專利名稱：：銀杏內(nèi)生真菌菌株發(fā)酵液的乙酸乙酯萃取物中分離的化合物的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種化合物，特別是一種銀杏內(nèi)生真菌菌株C/w"om/"mg/o6owm發(fā)酵液的乙酸乙酯萃取物中分離到的化合物，該化合物為一個新的化合物，蝦卵brineshrimp致死生測顯示非常高細胞毒活性。
背景技術：
：癌癥一直是不能攻克的世界難題，從天然產(chǎn)物中尋找抗癌活性成分是解決這個世界難題的有效途徑之一。銀杏是最古老的高等植物之一，是我國的特有植物，因為其所富含的各種活性成分，尤其是黃酮類化合物而被作為傳統(tǒng)的中藥以及開發(fā)成現(xiàn)代保健品。根據(jù)"基因水平傳遞假設"以及"共生理論"，與銀杏共生的內(nèi)生真菌可能會產(chǎn)生與銀杏相同或者類似的化學成分。98株銀杏內(nèi)生真菌化學成分的初探結果顯示部分內(nèi)生真菌具有和銀杏相同和相似的化學成分，如三萜和黃酮類化合物，內(nèi)生菌C7zaeto脂'wmg/o6owm發(fā)酵物的系統(tǒng)預試也顯示其能產(chǎn)生三萜黃酮類和生物堿類物質(zhì)，而多數(shù)這些物質(zhì)都是生理活性物質(zhì)，例如抗癌活性。因此對菌株C7^eto附/w附g/o6os"m進行了次生代謝化學成分研究，為從銀杏內(nèi)生菌中尋找抗癌活性物質(zhì)提供科學依據(jù)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于，提供一種銀杏內(nèi)生真菌菌株Cte"o脂'腦g/o6w謡發(fā)酵液的乙酸乙酯萃取物中分離的新化合物，該化合物具有抗癌活性，可作為制備抗癌藥物被應用。為了實現(xiàn)上述任務，本發(fā)明采取如下的技術解決方案一種銀杏內(nèi)生真菌菌株Oz"etom/簡g/o6ow附發(fā)酵液的乙酸乙酯萃取物4中分離的化合物，特征在于，其結構式為-該化合物的名稱為chaetomugilinD，分子式為c23H27o6ci，分子量為435。經(jīng)申請人所進行的鑒定以及生物活性試驗證明，該化合物對蝦卵brineshrimp有很高的細胞毒活性，能夠用于制備抗癌藥物的應用。圖1是6^eto肌'"y7^7oZ7as鵬發(fā)酵液的乙酸乙酯萃取物化學成分提取分離流程圖2是標題化合物chaetomugilinD的關鍵HMBC和^」HCOSY特征關系；圖3-圖12是標題化合物的結構鑒定圖，其中圖3是標題化合物^麗R，圖4是標題化合物13CNMR，圖5和圖6是標題化合物HMBC;圖7是標題化合物H-HCOSY;圖8是標題化合物HMQC，圖9是標題化合物HSQC;圖IO、11，12是標題化合物HMBC。以下結合附圖對本發(fā)明作進一步的詳細描述。具體實施例方式本發(fā)明為一種銀杏內(nèi)生真菌菌株Ow"o柳'wmg/o6ow附發(fā)酵液的乙酸乙酯萃取物中分離得到具有抗癌活性的新化合物，寄主植物銀杏(fo'/^^W7o&)，來源于山東省臨沂市。蝦卵致死試驗是在德國哥廷根大學完成。上述材料均為公開的生物材料。分離鑒定菌種以及擴大發(fā)酵所用的培養(yǎng)基配方分別為PDA培養(yǎng)基，用于培養(yǎng)和分離純化真菌，其配方為馬鈴薯汁1000ml，5葡萄糖20g，瓊脂20g，滅菌30min。改良培養(yǎng)基，用于擴大液體發(fā)酵，其配方為CaCl2:0.5g，KH2P04:0.lg，KC1:0.05g，MgS04*7H20:0.lg，蔗糖20.0g，蛋白胨15.0g,1000ml的&0，pH為6.0。馬鈴薯汁的制備方法是，土豆去皮，切片，稱200g放如入1000ml自來水中煮沸30min，雙層紗布過濾，濾液補水至1000ml。主要利用的試劑為石油醚(60_90°C)，二氯甲烷，環(huán)己垸，丙酮，甲醇等，均為分析純。銀杏內(nèi)生真菌菌株C/^etofm'M附g/o6仍"附發(fā)酵液的乙酸乙酯萃取物中分離的化合物，其分離過程如下1.菌種的發(fā)酵和發(fā)酵液的濃縮吸取C7weto/m'"mg/o6osww的菌懸液lml，加入到1000ml裝有200ml液體培養(yǎng)基(CaCl2:0.5g,KH2P04:0.lg，KC1:0.05g，MgS047H20:0.lg，glucose:20.0g，p印tone:15.0g，H20:1000ml,pH=6.0)的三角瓶中，在轉(zhuǎn)速150rpm，28-C下培養(yǎng)5天，結束發(fā)酵，過濾得到發(fā)酵液30L和菌絲體，菌絲體在5(TC下烘干，平均菌重4.6g/L。濾液共30L，甩等體積的乙酸乙酯萃取3次，濃縮有機相，得到發(fā)酵液乙酸乙酯提取浸膏2.83g;3.粗提物的活性預試海蝦致死試驗因為是最為研究人員所信賴的細胞毒性篩選方法而廣為使用，具體方法為將30個經(jīng)過挑選的蝦卵放入裝有0.2ml人造海水的培養(yǎng)槽(直徑為1.8cm，深2cm)中，用5^1的DMSO溶解20嗎發(fā)酵液乙酸乙酯提取物加入到培養(yǎng)槽中，對照只加入等量的DMSO，然后在黑暗環(huán)境，室溫下培養(yǎng)。24小時后，在顯微鏡下統(tǒng)計每個培養(yǎng)槽中的蝦卵死亡數(shù)，用下列公式計算致死率M。M=[(A-B-N)/(G-N)]100,其中A為24小時后的平均死亡數(shù)，B為24小時后對照里面的平均死亡數(shù)，N為在藥物加入之前死亡的蝦卵數(shù)，G為總的用于測試的蝦卵數(shù)。4.化合物的分離純化參見圖1,發(fā)酵液乙酸乙酯提取浸膏通過硅膠柱層析、凝膠柱層析、反相柱層析分離提取其中的化學成分，常壓柱層析采用濕法裝柱和硅膠拌樣上柱，根據(jù)薄層展開情況選擇洗脫溶劑系統(tǒng)，反相柱層析采用加壓裝置，凝膠柱層析選用SephadexLH-20,采用甲醇以及甲醇-二氯甲垸洗脫。多次柱層析最后得到化合物。硅膠柱2.83g發(fā)酵液乙酸乙酯提取浸膏千法拌樣(100-200目)5.6g,50g硅膠(200-300目)，用二氯甲烷_甲醇=100:0，二氯甲烷-甲醇=50:1，二氯甲垸-甲醇=30:1，二氯甲垸-甲醇=20:1，二氯甲垸-甲醇=10:1梯度洗脫，每份洗脫液為100ml，減壓蒸餾濃縮，薄板檢測，相似合并；得到A-E五個組分，其中B組分顯示較強的細胞毒活性，所以在活性追蹤下進行連續(xù)兩次凝膠SephadexLH-20柱層析,洗脫劑分別為(二氯甲烷-甲醇=6:4)和(甲醇)。得到活性組分B2-3，繼續(xù)硅膠柱層析，以環(huán)己烷-丙酮=10:1洗脫得到活性組分B2-3-c，然后繼續(xù)用反相RP-Cw柱層析純化，以水-甲醇(30%，45%，50%，55%)洗脫得到化合物。將此化合物做薄層層析，經(jīng)紫外，碘和硫酸-乙醇顯色為單一斑點，三種溶劑系統(tǒng)展開均為單一斑點，可初步認定為單一化合物。5.化合物的鑒定對分離到的化合物做質(zhì)譜，碳譜，氫譜，以及二維核磁共振?；衔颿haetomugilinD為黃色的粘膠狀，可溶解于氯仿，甲醇，丙酮，乙酸乙酯，比旋光度為[a]。2。-21°(c=0.04，MeOH)。由核磁共振譜數(shù)據(jù)(見表1，圖3-12)和高分辨質(zhì)譜得出分子式為C23H2706C1，分子量為435，查閱參考文獻，然后綜合分析得到的數(shù)據(jù)，并結合文獻對照分析化合物的可能結構類型，最后根據(jù)物理特性和譜學特征確定標題化合物結構為命名為chaetomugilinD，結構經(jīng)過多個數(shù)據(jù)庫查新，發(fā)現(xiàn)國內(nèi)外尚沒有此化合物的報道，可確定此化合物為新的化合物。表l:化合物chaetomugilinD的NMR特征(500MHz,CDC13)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>6.化合物的細胞毒活性測定按上面粗提物抗癌活性測定方法，純化合物的測試濃度為10ug/ml，即用5u1DMSO溶解2ug發(fā)酵液乙酸乙酯提取物加入到培養(yǎng)槽中，結果得到24小時后的平均死致死率為75.2%綜上所述，從銀杏內(nèi)生真菌菌株6^"0啦'咖W"OS"/Z7發(fā)酵液的乙酸乙酯萃取物中分離到的化合物，具有很強的抗癌活性。海蝦致死試驗結果為在濃度為10ug/ml下，24小時后的平均死致死率為75.2%。該化合物為一種新的化合物，其分子式為C23H2706C1，分子量為435。命名為chaetomugilinD。權利要求1.一種銀杏內(nèi)生真菌菌株Chaetomiumglobosum發(fā)酵液的乙酸乙酯萃取物中分離的化合物，其特征在于，該化合物的結構式為該化合物的名稱為chaetomugilinD，分子式為C23H27O6Cl，分子量為435。2.權利要求1所述銀杏內(nèi)生真菌菌株CA3e&啦'wz^7o力osi/yz7發(fā)酵液的乙酸乙酯萃取物中分離的化合物的分離方法，其特征在于，按如下步驟進行1)菌種的發(fā)酵和發(fā)酵液的濃縮吸取銀杏內(nèi)生真菌菌株Ow"o聰'wmg/o6osww的菌懸液lml，加入到1000ml裝有200ml液體培養(yǎng)基的三角瓶中，在轉(zhuǎn)速150rpm，28。C下培養(yǎng)5天，結束發(fā)酵，過濾得到發(fā)酵液30L和菌絲體，菌絲體在5(TC下烘干，平均菌重4.6g/L;2)粗提物的制備濾液共30L，用等體^^的乙酸乙酯萃取3次，濃縮有機相，得到發(fā)酵液乙酸乙酯提取浸膏2.83g;3)化合物的分離純化發(fā)酵液乙酸乙酯提取浸膏通過硅膠柱層析、凝膠柱層析、反相柱層析分離提取其中的化學成分，常壓柱層析采用濕法裝柱和硅膠拌樣上柱，根據(jù)薄層展開情況選擇洗脫溶劑系統(tǒng)，反相柱層析采用加壓裝置，凝膠柱層析選用SephadexLH-20，采用甲醇以及甲醇-二氯甲烷洗脫，多次柱層析最后得到化合物chaetomugilinD。3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述的液體培養(yǎng)基的配方為:CaCl2:0.5g，KH2P04:O.lg，KC1:0.05g，MgS04.7H20:O.lg,glucose:20.0g，peptone:15.0g，H20:1000ml，pH=6.0。4.權利要求1所述的銀杏內(nèi)生真菌菌株CA3e^^^^oZ^s咖發(fā)酵液的乙酸乙酯萃取物中分離的化合物用于制備抗癌藥物的應用。全文摘要本發(fā)明公開了一種銀杏內(nèi)生真菌菌株Chaetomiumglobosum發(fā)酵液的乙酸乙酯萃取物中分離的化合物，該化合物的結構式為，如右。命名為chaetomugilinD，分子式為C₂₃H₂₇O₆Cl，分子量為435。經(jīng)申請人所進行的鑒定以及細胞毒活性試驗證明，該化合物對蝦卵brineshrimp有很高的細胞毒活性，能夠用于制備抗癌藥物的應用。文檔編號C07D493/00GK101481379SQ200910020820公開日2009年7月15日申請日期2009年1月7日優(yōu)先權日2009年1月7日發(fā)明者張雅梅,張鞍靈,秦建春,高錦明申請人:西北農(nóng)林科技大學