專利名稱：一種制備高純度馬藺子甲素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制藥領(lǐng)域，具體涉及使用反相制備色譜法制備高純度馬藺子甲素。
背景技術(shù)：
馬藺子素是由鳶尾科植物馬藺子中提取的主要抗癌活性成分，主要含馬藺子甲素和 馬藺子乙素。
馬藺子甲素(I )的結(jié)構(gòu)為
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馬藺子乙素(II)的結(jié)構(gòu)為-
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馬藺子素是山東新華制藥股份有限公司與天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所聯(lián)合開發(fā)的西藥二
類新藥，1996年上市，臨床作為放療增敏劑與放療合用。
馬藺子甲素和馬藺子乙素二者結(jié)構(gòu)相似，不易分離與測(cè)定。馬藺子素成分分離測(cè)定 方法已報(bào)導(dǎo)的HPLC法藥物分析雜志，10 (4)， 19卯，P230-232。提供的方法是以甲 醇-水-乙腈-乙醚(65: 30: 20: 20)為流動(dòng)相，但該流動(dòng)相乙醚極易揮發(fā)，組分變動(dòng)較 大，不適合制備用。中草藥，16 (3)， 1985， P5。提供的方法是以無(wú)水甲醇加入硝酸銀 (5X10_2M)為流動(dòng)相，但該流動(dòng)相對(duì)儀器及色譜柱有損害，而且硝酸銀不易從樣品中 除去，同樣也不適合制備用。馬藺子甲素也可以用全合成的方法制備出來(lái)化學(xué)學(xué)報(bào)，47 (9)， 1989， P896-900。 全合成路線比較長(zhǎng)，試劑比較昂貴，難度較大。
使用反相制備色譜法制備高純度馬藺子甲素至今未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種制備高純度馬藺子甲素的方法，產(chǎn)品純度高，操作簡(jiǎn)易。 本發(fā)明制備高純度馬藺子甲素的方法，其特征在于采用反相制備色譜法，包括在液 相色譜柱中洗脫和洗脫流份的后處理過(guò)程， 其中洗脫的條件是-
樣品制備用馬藺子素溶液，是由馬藺子提取物分別經(jīng)乙醇、乙腈溶解，析晶、過(guò) 濾得到的，
流動(dòng)相含水的乙腈溶液 溫度20。C 30。C
后處理過(guò)程洗脫后含馬藺子甲素的洗脫流份，經(jīng)結(jié)晶、過(guò)濾、洗滌、干燥即得。 使用的高效液相色譜柱是C-18制備色譜柱，直徑為10mm， 25mm;長(zhǎng)度為250mm。 有很多供應(yīng)商能夠生產(chǎn)這種性質(zhì)的制備色譜柱，如Phe加meiiex公司等。
制備用馬藺子素溶液的制備將采購(gòu)的馬藺子種皮，經(jīng)粉碎、用乙酸乙酯回流提取、 過(guò)濾，濾液控溫60'C以下，壓力-0.07 -0.09MPa減壓濃縮至干，用乙醇室溫溶解，氧 化鋁柱層析，乙醇洗脫。洗脫液控溫60'C以下，壓力-0.07 -0.09MPa減壓濃縮至原體 積的二分之一，-20'(:冷凍結(jié)晶，過(guò)濾得粗品。粗品通過(guò)石油醚、乙醇反復(fù)重結(jié)晶(鄰 'C溶解，-20'C結(jié)晶)，得馬藺子提取物，其中馬藺子甲素83%~86%(W/W)，馬藺子乙 素9%~12%(W/W)。
馬藺子提取物經(jīng)預(yù)處理得制備用馬藺子素溶液。具體方法為馬藺子提取物用無(wú)水 乙醇回流溫度下溶解，降溫至35土5'C，保溫2小時(shí)，過(guò)濾，濾液降溫至零下15土5'C， 結(jié)晶，過(guò)濾，濾餅減壓干燥后，用乙腈溶解，溶解溫度為50土5'C，降溫至25土5'C，保 溫2小時(shí)，過(guò)濾，得制備用馬藺子素溶液。
馬藺子素各成分在固定相上吸附并被含有水的乙腈流動(dòng)相洗脫，其中水的體積百分 比為1%至10%，優(yōu)選2%至6%，最優(yōu)為3%至5%。本發(fā)明的反相制備色譜方法在20'C至30'C下進(jìn)行。較高溫度對(duì)馬藺子甲素的穩(wěn)定性 有影響，較低溫度容易析出結(jié)晶。
純化后含馬藺子甲素的洗脫流份，于零下20土5'C結(jié)晶，過(guò)濾，零下20土5'C的乙腈 洗滌，五氧化二磷為干燥劑室溫減壓干燥，得馬藺子甲素，HPLC法測(cè)定含量>99% (面 積歸一化法)。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)
使用本發(fā)明方法制備馬藺子甲素，產(chǎn)品純度髙，操作簡(jiǎn)易。本發(fā)明提供的方法與文 獻(xiàn)提供的方法相比較具有如下特點(diǎn)l)流動(dòng)相組分合理。馬藺子甲素與馬藺子乙素結(jié)構(gòu) 相似，區(qū)別在于馬藺子甲素側(cè)鏈第十位有一個(gè)雙鍵，馬藺子乙素側(cè)鏈為飽和碳鏈，其余 部分完全相同。根據(jù)其結(jié)構(gòu)差別，選擇了乙腈/水作為流動(dòng)相使兩者得到了良好分離。樣 品在該流動(dòng)相中溶解度較大，易于擴(kuò)大進(jìn)樣量。該流動(dòng)相對(duì)儀器及色譜柱無(wú)損害，穩(wěn)定， 適合制備用。2)含馬藺子甲素的洗脫流份，零下20士5'C結(jié)晶，過(guò)濾，零下20土5'C的 乙腈洗滌，五氧化二磷為干燥劑室溫減壓干燥。不需要濃縮處理，避免了溫度高，容易 分解的現(xiàn)象。3)制備周期短。
具體實(shí)施例方式
通過(guò)以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員 而言，不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)施例；凡基于本發(fā)明上述 內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
馬藺子提取物的制備過(guò)程(公知技術(shù))
將采購(gòu)的馬藺子種皮，經(jīng)粉碎、用乙酸乙酯回流提取、過(guò)濾，濾液控溫60'C以下， 壓力-0.07~ -0.091> &減壓濃縮至干，用乙醇室溫溶解，氧化鋁柱層析，乙醇洗脫。洗 脫液控溫60°C以下，壓力-0. 07~ -0.09MPa減壓濃縮至原體積的二分之一，-20'0冷凍結(jié) 晶，過(guò)濾得粗品。粗品通過(guò)石油醚、乙醇反復(fù)重結(jié)晶(50'C溶解，-20'C結(jié)晶)，得馬藺 子提取物，其中馬藺子甲素83%~86% (W/W)，馬藺子乙素9。/。 12。/。(WAV)。
制備用馬藺子素溶液的制備
馬藺子提取物用無(wú)水乙醇回流溶解。馬藺子提取物的濃度為0.1g/mL,降溫至35土5 'C，保溫2小時(shí)，過(guò)濾。濾液降溫至零下15土5'C，結(jié)晶8小時(shí)，過(guò)濾。濾餅減壓干燥后，用乙腈溶解，馬藺子提取物的濃度為0.06g/mL,溶解溫度為50 土5'C，降溫至25土5'C，保溫2小時(shí)，過(guò)濾，得制備用馬藺子素溶液。
含量測(cè)定方法是按照國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局頒布的《國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)》 WSHX-234)-2003Z公布的測(cè)定方法。
實(shí)施例l
上樣組分制備用馬藺子素溶液(含馬藺子甲素83。/。，馬藺子乙素12%)
固定相十八垸基(C18)配體的硅膠
柱子Phenomenex公司Luna色譜柱，250X10mm
流速5 mL/min
溫度20°C-30°C
檢測(cè)波長(zhǎng)270nm
流動(dòng)相95% (v/v)乙腈水溶液
收集甲素峰的洗脫流份，零下20土5'C結(jié)晶24小時(shí)，過(guò)濾，零下20土5'C的乙腈洗 滌三遍。五氧化二磷為干燥劑室溫減壓干燥至恒重。得馬藺子甲素，HPLC法測(cè)定含量 99% (面積歸一化法)。
實(shí)施例2
上樣組分制備用馬藺子素溶液(含馬藺子甲素85%，馬藺子乙素9%)
固定相十八烷基(C18)配體的硅膠
柱子Phenomenex公司Jupiter色譜柱，250X25mm
流速 10mLi/min
溫度20°C-30°C
檢測(cè)波長(zhǎng)270nm
流動(dòng)相97% (v/v)乙腈水溶液
收集甲素峰的洗脫流份，零下20'C 零下25'C結(jié)晶24小時(shí)，過(guò)濾。冷乙腈洗滌三遍。 五氧化二磷為干燥劑室溫減壓干燥至恒重。得馬藺子甲素，HPLC法測(cè)定含量99M (面 積歸一化法)。
權(quán)利要求
1、一種制備高純度馬藺子甲素的方法，其特征在于采用反相制備色譜法，包括在色譜柱中洗脫和洗脫流份的后處理過(guò)程，其中洗脫的條件是樣品制備用馬藺子素溶液，是由馬藺子提取物分別經(jīng)乙醇、乙腈溶解，析晶、過(guò)濾得到的，流動(dòng)相含水的乙腈溶液溫度20℃～30℃后處理過(guò)程洗脫后含馬藺子甲素的洗脫流份，經(jīng)結(jié)晶、過(guò)濾、洗滌、干燥即得。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于制備用馬藺子素溶液的方法為馬藺子 提取物用無(wú)水乙醇回流溫度下溶解，降溫至35士5'C，保溫2小時(shí)，過(guò)濾，濾液降溫至 零下15土5。C,結(jié)晶，過(guò)濾，濾餅減壓干燥后，用乙腈溶解，溶解溫度為50土5'C，降溫 至25土5'C,保溫2小時(shí)，過(guò)濾，得制備用馬藺子素溶液。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于流動(dòng)相為含水的乙腈溶液，其中水的體 積百分比為1至10。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于后處理過(guò)程是將含馬藺子甲素的洗脫流 份，于零下20土5'C結(jié)晶，過(guò)濾，零下20土5'C的乙腈洗滌，五氧化二磷為干燥劑室溫減 壓干燥。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述馬藺子提取物中含有馬藺子甲素 83%~86%，馬藺子乙素9%~12%，均以質(zhì)量百分?jǐn)?shù)計(jì)。
全文摘要
本發(fā)明制備高純度馬藺子甲素的方法，其特征在于采用反相制備色譜法，包括在液相色譜柱中洗脫和洗脫流份的后處理過(guò)程，其中洗脫的條件是樣品制備用馬藺子素溶液，是由馬藺子提取物分別經(jīng)乙醇、乙腈溶解，析晶、過(guò)濾得到的，流動(dòng)相含水的乙腈溶液溫度20℃～30℃后處理過(guò)程洗脫后含馬藺子甲素的洗脫流份，經(jīng)結(jié)晶、過(guò)濾、洗滌、干燥即得。本發(fā)明具有制備產(chǎn)品純度高，操作簡(jiǎn)易的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C07C50/28GK101575277SQ20091001598
公開日2009年11月11日 申請(qǐng)日期2009年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月8日
發(fā)明者劉懷林, 孫太紅, 王劍平, 麗 趙 申請(qǐng)人:山東新華制藥股份有限公司