti質(zhì)粒上的virE2基因之外，還可將一個(gè)或多個(gè)另外的virE2基因相對(duì) 于如下的其他vir基因順式地或反式地提供，所述其他vir基因天然出現(xiàn)于土壤桿菌菌株 的Ti質(zhì)粒上且是毒力所需的。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述土壤桿菌菌株在Ti質(zhì)粒、基 因組DNA和/或另外的質(zhì)粒上包含一個(gè)或多個(gè)virE2基因。
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例如，將包含編碼功能性virE2蛋白的virE2基因的一種或多種質(zhì)粒(例如所述 Ti質(zhì)粒和/或其他質(zhì)粒)導(dǎo)入所述菌株，所述virE2基因可操作地連接于在所述菌株中具 有活性或可誘導(dǎo)的合適轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)。所述質(zhì)粒還可包含出現(xiàn)在土壤桿菌Ti質(zhì)粒中的完整 virE操縱子。優(yōu)選至少2個(gè)編碼功能性virE2蛋白的基因存在于所述菌株中，但也可以存 在更多個(gè)，例如3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)或更多。包含Ti質(zhì)粒和至少一個(gè)編碼功能性virE2蛋白的 virE2基因的卸毒土壤桿菌菌株在領(lǐng)域中可廣泛獲得?？梢允褂靡阎椒▽?dǎo)入另外的virE2基因，例如通過將virE2基因的編碼序列可 操作地連接于土壤桿菌中的活性啟動(dòng)子(例如天然virE2啟動(dòng)子)，并將所述基因插入合適 的質(zhì)粒和/或插入所述菌株的Ti質(zhì)粒和/或插入基因組DNA中。另外的virE2基因例如可 插入至所述Ti質(zhì)粒的vir區(qū)中，或者插入至所述Ti質(zhì)粒的另一位置。在一個(gè)實(shí)施方案中， 至少2個(gè)virE2基因反式地存在于同一個(gè)遺傳元件例如所述Ti質(zhì)粒或另一質(zhì)粒上。在另 一個(gè)實(shí)施方案中，至少2個(gè)virE2基因以順式地存在于不同遺傳元件上。例如，一個(gè)virE2 基因在Ti質(zhì)粒上，而一個(gè)virE2基因在輔助質(zhì)粒上。所述virE2基因編碼功能性VirE2蛋 白。此外，所述virE2供體株還包含至少一個(gè)，任選至少2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)或更多個(gè)編碼 功能性virEl蛋白的virEl基因，virEl蛋白負(fù)責(zé)將所述virE2蛋白運(yùn)輸至植物細(xì)胞。所述 virEl基因可存在于土壤桿菌基因組、Ti質(zhì)粒(即，所述Ti質(zhì)?？砂烊籿irEl基因和啟 動(dòng)子，并且/或者可插入一個(gè)或多個(gè)其他virEl基因和啟動(dòng)子)和/或另一質(zhì)粒上。因此， 在一個(gè)實(shí)施方案中，用于導(dǎo)入所述virE2基因的所述Ti質(zhì)?；蚱渌|(zhì)粒還可包含至少一個(gè) virEl基因，所述virEl基因優(yōu)選可操作地連接于土壤桿菌中有活性的啟動(dòng)子，例如virE操 縱子啟動(dòng)子。編碼土壤桿菌virE蛋白的基因在本領(lǐng)域中是可獲得的，參見例如GenBank登 記號(hào) AAZ50537 (SEQ ID NO :5 ;pTiBol52 的 virEl)?！癡irEl ” 包括變體，例如與 SEQ IDNO 5有至少80%、90%、95%、98%、99%或更高氨基酸序列同一性的virE2蛋白。優(yōu)選所述菌株在與virE2突變株共接種時(shí)能夠產(chǎn)生足夠的virE2蛋白，以關(guān)聯(lián)于 所述virE2突變株提供的單鏈T-DNA(包含標(biāo)記基因的T-DNA)和所述virE2供體株提供的 單鏈T-DNA(包含GOI的T-DNA)。是否產(chǎn)生了“足夠的”virE2蛋白可由本領(lǐng)域技術(shù)人員使 用常規(guī)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行確定，例如如果共轉(zhuǎn)化效率低于50%，那么產(chǎn)生的virE2蛋白可能不足，需 要通過例如加入一個(gè)或多個(gè)另外的virE2基因(例如在輔助質(zhì)粒上)增加該水平。所述virE2基因已被克隆并且可根據(jù)需要導(dǎo)入至任何質(zhì)粒和/或土壤桿菌菌 株中。SEQ ID NO =KcDNA)和 SEQ ID NO :2(SEQ ID NO :1 編碼的蛋白)提供了 Ti 質(zhì) 粒PTiBo542的virE2基因/蛋白。VirE2基因和蛋白也可在公共數(shù)據(jù)庫中獲得，參見 AAZ50538 (來自 pTiBo542 的 virE2)、NP 059819 等。SEQ ID NO 3提供了在其開放閱讀框中有插入物的virE2基因。所述插入通過如 下方式產(chǎn)生將包含部分的所述virE2開放閱讀框(ORF)的質(zhì)粒整合(同源重組)至天然 virE20RF中。所述插入物可出現(xiàn)在所述virE20RF的任意位置，在本申請(qǐng)中出現(xiàn)在SEQ ID NO 1的第203號(hào)核苷酸之后。因此，在本申請(qǐng)中作為CBS121809保藏的所述virE2突變株 包含具有SEQ ID NO :3的Ti質(zhì)粒(包含SEQ ID NO 1的中斷形式)，導(dǎo)致在體內(nèi)無virE2 蛋白產(chǎn)生(見下文)。明顯地，使用本領(lǐng)域中已知的方法可以制備或鑒定(例如通過計(jì)算機(jī))或者從土壤桿菌菌株分離編碼功能性virE2蛋白的其他virE2序列。本發(fā)明的virE2基因涵蓋編碼 基本相似的氨基酸序列的基因(也稱為“變體”)，例如編碼與SEQ ID NO 2有至少70%， 優(yōu)選至少80 %、85 %、90 %、95 %、98 %、99 %或更高氨基酸序列同一性(在全長上使用兩兩 比對(duì)，例如使用EmbossWin的程序“needle”，空位產(chǎn)生罰分10. 0且空位擴(kuò)展罰分0. 5，使用 BloSum62作為矩陣)的核苷酸序列。因此，編碼功能性virE2蛋白或其變體(例如同源物) 的virE2基因可分離自其他生物體，特別是其他土壤桿菌菌株，并且可以用于在所述virE2 供體株中產(chǎn)生功能性virE2蛋白。其他的virE2核酸和/或氨基酸序列還可在DNA和/或 蛋白數(shù)據(jù)庫中用計(jì)算機(jī)進(jìn)行鑒定，或者通過核酸雜交或PCR使用所述virE2序列或其部分 作為探針或引物進(jìn)行鑒定。這同樣適用于上文進(jìn)一步描述的virG和VirEl基因和蛋白(以 及它們的變體)。使用例如實(shí)施例中描述的互補(bǔ)測(cè)定，可容易地測(cè)試所編碼的virE2蛋白和/或變 體的功能。明顯地，本發(fā)明的virE2核酸序列還涵蓋變體，例如與SEQ ID NO :1有至少70%， 優(yōu)選至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或更高核酸序列同一性(在全長上使用兩兩比 對(duì)，例如使用EmbossWin的程序“needle”，空位產(chǎn)生罰分10. 0且空位擴(kuò)展罰分0. 5，使用 DNAfull作為矩陣)的核酸序列。virE2 突變株用于本發(fā)明方法的第二菌株是不能產(chǎn)生功能性virE2蛋白的virE2突變株。當(dāng)提 及“無功能性virE2被制造”時(shí)包括這樣的可能性，即根本無virE2蛋白被所述菌株制造/ 可以被其制造，或者無功能的蛋白被制造/可以被制造。同時(shí)，可以使用任何土壤桿菌菌株和任何Ti質(zhì)粒，條件是出現(xiàn)于所述(優(yōu)選卸 毒的)Ti質(zhì)粒上的內(nèi)源性virE2基因被修飾，使得沒有功能性蛋白被制造/可以被制造。 VirE2突變株可通過類似于實(shí)施例中對(duì)EHA105-dE2(CBS121809)描述的方式進(jìn)行制備，通 過例如以同源重組方式將質(zhì)粒插入至所述virE20RF中。明顯地，在本領(lǐng)域中有許多其他方 法可獲得相同的結(jié)果。所述Ti質(zhì)粒上的virE2基因(例如SEQ ID NO=I或其變體)的整 體或部分的插入、缺失和/或替換會(huì)形成virE2突變株，以及包含突變體virE2基因或缺少 virE2基因的Ti質(zhì)粒。在提及“突變體” virE2基因時(shí)，涵蓋導(dǎo)致基本沒有功能性virE2蛋 白被制造的任何遺傳修飾，即編碼virE2蛋白的DNA的整體或部分的插入、替換或缺失的突 變/遺傳修飾。突變體virE2基因還可以是分離的，或者通過合成或使用分子生物學(xué)技術(shù) 制備；然后可以用于替換Ti質(zhì)粒上的功能性virE2基因，以用于所述菌株中。virE2活性的缺失可以如實(shí)施例中所述進(jìn)行確定?；蛘?，可以如已知使用其他的測(cè) 定法。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述virE2突變體為以登記號(hào)CBS121809保藏的菌 株(或其衍生菌株)，或者其中包含所述Ti質(zhì)粒的或其中包含所述突變體virE2基因的土 壤桿菌菌株?？梢詫鰒irE2突變體基因的Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至另一菌株例如經(jīng)矯正的 菌株中。或者，所述突變體基因可以從所述保藏株分離，并轉(zhuǎn)移至另一菌株和/或另一 Ti 質(zhì)粒中。另一些VirE2突變體土壤桿菌菌株在本領(lǐng)域中也已被記載，但這些菌株還未曾用 于共轉(zhuǎn)化方法中，而是僅用于研究virE2的功能。例如，Simone et al. 2001 (Mol MicrobiolVol 41 1283-1293), Dombek and Ream(1997, J of Bacteriology Vol 179 :1165_1173)， Binns et al. (1995，J of Bacteriol. Vol 177 :4890_4899)和 Stachel and Nester (1986 ； EMBO J Vol. 5 :1445-1454)描述了 virE2突變體和virE2突變株的產(chǎn)生。然而，該菌株不 是卸毒的并且它們未用于共轉(zhuǎn)化中，即互補(bǔ)測(cè)定利用了野生型菌株提供功能性virE2，然而 其不包含具有GOI的T-DNA。另外，所有這些virE2突變株都是章魚堿型菌株。上述參考文獻(xiàn)中描述的virE2突變株也可用于本發(fā)明中，但優(yōu)選在使用前對(duì)這些 菌株進(jìn)行卸毒。所述菌株包括包含其中virE2被nptll替換的pTiA6NC的根癌土壤桿菌 菌株WR5000 (Dombek and Ream，見上文，參見其中的圖1)或通過突變(例如出現(xiàn)于菌株 A348中的)所述Ti質(zhì)粒pTiA6NC上的virE2基因得到的另一 virE2突變體；Binnes et al.(見上文)的表1中列出的根癌土壤桿菌菌株，例如其中質(zhì)粒被整合至virE2的ORF中的 A348: :virE2 ；Stachel and Nester (見上文)中描述的土壤桿菌菌株358mx，在所述virE2 基因中包含轉(zhuǎn)座子插入?；径裕魏瓮寥罈U菌菌株均可被修飾以在所述virE2基因中包含突變或者以 缺失所述virE2基因。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了所述virE2突變株和/或virE2 突變體Ti質(zhì)粒，其中所述突變株和/或Ti質(zhì)粒為琥珀堿Ti質(zhì)粒，以及/或者包含這類質(zhì) 粒的菌株。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的virE2突變株優(yōu)選為琥珀堿菌株，例如攜帶 來自pTiBo542(EHA101，EHA105)的Ti質(zhì)粒。這些菌株具有寬泛的宿主范圍；這意味著它們 能夠轉(zhuǎn)化許多不同的植物宿主物種。所述virE2基因包含所述virE2基因的整體或部分的插入、缺失或替換，從而使 得無法制得所述virE2蛋白，或者所述virE2蛋白沒有功能(例如被截短或者未正確地折 疊)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述virE2突變株為以登記號(hào)CBS 121809保藏的EHA105_dE2，并 且所述Ti質(zhì)粒為位于該菌株中的質(zhì)粒，或者它們中任一個(gè)的衍生物。同時(shí)，提供了如SEQID NO 3中所示的分離的突變體virE2DNA，包含在SEQ ID NO 1的virE2 cDNA中的插入(敲 除)。SEQ ID NO :3示出了所述突變株的整個(gè)VirE操縱子區(qū)，所述突變株包含插入至所述 virE2 ORF中并且在加工中使其中斷的質(zhì)粒。因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述virE2突變株在所述virE2基因中包含一 個(gè)或多個(gè)插入、缺失和/或替換，其中所述virE2基因的部分或全部被缺失和/或替換，并 且/或者其中DNA被插入，由此所述變化會(huì)導(dǎo)致無法制造任何virE2蛋白或者導(dǎo)致制造出 無功能的virE2蛋白(例如截短的無功能蛋白)。在該方法的步驟(b)中，將包含目的基因的T-DNA導(dǎo)入所述virE2供體株，并且在 所述步驟中(c)，將包含篩選標(biāo)記基因的T-DNA導(dǎo)入至所述virE2突變株中。因此，提供了 合適的T-DNA，包含例如可操作地連接的元件例如RB和(任選的)LB、G0I或標(biāo)記物?？梢?使用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)方法制備所述T-DNA。優(yōu)選地，所述T-DNA在質(zhì)粒載體上，例如二元 載體或共整合載體。所述T-DNA或包含所述T-DNA的載體導(dǎo)入至所述土壤桿菌菌株可通過 例如電穿孔實(shí)現(xiàn)。因此，在所述方法的一個(gè)實(shí)施方案中，所述T-DNA被導(dǎo)入至DNA載體或質(zhì)粒上，并 且所述T-DNA至少包含右邊界序列。GOI可以為任意基因，不管是否編碼蛋白或具有不同的功能，例如(但不限于)選 自用于生物應(yīng)激耐受和/或非生物應(yīng)激耐受、疾病抗性、除草劑抗性、農(nóng)藝性狀、產(chǎn)出性狀等的基因(編碼序列，例如cDNA或基因組DNA)。所述GOI可以為植物基因或來自植物的基 因，或者天然存在于細(xì)菌、真菌、動(dòng)物(包括人)等中的基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述基因 為順式基因。合適的編碼序列的基因組DNA和cDNA在本領(lǐng)域中是可以獲得的，例如從核酸 數(shù)據(jù)庫中獲得。標(biāo)記基因包括植物篩選標(biāo)記物，例如(但不限于)抗性基因(例如抗生素抗性、除 草劑抗性等)，或者賦予可用于選擇轉(zhuǎn)化體的性狀的其他基因，例如賦予表型性狀的基因。在步驟(d)中，將待轉(zhuǎn)化的植物、植物部分、植物細(xì)胞或組織在合適的條件下與合 適量和/或合適比例的兩菌株(即至少1株virE2供體株和至少1株virE2突變株)接觸 (例如共接種或共感染)合適的時(shí)長，這例如如成熟的土壤桿菌轉(zhuǎn)化方案或其修改方案中 所述。番茄轉(zhuǎn)化參照和步驟概要參見實(shí)施例2。共接種或共感染在本文中是指兩者在物理 上一起(作為混合物或同時(shí))加入至細(xì)胞/組織，或者指所述菌株被先后加入。在先后接 觸的情況下，優(yōu)選首先加入包含所述GOI的菌株，這是因?yàn)樗鯣OI (通常)不能被選擇；然 后在短時(shí)間間隔內(nèi)加入包含所述的篩選標(biāo)記基因的菌株。例如，所述植物細(xì)胞或組織可以是子葉的外植體，或本領(lǐng)域中已知的其他組織，例 如根培養(yǎng)物、葉盤等。或者，可以接觸植株的部分或全部，例如通過浸潤。用于土壤桿菌 轉(zhuǎn)化的方法是本領(lǐng)域中已知的，并且可根據(jù)本發(fā)明使用。所述植物細(xì)胞、組織或植株可以 是適應(yīng)土壤桿菌轉(zhuǎn)化的任何物種。因此，任何植物例如單子葉植物或雙子葉植物都可能 是合適的，所述植物例如，玉米(maize/corn)(玉蜀黍?qū)?Zea)的種例如玉米(Z. mays)、 大當(dāng)草(Z. diploperennis) (chapule)、繁茂大當(dāng)草(Zea luxurians)(危地馬拉大當(dāng) 草)、玉米亞種 huehuetenangensis(San Antonio Huista 大芻草)、墨西哥玉米(Z. mays subsp. mexicana)(墨西哥大芻草)、玉米亞種parviglumis(巴爾薩斯大芻草(Balsas teosinte))、Ζ· perennis (多年生大芻草)和Z. ramosa、小麥(小麥屬的種)、大麥(barley) (例如大麥(Hordeum vulgare))、燕麥(oat)(例如燕麥(Avena sativa))、高梁(sorghum) (高粱(Sorghum bicolor))、黑麥(rye)(黑麥(Secale cereale))、大豆(soybean)(大豆 屬(Glycine)的多個(gè)種例如大豆(G. max))、棉花(棉屬的種例如陸地棉(G. hirsutum)、海 島棉(G. barbadense))、蕓苔屬的多個(gè)種(例如甘藍(lán)型油菜(B. napus)、芥菜(B. juncea)、甘 藍(lán)(B. oleracea)、蕪青(B. rapa)等)、向日葵(sunflower)(向日葵(Helianthus annus))、 煙草(煙草屬(Nicotiana)的種)、苜蓿(alfalfa)(紫花苜蓿(Medicago sativa)), 稻(稻屬(Oryza)的種例如印度稻(0. sativa indica)栽培種或日本稻(0. sativa japonica)栽培種)、牧草、珍珠粟(pearl millet)(狼尾草屬(Permisetum)的種例如 珍珠粟(Pennisetum glaucum))、樹類物種、蔬菜類物種例如番茄屬(Lycopersicon)的 亞種(最近被重新分為茄屬(Solanum))，如番茄(tomato)(普通番茄(L. esculentum)， 異名番茄(Solanum Iycopersicum))例如櫻桃番茄(變種cerasiforme)或現(xiàn)代番茄 (current tomato)(變禾中 pimpinellifolium))或樹番爺(tree tomato) (S. betaceum，異 名樹番爺(Cyphomandra betaceae))、馬鈴薯(potato)(馬鈴薯(Solanum tuberosum)) 和其他茄屬物種例如茄子(eggplant)(茄子(Solanum melongena))、人參果(ρ印ino) (人參果(S. muricatum)) > cocona(S. sessilif lorum)禾口 naranjilla (S. quitoense)；古月 椒類(peppers)(辣椒(Capsicum annuum)、/J、米椒(Capsicum frutescens)) >i^isi (pea) (例如豌豆(Pisum sativum))、菜豆(bean)(例如菜豆屬(Phaseolus)的種)、胡蘿卜(carrot)(胡蘿卜(Daucus carota))、萬宦屬的種(例如萬宦(Lactuca sativa)、山萬 H (Lactuca indica)、宿f艮萬H (Lactuca perennis)) > (cucumber) ( (Cucumis sativus))、舌甘瓜(melon)(舌甘瓜(Cucumis melo))、西葫聲(zucchini)(西葫聲(Cucurbita pepo))、胃 /R (squash)(胃 /R (Cucurbita maxima) > M(Cucurbita pepo) > Hf /R
(watermelon) (M/R (Citrullus lanatus), ^^M/R (Citrullus vulgaris))、I^MIt白勺 物種(葡萄、桃、李、草莓、芒果、甜瓜)、觀賞植物的物種(例如玫瑰、碧冬茄屬(Petunia)、 菊屬(Chrysanthemum)、百合、郁金香、大丁草屬(Gerbera)的種)、木本樹(例如楊屬 (Populus)、柳屬(Salix)、櫟屬(Quercus)、桉屬(Eucalyptus)的種)、纖維植物的物種例如 亞麻(flax)(亞麻(Linum usitatissimum))禾口大麻(hemp)(大麻(Cannabis sativa))。 在一個(gè)實(shí)施方案中優(yōu)選蔬菜類物種，特別是茄屬的種(包括番茄屬的種)。因此，可以轉(zhuǎn)化例如以下屬的種南瓜屬(Cucurbita)、玫瑰屬(Rosa)、葡萄屬 (Vitis)JJ^US (Juglans)、草莓屬(Fragaria)、百脈根屬(Lotus)、苜蓿屬(Medicag0)Jji 食草屬(Onobrychis)、三葉草屬(Trifolium)、胡盧巴屬(trigonella)、豇豆屬(Vigna)、 柑桔屬(Citrus)、亞麻屬(Linum)、老鸛草屬(Geranium)、木薯屬(Manihot)、胡蘿卜 屬(Daucus)、鼠耳芥屬(Arabidopsis)、蕓苔屬(Brassica)、蘿卡屬(Raphanus)、白芥屬 (Sinapis)、顛茄屬(Atropa)、辣椒屬(Capsicum)、曼陀羅屬(Datura)、黃瓜屬(Cucumis)、 直菪屬(Hyoscyamus)、番爺屬(Lycopersicon)、爺屬(Solanum)、煙草屬(Nicotiana)、蘋果 屬(Malus)、碧冬茄屬(Petunia)、毛地黃屬(Digitalis)、Majorana、菊苣屬(Ciahorium)、 ( ι] H ^M (Helianthus)、豸■ M (Lactuca)、雀麥屬(Bromus) > M /R M (Citrullus)、 天門冬屬(Asparagus)、金魚草屬(Antirrhinum)、Heterocallis、Nemesis、天竺葵屬 (Pelargonium)、黍?qū)?Panieum) > ^illlliptM (Pennisetum)、毛直屬(Ranunculus)、千里光 屬(Senecio)、智利喇叭花屬(Salpiglossis)、紫水晶屬(Browaalia)、大豆屬(Glycine)、 豌豆屬(Pisum)、菜豆屬(Phaseolus)、棉屬(Gossypium)、大豆屬(Glycine)、黑麥草屬 (Lolium)、羊茅屬(Festuca)、剪股穎屬(Agrostis)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述virE2突變體(包含所述篩選標(biāo)記基因)與所述virE2供 體株(包含所述GOI)的比例為約1 3。其他合適的比例包括任意比例，其中相對(duì)于所述 virE2突變株優(yōu)選使用更多供體株，例如超過1 1的比例，例如1 2、1 4、1 5等。 然而，例如對(duì)于煙草，1 1的比例被發(fā)現(xiàn)比超過1 1的比例更合適。所述兩菌株優(yōu)選是新鮮培養(yǎng)的。所述菌株可以在與所述植株或植物組織接觸之前 混合，或者可以使它們?cè)诓煌牟襟E中(例如先后地或同時(shí)地)與所述細(xì)胞接觸。每種菌株的量包括例如在液體MS20培養(yǎng)基中于600nm的OD為約0. 100-約0. 300， 或者與之相當(dāng)?shù)牧?。在步驟(e)中，基于所述標(biāo)記基因及其表達(dá)產(chǎn)物，將植物細(xì)胞、組織、器官或植株 (或小植株)以及/或者再生的植株或小植株經(jīng)過選擇步驟。因此，步驟(e)包括步驟利 用所述篩選標(biāo)記基因產(chǎn)物賦予的表型選擇植物細(xì)胞和/或再生植株(或小植株)。該步驟 的目的是為了選擇所述共轉(zhuǎn)化體。在該步驟中可使用標(biāo)準(zhǔn)的方法。例如，可以再生根和/或芽，并且基于所述標(biāo)記基 因以及/或者其表達(dá)產(chǎn)物或其賦予的表型，可篩選和選擇(部分的)所述再生組織。如上 文已述，用于從轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生整個(gè)植株的方法是本領(lǐng)域中已知的，并且可應(yīng)用于所
16述轉(zhuǎn)化的和/或選出的細(xì)胞。根據(jù)使用的標(biāo)記基因的類型，選擇方法可以不同。如果所述 標(biāo)記基因?yàn)槌輨┛剐曰?，那么小植株或葉的部分可以與所述除草劑接觸，然后選擇那 些對(duì)所述除草劑有抗性的小植株。所選擇的植株可以是原始轉(zhuǎn)化體(Tl代)，但選擇也可發(fā) 生在更晚階段或者進(jìn)一步發(fā)生在更晚階段，例如在通過自交或雜交得到的較后的代中。因 此，任選地可使所述植株進(jìn)一步雜交和/或自交，以產(chǎn)生在基因組中包含所述標(biāo)記基因DNA 的全植株和后代。由于本發(fā)明的共轉(zhuǎn)化方法的高效性，高百分比的包含所述標(biāo)記基因的原始轉(zhuǎn)化體 還包含所述G0I。因此，超過50%，例如至少60%、70%、80%、90%或更多(95%、99%、 100% )的所選轉(zhuǎn)化體除了包含所述標(biāo)記基因之外還包含所述G0I?？梢詫⑽幢贿x擇的植株 丟棄。轉(zhuǎn)化效率越高越好，這是因?yàn)殡S后需要更少的轉(zhuǎn)化體來使用費(fèi)力的分子方法(例如 針對(duì)所述GOI的PCR或者針對(duì)所述GOI的核酸雜交(例如DNA印跡分析))分析所述GOI 的存在情況。在本文的實(shí)施例中，100%的所選植株包含兩種T-DNA，這通過PCR分析得到確 認(rèn)。因此，與傳統(tǒng)的共轉(zhuǎn)化方法相比。只需要少得多的總轉(zhuǎn)化體數(shù)目。然后，所述方法任選還包含步驟(f):使所選的植株(或者來自所選的植物細(xì)胞或 小植株的植株)雜交和/或自交以產(chǎn)生后代，以及(g)任選丟棄那些包含所述篩選標(biāo)記基 因的后代并保留那些包含目的基因但缺少所述篩選標(biāo)記基因的后代(即所述標(biāo)記基因與 目的基因分離產(chǎn)生包含目的基因的無標(biāo)記物的植株)。由于所述標(biāo)記基因和GOI將能夠相互分離，任選可以丟棄那些包含所述篩選標(biāo)記 基因的植株或后代，并且可以保留那些包含所述GOI但缺少所述篩選標(biāo)記基因的植株和后 代供進(jìn)一步使用。因此，可以形成僅包含整合于基因組中的GOI的植株(不含標(biāo)記物的植 株)，所述標(biāo)記基因已從中分離出去。這類植株的選擇可以使用已知的方法進(jìn)行，例如PCR 篩選、基于雜交的方法以及/或者使用表型篩選。本發(fā)明的實(shí)施方案還提供了用于上述方法的土壤桿菌菌株和成對(duì)的土壤桿菌菌 株(至少一株virE2供體株和至少一株virE2突變株)。所述virE2供體株優(yōu)選在細(xì)胞內(nèi)(例如在質(zhì)粒上)還包含含有GOI的T-DNA，而所 述virE突變株優(yōu)選在細(xì)胞內(nèi)(例如在質(zhì)粒上)還包含含有標(biāo)記基因的T-DNA。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述virE2突變株包含在所述virE2基因中有突變(優(yōu)選DNA 插入)的Ti質(zhì)粒，所述突變導(dǎo)致所述菌株無法制造功能性virE2蛋白。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施 方案中，所述virE2突變株為以登記號(hào)CBS 121809保藏的菌株或其保留有存在于其中的Ti 質(zhì)粒的衍生物。在另一實(shí)施方案中，提供了包含CBS121809的Ti質(zhì)粒的菌株，該菌株包含 菌株CBS121809的Ti質(zhì)粒中存在的突變體virE2基因。本發(fā)明的用途根據(jù)上文的描述所述用途已經(jīng)明晰。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了如下2株 土壤桿菌用于以其中所含的兩種T-DNA共轉(zhuǎn)化植株、植物細(xì)胞或植物組織的用途，其中所 述2株土壤桿菌一株為不能產(chǎn)生功能性virE2蛋白并包含含有篩選標(biāo)記基因的T-DNA的第 一土壤桿菌菌株，另一株為包含編碼功能性virE2蛋白的基因和含有目的基因的T-DNA的 第二土壤桿菌菌株。所述第一土壤桿菌菌株的virE2基因優(yōu)選包含所述virE2基因的整體或部分的插入、缺失或替換。本發(fā)明的試劑念還提供了共轉(zhuǎn)化試劑盒，所述試劑盒包含第一土壤桿菌菌株和第二土壤桿菌菌 株，所述第一菌株由于存在于該菌株中的Ti質(zhì)粒的virE2基因中的整體或部分的插入、缺 失或替換而不能產(chǎn)生功能性virE2蛋白，所述第二菌株包含編碼功能性virE2蛋白的基因。如所述，所述第二菌株優(yōu)選包含至少2個(gè)編碼功能性virE2蛋白的virE2基因。所述菌株可以以冷凍或凍干的能存活培養(yǎng)物形式提供，或者作為活培養(yǎng)物(例如 在平板上)提供。同時(shí)，所述菌株可分開提供或者作為混合物提供，例如以用于共轉(zhuǎn)化的 合適比例和/或濃度。在所述試劑盒中可以提供其他材料，例如操作方案、對(duì)照物、virE2 DNA(例如探針和/或引物)、緩沖劑等。同時(shí)，本文涵蓋使用上述方法制備的轉(zhuǎn)化的和/或再生的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞和植株 (和/或植物部分)。序列SEQ ID NO 1 :virE2 cDNASEQ ID NO 2 :SEQ ID NO 1 編碼的 virE2 蛋白SEQ ID NO 3 :virE操縱子，包含因插入而產(chǎn)生的(敲除的)突變virE2 cDNASEQ ID NO 4:virG 蛋白(X62885)SEQ ID NO 5 :virEl 蛋白(AA250537)


圖1-質(zhì)粒pKG6305的圖譜圖2-質(zhì)粒pKG6330的圖譜圖3-T-DNA從土壤桿菌(下)轉(zhuǎn)移至植物細(xì)胞(上)中的總示意4A-使用非突變體菌株的共轉(zhuǎn)化，其中共轉(zhuǎn)化效率低于50% (黑點(diǎn)指示virE2 蛋白)圖4B-本發(fā)明的方法，其得到高共轉(zhuǎn)化效率(黑點(diǎn)指示virE2蛋白)。如下的非限制性實(shí)施例描述了本發(fā)明的共轉(zhuǎn)化方法和菌株。在這些實(shí)施例中除 非另外聲明，否則所有重組DNA技術(shù)依照以下文獻(xiàn)中描述的標(biāo)準(zhǔn)操作方案進(jìn)行=Sambrook et al. (1989)Molecular Cloning :A Laboratory Manual,第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press 禾口 Sambrook and Russell(2001)Molecular Cloning :A Laboratory Manual,第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY ；以及Ausubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA 的第 1 禾口第 2 卷。 用于植物分子研究的標(biāo)準(zhǔn)材料和方法記載于R. D. D. Croy的Plant Molecular Biology Labfax (1993)，其由 BIOS Scientific Publications Ltd (UK)和 Blackwell Scientific Publications, UK 聯(lián)合出版。實(shí)施例實(shí)施例1 :EHA105-dE2的構(gòu)建和確認(rèn)根癌土壤桿菌菌株EHA105_dE2( “d”代表被中斷)通過如下方式制備通過同源 重組將不能在根癌土壤桿菌中復(fù)制的中斷質(zhì)粒(名稱為PKG6328)整合至EHA105 VirE2基因中。EHA105的Ti質(zhì)粒是Ti質(zhì)粒pTiBo542的衍生物。pKG6328是否插入至VirE2開放 閱讀框(ORF)通過如下方式確認(rèn)將pKG6328的邊界部分?jǐn)U增至所述Ti質(zhì)粒并將其測(cè)序。 為了測(cè)試(無)功能性，進(jìn)行了轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，包括用作對(duì)照的敲除互補(bǔ)，所述敲除互補(bǔ)通過加 入能夠在根癌土壤桿菌中復(fù)制并由VirE操縱子啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)PTiBo542VirEl和VirE2 基因的質(zhì)粒(質(zhì)粒pKG6330)實(shí)現(xiàn)。菌株EHA105_dE2已經(jīng)由本申請(qǐng)人根據(jù)布達(dá)佩斯條約(Budapest Treaty)于 2007年8月30日以登記號(hào)CBS 121809保藏于荷蘭真菌保藏所(Centraalbureau voor Schimmelcultures(CBS), P. 0. Box 85167，3508AD Utrecht, The Netherlands)或"Fungal Biodiversity Centre，，(Utrecht, The Netherlands)。中斷載體pKG6328的構(gòu)建以包括一個(gè)在3個(gè)開放閱讀框中具有終止密碼子的特定部分的VirE2基因特異性 引物，在EHA105細(xì)菌上直接擴(kuò)增部分的pTiBo5420RF(正向5，-TGAATGAATGATGATGACACTGAC-3，禾口反向5，-TTAGTCAATTAGTCGCCGGCAAACCTGT-3，)。使用如下的PCR 譜80°C 3 分鐘 _94°C 2 分鐘 _(94°C 30 秒 _55°C 1 分鐘 _72°C 1 分鐘)30次-4°C保持。將所形成的PCR產(chǎn)物連結(jié)至使用R6K復(fù)制起點(diǎn)的來自Invitrogen 的PCR克隆載體。將所形成的質(zhì)粒測(cè)序，以確認(rèn)終止密碼子整合于所述部分VirE2 ORF的 每一側(cè)。該質(zhì)粒稱為PKG6328。根癌土壤桿菌菌株EHA105 VirE2基因的中斷將質(zhì)粒pKG6328通過電穿孔轉(zhuǎn)移至從EHA105制得的感受態(tài)細(xì)胞中。由于該質(zhì)粒 不能在根癌土壤桿菌內(nèi)復(fù)制，因此其需要使用所述VirE20RF部分通過同源重組整合，在該 過程中中斷了所述內(nèi)源性VirE2基因。用卡那霉素選擇轉(zhuǎn)化體，卡那霉素是存在于pKG6328 載體骨架上的篩選標(biāo)記。所述VirE2基因的中斷通過擴(kuò)增所述整合位點(diǎn)并將其測(cè)序(SEQ IDNO 3)來進(jìn)行確認(rèn)。將此新菌株命名為EHA105-dE2，并作為CBS 121809保藏。pKG6305 的構(gòu)建質(zhì)粒pBBRlMCS (GENBANK NR. U02374, Kovach et al. 1994，BioTechniques 16(5)， 800-802)是pKG6305和pKG6330 二者的骨架載體。使用如下的引物擴(kuò)增VirG基因反向 5，-CTCGCGTCATTCTTTGCTGGAG-3，和正向5，-TCCGGGATCGATTTCAACAATAC-3，。將來自根 癌土壤桿菌菌株EHA105的50ng總DNA作為模板用于如下PCR譜94°C 2分鐘_(94°C 30 秒-58°C 1分鐘-68°C 2分鐘)X30-72°C 10分鐘_4°C保持。將有校正功能的DNA聚合酶 用于降低PCR錯(cuò)誤的風(fēng)險(xiǎn)(來自Perkin Elmer的rTth聚合酶)。使用來自Perkin Elmer 的AmpliTaq red，通過將1個(gè)單位的該聚合酶加入至PCR反應(yīng)中并且在72°C下孵育10分 鐘生成“A突出物(A-overhang) ”。將該P(yáng)CR產(chǎn)物連接至來自Invitrogen的pCR2. IPCR克 隆載體并測(cè)序。通過以PstI和SacI切割所述質(zhì)粒并從凝膠分離含所述基因的1393bp片段，從該 載體得到所述VirG基因。將所述片段連接至pBBRlMCS的相應(yīng)位點(diǎn)。該新質(zhì)粒被給予用于 后續(xù)的克隆步驟的新多克隆位點(diǎn)(MSC)。該MCS由2條寡核苷酸組成5’ -TTCTAGAACTAGT GGGCCCCTGCAGGTTAACATGCA-3，和 5，-TGTTAACCTGCAGGGGCCCACTAGTTCTAGAAGGCC-3，。當(dāng)這 2條寡核苷酸在磷酸化后形成DNA雙鏈片段時(shí)，它將具有單鏈的DNA突出物，該突出物與由
19ApaI和PstI形成的突出物相適配。使用這2種酶，將該適配物連接于這些位點(diǎn)。該終產(chǎn)物 為pKG6305。質(zhì)粒pKG6305的圖譜可見于圖1。pKG6330 的構(gòu)建使用基因特異性引物從EHA105擴(kuò)增VirE操縱子啟動(dòng)子、VirEl基因和VirE2基 因，并將它們克隆至攜帶PBBR復(fù)制起點(diǎn)和氯霉素抗性基因(用于細(xì)菌篩選)的質(zhì)粒骨架 中。為了擴(kuò)增該VirE操縱子部分，使用了如下的引物正向5，-ACTAGTTGCCCGCGAAACAGCATTGACT-3‘禾口反向5，-GGGTACCATGACGCGGCAGCAGGAAC-3，。正向引物中嵌入了 SpeI限制酶位點(diǎn)，反向引物嵌入了 KpnI位點(diǎn)。位點(diǎn)在所述引物序列中以下劃 線示出。將來自根癌土壤桿菌菌株EHA105的50ng總DNA作為模板用于如下PCR譜94°C 2分鐘_(94°C 30秒-58°C 1分鐘_68°C 3分鐘)X30_72°C 10分鐘-4°C保持。將有校 正功能的DNA聚合酶用于降低PCR錯(cuò)誤的風(fēng)險(xiǎn)(來自Perkin Elmer的rTth聚合酶)。隨 后以SpeI和KpnI切割所述PCR產(chǎn)物，并連接至pKG6305相應(yīng)的位點(diǎn)。該質(zhì)粒在大腸桿菌 和根癌土壤桿菌中都可復(fù)制。在證實(shí)序列后，通過電穿孔將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至土壤桿菌。質(zhì)粒 PKG6330的圖譜可見于圖2。毒力和互補(bǔ)測(cè)試當(dāng)將用于gusA表達(dá)的補(bǔ)充有T-DNA的EHA105_dE2用于植株轉(zhuǎn)化時(shí)，所產(chǎn)生的轉(zhuǎn) 化細(xì)胞的數(shù)目由于所述VirE2基因的中斷應(yīng)接近于0。同時(shí)，當(dāng)將完整拷貝的VirE操縱子 加入該菌株時(shí)，所述表型應(yīng)得以補(bǔ)充且所述毒力恢復(fù)至VirE2未被中斷的菌株(VirE2基因 未被中斷的EHA105)的水平。進(jìn)行了本生煙草(Nicotiana benthamiana)轉(zhuǎn)化(葉盤轉(zhuǎn)化 和土壤桿菌浸潤)，以評(píng)估EHA105-dE2的毒力。使用了如下的菌株-質(zhì)粒組合1.含 T-DNA 的 EHA105 (陽性對(duì)照)；2.含 T-DNA 的 EHA105_dE2 (應(yīng)接近于 0)；3.含 T-DNA 和 pKG6330 的 EHA105-dE2 (互補(bǔ)測(cè)試)。對(duì)于葉盤轉(zhuǎn)化，從煙草葉切下直徑Icm的葉盤。用于煙草葉盤轉(zhuǎn)化的方案已記載 于 Horsch et al (1988, Plant molecular biology manual A5:l_9)0 對(duì)于每一土壤桿菌 處理，都轉(zhuǎn)化了 40個(gè)葉盤。在共栽培開始10天后，使用Xgluc作為底物將葉盤用于⑶S染 色(Jefferson et al. 1987EMB0 J. December 20 ；6(13) :3901_3907)。對(duì)于每個(gè)葉盤，計(jì)算 藍(lán)斑的數(shù)目。葉盤轉(zhuǎn)化的結(jié)果在如下表1中給出。表1:在使用不同菌株-質(zhì)粒組合轉(zhuǎn)化后獲得的每個(gè)葉盤的gus斑平均(AVG)數(shù) 目。對(duì)于每種組合，還計(jì)算了標(biāo)準(zhǔn)差(SD)、最大數(shù)目(MAX)和最小數(shù)目(MIN)。
權(quán)利要求
一種制備包含目的基因的無篩選標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包括如下步驟a)提供2株土壤桿菌——包含編碼功能性virE2蛋白的基因的virE2供體株，以及不能產(chǎn)生功能性virE2蛋白的virE2突變株，b)將包含目的基因的T DNA導(dǎo)入所述virE2供體株，c)將包含篩選標(biāo)記基因的T DNA導(dǎo)入所述virE2突變株，d)將植物細(xì)胞與兩菌株接觸，以及e)利用由所述篩選標(biāo)記基因產(chǎn)物賦予的表型選擇植物細(xì)胞或再生的植株，以及任選f)使所選的植株雜交或自交以產(chǎn)生后代，以及任選g)丟棄那些包含所述篩選標(biāo)記基因的后代并保留那些包含目的基因但缺少所述篩選標(biāo)記基因的后代。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述virE2供體株包含至少2個(gè)virE2基因，所述virE2基 因每個(gè)均編碼功能性virE2蛋白。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述virE2突變株在所述virE2基因中包含插入物，并 且/或者其中所述virE2基因的部分或整體被缺失和/或被替換。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述virE2突變株為以登記號(hào)CBS121809保藏的菌株或其 衍生菌株。
5.權(quán)利要求2的方法，其中一個(gè)virE2基因在Ti質(zhì)粒上，而一個(gè)virE2基因在輔助質(zhì) 粒上。
6.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述T-DNA被導(dǎo)入至DNA載體或質(zhì)粒上，并且其中 所述T-DNA至少包含右邊界序列。
7.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述virE2突變株和所述virE2供體株的比例為 1 1、1 2、1 3、1 4、1 5 或者更大。
8.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中共轉(zhuǎn)化效率為至少60%，優(yōu)選至少80%、90%或 100%。 一種土壤桿菌菌株，在virE2基因中包含有DNA插入物，藉此所述菌株不能制造功能 性virE2蛋白。
9.權(quán)利要求8的菌株，其中所述菌株為以登記號(hào)CBS121809保藏的菌株或其衍生菌株。
10.如下2株土壤桿菌用于以其中所含的兩種T-DNA共轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的用途，其中所述 2株土壤桿菌一株為不能產(chǎn)生功能性virE2蛋白并包含含有篩選標(biāo)記基因的T-DNA的土壤 桿菌菌株，另一株為包含編碼功能性virE2蛋白的基因和含有目的基因的T-DNA的土壤桿 菌菌株。
11.權(quán)利要求10的用途，其中所述內(nèi)源性virE2基因包含所述virE2基因的整體或部 分的插入、缺失或替換。
12.—種共轉(zhuǎn)化試劑盒，所述試劑盒包含第一土壤桿菌菌株和第二土壤桿菌菌株，所述 第一菌株由于Ti質(zhì)粒的virE2基因中的插入、缺失和/或替換而不能產(chǎn)生功能性virE2蛋 白，所述第二菌株包含編碼功能性virE2蛋白的基因。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的試劑盒，其中所述第二菌株包含至少2個(gè)編碼功能性virE2蛋 白的virE2基因。全文摘要
本發(fā)明涉及使用土壤桿菌的植物轉(zhuǎn)化領(lǐng)域。本文中提供了超高效的共轉(zhuǎn)化方法。
文檔編號(hào)C07K14/195GK101983206SQ200880126210
公開日2011年3月2日 申請(qǐng)日期2008年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月5日
發(fā)明者I·M·布魯吉曼, M·T·J·德博特 申請(qǐng)人:關(guān)鍵基因公司