專利名稱：HIV p17蛋白的一種截短形式的制作方法
HIV p1 7蛋白的一種截短形式本發(fā)明總體而言屬于免疫學(xué)領(lǐng)域，特別涉及HIV pl7蛋白的一種截短形式，其特別 適合用作抗HIV-I病毒的疫苗。開發(fā)一種有效的抗HIV-I疫苗是全世界科學(xué)界的主要目標(biāo)之一。所述疫苗必須首 先能夠同時引起顯著的細(xì)胞應(yīng)答和有力的體液活性發(fā)展，后者的特征在于產(chǎn)生能夠中和病 毒感染性的抗體。在最近幾年中，科學(xué)界的注意力已轉(zhuǎn)到源于病毒的多肽用作抗病毒疫苗設(shè)計的基 石出。pl7蛋白，其構(gòu)成HIV-I病毒的基質(zhì)，從所述觀點來看是特別令人感興趣的一種生 物靶。實際上，盡管已被分類為結(jié)構(gòu)蛋白，現(xiàn)在明確P17在病毒復(fù)制周期的多個階段行使 多種功能，從病毒進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，到病毒遺傳物質(zhì)整合到細(xì)胞遺傳物質(zhì)，再到新病毒顆粒的組 裝，因此不僅在病毒結(jié)構(gòu)中而且在HIV-I復(fù)制周期中起到了極其重要的作用。近期研究已能指出pl7的結(jié)構(gòu)與人促炎因子Y干擾素非常相似。此外，細(xì)胞生物 學(xué)研究已能指出P17調(diào)控來自天然或適應(yīng)性區(qū)域的多種免疫系統(tǒng)細(xì)胞的生物學(xué)活性的能 力。具體而言，P17對HIV-I的優(yōu)先目標(biāo)CD4+T淋巴細(xì)胞亞群的活性已顯示所述病毒蛋白能 夠通過激活所述淋巴細(xì)胞以刺激它們，因而使其更易受病毒感染。另外，P17能夠誘導(dǎo)激活 的T淋巴細(xì)胞向細(xì)胞培養(yǎng)微環(huán)境釋放促炎細(xì)胞因子，例如γ干擾素和腫瘤壞死因子α，因 而產(chǎn)生最適HIV-I復(fù)制的有利環(huán)境。ρ17作為“病毒因子”的活性取決于所述蛋白與靶細(xì)胞表面表達(dá)的特異性受體的直 接相互作用。從生物學(xué)觀點來看，ρ17能夠通過影響功能和誘導(dǎo)HIV-I復(fù)制活性增加而作用于 HIV-I靶細(xì)胞的事實，使得該蛋白被認(rèn)為是建立抗AIDS疫苗接種策略的優(yōu)秀靶標(biāo)。一個重 要的先決條件是P17應(yīng)從HIV-I感染的細(xì)胞釋放到細(xì)胞微環(huán)境。實際上，在體外HIV-I感 染的H9細(xì)胞釋放大量pl7到細(xì)胞培養(yǎng)上清液。另外，最近已證實pl7在HIV-I血清陽性患 者的淋巴結(jié)以及抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法(HAART)中以蛋白沉積物存在。令人感興趣地注意到在 沒有病毒顆粒和/或病毒基因組存在下可在淋巴結(jié)組織中檢測到P17。這表明，如其它HIV 結(jié)構(gòu)蛋白所證實，P17獨立于病毒存在而作為外源蛋白作用于某些靶細(xì)胞。這解釋了某些 研究者獲得的數(shù)據(jù)，所述數(shù)據(jù)指出了高水平抗P17中和抗體的存在與獲得性免疫缺陷綜合 征進(jìn)展的顯著延遲之間的聯(lián)系。由于P17在病毒結(jié)構(gòu)中位于糖蛋白衣殼之內(nèi)，因而抗體不 能接觸，在發(fā)現(xiàn)P17由感染細(xì)胞釋放之前無法解釋所述數(shù)據(jù)。國際專利申請W003/016337描述了從HIV pl7分離的短肽，其代表pl7中和表位 (殘基9到22)，其作為疫苗施用時能夠產(chǎn)生中和免疫應(yīng)答。但是，使用僅代表有限表位區(qū)域的肽作為疫苗制劑的基礎(chǔ)或者作為能夠刺激并引 起體液免疫應(yīng)答的分子顯示出某些缺點，主要的一點取決于肽通常表現(xiàn)出與全長蛋白顯示 不同的構(gòu)象的事實。因此，用此類肽免疫生產(chǎn)的抗體導(dǎo)致對天然病毒蛋白識別不佳，并因此 產(chǎn)生低效體液免疫應(yīng)答。國際專利申請W003/082908描述了使用全長pl7蛋白作為疫苗以引起能夠中和人類細(xì)胞上P17發(fā)揮的免疫刺激活性的免疫應(yīng)答。但是，使用所述全長蛋白作為疫苗顯示出 缺點，即所施用的全長蛋白可具有與天然病毒蛋白相同的有害生物效應(yīng)。為克服所述缺點，本發(fā)明提供了 pl7蛋白的一種截短形式，稱為“AT96”，其顯示與 全長P17蛋白相同的免疫學(xué)特性，但不顯示所述全長蛋白的典型有害生物活性。本發(fā)明的截短AT96蛋白由pl7蛋白的氨基酸1_96組成。優(yōu)選地，AT96由序列表 中SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列編碼。更優(yōu)選地，AT96具有序列表中SEQ ID N0:2所示 的氨基酸序列。本發(fā)明的截短AT96蛋白是一種非常有希望的抗HIV治療分子，因為如下面實驗章 節(jié)說明，即使其缺少對天然蛋白生物活性重要的P17羧基末端(即氨基酸97-132)，其仍然 保留免疫原性上重要的表位，即能促進(jìn)中和細(xì)胞介導(dǎo)的和體液的免疫應(yīng)答的表位。本發(fā)明的截短AT96蛋白已使用本身已知的重組DNA方法生產(chǎn)。簡單來說，所述AT96蛋白通過擴(kuò)增編碼pl7的氨基酸1_96的核苷酸序列并將其 克隆到原核PGEX-4T表達(dá)載體(GE Healthcare)中生產(chǎn)。該核苷酸序列通過從源自BHlO 病毒株(NCBI登錄號M15654)的全長pl7的編碼序列開始的突變PCR而獲得。使用的全長 P17的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO :3所示，對應(yīng)的所編碼氨基酸序列如SEQ ID NO 4所示。通過使用特別設(shè)計的誘變AT96BamHI和AT96EC0RI引物，建立如下a) AT96編碼序列上游的BamHI限制性位點，其對于隨后克隆到原核pGEX_4T表達(dá) 載體是必須的，并設(shè)計產(chǎn)生能夠與所述載體編碼的谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)以融合蛋白形式 表達(dá)AT96的限制性克?。灰约癰)編碼pl7的氨基酸96的GAC三聯(lián)體下游的終止密碼子和EcoRI限制性位點，其 對于隨后克隆到PGEX-4T是必須的。AT96BamHI和AT96EC0RI引物的序列分別如序列表中SEQ ID NO :5禾口 SEQ ID NO 6所示。所述擴(kuò)增反應(yīng)(終體積200 μ 1)使用20ng包含全長pl7核苷酸序列的質(zhì)粒作為 模板進(jìn)行。所述PCR反應(yīng)使用的條件如下94°C，30秒；50°C，30秒；72°C，60秒；共30個循 環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物使用標(biāo)準(zhǔn)程序純化(Qiaquick PCR Purification Kit，Qiagen)，然后使用限 制性內(nèi)切酶BamHI和EcoRI消化，最后克隆到使用相同限制性內(nèi)切酶預(yù)先消化的pGEX_4T 質(zhì)粒的多克隆位點。所得構(gòu)建體(PGEX-AT96)使用Big Dye Terminator labeling (Applied Biosystems)測序，結(jié)合測序儀和毛細(xì)管色譜(ABI PRISM 7700)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序分析。重組DNA技術(shù)也用于根據(jù)本身已知方法生產(chǎn)所述AT96蛋白。所述pGEX-AT96構(gòu)建體(20ng)通過電穿孔引入E. coli (BL21)，所述轉(zhuǎn)化細(xì)菌在 包含氨芐青霉素的平板上選擇。所選菌落中AT96插入片段的存在通過質(zhì)粒DNA的提取、純 化、和限制性酶切檢查。陽性菌落用于在含有氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中建立高容量(2-4升)生產(chǎn)培 養(yǎng)物。所述細(xì)菌在37°C孵育直至達(dá)到對應(yīng)于平臺期開始的光密度值(0.8AU)，然后在30°C 溫度通過加入IPTG (異丙基-β-硫代半乳糖苷，Sigma Aldrich)至終濃度IOOmM誘導(dǎo)生 產(chǎn)蛋白。所述IPTG通過去除IacZ操縱子上的阻斷，允許所述重組蛋白大量表達(dá)。所述ΑΤ96蛋白，以與GST酶(谷胱甘肽_S_轉(zhuǎn)移酶，其序列已插入pGEX系列載體)的融合體生產(chǎn)，通過超聲波破碎細(xì)菌細(xì)胞提取并使用谷胱甘肽瓊脂糖4B珠子填充的親 和柱(GE Healthcare)純化，所述谷胱甘肽瓊脂糖4B珠子由于與GST酶極其相關(guān)，以選擇 性方式捕獲所述融合蛋白。然后AT96使用凝血蛋白酶(GE Healthcare)通過蛋白水解切除從GST分離。備 選地，其可使用包含還原谷胱甘肽的緩沖液從所述谷胱甘肽瓊脂糖基質(zhì)洗脫，并借助于離 液序列高的物質(zhì)保存在溶液中。最后所述蛋白進(jìn)行緩沖液交換，使用3500kDa截斷的纖維 素膜(Pierce)對氯化鈉溶液透析，并使用離子交換柱通過HPLC(GE Healthcare)進(jìn)一步純 化。所述截短蛋白的免疫特性如下面實驗章節(jié)所述通過實驗檢查，參考附圖，其中

圖1表示本發(fā)明的截短AT96蛋白的三維結(jié)構(gòu)和氨基酸序列(SEQ IDNO :2)。圖1 列出的氨基酸序列基于單字母密碼，而序列表列出的氨基酸序列基于三字母密碼。圖2表明了用于證實所述截短AT96蛋白對抗pl7抗體反應(yīng)的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果。在 15%聚丙烯酰胺凝膠電泳之后，所述蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。使用直接抗pl7氨基末 端部分的純化小鼠單克隆抗體(MBS-3)檢測所述蛋白。所述膜使用DAB(二氨基聯(lián)苯胺) 作為底物，使用HRP結(jié)合的抗小鼠抗體顯影。A)和C)pl7(17KDa) ；B)使用還原谷胱甘肽洗 脫后的AT96-GST(53KDa) ；D)使用凝血蛋白酶切除后的AT96 (IlKDa)。圖3顯示了 pl7和AT96之間進(jìn)行的競爭性ELISA測試結(jié)果，其用于評估所述蛋白 對MBS-3抗體的親和力。MBS-3抗體與pl7和AT96蛋白之間的結(jié)合率通過使用免疫復(fù)合物 溶液進(jìn)行固相ELISA試驗以檢測pl7來間接計算。AT96(A)顯示與全長pl7 ( ■)相同的 mAb親和力。圖4顯示了有關(guān)AT96結(jié)合Raji細(xì)胞上表達(dá)的pl7受體以及蛋白-受體相互作用 中和的實驗結(jié)果。A)Raji細(xì)胞與無關(guān)蛋白(GST)孵育；B) Raji細(xì)胞與AT96 (50ng)孵育；C) Raji細(xì)胞與AT96(50ng)孵育，其中存在用能夠模擬pl7氨基末端部分的肽(AT20)(1 50) 免疫的小鼠血清，并包含小鼠中和抗P17抗體；D) Raji細(xì)胞與AT96(50ng)在用能夠模擬 P17羧基末端部分的肽(CT18)(1 50)免疫的小鼠血清存在下孵育。圖5顯示了第一次免疫后35天對AT96和pl7的體液應(yīng)答。所顯示的抗體應(yīng)答來 自如下免疫3次的小鼠組(A)使用AT96，劑量1 ( · )、5( ■)和25( ▲ ) μ g/小鼠，或者 使用P17(B)劑量1(·)、5(·)和25(A)yg/小鼠。Γ)未免疫小鼠。各血清集合用 ELISA試驗重復(fù)分析3次。圖6顯示了 pl7和AT96的淋巴細(xì)胞增生性活性之間的比較。培養(yǎng)從用pl7或 AT96免疫的小鼠脾臟提取的細(xì)胞，并用一種或另一種蛋白再刺激7天，以評估該蛋白誘導(dǎo) 特異性T淋巴細(xì)胞克隆擴(kuò)展的能力。向所述小鼠施用3次連續(xù)劑量(25 μ g/小鼠)的與 Freund' s不完全佐劑聯(lián)合的pl7 (中間條)、AT96 (右條)或PBS (左條)。最后一次加強(qiáng) 抗原注射后2個月，處死所述小鼠并移除脾臟用于細(xì)胞增殖研究。細(xì)胞在pl7或AT96存在 或不存在的條件下培養(yǎng)。以氚標(biāo)記胸腺嘧啶核苷的引入為基礎(chǔ)評估增殖。所述數(shù)據(jù)代表使 用來自不同動物的細(xì)胞進(jìn)行的5次實驗。圖7顯示了涉及小鼠⑶8+T細(xì)胞對AT96應(yīng)答的特異性擴(kuò)展的結(jié)果。所述小鼠接 受了 3次劑量的與Freimd’ s不完全佐劑結(jié)合的25 μ g/小鼠的AT96。最后一次加強(qiáng)注射 后2個月，處死所述小鼠，在AT96作為所述加強(qiáng)抗原不存在(A)或存在(B)的情況下脾臟細(xì)胞培養(yǎng)7天。所述細(xì)胞使用FITC綴合的抗CD8單克隆抗體標(biāo)記。在A和B中作圖的區(qū) 域包括的細(xì)胞以密度和大小代表淋巴細(xì)胞群。所述數(shù)據(jù)使用CellQuest程序分析并已表示 為點坐標(biāo)圖。所述AT96刺激的培養(yǎng)物中CD8+T細(xì)胞(C)的比例如右上角所示。圖8涉及pl7刺激后通過Raji細(xì)胞中的蛋白質(zhì)印跡評估MAP激酶和pAKT的磷酸 化指數(shù)。鑒定Raji細(xì)胞中的磷酸化ERK1/2 (A)和pAKT⑶MAPs，所述Raji細(xì)胞未經(jīng)pl7處 理(1 道)或經(jīng)過增加濃度的 100ng/ml (2 道)、200ng/ml (3 道)、500ng/ml (4 道)UOOOng/ ml (5道)、2000ng/ml (6道)的ρ 17處理5分鐘時間。通過評估總MAPs (C)進(jìn)行蛋白量的 檢測。圖9顯示了 ΑΤ96刺激后通過Raji細(xì)胞中蛋白質(zhì)印跡評估獲得的MAP激酶磷酸化 指數(shù)的結(jié)果。鑒定Raji細(xì)胞中的磷酸化ERK1/2㈧MAPs，所述Raji細(xì)胞未經(jīng)AT96處理(1 道)或經(jīng)過增加濃度的 100ng/ml (2 道)、200ng/ml (3 道)、500ng/ml (4 道)U000ng/ml (5 道)、2000ng/ml(6道)的AT96處理5分鐘時間。通過評估總MAPs (B)進(jìn)行蛋白量的檢測。實施例1使用能夠結(jié)合pl7中和表位的抗pl7抗體識別AT96使用免疫酶(ELISA)和蛋白質(zhì)印跡試驗評估AT96對能夠結(jié)合pl7中和表位的抗 P17抗體的應(yīng)答(圖2)。為證實與細(xì)胞受體相互作用的功能表位的構(gòu)象保留在AT96蛋白中，建立競爭性 ELISA試驗以評估AT96在溶液中與MBS-3單克隆抗體相互作用的比例，所述MBS-3單克隆 抗體識別P17的功能部分并抑制pl7/受體相互作用[1]。然后液相中AT96作為MBS-3與 孔中(固相)存在的P17之間結(jié)合的競爭者的活性與pl7用作自身競爭者的活性相比較。所述純化的抗體與增加濃度的AT96或pl7蛋白孵育，然后所獲得的免疫復(fù)合物 用于MBS-3對固定于固相(在板孔底部)的野生型pl7的結(jié)合活性的ELISA測定。源自 BHlO病毒株的重組pl7以100 μ 1 PBS中1 μ g/ml的濃度加入到用于免疫酶測定的聚苯乙 烯板的每個孔中，所述板在室溫下孵育過夜?？乖坏陌遄鳛闄z測板；而未包被的板作 為反應(yīng)板。為最小化所述蛋白的非特異性吸收，向檢測板的每個孔中加入包含2% BSA的 200 μ IPBS (測定緩沖液)。反應(yīng)和檢測板都在37°C孵育1小時。所述板使用包含0.1% tween 20的PBS (洗滌緩沖液)洗滌。向反應(yīng)板的每個孔加入100 μ 1適當(dāng)稀釋的MBS-3 抗Ρ17單克隆抗體，以及100 μ 1濃度在0. 1到25 μ g/ml測定緩沖液范圍內(nèi)的AT96，或僅 僅100 μ 1測定緩沖液。在室溫孵育2小時后，從反應(yīng)板的孔中轉(zhuǎn)移100 μ 1等分量到檢測 板的孔中。檢測板在室溫孵育2小時，然后用洗滌緩沖液洗滌4次。通過加入HRP綴合的 抗小鼠抗體檢測結(jié)合于固相的MBS-3單克隆抗體。從圖3可知，MBS-3抗體對ΑΤ96的親和力與其對全長ρ 17蛋白的親和力相同，證 實MBS-3抗體識別的氨基末端表位的三維結(jié)構(gòu)完全地保留下來，且在本發(fā)明的截短ΑΤ96蛋 白中所述表位暴露出來。ΑΤ96蛋白，因完整保留功能性和免疫原性表位，一旦接種到生物體 中，應(yīng)該能夠誘導(dǎo)顯著的細(xì)胞介導(dǎo)的和體液的抗P 17免疫應(yīng)答。在此語境中，體液應(yīng)答意 為產(chǎn)生中和ρ17生物學(xué)活性的抗體，所述抗體經(jīng)設(shè)計用于阻斷ρ17和ρ17受體之間的相互 作用。實施例2ΑΤ96與ρ17受體之間的相互作用以及所述相互作用的中和
材料與方法MM :AT96結(jié)合pl7細(xì)胞受體的能力在來自Raji細(xì)胞系的細(xì)胞上測定，即高度表 達(dá)P17受體的Burkitt's淋巴瘤細(xì)胞。所述細(xì)胞在包含10% FCS (小牛血清)、100U/ml青 霉素、50 μ g鏈霉素和ImM L-谷氨酰胺的RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco BRL)中培養(yǎng)。AT96與牛物素綴合所述AT96蛋白與生物素綴合以允許通過共價結(jié)合熒光鏈霉 親和素使用熒光法檢測。所述蛋白通過透析膜(3500kDa截斷，Pierce)對pH 8. 0的氯化 鈉/碳酸氫鈉溶液進(jìn)行緩沖液交換。然后所述蛋白在4°C與生物素琥珀酰亞胺酯(BioSPA) 反應(yīng)3小時，并進(jìn)一步對包含0. 2M氯化鈉的PBS (磷酸緩沖鹽溶液)透析過夜。結(jié)合與中和試驗使用細(xì)胞熒光測定法測定血清阻斷AT96結(jié)合pl7受體(pl7R) 的能力，所述血清采集自用模擬Pl7氨基末端部分的稱為AT20(序列表中SEQ ID NO 7)的 肽免疫的動物。AT20免疫動物的血清經(jīng)PBS(1 50)稀釋后與生物素化的AT96(50ng)在 4°C孵育20分鐘。Raji細(xì)胞使用FcR阻斷試劑(Miltenyi Biotech)在4°C處理15分鐘， 離心，然后重懸于預(yù)先與AT96孵育的血清。來自用模擬pl7羧基末端部分的稱為CT18的 肽免疫的動物的血清用作對照。然后所述細(xì)胞用PBS洗滌，并在冰上與IOOng綴合APC或 PE Cy5. 5熒光染料的鏈霉親和素(Becton Dickinson)孵育。使用FACSCalibur儀器進(jìn)行 所述樣品的細(xì)胞熒光分析，使用CellQuest Pro程序(Becton Dickinson)分析數(shù)據(jù)。合成肽:AT20合成肽由P17蛋白的氨基酸位點9和28之間的20個氨基末端氨 基酸(SEQ ID NO 7)組成。而CT18合成肽由pl7的氨基酸位點115和132之間的18個 羧基末端氨基酸(SEQ ID NO 8)組成。這些肽以游離形式合成，然后綴合到來自Primm的 KLH(鎖孔帽貝血藍(lán)蛋白)載體。免疫步驟使用經(jīng)Freund，s完全佐劑乳化的AT20-KLH或CT18-KLH以1、5、和 25μ g/小鼠的劑量通過腹腔途徑免疫C57BL/6小鼠并間隔15天連續(xù)2次，使用相同劑量的 不完全佐劑中的免疫原加強(qiáng)。通過ELISA進(jìn)行免疫動物血清中抗AT20和抗CT18抗體的檢 測。ELISA 通過ELISA試驗測定免疫小鼠血清中抗AT20和抗CT18抗體的存在。 ELISA板(Nunc)的孔使用IOOng AT96蛋白在PBS中室溫下包被過夜。使用洗滌緩沖液 (PBS+0. 1 % tween)洗滌2次后，加入100 μ 1測定緩沖液(PBS+2% BSA)并在37°C孵育1小 時。洗滌4次后，向每個孔轉(zhuǎn)入100 μ 1待測血清的梯度稀釋液(從1 100到1 3200)。 在37°C孵育1小時后，進(jìn)行4次洗滌，加入100 μ 1/孔HRP綴合的抗小鼠抗體的1 1000 稀釋液。在37°C孵育1小時后，進(jìn)行4次洗滌，加入100μ1四甲基聯(lián)苯胺底物。每孔使用 100 μ 1 2Ν硫酸中止顯色反應(yīng)。結(jié)果迄今為止所闡明的實驗已允許建立ΑΤ96蛋白氨基末端部分的完整性，假設(shè)為允 許Ρ17與其細(xì)胞受體相互作用的區(qū)域。因此，ΑΤ96應(yīng)該能夠如野生型ρ17蛋白一樣與細(xì)胞 膜上的受體相互作用。根據(jù)實驗，這已通過測定ΑΤ96與在表面高密度表達(dá)ρ17受體的Raji細(xì)胞系B細(xì) 胞的結(jié)合進(jìn)行評估。所述細(xì)胞與生物素綴合的ΑΤ96蛋白孵育30分鐘。數(shù)次洗滌后，通過 加入熒光鏈霉親和素(與APC或PE Cy5. 5熒光染料綴合)檢測生物素化的AT96與細(xì)胞表 面的結(jié)合。
圖4顯示無關(guān)生物素化蛋白不與Raji細(xì)胞結(jié)合(圖4A)。相反，AT96能夠結(jié)合 Raji細(xì)胞膜上的細(xì)胞受體(圖4B)。實際上，細(xì)胞熒光分析顯示，B中代表AT96標(biāo)記的熒 光細(xì)胞的直方圖，比A中不能結(jié)合Raji細(xì)胞表面的分子標(biāo)記的細(xì)胞的直方圖具有更高的光 密度對數(shù)等級。如預(yù)期一樣，在整個細(xì)胞群體中可檢測到AT96結(jié)合。類似地，還評估了指向特異性氨基末端中和表位的稱為AT20[2]的抗體阻斷pl7 與細(xì)胞受體體外相互作用的能力。AT96蛋白與用復(fù)制pl7氨基末端表位序列(AT20)的肽 免疫的動物血清孵育，或者與用能夠模擬P17羧基末端序列且不存在于AT96中的肽免疫的 動物血清孵育。然后使用熒光鏈霉親和素作為熒光示蹤劑檢測AT96/pl7受體相互作用。從 已進(jìn)行的實驗可知，AT96與野生型pl7 —樣，關(guān)于其對特異性受體的結(jié)合活性，被指向氨基 末端部分的抗體中和(圖4C)，而不能被指向羧基末端部分的抗體中和(圖4D)。這些數(shù)據(jù) 證實如下假說，P17與其受體之間的相互作用以高度特異性方式存在，很有可能通過其氨基 末端。實施例3誘導(dǎo)抗AT96的免疫應(yīng)答最近，已證明pl7作為抗原能夠在動物模型中誘導(dǎo)中和及細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫應(yīng) 答[2]。另外，pl7能夠作為體外加強(qiáng)抗原，誘導(dǎo)從事先用病毒蛋白免疫的動物提取的T淋 巴細(xì)胞的增殖。3. 1誘導(dǎo)體液應(yīng)答免疫步驟通過平行使用全長pl7和本發(fā)明的截短AT96蛋白進(jìn)行的本研究獲得的 數(shù)據(jù)指出后者也能夠誘導(dǎo)中和體液應(yīng)答。所述免疫如下進(jìn)行用不同劑量的P 17和AT96 在Freimd’ s不完全佐劑存在下施用免疫30只9周齡小鼠。每組由5只小鼠組成，通過腹 腔途徑以1、5、和25yg/小鼠施用pl7或AT96蛋白。隨后，用相同劑量的免疫原間隔15天 進(jìn)行2次連續(xù)的加強(qiáng)注射。通過對小鼠接種PBS和Freimd’ s不完全佐劑準(zhǔn)備陰性對照。 免疫小鼠在免疫后0、10、24、35天取血樣。用pl7和AT96對Balb/小鼠的免疫日程表在下面表1中列出。表 權(quán)利要求
一種截短蛋白，AT96，由HIV 1全長p17蛋白氨基酸序列的1到96殘基組成，所述截短AT96蛋白具有下列免疫學(xué)特性(i)其能夠結(jié)合抗p17抗體，所述抗p17抗體能夠抑制p17/p17受體(p17R)相互作用，且結(jié)合親和力與所述抗體和全長p17蛋白之間存在的結(jié)合親和力基本相同；(ii)其能夠結(jié)合p17受體；(iii)其能夠引起中和p17/p17受體相互作用的抗p17體液免疫應(yīng)答，且其能夠在所施用對象體內(nèi)引起細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答；其中所述截短AT96蛋白基本上缺少對全長p17蛋白具有的細(xì)胞激酶磷酸化的抑制活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的截短AT96蛋白，其中激酶磷酸化抑制通過評估Raji細(xì)胞中 ERK 1/2和pAKT的磷酸化進(jìn)行檢測。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的截短蛋白，其具有SEQID NO 2的氨基酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1到3中任一權(quán)利要求所述的截短蛋白用作藥物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1到3中任一權(quán)利要求所述的截短蛋白用作藥物，所述藥物能夠引起 中和HIV pl7蛋白的生物學(xué)活性的免疫應(yīng)答。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的截短蛋白，其中所述藥物適合用于治療或防止HIV感染。
7.—種核酸，其編碼根據(jù)權(quán)利要求1到3中任一權(quán)利要求所述的截短蛋白。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的核酸，其具有SEQID NO :1的核苷酸序列。
9.藥用組合物，其包含藥學(xué)上有效量的根據(jù)權(quán)利要求1到3中任一權(quán)利要求所述的截 短蛋白。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的組合物，為免疫原性或疫苗組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及HIV-1p17蛋白的一種截短形式，稱為AT96，其由全長p17蛋白的1到96殘基組成，以及對應(yīng)的核酸序列。所述截短的AT96蛋白具有與全長p17蛋白相同的免疫學(xué)特性，但同時沒有HIV-1p17蛋白的典型有害生物活性。
文檔編號C07K14/16GK101969998SQ200880128186
公開日2011年2月9日 申請日期2008年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月15日
發(fā)明者G·梅里齊 申請人:梅迪斯蒂研究及生產(chǎn)股份有限公司