專利名稱：β-葡萄糖基-Yariv試劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥中間體、生物診斷試劑和蛋白染色試劑制備領(lǐng)域，涉及一種
(3-葡萄糖基-Yariv試劑[即1， 3， 5-三(4-(3-D-葡吡喃糖氧基-氧化苯基偶氮基)-2， 4， 6-三羥基苯的合成方法。
背景技術(shù)：
P-葡萄糖基-Yariv試劑(p-D-glucosyl-Yariv reagent,卩GlcY)，即1，3,5-三
(4-卩-D-葡吡喃糖氧基-氧化苯基偶氮基)-2,4，6-三羥基苯，是一種人工合成的苯 基偶氮染色劑，其結(jié)構(gòu)式如下該試劑可與阿拉伯半乳糖蛋白(AGPS)的糖基發(fā)生反應(yīng)形成紅色沉淀。這
對于我們探究植物體中AGPs的分布和生理作用有著十分重要的意義。但如今，
這種試劑的合成技術(shù)在國內(nèi)外研究很不成熟，可以說已經(jīng)出現(xiàn)了一個技術(shù)缺口， 而國內(nèi)這項(xiàng)技術(shù)目前尚未見研究報(bào)道。
在國夕卜，最早是丄Yariv等人在1962年發(fā)表的文章(Yariv，丄；Rapport, M. M.; Graf, L The interaction of glycosides and saccharides with antibody to the corresponding phenyl azo glycoside, 8/'oc/7em. J. 1962， 85, 383-388.)中提出了
-D-葡萄糖苷Yariv試劑的合成方法。之后也僅在I. Ganjian等人的文章(Ganjian, l.; Basile， D. V. Reductive syntheses of p-aminophenyl-(3-D-glucoside and its conversion tog-glucosyl Yariv reagent. /Ana/. 8/oc/7em. 1997, 246, 152-155.)中
對其合成進(jìn)行了改進(jìn)，即從對硝基苯基葡萄糖苷作為起始原料進(jìn)行合成。但這些 方法在合成中都存在操作繁瑣、產(chǎn)率較低等問題，總產(chǎn)率為一般在20 40%左右。 合成上的困難嚴(yán)重約束了此試劑的更廣泛應(yīng)用和發(fā)展。正在這種背景下，需 要找尋一種合成(3-葡萄糖基-Yariv試劑的較為簡捷、經(jīng)濟(jì)和高效的合成方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種(3-葡萄糖基-Yariv試劑[即1， 3， 5-三(4-p-D-葡吡喃
糖氧基-氧化苯基偶氮基)-2， 4， 6-三羥基苯]的合成方法，提高產(chǎn)率，而且方法 簡捷，使其制備具有工業(yè)生產(chǎn)價值。 技術(shù)方案為
(1)對硝基苯基葡萄糖苷還原制備對氨基苯基葡萄糖苷
將硝基苯基葡萄糖苷與溶劑混合攪拌，加入鈀催化劑和甲酸銨，40 6(TC條件下反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后過濾，取濾液減壓濃縮；其中Pd與硝基苯基葡萄糖苷的
摩爾比為(0.02 0.5) :1，硝基苯基葡萄糖苷與甲酸銨的摩爾比為1: (2 10);
所述的溶劑選自甲醇或乙醇。
硝基苯基葡萄糖苷與溶劑的質(zhì)量體積比為0.05 0.02g/ml。 鈀催化劑中，鈀的重量百分含量為5% 15%，可選用Pd/C。 Pd與硝基苯基葡萄糖苷的摩爾比優(yōu)選為(0.02 0.2) :1。 硝基苯基葡萄糖苷與甲酸銨的摩爾比優(yōu)選為1: (3 6)。
(2) 重氮化反應(yīng)
取步驟(1)得到的固體溶于水中，去除低沸點(diǎn)雜質(zhì)后，將溫度控制在0 5°C， 加入HCI溶液，再滴加亞硝酸鹽溶液；硝基苯基葡萄糖苷與HCI的摩爾比為1: (1 5)，硝基苯基葡萄糖苷與亞硝酸鹽的摩爾比為1:(1 5)，得到重氮鹽溶液。 HCI溶液濃度為0.3 1.0M。
亞硝酸鹽選自亞硝酸鈉或亞硝酸鉀。硝基苯基葡萄糖苷與亞硝酸鹽的摩爾比 優(yōu)選為1: (1 2)。
去除低沸點(diǎn)雜質(zhì)的方法為將pH調(diào)節(jié)至2 3，在1 20mmHg、 20 35°C 下減壓蒸餾，去除反應(yīng)系統(tǒng)中1/3 1/2體積水分；加入原反應(yīng)系統(tǒng)1/3 1/2體 積的水，調(diào)節(jié)pH至2 3，在20 35。C下減壓蒸餾，去除反應(yīng)體系中1/3 1/2 體積水分；再加入水至原反應(yīng)系統(tǒng)體積。
(3) 偶聯(lián)反應(yīng)
向重氮鹽溶液中滴加間苯三酚溶液，將溫度保持在0 5'C同時攪拌，硝基苯 基葡萄糖苷與間苯三酚的摩爾比為1: 0.25 0.5; 0 5。C條件下調(diào)節(jié)pH為8.0 9.0，并反應(yīng)1 5小時；反應(yīng)結(jié)束后加入0.5 2倍體積甲醇或乙醇混合，0 5°C條件下放置12 48小時，取沉淀。
<formula>formula see original document page 8</formula>III IV
本反應(yīng)在重氮偶聯(lián)過程中所用的0.5M鹽酸溶液與對硝基苯基葡萄糖苷的摩 爾比為1.0 5.0，且以1.2 1.5為宜。摩爾比太低，不能提供適宜的酸性條件， 致使重氮化反應(yīng)不能進(jìn)行完全；摩爾比太高會使其后引入的NaOH的量增多，從 而帶入過多的水及鹽，使部分產(chǎn)物溶解，阻礙產(chǎn)物析出，致使最終產(chǎn)率降低，增 加生產(chǎn)成本，降低了工業(yè)生產(chǎn)價值。此外，反應(yīng)溫度對反應(yīng)的結(jié)果影響很大。反 應(yīng)溫度太低，反應(yīng)速度太慢，并且反應(yīng)不能進(jìn)行完全；反應(yīng)溫度太高會使重氮鹽 分解，致使最終產(chǎn)率降低，增加生產(chǎn)成本，降低了工業(yè)生產(chǎn)價值。故采用冰水浴 的方法且控制反應(yīng)溫度在0 5"C為佳。
本發(fā)明以對硝基苯基葡萄糖苷為起始原料，采用的是"一鍋煮"的合成方法， 與傳統(tǒng)的合成方法相比，操作更為簡便，產(chǎn)率提高到80%左右，大大高于文獻(xiàn)中 報(bào)道的各種方法；并且反應(yīng)所使用的試劑均價廉易得，反應(yīng)條件更為溫和，有機(jī) 溶劑和催化劑用量大大減少，生產(chǎn)成本明顯降低。這種方法還降低能耗，是一種 較為綠色環(huán)保和經(jīng)濟(jì)高效的合成方法，適用于工業(yè)化生產(chǎn)，是一種很有應(yīng)用前景 的糖苷合成新方法。


圖1是(3-葡萄糖基-Yariv[1， 3， 5-三(4-(3-D-葡吡喃糖氧基-氧化苯基偶氮基) -2， 4， 6-三羥基苯]試劑的11"1-核磁譜圖2是p-葡萄糖基-Yariv[1 ， 3， 5-三(4-P-D-葡吡喃糖氧基-氧化苯基偶氮基) -2， 4， 6-三羥基苯]試劑的紅外譜圖
圖3是(3-葡萄糖基-Yariv[1 ， 3， 5-三(4-(3-D-葡吡喃糖氧基-氧化苯基偶氮基) -2， 4， 6-三羥基苯]試劑的質(zhì)譜圖
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
(1) 對硝基苯基葡萄糖苷的還原
在一個100ml的圓底燒瓶加入25ml無水甲醇，加入0.25g (0.83mmol)對
硝基苯基葡萄糖苷，將混合物攪拌約5分鐘。再加入0.1g 5% Pd/C催化劑，加 入0.24g (3.81mmo1)甲酸銨。在50°C水浴中繼續(xù)攪拌。待轉(zhuǎn)化完全后冷至室 溫經(jīng)硅膠土板過濾。濾液合并后在40。C、 1 15mmHg下進(jìn)行減壓濃縮。
(2) 重氮化
將殘?jiān)芙庠谒?5ml)，溶液用5%硫酸第一次酸化至pH=3.0。3 6mmHg 真空度和29t:條件下蒸去2.5ml水；再加水至5ml，用5%氫氧化鈉堿化至 pH=9.0， 5 10mmHg真空度和29。C條件下蒸去2.5ml水；再加水至5ml。
將圓底瓶冰水浴，加入0.5M鹽酸(2.5ml)，控制溫度在0~5度。稱取0.0643g 亞硝酸鈉(0.93mmol)溶于3.5ml冷水中，30min內(nèi)用滴液漏斗滴完。
(3) 偶聯(lián)
0.0372g (0.30mmol)間苯三酚溶于12ml冰水，由分液漏斗中緩慢滴入重 氮鹽溶液中，0 5度。同時保持均勻攪拌，并保持低溫。5%的氫氧化鈉溶液緩 慢加入直到pH-9.0， pH穩(wěn)定在9.0—個半小時，溶液用等體積的乙醇稀釋，冰 箱中放置過夜(16小時)，過濾沉淀，干燥后得到0.22g (83%)產(chǎn)品。
實(shí)施例2
(1)對硝基苯基葡萄糖苷的還原
對一個500ml的圓底燒瓶加入80ml無水乙醇(20 mol)，加入1g對硝基苯 基葡萄糖苷(3.3mmol)，將混合物攪拌約5分鐘。再加入0.25g 10% Pd/C，加入1g甲酸銨(15.9 mmol)，在50°C水浴中繼續(xù)攪拌。待反應(yīng)轉(zhuǎn)化完全后冷至 室溫經(jīng)硅藻土過濾。濾液合并后在29 40°C、 1 15mmHg下進(jìn)行減壓濃縮。
(2) 重氮化反應(yīng)-
將上一步所得殘?jiān)芙庠谒?20ml)，溶液用5%硫酸第一次酸化至 pH=3.0。 29°C、 10 15mmHg真空度條件下蒸去10ml水。再加水至20ml，用 5%氫氧化鈉堿化至pH=9.0， 29°C、 2 8mmHg真空度條件下蒸去10ml水， 再加入水至20ml。
將圓底瓶冰水浴，加入0.5M鹽酸(15ml)，控制溫度在0 5。C。稱取0.26g (3.8mmol)亞硝酸鈉溶于14ml冷水中，30min內(nèi)用滴液漏斗滴完。
(3) 偶聯(lián)
0.15g間苯三酚溶于48ml冰水，由分液漏斗中緩慢滴入重氮鹽溶液中，0 5°C。同時保持均勻攪拌，并保持低溫。5。/。的氫氧化鈉溶液緩慢加入直到pH=9.0， pH穩(wěn)定在9.0約1.5小時，溶液用等體積的乙醇稀釋，冰箱中放置36小時，過 濾沉淀，干燥后得到0.78g (73%)產(chǎn)品。
對所得產(chǎn)物(3-葡萄糖基-丫ariv試劑進(jìn)行了 1H-NMR、 IR、質(zhì)譜及HPLC分析， 確認(rèn)為純的目標(biāo)產(chǎn)物。1^1-核磁譜、紅外譜圖和質(zhì)譜圖如圖1 3所示。測試數(shù)據(jù) 如下
1H—NMR: (500MHz，DMSO-d6, TMS內(nèi)標(biāo))(ppm) 3.19(m,1H)， 3.45(m,1H)， 3.71(m，1H), 4.34(t， J=".5Hz，1H), 4.60(t， J=11.5Hz，1H), 4.92(d, J=7.5Hz，1H) 5.03(d' J=5.0Hz，1H)， 5.09(d, J=5.0Hz,1H), 5.27(d， J=5.0Hz, 1H)' 7,15(d, J=9.0Hz, 2H), 7.65 (d, J=3.0Hz,2H);
IR (KBr, pellet, cm1): 3395.6(s), 2920.0(w), 1608.9(m)， 1511.1(m), 1484.4(s)， 1435.6(m)， 1408.9(s), 1324.4(w), 1231.1(s)， 1195.6(m)，1075.6(s), 835.6(w) MS (ESI, negative mode) : m/z 971.3(M-H+, 100);
HPLC (Diamonsil C18 5[j 250M.6mm; DLKMA Technologies;流動相甲醇 水=1: 1 (V/V),流速0.5ml/min)保留時間10.45 min，純度99.1%
權(quán)利要求
1、具有式(I)結(jié)構(gòu)的β-葡萄糖基-Yariv試劑的制備方法，其特征在于，包括如下步驟(1)對硝基苯基葡萄糖苷還原制備對氨基苯基葡萄糖苷將硝基苯基葡萄糖苷與溶劑混合攪拌，加入鈀催化劑和甲酸銨，40～60℃條件下反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后過濾，取濾液減壓濃縮；其中Pd與硝基苯基葡萄糖苷的摩爾比為(0.02～0.5)∶1，硝基苯基葡萄糖苷與甲酸銨的摩爾比為1∶(2～10)；所述的溶劑選自甲醇或乙醇；(2)重氮化反應(yīng)取步驟(1)得到的殘?jiān)苡谒?，去除低沸點(diǎn)雜質(zhì)后，將溫度控制在0～5℃，加入HCl溶液，再向反應(yīng)體系中加入亞硝酸鹽溶液；硝基苯基葡萄糖苷與HCl的摩爾比為1∶(1～5)，硝基苯基葡萄糖苷與亞硝酸鹽的摩爾比為1∶(1～5)，得到重氮鹽溶液；(3)偶聯(lián)反應(yīng)向重氮鹽溶液中滴加間苯三酚溶液，將溫度保持在0～5℃同時攪拌，硝基苯基葡萄糖苷與間苯三酚的摩爾比為1∶(0.25～0.5)；0～5℃條件下調(diào)節(jié)pH至8.0～9.0，并反應(yīng)1～5小時；反應(yīng)結(jié)束后加入0.5～2倍體積甲醇或乙醇混合，0～5℃條件下放置12～48小時，取沉淀。
2、 權(quán)利要求1所述(3-葡萄糖基-Yariv試劑的制備方法，其特征在于，步驟(1) 中所述的鈀催化劑為Pd/C。
3、 權(quán)利要求1或2所述(3-葡萄糖基-Yariv試劑的制備方法，其特征在于，步驟 (1)中所述的鈀催化劑中，鈀的重量百分含量為5% 15%。
4、 權(quán)利要求1所述P-葡萄糖基-Yariv試劑的制備方法，其特征在于，步驟(1) 中，硝基苯基葡萄糖苷與溶劑的質(zhì)量體積比為0.05 0.02g/ml。
5、 權(quán)利要求1所述P-葡萄糖基-Yariv試劑的制備方法，其特征在于，步驟(1) 中，所述Pd與硝基苯基葡萄糖苷的摩爾比為(0.02 0.2) :1。
6、 、權(quán)利要求1所述P-葡萄糖基-Yariv試劑的制備方法，其特征在于，步驟(1) 中，所述硝基苯基葡萄糖苷與甲酸銨的摩爾比為1: (3 6)。
7、 權(quán)利要求1所述(3-葡萄糖基-Yariv試劑的制備方法，其特征在于，步驟(2) 中去除低沸點(diǎn)雜質(zhì)的方法為將pH調(diào)節(jié)至2 3，在1 20mmHg、 20 35。C下 減壓蒸餾，去除反應(yīng)系統(tǒng)中1/3 1/2體積水分；加入原反應(yīng)系統(tǒng)1/3 1/2體積的水，調(diào)節(jié)pH至2 3，在20 35'C下減壓蒸餾，去除反應(yīng)體系中1/3 1/2體 積水分；再加入水至原反應(yīng)系統(tǒng)體積。
8、 權(quán)利要求1所述P-葡萄糖基-Yariv試劑的制備方法，其特征在于，步驟(2) 中所使用的HCI溶液濃度為0.3 1.0M。
9、 權(quán)利要求1所述的P-葡萄糖基-Yariv試劑的制備方法，其特征在于，步驟(2)中所述的硝基苯基葡萄糖苷與HCI的摩爾比為1: (1.2 1.5)。
10、 權(quán)利要求1所述的P-葡萄糖基-Yariv試劑的制備方法，其特征在于，步驟 (2)中所述的硝基苯基葡萄糖苷與亞硝酸鹽的摩爾比為1: (1 2)，所述的亞硝酸鹽為亞硝酸鈉或亞硝酸鉀。
全文摘要
本發(fā)明涉及β-葡萄糖基-Yariv試劑的制備方法。其步驟包括(1)對硝基苯基葡萄糖苷還原制備對氨基苯基葡萄糖苷；(2)重氮化反應(yīng)；(3)偶聯(lián)反應(yīng)。本發(fā)明以對硝基苯基葡萄糖苷為起始原料，采用的是“一鍋煮”的合成方法，與傳統(tǒng)的合成方法相比，操作更為簡便，產(chǎn)率提高到80％左右，并且反應(yīng)所使用的試劑均價廉易得，反應(yīng)條件更為溫和，有機(jī)溶劑和催化劑用量大大減少，生產(chǎn)成本明顯降低，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C07H15/203GK101525358SQ20091004926
公開日2009年9月9日 申請日期2009年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月14日
發(fā)明者張劍波, 萌 李, 田祥光, 許意達(dá), 琛 陳 申請人:華東師范大學(xué)