專(zhuān)利名稱(chēng)：高爾基體蛋白gp73的純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于體外診斷試劑領(lǐng)域，涉及診斷試劑抗原的制備，具體為高爾基體蛋白 GP73的純化方法。
背景技術(shù)：
高爾基體蛋白GP73是存在于高爾基體的一種跨膜蛋白，2000年Kladney研究表 明，在正常的人體肝組織中，GP73主要由膽管上皮細(xì)胞表達(dá)，而肝細(xì)胞表達(dá)很少甚至不表 達(dá)。肝細(xì)胞受到病毒感染后可引起GP73的表達(dá)上調(diào)。進(jìn)一步研究提示無(wú)論是由病毒(HBV 及HCV)感染引起還是由非病毒原因(酒精性肝病及自身免疫性肝炎)引起的肝病患者中， GP73水平均有一定程度的升高。在一項(xiàng)研究中，與肝硬化患者相比，144例肝癌患者的血清 GP73水平顯著升高。GP73診斷肝癌的敏感性為69%，特異性為75%。對(duì)于早期肝癌(Tl: 單個(gè)結(jié)節(jié)，直徑< 2cm及T2 單個(gè)結(jié)節(jié)，直徑位于2cm 5cm之間或小于三個(gè)結(jié)節(jié)，每個(gè)直徑 < 3cm)的診斷，GP73的敏感性(62% )顯著優(yōu)于AFP(25% )。而且，AFP水平低于20ng/mL 的肝癌患者中，有57% (32/56)的人GP73水平顯著升高。從而提示，肝癌患者血清中GP73 水平明顯增高，并且對(duì)于診斷早期肝癌，GP73可能優(yōu)于AFP。Cassandra因此提出GP73可 能成為更好的診斷肝癌尤其是早期肝癌的血清標(biāo)志物。我國(guó)研究人員率先就GP73在中國(guó)乙肝肝癌患者中的敏感性進(jìn)行了初步檢測(cè)，他 們對(duì)37例乙肝肝癌患者、25例乙肝病毒攜帶者、12例非肝病患者和99例正常健康志愿者 的AFP和GP73及相關(guān)肝癌血清指標(biāo)進(jìn)行了檢測(cè)和比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GP73在肝癌患者中的 敏感性達(dá)到76. 9%。以上結(jié)果初步揭示了 GP73高表達(dá)與我國(guó)乙肝為基礎(chǔ)的肝癌患者的密 切關(guān)系，證明了其敏感性遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于傳統(tǒng)的AFP方法，為GP73成為肝癌早期診斷的新手段邁 出了重要的第一步，并成為來(lái)自亞洲地區(qū)的有關(guān)GP73的惟一報(bào)道。本發(fā)明采用包涵體的洗滌、離子交換層析、疏水層析的方法來(lái)純化抗原，其制作成 本低廉、工藝簡(jiǎn)便，純化蛋白純度高等優(yōu)點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種制備高爾基體蛋白GP73的方法。具體步驟包括1.包涵體洗滌稱(chēng)取Ig表達(dá)的包涵體，重懸于20ml洗滌液I (20mMTris，0. 15麗aCl，0. 75 % TritonX-100,0. 5MEDTA, ImMDTT, ρΗ8. 0)中，室溫?cái)嚢?30min，13500rmp4°C 離心 20min，棄 上清；沉淀再次重懸于20ml洗滌液II (20mM Tris, 3Murea, 0. 2mMDTT, pH8. 0)中，室溫?cái)?拌30min，13500rmp4°C離心20min，棄上清；沉淀最后重懸于洗滌液III (20mMTris, 4Murea, 0. 2mMDTT, pH8. 0)中，室溫?cái)嚢?30min，13500rmp4°C離心 20min，棄上清。2.離子交換層析洗滌好的包涵體溶于緩沖液(20mMTris，6MUrea，lOmMDTT，ρΗΙΟ. 0)中進(jìn)行離子 交換層析。層析柱=Q FF ；平衡緩沖液:25MTris,8MUrea, ρΗΙΟ. 0 ；洗脫緩沖液:25mMTris,IMUrea, IMNaCl, ρΗΙΟ. O。先用平衡緩沖液平衡柱子30min，流速20ml/min，基線穩(wěn)定后上樣，上樣完成后再用平衡緩沖液平衡20min，然后30min增加洗脫緩沖液到100%，收集洗脫峰。3.疏水層析收集離子交換層析的洗脫峰進(jìn)行疏水層析。層析柱Phenyl Sepharose High Performance ；平衡緩沖液20mMTris，1M(NH4)2S04, PH7. 5 ；洗脫緩沖液20mMTris，pH7. 5。 先用平衡緩沖液平衡柱子30min，流速lOml/min，待基線穩(wěn)定后上樣，上樣完成后再用平衡 緩沖液平衡20min，然后20min增加洗脫緩沖液到100%，收集洗脫峰。SDS-PAGE檢測(cè)GP73， 純度在90%以上。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的方案作進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例一1.包涵體洗滌包涵體用不同的洗液洗滌三遍，備用。2.離子交換層析將洗滌好后的包涵體溶于緩沖液，利用蛋白純化系統(tǒng)AKTA進(jìn)行層析，收集洗脫 峰，待處理。3.疏水層析將離子交換層析所得的洗脫液進(jìn)行疏水層析，收集洗脫單峰即得高爾基體蛋白 GP73。
權(quán)利要求
高爾基體蛋白的純化方法，其特征在于以下步驟(1)稱(chēng)取1g表達(dá)的包涵體，重懸于20ml洗滌液Ⅰ(20mMTris，0.15MNaCl，0.75％TritonX-100，0.5MEDTA，1mMDTT，pH8.0)中，室溫?cái)嚢?0min，13500rmp4℃離心20min，棄上清；沉淀再次重懸于20ml洗滌液Ⅱ(20mM Tris，3Murea，0.2mMDTT，pH8.0)中，室溫?cái)嚢?0min，13500rmp4℃離心20min，棄上清；沉淀最后重懸于洗滌液Ⅲ(20mMTris，4Murea，0.2mMDTT，pH8.0)中，室溫?cái)嚢?0min，13500rmp4℃離心20min，棄上清；(2)洗滌好的包涵體溶于緩沖液(20mMTris，6MUrea，10mMDTT，pH10.0)中進(jìn)行離子交換層析；層析柱Q FF；平衡緩沖液25MTris，8MUrea，pH10.0；洗脫緩沖液25mMTris，1MUrea，，1MNaCl，pH10.0。先用平衡緩沖液平衡柱子30min，流速20ml/min，基線穩(wěn)定后上樣，上樣完成后再用平衡緩沖液平衡20min，然后30min增加洗脫緩沖液到100％，收集洗脫峰；(3)收集離子交換層析的洗脫峰進(jìn)行疏水層析。層析柱Phenyl Sepharose HighPerformance；平衡緩沖液20mMTris，1M(NH4)2SO4，PH7.5；洗脫緩沖液20mMTris，pH7.5；先用平衡緩沖液平衡柱子30min，流速10ml/min，待基線穩(wěn)定后上樣，上樣完成后再用平衡緩沖液平衡20min，然后20min增加洗脫緩沖液到100％，收集洗脫峰；SDS-PAGE檢測(cè)GP73，純度在90％以上。
2.按權(quán)利要求1所述高爾基體蛋白的純化方法，其特征在于按以上步驟純化高爾基 體蛋白GP73。
全文摘要
具有良好應(yīng)用前景的新肝癌標(biāo)記物高爾基體蛋白GP73的純化方法。采用離子交換層析，疏水層析，收集單峰，具有成本低廉、工藝簡(jiǎn)便易行、蛋白收率高等優(yōu)點(diǎn)。其制備方法包括將表達(dá)的蛋白包涵體洗滌，再變性溶解，分別利用離子交換層析和疏水層析進(jìn)行純化，收集洗脫單峰，即得高爾基體蛋白。
文檔編號(hào)C07K14/435GK101812125SQ20091002442
公開(kāi)日2010年8月25日 申請(qǐng)日期2009年2月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月24日
發(fā)明者于秀菊, 呂棠山, 符芳芳 申請(qǐng)人:江蘇默樂(lè)生物科技有限公司