專利名稱：：一種小分子肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及有機(jī)化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種肽，特別是含5-ll個(gè)氨基酸的肽。
背景技術(shù)：
：肺癌在我國(guó)城市惡心腫瘤的發(fā)病中已居于首位，且其發(fā)病率仍呈明顯上升趨勢(shì)。由于肺癌常常發(fā)生胸膜轉(zhuǎn)移引起胸水，因此胸水脫落細(xì)胞檢查是一種常用的診斷方法，具體方法如下①臨床新鮮抽取的不同原發(fā)病患者的胸水50ml，離心1000轉(zhuǎn)/分鐘X5分鐘，留取離心細(xì)胞lml;②用吸管吸取約滴在玻璃片上，用另一個(gè)玻璃片進(jìn)行刮片；③涼干后，75%酒精+甲醛固定10分鐘；④蘇木素染色1分鐘；⑤伊紅染色1分鐘；⑥樹(shù)膠封片。但是該方法不敏感，在大量胸水中查找癌細(xì)胞，猶如大海撈針，而且胸水中細(xì)胞成分雜，有間皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等，加上癌細(xì)胞不典型，影響了該方法的確診率。本發(fā)明人長(zhǎng)期致力于肺癌的治療和診斷工作，曾利用"一個(gè)珠子一個(gè)化合物"的組合化學(xué)肽庫(kù)篩選得到一個(gè)可特異性識(shí)別非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞(A549)的小分子肽cNGQGEQc，并發(fā)現(xiàn)該肽中，對(duì)特異性粘附A549作出主要貢獻(xiàn)的結(jié)構(gòu)是-NGXG-以及六肽長(zhǎng)度。但是A549僅是肺癌細(xì)胞中的一種，該小分子肽能否與肺癌患者胸水中癌細(xì)胞發(fā)生特異性結(jié)合，尚不清楚。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提高胸水脫落細(xì)胞檢査法診斷肺癌的確診率。本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案是一種小分子肽，該小分子肽的氨基酸序列為cdGIGPQc(SEQNO.l);其中，c表示D型半胱氨酸，d表示D型天冬氨酸，G表示L型甘氨酸，I表示L型異亮氨酸，P表示L型脯氨酸，Q表示L型谷氨酸。本發(fā)明小分子肽可用常規(guī)的固相合成法(LamKS，SalmonSE，HershEM，HrubyVJ，KazmierskiWM，KnappRJ.A^w"1991，15《82)制備，具體方法如下取表面具有NH2活性基團(tuán)的樹(shù)脂珠子，先用二甲基酰胺洗滌，然后浸泡在二甲基酰胺中使所述珠子充分腫脹，接著按照所述小分子肽的氨基酸序列依次將相應(yīng)的氨基酸偶聯(lián)到所述珠子上并形成肽鏈，最后將珠子上連接的肽洗脫即可。本發(fā)明小分子肽能與肺癌細(xì)胞特異性結(jié)合，將其連接在固相中可用于分離胸水中的肺癌細(xì)胞，有助于提高胸水脫落細(xì)胞檢查法診斷非小細(xì)胞肺癌的確診率。本發(fā)明小分子肽用于分離胸水中的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的方法是將本發(fā)明小分子肽固定在載體上，然后與胸水脫落細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)液中共培養(yǎng)12小時(shí)后收集所述的載體，再用3DMEM培養(yǎng)液洗滌后用胰蛋白酶分離粘附在所述小分子肽上的細(xì)胞，即可。所述的載體應(yīng)是易于分離且性質(zhì)穩(wěn)定的固體物質(zhì)，如樹(shù)脂珠子。樹(shù)脂珠子具有性質(zhì)穩(wěn)定和表面可修飾的特點(diǎn)，是一種非常合適的小分子肽載體；此外，樹(shù)脂珠子還具有可磁化的特點(diǎn)，很容易利用其磁性將非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞從胸水脫落細(xì)胞中分離出來(lái)。為了更好地實(shí)施上述方法，本發(fā)明還提供一種用于分離非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的樹(shù)脂珠子，該樹(shù)脂珠子由表面具有NH2活性基團(tuán)的樹(shù)脂珠子與本發(fā)明小分了肽通過(guò)-CO-NH-連接構(gòu)成。本發(fā)明所述樹(shù)脂珠子可采用固相合成法，按照本發(fā)明小分子肽的序列依次將相應(yīng)氨基酸偶聯(lián)到樹(shù)脂珠子上即可。用本發(fā)明所述樹(shù)脂珠子分離胸水中非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的方法是將本發(fā)明所述樹(shù)脂珠子與胸水脫落細(xì)胞在函EM培養(yǎng)液中共培養(yǎng)12小時(shí)，然后收集所述的樹(shù)脂珠子，先用DMEM培養(yǎng)液洗滌，再用胰蛋白酶消化分離得到非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞。本發(fā)明磁性樹(shù)脂珠子上具有對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞具有很高特異性的小分子肽，用于輔助胸水脫落細(xì)胞檢査法診斷非小細(xì)胞肺癌，可將確診率提高至13.51%。圖1是SSCP-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖，其中泳道M是marker,1是AGT突變的肺癌細(xì)胞株的PCR產(chǎn)物，2是GGT突變的肺癌細(xì)胞株的PCR產(chǎn)物，3是AGT和GGT突變的肺癌細(xì)胞株的PCR產(chǎn)物，4是A549標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞株的PCR產(chǎn)物，5是受檢細(xì)胞的PCR產(chǎn)物。具體實(shí)施例方式1、利用固相合成方法制備本發(fā)明所述的樹(shù)脂珠子(1)稱取lg表面具有NH2活性基團(tuán)的樹(shù)脂珠子，用二甲基酰胺洗滌3次，然后在二甲基酰胺浸泡至珠子充分腫脹；(2)加入半胱氨酸和N，N'-二異丙基碳二亞胺，室溫下反應(yīng)2小時(shí)后，用DMF洗滌珠子5次，接著加入20%的哌啶，在室溫下反應(yīng)5min，再加入20%的DMF,反應(yīng)15min，完全脫去Fmoc保護(hù)基；(3)按步驟(2)方法依次偶聯(lián)天冬氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、甘氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺和半胱氨酸；(4)將連接完最后一個(gè)氨基酸的珠子經(jīng)25%的三氟乙酸洗滌一次，蒸餾水洗滌3次，即得本發(fā)明所述的樹(shù)脂珠子。2、本發(fā)明小分子肽的獲得將上述方法獲得的本發(fā)明所述的樹(shù)脂珠子用蒸餾水洗滌，即可獲得本發(fā)明小分子肽。3、用肺癌細(xì)胞A549驗(yàn)證珠子上小分子肽的生物活性4①抽取正常健康人血3ml，加入約1000個(gè)肺癌細(xì)胞A549，充分混合；②吸取100^1(約7500個(gè))本發(fā)明珠子，PBS液洗滌1次，75%酒精洗滌2次，培養(yǎng)液DMEM洗滌1次，分別加入盛有2mlDMEM培養(yǎng)液的6孔培養(yǎng)板內(nèi)；同時(shí)設(shè)無(wú)小分子肽的珠子作為對(duì)照。③吸?、僦袦?zhǔn)備的細(xì)胞300pl(約100個(gè)肺癌細(xì)胞)，加入②中6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)箱(37GC,5%C02)中培養(yǎng)12h;將上述6孔培養(yǎng)板中珠子，集中到25ml的離心管中，收集珠子，胰蛋白酶分離粘附珠子上細(xì)胞，HE染色細(xì)胞，顯微鏡下顯示細(xì)胞核大，染色深，符合肺癌細(xì)胞A549形態(tài)。單鏈構(gòu)像多態(tài)性-多聚酶鏈反應(yīng)(SSCP-PCR)技術(shù)分析珠子上粘附細(xì)胞k-ras基因突變A.采用以下兩對(duì)引物擴(kuò)增K-ras基因第12外顯子首次PCR的引物為Pl:5'-GGCCTGCTGAAAATGACTGA-3、，P2:5'-GCACCAGTAATATGCATA-3';PCR反應(yīng)體系反應(yīng)液體積50nl，其中4XdNTP2pl，Taq酶l.OU，10Xbuffer2^1，引物各5Opmol/L，模板DNA(珠子上粘附細(xì)胞中提取的DNA)2^1;PCR反應(yīng)條件95。Clmin55。Clmin>30個(gè)循環(huán)，72°Clmin72。C延伸10min。第二次PCR的引物P3:5'-GACTGAATATAAACTTGTGGT-3'，P3:5、-TGTTGGATCAT-ATTCGTC-3、；PCR反應(yīng)體系取首次PCR反應(yīng)產(chǎn)物lpl作為模板，其余試劑和反應(yīng)液體積同上；PCR反應(yīng)條件95°Clmin、55°Clmin、30個(gè)循環(huán)，72°Clmin72°C延伸10min。用2°/。的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。B.根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果，取lnl第二次PCR反應(yīng)產(chǎn)物，加適當(dāng)?shù)恼麴s水與等體積的加樣緩沖液(100%甲酰胺，0.05°/。二甲苯青，0.05%溴酚蘭)混合，以已知AGT和GGT突變的肺癌細(xì)胞株及正常肺組織的擴(kuò)增產(chǎn)物作為對(duì)照。90'C變性5min，立即置冰浴。聚丙烯酰胺凝膠電泳，電壓200V，常溫下3h。采用銀染試劑盒銀染10。/。乙醇+冰乙酸+FEC固定20min，銀染色10-20min，10。/。乙酸終止固定10min，沖水晾干封膜。結(jié)果如圖l所示，待測(cè)標(biāo)本珠子上粘附細(xì)胞出現(xiàn)k-ms基因突變，與對(duì)照A549細(xì)胞和標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照一致，提示珠子上粘附的細(xì)胞為A549細(xì)胞，表明載有小分子肽的樹(shù)脂珠子有粘附肺癌細(xì)胞的生物活性。4、樹(shù)脂珠子上小分子肽的特異性粘附非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的驗(yàn)證(1)實(shí)驗(yàn)材料A549(肺腺癌)、Calu-l(肺鱗癌)、H178(肺腺鱗癌)、DMS53(小細(xì)胞肺癌)、HBE(永生化支氣管上皮細(xì)胞)、MCF-7(乳腺癌)、PC3(前列腺癌)、SKOV-3(卵巢癌)、HT-29(結(jié)腸癌)、HepG2(肝癌)、HL-60(白血病)、Jurkat(淋巴瘤)、Raji(淋巴瘤)和Hs68(纖維母細(xì)胞)。(2)實(shí)驗(yàn)方法將上述不同種類的細(xì)胞株分別與小分子肽cdGIGPQc珠子混合，置于37'C和5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)，顯微鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)100個(gè)珠子，計(jì)算每種細(xì)胞與小分子肽的結(jié)合百分率，以此評(píng)價(jià)小分子肽與細(xì)胞粘附結(jié)合的特異性。(3)結(jié)果如表1所示，本發(fā)明小分子肽與非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的陽(yáng)性結(jié)合率明顯高于其他癌細(xì)胞，尤其是與A549和Calu-l的結(jié)合率更高達(dá)95%以上，可見(jiàn)，本發(fā)明小分子肽可特異性結(jié)合非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞。6表1<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>5、本發(fā)明小分子肽在分離患者胸水中非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的應(yīng)用(1)實(shí)驗(yàn)方法對(duì)臨床已確診的肺癌病例、間皮瘤、胃癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、肺炎和胸膜結(jié)核患者的胸水進(jìn)行常規(guī)細(xì)胞學(xué)診斷和用本發(fā)明樹(shù)脂珠子聯(lián)合常規(guī)細(xì)胞學(xué)診斷，同時(shí)設(shè)常規(guī)細(xì)胞學(xué)診斷對(duì)照。其中，常規(guī)細(xì)胞學(xué)診斷和用本發(fā)明樹(shù)脂珠子聯(lián)合常規(guī)細(xì)胞學(xué)診斷方法如下①臨床新鮮抽取的不同原發(fā)病患者的胸水50ml，1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，在細(xì)胞培養(yǎng)室操凈臺(tái)中棄取上清液，留取離心細(xì)胞lml;②吸取200^1本發(fā)明樹(shù)脂珠子，PBS液洗滌1次，75%酒精洗滌2次，培養(yǎng)液DMEM洗滌1次，加入600pl培養(yǎng)液DMEM，分別加入6孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔再加入2mlDMEM;(D在6孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔加入100pl步驟①中準(zhǔn)備的細(xì)胞，輕輕搖動(dòng)6孔板，使細(xì)胞和珠子混合，然后將培養(yǎng)板放入37t，5e/。C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h;④將上述6孔培養(yǎng)板中珠子，集中到25ml的離心管中，收集樹(shù)脂珠子，胰蛋白酶分離粘附樹(shù)脂珠子上細(xì)胞，取5pl細(xì)胞進(jìn)行涂片，蘇木素染色lmin，伊紅染色lmin，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，并通過(guò)免疫組織化學(xué)染色(抗人CEA單克隆抗體)觀察。(2)實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)果如表1所示，對(duì)37例肺癌病例的胸水進(jìn)行了常規(guī)細(xì)胞學(xué)診斷和用本發(fā)明樹(shù)脂珠子聯(lián)合常規(guī)細(xì)胞學(xué)診斷，常規(guī)細(xì)胞學(xué)方法僅診斷出一例陽(yáng)性，陽(yáng)性檢出率為2.70%，而用本發(fā)明樹(shù)脂珠子聯(lián)合常規(guī)細(xì)胞學(xué)方法檢出了5例陽(yáng)性，陽(yáng)性檢出率達(dá)到13.51%,陽(yáng)性率提高了10.81%,可見(jiàn)用本發(fā)明樹(shù)脂珠子輔助常規(guī)細(xì)胞學(xué)方法診斷可明顯提高肺癌的確診率。另外，從對(duì)其他疾病引起的胸水的檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，用本發(fā)明樹(shù)脂珠子聯(lián)合常規(guī)細(xì)胞學(xué)方法均沒(méi)有出現(xiàn)假陽(yáng)性的結(jié)果，可見(jiàn)本發(fā)明樹(shù)脂珠子對(duì)肺癌細(xì)胞的特異性粘附能力很高。表2臨床診斷例數(shù)常規(guī)細(xì)胞學(xué)+-陽(yáng)性率珠子++細(xì)胞學(xué)診斷陽(yáng)性率肺癌37362.70%53213.51%間皮瘤3120371607結(jié)腸癌21102乳腺癌31203肺炎30303胸膜結(jié)核908098序列表<110>南方醫(yī)科大學(xué)<120>—種小分子肽及其應(yīng)用<160〉5<170>PatentInversion3.3<210>1<211>8<212〉PRT<213>人工序列<400>1CysAspGlylieGlyProGinCys15<210〉2<211>20<212〉DNA<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>權(quán)利要求1、一種小分子肽，該小分子肽的氨基酸序列為cdGIGPQc；其中，c表示D型半胱氨酸，d表示D型天冬氨酸，G表示L型甘氨酸，I表示L型異亮氨酸，P表示L型脯氨酸，Q表示L型谷氨酸。2、權(quán)利要求1所述的小分子肽在分離非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中的應(yīng)用。3、一種用于分離非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的樹(shù)脂珠子，該樹(shù)脂珠子由表面具有NH2活性基團(tuán)的樹(shù)脂珠子與權(quán)利要求1所述的小分子肽通過(guò)-CO-NH-連接構(gòu)成。全文摘要本發(fā)明提供了一種小分子肽，其氨基酸序列為cdGIGPQc(SEQNO.1)，可采用固相合成法制備得到。該小分子肽對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞具有特異性粘附作用，可用于分離非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞。本發(fā)明還提供一種樹(shù)脂珠子，該樹(shù)脂珠子由表面具有NH₂活性基團(tuán)的樹(shù)脂珠子與本發(fā)明小分子肽通過(guò)-CO-NH-連接構(gòu)成，對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞具有很高的特異性，用于輔助胸水脫落細(xì)胞檢查法診斷非小細(xì)胞肺癌，可將確診率提高至13.51％。文檔編號(hào)C07K7/06GK101486754SQ200910037239公開(kāi)日2009年7月22日申請(qǐng)日期2009年2月18日優(yōu)先權(quán)日2009年2月18日發(fā)明者帆張,蔡穎謙,穎郭,郭琳瑯申請(qǐng)人:南方醫(yī)科大學(xué)