專利名稱：：利用褐多孔菌的發(fā)酵液分離制備化合物2,4-二羥基-5-甲基-苯乙酮的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種化合物的制備方法，特別涉及一種利用褐多孔菌的發(fā)酵液進(jìn)行分離制備化合物2，4-二羥基-5-甲基-苯乙酮(II)的方法。本發(fā)明制備的化合物2，4-二羥基-5-甲基-苯乙酮(II)是一新的天然產(chǎn)物，可抑制多種植物病原真菌的生長，對棉花枯萎病菌，玉米彎孢病菌，蘋果炭疽病菌有很好的抑制作用。
背景技術(shù)：
：高等真菌包含子囊菌綱(Ascoy^^"s)的部分種和擔(dān)子菌綱(5^^Wo/zy^"^)真菌。由于長期協(xié)同進(jìn)化作用，很多高等真菌形成了自己特有的化學(xué)防御體系。一旦受傷即啟動系統(tǒng)分泌酶將次生代謝物轉(zhuǎn)化為有活性的物質(zhì)。一個有趣的現(xiàn)象是:很多大型真菌的子實(shí)體從來不被昆蟲侵襲。其中一個典型的例子是乳燕屬中無活性的s&aroj^M^/"/7a7受損反應(yīng)后立刻轉(zhuǎn)化為具有很強(qiáng)活性的抗生素^OM7^ra7。此外，人們通過實(shí)驗(yàn)對比受傷和未受傷的子實(shí)體，發(fā)現(xiàn)子實(shí)體在受傷后很快產(chǎn)生大量的次生代謝產(chǎn)物，這些產(chǎn)物具有抗真菌、殺蟲等多種活性。由此看來，高等真菌也是生物源農(nóng)藥研究和開發(fā)的重要資源。從高等真菌發(fā)酵物中尋找具有殺蟲抑菌作用的先導(dǎo)化合物己引起國內(nèi)外學(xué)者的極大關(guān)注。一方面是因?yàn)閺拇笮驼婢胁粩喟l(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)新穎和具有顯著生物活性的化合物，且結(jié)構(gòu)變化大。這種結(jié)構(gòu)多樣性對于藥物(或農(nóng)藥)的發(fā)現(xiàn)有重要意義。另一方面，大型真菌不僅可以直接采來作為研究材料用，而且可以較方便地通過菌絲體或孢子發(fā)酵培養(yǎng)，其優(yōu)點(diǎn)是可以進(jìn)行工業(yè)化連續(xù)生產(chǎn)、規(guī)模大、產(chǎn)量高、發(fā)酵周期短、生產(chǎn)效益高。這為今后可能的工業(yè)化生產(chǎn)提供了資源保證，相對于受資源的限制植物源農(nóng)藥這是一個潛在的優(yōu)勢。改進(jìn)發(fā)酵過程中的條件，促進(jìn)發(fā)酵過程朝向提高目的產(chǎn)物的方向進(jìn)行，提高產(chǎn)物品質(zhì)，降低發(fā)酵成本，使投入產(chǎn)出比達(dá)到最小，是液體發(fā)酵研究的一個方向。藥用真菌在液體發(fā)酵過程中，除菌絲或孢子會大量增殖外，還會在發(fā)酵液中產(chǎn)生多糖、多肽、生物堿、萜類化合物、甾醇、植物激素及具有抗生素作用的各種化合物。這些物質(zhì)分別對心血管、肝臟、神經(jīng)系統(tǒng)、性器官等人體器官具有防病治病的作用，并有抗癌、抗炎、抗菌、抗衰老、抗?jié)兊裙πАＨ藗儗λ幱谜婢囊后w發(fā)酵，除獲得菌絲體外，還以獲取上述具有活性的次生代謝產(chǎn)物為目的。利用高等真菌開發(fā)農(nóng)藥已有商業(yè)成功的先例如德國學(xué)者從高等真菌嗜球果傘(5^ro力L〃27/sfe/ace77〃s)中發(fā)現(xiàn)了具有殺霉菌活性的先導(dǎo)化合物strobilurin，但該項(xiàng)目險些被中斷，因?yàn)樵摶衔镌谔镩g實(shí)驗(yàn)中顯示的活性并不強(qiáng)。從化學(xué)的角度講，strobilurin含有共軛雙鍵，不穩(wěn)定，易被氧化。依此為母體合成了約10000個化合物，從中德國巴斯夫公司(BASF)開發(fā)出的一類新農(nóng)藥Kresoxim-methyl(商品名Brio,Allegro,Diskus，Juwel，Mentor等殺霉菌劑)，另一家公司Zeneca也一直進(jìn)行類似的研究，該公司最后成功地合成了化合物ICIA5504，也具有非常好的活性，商品名為Amistar?，F(xiàn)在這類化合物全世界每年的銷售額已達(dá)到5億多美元。這類化合物可抑制線粒體的呼吸而致效，對子囊菌、擔(dān)子菌、不完全菌及卵綱菌等廣范圍病原菌具有殺菌效果，除水稻稻瘟病外，還對水稻紋枯病、穗枯病、葉枯病等水稻病害具有抑制效果。褐多孔菌(尸o7y/7omspiecesFr)為擔(dān)子菌綱，多孔菌目，多孔菌科，屬木腐菌，生于闊葉樹腐木上，有時也生于針葉樹上，導(dǎo)致樺、椴、水曲柳、槭或冷杉的木質(zhì)部形成白色腐朽。子實(shí)體大。蓋直徑4-16cm，厚2-3.5nim，扇形、腎形、近圓形至圓形，稍凸至平展，基部常下凹，粟褐色，中部色較深，有時表面全呈黑褐色，光滑，邊緣薄而銳，波浪狀至瓣裂。菌柄側(cè)生或偏生，長2-5mm，粗0.3-1.3cm，黑色或基部黑色，初期具細(xì)絨毛后變光滑。菌肉白色或近白色，厚0.5-2mm。菌管延生，長0.5_1.5mm，與菌肉色相似，干后呈淡粉灰色。管口角形至近圓形，每毫米5-7個。子實(shí)層中菌絲體無色透明，菌絲粗1.2-2um。孢子橢圓形至長橢圓形，一端尖狹，無色透明，平滑，5.8-7.5umX2.8-3.5um。它分布于遼寧、吉林、黑龍江、河北、甘肅、江蘇、安徽、浙江、江西、廣西、福建、四川、云南、貴州、西藏等地。它能調(diào)節(jié)內(nèi)分泌功能，軟化血管，調(diào)節(jié)血壓，溶化血栓，防治心肌梗死和腦血栓，并具有預(yù)防和延緩心臟老化，增強(qiáng)人體免疫功能，調(diào)節(jié)大腦神經(jīng)功能，抗衰老之功效。褐多孔菌配方的心腦血管系列湯劑可治療高心病、冠心病、風(fēng)心病、肺心病、心肌炎、心肌勞損、心肌梗死以及腦梗塞、腦積水、腦震蕩后遺癥等。大興安嶺原始森林的褐多孔菌及其系列煎劑，旨在改善或恢復(fù)心腦血管內(nèi)在的供給機(jī)制和代謝機(jī)制、溶栓和恢復(fù)膠原蛋白的活力，使血液中的甘油三脂、膽固醇等恢復(fù)正常，療效確切。相關(guān)文獻(xiàn)[A.A.Morais，R.B.Fo，S.V.FraizJr,Synthesisofthreenatural1，3-diarylpropanes:Tworevisedstructures,Phytochemistry，1989，28(1):239-242]和[蔡孟深，王蘭明.碳苷研究一XXVI.異黑豆素類似物的合成，化學(xué)學(xué)報，1990，48，1191-1198]僅報道了2，4-二羥基-5-甲基-苯乙酮作為人工合成的中間體;但未見其作為天然產(chǎn)物與抗植物病原真菌活性的相關(guān)報道。申請人曾經(jīng)首次報道了褐多孔菌發(fā)酵代謝物的抑菌活性初步研究(董艷紅，張鞍靈，馬慧妮，李曉明，高錦明，西北林學(xué)院學(xué)報，2007，22(2):105-108)，但是，發(fā)酵液中抗菌活性化合物尚不清楚。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于，提供一種利用褐多孔菌的發(fā)酵液進(jìn)行分離制備化合物2，4-二羥基-5-甲基-苯乙酮(II)的方法。為了實(shí)現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明采用如下的技術(shù)解決方案一種利用褐多孔菌的發(fā)酵液進(jìn)行分離制備化合物2，4-二羥基-5-甲基-苯乙酮(II)的方法，其特征在于，該方法采用平皿轉(zhuǎn)瓶液體培養(yǎng)的方法，首先用去皮馬鈴薯、葡萄糖、蒸餾水，經(jīng)滅菌制成培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基的pH值為7.2;然后培養(yǎng)發(fā)酵得發(fā)酵液，用乙酸乙酯萃取發(fā)酵液得到浸膏；通過有機(jī)溶劑浸提，經(jīng)加壓正相硅膠層析，用CHCl3/MeOH梯度洗脫，常壓柱層析采用濕法裝柱和硅膠拌樣上柱，根據(jù)薄層展開情況選擇洗脫溶劑系統(tǒng)，經(jīng)過多次正相硅膠柱層析、反相ds柱、S印hadexLH-20凝膠柱層析以及薄層制備與重結(jié)晶法進(jìn)行分離，得到化合物2，4-二羥基-5-甲基-苯乙酮(II)純品。具體按下述步驟進(jìn)行1)菌株的發(fā)酵和發(fā)酵液的濃縮從經(jīng)活化的固體平板菌種(28°C，培養(yǎng)56d)取810咖2大小的菌餅23塊接入以去皮馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，蒸餾水1000mL，pH7.2左右，121。C滅菌30min制成的液體PDA培養(yǎng)基(裝液量為50mL/150mL三角瓶)內(nèi)，于28'C旋轉(zhuǎn)搖床(150r/min)培養(yǎng)34天形成菌球后以10%的接種量轉(zhuǎn)接于發(fā)酵瓶中(裝液量為150mL/500raL三角瓶)，發(fā)酵1113d，共得到發(fā)酵液50L，將50L發(fā)酵液于55。C下減壓濃縮減半；2)粗提物的制備發(fā)酵物濃縮液用乙酸乙酯萃取，減壓濃縮得到乙酸乙酯浸膏16g;3)選取乙酸乙酯浸膏為材料，通過有機(jī)溶劑浸提，經(jīng)加壓正相硅膠層析，用CHCl3/MeOH梯度洗脫，常壓柱層析采用濕法裝柱和硅膠拌樣上柱，根據(jù)薄層展開情況選擇洗脫溶劑系統(tǒng)，經(jīng)過多次正相硅膠柱層析、反相C18柱、S印hadexLH-20凝膠柱層析以及薄層制備與重結(jié)晶法進(jìn)行分離，得到純化合物2，4-二羥基-5-甲基-苯乙酮(11)。本發(fā)明的方法具有培養(yǎng)條件溫和、培養(yǎng)基配制簡單易行、發(fā)酵時間短等優(yōu)點(diǎn)。將本發(fā)明制備的化合物2，4-二羥基-5-甲基-苯乙酮(II)開發(fā)成抗植物病原真菌抗生素的原藥，可抑制多種植物病原真菌菌絲體的生長，對棉花枯萎病菌，玉米彎孢病菌，蘋果炭疽病菌具有顯著的抑制作用，能夠解決2，4-二羥基-5-甲基-苯乙酮的原料來源問題。圖1是褐多孔菌發(fā)酵液分離制備化合物2，4-二羥基-5-甲基-苯乙酮(II)的流程圖2圖11是化合物2，4-二羥基-5-甲基-苯乙酮的結(jié)構(gòu)鑒定圖，其中，圖2是化合物n紅外光譜圖；圖3是化合物n紫外光譜圖；圖4是化合物n的力麗R;圖5是化合物II的13CNMR;圖6是化合物II的HMBC;圖7是化合物II的H-HC0SY;圖8是化合物II的HSQC;圖9是化合物II的N0ESY;圖10發(fā)酵原液中化合物II的HPLC色譜圖；圖ll化合物II抑菌曲線圖。以下結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。申請人首次從褐多孔菌(i^/ypomsp/"j^s)發(fā)酵液中進(jìn)行分離制備了化合物2，4-二羥基-5-甲基-苯乙酮(II)并測定了它的抗病原真菌活性。EC5。值證明，該天然產(chǎn)物可抑制多種植物病原真菌菌絲體的生長，對棉花枯萎病菌，玉米彎孢病菌，蘋果炭疽病菌具有顯著的抑制作用。已知的化合物2，4-二羥基-5-甲基-苯乙酮的化學(xué)結(jié)構(gòu)如下；具體實(shí)施方式鑒于該化合物在抗病原真菌方面表現(xiàn)出的很好活性，將2，4-二羥基-5-甲基-苯乙酮開發(fā)為抗病原真菌抗生素的原料藥有深入研究的價值。申請人在研究中摸索優(yōu)化了褐多孔菌(戶o/^on^pzV^M)的培養(yǎng)基、發(fā)酵條件及分離制備過程，從而使該菌種發(fā)酵液中2，4-二羥基-5-甲基-苯乙酮成分含量提高，發(fā)酵時間縮短(H13天)。本發(fā)明的利用褐多孔菌的發(fā)酵液進(jìn)行分離制備化合物2，4-二羥基-5-甲基-苯乙酮(II)的方法，所利用的微生物菌株為褐多孔菌(戶o^/w^/^^M)，來源于中國科學(xué)院昆明植物研究所。棉花枯萎病菌(尸〃sarj.卿ciYy印or7'咖/!朋s/w/"ecz^/w)、西瓜枯菱病菌(/^sariiz/z7。;rys/ari鵬/!/7_z>ew/z)、番琉灰霉病菌(5"iT"s"'/7tres)，小麥赤霉病菌WZZere77azeae)，馬鈴薯干腐病菌(尸〃5"ar7.鵬ay75770i^.鵬)，玉米大斑病菌(fxsero//7咖twrcic鵬)，蘋果炭疽病菌(Co/7""ric力〃鄰7oeospo/^.oiflfe51)，番莉早疫病菌(^Jtei7ai^'asoJa/j')，西瓜枯萎病菌(Fi/sariwflZw7ZuVey7〃歷)，由西4匕農(nóng)林科技大學(xué)微生物研究中心提供。上述微生物均為公開的生物材料。本發(fā)明主要利用的試劑為AmphotericinB，購自西安沃爾森生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)貨號AB0004，產(chǎn)地Amresco。石油醚(6090)，氯仿，乙酸乙酯，丙酮，甲醇，甲酸，乙酸試劑均為分析純；乙腈，甲醇試劑為色譜純。制備實(shí)施例l:該實(shí)施例采用平皿轉(zhuǎn)瓶液體培養(yǎng)的方法，其具體步驟如下1)菌株的發(fā)酵和發(fā)酵液的濃縮從經(jīng)活化的固體平板菌種(28°C，培養(yǎng)56d)取810腿2大小的菌餅23塊接入以去皮馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，蒸餾水1000mL，pH7.29左右，121"滅菌30min制成的液體PDA培養(yǎng)基(裝液量為50mL/150mL的三角瓶)內(nèi)，于28。C旋轉(zhuǎn)搖床(轉(zhuǎn)速150r/min)，培養(yǎng)34天形成菌球后以10%的接種量轉(zhuǎn)接于發(fā)酵瓶中(裝液量為150mL/500mL三角瓶)，發(fā)酵13d，共得到發(fā)酵液50L。將50L發(fā)酵液于55'C下減壓濃縮減半；2)粗提物的制備發(fā)酵物濃縮液用乙酸乙酯萃取，減壓濃縮得到乙酸乙酯浸膏16g;3)化合物的分離純化參見圖l，選取乙酸乙酯萃取物為材料，通過有機(jī)溶劑浸提乙酸乙酯浸膏，經(jīng)加壓正相硅膠層析，用CHCl3/MeOH梯度洗脫，常壓柱層析采用濕法裝柱和硅膠拌樣上柱，根據(jù)薄層展開情況選擇洗脫溶劑系統(tǒng)，經(jīng)過多次正相硅膠柱層析、反相U柱、S印hadexLH-20凝膠柱層析以及重結(jié)晶法進(jìn)行分離，最后得化合物的結(jié)晶。硅膠柱層析分離4號樣品。4號樣品干重4.38g;①號硅膠柱柱層析硅膠120g(200-300目)，拌樣硅膠6g(100-200目)。依次用氯仿/甲醇=98:2，氯仿/甲醇=95:5洗脫；洗脫液以120ml為單位接收，減壓蒸餾濃縮；經(jīng)GF254薄層硅膠板檢測，相似合并；共得7個組分。其中2，3組分均出現(xiàn)類似結(jié)晶合并約500mg，然后上S印hadexLH-20(氯仿/甲醇=1:1)凝膠進(jìn)一步分離純化。②號凝膠柱S印hadexLH-20(氯仿/甲醇=1:1)凝膠；用氯仿/甲醇=1:1溶解樣品，濕法上樣。氯仿/甲醇=1:1洗脫，經(jīng)GF254膠板檢測，碘粉和5%的硫酸乙醇顯色，相似合并；大約250mg。用丙酮溶解后，上③號硅膠柱進(jìn)一步分離純化。③號硅膠柱柱層析硅膠15g(200-300目)，拌樣硅膠0.6g(100-200目)。用氯仿/丙酮二100:1洗脫，經(jīng)GF254薄層硅膠板檢測，碘粉和5%的硫酸乙醇顯色，相似合并；約230mg。用丙酮溶解后，上④號硅膠柱進(jìn)一步分離純化。號硅膠柱柱層析硅膠15g(200-300目)，拌樣硅膠lg(100-200目)。用氯仿/甲醇二98:2洗脫，經(jīng)GF254薄層硅膠板檢測，碘粉和5%的硫酸乙醇顯色，相似合并；大約180mg。最后將180mg晶體用氯仿/丙酮進(jìn)行反復(fù)重結(jié)晶得到白色針狀晶體純化合物2，4-二羥基-5-甲基-苯乙酮(11)。制備實(shí)施例2:本實(shí)施例采用平皿轉(zhuǎn)瓶液體培養(yǎng)的方法，其具體步驟如下1)菌株的發(fā)酵和發(fā)酵液的濃縮從經(jīng)活化的固體平板菌種(25°C，培養(yǎng)67d)取68mm2大小的菌餅34塊接入以去皮馬鈴薯180g/L，葡萄糖18g/L，蒸餾水1000mL，pH7.2左右，121。C滅菌30min制成的液體PDA培養(yǎng)基(裝液量為50mL/150mL的三角瓶)內(nèi)，于25'C旋轉(zhuǎn)搖床(轉(zhuǎn)速130r/min)培養(yǎng)45天形成菌球后以10%的接種量轉(zhuǎn)接于發(fā)酵瓶中(裝液量為130mL/500mL的三角瓶)，發(fā)酵14d，共得到發(fā)酵液10L。將10L發(fā)酵液于55t:下減壓濃縮減半；2)粗提物的制備發(fā)酵物濃縮液用乙酸乙酯萃取，減壓濃縮得到乙酸乙酯浸膏2.78g;3)化合物的分離純化將乙酸乙酯浸膏上硅膠柱分離，以體積比100-85:0-15的CHCl3/MeOH系統(tǒng)梯度洗脫，每30ml為一個流份；在CHCl3/MeOH(體積比92:8)洗脫部分經(jīng)反復(fù)柱層析得到含2，4-二羥基-5-甲基-苯乙酮的一組混合物；該混合物采用石油醚-丙酮(體積比10:1)洗脫分離，再用薄層制備，最后用S印hadexLH-20凝膠柱層析(丙酮)，得到化合物2，4-二羥基-5-甲基-苯乙酮(II)純品。制備實(shí)施例3:本實(shí)施例采用平皿轉(zhuǎn)瓶液體培養(yǎng)的方法，其具體步驟如下1)菌株的發(fā)酵和發(fā)酵液的濃縮從經(jīng)活化的固體平板菌種(3CTC，培養(yǎng)45d)取68咖2大小的菌餅23塊接入以去皮馬鈴薯250g/L，葡萄糖25g/L，蒸餾水1000mL，pH7.2左右，12rC滅菌30min制成的液體PDA培養(yǎng)基內(nèi)(裝液量為50mL/150mL的三角瓶)，于34'C旋轉(zhuǎn)搖床(170r/min)培養(yǎng)34天形成菌球后以10%的接種量轉(zhuǎn)接于發(fā)酵瓶中(裝液量為170mL/500mL的三角瓶)，發(fā)酵lld，共得到發(fā)酵液15L。將15L發(fā)酵液于55"C下減壓濃縮減半；2)粗提物的制備發(fā)酵物濃縮液用乙酸乙酯萃取，減壓濃縮得到乙酸乙酯浸膏4.37g;3)化合物的分離純化將乙酸乙酯浸膏上硅膠柱分離，以體積比100-85:0-15的CHCl3/MeOH系統(tǒng)梯度洗脫，每60ml為一個流份；在CHCl3/MeOH(體積比93:7)洗脫部分經(jīng)反復(fù)柱層析得到含2，4-二羥基-5-甲基-苯乙酮的一組混合物；該混合物采用氯仿-丙酮(體積比99:1)，石油醚-丙酮(體積比95:5)洗脫分離，再用S印hadexLH-20凝膠柱層析(丙酮)，最后用氯仿-丙酮反復(fù)重結(jié)晶得到化合物2，4-二羥基-5-甲基-苯乙酮(II)純品。分別對實(shí)例l、2、3中所得化合物2，4-二羥基-5-甲基-苯乙酮HI)純品進(jìn)行理化及波普數(shù)據(jù)分析，結(jié)果如下白色針狀結(jié)晶(CHC13)，熔點(diǎn)167-168。C;EI-MSm/z(%):166(54,[M]+)，167(11.5)，151(100)，95(4)，77(4)，69(4.4)。正TOF陽MS國MS國ES:167.0700(計(jì)算值為166.0621);其分子式確定為C9H1()03。^-NMR(acetone-d6;ppm/S;500MHz)譜S2.20(3H，s,H-9);2.50(3H，s，H國8);6.25(1H，s，H-3);7.64(1H，s，H畫6);9.4(4國OH);12.6(2國OH)。13CNMR(ppm/S125MHz;acetone-d6)譜顯示112.8(s，C-l)，163.1(s，C畫2)，102.0(d,C國3)，162.7(s,C-4)，117.2(s，C曙5)，134.12(d，C-6)，12202.5(s，C-7)，26.0(q，C-8)，15.2(q，C-9)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[Phytochemistiy，1989，28(1):239-242;化學(xué)學(xué)報，1990，48，1191-1198]中記載一致。中文名稱為2，4-二羥基-5-甲基-苯乙酮(n)，結(jié)構(gòu)式為此結(jié)構(gòu)經(jīng)數(shù)據(jù)庫査新，可確認(rèn)此化合物為一種新的天然產(chǎn)物。HPLC法測定褐多孔菌(戶o(y/on^;/c^m)的發(fā)酵原液中化合物II的含量分析1.1色譜條件色譜柱采用AgilentzorbaxextendCl8(4.6mmx200mm，5um);流動相0.3%甲酸的乙腈溶液-水(0.3%甲酸的乙腈溶液50%-100%，水50%-0%)，梯度洗脫lh;流速0.4mLmin";柱溫18'C;檢測波長254nm。1.2對照品溶液的制備取干燥至恒重的化合物II適量，精密稱定，用甲醇依次配制成100pg/mL，80tig/mL，50^ig/mL，25pg/mL，10pg/mL等濃度備用。1.3供試品溶液的制備將發(fā)酵原液取50mL濃縮至干，2mL甲醇超聲溶解，微孔濾膜(0.45pm)過濾，然后再稀釋5倍備用。1.4線性關(guān)系考察精密吸取化合物2，4-二羥基-5-甲基-苯乙酮(II)(保留時間tR=7.486min)對照品溶液15jiL(不同濃度下100pg/mL，80pg/mL，50pg/mL，25(ig/mL，lOpg/mL)，注入液相色譜儀中，測定峰面積，以對照品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。回歸方程為Y=87.463x+147.13，r=0.9988，結(jié)果表明，化合物2，4-二羥基-5-甲基-苯乙酮(II)進(jìn)樣量0.151.5嗎范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。1.5發(fā)酵液中化合物2，4-二羥基-5-甲基-苯乙酮(II)含量測定取供試品，按1.3制備樣品供試液，按l.l色譜條件，分別進(jìn)樣對照品和供試品溶液，按外標(biāo)法計(jì)算發(fā)酵液中化合物II含量，結(jié)果發(fā)酵液中化合物2，4-二羥基-5-甲基-苯乙酮(II)含量為4.696pg/mL。生長速率抑制法測定化合物2，4-二羥基-5-甲基-苯乙酮(II)的毒力'"與EC50(jxg/mU測定化合物2，4-二羥基-5-甲基-苯乙酮(II)對9種病原菌的毒力時，在無菌條件下，將配制好的樣品丙酮溶液用融化的PSA培養(yǎng)基100)Lig/mL;初篩后對4，6，8,9號病原菌的毒力測定時依次配成0，5，10，20，50，100，200pg/mL系列濃度的帶藥培養(yǎng)基。陽性對照為AmphotericinB，濃度為200pg/mL。最后根據(jù)不同濃度的抑制率計(jì)算毒力，得出毒力方程和ECs。值。結(jié)果見表l、表2及圖11。表1.化合物2，4-二羥基-5-甲基-苯乙酮對9種病原真菌的抑制率<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表2.化合物2，4-二羥基-5-甲基-苯乙酮的毒力方程與ECs。((ig/mL)菌<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>綜上所述，本發(fā)明的方法制備的化合物2，4-二羥基-5-甲基-苯乙酮(II)能夠用于制備植物病原真菌抗生素的藥物應(yīng)用。權(quán)利要求1、一種利用褐多孔菌的發(fā)酵液進(jìn)行分離制備化合物2，4-二羥基-5-甲基-苯乙酮(II)的方法，其特征在于，該方法采用平皿轉(zhuǎn)瓶液體培養(yǎng)的方法，首先用去皮馬鈴薯、葡萄糖、蒸餾水，經(jīng)滅菌制成培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基的pH值為7.2；然后培養(yǎng)發(fā)酵得發(fā)酵液，用乙酸乙酯萃取發(fā)酵液得到浸膏；通過有機(jī)溶劑浸提，經(jīng)加壓正相硅膠層析，用CHCl3/MeOH梯度洗脫，常壓柱層析采用濕法裝柱和硅膠拌樣上柱，根據(jù)薄層展開情況選擇洗脫溶劑系統(tǒng)，經(jīng)過多次正相硅膠柱層析、反相C18柱、SephadexLH-20凝膠柱層析以及薄層制備與重結(jié)晶法進(jìn)行分離，得到純化合物2，4-二羥基-5-甲基-苯乙酮(II)。2、如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的化合物2，4-二羥基-5-甲基-苯乙酮(II)的制備按下述步驟進(jìn)行1)菌株的發(fā)酵和發(fā)酵液的濃縮從經(jīng)活化的固體平板菌種取810mm2大小的菌餅23塊接入以去皮馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，蒸餾水1000mL，pH為7.2，經(jīng)121。C滅菌30min制成的液體PDA培養(yǎng)基內(nèi)，于28。C旋轉(zhuǎn)搖床培養(yǎng)34天形成菌球后以10%的接種量轉(zhuǎn)接于發(fā)酵瓶中，發(fā)酵ll13d，共得到發(fā)酵液50L，將50L發(fā)酵液于55'C下減壓濃縮減半;2)粗提物的制備發(fā)酵物濃縮液用乙酸乙酯萃取，減壓濃縮得到乙酸乙酯浸膏16g;3)以乙酸乙酯浸膏為材料，通過有機(jī)溶劑浸提，經(jīng)加壓正相硅膠層析，用CHCl3/MeOH梯度洗脫，常壓柱層析采用濕法裝柱和硅膠拌樣上柱，根據(jù)薄層展開情況選擇洗脫溶劑系統(tǒng)，經(jīng)過多次正相硅膠柱層析、反相Cw柱、S印hadexLH-20凝膠柱層析以及薄層制備與重結(jié)晶法進(jìn)行分離，得到化合物2，4-二羥基-5-甲基-苯乙酮(II)純品。3、如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的化合物2，4-二羥基-5-甲基-苯乙酮(II)為新的天然產(chǎn)物，其分子式為C9Hu)03，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>4、權(quán)利要求1或2或3所述的化合物2，4-二羥基-5-甲基-苯乙酮(II)用于制備植物病原真菌抗生素的藥物應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及一種利用褐多孔菌(Polyporuspicipes)的發(fā)酵液進(jìn)行分離制備化合物2，4-二羥基-5-甲基-苯乙酮的方法，該方法采用平皿轉(zhuǎn)瓶液體培養(yǎng)的方法，首先用去皮馬鈴薯，葡萄糖，蒸餾水，pH7.2左右，滅菌制成培養(yǎng)基；然后培養(yǎng)發(fā)酵得發(fā)酵液，用乙酸乙酯萃取發(fā)酵液得到浸膏，用柱層析分離，以氯仿-甲醇系統(tǒng)梯度洗脫；經(jīng)過多次正相硅膠柱層析、反相C₁₈柱、SephadexLH-20凝膠柱層析以及重結(jié)晶法進(jìn)行分離，得到純化合物2，4-二羥基-5-甲基-苯乙酮(II)。本發(fā)明可以將化合物2，4-二羥基-5-甲基-苯乙酮(II)開發(fā)成為抗病原真菌抗生素的原藥，并解決2，4-二羥基-5-甲基-苯乙酮的原料來源問題，具有培養(yǎng)條件溫和、培養(yǎng)基配制簡單易行、發(fā)酵時間短等優(yōu)點(diǎn)。文檔編號C07C49/00GK101492356SQ20091002096公開日2009年7月29日申請日期2009年1月19日優(yōu)先權(quán)日2009年1月19日發(fā)明者張煒玲,張鞍靈,勇李,石新衛(wèi),解思達(dá),高錦明申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)