專(zhuān)利名稱(chēng)：純化肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明尤其涉及純化肽，特別是環(huán)肽或非環(huán)肽、它們的類(lèi)似物或其衍生物的領(lǐng)域。 更具體地，本發(fā)明涉及一種通過(guò)色譜程序(層析過(guò)程)從包括所述肽和至少一種相關(guān)雜質(zhì) 的組合物中純化環(huán)肽的簡(jiǎn)化且優(yōu)化的純化方法，該色譜程序能實(shí)現(xiàn)期望的最終產(chǎn)物的高 產(chǎn)率、選擇性和純度。該改善的方法尤其可用于制備埃替非巴肽(依非巴肽，依替巴肽， 印tifibatide)、艾塞那肽(exenatide)、阿托西班(atosiban)、奈西立肽(nesiritide)以 及它們各自的衍生物和類(lèi)似物。以至少約96%，并且優(yōu)選至少約99%的高純度來(lái)制備多 肽。
背景技術(shù)：
生產(chǎn)包括旨在供人或動(dòng)物治療使用的環(huán)肽、其衍生物以及其類(lèi)似物的重組(通常 基因改造的)多肽的重要方面是所述的純化方法，以獲得足夠高水平的選擇性、生產(chǎn)率和 純度，使得期望的蛋白質(zhì)基本上沒(méi)有由于在生產(chǎn)過(guò)程中可能產(chǎn)生的外來(lái)蛋白質(zhì)而污染。在肽合成期間可產(chǎn)生各種雜質(zhì)，諸如非對(duì)映異構(gòu)體、不穩(wěn)定酰胺鍵的水解產(chǎn)物、在 固相肽合成中顯著形成的缺失序列、插入肽和副產(chǎn)物，例如在合成的最后步驟中除去保護(hù) 基的過(guò)程中形成的多晶型物。它們通常是與含有二硫鍵的環(huán)肽的形成相關(guān)的一些副產(chǎn)物 (Bodansky et.al,Principles of Peptide Synthesis ;Springer_Verlag ;berlin，1993)。 本領(lǐng)域需要開(kāi)發(fā)可以以最少的步驟大規(guī)模地操作的簡(jiǎn)單的色譜純化程序，以從相關(guān)雜質(zhì)的 復(fù)雜混合物中分離出母液中的期望的肽。實(shí)質(zhì)上，如在本發(fā)明的上下文中，在合成工藝過(guò) 程中產(chǎn)生的大部分雜質(zhì)不能被單色譜方法除去，而是通過(guò)方法的組合除去，例如反相色譜 和陽(yáng)離子交換色譜，從而在配方緩沖液(formulation buffer)中制備藥物產(chǎn)品、藥物物質(zhì) (drug substance)0本發(fā)明涵蓋兩種可操作的色譜程序(色譜步驟)，其包括反相色譜和陽(yáng)離子交換 色譜?？刹捎迷S多不同的色譜程序以獲得關(guān)于純度和產(chǎn)率的期望的最終結(jié)果。反相色譜 是采用的利用疏水相互作用作為主要分離原理的純化中的最有效的方法之一。反相液相色 譜(“RP-LC”)和反相高效液相色譜(“RP-HPLC”)通常用于純化分子，例如通過(guò)合成或重 組方法生產(chǎn)的肽或蛋白質(zhì)。RP-LC和RP-HPLC方法可以有效地分離緊密相關(guān)的雜質(zhì)，并已 用于純化許多不同分子(Lee 等人，“Pr印arative HPLC, " 8th Biotechnology Symposium, Pt. 1,593-610(1988))。而且，RP-LC和RP-HPLC已成功地用于純化分子，特別是，工業(yè)規(guī)模 的蛋白質(zhì)(Olsen 等人，1994，J. Chromatog. A，675，101)。根據(jù)離子交換樹(shù)脂上配體的電荷，離子交換色譜原理包括兩種不同的途徑(方 式)陰離子交換和陽(yáng)離子交換。傳統(tǒng)的IEC純化工藝通常由一個(gè)或多個(gè)階段組成平 衡階段(sections)、施加或加樣階段(application or loading section)、沖洗階段、 洗脫階段、和再生階段(參考 Remington' s Pharmaceutical Sciences, Gennaro, ed., Mack Publishing Co. , Easton, Pa. ,1990,或 Remington :The Science and PracticeofPharamacy，第 19 版(1995))。色譜程序的每個(gè)屬性在獲得期望的蛋白質(zhì)產(chǎn)物中起重要作用。各種色譜介質(zhì)已用 于在反相樹(shù)脂上大規(guī)模純化肽。其中最受歡迎的是連接至二氧化硅表面上的C-4、C-8和 C-18烷基鏈的那些。一些重要的考慮因素包括固定相的樹(shù)脂顆粒的形狀和大小。一些其它 重要性質(zhì)包括緩沖體系、流速、PH等。盡管肽純化有所改進(jìn)，但一些純化的肽仍包含不期望 量的無(wú)法接受的反離子。由于該據(jù)信的操作理論，因此通過(guò)該應(yīng)用提及純化的備選方法，以 克服現(xiàn)有技術(shù)中遇到的問(wèn)題。US2006148699涉及一種基于RP-HPLC純化多肽的方法，該方法包括用藥用反離子 鹽的水溶液沖洗柱；以及用有機(jī)溶劑和藥用反離子酸的溶劑混合物洗脫，其中所述水溶液 具有至少約6的pH。還具體要求保護(hù)關(guān)于環(huán)肽、非環(huán)肽和埃替非巴肽的并列獨(dú)立權(quán)利要求。W02005100388公開(kāi)了毒蜥外泌肽~4 (exendin-4)的RP-HPLC純化，該純化使用了 乙腈_水梯度，并且回收純度為97. 5%的產(chǎn)物。W02005019262涉及基于聚苯乙烯/ 二乙烯苯的樹(shù)脂在胰高血糖素樣肽的RP-HPLC 純化中的應(yīng)用。本領(lǐng)域需要通過(guò)固相合成制備后選擇性分離諸如環(huán)肽的分子的高效色譜方案，從 而獲得高純的肽最終產(chǎn)物。當(dāng)該過(guò)程可以盡可能重現(xiàn)(復(fù)制)色譜過(guò)程的產(chǎn)率、純度、產(chǎn)量 和操作條件時(shí)，就滿(mǎn)足了該需要，其中洗脫由選擇的溶劑體系、PH范圍和其他相關(guān)因素控制 (conduct) 0操作程序可有利地用于商業(yè)分離。根據(jù)本發(fā)明的分離工藝(方法)的另一個(gè)重要優(yōu)點(diǎn)在于該它們可以以可重復(fù)和一 致的方式按比例放大。而且，本發(fā)明的工藝可提供比通過(guò)迄今已知的純化方法獲得的那些 產(chǎn)物好的產(chǎn)物，并給出更高的產(chǎn)率。本發(fā)明涉及以2-8范圍的PH應(yīng)用PH緩沖溶劑，該溶劑包含極性溶劑作為用于 RP-HPLC純化環(huán)肽及其類(lèi)似物或衍生物的有機(jī)洗脫劑(elution agents) 0在使用前述溶劑 體系進(jìn)行環(huán)肽的RP-HPLC純化的情況下，與本領(lǐng)域的目前狀況相比，本發(fā)明促進(jìn)增加的分 離效率、更高的純度和工業(yè)應(yīng)用的方便操作。驚人地，通過(guò)本發(fā)明中采用的新方法可以改善 靶環(huán)肽化合物和相關(guān)雜質(zhì)的分離，并產(chǎn)生更純的環(huán)樣肽產(chǎn)物。與傳統(tǒng)方法相比，肽在配方溶液中的洗脫具有優(yōu)點(diǎn)。傳統(tǒng)方法包括冷凍干燥純化 的肽，并在添加賦形劑之前，將凍干的粉末再溶解在溶液中。肽在配方溶液中的洗脫避免了 冷凍干燥機(jī)的操作以及之后的再溶解。因而，當(dāng)單獨(dú)使用或與標(biāo)準(zhǔn)提取和色譜技術(shù)組合使 用時(shí)，本發(fā)明的提取方法允許本發(fā)明利用比傳統(tǒng)方法所需更少的步驟以高產(chǎn)率和高純度來(lái) 分離環(huán)肽。發(fā)明目的本發(fā)明的主要目的在于提供一種用于從包含至少一種相關(guān)雜質(zhì)的混合物中純化 肽的方法。本發(fā)明的另一目的在于提供一種使用反相高效液相色譜和離子交換色譜進(jìn)行純 化的方法。本發(fā)明的又一目的在于提供一種用于純化環(huán)肽或非環(huán)肽的方法，該環(huán)肽或非環(huán)肽 選自包括埃替非巴肽、艾塞那肽、阿托西班或奈西立肽以及相關(guān)類(lèi)似物或衍生物的組。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明涉及一種從包括至少一種相關(guān)雜質(zhì)的混合物中純化肽的方法，所述 方法包括使肽混合物與反相高效液相色譜基質(zhì)(matrix)和/或離子交換色譜基質(zhì)接觸以 獲得純化的肽的步驟；使用反相高效液相色譜從包含至少一種相關(guān)雜質(zhì)的混合物中純化肽 的方法，所述方法包括以下步驟用基于二氧化硅的聚合物樹(shù)脂填裝反相高效液相色譜柱， 接著用有機(jī)酸緩沖液中的約5%的極性溶劑平衡該柱，以約< 100-400cm/h的流速將含有 至少一種相關(guān)雜質(zhì)的肽組合物加樣在該色譜柱上，用與步驟(a)中相同的緩沖溶液沖洗該 柱，以及通過(guò)執(zhí)行8-14%的線性梯度從該柱中洗脫純化的產(chǎn)物以獲得純化的肽產(chǎn)物；使用 離子交換色譜從包括至少一種相關(guān)雜質(zhì)的混合物中純化出肽的方法，所述方法包括以下步 驟用弱酸緩沖液的水溶液平衡陽(yáng)離子交換柱，用純化的肽對(duì)反相高效液相色譜柱加樣，以 及用如步驟(a)中使用的緩沖液沖洗該柱和洗脫該肽，從而獲得純化的肽產(chǎn)物；以及從含 有至少一種相關(guān)雜質(zhì)的混合物中純化出肽的方法，所述方法包括以下步驟用基于二氧化 硅的聚合物樹(shù)脂填裝反相高效液相色譜柱，接著使用有機(jī)酸緩沖液中約5%的極性溶劑平 衡該柱，以約< 100-400cm/h的流速將含有至少一種相關(guān)雜質(zhì)的肽組合物加樣在該柱上， 接著用與步驟(a)中相同的緩沖溶液沖洗該柱，通過(guò)執(zhí)行8-14%的線性梯度從該柱中洗脫 純化的產(chǎn)物，將從反相高效液相色譜柱洗脫的產(chǎn)物加樣在用弱酸緩沖液的水溶液平衡的陽(yáng) 離子交換柱上，以及在洗脫緩沖液中沖洗該柱并洗脫肽產(chǎn)物，從而獲得純化的肽產(chǎn)物。


圖1.表示埃替非巴肽的純度的色譜2.表示阿托西班的純度的色譜3.表示奈西立肽的純度的色譜4.表示艾塞那肽的純度的色譜圖
具體實(shí)施例方式本發(fā)明涉及一種從包括至少一種相關(guān)雜質(zhì)的混合物中純化肽的方法，所述方法包 括使肽混合物與反相高效液相色譜基質(zhì)和/或離子交換色譜基質(zhì)接觸，從而獲得純化的肽 的步驟。在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，所述肽是選自包括埃替非巴肽、艾塞那肽、阿托西班 或奈西立肽以及相關(guān)類(lèi)似物或衍生物的組中的環(huán)肽或非環(huán)肽。在本發(fā)明的又一實(shí)施方式中，所述肽混合物以任何順序與由基于二氧化硅的聚合 物樹(shù)脂構(gòu)成的所述基質(zhì)接觸。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方式中，該樹(shù)脂可以選自包括下列物質(zhì)的組葡聚糖凝膠 (交聯(lián)葡聚糖，S印hadex)、葡聚糖凝膠LH20、葡聚糖凝膠G-25、葡聚糖凝膠G-10、瓊脂糖 (S印har0Se)、SUperdeX、甲基丙烯酸酯樹(shù)脂、羧甲基纖維素、磺丙基(磺基丙基)纖維素、羧 甲基葡聚糖凝膠、磺丙基(磺基丙基)葡聚糖凝膠、磺丙基(磺基丙基)瓊脂糖和羧甲基瓊 脂糖，優(yōu)選聚苯乙烯或二乙烯苯。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方式中，樹(shù)脂珠的顆粒大小和孔徑分別在1 μ m-50ym和 100入-500 A的范圍內(nèi)。
在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方式中，所述純化采用水相中極性有機(jī)緩沖溶劑的約2% 至約30%的梯度，該水相包含有機(jī)酸緩沖液。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方式中，其中所述極性緩沖溶劑是乙腈。 在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方式中，所述有機(jī)酸緩沖液選自包括檸檬酸、乙酸、高氯酸 和甲酸的組。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，該緩沖液的摩爾濃度在10mM-50mM的范圍內(nèi)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，該純化在2-9范圍的pH下進(jìn)行。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步包括另一可選的尺寸排阻色譜步
馬聚ο在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，純化的肽產(chǎn)物通過(guò)本發(fā)明的方法獲得，其中該肽 產(chǎn)物的純度在97% -100%的范圍。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，產(chǎn)物的純度至少為96%。本發(fā)明涉及一種使用反相高效液相色譜從包括至少一種相關(guān)雜質(zhì)的混合物中純 化肽的方法，所述方法包括以下步驟a)用基于二氧化硅的聚合物樹(shù)脂填裝反相高效液相色譜柱，接著用有機(jī)酸緩沖液 中的約5%的極性溶劑平衡該柱；b)以約彡100-400cm/h的流速將包含至少一種相關(guān)雜質(zhì)的肽組合物加樣在該色 譜柱上；c)用與步驟(a)中相同的緩沖溶液沖洗該柱；以及d)通過(guò)執(zhí)行8-14%的線性梯度從該柱中洗脫純化的產(chǎn)物，從而獲得純化的肽產(chǎn) 物。本發(fā)明涉及一種使用離子交換色譜從包含至少一種相關(guān)雜質(zhì)的混合物中純化肽 的方法，所述方法包括以下步驟a)用弱酸緩沖液的水溶液平衡陽(yáng)離子交換柱；b)用純化的肽對(duì)反相高效液相色譜柱加樣；以及c)用如步驟a)中使用的緩沖液沖洗該柱并洗脫該肽，從而獲得純化的肽產(chǎn)物。本發(fā)明涉及一種從包含至少一種相關(guān)雜質(zhì)的混合物中純化肽的方法，所述方法包 括以下步驟a)用基于二氧化硅的聚合物樹(shù)脂填裝反相高效液相色譜柱，接著用有機(jī)酸緩沖液 中約5%的極性溶劑平衡該柱；b)以約彡100-400cm/h的流速將包含至少一種相關(guān)雜質(zhì)的肽組合物加樣在該柱 上，接著用與步驟a)中相同的緩沖溶液沖洗該柱；c)通過(guò)執(zhí)行8-14%的線性梯度從該柱中洗脫純化的產(chǎn)物；d)將從反相高效液相色譜柱洗脫的產(chǎn)物加樣到用弱酸緩沖液的水溶液平衡的陽(yáng) 離子交換柱上；以及e)在洗脫緩沖液中沖洗該柱并洗脫肽產(chǎn)物，從而獲得純化的肽產(chǎn)物。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，該樹(shù)脂可以選自包括下列物質(zhì)的組葡聚糖凝膠、 甲基丙烯酸酯樹(shù)脂、羧甲基纖維素、羧甲基葡聚糖凝膠、磺丙基纖維素、以及磺丙基葡聚糖 凝膠，優(yōu)選聚苯乙烯或二乙烯基苯。
在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方式中，樹(shù)脂珠的顆粒大小和孔徑分別在1 μ m-50 μ m和 ioo A — 500 A 的范圍。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步包括另一可選的尺寸排阻色譜步
馬聚ο在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方式中，所述肽是選自包括埃替非巴肽、艾塞那肽、阿托西 班或奈西立肽以及相關(guān)類(lèi)似物或衍生物的組中的環(huán)肽或非環(huán)肽。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方式中，極性緩沖溶劑是乙腈。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方式中，有機(jī)酸緩沖液選自包括檸檬酸、乙酸和甲酸的組。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方式中，使用的緩沖液的摩爾濃度在10mM-50mM的范圍 內(nèi)。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方式中，該純化在2-9范圍的pH下進(jìn)行。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方式中，純化的肽產(chǎn)物通過(guò)本發(fā)明的方法獲得，其中肽產(chǎn) 物的純度在97% -100%的范圍。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方式中，該肽埃替非巴肽、艾塞那肽、阿托西班和奈西立肽 與至少96%的純度有關(guān)。本發(fā)明的上面和其它目的提供在具體描述的用于形成和純化在固相合成后獲得 的環(huán)肽或非環(huán)肽化合物的工藝中。一種用于純化肽的方法，所述方法包括通過(guò)采用水相中極性緩沖溶劑，優(yōu)選約2% 至約20%梯度的乙腈經(jīng)由反相高效液相色譜的色譜純化，該水相包含pH在約2到約5之間 的有機(jī)酸緩沖液。本發(fā)明的目的在于提供一種色譜介質(zhì)/溶劑體系，其中該方法基于RP-HPLC和陽(yáng) 離子交換色譜。在寬泛的方面，本發(fā)明涉及一種用于從包括肽和相關(guān)雜質(zhì)的混合物中純化所述肽 的RP-HPLC色譜工藝，包括以下步驟通過(guò)填裝有用有機(jī)酸緩沖液中的約5%極性溶劑平 衡的基于聚合物的樹(shù)脂的RP-HPLC柱洗脫，分離所述混合物的所述肽和所述相關(guān)雜質(zhì)，以 ^ 360cm/h的期望流速將該肽的溶液加樣在該柱上，用50mM有機(jī)酸中的較低百分比(5% ) 的極性有機(jī)溶劑沖洗，通過(guò)用所述緩沖液的組合執(zhí)行8-14%的線性梯度來(lái)洗脫該肽產(chǎn)物。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)了解，存在在本發(fā)明的色譜程序過(guò)程中可以調(diào)節(jié)的各種變 量。這樣的變量包括加樣和洗脫條件，例如離子強(qiáng)度、緩沖液組成、PH、溫度、少量有機(jī)溶劑 的添加等。然而，在本領(lǐng)域中這樣的變量可按常規(guī)調(diào)節(jié)，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地建 立最佳條件。在通過(guò)示例性附圖、實(shí)驗(yàn)、結(jié)果和程序詳細(xì)地解釋本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施方式之 前，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明不限于在下列描述中闡述的或在附圖、實(shí)驗(yàn)和/或結(jié)果中示出的部件 的構(gòu)造和布置的細(xì)節(jié)中的應(yīng)用。本發(fā)明能夠是其它實(shí)施方式或能夠以各種形式實(shí)踐或?qū)?施。因此，本文使用的語(yǔ)言旨在給出最寬的可能范圍和含義，并且這些實(shí)施方式意味著是示 例性的，而非窮舉。而且，應(yīng)當(dāng)理解，本文采用的措辭和術(shù)語(yǔ)是用于描述的目的，并且不應(yīng)視 為限制。本發(fā)明涉及在純化具有類(lèi)似于天然肽的生物活性的環(huán)肽/非環(huán)肽中有用的方法 和程序，并且更特別地，涉及利用用于將活性肽物質(zhì)與沒(méi)有這樣的活性并因此可視為雜質(zhì)的其他物質(zhì)分離的RP-HPLC，色譜的工藝。該純化的肽產(chǎn)物是在配方溶液中使用陽(yáng)離子交換 色譜，或陽(yáng)離子交換色譜與尺寸排阻色譜的組合而制備的。本發(fā)明的一方面提供了一種純化通過(guò)固相合成制備的肽、多肽或蛋白質(zhì)的方法， 所述方法包括在足以獲得近99%純度的所述肽的色譜條件下，通過(guò)包含基于聚合物的樹(shù)脂 基質(zhì)的反相色譜，對(duì)該肽樣品進(jìn)行第一步純化，并進(jìn)一步使洗脫的肽經(jīng)受陽(yáng)離子交換色譜， 用于在配方溶液中富集以制備藥物產(chǎn)品。與傳統(tǒng)方法相比，肽在配方溶液中的洗脫具有優(yōu)點(diǎn)。傳統(tǒng)方法包括冷凍干燥純化 的肽，并在添加賦形劑之前，將凍干的粉末再溶解在溶液中。肽在配方溶液中的洗脫避免了 冷凍干燥機(jī)的操作以及之后的再溶解。在另一方面，本發(fā)明的特征在于一種純化蛋白質(zhì)的方法，該方法包括以下步驟使 包括該化合物的混合物經(jīng)受反相HPLC柱并用有機(jī)溶劑洗脫包括肽的樣品，在允許該化合 物結(jié)合到樹(shù)脂上的條件下使該樣品與離子交換樹(shù)脂接觸，以及用含水的緩沖溶液從樹(shù)脂中 洗去有機(jī)溶劑。本發(fā)明的有效實(shí)行需要待使用的色譜基質(zhì)、用于高效純化的緩沖液pH值和離子 強(qiáng)度的個(gè)性化的正確組合。色譜程序的每個(gè)屬性在獲得期望的蛋白質(zhì)產(chǎn)物中起重要作用。用于純化的緩沖體 系能夠基于該化合物的疏水性來(lái)改善該雜質(zhì)與該分子的分離。在洗脫梯度下，特定PH的緩 沖體系可及早洗脫出雜質(zhì)。由于在特定條件下雜質(zhì)的疏水性比感興趣分子的疏水性低，因 此可以實(shí)現(xiàn)此目的。緩沖體系的pH可影響與化合物的疏水性結(jié)合的分離。色譜分離的不同步驟中發(fā) 生的PH變化可影響化合物在柱中的流動(dòng)性。用于分離的珠是10 μ m顆粒大小和300 A孔徑的聚苯乙烯/ 二乙烯基苯。加樣樣 品具有結(jié)合至珠的能力，因?yàn)樵摽讖娇煽刂品肿舆M(jìn)入的表面積。該珠具有高的PH穩(wěn)定性， 因?yàn)樗腔诰酆衔锏模⑶翌w粒大小可提供更好的分離度。配方溶液組成埃替非巴肽1.注射劑(injection)每毫升由2mg埃替非巴肽、5. 25mg檸檬酸和用乙酸、足量 水調(diào)節(jié)的PH 5. 25的溶液組成。2.浸劑(浸液)每毫升由0.75mg埃替非巴肽、5.25mg檸檬酸和用乙酸、足量水 調(diào)節(jié)的PH 5. 25的溶液組成。阿托西班1.注射劑每毫升由7. 5mg埃替非巴肽、50mg甘露醇和用鹽酸、足量水調(diào)節(jié)的pH 4. 5的溶液組成。定義或術(shù)語(yǔ)在描述和要求保護(hù)本發(fā)明的過(guò)程中，將根據(jù)本文中闡述的定義來(lái)使用以下術(shù)語(yǔ)。術(shù)語(yǔ)‘多肽’、‘蛋白質(zhì)’、‘肽’指的是氨基酸的聚合物，并且沒(méi)有提及該產(chǎn)物的具體 長(zhǎng)度；因而，肽、寡肽，和蛋白質(zhì)包括在多肽定義的范圍內(nèi)。該術(shù)語(yǔ)也沒(méi)有提及或排除多肽的 表達(dá)后修飾，但這些多肽的化學(xué)修飾或表達(dá)后修飾可作為具體實(shí)施方式
被包括或排除。因 此，例如，術(shù)語(yǔ)多肽明顯包括對(duì)多肽的修飾，這些修飾包括糖基基團(tuán)、乙?；鶊F(tuán)、磷酸酯基團(tuán)、脂質(zhì)基團(tuán)等。而且，帶有這些修飾的多肽可指定為本發(fā)明包括或排除的單個(gè)種類(lèi)。在一 個(gè)實(shí)施方式中，該分子是多肽或它們的相關(guān)類(lèi)似物或其衍生物。優(yōu)選地，該多肽是環(huán)肽。根 據(jù)另一優(yōu)選的實(shí)施方式，該多肽是非環(huán)肽。在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，該多肽選自包括埃 替非巴肽、艾塞那肽、阿托西班或奈西立肽的組。術(shù)語(yǔ)從包括肽和一種或多種污染物的組合物中“純化”肽，從而通過(guò)減少肽組合物 中至少一種污染物的含量來(lái)增大組合物中肽的純度?！半s質(zhì)”是與期望的多肽產(chǎn)物或感興趣的蛋白質(zhì)不同的材料。該雜質(zhì)包括，但不限 于非對(duì)映異構(gòu)體、不穩(wěn)定酰胺鍵的水解產(chǎn)物、固相肽合成中顯著形成的缺失序列，插入肽和 副產(chǎn)物，例如在合成的最后步驟中除去保護(hù)基的過(guò)程中形成的多晶型物。術(shù)語(yǔ)“色譜”指的是通過(guò)其使混合物中感興趣的溶解物(溶質(zhì))與混合物中的其 它溶解物分離的工藝，該分離是由于速率不同而引起的，在該速率下，在流動(dòng)相的影響下， 或在結(jié)合和洗脫過(guò)程中混合物的單獨(dú)溶解物移動(dòng)通過(guò)固定介質(zhì)。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“高效液相色譜”指的是這樣的色譜程序，其中用于柱填 充的顆粒(固定相)很小(在3到50微米之間)和選擇尺寸小的規(guī)律性變化。這樣的色 譜典型地采用相對(duì)高(約500-3500psi)的進(jìn)氣壓力。術(shù)語(yǔ)“離子交換”和“離子交換色譜”指的是這樣的色譜工藝，其中混合物中感興趣 的溶解物(例如蛋白質(zhì))與連接(例如通過(guò)共價(jià)連接)到固相離子交換材料的帶電化合物 相互作用，使得感興趣的溶解物與帶電化合物非特異性相互作用比混合物中的溶解物雜質(zhì) 或污染物的大或小?；旌衔镏械奈廴救芙馕飶碾x子交換材料的柱中洗脫比感興趣的溶解物 更快或更慢，或者相對(duì)于感興趣的溶解物結(jié)合到樹(shù)脂上或被樹(shù)脂排阻?！半x子交換色譜”具 體包括陽(yáng)離子交換、陰離子交換和混合模式色譜。陽(yáng)離子交換色譜步驟可以跟隨RP-HPLC 步驟，或反之亦然。優(yōu)選地，陽(yáng)離子交換色譜步驟后為其他色譜步驟。“陽(yáng)離子交換色譜”是其中帶正電的離子結(jié)合至帶負(fù)電的樹(shù)脂的工藝?！凹訕泳彌_液”用于將包含感興趣的多肽分子和一種或多種雜質(zhì)的組合物加樣到 離子交換樹(shù)脂上。加樣緩沖液具有導(dǎo)電性和/或PH，使得感興趣的多肽分子(以及通常一 種或多種雜質(zhì))結(jié)合到離子交換樹(shù)脂上，或使得感興趣的蛋白質(zhì)流過(guò)該柱而雜質(zhì)結(jié)合到樹(shù) 脂上?！皹O性緩沖溶劑”可以是可溶解離子化合物或離子化的共價(jià)化合物、用作緩沖液的 任何溶劑。優(yōu)選地，在本發(fā)明的上下文中，使用的極性溶劑是乙腈。用于分離和純化通過(guò)固相合成制備的本發(fā)明的肽的方法的典型實(shí)例包括以下步 驟i)以用有機(jī)酸酸緩沖液中約5%的極性溶劑平衡的基于聚合物的樹(shù)脂填裝 RP-HPLC 柱。ii)以約彡100-400cm/h的流速將包含至少一種相關(guān)雜質(zhì)的肽組合物加樣在該柱上。iii)用與步驟i中相同的緩沖溶液沖洗該柱。iv)通過(guò)執(zhí)行8-14%的線性梯度從該柱中洗脫純化的產(chǎn)物。將該肽的洗脫純化溶液進(jìn)一步加樣在陽(yáng)離子交換柱上，從而促進(jìn)產(chǎn)品的富集(濃 縮)。
與洗脫結(jié)合，在配方緩沖液中通過(guò)陽(yáng)離子交換色譜富集所述肽包括下列步驟a.用弱酸緩沖液的水溶液平衡陽(yáng)離子交換柱。b.將RP-HPLC純化的肽加樣到該柱上。c.用如步驟a中使用的緩沖液沖洗該柱并洗脫肽產(chǎn)物。緩沖液A是1-5%的乙腈，而緩沖液B是10_50mM的有機(jī)酸緩沖液，并且樣品以約 ^ 100-400cm/h的流速加樣。使用的梯度相對(duì)于待純化的樣品肽進(jìn)行變化。本文工藝的第一步驟涉及通過(guò)將混合物加樣在反相液相色譜柱上而從含有分子 的混合物中純化它們。該柱可以是低壓或高壓(HPLC)的，后者是用顆粒直徑小于約20 μ m 的介質(zhì)填裝的。優(yōu)選地，該柱是用顆粒直徑為約5-40 μ m，更優(yōu)選為約10-40μπι，并且最優(yōu) 選為約10-15 μ m的介質(zhì)填裝的。在本發(fā)明的上下文中，填裝在該柱中的樹(shù)脂的顆粒大小 是ΙΟμπι。因此，該柱優(yōu)選為HPLC柱，尤其是用于純化需要它的肽。優(yōu)選地，該柱具有約 100-4000埃，更優(yōu)選約100-500埃的孔徑。在本發(fā)明的上下文中，填裝在該柱中的樹(shù)脂的孔 徑為300埃。該柱長(zhǎng)度優(yōu)選為10-50cm，更優(yōu)選為約25-35cm。洗脫緩沖液的pH可以為約2至約9，可替換地為約3至約8，約4至約8，或約5至 約8，但用于洗脫的pH或pH范圍將根據(jù)感興趣的期望蛋白質(zhì)和實(shí)踐的色譜類(lèi)型來(lái)確定。用 于加樣、沖洗或洗脫緩沖液的適當(dāng)?shù)腜H范圍很容易通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)確定，使得感興趣的蛋 白質(zhì)以活性形式回收。用于該目的的洗脫緩沖液的實(shí)例包括檸檬酸鹽緩沖液或乙酸鹽緩沖 液。柱的介質(zhì)可以是任何合適的材料，包括基于聚合物的樹(shù)脂介質(zhì)、基于二氧化硅的 介質(zhì)，或甲基丙烯酸酯介質(zhì)。優(yōu)選地，該介質(zhì)是AMBERCHROM HPRlO0期望用在本發(fā)明實(shí)踐中 的陽(yáng)離子交換樹(shù)脂包括磺丙基瓊脂糖、水凝膠聚合的陶瓷珠、羧甲基纖維素、親水性球形聚 合物珠、羧甲基葡聚糖凝膠、磺丙基纖維素、磺丙基葡聚糖凝膠等。目前優(yōu)選的陽(yáng)離子交換 樹(shù)脂包括磺丙基瓊脂糖和水凝膠聚合的陶瓷珠，其中磺丙基瓊脂糖是用在本發(fā)明實(shí)踐中的 目前最優(yōu)選的陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，這是因?yàn)樗囊椎眯院蛢?yōu)異性能。使用的尺寸排阻樹(shù)脂是 葡聚糖凝膠LH-20、葡聚糖凝膠G-25、葡聚糖凝膠G-IO。流速一般為約20-400cm/h，或4_40柱體積(CV) /h,取決于該色譜是酸性還是中性 的。優(yōu)選地，該肽以彡360cm/h的流速加樣在柱上。對(duì)于基于該分子和存在的雜質(zhì)的RP-HPLC色譜分離，在該柱上肽的加樣能力一般 為2-15g/L。對(duì)于富集步驟，離子交換柱的加樣能力為< 70g/L。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在閱讀本公開(kāi)內(nèi)容和本文提供的權(quán)利要求之后，容易理解本 發(fā)明的這些和其他非限制性實(shí)施方式。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明并不限于所描述的特定方法和工 藝，因?yàn)檫@樣的期望的蛋白質(zhì)/肽產(chǎn)物和方法當(dāng)然可以變化。也應(yīng)當(dāng)理解，本文使用的術(shù)語(yǔ) 僅為了描述特定實(shí)施方式的目的，并且不是用于限制。應(yīng)當(dāng)理解，為了獲得高分離度的分離，使用如實(shí)例中描述的純化的示例性方法，與 用于分離的部件結(jié)合，使得可特別有效地以特別簡(jiǎn)單、方便且廉價(jià)的方式獲得期望的肽。借助于下面的實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步詳述本申請(qǐng)的技術(shù)。然而，這些實(shí)施例不應(yīng)當(dāng)解釋 為限制本發(fā)明的范圍。下面的實(shí)施例表示本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式。實(shí)施例1:通過(guò)固相合成制備的66%純度的埃替非巴肽TFA鹽用于在基于聚合物的樹(shù)脂填裝的柱上純化。最初將埃替非巴肽TFA鹽溶解在1 1的乙腈和50mM乙酸的混合物中，從 而獲得澄清溶液。使用50mM乙酸將獲得的溶液進(jìn)一步稀釋至5%的乙腈濃度和< 2g/L的 埃替非巴肽濃度。過(guò)濾該溶液，從而加樣在該柱上。用50mM乙酸中的較低百分比(5% )的乙腈平衡用Amberchrom HPRlO (顆粒大小 10 μ m和孔徑300 A )樹(shù)脂填裝的柱。以彡360cm/h的流速將過(guò)濾的埃替非巴肽溶液加樣 在該柱上。柱上該肽的加樣是對(duì)< 10g/L濃度的樹(shù)脂進(jìn)行的。在加樣之后，用50mM乙酸溶 液中的較低百分比(5%)的乙腈沖洗該柱。對(duì)于25CV，通過(guò)執(zhí)行乙腈(緩沖液B)的8-14% 的線性梯度從該柱洗脫純產(chǎn)物，而50mM乙酸是緩沖液Α。在純化期間通過(guò)該柱的壓力降為 23-26bar。由該過(guò)程獲得的埃替非巴肽的純度為98. 7%，產(chǎn)率為54%。用于埃替非巴肽的 HPLC分析的條件在下表中給出，表1:
權(quán)利要求
一種從包含至少一種相關(guān)雜質(zhì)的混合物中純化環(huán)肽或非環(huán)肽和相關(guān)類(lèi)似物或衍生物的方法，所述方法包括使所述肽混合物以任何順序與RP HPLC色譜基質(zhì)和/或離子交換色譜基質(zhì)接觸，所述分離基質(zhì)由基于二氧化硅的聚合物樹(shù)脂組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述純化在包含有機(jī)酸緩沖液的水相中采用約 2%至約30%梯度的極性有機(jī)緩沖溶劑進(jìn)行。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述樹(shù)脂可以選自包括葡聚糖凝膠、葡聚糖凝膠 LH20、葡聚糖凝膠G-25、葡聚糖凝膠G-10、瓊脂糖、Superdex、甲基丙烯酸酯樹(shù)脂、羧甲基纖 維素、磺丙基纖維素、羧甲基葡聚糖凝膠、磺丙基葡聚糖凝膠、磺丙基瓊脂糖、羧甲基瓊脂糖 的組。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述樹(shù)脂是聚苯乙烯或二乙烯基苯。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，樹(shù)脂珠的顆粒大小和孔徑分別在1μ m-50 μ m和 ioo A - 500 A的范圍內(nèi)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述環(huán)肽或非環(huán)肽選自包括埃替非巴肽、艾塞那 肽、阿托西班或奈西立肽的組。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述極性緩沖溶劑是乙腈。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述有機(jī)酸緩沖液選自包括檸檬酸、乙酸、高氯 酸和甲酸的組。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，使用的所述緩沖液的摩爾濃度在10mM-50mM的范 圍內(nèi)。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述純化在2-9范圍的pH下進(jìn)行。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述方法進(jìn)一步包括另一可選的尺寸排阻色譜步驟。
12.—種根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)獲得的肽產(chǎn)物，所述肽產(chǎn)物具有97-100%范圍的純度。
13.一種根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)獲得的肽產(chǎn)物，所述肽產(chǎn)物具有至少96%的純度。
14.一種通過(guò)反相色譜從包含至少一種相關(guān)雜質(zhì)的混合物中純化環(huán)肽或非環(huán)肽和相關(guān) 類(lèi)似物或衍生物的方法，包括以下步驟a)利用由有機(jī)酸緩沖液中的約5%的極性溶劑平衡的基于二氧化硅的聚合物樹(shù)脂填 裝 RP-HPLC 柱；b)以約<100-400cm/h的流速將包含至少一種相關(guān)雜質(zhì)的肽組合物加樣在所述柱上；c)用與步驟a)中相同的緩沖溶液沖洗所述柱；以及d)執(zhí)行8-14%的線性梯度以從所述柱中洗脫純化的產(chǎn)物。
15.一種通過(guò)離子交換色譜從包含至少一種相關(guān)雜質(zhì)的混合物中純化環(huán)肽或非環(huán)肽和 相關(guān)類(lèi)似物或衍生物的方法，包括以下步驟a)用弱酸緩沖液的水溶液來(lái)平衡陽(yáng)離子交換柱；b)將RP-HPLC純化的肽加樣在所述柱上；以及c)用如在步驟a)中使用的緩沖液沖洗所述柱和洗脫所述肽產(chǎn)物。
16.一種使所述肽混合物以任何順序與RP-HPLC色譜基質(zhì)和/或離子交換色譜基質(zhì)接觸來(lái)從包含至少一種相關(guān)雜質(zhì)的混合物中純化環(huán)肽或非環(huán)肽和相關(guān)類(lèi)似物或衍生物的方 法，所述純化方法包括以下步驟a)利用由有機(jī)酸緩沖液中約5%的極性溶劑平衡的、基于二氧化硅的聚合物樹(shù)脂來(lái)填 裝 RP-HPLC 柱；b)以約<100-400cm/h的流速將所述包含至少一種相關(guān)雜質(zhì)的肽組合物加樣在所述 柱上；c)用與步驟a)中相同的緩沖溶液沖洗所述柱；d)執(zhí)行8-14%的線性梯度以從所述柱中洗脫純化的產(chǎn)物；e)用弱酸緩沖液的水溶液來(lái)平衡陽(yáng)離子交換柱；f)將所述RP-HPLC純化的肽加樣在所述柱上；以及g)在洗脫緩沖液中沖洗所述柱和洗脫肽產(chǎn)物。
17.根據(jù)權(quán)利要求14、15或16所述的方法，其中，所述樹(shù)脂可以選自包括葡聚糖凝膠、甲基丙烯酸酯樹(shù)脂、羧甲基纖維素、羧甲基葡聚糖凝膠、磺丙基纖維素、磺丙基葡聚糖凝膠 的組。
18.根據(jù)權(quán)利要求14、15或16所述的方法，其中，所述樹(shù)脂是聚苯乙烯或二乙烯基苯。
19.根據(jù)權(quán)利要求14、15或16所述的方法，其中，所述樹(shù)脂珠具有1μ m_50 μ m的顆粒大小。
20.根據(jù)權(quán)利要求14、15或16所述的方法，其中，所述樹(shù)脂珠的孔徑為loo A-500 A。
21.根據(jù)權(quán)利要求14、15或16所述的方法，其中，所述方法進(jìn)一步包括另一可選的尺寸 排阻色譜步驟。
22.根據(jù)權(quán)利要求14、15或16所述的方法，其中，所述環(huán)肽或非環(huán)肽選自包括埃替非巴 肽、艾塞那肽、阿托西班或奈西立肽的組。
23.根據(jù)權(quán)利要求14、15或16所述的方法，其中，所述極性緩沖溶劑是乙腈。
24.根據(jù)權(quán)利要求14、15或16所述的方法，其中，所述有機(jī)酸緩沖液選自包括檸檬酸、 乙酸、高氯酸和甲酸的組。
25.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，使用的所述緩沖液的摩爾濃度在10mM-50mM的 范圍內(nèi)。
26.根據(jù)前述權(quán)利要求14至25中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述純化在2-9范圍內(nèi)的 PH下進(jìn)行。
27.根據(jù)前述權(quán)利要求14至26中任一項(xiàng)獲得的肽產(chǎn)物，其中，所述純度至少為96%。
28.根據(jù)前述權(quán)利要求14至26中任一項(xiàng)獲得的肽產(chǎn)物，所述肽產(chǎn)物具有97-100%的純度。
29.純化的埃替非巴肽，所述純化的埃替非巴肽具有至少96%的純度。
30.純化的艾塞那肽，所述純化的艾塞那肽具有至少96%的純度。
31.純化的阿托西班，所述純化的阿托西班具有至少96%的純度。
32.純化的奈西立肽，所述純化的奈西立肽具有至少96%的純度。
33.用于純化肽的方法和純化的肽產(chǎn)物，所述方法和肽產(chǎn)物基本上如本文中連同附圖 和實(shí)施例所描述的。
全文摘要
本發(fā)明尤其涉及肽，特別是環(huán)肽或非環(huán)肽、它們的類(lèi)似物或其衍生物的純化領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及一種通過(guò)色譜程序從包括所述肽和至少一種相關(guān)雜質(zhì)的組合物中純化環(huán)肽的簡(jiǎn)化且優(yōu)化的純化方法，該色譜程序能實(shí)現(xiàn)期望的最終產(chǎn)物的高產(chǎn)率、選擇性和純度。該改善的方法特別可用于制備埃替非巴肽、艾塞那肽、阿托西班、奈西立肽以及它們各自的衍生物和類(lèi)似物。以至少約96％，并且優(yōu)選至少約99％的高純度來(lái)制備多肽。
文檔編號(hào)C07K1/18GK101981048SQ200880128402
公開(kāi)日2011年2月23日 申請(qǐng)日期2008年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月6日
發(fā)明者克里希納穆?tīng)柕佟の目ㄌ厣? 哈里什·耶爾, 尼特斯·戴夫, 拉姆普瑞布·納賈拉雅 申請(qǐng)人:拜康有限公司