專利名稱：：恩諾沙星單克隆抗體及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及恩諾沙星的特異性單克隆抗體及其制備方法和應(yīng)用，還涉及其雜交瘤細(xì)胞林，屬于免疫化學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：恩諾沙星(enrofloxacin)是第一個(gè)畜禽專用的氟喹諾酮類藥物，因其具有抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)、易吸收、體內(nèi)分布廣等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于獸醫(yī)臨床預(yù)防和治療。隨著該藥物在食源性動(dòng)物中的廣泛應(yīng)用，由其引起的毒副作用如神經(jīng)中毒、腎功能損傷、過敏反應(yīng)、幼畜關(guān)節(jié)炎等也日益增多。由于該藥物在動(dòng)物性食品中的殘留而誘導(dǎo)人類致病菌產(chǎn)生耐藥性問題的發(fā)現(xiàn)，進(jìn)一步加深了人們對(duì)該藥的認(rèn)識(shí)。為了減少該藥物對(duì)人類的危害，美國(guó)禁止將恩諾沙星用于食品動(dòng)物，而日本厚生勞動(dòng)省自2007年5月將魚、貝類產(chǎn)品中恩諾沙星的殘留限量由0.lppm調(diào)整為0.Olppm。因此，開展其殘留4企測(cè)方法的研究至關(guān)重要。為了監(jiān)控恩諾沙星在動(dòng)物性食品中的殘留，聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)/世界衛(wèi)生組織(冊(cè)0)和食品添加劑聯(lián)合專家委員會(huì)(JCEFA)制定了恩諾沙星在牛、豬、禽的最高殘留限量(maximumresiduelimit,MRL)。美國(guó)FDA規(guī)定恩諾沙星禁用于食品動(dòng)物，歐盟(EC)規(guī)定恩諾沙星在牛、豬、家禽的肝、腎、肌肉中最高殘留限量(MRL)為30ug/kg;世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦的恩諾沙星MRL為40jng/kg。我國(guó)農(nóng)業(yè)部規(guī)定恩諾沙星在肌肉、牛奶中的MRL不得超過100yg/kg。因此加強(qiáng)對(duì)該藥在動(dòng)物性食品中的殘留檢測(cè)和監(jiān)督顯得尤為突出。然而作為半抗原的恩諾沙星本身不能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體，必須將其與載體蛋白偶聯(lián)獲得人工合成的完全抗原才具有抗原性。而小分子抗原與載體蛋白的偶聯(lián)效果及細(xì)胞融合后陽(yáng)性克隆的篩選都直接影響著抗體的制備效果，是抗體制備的關(guān)鍵。為了建立恩諾沙星酶免疫分析方法和金標(biāo)試紙，需要制備特異性強(qiáng)、可大量生產(chǎn)的抗恩諾沙星的單克隆抗體。申請(qǐng)人4企索發(fā)現(xiàn)中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)(2004,37(7):1060-1064)的一篇文獻(xiàn)中介紹了恩諾沙星單克隆抗體的制備及其鑒定，主要是用碳二亞胺法合成了2種恩諾沙星(enrofloxacin，ENFX)人工抗原ENFX-BSA和ENFX-0VA,用紫外掃描和分析載體蛋白的氨基酸組成等方法對(duì)人工抗原進(jìn)行鑒定，ENFX與BSA的結(jié)合比約為48:1。用ENFX-BSA免疫BALB/C小鼠，采用顯微克隆技術(shù)最終篩選出2抹特異性分泌細(xì)胞2C5和5D5并獲取腹水，純化后腹水效價(jià)分別為1:3200和1:6400。2C5和5D5均屬IgG2a型抗體。該單抗對(duì)氟會(huì)諾酮類藥物有很高的選擇性，與環(huán)丙沙星、麻保沙星、沙拉沙星、達(dá)氟沙星的交叉反應(yīng)率分別為110.84%、27.40%、71.05%和37.41%,交叉反應(yīng)率比較高，特異性不強(qiáng)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對(duì)以上現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點(diǎn)，提出與環(huán)丙沙星和沙拉沙星無(wú)交叉反應(yīng)的，并具有特異性的、可大量生產(chǎn)的恩諾沙星單克隆抗體。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供分泌該特異性抗恩諾沙星單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞抹。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明產(chǎn)生恩諾沙星單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞4朱6A4或8E6，6A4是小鼠雜交瘤細(xì)^^系CGMCCNo.3016，于2009年4月9日j呆藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)是CGMCCNo.3016;8E6是小鼠雜交瘤細(xì)胞系CGMCCNo.3017，于2009年4月9曰保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)是CGMCCNo.3017。由小鼠雜交瘤細(xì)胞林6A4或小鼠雜交瘤細(xì)胞林8E6分泌的單克隆抗體。小鼠雜交瘤細(xì)胞林6A4或小鼠雜交瘤細(xì)胞抹8E6分泌的單克隆抗體的的制備方法，包括以下步驟a.制備免疫原和包被原采用碳二亞胺法將載體蛋白與恩諾沙星偶聯(lián)，合成免疫原和包被原；b.動(dòng)物免疫注射以小鼠作為免疫動(dòng)物，腹腔注射免疫原與等量弗氏完全佐劑混合液，進(jìn)行第一次免疫注射；3周后進(jìn)行第二次免疫注射；再間隔2周后進(jìn)行第三次免疫注射；c.篩選動(dòng)物免疫血清用酶聯(lián)免疫吸附法和竟?fàn)幟?關(guān)免疫吸附法篩選免疫鼠血清，對(duì)小鼠進(jìn)行加強(qiáng)免疫注射；d.制備雜交瘤細(xì)胞取經(jīng)過加強(qiáng)免疫的小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，經(jīng)過3次亞克隆獲得穩(wěn)定分泌抗恩諾沙星的單克隆抗體細(xì)胞4朱6A4或8E6;e.制備并純化單克隆抗體用滅菌石蠟對(duì)小鼠進(jìn)行免疫，7天后分別腹腔注射所述單克隆抗體細(xì)胞抹6A4或8E6,7-10天采集腹水，用辛酸-硫酸銨鹽析法對(duì)腹水純化，即得恩諾沙星單克隆抗體。其中，步驟a中所述載體蛋白為牛血清白蛋白、人血清白蛋白和卵清白蛋白的至少一種，對(duì)應(yīng)的免疫原為ENR-BSA、ENR-HAS，包被原為ENR-0VA;所述石友二亞胺法中，EDC和NHS活化恩^i若沙星的反應(yīng)時(shí)間為2小時(shí)，恩諾沙星與載體蛋白反應(yīng)12小時(shí)。所述步驟b中的各次免疫注射劑量是50-100ng/只。所述步驟d中，在進(jìn)行細(xì)胞融合之前，將免疫鼠血清利用間接ELISA方法進(jìn)行效價(jià)4企測(cè)，同時(shí)利用間接竟?fàn)嶦LISA方法4企測(cè)血清對(duì)恩諾沙星的抑制效果，用#企測(cè)后的鼠脾細(xì)胞進(jìn)行融合。所述步驟e中對(duì)免疫小鼠腹腔進(jìn)行單克隆抗體細(xì)胞林的注射量為1-5x106個(gè)/只。通過亞型鑒定得出本發(fā)明單克隆抗體的亞型為IgGl型。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供該單克隆抗體在制備檢測(cè)恩諾沙星試劑中的應(yīng)用。其主要是將其應(yīng)用于制備恩諾沙星殘留檢測(cè)試劑盒和膠體金試條紙。本發(fā)明的有益效果是通過兩林小鼠雜交瘤細(xì)胞林6A4和8E6產(chǎn)生特異性強(qiáng)的恩諾沙星單克隆抗體，與其它氟喹諾酮類藥物交叉反應(yīng)率低，能夠大量生產(chǎn)，可用于制備檢測(cè)恩諾沙星的酶聯(lián)免疫分析法試劑盒和膠體金試紙條，達(dá)到快速且靈敏地檢測(cè)牛奶，肌肉及水產(chǎn)品中的恩諾沙星藥物殘留的效果。下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。圖1:ENR-HSA免疫原質(zhì)譜檢測(cè)圖。圖2:ENR-BSA免疫原質(zhì)譜檢測(cè)圖。圖3:ENR-OVA包被原質(zhì)譜檢測(cè)圖。圖4:兩個(gè)單克隆抗體8E6，和6A4，的亞型鑒定圖。圖5:本發(fā)明的單克隆抗體8E6，與恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品的反應(yīng)曲線。圖6:本發(fā)明的單克隆抗體6A4，與恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品的反應(yīng)曲線。具體實(shí)施例方式實(shí)施例一試劑與材料準(zhǔn)備恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)，牛血清白蛋白(BSA)(Amresco，0332)、人血清白蛋白(HSA)(Sigma,A9511),卵清白蛋白(OVA)(Sigma,A5503),碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)(Sigma，E6383)N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)(Sigma,130672)，N，N-二曱基曱酰胺(DMF)(Sigma,D4551),弗氏完全佐劑(Sigma,F5881),弗氏不完全佐劑(Sigma,F5506),四曱基聯(lián)苯胺(TMBXAmresco，0759)，HAT(Sigma，H0262)和HT(Sigma，H0137)，氯化鈉(Amresco，0241)，氯化鉀(Amresco,0395)，磷酸二氬鐘(Sigma,P9791)，磷酸氬二鈉(Sigma,71639),羊抗鼠IgG-HRP(Jackson,115-035-044)，二甲基亞砜(DMSO)(Applichem，0231),聚乙二醇4000(PEG4000)(Sigma,P7306),DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco，11995)，胎牛血清(Gibco，C2027050)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞Balb/c小鼠(6-8周齡，雌性)，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，SP2/0(小鼠骨髓瘤細(xì)胞)由中科院生物物理研究所感染與免疫研究中心唐捷教;l受惠贈(zèng)。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)步驟如下a.制備免疫原ENR-BSA、ENR-HSA和包^皮原ENR-OVA:本發(fā)明所述的人工抗原采用碳二亞胺法[1制備恩諾沙星藥物與載體蛋白復(fù)合物，并略做改進(jìn)(1)取100jliL的DMF分別溶解2.4mg,2.5mg,1.6mg的恩諾沙星，將溶解后的恩諾沙星加入100iL的PBS(pH8.0)中，混勻；(2)在震蕩狀態(tài)下緩慢加入150iiL0.3M的EDC，繼續(xù)加入150jnL0.2M的NHS，室溫反應(yīng)2h;(3)將反應(yīng)產(chǎn)物緩慢加入含10mgBSA,HSA和OVA的500jiL的PBS(pH8.0)溶液中，4。C避光反應(yīng)12小時(shí)；(4)將上述反應(yīng)產(chǎn)物裝入透析袋(截留分子量3500)進(jìn)行透析，2小時(shí)換液一次，共換液3次，以13000轉(zhuǎn)離心30min，收集上清，分裝保存于-2(TC備用。(5)對(duì)透析后的免疫原ENR-HSA，ENR-BSA和包被原ENR-OVA，分別進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，結(jié)果見圖1、圖2，圖3。圖1顯示偶聯(lián)物ENR-HSA和載體蛋白的偶聯(lián)比是9:1;圖2顯示偶聯(lián)物ENR-BSA和載體蛋白BSA的偶聯(lián)比是5:1;圖3顯示偶聯(lián)物ENR-OVA和載體蛋白OVA的偶聯(lián)比是9:1，從圖示結(jié)果可以判定偶聯(lián)成功。b.動(dòng)物免疫采用Balb/c小鼠作為免疫動(dòng)物，免疫原是ENR-HSA或ENR-BSA,免疫劑量是50-100jug/只，第一次用免疫原與等量弗氏完全佐劑混合乳化，腹腔注射，劑量為100pg/0.2ml/只；3周后用免疫原與等量弗氏不完全佐劑混合乳化進(jìn)行笫二次免疫注射，劑量為50|ag/0.2ml/只，間隔2周后，以不完全佐劑乳化的抗原進(jìn)行第三次免疫注射，劑量同上。c.篩選動(dòng)物免疫血清以上免疫小鼠在第三次免疫后7-IO天用ELISA法測(cè)血清效價(jià)，同時(shí)利用間接竟?fàn)嶦LISA方法[2)檢測(cè)血清對(duì)恩諾沙星的抑制效果。選取血清效價(jià)高的小鼠進(jìn)行加強(qiáng)免疫，免疫三天后取脾臟。d.制備雜交瘤細(xì)胞取上述免疫Balb/c小鼠的脾細(xì)胞，以50%的PEG4000作融合劑，將免疫脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞按5:1的比例進(jìn)行細(xì)胞融合。采用間接ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清，篩選出陽(yáng)性克隆，對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)一步用間接竟?fàn)嶦LISA法檢測(cè)，仍為陽(yáng)性者利用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，經(jīng)3次亞克隆以后，檢測(cè)有單克隆生長(zhǎng)孔的細(xì)胞培養(yǎng)上清，陽(yáng)性率達(dá)到100%,得到穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞才朱6A4和8E6;該步驟中建立間接ELISA法的步驟如下最佳抗原包被稀釋度的選擇，采用方陣法確定包被原濃度(1)包被用O.05mol/L、PH9.6的碳酸鹽緩沖液將包被原稀釋成一系列濃度加入酶標(biāo)板中，100nL/孔，4。C包被過夜；(2)洗滌甩凈包被液，洗滌液是含1%。吐溫的0.01mol/LPH7.4的PBS，用洗板機(jī)洗板3次，并在吸水紙上拍干；(3)封閉每孔加入200pL的0.5%BSA封閉液，37。C孵育lh;(4)洗滌同上；(5)—抗加入系列濃度的抗體，100nL/孔，37。C孵育lh;(6)洗滌同上；(7)酶標(biāo)二抗加入l:IOOOO稀釋的羊抗鼠-HRP,100^07孔,37。C孵育lh，洗滌同上；(8)顯色每孔加入10(VL的TMB顯色液，20-25。C顯色10min;(9)終止反應(yīng)加入2M的H2S04終止液終止反應(yīng)，50pL/孔，并于酶標(biāo)儀上讀取ODw值。判定標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)陽(yáng)性血清0D值及P/N》2.1,確定包,皮原最佳包被稀釋度為l:28000(濃度為O.lng/ml)。具體結(jié)果見表l<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表1抗原、抗體最佳工作濃度該步驟中建立間接竟?fàn)嶦LISA法的步驟如下(1)包被用O.05mol/L、PH9.6的碳酸鹽緩沖液將包被原稀釋為O.lug/ml,加入酶標(biāo)板中，100nL/孔，4。C包^皮過夜；(2)洗滌甩凈包被液，洗滌液是含1%。吐溫的0.Olmol/LPH7.4的PBS，用洗板機(jī)洗板3次，并在吸水紙上拍干；(3)封閉每孔加入200pL的0.5%BSA封閉液，37。C孵育lh;(4)洗滌同上；(5)加樣先將相鄰兩孔酶標(biāo)板孔內(nèi)加入稀釋液，50pL/孔，與此兩孔相鄰的孔內(nèi)加入適當(dāng)濃度的恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品，50pL/孔，最后加入稀釋好的抗體，50pL/孔，酶標(biāo);tl稍作震蕩混勻，37。C孵育lh;(6)洗滌同上；(7)酶標(biāo)二抗加入l:10000稀釋的羊抗鼠-HRP,100nL/孔，37°C孵育lh，洗滌同上；(8)顯色每孔加入100pL的TMB顯色液，20-25。C顯色10min;(9)終止反應(yīng)加入2mol/L的H2S04終止液終止反應(yīng)，50nL/孔，并于酶標(biāo)^義上讀取OD"。值。判定標(biāo)準(zhǔn)首先，乂人肉眼可以看出，抑制孔與未抑制孔顏色的變化，若抑制孔顏色較淺或者無(wú)色，說明有特異性抗體產(chǎn)生，反之則無(wú)特異性抗體產(chǎn)生。其次，根據(jù)OD值可以判定，抑制孔OD值小于未抑制孔OD值，說明有特異性抗體產(chǎn)生。采用有抑制效果血清的免疫小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，并篩選出能分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞林?？贵w特異性的強(qiáng)弱可纟艮據(jù)竟?fàn)幰种坡实拇笮砼卸?。竟?fàn)幰种坡?1-B/BO(B為加竟?fàn)幬锏囊种瓶譕D值，BO為不加竟?fàn)幬锏年?yáng)性對(duì)照孔OD值)。e.制備并純化單克隆抗體，效價(jià)測(cè)定首先制備和鑒定單克隆抗體細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)取出凍存管，立即于37°C水浴中融解，之后移入培養(yǎng)亞內(nèi)擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含10。/。FBS的DMEM培養(yǎng)基。其中，凍存管內(nèi)凍存的是對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的能夠穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞抹6A4和8E6。用滅菌石蠟免疫8只Balb/c小鼠，0.5ml/只，將小鼠分為兩組，每組4只，7天后分別對(duì)每組小鼠腹腔注射雜交瘤細(xì)胞6A4和8E6，注射劑量為1-5><106個(gè)/只，7-10天采集腹水，得到單克隆抗體，命名為6A4'和8E6'。采用購(gòu)自Pierce/>司的鼠源單抗亞型鑒定試劑盒(MouseMonoclonalAntibodySubtypeIdentificationKit)對(duì)本發(fā)明所得到的單克隆抗體進(jìn)行亞型鑒定，其亞型鑒定結(jié)果表明，單克隆抗體6A4，和8E6，均為IgGl亞型，與已有文獻(xiàn)才艮道的IgG2a亞型不同，結(jié)果見表2和圖4。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>然后純化單克隆抗體(以下簡(jiǎn)稱單抗)用辛酸J危酸銨鹽析法對(duì)上述腹水進(jìn)行處理，具體步驟如下(1)取1倍體積的腹水，加入4倍體積的0.06mol/LPH4.8的NaAC-HAC緩沖液，輕輕混勻；(2)按每ml腹水加入30%的辛酸的量，加好后，室溫于搖床上搖30min。之后4'C靜置3h;(3)4。C在13謂rpm，離心30min，取上清，用NaOH調(diào)PH至7.4;(4)向上清中加入等體積的飽和硫酸銨溶液，使其終濃度為50%,4。C-睜置lh。之后4。C13000rpm，離心10min;(5)棄上清，用適量的0.OlmolPH7.2的PBS懸浮沉淀；(6)將單抗懸液轉(zhuǎn)入透析袋內(nèi)透析12h,中間換3次透析液；(7)透析后的單抗用離子交換法做進(jìn)一步純化，所用的離子交換柱為HiTrapQHPlmL，上樣緩沖液為20mMTris-HCL，pH8.6，洗脫緩沖液為20mMTris-HCL，1MNaCL，pH8.6,當(dāng)鹽濃度達(dá)到30%時(shí)開始收集單抗，lml/管。(8)純化后的單抗進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)其純度。利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度，根據(jù)測(cè)定結(jié)果將單抗調(diào)整為lmg/ml，然后測(cè)其效價(jià)，分裝，-8(TC保存；(9)單抗效價(jià)的測(cè)定以0.lpg/ml的包被原ENR-OVA包被ELISA板，將純化的6A4，單抗進(jìn)行1:2000，1:4000,1:8000，1:16000，1:32000,1:64000，1:128000稀釋，<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>(0.05pig/ml)和8E6，(0.05pg/ml)抗體，同時(shí)加入不同濃度的恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品，加有8E6，抗體的孔內(nèi)加入的恩諾沙星濃度分另U為10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1.25ng/mL、0.625ng/mL、0.313ng/mL、0ng/mL，加有6A4，才元體的孑L內(nèi)加入的恩諾沙星濃度分別為100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL,、12.5ng/mL、6.25ng/mL、3.125ng/mL、0ng/mL,重復(fù)測(cè)定3次，結(jié)果分別見表4、表5。以藥物濃度的自然對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以B/BO值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)曲，結(jié)果見圖5，圖6。根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算6A4，和8E6，單抗的IC50值分別為14ng/ml和2.3ng/ml。從標(biāo)準(zhǔn)曲線的OD值和IC50值可以看出，6A4，單抗在ENR濃度為3.125ng/ml時(shí)，仍具有很好的抑制效果；而8E6，單抗在ENR濃度為0.313ng/ml時(shí)，抑制效果明顯，這說明本發(fā)明中篩選到的兩抹單克隆抗體具有4艮高的特異性和敏感性。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>表4單克隆抗體8E6，的抑制效果<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>表5單克隆抗體6A4，的抑制效果(11)單克隆抗體親和力的測(cè)定根據(jù)Gosling介紹的ELISA方法進(jìn)^f亍抗體親和力的測(cè)定，其親和力的大小用親和常數(shù)Ka的大小來表示，公式為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>親和常數(shù)的單位為濃度的倒數(shù)，即克分子濃度(L/moL)，其值越高表示抗原抗體結(jié)合的緊密程度越高。其檢測(cè)過程如下第一步、確定抗原，抗體最佳作用濃度1、將人工抗原分別進(jìn)行13000,26000，52000，104000,208000,416000倍稀釋后各包被4條，100L/孑L，37°C，溫育2h,洗滌、封閉；2、將抗體進(jìn)^f于7500,15000，30000,60000，120000，240000，480000倍稀釋，分別加于2條中，100L/孔，室溫溫育1h;3、將這兩條中的抗體分別移入第二條中，室溫溫育1h;4、將這兩條洗滌加酶標(biāo)二抗，繼續(xù)做ELISA，最后測(cè)定OD值A(chǔ)l;5、后兩條按上述步驟，最后測(cè)定0D值A(chǔ)2。6、根據(jù)公式A丄(c卜A2(c)計(jì)算f值，選取所有f值都小于10%的抗原，抗體稀釋度，根據(jù)OD值大小確定最佳抗原濃度為208000倍稀釋，最佳抗體濃度為120000倍稀釋。第二步、測(cè)定親和力1、配制一系列濃度抗原6個(gè)；2、在加有最佳濃度抗體的EP管內(nèi)加入等量系列濃度抗原，共7管，最后一管加入抗原稀釋液，室溫下過夜；3、同時(shí)將抗原進(jìn)行208000倍稀釋后進(jìn)行包^:，室溫下過夜，洗板，封閉；4、將第二步的反應(yīng)產(chǎn)物取100juL加入以上封閉的板孔內(nèi)，室溫下進(jìn)行ELISA,最后測(cè)定OD值A(chǔ);5、根據(jù)Scatchard公式-V)計(jì)算其斜率值，其中，ot為游離抗原的濃度，V為結(jié)合抗體位點(diǎn)與總抗體位點(diǎn)的比，所得親和力的大小即親和常數(shù)Ka,為斜率值的負(fù)數(shù)。得到的結(jié)果是單克隆抗體8E6，的親和常數(shù)為1.8*1(T，單克隆抗體6A4，的親和力為1.2*101()。實(shí)施例二藥物交叉反應(yīng)試-驗(yàn)按實(shí)施例一中建立的單抗篩選間接竟?fàn)嶦LISA方法進(jìn)行，恩諾沙星的單克隆抗體與恩諾沙星半抗原結(jié)構(gòu)類似物如鹽酸環(huán)丙沙星，氧氟沙星，曱磺酸達(dá)氟沙星，曱磺酸培氟沙星，鹽酸二氟沙星，諾氟沙星，洛美沙星進(jìn)行竟?fàn)幵囼?yàn)，將這些標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成不同濃度進(jìn)行間接竟?fàn)嶦LISA，繪制抑制曲線，計(jì)算竟?fàn)幬锏腎"值和交叉反應(yīng)率，其最高交叉反應(yīng)率為1.464%。文獻(xiàn)中報(bào)道的恩諾沙星的單克隆抗體與環(huán)丙沙星的交叉反應(yīng)率達(dá)到110.874，與沙*扭沙星的交叉反應(yīng)率達(dá)到71.05%，與其它的會(huì)諾酮類藥物反應(yīng)的交叉率也達(dá)到20%以上，而本發(fā)明所制備的抗恩諾沙星的單克隆抗體只與恩諾沙星反應(yīng)，與其它喹諾酮類藥物反應(yīng)的交叉率在1.5%以下，因此，本發(fā)明中所制備的抗恩諾沙星的單克隆抗體具有更高的特異性，具體結(jié)果見表6。<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>表6單克隆抗體8E6，和6A4，與其他喹諾酮類藥物的交叉反應(yīng)實(shí)施例三本實(shí)施例是本發(fā)明中單克隆抗體8E6，在建立檢測(cè)恩諾沙星殘留ELISA方法的應(yīng)用舉例，可以用于雞肉，水產(chǎn)品，牛奶及蜂蜜中恩諾沙星殘留的才企測(cè)。以雞肉(市場(chǎng)購(gòu)買)為例，說明;險(xiǎn)測(cè)雞肉中恩i若沙星殘留的主要步驟如下1、樣品前處理稱取15g雞肉樣品進(jìn)行勻漿，稱取0.5g勻漿液，加入1.5ml80%的用樣品稀釋液稀釋的曱醇溶液，震蕩混勻30min，2000g，離心10min,耳又lOOjaL上清與90(VL樣品稀釋液混勻，取5OpL進(jìn)4亍4會(huì)測(cè)。2、本發(fā)明中試劑盒的檢測(cè)原理是間接竟?fàn)嶦LISA方法，將包被原OVA-ENR包被于微孔板上，加入系列稀釋的恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品或者樣品，再加入抗恩諾沙星的單克隆抗體(本實(shí)施例中選取的單克隆抗體是8E6，)，樣品中殘留的恩諾沙星與包被的抗原同時(shí)與抗恩諾沙星的抗體竟?fàn)幮越Y(jié)合，然后加入酶標(biāo)二抗，TMB顯色，顯色后在酶標(biāo)^[義上讀取OD45。，樣品中恩諾沙星的含量與樣本吸光度值呈負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線相比，即可得出相應(yīng)殘留物恩諾沙星的含量。3、本發(fā)明中抗恩諾沙星的單克隆抗體的高特異性，使得與現(xiàn)有的樣品處理方法相比，大大簡(jiǎn)化了肌肉樣品的前處理步驟，只需要80%曱醇提取后直接進(jìn)行10倍稀釋即可用于檢測(cè)。由于抗體的高親和力，使得檢測(cè)的靈敏度大大提高，標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍為0.313-10ng/ml。采用以上方法，對(duì)20份雞肉樣品進(jìn)行檢測(cè)，見表7，結(jié)果表明利用恩諾沙星抗體建立的ELISA方法檢測(cè)雞肉組織中恩諾沙星的殘留，結(jié)果與高效液相色譜法測(cè)得的結(jié)果符合率達(dá)到畫。<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>實(shí)施例四本實(shí)施例是本發(fā)明中的單克隆抗體6A4，在制備恩諾沙星殘留的膠體金試紙條中的應(yīng)用舉例，主要是應(yīng)用于沖企測(cè)月幾肉(雞肉，魚肉，豬肉)、牛奶、蜂蜜中的恩諾沙星殘留。反應(yīng)原理采用竟?fàn)幏▽?duì)小分子藥物恩諾沙星進(jìn)行半定量檢測(cè)，樣品中存在的恩諾沙星分子在沿試紙條上移過程中先與金顆粒標(biāo)記的抗體蛋白結(jié)合，固定在NC膜上的包被原與恩諾沙星同時(shí)竟?fàn)幗Y(jié)合抗體，T線的顯色強(qiáng)弱與樣品中殘留恩諾沙星的含量成反比，若樣品中無(wú)恩諾沙星殘留，則金標(biāo)抗體全部與包被原反應(yīng)，試紙條的T線顯色。當(dāng)C、T線均顯色時(shí)表示陰性，當(dāng)C線顯色T線不顯色時(shí)則表示為陽(yáng)性，當(dāng)C線不顯色，T線顯色或不顯色都表示試紙條失效。(1)具體操作步驟如下1、樣品前處理本方法中各種樣品的處理方法同ELISA方法中的樣品前處理方法；2、將試紙條^:于干凈平整的臺(tái)面上，用滴管吸取^f寺測(cè)樣品溶液，滴加12滴于樣品墊上；3、等待紫紅色條帶的出現(xiàn)，靜置反應(yīng)5-IO分鐘時(shí)讀取測(cè)試結(jié)果,IO分鐘以后判定無(wú)效。(2)試紙條檢測(cè)限的確定1、取試紙條平放于試驗(yàn)臺(tái)上，分別用含不同濃度(O，1，2,3,4，5，6，7，8,9,10ng/ml)恩諾沙星的PBS溶液作為待測(cè)樣品液，滴加于樣品墊上，反應(yīng)后5-10min判定結(jié)果，確定試紙條的-險(xiǎn)測(cè)限為2ng/ml，對(duì)牛奶和各種肌肉的4企測(cè)限可以才艮據(jù);險(xiǎn)測(cè)要求進(jìn)行不同的稀釋，2乘以不同的稀釋倍數(shù)即為各種樣品的檢測(cè)限。舉例如下如果樣品進(jìn)行10倍稀釋，則對(duì)該樣品的4全測(cè)限為20ng/ml，含量大于20ng/ml的樣品判定為陽(yáng)性，含量小于20ng/ml的樣品判定為陰性。按上述方法對(duì)20份購(gòu)買于市場(chǎng)的不含恩諾沙星(經(jīng)高效液相色譜法證實(shí)不含恩諾沙星)的牛奶樣品進(jìn)行不同濃度的恩諾沙星添加試驗(yàn)，然后采用膠體金試紙法與高效液相色譜法進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果表明兩種方法的符合率達(dá)到100%,檢測(cè)結(jié)果見表8。<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>20陰性(C、T線均顯色)<25表8膠體金方法與高效液相色譜法檢測(cè)結(jié)果比較除上述實(shí)施例外，本發(fā)明還可以有其他實(shí)施方式。凡采用等同替換或等效變換形成的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明要求的保護(hù)范圍。參考文獻(xiàn)1、HoltzappleCK,BuckleySA,StankerLH.Productionandcharacterizationofmonoclonalantibodiesagainstsarafloxacinandcros畫reactivitystudiesofrelatedfluoroquinolones.JournalofAgriculturalandFoodChemistry,1997，45:1984-1990.2、楊利國(guó)，《酶免疫測(cè)定技術(shù)》，南京大學(xué)出版社，1998.權(quán)利要求1.產(chǎn)生恩諾沙星單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株6A4或8E6，6A4是小鼠雜交瘤細(xì)胞系CGMCCNo.3016,8E6是小鼠雜交瘤細(xì)胞系CGMCCNo.3017。2.由小鼠雜交瘤細(xì)胞抹6A4或小鼠雜交瘤細(xì)胞林8E6分泌的單克隆抗體6A4，或8E6，。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述小鼠雜交瘤細(xì)胞抹6A4或小鼠雜交瘤細(xì)胞林8E6分泌的單克隆抗體的制備方法，包括以下步驟a.制備免疫原和包被原采用碳二亞胺法將載體蛋白與恩諾沙星偶聯(lián)，合成免疫原和包被原；b.動(dòng)物免疫注射以小鼠作為免疫動(dòng)物，腹腔注射免疫厚與等量弗氏完全佐劑混合液，進(jìn)行第一次免疫注射；3周后進(jìn)行第二次免疫；再間隔2周后進(jìn)行第三次免疫注射；c.篩選動(dòng)物免疫血清用酶聯(lián)免疫吸附法和竟?fàn)幟嘎?lián)免疫吸附法篩選免疫鼠血清，對(duì)小鼠進(jìn)行加強(qiáng)免疫注射；d.制備雜交瘤細(xì)胞取經(jīng)過加強(qiáng)免疫的小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，經(jīng)過3次亞克隆獲得穩(wěn)定分泌抗恩諾沙星的單克隆抗體細(xì)胞抹6A4或8E6;e.制備并純化單克隆抗體用滅菌石蠟對(duì)小鼠進(jìn)行免疫注射，7天后分別腹腔注射所述單克隆抗體細(xì)胞抹6A4或8E6,7-10天采集腹水，用辛酸-硫酸銨鹽析法對(duì)腹水純化，即得恩諾沙星單克隆抗體6A4，或8E6'。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述小鼠雜交瘤細(xì)胞抹6A4或小鼠雜交瘤細(xì)胞抹8E6分泌的單克隆抗體的制備方法，其特征在于步驟a中所述載體蛋白為牛血清白蛋白、人血清白蛋白和卵清白蛋白的至少一種，對(duì)應(yīng)的免疫原為ENR-BSA、ENR-HAS,包^皮原為ENR-OVA;所述石友二亞胺法中，EDC和NHS活化恩諾沙星的反應(yīng)時(shí)間為2小時(shí)，恩諾沙星與載體蛋白反應(yīng)12小時(shí)。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述小鼠雜交瘤細(xì)胞林6A4或小鼠雜交瘤細(xì)胞抹8E6分泌的單克隆抗體的制備方法，其特征在于所述步驟b中的各次免疫注射劑量是50-100|ag/只。6.根據(jù)權(quán)利要求3所述小鼠雜交瘤細(xì)胞抹6A4或小鼠雜交瘤細(xì)胞林8E6分泌的單克隆抗體的制備方法，其特征在于所述步驟d中，在進(jìn)行細(xì)胞融合之前，將免疫鼠血清利用間接ELISA方法進(jìn)行效價(jià)檢測(cè)，同時(shí)利用間接竟?fàn)嶦LISA方法檢測(cè)血清對(duì)恩諾沙星的抑制效果，用沖企測(cè)后的鼠脾細(xì)月包進(jìn)4亍融合。7.根據(jù)權(quán)利要求3所述小鼠雜交瘤細(xì)胞抹6A4或小鼠雜交瘤細(xì)胞抹8E6分泌的單克隆抗體的腹水制備方法，其特征在于所述步驟e中對(duì)免疫小鼠腹腔進(jìn)行單克隆抗體細(xì)胞林的注射量為l-5xl(^個(gè)/只8.根據(jù)權(quán)利要求2所述小鼠雜交瘤細(xì)胞抹6A4或小鼠雜交瘤細(xì)胞抹8E6分泌的單克隆抗體，其特征在于所述抗體亞型為IgGl型。9.根據(jù)權(quán)利要求2所述小鼠雜交瘤細(xì)胞抹6A4或小鼠雜交瘤細(xì)胞抹8E6分泌的單克隆抗體在制備檢測(cè)恩諾沙星試劑中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及恩諾沙星的特異性單克隆抗體及應(yīng)用，還涉及其雜交瘤細(xì)胞株，屬于免疫化學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
。由小鼠雜交瘤細(xì)胞株6A4和8E6產(chǎn)生的，其制備方法是采用碳二亞胺法將恩諾沙星和載體蛋白BSA、HSA及OVA偶聯(lián)，合成人工免疫原EnR-BSA，EnR-HSA和包被原EnR-OVA；用合成的人工免疫原EnR-BSA，EnR-HSA免疫Balb/c小鼠，取其免疫小鼠脾細(xì)胞和SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，用包被原EnR-OVA包被，建立間接ELISA法和間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法篩選出能穩(wěn)定分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞株。用獲得的細(xì)胞株免疫Balb/c小鼠制備腹水，用辛酸-硫酸銨法和離子交換法純化腹水，兩細(xì)胞株純化后的抗體效價(jià)分別達(dá)1.024×10^-6和1.28×10^-5以上。該單克隆抗體特異性強(qiáng)，應(yīng)用于制備恩諾沙星殘留檢測(cè)試劑盒和膠體金試紙條，可靈敏快速地檢測(cè)恩諾沙星殘留。文檔編號(hào)C07K16/44GK101565690SQ20091002779公開日2009年10月28日申請(qǐng)日期2009年5月21日優(yōu)先權(quán)日2009年5月21日發(fā)明者宏唐,王曉艷申請(qǐng)人:泰州市蛋白質(zhì)工程研究院