專(zhuān)利名稱(chēng)：阿藿烯(ajoene)的制備工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物化學(xué)與天然產(chǎn)物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種用生物方法制備大蒜素 allicin，用化學(xué)方法轉(zhuǎn)變成為阿藿烯的工藝。
背景技術(shù)：
阿藿烯是從大蒜中分離的一種活性物質(zhì)，這種物質(zhì)有廣泛的生理活性，它是一種 新型的抗血栓劑、抑菌劑，脂肪酶抑制劑，在抗艾滋病和惡性腫瘤方面也有一定的作用，因 此阿藿烯是一個(gè)引人注目的活性物質(zhì)。多年來(lái)人民一直在尋找適合的方法來(lái)制備阿藿烯， 早在在80年代，美國(guó)Eric Block就從大蒜中成功地制備到了阿藿烯，其方法將大蒜剁成 小塊，在甲醇中浸泡三天，分出濾液經(jīng)過(guò)濃縮后用乙醚萃取，乙醚萃取物經(jīng)過(guò)濃縮后再次溶 于甲醇中，在-20°C的冰箱中放置四天，萃取層析方式分離可以制備到產(chǎn)率0.0108%的阿 藿烯，之后他們又用了合成的蒜素allicim為原料，在丙酮水溶液在50 65°C加熱24小 時(shí)后將蒜素allicin轉(zhuǎn)變成阿藿烯，其產(chǎn)率可以達(dá)到34%，(Apitz Castro, Rafael J. US 4, 665, 088) ο之后，日本Hibi Takayoshi (US 5，612，007)改用了一個(gè)新的方法來(lái)制備阿 藿烯，將大蒜與水按照1 1的比例粉碎，取得到蒜汁在0 50°C與食用油混合，保持蒜汁 的PH值為6 8之間。阿藿烯在食用油相中1 7天內(nèi)形成產(chǎn)品，含量可以達(dá)到500 700mu.g/g。此方法的一個(gè)明顯不足就是難以獲得純凈的阿藿烯產(chǎn)品。在蒜汁與食用油長(zhǎng) 時(shí)間混合時(shí)還存在由于水解使食用油酸值偏高，乳化現(xiàn)象較重等問(wèn)題。法國(guó)的Dnessnandt， Guenter等發(fā)明了一種讓蒜素在環(huán)狀糊精轉(zhuǎn)變成為阿藿烯的方法(US 5，741，932)，即將蒜 素allicin的水溶液(或水醇)在室溫下與環(huán)狀糊精混合3小時(shí)，之后在室溫下干燥成為 固體細(xì)粉，再用乙酸乙酯萃取，萃取溶液去除溶劑后可以得到產(chǎn)率30%的阿藿烯(以蒜素 allicin計(jì))其中Z-式和E-式的比例為1 2 3 1不等。通過(guò)制備的用HPLC分離可 以制備到98%純度的濃縮阿藿烯產(chǎn)物。到目前為止還未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道可以高產(chǎn)率的制備阿藿烯的方法，目前的方法僅僅可 以達(dá)到蒜素30 40%轉(zhuǎn)化成為阿藿烯，而且要經(jīng)過(guò)層析才能獲得較高純度的產(chǎn)品。本文發(fā) 明的方法可以90%的轉(zhuǎn)化率來(lái)制備阿藿烯，形成的產(chǎn)品未經(jīng)特殊的純化處理產(chǎn)品純度達(dá)到 90%以上。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種高轉(zhuǎn)化率、高純度的阿藿烯制備方法，產(chǎn)品可用作醫(yī)藥 和保健品的原料。本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下一種可用蒜氨酶將蒜氨酸轉(zhuǎn)化成為蒜素，再將蒜素轉(zhuǎn)變成為阿藿烯，去除溶劑后 得到90%純度的阿藿烯產(chǎn)品的方法。所述的蒜氨酶是指未經(jīng)分離的大蒜蒜氨酸，或者經(jīng)過(guò)粗分離的蒜氨酶固化在載體 上，或者經(jīng)過(guò)層析精分離的固化在載體的蒜氨酶，所述的載體是指活化的瓊脂糖、葡聚糖、
3纖維素、殼聚糖等高分子載體。所述的蒜氨酸包括天然的未經(jīng)分離的蒜氨酸(即大蒜本身所含的蒜氨酸)，從天 然產(chǎn)物中分離的蒜氨酸以及用化學(xué)合成方法制備合成蒜氨酸。所述的蒜氨酸轉(zhuǎn)變成為蒜素是指酶促作用將蒜氨酸完全轉(zhuǎn)變成為蒜素allicin， 為了保證蒜氨酸完全發(fā)生轉(zhuǎn)化，通常加入0 10倍的水通過(guò)粉碎讓其中蒜氨酸和蒜氨酶溶 到水溶液中，經(jīng)過(guò)酶促作用使其轉(zhuǎn)變成為蒜素。如果用合成或者天然提取的蒜氨酸，又是用 非固定化的大蒜中的蒜氨酶，可以直接加入到粉碎大蒜所用的水中，形成溶液后經(jīng)過(guò)破碎、 攪拌使酶與底物充分作用完成轉(zhuǎn)化，或先通過(guò)磨碎過(guò)濾去除不溶物分離出含蒜氨酶的水溶 液，再加入適量合成或天然的蒜氨酸，通常為0 10% (以大蒜重量計(jì))，以保證在酶促反 應(yīng)結(jié)束之后所有的蒜氨酸均已發(fā)生轉(zhuǎn)變。當(dāng)用固定化的蒜氨酶時(shí)，先讓合成蒜氨酸或天然蒜氨酸溶解在PH4 7的磷酸緩 沖液中，直接加入固定酶充分作用直到蒜氨酸完全發(fā)生轉(zhuǎn)化，也可以將固化酶裝在柱子中， 將溶有蒜氨酸的磷酸緩沖溶液在柱子中循環(huán)，直到蒜氨酸完全發(fā)生轉(zhuǎn)變。所述的酶促轉(zhuǎn)化還可以在溶液中添加一些增強(qiáng)酶的活性和穩(wěn)定性的無(wú)機(jī)離子和 有機(jī)物，如EDTA，Mg2+，F(xiàn)e2+,鹽酸吡哆鋅等等成分。所述的蒜素高轉(zhuǎn)化率地轉(zhuǎn)變成為阿藿烯，是先將酶促轉(zhuǎn)變所得的蒜素溶液加入有 機(jī)溶劑去除固體物和一些大分子物質(zhì)，制備到含蒜素且適合轉(zhuǎn)變ajoene的有機(jī)溶劑水溶 液。所用的有機(jī)溶劑是指水溶性的有機(jī)溶液，包括醇類(lèi)、酮類(lèi)、醚類(lèi)等。如甲醇、乙醇、丙酮、 丁酮、四氫呋喃、乙二醇單甲醚等。之后進(jìn)行適度脫水，保證體系能更適合高轉(zhuǎn)化率地將蒜 素Allicin轉(zhuǎn)變成為阿藿烯。使用干燥劑進(jìn)行適度脫水，包括無(wú)機(jī)或有機(jī)干燥劑。主要使 用無(wú)機(jī)鹽進(jìn)行脫水，無(wú)機(jī)鹽包括硫酸鎂、氯化鈣、硫酸鈉、、分子篩、硅膠等。脫水在0 500C的條件下進(jìn)行，最好在0 15°C條件下進(jìn)行，脫水劑量為含水量的5 20倍，脫水時(shí)間 為0. 5 6小時(shí)，最好為2 4小時(shí)。經(jīng)適度脫水的蒜素溶液，在過(guò)濾去除固體脫水劑后， 室溫放置或加熱即可轉(zhuǎn)變成為阿藿烯，溫度宜0 70°C，在0. 5小時(shí) 2天內(nèi)完成轉(zhuǎn)變，最 好在50 65°C，2 4小時(shí)內(nèi)完成轉(zhuǎn)變。所述的阿藿烯產(chǎn)物分離提純，是指通過(guò)上述方法制備的阿藿烯溶液經(jīng)過(guò)減壓蒸餾 脫去溶劑，包括旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，薄膜蒸發(fā)等蒸餾，在溫度小于65°C取得的阿藿烯溶液。將大部分 水溶液溶劑脫去，此時(shí)阿藿烯以液體形式可以水分層，油水分離后油層即為阿藿烯，殘余在 水中的阿藿烯可以用非水溶性的有機(jī)溶劑萃取再經(jīng)過(guò)蒸餾后得到阿藿烯油，殘留在阿藿烯 油中有機(jī)溶劑可以采用反復(fù)薄膜蒸餾的方式去除，直到殘留量在允許的范圍。
具體實(shí)施例方式以下用具體實(shí)例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此，按此 發(fā)明專(zhuān)利思想設(shè)計(jì)的方法都屬于本專(zhuān)利的范圍。實(shí)施例1取100克大蒜，加入100克水，用剪切式攪拌或膠體磨在冰浴下磨成漿液，維持冰 浴，攪拌混合1小時(shí)，加入預(yù)冷的丙酮(0 5°C ) 800ml攪拌混合30分鐘，過(guò)濾去除固體沉 渣，得到澄清的溶液，向其中加入400克的無(wú)水硫酸鎂，在0 15°C的溫度下攪拌混合4小 時(shí)，之后過(guò)濾去除固體物，濾液在50 60°C的冰浴下維持3 4小時(shí)，用薄層分析方法跟蹤直到其完全轉(zhuǎn)變成為止。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在小于60°C下蒸去水溶性有機(jī)溶劑丙酮，得到含 油滴的混濁液，加入乙酸乙酯萃取(50ml*3)三次，合并萃取液，加入5克的無(wú)水硫酸鈉干燥 2小時(shí)，之后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在小于60°C的水浴下蒸去乙酸乙酯，可以得到紅棕色的阿藿烯油。產(chǎn)品可以用正己烷乙酸乙酯(4 1)作為展開(kāi)劑進(jìn)行薄層分析。以乙腈水或 甲醇水混合液作為流動(dòng)相，240nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行高效液相色譜分析。從圖譜可以看 出，面積歸一化阿藿烯純度為90%以上。實(shí)施例2按文獻(xiàn)報(bào)道的方法合成蒜氨酸(Stol1，H. Experimentia, 1950,6 330)。按文獻(xiàn)報(bào)道的方法制備天然蒜氨酸(黃雪松，食品科學(xué)，2004,25(11) :200 203)。取100毫升水，往其中加入4克合成蒜氨酸或天然蒜氨酸，加入和C12，鹽酸吡咯 醇，如EDTA，Mg2+，F(xiàn)e2+，鹽酸吡哆鋅等作為酶活促進(jìn)劑，充分?jǐn)嚢韬笕芙饧尤?00克的大 蒜，按實(shí)施例1的方法進(jìn)行酶促反應(yīng)和轉(zhuǎn)化成為產(chǎn)物阿藿烯。以正丁醇甲醇乙酸水 (4:1:1: 0.5)作為展開(kāi)劑進(jìn)行薄層分析，茚三酮作為顯色劑，來(lái)跟蹤酶促轉(zhuǎn)化。分析 表明，無(wú)論是合成蒜氨酸還是天然的蒜氨酸可以酶促轉(zhuǎn)化完全。高效液相色譜法分析所得 的產(chǎn)物，阿藿烯峰面積歸一化純度在90%以上。實(shí)例3取100克大蒜和100克的純水，在冰浴下用剪切式攪拌機(jī)或膠體磨成漿液，用低溫 離心機(jī)離心去除固體沉淀，或用200目的濾布快速過(guò)濾，得到略混的溶液，轉(zhuǎn)入到冰浴中， 按實(shí)例2的方法加入酶活促進(jìn)劑、穩(wěn)定劑和4克蒜氨酸，進(jìn)行酶促反應(yīng)和轉(zhuǎn)化成阿藿烯，也 可以完成酶促反應(yīng)和實(shí)現(xiàn)阿藿烯的制備。實(shí)施例4按文獻(xiàn)報(bào)道的方法分離制備粗品蒜氨酶和高純度的蒜氨酶(E. Bartholomecus Kuettner, Archives of Biochemistry and Biophysics. 2002,402 :192 200)。取已經(jīng)活化的瓊脂糖4B，其活化基團(tuán)為含長(zhǎng)鏈臂的活化酯，加入到含粗品蒜氨酶 或純化蒜氨酶的PH為8. 5的磷酸鹽緩沖液中，在室溫下聯(lián)偶反應(yīng)4小時(shí)，將蒜氨酶完全固 化到瓊脂糖上，其中固化的蒜氨酶的量為每克瓊脂糖載體蒜酶量0. 10%。過(guò)濾去水 溶液得到載有蒜酶的瓊脂糖。取100毫升水，加入4克的合成蒜氨酸或天然蒜氨酸，再加入酶活促進(jìn)劑，如EDTA， Mg2+，F(xiàn)e2+，鹽酸吡哆鋅等，并加入磷酸鈉調(diào)PH為6士0. 5，將此溶液加入到載有蒜氨酶的瓊 脂糖上，余者按實(shí)施例2的方法進(jìn)行酶促反應(yīng)和轉(zhuǎn)化成為產(chǎn)物阿藿烯，薄層分析表明無(wú)論 是合成蒜氨酸還是天然蒜氨酸，固定化的大蒜酶可以將其酶促轉(zhuǎn)化完全，制備的阿藿烯產(chǎn) 品經(jīng)高效液相色譜，峰面積歸一化，其純度載90%以上。
權(quán)利要求
一種制備高產(chǎn)率、高純度的阿藿烯的工藝路線，其特征在于用天然大蒜為蒜氨酶的來(lái)源，在粉碎后形成含有蒜氨酶的水溶液，權(quán)利要求粉碎條件是加入0～50倍的水(大蒜重量)，用具備破壁的裝置，在溫度0～50℃條件進(jìn)行，最好在0℃條件下進(jìn)行，破壁裝置包括均質(zhì)粉碎機(jī)、中藥粉碎機(jī)、膠體磨、剪切攪拌機(jī)等。
2.直接利用上述制備的含蒜氨酶的混懸溶液或者經(jīng)過(guò)濾除渣的混濁液，大蒜中的蒜 氨酸經(jīng)酶促作用轉(zhuǎn)變成為大蒜素(Allicin)，或在含蒜氨酶的混懸液或混濁液中添加入適 量的合成蒜氨酸或天然蒜氨酸，通過(guò)酶促作用將大蒜中的蒜氨酸和添加的蒜氨酸轉(zhuǎn)變成為 大蒜素(Allicin)。權(quán)利要求蒜氨酸酶促轉(zhuǎn)變成為大蒜素的溫度在0 65°C，最好在0 15°C，在攪拌或靜止的容皿中，加入或不加入酶活增強(qiáng)劑(EDTA，Mg2+，F(xiàn)e2+，鹽酸吡哆鋅等) 等條件下進(jìn)行。外加的蒜氨酸量以能完全轉(zhuǎn)變成為大蒜素計(jì)，通常在0 20%的范圍內(nèi)，最 好在5%左右。
3.實(shí)現(xiàn)酶促反應(yīng)也可以在固化蒜氨酶中進(jìn)行，大蒜粉碎后的混懸液經(jīng)過(guò)澄清處理后， 用如(NH4)2SO4或PEG沉淀出粗酶，或者將粗酶經(jīng)過(guò)柱層析制備到精制的蒜氨酶，酶偶聯(lián)到 活化的固定酶載體，再按上述的條件完成酶促轉(zhuǎn)化。
4.用水溶性的有機(jī)溶劑加入到已完成酶促轉(zhuǎn)化的混懸液或混濁液，通過(guò)沉淀去除固 狀物或高分子雜質(zhì)，也可加入到用固定蒜氨酶酶促轉(zhuǎn)變后的溶液中，制備到蒜素(allicin) 的澄清溶液。權(quán)力要求所用的水溶性有機(jī)溶劑包括醇類(lèi)(如甲醇、乙醇、丙醇)、酮類(lèi)(如丙 酮)、醚類(lèi)(如四氫呋喃)等，加入的溶劑量為酶促轉(zhuǎn)化后混懸液或溶液的1 30倍，最好 是5 8倍，操作可以在0 50°C條件下進(jìn)行，最好在0 15°C下進(jìn)行。
5.制備的蒜素(allicin)有機(jī)溶液，加入適量的干燥劑處理，進(jìn)行適度的脫水。權(quán)利要 求使用的干燥劑包括MgS04、MgCl2, Na2SO4, CaCl2等，可以用單一干燥劑或多個(gè)干燥劑的混 合物，加入的干燥劑用量按吸水量計(jì)可以將溶液中的水份完全去除作為最少加入量，加入 后維持?jǐn)嚢柙? 50°C下至少維持2小時(shí)以上，最好在0 15°C下進(jìn)行。
6.適度脫水處理的蒜素(allicin)溶液熱轉(zhuǎn)變?yōu)榘⑥较?。?quán)利要求在20 75°C條件 下轉(zhuǎn)化，最好在50°C -60°C條件下轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化時(shí)間為2 48小時(shí)。最好在4 6小時(shí)，此過(guò) 程中蒜素allicin 90%以上轉(zhuǎn)變成為阿藿烯。
7.阿藿烯產(chǎn)品的分離純化。權(quán)利要求用蒸餾方法去除水溶性有機(jī)溶劑，包括在薄膜蒸 發(fā)儀和旋轉(zhuǎn)蒸餾儀等裝置中進(jìn)行，去除水溶性有機(jī)溶劑的殘液加入水不溶的溶劑萃取，包 括乙醚，乙酸乙酯、超臨界或液體二氧化碳分方法分離出阿藿烯產(chǎn)品。經(jīng)過(guò)蒸餾去除殘余的 有機(jī)溶劑。
全文摘要
一種制備阿藿烯的工藝方法，此方法是利用大蒜中的蒜氨酶將天然的蒜氨酸或合成蒜氨酸在水溶液中轉(zhuǎn)變成為蒜素，加入水溶性有機(jī)溶劑如醇、酮、醚等方法去除部分雜質(zhì)，制備到蒜素溶液，再加入脫水劑進(jìn)行適度脫水，在適當(dāng)?shù)臏囟认滤馑?0％的轉(zhuǎn)變成為阿藿烯，蒸去溶劑后即可得到純度90％的阿藿烯產(chǎn)品。本工藝方法簡(jiǎn)便易行，適合規(guī)模化制備阿藿烯產(chǎn)品。
文檔編號(hào)C07C319/28GK101928735SQ200910039208
公開(kāi)日2010年12月29日 申請(qǐng)日期2009年5月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月5日
發(fā)明者嚴(yán)浩成, 張相年, 李超, 蔣琳蘭, 趙樹(shù)進(jìn) 申請(qǐng)人:廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院;廣州華博生物制藥研究所