專利名稱：陽離子核-殼肽納米顆粒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及陽離子核-殼(core-Shell)肽納米顆粒，其形成以及作為抗微生物制 劑的用途。
背景技術(shù)：
腦部炎癥疾病諸如腦膜炎和腦炎屬于排在前十位的傳染性致死原因，其可以由不 同的細(xì)菌諸如炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthrax)和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) 或真菌引起。感染HIV的患者由于其受損的免疫系統(tǒng)而非常容易受真菌感染，并且白 色念珠菌(Candida albicans)是腦膜炎中最常發(fā)現(xiàn)的真菌。據(jù)報(bào)道來自紙葡萄穗霉 (Stachybotrys chartarum)的暴露毒素G(Satratoxin G)也引起腦部炎癥。腦部感染可以 是很嚴(yán)重的，因?yàn)樗梢栽斐陕犛X喪失、學(xué)習(xí)障礙(learning disability)或腦部損傷。盡 管有抗生素療法，但是因?yàn)檩斔退幬锎┻^血腦屏障(BBB)至腦中的困難，所以存在高死亡 率和發(fā)病率。陽離子抗微生物肽最近受到越來越多的關(guān)注，因?yàn)槠鋸V譜活性和抗擊多重藥 物抗性微生物的能力。因此需要具有改良抗微生物活性的陽離子肽的新形式，優(yōu)選可以穿 過血腦屏障的陽離子抗微生物肽的形式。發(fā)明目的本發(fā)明的目的是在實(shí)質(zhì)上至少部分滿足上述需要。發(fā)明概述在本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供了兩親性抗微生物物質(zhì)，其包含與陽離子寡肽部分 偶聯(lián)的疏水部分。下列選擇可以與第一個(gè)方面聯(lián)用，單獨(dú)地或以任意合適的組合。所述陽離子寡肽部分可以包含精氨酸殘基。其可以包含賴氨酸殘基。其可以包括 精氨酸和賴氨酸殘基。其長(zhǎng)度可以在5到35個(gè)肽單元之間。其可以包含蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。 蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域可以是末端結(jié)構(gòu)域。其可以是TAT(YGRKKRRQRRR)。其可以與陽離子寡肽基 團(tuán)偶聯(lián)。因此所述陽離子寡肽部分可以包含與該陽離子寡肽基團(tuán)偶聯(lián)的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。 該陽離子寡肽基團(tuán)可以包含精氨酸基團(tuán)和/或賴氨酸基團(tuán)。其可以由精氨酸基團(tuán)組成。其 可以由賴氨酸基團(tuán)組成。其可以由賴氨酸和精氨酸基團(tuán)組成。其可以具有2到約15個(gè)賴 氨酸和/或精氨酸基團(tuán)。其可以是例如Re。其可以通過間隔區(qū)(spacer)與所述疏水部分 偶聯(lián)。因此所述陽離子寡肽部分可以包含與該陽離子寡肽基團(tuán)偶聯(lián)的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，所 述陽離子寡肽基團(tuán)依次再與間隔區(qū)偶聯(lián)。所述間隔區(qū)可以是相對(duì)親水的。其可以是寡肽基 團(tuán)。其可以是不帶電荷的。其可以是不帶電荷的寡肽基團(tuán)。其可以是1到約10個(gè)氨基酸 長(zhǎng)。其可以包括或由甘氨酸殘基組成。其可以是例如G3。如果該間隔區(qū)是寡肽基團(tuán)時(shí)，可 以通過其N端將其與疏水基團(tuán)連接。該間隔區(qū)可以額外或者另一選擇為包含含有官能團(tuán)的 氨基酸，諸如羧酸(例如天冬氨酸-D和谷氨酸-E)，胺(例如賴氨酸-K)以及羥基(例如絲 氨酸-S)。在這種情況下，該間隔區(qū)基團(tuán)可以通過所述官能團(tuán)與疏水部分偶聯(lián)。在一些實(shí)施方案中，所述陽離子寡肽基團(tuán)是R6并且間隔區(qū)是G3，其中末端甘氨酸 殘基通過其N端與疏水部分鍵合。
所述疏水部分可以是C4到C40基團(tuán)。其可以包含或者可以是類固醇基團(tuán)。該類 固醇基團(tuán)可以是膽固醇基團(tuán)。其可以包含或由疏水聚合物組成。該疏水聚合物可以是可生 物降解的。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗微生物物質(zhì)是CholG3R6TAT,其中Chol代表膽固醇基 團(tuán)，而TAT代表YGRKKRRQRRR。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該抗微生物物質(zhì)是CholG3K6TAT15在這 些實(shí)施方案的任一個(gè)中，該抗微生物物質(zhì)可以平均直徑小于約700nm的膠團(tuán)或納米顆粒分 散在水性基質(zhì)中。所述抗微生物物質(zhì)可以是膠團(tuán)或納米顆粒的形式。膠團(tuán)或納米顆粒的平均直徑為 約100到約700nm。所述抗微生物物質(zhì)可以具有針對(duì)枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和紙葡萄穗霉中任一 種、任選每一種小于約15 μ M的最低抑制濃度(MIC)。其可以具有針對(duì)細(xì)菌、酵母和真菌中 的一種、兩種或全部的活性。其可以具有針對(duì)細(xì)菌和真菌的活性。所述抗微生物物質(zhì)可以是能夠穿過血腦屏障的。在本發(fā)明的第二個(gè)方面中，提供了制備第一個(gè)方面兩親性抗微生物物質(zhì)的方法， 所述方法包含將疏水化合物與陽離子寡肽偶聯(lián)。下列選擇可以單獨(dú)地或者以任意合適的組合與第二個(gè)方面聯(lián)用。該方法可以包含將疏水化合物與陽離子寡肽的N端或所述陽離子寡肽的官能團(tuán) 反應(yīng)。該陽離子寡肽可以包含具有與其C端偶聯(lián)的陽離子寡肽基團(tuán)的不帶電荷的寡肽間隔 區(qū)，所述陽離子寡肽基團(tuán)具有與其C端偶聯(lián)的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。所述疏水化合物可以是鹵甲酸酯(haloformate ester)。所述方法還可以另外包括將抗微生物物質(zhì)分散到水中的步驟，以便在水中形成該 抗微生物物質(zhì)的納米顆粒或膠團(tuán)。納米顆?；蚰z團(tuán)每個(gè)均可以包含被親水殼包圍的疏水 核。在這種情況下，所述方法可以包括將一種或多種治療劑摻入納米顆?；蚰z團(tuán)的核中。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供一種制備第一個(gè)方面的兩親性抗微生物物質(zhì)的方法，所 述方法包括將類固醇氯甲酸酯與陽離子寡肽的N端偶聯(lián)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供一種制備第一個(gè)方面的兩親性抗微生物物質(zhì)的方法， 所述方法包括使用固態(tài)法合成陽離子寡肽，所述寡肽包括寡肽接頭部分，該接頭部分具有與其 C-端偶聯(lián)的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域；以及將類固醇氯甲酸酯與所述陽離子寡肽的N-端偶聯(lián)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供一種制備第一個(gè)方面的兩親性抗微生物物質(zhì)的方法， 所述方法包括使用固態(tài)法合成陽離子寡肽，所述寡肽包括寡肽接頭部分，該接頭部分具有與其 C-端偶聯(lián)的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域；將類固醇氯甲酸酯與所述陽離子寡肽的N-端偶聯(lián)以形成抗微生物物質(zhì)；以及在水性基質(zhì)中形成所述抗微生物物質(zhì)的膠團(tuán)或納米顆粒。本發(fā)明還提供由第二個(gè)方面的方法制備的兩親性抗微生物物質(zhì)。該兩親性抗微生 物物質(zhì)可以是納米顆?；蚰z團(tuán)的形式，每種均包括被親水殼包圍的疏水核。在這種情況下， 納米顆?；蚰z團(tuán)的核可以包括一種或多種治療劑。
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在本發(fā)明的第三個(gè)方面，提供一種殺死微生物的方法，包括將所述微生物暴露于 第一個(gè)方面的抗微生物物質(zhì)或由第二個(gè)方面的方法制備的抗微生物物質(zhì)。所述微生物可以是細(xì)菌，酵母或真菌或者可以是這些中任意兩種或全部的混合 物。微生物所暴露于的抗微生物物質(zhì)的濃度可以是小于約15 μ Μ。在第三個(gè)方面的方法的一些實(shí)施方案中，微生物是位于患者中的病原體。在這些 實(shí)施方案中，暴露的步驟可以包括給患者施用所述抗微生物物質(zhì)。病原體可以位于患者腦 內(nèi)。在這種情況下，暴露的步驟可以包括使得抗微生物物質(zhì)穿過所述患者的血腦屏障。在第三個(gè)方面的方法的其他實(shí)施方案中，殺死不包括給患者施用抗微生物物質(zhì)。 它可以不是用于治療患者病癥的方法。在本發(fā)明的第四個(gè)方面，提供第一個(gè)方面的或由第二個(gè)方面的方法制備的抗微生 物物質(zhì)在制備用于治療對(duì)象中感染的藥物中的用途，所述抗微生物物質(zhì)在所述感染的治療 中是有效的。所述感染可以是所述對(duì)象腦的感染。所述抗微生物物質(zhì)可以是納米顆?；蚰z團(tuán)的形式，每種均包括被親水殼包圍的疏 水核。在這種情況下，納米顆粒或膠團(tuán)的核可以包括一種或多種治療劑。所述一種或多種 治療劑可以在所述感染的治療中是有效的。所述藥物可適于將一種或多種治療劑輸送給對(duì)象。在本發(fā)明的第五個(gè)方面，提供第一個(gè)方面的或由第二個(gè)方面的方法制備的抗微生 物物質(zhì)在治療中的用途。在本發(fā)明的第六個(gè)方面，提供了藥物組合物，包括第一個(gè)方面的或由第二個(gè)方面 的方法制備的抗微生物化合物以及一種或多種藥學(xué)可接受的載體、稀釋劑和/或佐劑。所述抗微生物化合物可以是水性基質(zhì)中的納米顆?；蚰z團(tuán)的形式。膠團(tuán)或納米顆 ?？梢园鼑杷说挠H水殼。親水殼可以包含陽離子寡肽部分。疏水核可以包含疏水 部分。疏水核還可以包含疏水性物質(zhì)。疏水性物質(zhì)可以是治療性物質(zhì)，例如抗癌藥物，小分 子抗生素或其他合適的疏水性治療物質(zhì)。因此在一個(gè)實(shí)施方案中，提供一種兩親性抗微生物物質(zhì)的納米顆?；蚰z團(tuán)形式的 抗微生物化合物，所述物質(zhì)包含與陽離子寡肽部分偶聯(lián)的疏水部分，其中所述納米顆?；?膠團(tuán)的親水殼包含陽離子寡肽部分以及所述納米顆粒或膠團(tuán)的疏水核包含疏水部分和疏 水性治療物質(zhì)。附圖簡(jiǎn)述現(xiàn)參照附圖僅以舉例方式來描述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，其中

圖1顯示合理肽設(shè)計(jì)和肽納米顆粒的圖像a.具有(1)膽固醇，(2)甘氨酸，(3) 精氨酸和(4)TAT的經(jīng)設(shè)計(jì)的肽的示意圖；b和c 納米顆粒的掃描電子顯微照片。圖2顯示用13. 0μ M納米顆粒處理前(Al、Α2、Bi、Β2)和治療后30 (Β3)、90 (A3， Α4)、100 (Β4, Β5)和200分鐘(Β6)以及26. 0 μ M治療后90分鐘(Α5)的枯草芽孢桿菌(A) 和白色念珠菌(B)的掃描電子顯微照片。圖3顯示與兩性霉素B相比，納米顆粒溶血活性的劑量依賴性。圖4輸送加載FITC的納米顆粒穿過血腦屏障。靜脈注射后4小時(shí)大鼠的海馬腦切片。A. FITC ；B.加載FITC的納米顆粒。圖5顯示1339/1334比例作為DI水中肽濃度對(duì)數(shù)(LogC)函數(shù)的曲線圖。圖6顯示枯草芽孢桿菌(A)，白色念珠菌(B)和紙葡萄穗霉(C)的生長(zhǎng)作為溫育時(shí) 間的函數(shù)。在對(duì)數(shù)期終止葡萄穗霉I的溫育以避免由培養(yǎng)基蒸發(fā)和大塊菌絲形成而引起的 不準(zhǔn)確O.D.讀數(shù)。圖7顯示在肽納米顆粒和常規(guī)抗真菌劑存在時(shí)枯草芽孢桿菌(A，MIC 10. 7μΜ), 白色念珠菌(B,MIC :10.8μΜ)和紙葡萄穗霉(C,MIC :11.0μΜ)的劑量依賴性生長(zhǎng)抑制?；?于其生長(zhǎng)曲線(在圖5中)來選擇每種微生物的溫育時(shí)間。一旦達(dá)到穩(wěn)定期就終止溫育。圖8顯示在G3TAT存在時(shí)枯草芽孢桿菌(A，MIC 290. O μ Μ)和白色念珠菌(B，MIC 289. 0 μ Μ)的劑量依賴性生長(zhǎng)抑制。圖9顯示在G3R6TAT存在時(shí)枯草芽孢桿菌(A，MIC 75. 0 μ Μ)和白色念珠菌(B， MIC :75.0μ Μ)的劑量依賴性生長(zhǎng)抑制。圖10顯示在G3R12存在時(shí)枯草芽孢桿菌(A，MIC 242. 0 μ Μ)和白色念珠菌(B， MIC 242. ΟμΜ)的劑量依賴性生長(zhǎng)抑制。圖11顯示在G3R6存在時(shí)枯草芽孢桿菌(A，MIC > 444. 4 μ Μ)和白色念珠菌(B， MIC > 444. 4 μ Μ)的劑量依賴性生長(zhǎng)抑制。圖12顯示在青霉素G (A，MIC :1074μΜ)和強(qiáng)力霉素(B, MIC 13. 5μΜ)存在時(shí)(16 小時(shí)的溫育)枯草芽孢桿菌的劑量依賴性生長(zhǎng)抑制。圖13顯示G3R6TAT和CG3R6TAT的MALDI-T0F質(zhì)譜。G3R6TAT的譜顯示其理論分 子量為2667Da，表明肽的成功合成。CG3R6TAT的理論分子量是3080Da，其出現(xiàn)在CG3R6TAT 的譜中，表明膽固醇的成功綴合。圖 14 顯示 d-DMSO 中的 CG3R6TAT 和 G3R6TAT 的 IH-匪R 譜。δ 0. 7-1. 1 處的弱和 多重峰(信號(hào)a)來自膽固醇。δ 6. 7-8. 5處的多重峰(信號(hào)b)歸因于來自酪氨酸中苯環(huán) 的質(zhì)子。這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步證明膽固醇在肽上的成功綴合。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及陽離子核/殼納米顆粒，其是由含細(xì)胞穿透肽的基于兩親性寡肽的分 子自組裝而成的。它們可以被用作抗微生物劑。它們可以是能夠穿過血腦屏障(BBB)的。本發(fā)明提供一種兩親性抗微生物物質(zhì)，其包含與陽離子寡肽部分偶聯(lián)的疏水部 分。它可以包含或者基本上由與單個(gè)陽離子寡肽部分偶聯(lián)的單個(gè)疏水部分組成。因此它可 以具有結(jié)構(gòu)A-B，其中A是疏水部分而B是陽離子寡肽部分。疏水部分在寡肽部分內(nèi)不可以 重復(fù)。寡肽部分可以包括將疏水部分與陽離子寡肽部分的陽離子殘基連結(jié)的間隔區(qū)。間隔 區(qū)可以是相對(duì)親水的。它可以包含或可以由不帶電荷的寡肽基團(tuán)例如寡甘氨酸組成。所述 物質(zhì)可以是能夠穿過BBB的。它可以具有針對(duì)腦中感染微生物的活性。在本說明書中，使用下列氨基酸的單字母代碼酪氨酸-Y ；甘氨酸-G ；精氨酸-R ； 賴氨酸-K;谷氨酰胺-Q;組氨酸-H。這些與氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)單字母代碼一致。任何一個(gè)或多 個(gè)可以(獨(dú)立的)是天然存在的旋光異構(gòu)體或非天然存在的旋光異構(gòu)體。陽離子寡肽部分可以包括精氨酸殘基。它可以包括能夠提供陽離子特性的其他氨 基酸。它可以包括賴氨酸殘基。它可以包括單一類型的氨基酸(例如它可以是寡精氨酸 殘基)或它可以包括超過一種類型的氨基酸，例如2，3，4，5或6種類型的氨基酸。氨基酸
7可以成區(qū)塊(block)或可以不成區(qū)塊，或一些可以成區(qū)塊而一些可以不成區(qū)塊。陽離子寡 肽部分可以包括陽離子氨基酸(任選相同氨基酸)的區(qū)塊和非離子氨基酸(任選相同氨基 酸)的區(qū)塊。非離子氨基酸的區(qū)塊可以作為間隔區(qū)。非離子氨基酸的區(qū)塊可以與疏水部分 直接偶聯(lián)。陽離子寡肽部分的長(zhǎng)度可以為5和35個(gè)肽單元(即氨基酸殘基)之間，或者為 5 到 20，5 到 10，10 到 35，20 到 35，10 到 20 或 15 到 20，例如 5,6,7,8,9,10，11，12，13，14， 15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，30 或 35 肽單元。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，陽離子寡肽部分包含蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。此結(jié)構(gòu)域可 以使得抗微生物物質(zhì)穿過血腦屏障和/或可以增強(qiáng)細(xì)胞膜穿透。這可以有益于使得抗微生 物物質(zhì)用于治療腦疾病或產(chǎn)生增強(qiáng)的抗微生物活性。蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域可以是來自天然存在 蛋白的轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。它可以例如是來自人HIV-I (人類免疫缺陷病毒1型)的轉(zhuǎn)錄激活物 Tat蛋白的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。此轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域是TAT(YGRKKRRQRRR)。可以使用TAT的類似物， 其中進(jìn)行了一個(gè)或多個(gè)氨基酸的保守取代。在有關(guān)穿過BBB和/或增強(qiáng)細(xì)胞穿透方面，所 述類似物應(yīng)具有與TAT類似的特性。蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域可以是細(xì)胞穿透結(jié)構(gòu)域。蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié) 構(gòu)域可以是末端結(jié)構(gòu)域，即它可以位于兩親性抗微生物物質(zhì)分子的尾部(末端)。當(dāng)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié) 構(gòu)域是TAT時(shí)，TAT的末端R可以位于分子的尾部。末端位置可以使其相比位于在非末端 位置而具有更高的穿透BBB的活性。蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，如果存在的話，可以通過間隔區(qū)與疏水部分偶聯(lián)。合適的間隔區(qū) 包括寡肽間隔區(qū)。通常陽離子寡肽基團(tuán)位于蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和間隔區(qū)之間。陽離子寡肽基 團(tuán)可以包含精氨酸殘基和/或賴氨酸和/或組氨酸殘基以為其提供陽離子性質(zhì)。據(jù)認(rèn)為接 頭基團(tuán)的陽離子性質(zhì)可有助于抗微生物物質(zhì)的抗微生物活性。蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域也可有助于 抗微生物活性。間隔區(qū)和蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域之間陽離子基團(tuán)的存在可以影響抗微生物物質(zhì)的 構(gòu)象，尤其是當(dāng)采用納米顆粒或膠團(tuán)的形式時(shí)，從而使物質(zhì)更具生物活性。間隔區(qū)加陽離子 寡肽基團(tuán)的長(zhǎng)度可以為約5和到約15個(gè)肽單元之間，或者5到10，10到15或7到11，例 如5,6,7,8,9,10，11，12，13，14或15個(gè)肽單元。陽離子寡肽基團(tuán)可以包括單一類型的氨基 酸(例如它可以是寡精氨酸殘基)或它可以包括超過一種類型的氨基酸，例如2，3，4，5或 6種類型的氨基酸。氨基酸可以成區(qū)塊或可以不成區(qū)塊，或一些可以成區(qū)塊和一些可以不 成區(qū)塊。它可以例如包含雙區(qū)塊(diblock)寡肽。它可以包括雙塊寡肽，其中區(qū)塊的氨基 酸單元一個(gè)是陽離子的或任選兩個(gè)均是陽離子的。陽離子氨基酸殘基可以位于朝向寡肽基 團(tuán)的C端。寡肽基團(tuán)可以例如包含&或!16或1(6。間隔區(qū)可以包含或者由不帶電荷的或非 離子的肽殘基組成。它可以是相對(duì)親水的。它可以在疏水部分和陽離子寡肽部分之間具有 親水性中間物。它可以長(zhǎng)1到約6個(gè)肽單元，或長(zhǎng)約1到3，3到6或2到4個(gè)肽單元。它 可以是例如1，2，3，4，5或6個(gè)肽單元長(zhǎng)。它可以包含或由甘氨酸單元組成。間隔區(qū)的N端 氨基酸可以是甘氨酸。在這種情況下末端的甘氨酸殘基可以通過其N端與疏水部分鍵合。 如果存在的話，蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域可以通過陽離子氨基酸殘基的C端與陽離子氨基酸殘基鍵 合，例如精氨酸，賴氨酸或組氨酸。陽離子氨基酸殘基的C端可以與蛋白精氨酸，賴氨酸或 組氨酸。陽離子氨基酸殘基的C端可以與蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的N端鍵合(例如與TAT的Y)。疏水部分可以是任意合適的疏水基團(tuán)，從而使兩親性抗微生物物質(zhì)能夠在水性基 質(zhì)中形成膠團(tuán)。疏水部分可以是C4到C40基團(tuán)(即具有4到40個(gè)碳原子)，或C4到C20， C4 到 CIO, ClO 到 C20, C20 到 C30, C30 到 C40, C15 到 C25 或 C25 到 C35。它可以具有 4,5,6,7,8,9,10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，
33，34，35，36，37，38，39或40個(gè)碳原子。它可以是烴基。它可以是經(jīng)取代的。它可以是未 經(jīng)取代的。它可以是線性的。它可以是分枝的。它可以是環(huán)狀的。它可以是雙環(huán)的。它可 以是多環(huán)的。它可以是脂肪族的。它可以具有芳香族區(qū)。它可以源自天然產(chǎn)物。它可以包 含，或可以是，類固醇基團(tuán)，例如膽固醇基團(tuán)。它可以通過酰胺鍵，或氨基甲酸酯(氨基甲酸 乙酯)鍵，或其他的合適鍵與寡肽部分偶聯(lián)。疏水部分可以包含或由疏水聚合物組成。疏 水聚合物可以是可生物降解的。它可以例如是聚丙交酯，聚(丙交酯-共_乙交酯)，聚己 內(nèi)酯，聚碳酸酯或其他一些可生物降解的聚合物。疏水部分可以只與一個(gè)陽離子寡肽部分 偶聯(lián)，或它可以與超過一個(gè)陽離子寡肽部分偶聯(lián)，例如2，3，4，5，6，7，8，9，10或多于10個(gè)陽 離子寡肽部分。當(dāng)它與超過兩個(gè)陽離子寡肽部分偶聯(lián)時(shí)，所述物質(zhì)可以被認(rèn)為是星形聚合 物或樹枝狀分子。它可以采用核-殼結(jié)構(gòu)的形式，其中疏水部分位于核，陽離子寡肽部分位 于殼?？刮⑸镂镔|(zhì)可以例如是CholG3R6TAT,或 CholG3K6TAT,或 CholG3H6TAT,其中 Chol 代表通過氨基甲酸乙酯鍵與G偶聯(lián)的膽固醇基團(tuán)，TAT代表YGRKKRRQRRR。在一些情況下， 可以使用抗微生物物質(zhì)的混合物，例如上述所列的三種?？刮⑸镂镔|(zhì)可以是能夠形成膠團(tuán)或納米顆粒的。具體來說它可以是能夠在極性 (例如水性)基質(zhì)中形成膠團(tuán)或納米顆粒?；|(zhì)優(yōu)選是流體基質(zhì)?？梢酝ㄟ^膜透析法或溶 劑蒸發(fā)法或乳化法形成膠團(tuán)或納米顆粒。膠團(tuán)或納米顆粒可以在水性基質(zhì)中自發(fā)形成。它 們無需實(shí)質(zhì)上的機(jī)械作用(例如無需劇烈攪拌，超聲處理等等)就可以形成。當(dāng)物質(zhì)是在 該分子一端具有疏水部分并在另一端具有親水(陽離子寡肽)部分的兩親分子時(shí)，它可以 是能夠在適當(dāng)?shù)幕|(zhì)中進(jìn)行自組裝的。特別地，在極性基質(zhì)中，可以形成結(jié)構(gòu)，其中疏水部 分被埋藏遠(yuǎn)離極性基質(zhì)，而親水部分從疏水部分向外延伸指向極性基質(zhì)。合適的這類結(jié)構(gòu) 是膠團(tuán)或納米顆粒。這些可以被認(rèn)為是核-殼納米顆粒(或核_殼膠團(tuán))，其中核包括疏水 部分而殼包括親水(陽離子寡肽)部分?？梢詫⒅委焺┲T如抗癌藥或小分子抗生素?fù)饺牒?中，例如通過膜透析法或通過溶劑蒸發(fā)法或通過乳化法。本發(fā)明人認(rèn)為所述抗微生物物質(zhì) 的陽離子基團(tuán)與其抗微生物活性有關(guān)。因此如上所述的核_殼結(jié)構(gòu)將在殼中提供這些陽離 子基團(tuán)，使它們能夠接近并作用于微生物。適于誘導(dǎo)如上所述的自組裝的合適極性基質(zhì)包 括水性基質(zhì)，例如水，鹽溶液，水性生物體液(血液，唾液等)或其他水成液。當(dāng)殼包含蛋白 轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域時(shí)，它很有可能位于親水殼中。這很可能使得所述結(jié)構(gòu)域可用于促進(jìn)膠團(tuán)或納 米顆粒穿過BBB和/或穿透細(xì)胞?？刮⑸镂镔|(zhì)膠團(tuán)或納米顆粒通常具有平均直徑為約100到約700nm，或約100到 500，100 到 300，300 到 500，500 到 700 或 200 到 400nm,例如約 100，150，200，250，300，350， 400，450，500，550，600，650或700nm。它們可以是基本上單分散的。此直徑將取決于物質(zhì)的 精確性質(zhì)，包括疏水部分以及親水部分的大小和結(jié)構(gòu)。它們可以具有低多分散性指數(shù)。多分 散性指數(shù)可以小于約1，或小于約0.5，0.4或0.3，或可以是約0. 1到約1，或約0. 25到1， 0. 5 到 1，0. 1 到 0. 5,0. 1 到 0. 3 或 0. 2 到 0. 4，例如約 0. 1,0. 15，0. 2,0. 25，0. 3,0. 35，0. 4， 0. 45,0. 5,0. 55,0. 6,0. 65,0. 7,0. 75,0. 8,0. 85,0. 9,0. 95 或 1。它們的 zeta 電位可大于約 30，或大于約 40，50，60，70，80 或 90mV，或約 30 到 100，40 到 100，60 到 100，80 到 100，90 到 100，30 到 80，30 到 60，30 到 40，60 到 80，85 到 95 或 90 到 95mV,例如約 30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95或IOOmV。它們可以是帶很高電荷的。它們可以具有高的正
電荷。這類電荷提供顆粒的實(shí)質(zhì)穩(wěn)定性。抗微生物物質(zhì)可以具有針對(duì)多種微生物的活性(任選致死性)。它可以具有針對(duì) 細(xì)菌、酵母和真菌中一種或多種的活性。它可以是抗細(xì)菌劑。它可以是抗酵母劑。它可以 是抗真菌劑。它可以具有針對(duì)革蘭氏陽性細(xì)菌的活性。它可以具有針對(duì)其他類型微生物的 活性。它可以具有針對(duì)靶生物體的小于約20 μ M的最低抑制濃度(MIC)，或小于約15，10或 5μΜ，或約 2 到約 20，約 5 到 20，10 到 20，2 至Ij 10，2 至Ij 5 或 5 到 10 μ Μ，例如約 2,3,4,5,6, 7,8,9,10，11，12，13，14，15，16，17，18，19 或 20 μ Μ?？刮⑸镂镔|(zhì)能夠穿過血腦屏障(BBB)。它可以是能夠以足夠數(shù)量或足夠速率穿 過ΒΒΒ，從而實(shí)現(xiàn)針對(duì)對(duì)象腦中靶微生物的致死劑量。它可以是能夠穿透細(xì)胞壁從而進(jìn)入細(xì) 胞的?？梢酝ㄟ^包括將疏水化合物與陽離子寡肽偶聯(lián)的方法來制備本文所描述的兩親 性抗微生物物質(zhì)。疏水化合物可以對(duì)應(yīng)于前面描述的抗微生物物質(zhì)的疏水部分。它可以包括疏水 部分以及與其偶聯(lián)的官能團(tuán)(任選與其直接鍵合)，其中功官團(tuán)能夠與寡肽反應(yīng)(例如與 寡肽的N端)從而將疏水部分與寡肽偶聯(lián)(例如與寡肽的N端)。官能團(tuán)可以是鹵甲酸酯 (0C( = 0)Χ，其中X是鹵素)，例如氯甲酸酯或溴甲酸酯，從而與寡肽形成氨基甲酸酯鍵，或 它可以是?；u(C( = 0)X，其中X是鹵素)，例如?；然蝓；?，從而與寡肽形成酰胺 鍵，或它可以是能夠與寡肽N端反應(yīng)的其他合適官能團(tuán)，從而將疏水部分與寡肽偶聯(lián)。在一些實(shí)施方案中，間隔區(qū)包括官能團(tuán)。它可以例如包括帶有官能團(tuán)的氨基酸殘 基。在這些實(shí)施方案中，疏水化合物可以通過所述官能團(tuán)與陽離子寡肽偶聯(lián)。因此如果官 能團(tuán)是羧酸，疏水化合物可以帶有胺或羥基，以便分別通過酰胺或酯基與陽離子寡肽進(jìn)行 偶聯(lián)。如果官能團(tuán)是胺基或羥基，疏水化合物可以帶有羧酸基團(tuán)，以便分別通過酰胺或酯基 進(jìn)行偶聯(lián)。其他合適的偶聯(lián)反應(yīng)包括“click”反應(yīng)。例如，陽離子寡肽可以用疊氮基團(tuán)進(jìn) 行功能化，而疏水基團(tuán)可以含炔基，由此此二者可以反應(yīng)形成1，2，3-三唑鍵。陽離子寡肽可以對(duì)應(yīng)于前面所描述的陽離子寡肽部分。它可以包括具有NH2基團(tuán) 的所述寡肽部分作為其N末端。將疏水化合物與陽離子寡肽偶聯(lián)的步驟可以包括將疏水化合物溶液與陽離子寡 肽溶液混合。它還包括允許反應(yīng)進(jìn)行的足夠時(shí)間。所述足夠的時(shí)間可以是至少約1小時(shí)，或 至少約2，3，4，6，12，18或24小時(shí)，或可以是約1到約48小時(shí)，或約1到24，1到12，1到6， 6 到 48，12 到 48，24 到 48，6 至Ij 30，12 到 30，18 到 30 或 18 到 24 小時(shí)，例如約 1,2,3,6,12， 15，18，21，24，30，36，42或48小時(shí)?；旌虾徒酉聛淼姆磻?yīng)可以獨(dú)立地在約0到約25°C之間 進(jìn)行，或約0到20，0到15，0到10，0到5，5到25，10到25或5到10°C，例如在大約0,1, 2，3，4，5，10，15，20或251進(jìn)行。反應(yīng)時(shí)間可以取決于所使用的溫度。根據(jù)所使用的偶聯(lián) 反應(yīng)的性質(zhì)，偶聯(lián)反應(yīng)可以是堿催化的。合適的堿包括叔胺或吡啶，例如三乙胺，三丙胺，吡 啶等。溶劑應(yīng)當(dāng)能夠溶解疏水化合物和陽離子寡肽。在某些情況下對(duì)于陽離子寡肽和疏水 化合物可以使用不同的溶劑。在這種情況下，不同的溶劑可以是可混溶的，并且溶液應(yīng)當(dāng)以 一定比例混合以便使所得的溶劑混合物能夠溶解疏水化合物和陽離子寡肽。可以使用過量 摩爾的疏水化合物?？梢允褂眉s1.5到約20的過量摩爾(其中過量摩爾定義為所使用的疏水化合物摩爾數(shù)除以所使用的陽離子寡肽摩爾數(shù))，或約2到20，5到20，10到20，1. 5到 10，1. 5 到 5，2 至Ij 15，5 到 15 或 5 到 10，例如約 1. 5，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，
16，17，18，19或20。用于反應(yīng)的合適溶劑包括偶極非質(zhì)子溶劑諸如二甲基甲酰胺，二甲基 亞砜，六甲基磷酰胺，二噁烷，四氫呋喃等。在反應(yīng)后，可以去除溶劑。通常將使用能夠溶解 未反應(yīng)的疏水化合物但不溶解抗微生物化合物產(chǎn)物的合適溶劑來清洗殘留物。合適的溶劑 包括二乙醚。產(chǎn)物可以繼而被進(jìn)一步純化。合適的方法包括使用分子量截?cái)嘀?cut-off) 低于產(chǎn)物分子量的膜進(jìn)行透析。在某些情況下其他合適的方法可以包括制備型凝膠滲透層 析和制備型HPLC。一些情況下可以使用這類方法的組合。所述方法還可以包括制備陽離子寡肽的步驟。這可以通過固態(tài)合成或其他已知的 方法實(shí)現(xiàn)。特別是可以通過肽合成儀來制備陽離子寡肽。該方法可以使用Fmoc保護(hù)基。其 他合適的保護(hù)基包括t-Boc。它可以從寡肽的C端行進(jìn)到N端。它可以使用雙偶聯(lián)方法。 因此在所述合成的典型氨基酸加成步驟中，將過量的(例如約5mol當(dāng)量)的氨基酸與活化 劑和過量摩爾的堿(例如約IOmol當(dāng)量)一起暴露于樹脂(具有與其附著的正在增長(zhǎng)的寡 肽鏈)。合適的活化劑包括苯并三唑-1-基_氧基三吡咯烷基磷鐺六氟磷酸酯/鹽(benzo trizo 1-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexaf luorophosphate)。合適的減包括叔 胺諸如N-甲基嗎啉?？梢允褂萌鯄A諸如哌啶來達(dá)到Fmoc保護(hù)基的去除。可以使用酸如三 氟乙酸與合適的硅烷如三異丙基硅烷一起來將最終形成的寡肽與樹脂分離?？梢酝ㄟ^合適 的已知方法諸如HPLC來純化所分離的寡肽。所述方法可以另外包括將抗微生物物質(zhì)分散到水中的步驟，從而在水中形成抗微 生物物質(zhì)的納米顆粒或膠團(tuán)。用于實(shí)現(xiàn)這一目的的合適方法包括將抗微生物物質(zhì)溶于水混 溶性溶劑，并使用具有低分子量截?cái)嘀档耐肝瞿び盟畞硗肝鏊玫娜芤骸：线m的溶劑包括 偶極非質(zhì)子溶劑諸如二甲基甲酰胺，二甲基亞砜，二甲基乙酰胺，六甲基磷酰胺，二噁烷，四 氫呋喃等。優(yōu)選所述的水是凈化水，例如去離子水，蒸餾水，反滲透凈化水或其他合適的純 水。透析膜的截?cái)嘀悼梢孕∮诳刮⑸镂镔|(zhì)的分子量。它可以例如是約500到約1500，例 如約500，1000或1500。前面已經(jīng)描述了所得的膠團(tuán)或納米顆粒的特性。所述方法還可以包括將疏水物質(zhì)摻入到納米顆?；蚰z團(tuán)的核中。這可以通過膜透 析法或通過溶劑蒸發(fā)法或通過乳化法來實(shí)現(xiàn)。因此本發(fā)明還提供了水性基質(zhì)中的抗微生物物質(zhì)的膠團(tuán)溶液或納米顆粒懸液。納 米顆粒或膠團(tuán)溶液的膠團(tuán)可以包括疏水物質(zhì)。該疏水物質(zhì)可以位于納米顆?；蚰z團(tuán)的疏水 核中。該疏水物質(zhì)可以是治療性物質(zhì)。在這種情況下膠團(tuán)溶液或懸液可用于輸送治療性物 質(zhì)。水性基質(zhì)可以是如上所述的凈化水，或它可以是其他的水性基質(zhì)。在這種情況下，可以 通過向膠團(tuán)溶液或懸液添加(任選溶解)一種或多種其他物質(zhì)來對(duì)膠團(tuán)溶液或納米顆粒懸 液進(jìn)行精制。這些物質(zhì)可以例如包括用于維持滲透壓的鹽，或可以是用于抗微生物物質(zhì)的 佐劑，或可以是與抗微生物物質(zhì)聯(lián)用的另外的治療劑，或可以是其他類型的物質(zhì)。添加的這 類物質(zhì)的量將取決于它們的性質(zhì)和所需的活性。所述抗微生物物質(zhì)可以用于殺死微生物。因此暴露于所述抗微生物物質(zhì)的微生物 可以被有效殺死。根據(jù)具體應(yīng)用的性質(zhì)，所述抗微生物物質(zhì)可以采用如前所述的納米顆粒 水分散體或水膠團(tuán)溶液的形式，或可以純凈地使用，在溶液中，采用乳劑或洗劑或其他合適
11形式的。因此它可以內(nèi)部地、全身性地、局部地用于活的患者，或可用于表面消毒。特別是抗微生物物質(zhì)可以內(nèi)部地用于患者以治療內(nèi)部感染。在這種情況下所述物 質(zhì)可對(duì)患者具有低或可忽略的毒性。它可以具有足夠低的毒性，從而使能有效治療、控制或 治愈感染的抗微生物物質(zhì)的劑量對(duì)于患者來說是無毒的，或至少是非致死性的。它在針對(duì) 靶微生物的MIC或有效劑量下可以顯示低毒性。所述抗微生物物質(zhì)可以給患者口服施用， 或可以通過注射(皮下，靜脈內(nèi)，肌內(nèi)等)施用或它可以是鼻內(nèi)施用或它可以是通過其他途 徑(例如通過吸入)施用。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，抗微生物物質(zhì)能夠穿過BBB。這使 得這些實(shí)施方案尤其適用于治療患者腦內(nèi)的感染。經(jīng)施用抗微生物物質(zhì)的患者可以是人，或它可以是非人動(dòng)物。它可以是哺乳動(dòng)物， 例如非人哺乳動(dòng)物。它可以是鳥類。它可以是魚類。它可以是靈長(zhǎng)類，如狗，貓，牛，馬，綿 羊，山羊，小鼠，大鼠或其他靈長(zhǎng)類。它可以是家畜。它可以是寵物。它可以是農(nóng)畜。它可 以是野生的或未馴服的動(dòng)物。所述抗微生物物質(zhì)可以具有低的溶血活性。它可以具有針對(duì)紅細(xì)胞的低溶血活 性。在針對(duì)靶微生物的MIC它可以顯示出小于約30%的溶血作用，或小于約20，15，10或 5%，例如約 30，25，20，25，10，9，8，7，6，5，4，3，2，1 或 0% 的溶血作用。兩親性抗微生物物質(zhì)可以是可生物降解的。它可以適用于輸送位于抗微生物物質(zhì) 膠團(tuán)或納米顆粒的疏水核中的疏水性治療物質(zhì)。優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)說明在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及接枝膽固醇的陽離子肽，其適于用作對(duì)治 療腦感染具有廣譜活性的抗微生物劑。此肽含有膽固醇部分，3個(gè)甘氨酸殘基作為間隔區(qū)， 6個(gè)精氨酸殘基和細(xì)胞穿透肽，TAT。此肽在去離子(DI)水中具有31. 6mg/L(即10. 1 μ Μ) 的臨界膠團(tuán)濃度(CMC)(圖5)，并且在水溶液中可容易地自組裝形成31. 6mg/L或以上的陽 離子核/殼結(jié)構(gòu)的納米顆粒。這些納米顆粒是球形的并具有約300nm的平均直徑，zeta電 位為92mV。它們對(duì)枯草芽孢桿菌(細(xì)菌)，白色念珠菌(酵母)和紙葡萄穗霉(真菌)顯 示出低的最低抑制濃度(MIC)，分別為10. 7，10. 8和ΙΙ.ΟμΜ,比不含膽固醇的陽離子肽展 示出強(qiáng)得多的抗微生物能力。本發(fā)明人觀察到與該納米顆粒溫育在酵母表面誘導(dǎo)孔形成以 及誘導(dǎo)細(xì)菌的粗糙表面。它還加速細(xì)菌分裂，形成小細(xì)胞。納米顆粒和細(xì)胞壁之間的相互 作用導(dǎo)致細(xì)胞壁合成的抑制并因而導(dǎo)致細(xì)胞的滲透裂解。重要的是，已經(jīng)證明所述抗微生 物納米顆粒在大鼠模型中穿過血腦屏障(BBB)。這些陽離子自組裝的肽納米顆粒提供了有 希望的針對(duì)腦感染的抗微生物劑。本發(fā)明不限于本文所描述的具體優(yōu)選實(shí)施方案。例如肽的精氨酸殘基或甘氨酸殘 基的長(zhǎng)度可以是變化的，并且可以使用不同的疏水基團(tuán)。此外，精氨酸可以被賴氨酸(TAT 中的精氨酸未包括)取代。在某些應(yīng)用中，TAT可以不存在于化合物中。本發(fā)明人在此描述了由含有細(xì)胞穿透殘基的兩親性肽自組裝而成的陽離子核/ 殼納米顆粒，并證明了這些納米顆粒具有強(qiáng)的抗微生物活性。所述納米顆粒的低最低抑制 濃度(MIC)比沒有形成納米顆粒的那些親水陽離子肽的MIC低得多。據(jù)觀察與所述納米顆 粒溫育在酵母表面誘導(dǎo)孔形成和誘導(dǎo)細(xì)菌的粗糙表面以及加速分裂，形成小細(xì)胞。TAT (YGRKKRRQRRR)肽是來自人類免疫缺陷性病毒1型(HIV-1)的轉(zhuǎn)錄激活物Tat 蛋白的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。在與TAT綴合后，分子量為36到119kDa的蛋白(Schwarze，S. R.，Ho, A. , Vocero-Akbani, A. & Dowdy, S. F. In vivo protein transduction :delivery of a biologically active protein into themouse. Science 285,1569-1572(1999))禾口量 子點(diǎn)能夠穿過 BBB(Santra，S.，Yang, H.，Stanley, J. Τ.，Holloway, P. H.，Moudgi 1, B. Μ.， Walter, G. & Mericle, R. A. Rapid and effective labeling of brain tissue using TAT-con jugatedCdS: Mn/ZnS quantum dots. Chem. Commun. 25，3144-3146 (2005))。在本工 作中，構(gòu)建了兩親性肽(CholG3R6TAT),其含有細(xì)胞穿透肽TAT，6個(gè)精氨酸殘基(R6)，3個(gè)甘 氨酸部分(G3)作為間隔區(qū)以及膽固醇(Chol)作為疏水區(qū)塊(圖la)。此肽可以輕易形成 核/殼結(jié)構(gòu)的納米顆粒(即膠團(tuán))，其具有疏水膽固醇核和親水陽離子肽殼，所述殼含有朝 向周圍環(huán)境排列的TAT分子。納米顆粒的形成預(yù)期增加正電荷的局部密度，增強(qiáng)陽離子肽 的抗微生物特性。表面TAT分子的存在使這些納米顆粒能夠穿過BBB用于治療腦感染。通過固相法合成G3R6TAT15通過將膽固醇氯甲酸酯接枝到G的N-末端而獲得 CholG3R6TAT0此肽在水溶液中可以容易地自組裝形成納米顆粒。將IOmg CholG3R6TAT溶于 3mL 二甲基亞砜(DMSO)，并使用分子量截?cái)嘀禐?，000的透析膜(Spectra/Por 7，Spectrum Laboratories Inc.)在室溫(22°C )用500mL去離子(DI)水透析24小時(shí)。每6個(gè)小時(shí)更 換外部水相。將所得的納米顆粒使用具有動(dòng)態(tài)光散射能力的zeta電位分析器(ZetaPlus. Brookhaven, U. S. Α.)來進(jìn)行鑒定。它們的有效直徑和zeta電位分別為300nm(多分散 性指數(shù)是0.25)和92士2mV。該納米顆粒實(shí)質(zhì)上是球形的，在空氣中自干燥后其大小小于 150nm(圖 lb)。在臨床實(shí)踐中，在鑒別具體病原體前通常按照經(jīng)驗(yàn)用具有廣譜抗微生物活性的抗 生素治療腦膜炎患者，因?yàn)槿魏沃委煹难泳彾伎赡茉斐伤劳龊桶l(fā)病。因此，作為抵御腦感染 的潛在抗微生物劑的肽必須能夠殺死細(xì)菌和真菌。針對(duì)枯草芽孢桿菌(革蘭氏陽性細(xì)菌)， 白色念珠菌(酵母)和紙葡萄穗霉(真菌)評(píng)估了肽和陽離子肽納米顆粒的MIC。納米 顆粒顯示抗菌和抗真菌活性，并且它們針對(duì)枯草芽孢桿菌，白色念珠菌和紙葡萄穗霉的MIC 分別是10. 7，10. 8和11. O μ M(參見圖6和7)。G3TAT具有低抗微生物活性，并且其針對(duì)枯 草芽孢桿菌和白色念珠菌的MIC分別是290. O和289. O μ M(圖8)。給TAT添加6個(gè)精氨酸 殘基(即G3R6TAT)顯著降低MIC(對(duì)于枯草芽孢桿菌和白色念珠菌分別是290.0和289.0 對(duì)75. O μ Μ)(圖9)。TAT的存在不僅僅提供正電荷，因?yàn)镚3R12針對(duì)枯草芽孢桿菌和白色 念珠菌的MIC比G3R6TAT高得多(242. O對(duì)75. O μ Μ)(圖10)。TAT的細(xì)胞穿透特性一定在 抑制微生物的生長(zhǎng)中發(fā)揮了作用，并且給G3R6添加TAT極大增強(qiáng)了其抗微生物活性(MIC 75. O對(duì)> 444. 4 μ Μ)(圖11)。然而，G3R6TAT的MIC仍比由兩親性肽自組裝而成的納米顆粒 要高得多(10. 7對(duì)75. O μ Μ)。核/殼納米顆粒的形成增強(qiáng)了肽的抗微生物能力，導(dǎo)致更低 的MIC。此外，與常規(guī)抗真菌劑諸如氟康唑和兩性霉素B相比，納米顆粒在抑制紙葡萄穗霉 的增殖方面要更有效得多^1(:11.(^11分別對(duì)>817.0和>54.(^10(圖70。另外，在 殺死枯草芽孢桿菌方面納米顆粒也優(yōu)于常規(guī)的抗生素諸如青霉素G和強(qiáng)力霉素優(yōu)越(MIC 11. O 分別對(duì) 6720 禾口 13. 5 μ Μ)(圖 12)。然后，在與致死劑量的納米顆粒溫育不同時(shí)段之前和之后對(duì)枯草芽孢桿菌和白 色念珠菌的形態(tài)變化進(jìn)行了研究。未處理的枯草芽孢桿菌顯示光滑表面(圖2Α1和Α2)。 與此形成鮮明的對(duì)比，在用13. O μ M納米顆粒處理90分鐘后細(xì)胞表面變得極端粗糙，形 成大量小細(xì)胞，并觀察到細(xì)胞碎片(圖2Α3和Α4)。用26. O μ M納米顆粒處理90分鐘導(dǎo)
13致更多的細(xì)胞碎片(圖2A5)。在用陽離子肽抗生素乳鏈菌肽處理的枯草芽孢桿菌中也 觀察到小細(xì)胞的形成。納米顆粒可能具有類似于乳鏈菌肽的針對(duì)枯草芽孢桿菌的作用機(jī) 制。通過非特異性靜電相互作用將納米顆粒攝取進(jìn)入細(xì)胞壁加速細(xì)胞分裂，引起小細(xì)胞 形成。本發(fā)明人認(rèn)為納米顆粒在細(xì)胞壁中提供的位阻現(xiàn)象以及陽離子肽和細(xì)胞壁肽聚糖 之間的氫鍵/靜電相互作用(所述肽聚糖由β鍵中交替的N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞 壁酸通過短肽主干(ρ印tide stem)交聯(lián)而成的聚合物形成)，可能抑制細(xì)胞壁合成，導(dǎo)致 細(xì)胞的滲透裂解。白色念珠菌經(jīng)歷不同的形態(tài)變化(圖2B1至B6)。用13.0μΜ的納米 顆粒處理30分鐘后在細(xì)胞表面形成大小小于50nm的許多孔(圖2B3)。細(xì)胞壁被有效破 壞并且100分鐘后因?yàn)榧?xì)胞壁合成的抑制而使原生質(zhì)體暴露(圖2B4和B5)。在第200 分鐘時(shí)，由于滲透裂解大多數(shù)原生質(zhì)體破裂成碎片(圖2B6)。在細(xì)胞壁合成抑制引起的 滲透裂解機(jī)制之外，納米顆?？赡苡捎赥AT的存在而滲透穿過兩種生物體的細(xì)胞質(zhì)膜，基 于電穿孔和/或沉排模型(sinking raft model)使膜失去穩(wěn)定性(Chan, D. L，Prenner, Ε. J. & Vogel,H. J. Tryptophan-andarginine—rich antimicrobial peptides Structures and mechanisms of action. Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes 1758, 1184-1202(2006))。對(duì)大鼠紅細(xì)胞與納米顆粒和兩性霉素B溫育后誘導(dǎo)的溶血進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。 納米顆粒在低濃度時(shí)顯示出低溶血活性(圖3)。在高于MIC的濃度，16. O μ M(即50mg/L)， 對(duì)于納米顆粒觀察到小于20%的溶血作用，而兩性霉素B甚至在低于其MIC的濃度時(shí)介導(dǎo) 高于90%的溶血作用。為了確定納米顆粒是否能夠穿過BBB，在靜脈注射FITC或加載FITC的納米顆粒 4小時(shí)后觀察大鼠海馬腦切片中的FITC分布。首先將FITC加載入CholG3R6TAT納米顆粒。 將0. 35mg FITC和2. 3mg CholG3R6TAT溶于ImL DMS0，然后用分子量截?cái)嘀禐?，OOODa的透 析袋在10°C用500mL DI水透析三天。更換外部水相6次。按重量計(jì)FITC含量為5. 3%， 加載FITC的納米顆粒的有效直徑為356nm。裸FITC不能穿過BBB(圖4A)。與此相反，加 載FITC的納米顆粒穿過BBB，主要包圍在神經(jīng)元的細(xì)胞核周圍(圖4B，白色箭頭)。總之，已經(jīng)證明兩親性肽CholG3R6TAT能夠自組裝成陽離子核/殼納米顆粒。這些 納米顆粒具有廣譜抗微生物活性。它們以低MIC有效抑制細(xì)菌(格蘭氏陽性)和真菌的生 長(zhǎng)，并誘導(dǎo)相對(duì)低的溶血。此外，它們能夠穿過BBB，在治療腦感染中提供了巨大潛力。
實(shí)施例肽合成使用Apex 396肽合成儀(Aapptec，U. S. A.)按照9_芴甲氧羰酰(Fmoc)方法合 成 GGGRRRRRRYGRKKRRQRRR(G3R6TAT)。使用雙偶聯(lián)法在 Fmoc-Arg(Pbf)-Rink Amide-MBHA 樹脂(LC Sciences, U. S. Α.)上以0. Immol尺度組裝肽。簡(jiǎn)短來說，樹脂與5個(gè)當(dāng)量的氨 基酸，5個(gè)當(dāng)量的活化劑，苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷鐺六氟磷酸酯/鹽(PyBOP， LC Sciences, U.S.A.)和10個(gè)當(dāng)量的堿N-甲基嗎啉(NMM，Merk)反應(yīng)。通過在二甲基 甲酰胺(DMF，Sigma-Aldrich)中的20%哌啶(Merk)中溫和攪拌去除Fmoc基團(tuán)。在肽合 成后，利用體積比為95 2. 5 2. 5的三氟乙酸(TFA，Merk)，三異丙基硅烷(TIS，Merk) 和水的混合物進(jìn)行肽與樹脂的裂解4-6小時(shí)。溶液通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)以及隨后在冷的二乙醚(Sigma-Aldrich)中沉淀而進(jìn)行濃縮。通過過濾收集粗制的肽并在真空下干燥。然后使用高 效液相層析(HPLC)進(jìn)一步純化粗制的肽，所述高效液相層析由Waters 2767樣品管理器， Waters 996 PDA 檢測(cè)器(Waters Corporation，U. S. A.)和 Grace Vydac C18 柱(10x250mm) 組成。流動(dòng)相由含有0. 1% TFA的水和包含0. 1% TFA的乙腈組成，并在SmL/分鐘的流速 下將乙腈的體積百分比在20分鐘內(nèi)從5%逐漸增加到40%。通過分析型反相HPLC和基質(zhì) 輔助激光解吸離子化-飛行時(shí)間(MALDI-T0F)質(zhì)譜(Autoflex II,Bruker Daltronics)來 對(duì)所述肽進(jìn)行鑒定(圖13)。根據(jù)HPLC分析發(fā)現(xiàn)肽的純度為約95%。通過G的N-末端將膽固醇氯甲酸酯接枝到G3R6TAT而獲得CholG3R6TAT15在0°C 攪拌下將溶于15mL DMF的膽固醇氯甲酸酯(Sigma-Aldrich，148mg)緩慢添加至5mL含有 70 μ L三乙胺(Fluka)和88mgG3R6TAT的DMF中。在反應(yīng)24小時(shí)后，通過吹掃(purge)干 燥氮?dú)鈴幕旌衔锶コ鼶MF，然后用二乙醚清洗混合物3次以去除未反應(yīng)的膽固醇氯甲酸酯。 使用分子量截?cái)嘀禐?，OOODa的膜用DMF透析6天以進(jìn)一步純化粗產(chǎn)物。然后通過真空干 燥去除DMF以產(chǎn)生終產(chǎn)物。通過MALDI-T0F和1H-WR分析證明了 CholG3R6TAT的成功合 成(參見圖13和14)。最低抑制濃度(MIC)的確定枯草芽孢桿菌，白色念珠菌和紙葡萄穗霉(ATCC)分別在37°C的胰胨豆胨培養(yǎng)基、 24V的酵母霉菌培養(yǎng)基和26°C的胰胨豆胨培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。利用培養(yǎng)基微量稀釋法來測(cè) 定肽或肽納米顆粒的MIC。簡(jiǎn)短來說，將50 μ L濃度為7. 1到142 μ M的肽和肽納米顆粒溶 液置于96孔板的每個(gè)孔中。將50 μ L微生物溶液添加到每個(gè)孔中以得到600nm處0. 1到 0.2的光密度讀數(shù)。對(duì)于枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和紙葡萄穗霉分別將細(xì)胞培養(yǎng)物溫育 15，12/16和170小時(shí)，在觀察不到生長(zhǎng)的濃度取得MIC。只含有細(xì)胞的培養(yǎng)基被用作對(duì)照。 試驗(yàn)重復(fù)三次。掃描電子顯微術(shù)(SEM)利用在5. OkeV加速電壓下運(yùn)行的場(chǎng)致發(fā)射SEM(JE0L JSM-7400F)觀察肽或肽納 米顆粒處理之前和之后的肽納米顆粒以及微生物的形態(tài)。對(duì)于肽納米顆粒，將20 μ L納米 顆粒溶液置于硅晶片上，并在室溫下風(fēng)干。將晶片固定于鋁釘(aluminum stud)上，然后用 鉬包被用于可視化。通過在2500g離心10分鐘收集在培養(yǎng)基中單獨(dú)生長(zhǎng)的或與肽或肽納米顆粒一起 溫育的微生物。用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌細(xì)胞三次，然后在含有5%甲醛的PBS中固 定一天。在用一系列乙醇清洗進(jìn)行脫水前用DI水進(jìn)一步洗滌細(xì)胞，然后在臨界點(diǎn)干燥器 (Autosamdri-815, Tousimis ResearchCorporation, U. S. A.)中干燥，固定于招釘上。在 SEM分析前用鉬包被樣品。溶血作用測(cè)驗(yàn)用PBS將新鮮的大鼠紅細(xì)胞洗滌3次。將100 μ L懸浮于PBS的紅細(xì)胞(4%按體 積計(jì))置于96孔板的每個(gè)孔中，然后向每孔添加100 μ L肽納米顆?；騼尚悦顾谺溶液。將 板在37°C溫育1小時(shí)。取出細(xì)胞懸液，并在IOOOg離心5分鐘。將等份(100 μ L)上清轉(zhuǎn) 移到96孔板，利用微板讀數(shù)器(Bio-Tecklnstruments，Inc)在576nm監(jiān)測(cè)血紅蛋白釋放。 使用下列公式計(jì)算溶血作用百分比溶血作用(％)=[(納米顆粒溶液中的O.D.57ta-PBS 中的 0. D. 576J/(0. 1% Triton X-100 中的 0. D. 576nm-PBS 中的 0. D. 576J ] X 100。
體內(nèi)研究所有涉及動(dòng)物的程序均得到DSO IA⑶C委員會(huì)的批準(zhǔn)，并且按照National Institute of Health Guide for the Care and Use of LaboratoryAnimals (NIH Publications NO. 85-23，1996年修訂)中闡述的指南進(jìn)行。通過尾靜脈給10周大的SD成 年大鼠(重量為250g)注射純FITC或加載FITC的納米顆粒溶液。注射后4小時(shí)處死動(dòng)物。 給它們灌注Ringer' s溶液，然后是4%多聚甲醛(pH7. 4)。在灌注后，取出腦，在類似固定 劑中保存2小時(shí)。然后將它們?cè)?°C含有20%蔗糖的0. IM磷酸鹽緩沖液中保存過夜。切 出30 μ m厚的大腦冷凍冠狀切片，并在低溫恒溫器中用PBS清洗，然后放于載片上。利用共 焦顯微鏡(Olympus Fluoview TM1000)觀察樣本。
權(quán)利要求
一種兩親性抗微生物物質(zhì)，其包含與陽離子寡肽部分偶聯(lián)的疏水部分。
2.權(quán)利要求1的抗微生物物質(zhì)，其中所述陽離子寡肽部分包含精氨酸殘基和/或賴氨酸殘基。
3.權(quán)利要求1或2的抗微生物物質(zhì)，其中所述陽離子寡肽部分的長(zhǎng)度在5和35個(gè)肽單 元之間。
4.權(quán)利要求1到3中任一項(xiàng)的抗微生物物質(zhì)，其中所述陽離子寡肽部分包含蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo) 結(jié)構(gòu)域。
5.權(quán)利要求4的抗微生物物質(zhì)，其中所述蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域是末端結(jié)構(gòu)域。
6.權(quán)利要求4或5的抗微生物物質(zhì)，其中所述蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域是TAT(YGRKKRRQRRR)。
7.權(quán)利要求4到6中任一項(xiàng)的抗微生物物質(zhì)，其中所述蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域與陽離子寡肽基團(tuán)偶聯(lián)。
8.權(quán)利要求7的抗微生物物質(zhì)，其中所述陽離子寡肽基團(tuán)包含精氨酸基團(tuán)和/或賴氨酸基團(tuán)。
9.權(quán)利要求8的抗微生物物質(zhì)，其中所述陽離子寡肽基團(tuán)具有2到約15個(gè)賴氨酸和/或精氨酸基團(tuán)。
10.權(quán)利要求7到9中任意一項(xiàng)的抗微生物物質(zhì)，其中所述陽離子寡肽基團(tuán)通過接頭基 團(tuán)與疏水部分偶聯(lián)。
11.權(quán)利要求10的抗微生物物質(zhì)，其中所述接頭基團(tuán)是寡肽基團(tuán)。
12.權(quán)利要求7到11中任意一項(xiàng)的抗微生物物質(zhì)，其中所述陽離子寡肽基團(tuán)是R6，所 述接頭基團(tuán)是G3,其中末端甘氨酸殘基通過其N端與疏水部分鍵合。
13.權(quán)利要求1到12中任意一項(xiàng)的抗微生物物質(zhì)，其中所述疏水部分是C4到C40基團(tuán) 或疏水性可生物降解的聚合物。
14.權(quán)利要求1到13中任意一項(xiàng)的抗微生物物質(zhì)，其中所述疏水部分包含類固醇基團(tuán)。
15.權(quán)利要求14的抗微生物物質(zhì)，其中所述類固醇基團(tuán)是膽固醇基團(tuán)。
16.權(quán)利要求1到15中任意一項(xiàng)的抗微生物物質(zhì)，其是CholG3R6TAT,其中Chol代表膽 固醇基團(tuán)，TAT代表YGRKKRRQRRR。
17.權(quán)利要求1到16中任意一項(xiàng)的抗微生物物質(zhì)，所述物質(zhì)是膠團(tuán)或納米顆粒的形式。
18.權(quán)利要求17的抗微生物物質(zhì)，其中所述膠團(tuán)或納米顆粒具有約100到約700nm的 平均直徑。
19.權(quán)利要求1到18中任意一項(xiàng)的抗微生物物質(zhì)，所述物質(zhì)針對(duì)枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis),白 fe i _ 胃(Candida albicans)禾口 罾 H β (Stachybotrys chartarum)中每一種具有小于約15 μ M的MIC。
20.一種制備權(quán)利要求1到19中任意一項(xiàng)的兩親性抗微生物物質(zhì)的方法，所述方法包 括將疏水化合物與陽離子寡肽偶聯(lián)。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述偶聯(lián)包括將疏水化合物與陽離子寡肽的N端或與陽 離子寡肽中的官能團(tuán)反應(yīng)。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述陽離子寡肽包含具有與其C-端偶聯(lián)的陽離子寡肽基 團(tuán)的不帶電荷的寡肽間隔區(qū)，所述陽離子寡肽基團(tuán)具有與其C-端偶聯(lián)的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。
23.權(quán)利要求20到22中任意一項(xiàng)的方法，其中所述疏水化合物是鹵甲酸酯。
24.權(quán)利要求20到23中任意一項(xiàng)的方法，另外包含將抗微生物物質(zhì)分散到水中的步 驟，從而在水中形成抗微生物物質(zhì)的納米顆?；蚰z團(tuán)。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述納米顆?；蚰z團(tuán)每個(gè)均包含被親水殼包圍的疏水 核，并且所述方法包括將一種或多種治療劑摻入到納米顆?；蚰z團(tuán)的核內(nèi)。
26.—種殺死微生物的方法，包含將所述微生物暴露于權(quán)利要求1到19中任意一項(xiàng)的 抗微生物物質(zhì)。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述微生物選自以下所組成的組細(xì)菌，酵母和真菌以及 這些中任意兩種或全部的混合物。
28.權(quán)利要求26或27的方法，其中微生物所暴露于的抗微生物物質(zhì)的濃度小于約 15 μ Μ。
29.權(quán)利要求26到28中任意一項(xiàng)的方法，其中所述微生物是位于患者中的病原體，并 且暴露步驟包括給患者施用所述抗微生物物質(zhì)。
30.權(quán)利要求29的方法，其中所述病原體位于患者腦內(nèi)，并且暴露步驟包括讓抗微生 物物質(zhì)穿過所述患者的血腦屏障。
31.權(quán)利要求1到19中任意一項(xiàng)的抗微生物物質(zhì)在制備用于治療患者感染的藥物中的 用途，所述抗微生物物質(zhì)在所述感染的治療中是有效的。
32.權(quán)利要求31的用途，其中所述感染是對(duì)象的腦感染。
33.權(quán)利要求1到19中任意一項(xiàng)的抗微生物物質(zhì)在治療中的用途。
34.一種藥物組合物，包含權(quán)利要求1到19中任意一項(xiàng)的抗微生物化合物與一種或多 種藥學(xué)可接受的載體、稀釋劑和/或佐劑。
35.權(quán)利要求34的藥物組合物，其中所述抗微生物化合物是水性基質(zhì)中的納米顆?；?膠團(tuán)的形式。
36.權(quán)利要求35的藥物組合物，其中所述納米顆粒或膠團(tuán)每個(gè)均包含被親水殼包圍的 疏水核，并且一種或多種治療劑存在于納米顆?；蚰z團(tuán)的核中。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種兩親性抗微生物物質(zhì)，其包含與陽離子寡肽部分偶聯(lián)的疏水部分。所述陽離子寡肽部分可以包含與陽離子寡肽基團(tuán)偶聯(lián)的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。
文檔編號(hào)C07K7/08GK101945887SQ200880127021
公開日2011年1月12日 申請(qǐng)日期2008年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月18日
發(fā)明者L·劉, 楊義燕 申請(qǐng)人:新加坡科技研究局