專利名稱：：一種人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長抑制因子嵌合多肽及其制備方法和在靶向性抗腫瘤活性中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長抑制因子嵌合多肽及其制備方法和在靶向性抗腫瘤活性中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：惡性腫瘤是嚴(yán)重威脅人類生命健康的頭號殺手，手術(shù)、放療和化療是治療腫瘤的常用方法。放療、化療因同時殺傷腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞，副作用大，因此尋找特異、高效的腫瘤治療方法一直是腫瘤研究的熱點(diǎn)。腫瘤靶向治療是利用具有一定特異性的載體，將藥物或其他殺傷腫瘤細(xì)胞的活性物質(zhì)選擇性地運(yùn)送到腫瘤部位，把治療作用或藥物效應(yīng)盡量限定在特定的靶細(xì)胞、組織或器官內(nèi)，而不影響正常細(xì)胞、組織或器官的功能，從而提高療效、減少毒副作用的一種方法。腫瘤的血管新生(tumorangiogenesis)是一個多步驟的復(fù)雜過程，且受控于多種血管生成因子，是血管生成刺激因子與血管生成抑制因子的不平衡調(diào)節(jié)的結(jié)果。"抑制腫瘤新生血管理論，，認(rèn)為異常活躍的血管新生(Angiogenesis)是胂瘤生長的必要條件(1)腫瘤必須建立新的血管獲取營養(yǎng)以利于其生長和擴(kuò)散；(2)如果沒有新生血管提供營養(yǎng)，實體瘤的生長不會超過2mm3,并且不會發(fā)生轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散;(3)已經(jīng)形成的腫瘤在新生血管崩潰后亦發(fā)生腫塊崩潰。血管新生4吉才元劑(Antiangiogenicagents,orAngiogenesisinhibitors)通過阻斷腫瘤誘導(dǎo)血管新生的病理過程，在動物腫瘤才莫型試-瞼中，可以觀察到腫瘤體積由較大消退至微小，并可以在藥效范圍內(nèi)使之保持休眠。腫瘤血管有四大特點(diǎn)，使其成為開發(fā)抗癌藥物的一個理想靶標(biāo)。(l)同處于靜止?fàn)顟B(tài)的正常血管相比，腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞處于高度活躍的生長狀態(tài)，兩4者具有明顯相異的表型，因而選擇性地抑制生長中的腫瘤血管內(nèi)皮而不損傷靜息的正常血管，使得藥物的副作用小，從而可長期使用；(2)腫瘤血管細(xì)胞是從正常組織進(jìn)入肺瘤的正常細(xì)胞，基因組穩(wěn)定，與基因組極不穩(wěn)定的癌細(xì)胞相比，不容易產(chǎn)生抗藥性；(3)盡管各種腫瘤細(xì)胞的基因組和表型差異極大，其血管細(xì)胞因為是正常細(xì)胞，差異較小，因此針對腫瘤血管的同一藥物理論上對不同肺瘤均有療效；(4)由于一條血管可供養(yǎng)成百上千個腫瘤細(xì)胞，因此其作用效率較高。此外，抗血管新生療法只是阻抑新生血管的發(fā)生和生長，從而阻止腫瘤的增殖和擴(kuò)散。正常細(xì)胞不會受到影響。血管內(nèi)皮生長抑制因子(VEGI)是一種新發(fā)現(xiàn)的血管新生拮抗劑，由Tan等人于1997年通過篩選人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞cDNA文庫首先發(fā)現(xiàn)的，定位于染色體9q32。VEGI由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成，屬于TNF(tumournecrosisfactor腫瘤壞死因子)超家族成員，與TNF超家族其他成員的氨基酸序列同源性為20%-30%，屬II型跨膜糖蛋白，其N端l-25位氨基酸為胞內(nèi)區(qū)和跨膜區(qū)，C端29-174為胞外區(qū)。完整的成熟蛋白質(zhì)(VEGI174)由174個氨基酸組成，分子量為22kD。人VEGI基因全長17kb,由四個外顯子和三個內(nèi)含子組成，通過不同的剪接方式形成三種異構(gòu)體，分別含有174個(VEGI-174)，192個(VEGI-192)和251(VEGI-251)個氨基酸。研究發(fā)現(xiàn)，全長的VEGI-174的可溶性很差，對于體外培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞無明顯的抑制作用。而人VEGI的第29-174氨基酸殘基的重組蛋白卻表現(xiàn)出對血管內(nèi)皮細(xì)胞很強(qiáng)的抑制作用。在進(jìn)一步的研究中，我們發(fā)現(xiàn)VEGI不只是特異性的作用于內(nèi)皮細(xì)胞，它對于各種不同的胂瘤才莫型(其中包括乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌等)都具有顯著的抗腫瘤療效。體外實驗表明，VEGI-192A能顯著抑制牛主動脈內(nèi)皮細(xì)胞與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，在三種拼接異構(gòu)體中為最高，而對人冠狀動脈平滑肌細(xì)胞以及鼠路易士肺癌細(xì)胞LLC等其他類型的細(xì)胞無抑制增殖作用。此外，VEGI-192A還能抑制內(nèi)皮細(xì)胞形成血管狀結(jié)構(gòu)。體內(nèi)實-瞼研究顯示，在鼠路易士肺癌同種移植C57BL/6小鼠腫瘤模型中，系統(tǒng)性腹腔注射VEGI-192A可有效抑制異體移植的肺瘤生長，肺瘤血管化程度顯著降低。且對腎臟、肝臟顯示無毒性。作為血管內(nèi)皮細(xì)胞自分泌的抑制因子，VEGI-192A具有重要的病理生理意義。這說明VEGI有望成為一種廣譜性的腫瘤抑制藥物。整合素是一類膜受體家族，每個成員的分子都是由a、fi兩條鏈(亞單位)靠非共價鍵連接形成的異源雙體跨膜蛋白?，F(xiàn)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有18種a亞單位和8種J3亞單位。整合素通過與相應(yīng)配體結(jié)合介導(dǎo)細(xì)胞與基底膜、細(xì)胞與細(xì)胞的粘附，還作為細(xì)胞內(nèi)外信息傳遞的橋梁。目前已知的24種整合素中，大部分與配體結(jié)合是通過識別配體所含的RGD序列。雖然，不同的整合素都能以一定的親合力與含RGD的配體結(jié)合，但是不同的整合素還是能夠區(qū)分出各自不同的配體。在一些腫瘤細(xì)胞或者腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞常特異性地高表達(dá)某些整合素，如avfi3或ayfi5受體，而正常細(xì)胞不表達(dá)或表達(dá)量很低。整合素avB3在腫瘤新生血管形成、腫瘤生長和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用，利用RGD肽竟?fàn)幗Y(jié)合整合素，可以抑制腫瘤遷移和肺瘤新血管生成，因此這類受體可以作為一類新的腫瘤治療靶點(diǎn)。RGD肽是一類含有精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸(Arg-Gly-Asp)的短肽，細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)和血液中的粘附蛋白是人體中最常見的含RGD序列的蛋白，主要包括纖維蛋白(fibrinogen,Fg)、層粘連蛋白原(vitronectin,Vn)、膠原(collagen)等。研究發(fā)現(xiàn)，大部分整合素與其配體的結(jié)合過程，是通過識別配體中所含的RGD序列來完成的(PierschbacherMD,etal.Nature,1984，309:30—33;RuoslahtiE.MatrixBiol,2003，22(6):459-465.)。作為整合素和其配體相互作用的識別位點(diǎn)，介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)及細(xì)胞之間的相互作用。腫瘤細(xì)胞或者新生血管可以特異表達(dá)某些整合素如avB3，能以一定的親和力結(jié)合RGD肽，成為胂瘤治療的新靶點(diǎn)。因此，RGD肽在腫瘤治療中的應(yīng)用已成為研究熱點(diǎn)。RGD肽可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡且作為載體在腫瘤靶向治療中發(fā)揮重要作用。目前，通過噬菌體表面展示技術(shù)，篩選出了一類與整合素aA特異性結(jié)合的RGD肽，即ACDCRGDCFCG(RGD-4C),這類RGD肽可以作為腫瘤靶向載體，特異性地引導(dǎo)抗腫瘤藥物到達(dá)腫瘤部位。RGD肽在腫瘤顯像、6抑制腫瘤血管形成、腫瘤基因靶向治療等方面有著廣泛應(yīng)用將TNF-a和含RGD的多肽ACDCRGDCFCG融合后，RGD多肽結(jié)合avB3的能力沒有減低，同時TNF-a的抗腫瘤特性也得到增強(qiáng)，更重要的是發(fā)揮了RGD多肽的靶向性，減少了TNF-a單獨(dú)使用的副反應(yīng)。有研究顯示將通過噬菌體庫篩選的與avI33高親和力的RGD多肽與抗腫瘤抗體的Fc融合，抑制腫瘤血管生成并且具有乾向治療效果。目前對于VEGI蛋白的三維立體結(jié)構(gòu)、作用機(jī)理和藥理學(xué)性質(zhì)沒有完整清晰的了解，需要構(gòu)建靶向性更強(qiáng)的嵌合重組蛋白，并檢測其生物學(xué)活性，研究融合蛋白體外誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞生長的能力，并檢測其與腫瘤細(xì)胞的結(jié)合特性，鑒定其胂瘤靶向性，深入探討利用VEGI蛋白構(gòu)建的重組蛋白的體內(nèi)輩巴向抑瘤活性及腫瘤治療的應(yīng)用前景。
發(fā)明內(nèi)容為了克服上述技術(shù)缺陷，本發(fā)明提供了一種人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長抑制因子嵌合多肽，具體指RGD-VEGI-192A嵌合多肽，同時提供了該嵌合多肽的制備方法和在革巴向性抗腫瘤活性中的應(yīng)用，為RGD-VEGI-192A嵌合多肽作為一種更為有效的臨床藥物開發(fā)打下基礎(chǔ)。本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下本發(fā)明的一種人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長抑制因子的嵌合多肽是人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長抑制因子VEGI-192A與RGD-4C多肽相連接而成的RGD-VEGI-192A嵌合重組蛋白。該嵌合多肽具有如SEQIDNO:1所示的編碼核苷酸序列。該嵌合多肽具有如SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。上述RGD-4C多肽的氨基酸序列為ACDCRGDCFCG:Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly。本發(fā)明還提供了一種上述嵌合多肽的制備方法，包括用上述SEQIDNO:1所示的核苷酸序列構(gòu)建表達(dá)載體，并將該表達(dá)載體在宿主細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)的步驟。進(jìn)一步，本發(fā)明還提供了一種上述嵌合多肽的制備方法，通過RT-PCR從人臍l爭脈血管內(nèi)皮細(xì)胞總RNA擴(kuò)增得到RGD-VEGI-192A目的基因片段，將ACDCRGDCFCG多肽和VEGI-192A的N端融合，使用限制性內(nèi)切酶雙酶切取目的基因，連接至表達(dá)載體pET-30a中構(gòu)建重組蛋白RGD-VEGI-192A表達(dá)載體，插入位點(diǎn)5，端含有編碼ACDCRGDCFCG多肽的核苷酸序列，3'端含有編碼6個組氨酸的核苷酸序列。再轉(zhuǎn)化至大腸桿菌宿主菌中誘導(dǎo)表達(dá)，最后純化蛋白。ACAAAGGGCCGTCT-3，，5，-CGCGGATCCCTATAGTAAGAAGGCTCCAAAGAAGGTT-3，,所述上游引物和下游引物均含有5'端的Ndel限制性酶切位點(diǎn)以及3，端的BamHI限制性酶切位點(diǎn)。優(yōu)選的，所述的大腸桿菌宿主菌為OrigamiB(DE3)。優(yōu)選的，所述的誘導(dǎo)方法采用pETT7RNA聚合酶復(fù)合自動誘導(dǎo)。優(yōu)選的，所述的純化方法采用鎳離子金屬螯合親和層析。上述人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長抑制因子RGD-VEGI-192A的嵌合多肽可以應(yīng)用在^^向性抗腫瘤中。本發(fā)明具有如下有益效果本發(fā)明的一種人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長抑制因子RGD-VEGI-192A的嵌合多肽是一種新型血管新生拮抗劑。以整合素avB3為腫瘤靶點(diǎn)，RGD-4C肽為腫瘤靶向載體，VEGI-192A蛋白為抗腫瘤效應(yīng)分子，RGD-VEGI-192A嵌合蛋白體內(nèi)靶向性抑瘤活性更強(qiáng)，在腫瘤等血管新生性疾病中具有巨大的潛在治療價值。同時，本發(fā)明豐富了VEGI-192A在肺瘤治療中的應(yīng)用形式，為腫瘤靶向治療提供了新思路，為RGD-VEGI-192A嵌合多肽作為一種更為有效的臨床藥物開發(fā)打下基礎(chǔ)。8下面將結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。圖1是本發(fā)明PCR擴(kuò)增RGD-VEGI-192A目的基因的一個優(yōu)選實施例的電泳圖2是本發(fā)明酶切鑒定重組質(zhì)粒所得酶切產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳的一個優(yōu)選實施例的電泳分析圖3是本發(fā)明自動誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)中高表達(dá)克隆的篩選獲得的8個克隆菌落裂解液的SDS-PAGE的一個優(yōu)選實施例的結(jié)果圖4是本發(fā)明自動誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的不同誘導(dǎo)時間表達(dá)的蛋白的SDS-PAGE的一個優(yōu)選實施例的結(jié)果圖5是本發(fā)明采用7種不同特性的變性劑溶解包含體檢測最佳溶解方案的一個優(yōu)選實施例的結(jié)果圖6是本發(fā)明在變性條件下采用Ni-NTA柱金屬螯合親和層析技術(shù)純化提取重組蛋白的SDS-PAGE的一個優(yōu)選實施例的結(jié)果圖7是本發(fā)明純化的目的蛋白的WesternBlotting的一個優(yōu)選實施例的結(jié)果圖8是本發(fā)明MTT比色法檢測RGD-VEGI-192A嵌合蛋白體外劑量依賴性抑制牛主動脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的生物學(xué)活性的一個優(yōu)選實施例的結(jié)果圖9是本發(fā)明MTT比色法;險測RGD-VEGI-192A嵌合蛋白體外劑量依賴性抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的生物學(xué)活性的一個優(yōu)選實施例的結(jié)果圖10是本發(fā)明AnnexinV-FITC/PI染色流式細(xì)胞儀檢測RGD-VEGI-192A重組蛋白誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的生物學(xué)活性的一個優(yōu)選實施例的結(jié)果圖11是本發(fā)明采用雞胚絨毛尿嚢血管新生抑制試驗測定RGD-VEGI-192A嵌合蛋白及rhVEGI-192A重組蛋白體內(nèi)抑制血管新生活性的一個優(yōu)選實施例的結(jié)果圖12是本發(fā)明對BALB/cA-皿de棵鼠皮下接種人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB9435體內(nèi)抗胂瘤活性檢測中腹腔注射RGD-VEGI-192A嵌合蛋白及rhVEGI-192A重組蛋白對體內(nèi)腫瘤生長抑制的一個優(yōu)選實施例的曲線圖13是本發(fā)明對BALB/cA-nude棵鼠皮下接種人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB435體內(nèi)抗腫瘤活性檢測中小鼠體重隨給藥時間變化的一個優(yōu)選實施例的曲線圖。具體實施例方式為使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例l:嵌合蛋白RGD-VEGI-192A表達(dá)載體的構(gòu)建通過RT-PCR方法技術(shù)從人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞總RNA中擴(kuò)增，根據(jù)SEQIDNO:l所示的VEGI-192A核苷酸序列，將ACDCRGDCFCG多肽和VEGI-192A的N端融合，擴(kuò)增獲得RGD-VEGI-192A目的基因。PCR上游引物為5，-AAAGGGCCGTCT-3'，下游引物為5，-CGCGGATCCCTATAGTAAGAAGGCTCCAAAGAAGGTT-3'。上下游引物都含有5'端的NdeI限制性酶切位點(diǎn)以及3'端的BamHI限制性酶切位點(diǎn)。圖1是PCR擴(kuò)增RGD-VEGI-192A目的基因后，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析的電泳圖，其中1，2，3，4為PCR產(chǎn)物，M為1Kb梯度DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。圖1的結(jié)果顯示擴(kuò)增得到的產(chǎn)物片段大小在500bp-750bp之間，與RGD-VEGI-192A目的基因的預(yù)期片段大小630bp相符。再使用以上兩種限制性內(nèi)切酶雙酶切取目的基因，最后連接至表達(dá)載體pET-30a中構(gòu)建融合重組蛋白RGD-VEGI-192A表達(dá)載體。插入位點(diǎn)5，端含有編碼ACDCRGDCFCG多肽的核苷酸序列，3'端含有編碼6個組氨酸的核苷酸序列。圖2是酶切鑒定重組質(zhì)粒實驗中，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析的電泳圖，其中1,2，3，4,5為pET-30a-RGD-VEGI-192A經(jīng)NdeI和BamHI雙酶切產(chǎn)物，M為1Kb梯度DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。圖2的結(jié)果顯示酶切后的產(chǎn)物除了pET-30a外，還有一段RGD-VEGI-192A的基因片段，在500bp-750bp之間，與RGD-VEGI-192A目的基因的預(yù)期片段大小630bp接近。實施例2:RGD-VEGI-192A嵌合蛋白在大腸桿菌中的自動誘導(dǎo)表達(dá)及高表達(dá)克隆的篩選1.自動誘導(dǎo)采用表達(dá)載體pET-30a-RGD-VEGI-192A轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)pLysS，隨機(jī)挑取8個克隆菌落到3mLLB培養(yǎng)基中，添加卡那霉素至終濃度50嗎/mL,37。C復(fù)蘇培養(yǎng)過夜。次日離心收集菌體沉淀，通過SDS-PAGE分析重組表達(dá)的情況。2.1000x微量金屬溶液:0.05MFeCl3;-0.12MHC1;0.02MCaCl2;0.01MMnCl2-4H20;0.01MZnS04-7H20;0.002MCoCl2-6H20;0.002MCuCl2-2H20;0.002MNiCl2-6H20;0.002MNa2Mo04-5H20;0.002MNa2SeOr5H20;0.002MH3B03.加雙蒸水定量到100mL。3.自誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基1%胰蛋白胨(tryptone),0.5%酵母提取物(yeastextract),25mMNa2HP04，25mMKH2P04,50mMNH4Cl,5mMNa2S04，2mMMgS04,0.2xmetals(10|uMFe+9)，0.5%甘油(glycerol)(54mM)，0.05%glucose(葡萄糖)(2.8mM),0.2。/。a-乳糖(a-lactose)(5.6mM)。4.應(yīng)用高通量SDS-PAGE的方法，從136個克隆菌落中篩選出表達(dá)效率最高的8個單菌落。圖3是自動誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)中高表達(dá)克隆的篩選獲得的8個克隆菌落裂解液進(jìn)行的SDS-PAGE結(jié)果圖，其中1至8為高表達(dá)克隆菌落組，C為轉(zhuǎn)化了空質(zhì)粒栽體的克隆菌落組，M為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(kD)，宿主菌為OrigamiB(DE3)。在進(jìn)行后續(xù)表達(dá)、純化工作的同時低溫-80。C保種已篩選出的克隆菌落。SDS-PAGE后應(yīng)用凝膠掃描軟件分析目的蛋白表達(dá)量占到總菌體蛋白的50%。實施例3:自動誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的條件優(yōu)化1.宿主菌優(yōu)化為改善RGD-VEGI-192A嵌合蛋白的可溶性，我們采用BL21(DE3)pLysS和OrigamiB(DE3)兩種宿主菌，其中OrigamiB(DE3)宿主菌tncB和gor基因有突變，從而為重組蛋白在宿主菌中提供均衡氧化還原勢，以利于蛋白的正確空間折疊。根據(jù)上述圖3的結(jié)果，在兩種宿主菌中自動誘導(dǎo)RGD-VEGI-192A嵌合蛋白重組蛋白的產(chǎn)量相差不大，但是在宿主菌OrigamiB(DE3)中自動誘導(dǎo)體系中背景雜蛋白較稍小，所以我們最終選擇宿主菌為OrigamiB(DE3)的#l號高表達(dá)克隆菌落，培養(yǎng)時間為16h,培養(yǎng)溫度為25。C，采用自誘導(dǎo)培養(yǎng)系統(tǒng)高密度培養(yǎng)來制備目的蛋白。2.誘導(dǎo)溫度優(yōu)化在10。C、25°C、37。C三種溫度下，自動誘導(dǎo)下大量表達(dá)RGD-VEGI-192A嵌合蛋白重組蛋白，并以包含體形式回收RGD-VEGI-192A嵌合蛋白。由結(jié)果可知誘導(dǎo)溫度越低，高活性的RGD-VEGI-192A嵌合蛋白(以二聚體或多聚體形式存在)越多。綜合產(chǎn)量和活性考量，我們選擇25。C誘導(dǎo)條件。3.誘導(dǎo)時間優(yōu)化在以下六個時間點(diǎn)2h,4h，8h,12h，16h，24h,分別收集菌液用裂解緩沖液裂解細(xì)菌進(jìn)行SDS-PAGE電泳-險測目的蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)量。結(jié)果見圖4,圖4中BSA加樣量為2pg,M為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，宿主菌為OrigamiB(DE3)。由此圖可知，誘導(dǎo)時間為16h就可以得到較高產(chǎn)量。實施例4:重組蛋白的純化與復(fù)性1.首先用7種不同特性的變性劑溶解包含體。圖5是采用7種不同特性的變性劑溶解包含體檢測最佳溶解方案。l至7分別表示為1:1%TritonX-100;2:0.1%TritonX-100;3:CHAPS(3-[(3-膽酰氨基丙基)二甲氨基]丙磺酸鹽)；4:PBS;5:Non-detergentsulfobetaines-195(1-(3-磺丙基)吡啶內(nèi)嗡鹽-195);6:8M尿素(Urea);7:4M尿素(Urea)，M為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(kD)，宿主菌為OrigamiB(DE3)。由圖5得出最佳溶解方案為利用8mM尿素溶解細(xì)菌和包涵體。由圖5可知，選用8M尿素作為變性劑較好。2.采用Ni-NTA柱金屬螯合親和層析技術(shù)純化提取重組蛋白1)取誘導(dǎo)培養(yǎng)的菌液，15000r/min，lmin離心收集菌體沉淀；加入1/100倍細(xì)菌培養(yǎng)液體積的細(xì)菌裂解液重懸細(xì)菌，15000r/min,lmin離心，收集上清液；2)在第1)步中收集到的上清液中加入1Z4倍細(xì)菌培養(yǎng)液體積的50%Ni-NTAHis.Bind層析劑，然后將混合液放到搖床上，室溫下混合60min。(為了達(dá)到更好的結(jié)合效果，可以混合更長時間，不過如果時間很長的話，應(yīng)在冰上操作，避免蛋白的降解)。將混合物裝柱，待柱料沉降完全后，收集剩余l(xiāng)mL上清，用于SDS-PAGE分析。3)用4mL洗滌液洗滌層析柱，流速約28-30滴/min，共洗滌8次，收集每次洗滌液從層析柱流出的液體，用于SDS-PAGE分析。4)用0.5mL洗脫液洗脫目的蛋白，流速約28-30滴/min，共洗脫8次，收集每次洗滌液從層析柱流出的液體，用于SDS-PAGE分析。利用8mM尿素溶解細(xì)菌和包含體，采用Ni-NTA柱親和層析技術(shù)對收集的重組蛋白包含體溶解液進(jìn)行純化。SDS-PAGE結(jié)果顯示，N產(chǎn)-NTA親和層析柱與目的蛋白的結(jié)合能力很強(qiáng)，所以過柱后的流出液中幾乎無目的蛋白。鑒于我們的蛋白產(chǎn)量非常高，所以洗滌4次。洗脫的結(jié)果4艮好，SDS-PAGE結(jié)果顯示為電泳單帶，沒有其它的雜蛋白條帶，結(jié)果見圖6。圖6是在變性條件下采用Ni-NTA柱金屬螯合親和層析技術(shù)純化提取重組蛋白的電泳圖。Wl至W4為四次洗滌液點(diǎn)樣，El至E12為十二次洗脫液點(diǎn)樣，F(xiàn)T為過柱后流出液，BSA加樣量為2ng，M為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(kD)，宿主菌為OrigamiB(DE3)。3.重組蛋白的透析復(fù)性透析復(fù)性緩沖液(50xDialysisbuffer):購自Novagen公司，使用時稀釋成lxDialysisbuffer;lmol/LDTT:購自Novagen公司；30%十二烷基月幾氨酸鈉溶液(N-lauroylsarcosine):購自Novagen公司；透析液A:1xDialysisbuffer,加入DTT至終濃度0.1mmol/L;透析液B:1xDialysisbuffer;透析液C:lxDialysisbuffer,加入1mmol/L還原型谷胱甘肽和0.2mmol/L氧化型谷胱甘肽。利用8mol/L尿素強(qiáng)變性劑保持蛋白的溶解性，在透析過程中使變性蛋白逐漸自然復(fù)性。將含有目的蛋白的洗脫液按比例用去離子水稀釋，加入4mol/L尿素溶液，裝入上述經(jīng)過預(yù)處理的透析袋中。取50倍于蛋白稀釋體積的透析液A,4'C透析3小時，更換透析液A繼續(xù)透析3小時。然后用透析液透B析3小時，更換透析液B繼續(xù)透析3小時。取25倍于蛋白稀釋體積的透析液C,4。C透析過夜。收集透析后蛋白，離心收集上清液。通過SDS-PAGE分析透析結(jié)果。對該純化蛋白應(yīng)用NovagenRefolding試劑盒結(jié)合陰離子交換樹脂的方法進(jìn)行復(fù)性，成功建立了針對RGD-VEGI-192A的穩(wěn)定的復(fù)性方法，獲得可溶性的重組蛋白，復(fù)性得率約為60%。實施例5:WesternBlot鑒定目的蛋白SDS-PAGE只能從分子量上去推測得到的是目的蛋白，要進(jìn)一步確定得到的是目的蛋白，需要進(jìn)行WesternBlotting檢測，所以我們對制備的RGD-VEGI-192A嵌合蛋白進(jìn)行WesternBlotting分析，結(jié)果證明我們純化提取的重組蛋白即為RGD-VEGI-192A嵌合蛋白，見圖7。圖7是鑒定目的蛋白的WesternBlotting結(jié)果，RGD-VEGI-192A為純化得到的重組蛋白。Westernblotting實驗方法將蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行SDS-PAGE,待溴酚藍(lán)跑出膠后停止電泳；準(zhǔn)備好兩張3M濾紙和一張PVDF膜，浸入曱醇去離子水5分鐘，然后與專用濾紙和纖維墊浸泡于lx轉(zhuǎn)膜緩沖液中；剝下凝膠，去掉濃縮膠部分，并把濾紙和PVDF膜裁成凝膠大??；按照三明治夾心法轉(zhuǎn)膜，安置次序如下負(fù)極-纖維墊-l張專用濾紙-凝膠-PVDF膜-l張專用濾紙-纖維墊正極板，將其放入轉(zhuǎn)膜槽中；水浴，300mA轉(zhuǎn)膜l小時；取出PVDF膜，封閉液封閉2小時；一抗孵育2小時；回收一抗，TBST洗膜，每次15min，重復(fù)3次；二抗孵育45-60min;回收二抗，TBST洗膜，每次15min,重復(fù)3次；在暗房用ECL顯色液顯色。實施例6:濃度和純度的檢測1.純度檢測SDS-PAGE法檢測，96%單體，4%為多聚體。多聚體中95%14為二聚體，3%為三聚體及多聚體。應(yīng)用透析法復(fù)性，并采用液相層析法去除內(nèi)毒素。以鱟試劑法檢測每批次蛋白內(nèi)毒素濃度均小于5EU/mg。2.濃度檢測采用BCA蛋白定量法對提取純化的RGD-VEGI-192A嵌合蛋白重組蛋白定量，得到定量標(biāo)準(zhǔn)曲線圖及濃度公式Y(jié)^.0521X+0.0357,相關(guān)系數(shù)W達(dá)到0.999,結(jié)果準(zhǔn)確度非常高。由此計算出獲取RGD-VEGI-192A嵌合蛋白重組蛋白最大產(chǎn)量達(dá)80mg/L(最佳產(chǎn)量菌抹#1號克隆)。實施例7:RGD-VEGI-192A嵌合蛋白及rhVEGI-192A重組蛋白的體外劑量依賴性抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖的生物學(xué)活性比較1.細(xì)胞培養(yǎng)牛主動脈內(nèi)皮細(xì)胞(ABAE)培養(yǎng)于含5%胎牛血清、2mML-谷氨酰胺、O.lmM非必需氨基酸、10mMHepes(羥乙基哌秦乙硫磺酸溶液)、100IU/mL青霉素和100iag/mL鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基中，置于37"、5%C02孵箱中孵育培養(yǎng)；傳代時用含0.02。/。EDTA的0.05%胰酶消化，以DMEM完全培養(yǎng)基終止消化。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)培養(yǎng)于含20%胎牛血清HESFM培養(yǎng)基中，置于37。C、5%<302孵箱中孵育培養(yǎng)；傳代時用上述胰酶消化，以胰酶抑制劑終止消化。2.MTT比色實驗將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)和牛主動脈內(nèi)皮細(xì)胞(ABEC)細(xì)胞消化后計數(shù)，按每孔1.(^104個細(xì)胞分別接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于37。C、5。/。C02孵箱中孵育培養(yǎng)。24h后更換為含不同濃度的rhVEGI-192A重組蛋白以及RGD-VEGI-192A嵌合蛋白的培養(yǎng)基，每個濃度均設(shè)3個平行復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48h。隨后每孔加入5mg/mLMTT溶液20iiL,37。C作用4h,離心后棄上清液，加入DMSO15(VL,振蕩器振蕩10min充分溶解結(jié)晶，置酶標(biāo)儀上測定波長為570nm下的吸光度A值，按以下公式計算抑制率。細(xì)胞生長抑制率(％)=(對照組平均A值-實驗組平均A值)/對照組平均A值x100%。對照組即rhVEGI-192A重組蛋白或RGD-VEGI-192A嵌合蛋白濃度為0的培養(yǎng)孔。使用半數(shù)抑制濃度(IC5o)計算軟件Bliss，ssoftware計算ICM)，應(yīng)用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。3.結(jié)果應(yīng)用MTT比色試驗法測定rhVEGI-192A重組蛋白和RGD-VEGI-192A嵌合蛋白對內(nèi)皮細(xì)胞生長增殖的抑制活性，結(jié)果見圖8和圖9。圖8是MTT比色法檢測重組蛋白RGD-VEGI-192A體外劑量依賴性抑制牛主動脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的生物學(xué)活性。圖9是MTT比色法4企測重組蛋白RGD-VEGI-192A體外劑量依賴性抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的生物學(xué)活性。比較RGD-VEGI-192A嵌合蛋白與rhVEGI-192重組蛋白抑制內(nèi)皮細(xì)胞生長的活性，發(fā)現(xiàn)，前者比后者強(qiáng)一倍左右。RGD-VEGI-192A嵌合蛋白對HUVEC細(xì)胞系ICso為0.396382嗎/mL,對ABAE細(xì)胞系1〔50為0.0791472嗎/mL。rhVEGI-192重組蛋白對HUVEC細(xì)胞系IC50為0.566185|ug/mL,對ABAE細(xì)胞系ICso為0.100979昭/mL。實施例8:AnnexinV-FITC/PI染色檢測RGD-VEGI-192A嵌合蛋白及rhVEGI-192A重組蛋白誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡效果的比較使用A皿exinV細(xì)胞染色分析檢測細(xì)胞早期凋亡指標(biāo)。在正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，而在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞膜中的磷脂酰絲氨酸由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。AnnexinV是一種的Ca"依賴性磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，故可通過細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。因此AnnexinV被作為檢測細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)之一。將A皿exinV進(jìn)行熒光素FITC標(biāo)記，以標(biāo)記了的AnnexinV作為熒光探針，利用熒光顯微鏡可檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶(PropidiumIodide,PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細(xì)胞膜，但對凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI能夠透過細(xì)月包膜而使細(xì)胞核染紅。因此將AnnexinV與PI匹配j吏用，就可以將處于不同凋亡時期的細(xì)胞區(qū)分開來。AnnexinV-FITC/PI染色方法將HUVEC細(xì)胞分別用0.5Mg/mLRGD-VEGI-192A嵌合蛋白及rhVEGI-192A重組蛋白蛋白處理后，用細(xì)胞刮從培養(yǎng)皿上刮取細(xì)胞，lxPBS洗滌細(xì)l包二次(2000xrpm離心5min)，收集5xl05個細(xì)胞。加入500pL的結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞后，加入5pLAnnexinV-FITC混16勻，再加入5^U典化丙錠(PI),混勻，室溫避光反應(yīng)515min。在lh內(nèi)，用流式細(xì)胞4義;險測，激發(fā)波長Ex二488nm;發(fā)射波長En^530nm。A皿exinV-FITC的綠色熒光通過FITC通道(FL1)檢測；PI紅色焚光通過PI通道(FL2或FL3)檢測，建議使用FL3。焚光補(bǔ)償調(diào)節(jié)使用未經(jīng)凋亡誘導(dǎo)處理的正常細(xì)胞，作為對照進(jìn)行熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)去除光譜重疊和設(shè)定十字門的位置。對HUVEC細(xì)胞分別用RGD-VEGI-192A嵌合蛋白及rhVEGI-192A重組蛋白以同等濃度0.5貼/mL處理8小時后，結(jié)果顯示，兩種蛋白能夠誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC的凋亡。且RGD-VEGI-192A嵌合蛋白誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的能力比rhVEGI-192A重組蛋白的強(qiáng)，在同等濃度同樣時間作用下，前者誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡細(xì)月包所占比例為后者的一倍左右。見圖10(AnnexinV-FITC/PI染色流式細(xì)胞儀檢測RGD-VEGI-192A重組蛋白誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的生物學(xué)活性的結(jié)果圖)。實施例9:RGD-VEGI-192A嵌合蛋白及rhVEGI-192A重組蛋白的抑制雞胚絨毛象囊膜血管新生生物學(xué)活性的比較種蛋孵化第6天，在超凈臺上將蛋胚用酒精消毒后用牙科鉆或砂、輪在蛋胚頂端戳一小口，然后小心地去掉周圍的蛋殼和殼膜，使開口約為1.5cmxl.5cm大小。此時可以看到氣室底部隔著一氣室膜即為尿囊膜(CAM),并且可以清楚地看到CAM膜上血管網(wǎng)的大小和分布位置以及跳動的雞胚心臟。確定加樣部位后小心地用注射針頭從氣室與卵黃分隔處挑破氣室膜，注人1-2滴無菌7jc,使氣室膜與CAM膜分開，然后用鑷子輕輕去除上層的氣室膜，暴露下層的CAM膜。先期準(zhǔn)備好樣品，并分為三組PBS對照組，rhVEGI-192A重組蛋白組以及RGD-VEGI-192A嵌合蛋白組，將樣品以10pL體積(均為10mg)拌加到5mmx5mm大小的明膠海綿載體上風(fēng)干后，用鑷子輕輕將載樣濾紙置于CAM和卵黃嚢膜處血管較少的部位,然后用滅菌透明膠封口，繼續(xù)孵育48h或更長時間。由觀察窗加入曱醇丙酮=1:1的固定液預(yù)固定15min，去掉雞胚，取下CAM并與蛋皮分離，完成后固定，將CAM平鋪在平板或濾紙上，解剖鏡下相同放大倍數(shù)計數(shù)血管，根據(jù)直徑分為大、中、小三種血管。以實驗部位邊緣lmm范圍內(nèi)為一級血管，以實驗部位邊緣5mm處為二級血管，一、二級管血管分別觀察分析。以被檢物為中心，周圍血管放射狀朝向被檢物的生長狀態(tài)，稱為血管輻輳。主干血管向載體盤的彎曲和靠近稱之為血管的吸引。在解剖顯微鏡觀察下，根據(jù)血管直徑將血管分為3類dX).lmm為大血管;0.1mm〉dX).05mm為中血管;(K0.05mm為小血管(王蕾，張樹成，吳志套，等，中國藥理與臨床，2000，16(6):46-47)。陽性標(biāo)準(zhǔn)表現(xiàn)出明顯的血管輻輳，以實驗部位為中心，尿嚢膜血管大量向載體生長集中，排列成車輻狀,其中有l(wèi)條以上中血管或小血管成車輻狀，但同時有中等以上的血管吸引。陰性標(biāo)準(zhǔn)周圍血管形成正常，或血管反應(yīng)較輕，向載體生長的血管少而細(xì)，分布零亂，甚至產(chǎn)生視覺可見的無血管區(qū)域。居于二者之間的也定為陰性。血管計數(shù)可結(jié)合自動圖像分析系統(tǒng)、攝像等技術(shù)完成。我們觀察明膠海綿載體周圍lcm范圍內(nèi)與遠(yuǎn)離(大于lcm)位置的血管密度，計算出現(xiàn)血管新生抑制的雞胚數(shù)目，數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。表l是重組蛋白rhVEGI-192A及RGD-VEGI-192A對雞胚尿嚢膜一級血管，二級血管的抑制作用的數(shù)據(jù)方差分析，表2是重組蛋白rhVEGI-192A及RGD-VEGI-192A對雞胚尿囊膜大、中、小血管的抑制作用。圖ll是采用雞胚絨毛尿嚢血管新生抑制試驗測定RGD-VEGI-192A嵌合蛋白及rhVEGI-192A重組蛋白體內(nèi)抑制血管新生活性的結(jié)果圖。由結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)rhVEGI-192A重組蛋白組以及RGD-VEGI-192A嵌合蛋白組相比較于對照組，大血管數(shù)目變化不顯著,血管分支明顯減少,中小血管數(shù)目明顯降低,說明兩組蛋白均顯著抑制新生血管生成，且主要抑制中、小血管的新生。同時，我們發(fā)現(xiàn)RGD-VEGI-192A嵌合蛋白組相比較于rhVEGI-192A重組蛋白組，大血管數(shù)目變化不顯著,血管分支明顯減少較多，中小血管數(shù)目明顯降低較多,說明RGD-VEGI-192A嵌合蛋白組抑制新生血管生成的作用更強(qiáng)。表l18<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>表2<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>*P<0.05實施例10:RGD-VEGI-192A嵌合蛋白及rhVEGI-192A重組蛋白的體內(nèi)抗腫瘤活性檢測對BALB/cA-nude棵鼠皮下接種人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB435，分別以20mg/kg劑量重組蛋白rhVEGI-192A以及RGD-VEGI-192A每3天腹腔注射給藥一次，持續(xù)28天，觀察并記錄rhVEGI-192A以及RGD-VEGI-192A的體內(nèi)抑瘤作用。體內(nèi)抗腫瘤實-驗證明，同劑量的兩種重組蛋白組，與對照組相比，具有明顯的抑制腫瘤生長的作用，同時嵌合了RGD肽的VEGI-192蛋白表現(xiàn)出更高的體內(nèi)抗胂瘤活性，并且差別有統(tǒng)計學(xué)意義。表3是重組蛋白rhVEGI-192A及RGD-VEGI-192A體內(nèi)抑制肺瘤生長抑制率的數(shù)據(jù)方差分析。圖12是本發(fā)明實施10例對BALB/cA-nude棵鼠皮下接種人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB435體內(nèi)抗腫瘤活性檢測中RGD-VEGI-192A嵌合蛋白及rhVEGI-192A重組蛋白對體內(nèi)胂瘤生長抑制曲線。并且小鼠表征指標(biāo)之一的體重隨給藥時間的變化并不明顯，見圖13，圖13是對BALB/cA-皿de棵鼠皮下接種人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB435體內(nèi)抗腫瘤活性檢測中小鼠體重隨給藥時間變化曲線圖。初步提示在高劑量長期給藥情況下，表現(xiàn)出毒性較低、安全性較高的特點(diǎn)。19表3<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>最后所應(yīng)當(dāng)說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實質(zhì)和范圍。序列表<110>中山大學(xué)<120>人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長抑制因子RGD-VEGI-192嵌合重組多肽<160>2<210>1<211>612<212>cDNA<213>人工序列<220><221><222><223><400>1atggcttgcgactgccgtggtgactgcttctgcggtcaactcacaaagggccgtcttcat60<formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula>505560HisPheLysAsnGinPheProAlaLeuHisTipGluHisGluLeu657075GlyLeuAlaPheThrLysAsnArgMetAsnTyrThrAsnLysPhe8085卯LeuLeulieProGluSerGlyAspTyrPhelieTyrSerGinVal95100105ThrPheArgGlyMetThrSerGluCysSerGlulieArgGinAla110115120GlyArgProAsnLysProAspSerlieThrValVallieThrLys125130135ValThrAspSerTyrProGluProThrGinLeuLeuMetGlyThr140145150LysSerValCysGluValGlySerAsnTipPheGinProIITyr155160165LeuGlyAlaMetPheSerLeuGinGluGlyAspLysLeuMetVal170175180AsnValSerAsplieSerLeuValAspTyrThrLysGluAspLys185190195ThrPhePheGlyAlaPheLeuLeu20020權(quán)利要求1、一種人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長抑制因子的嵌合多肽，其特征在于，該嵌合多肽是人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長抑制因子VEGI-192A與RGD-4C多肽相連接而成的RGD-VEGI-192A嵌合重組蛋白。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合多肽，其特征在于，其具有如SEQIDNO:1所示的編碼核苷酸序列。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合多肽，其特征在于，其具有如SEQIDNO:2所示的氨基酉^f列。4、一種權(quán)利要求1所述的嵌合多肽的制備方法，其特征在于，包括用如SEQIDNO:1所示的編碼核苷酸序列構(gòu)建表達(dá)載體，并將所述表達(dá)載體在宿主細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)的步驟。5、一種權(quán)利要求1所述的嵌合多肽的制備方法，其特征在于，通過RT-PCR從人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞總RNA,將ACDCRGDCFCG多肽和VEGI-192A的N端融合，擴(kuò)增得到RGD-VEGI-192A目的基因片^殳，^f吏用限制性內(nèi)切酶雙酶切取目的基因，連接至表達(dá)載體pET-30a中構(gòu)建重組蛋白RGD-VEGI-192A表達(dá)載體，再轉(zhuǎn)化至大腸桿菌宿主菌中誘導(dǎo)表達(dá)，最后純化蛋白。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述RT-PCR中使用的上游引物和下游引物分別為5，-TTCCATATGGCTTGCGACTGCCGTGGTGACTGCTTCTGCGGTCAACTCACAAAGGGCCGTCT誦3，，..5，-CGCGGATCCCTATAGTAAGAAGGCTCCAAAGAAGGTT-3'，所述上游引物和下游引物均含有5，端的NdeI限制性酶切位點(diǎn)以及3'端的Bamffl限制性酶切位點(diǎn)。7、根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述的大腸桿菌宿主菌為OrigamiB(DE3)。8、根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述的誘導(dǎo)方法采用pETT7RNA聚合酶復(fù)合自動誘導(dǎo)。9、根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述的純化方法采用鎳離子金屬螯合親和層析。10、一種權(quán)利要求1所述的嵌合多肽在靶向性抗腫瘤中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明提供了一種人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長抑制因子的嵌合多肽，其嵌合多肽是人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長抑制因子VEGI-192A與RGD-4C多肽相連接而成的RGD-VEGI-192A嵌合重組蛋白。上述嵌合多肽的制備方法包括用SEQIDNO1所示的核苷酸序列構(gòu)建表達(dá)載體，并在宿主細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)的步驟。本發(fā)明的該嵌合多肽是一種新型血管新生拮抗劑，可應(yīng)用在靶向性抗腫瘤中，在腫瘤等血管新生性疾病中具有潛在治療價值。同時，本發(fā)明豐富了VEGI-192A在腫瘤治療中的應(yīng)用形式，為腫瘤靶向治療提供了新思路，為RGD-VEGI-192A嵌合多肽作為一種更為有效的臨床藥物開發(fā)打下基礎(chǔ)。文檔編號C07K19/00GK101503474SQ20091003770公開日2009年8月12日申請日期2009年3月9日優(yōu)先權(quán)日2009年3月9日發(fā)明者何振健,吳玨珩,勛朱,李魯遠(yuǎn),寧王,胡潔萍,潔袁,旭陳,黎孟楓申請人:中山大學(xué)