專利名稱：一種富集血清中低豐度蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白純化技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種富集血清中低豐度蛋白的方法。
背景技術(shù)：
人體血清中因疾病而引起的蛋白質(zhì)的含量及種類變化是臨床上各種病癥 早期診斷及評(píng)價(jià)病情、判斷預(yù)后等常規(guī)檢驗(yàn)的一個(gè)重要指標(biāo)，應(yīng)用現(xiàn)代生物技 術(shù)如蛋白質(zhì)組學(xué)等尋找與疾病相關(guān)的特異蛋白質(zhì)變化是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。然 而，由于血清中的蛋白質(zhì)種類超過一萬種之多，其中高豐度蛋白如白蛋白、球
蛋白、纖維蛋白原等就多達(dá)22種，占據(jù)了蛋白質(zhì)總量的99%左右，從而掩蓋 了可能含有特異分子的低豐度蛋白質(zhì)，造成其難于被檢測，因此，預(yù)先有效地 去除血清中高豐度蛋白質(zhì)，富集低豐度蛋白，可以提高應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)尋 找疾病診斷的敏感性分子標(biāo)志物的可能性。
目前在科研中雖然應(yīng)用許多方法選擇性地去除1 2種高豐度蛋白，但這些 方法普遍純化率偏低，操作復(fù)雜?，F(xiàn)有的商業(yè)化產(chǎn)品使用成本高，而且易于去 除與高豐度蛋白有相互作用的低豐度蛋白，故應(yīng)用性不大，如MARS純化柱 價(jià)格昂貴，需要應(yīng)用成本較高的HPLC高效液相色譜技術(shù)，該純化過程只能去 除其中6種豐度最高的蛋白質(zhì)，仍然留下不少高豐度的蛋白，且由于MARS 純化柱是在非變型條件下進(jìn)行純化的，在天然構(gòu)象狀態(tài)下能與白蛋白等蛋白結(jié) 合的蛋白也會(huì)被同時(shí)去除，導(dǎo)致蛋白損失過多，影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種重復(fù)性好、操作簡單、 純化成本低，能夠有效地去除血清中的高豐度蛋白并富集大量低豐度蛋白的方 法。
本發(fā)明的上述目的是通過如下方案予以實(shí)現(xiàn)的
一種富集血清中低豐度蛋白的方法，該方法是利用肝素與血清中許多高豐 度蛋白質(zhì)相互作用的特性，將肝素瓊脂糖作為純化柱的填料，采用本領(lǐng)域技術(shù) 人員進(jìn)行親和層析時(shí)的常規(guī)操作進(jìn)行裝柱、平衡和上樣，由于不同的洗脫液會(huì) 收集得到不同的洗脫成分，洗脫液的選擇對(duì)洗脫效果影響很大，因此本發(fā)明人
對(duì)洗脫液進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)采用濃度為1.5mol/L的NaCl做為洗脫 液時(shí)，洗脫得到的組分中含有大量富集的低豐度蛋白，而高豐度蛋白含量很低。
上述方法中，用1.5mol/L的NaCl做為洗脫液時(shí)，可采用Tris-HCl緩沖液 調(diào)節(jié)NaCl溶液的pH，如洗脫液的配方可以為10 mmol/L Tris-HC1禾口 1.5 mol/LNaCl， pH7.0。
上述方法中，采用1.5mol/L的NaCl做為洗脫液，得到的洗脫產(chǎn)物還可以 采用蛋白G瓊脂糖凝膠(Protein Gsepharose)進(jìn)一步去除其中的IgG。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果
l.本發(fā)明的方法選擇肝素瓊脂糖作為純化材料，材料本身價(jià)格便宜，利用 肝素與血清中許多高豐度蛋白質(zhì)相互作用的特性，應(yīng)用普通的親和層析的方法 便可獲得低豐度血清蛋白，而且層析過程簡單易行，大大降低純化成本，且與 MARS純化柱相比，肝素瓊脂糖純化的效果更好，能得到種類更多的血清蛋白， 而且肝素瓊脂糖可重復(fù)利用，也節(jié)約了成本；2. 本發(fā)明的方法能夠有效去除血清中高豐度蛋白，解決血清中高豐度蛋白 的干擾問題，進(jìn)而高效富集大量的低豐度蛋白，獲得研究中所需的目的種類的 低豐度蛋白，為進(jìn)一步深入研究確診疾病的高效、特異性的低豐度蛋白標(biāo)識(shí)物
提供了研究條件；
3. 本發(fā)明的方法為應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行疾病研究，得到所需的高效、特異
性的低豐度蛋白標(biāo)志物提供了研究基礎(chǔ)，利用該方法還可以制作成商品化的蛋
白純化柱，對(duì)于在應(yīng)用功能蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行疾病診斷標(biāo)志物的尋找和疾病發(fā)病
機(jī)制的研究以及藥物開發(fā)的機(jī)構(gòu)推廣具有較大意義，產(chǎn)業(yè)化后也能帶來良好的
經(jīng)濟(jì)效益，同時(shí)也具有良好的社會(huì)效益。


圖1為SDS-PAGE考染和銀染電泳其中，l為考染電泳圖，2為銀染電泳圖，3為Marker, 4為洗脫組分，5 為進(jìn)一步去除IgG后組分，6為IgG， 7為IgG重鏈，8為IgG輕鏈； 圖2為MARS column處理所得的蛋白組分的2D-PAGE電泳圖； 圖3為肝素親和富集的低豐度蛋白組分的2D-PAGE電泳圖； 圖4為洗脫條件優(yōu)化SDS-PAGE電泳其中，1為Marker, 2為未處理過的血清，3為清洗組分(即肝素不結(jié)合 的組分)，4為洗脫液配方(1) ， 5為洗脫液配方(2) ， 6為洗脫液配方(3)， 7為洗脫液配方(4) ， 8為洗脫液配方僅含有1.5mol/LNaCl。 具體事實(shí)方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步地解釋，但具體實(shí)施例并不對(duì)本發(fā) 明做任何限定。實(shí)施例l肝素親和層析
本實(shí)施例以肝素瓊脂糖作為純化柱的填料，對(duì)樣品進(jìn)行肝素親和層析，其 具體步驟如下
1. 樣品預(yù)處理
收集10mL正常人血液于不抗凝試管中，室溫靜置30min，然后1500g離 心30min，取上清液再次5000g， 4。C離心20min，去除沉淀收集上清液，取該 上清液IO(VL，用60jiL純凈水和40pL的乙腈稀釋，40。C溫浴15min， 14 OOOg 離心10min去除沉淀，收集上清液即為本實(shí)施例的血清上樣品。
2. 親和層析
本實(shí)施例的親和層析釆用本領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)操作，所用到的儀器和試 劑均為市售。
裝柱將lmL肝素瓊脂糖裝入5mL的BIO-RAD層析柱； 平衡用5mL平衡液(含有IO mmol/L Tris-HCl和50 mmol/L NaCl， pH 7.0)平衡柱子；
上樣將180pL上述血清上樣品用lmL平衡液(含有10mmol/L Tris-HCl 和50 mmol/L NaCl， pH 7.0)稀釋后，上柱；
平衡上柱后再次用5mL平衡液(含有IO mmol/L Tris-HCl和50 mmol/L NaCl， pH7.0)平衡；
洗脫用2.5mL洗脫液(含有IO mmol/L Tris-HCl和1.5 mol/LNaCl， pH 7.0) 洗脫柱子，收集洗脫產(chǎn)物。
層析結(jié)束后依次用Cleaning Buffer 1 (含有0.1mol/L硼酸鹽和l mol/LNaCl， pH9.8) 、 Cleaning Buffer 2 (含有0.1mol/L硼酸鹽，pH9.8) 、 Cleaning Buffer3 (超純水，MilliQ Water)和Cleaning Buffer 4 (含有2.0 mol/L NaCl)這四
種清洗液各5mL清洗柱子后，則可重復(fù)利用柱子。 3.IgG的去除
用PBS清洗兩遍Protein G sepharose (市售)，并將其儲(chǔ)存于等體積的PBS
中；
將上述洗脫產(chǎn)物濃縮于500pLPBS中，加入200^L Protein G sepharose，于 恒溫震蕩器上4i:震蕩3h后，14000g離心10min去除ProteinG，吸取上清作為后 續(xù)試驗(yàn)的樣品。
4.SDS-PAGE
采用本領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)操作，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)果用考染 及銀染染色，如圖1所示，
4為肝素親和層析所得的洗脫組分，即肝素結(jié)合蛋白組分，其中仍存在較 濃的IgG條帶，5為進(jìn)一步去除IgG后的洗脫組分，IgG條帶大幅變淡，6為被去 除的IgG組分，7和8分別為IgG的重鏈和輕鏈條帶。
5.2D-PAGE
對(duì)上述步驟3中去除IgG后的上清樣品進(jìn)行二維聚丙烯酰胺凝膠電泳 (2D-PAGE)，其具體操作采用本領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)操作，電泳結(jié)果用銀 染顯示。
6.圖像分析處理
將上述SDS-PAGE和2D-PAGE的銀染染色膠都進(jìn)行Image Scanner (Amersham Biosciences)掃描，過程中使用軟件Lab Scan 3.00進(jìn)行操作，掃 描后圖像用Image Master 2D Elite Software 4.01 (Amersham Biosciences)軟件分析。
掃描結(jié)果運(yùn)用MARS column處理所得的蛋白組分的2D-PAGE電泳圖 如圖2所示；運(yùn)用該實(shí)施例肝素親和所富集的低豐度蛋白組分的2D-PAGE電泳 圖如圖3所示；從圖2和圖3可以看出用MARS處理后，2D-PAGE顯示561個(gè)點(diǎn)， 而用肝素瓊脂糖和ProteinGsepharose處理后，顯示622個(gè)點(diǎn)，說明本方法能夠 比MARS純化柱分離到更多的蛋白。
實(shí)施例2肝素親和洗脫條件優(yōu)化
本實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的樣品洗脫條件進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)實(shí)施例1中的洗脫液進(jìn)行 一系列不同的配方，對(duì)比洗脫效果，從而選出最優(yōu)洗脫條件。 洗脫液配方
(1) 10mmol/LTris-HCl和0.5mol/LNaCl， pH7.0;
(2) 10mmol/LTris-HCl和1.0mol/LNaCl， pH7.0;
(3) 10 mmol/L Tris匿HCl和1.5 mol/L NaCl， pH 7.0;
(4) 10mmol/LTris-HCl和2.0mol/LNaCl， pH7.0。
同時(shí)本實(shí)施例還設(shè)置了對(duì)比組未處理的血清，肝素不結(jié)合組分，洗脫液
配方僅有1.5 mol/LNaCl。
將上述不同處理后的結(jié)果進(jìn)行SDS-PAGE電泳，如圖4所示，
1為Marker, 2為未處理的血清，3為肝素不結(jié)合組分，4 7分別為使用
洗脫液配方1 4進(jìn)行梯度洗脫的結(jié)果，8為僅使用10 mmol/L Tris-HCl和1.5
mol/LNaCl， pH 7.0配方進(jìn)行洗脫的結(jié)果，可見使用該洗脫液配方基本可將肝
素結(jié)合組分全部洗脫下來。
因此，本實(shí)施例選擇配方(3) : 10mmol/LTris陽HCl和1.5mol/LNaClpH7.0，作為優(yōu)選的洗脫液配方,
權(quán)利要求
1、一種富集血清中低豐度蛋白的方法，其特征在于該方法是采用肝素瓊脂糖作為純化柱的填料，NaCl做為洗脫液，對(duì)血清進(jìn)行低豐度蛋白的富集。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于所述洗脫液的配方為10mmol/L Tris — HC1和1.5 mol/L NaCl， pH 7.0。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于所述肝素瓊脂糖經(jīng)Cleaning Buffer 1 、 Cleaning Buffer2、 Cleaning Buffer 3和Cleaning Buffer 4這四種清洗 液清洗后，可多次使用；所述Cleaning Buffer 1含有0.1 mol/L硼酸鹽和1 mol/L NaCl， pH9.8;所述Cleaning Buffer2含有0.1 mol/L硼酸鹽，pH 9.8;所述 Cleaning Buffer 3為超純水；所述Cleaning Buffer 4含有2.0 mol/L NaCl。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于所述純化柱的平衡液為10 mmol/L Tris-HCl和50 mmol/L NaCl， pH 7.0。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于該方法采用洗脫液洗脫后，洗 脫產(chǎn)物再采用蛋白G瓊脂糖凝膠進(jìn)一步處理。
全文摘要
本發(fā)明公開一種富集血清中低豐度蛋白的方法，該方法采用肝素瓊脂糖作為純化柱的填料，1.5mol/L的NaCl做為洗脫液，洗脫得到的組分中含有大量富集的低豐度蛋白，而高豐度蛋白含量很低，解決了血清中高豐度蛋白的干擾問題，獲得研究中所需的目的種類的低豐度蛋白，為進(jìn)一步深入研究診斷疾病的高效、特異性的低豐度蛋白標(biāo)識(shí)物提供了研究條件。本發(fā)明選擇肝素瓊脂糖作為純化材料，材料本身價(jià)格便宜，層析過程簡單易行，純化效果好，能得到種類更多的血清蛋白，且肝素瓊脂糖可重復(fù)利用。利用本發(fā)明方法還可制作商品化的蛋白純化柱，對(duì)于在應(yīng)用功能蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行疾病診斷標(biāo)志物的尋找和疾病發(fā)病機(jī)制的研究以及藥物開發(fā)推廣具有較大意義。
文檔編號(hào)C07K14/435GK101575370SQ200910040389
公開日2009年11月11日 申請(qǐng)日期2009年6月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月19日
發(fā)明者何慶瑜, 霆 雷 申請(qǐng)人:暨南大學(xué)