專利名稱：雙環(huán)取代吡唑酮偶氮類衍生物的鹽,其制備方法及其在醫(yī)藥上的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的雙環(huán)取代吡唑酮偶氮類衍生物藥學(xué)上可接受的鹽、其制備方 法以及含有該藥學(xué)上可接受鹽的藥物組合物、以及其作為治療劑特別是作為血小板生成素 (TPO)模擬物(mimetic)和血小板生成素受體激動(dòng)劑的用途。
背景技術(shù)：
血小板生成素(Thrombopoiet in，ΤΡ0)，又稱為巨核細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育 因 子(megakaryocyte growth and development factor, MGDF), 血 小 板 生 成 刺 激因子(thrombocytopoiesis stimulating factor, TSF), c-Mpl 配 體 (c-myeloproliferativeleukemia ligand, c_Mpl)，mpl HS體，megapoietin 是一禾中與產(chǎn)生 血小板有關(guān)的糖蛋白(Wendling，F(xiàn).，et. al.，Biotherapy 10(4) :269_77 (1998) ；Kuter D. 1.et al.，TheOncologist ；1 :98_106(1996) ；Metcalf，Nature 369 :519_520(1994))。在某些情況下，TPO的活性源自TPO與TPO受體(也稱MPL)的結(jié)合。TPO受體 已經(jīng)被成功克隆，也進(jìn)行了氨基酸序列的測(cè)序(Vigon et al.，Proc. Nat. Acad. Sci. ,89 5640-5644(1992))。TPO是一種332-氨基酸糖基化多肽，在調(diào)節(jié)巨核細(xì)胞生成和由骨髓巨核細(xì)胞 產(chǎn)生血小板的過(guò)程中起著關(guān)鍵的作用(Kuter et al. , Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91: 11104-11108(1994) ；Barley et al.，Cell 77:1117-1124(1994) ；Kaushansky et al.， Nature 369:568-571(1994) ；Wendling et al. ,Nature 369:571-574(1994) ；and Sauvage et al. ,Nature 369 :533_538 (1994))。ΤΡ0產(chǎn)生于肝臟但主要作用于骨髓，刺激干細(xì)胞分化 成為巨核細(xì)胞以及巨核細(xì)胞的增殖，多倍體化，最重要的是進(jìn)入血小板身體循環(huán)分裂。TPO 在血小板減少癥和大量關(guān)于增加血小板數(shù)量、大小、增加實(shí)驗(yàn)動(dòng)物同位素參入血小板的研 究中是一種主要的調(diào)節(jié)劑(Metcalf Nature 369 :519_520 (1994))。TPO被認(rèn)為主要通過(guò)幾 個(gè)途徑影響巨核細(xì)胞生成(1)引起巨核細(xì)胞大小和數(shù)量的增加；(2)增加DNA內(nèi)含物，多 倍體的形式，巨核細(xì)胞；(3)增加巨核細(xì)胞的核內(nèi)有絲分裂；(4)增加成熟的巨核細(xì)胞；(5) 增加前體細(xì)胞的百分比，小乙酰膽堿酶-陽(yáng)性形式的細(xì)胞，骨髓細(xì)胞。血小板是血液凝固必需的，當(dāng)它的數(shù)量非常低時(shí)，病人就有出血死亡的危險(xiǎn)。因 此，TPO已經(jīng)被用于診斷和治療多種血液疾病，如主要由血小板缺陷引起的疾病。同時(shí)，TPO 可以用于治療血小板減少癥，尤其是為治療癌癥和淋巴瘤而進(jìn)行的化療、放療和骨髓移植。患者因血小板減少癥而導(dǎo)致血小板水平恢復(fù)過(guò)慢是一個(gè)嚴(yán)重的問(wèn)題，因此希望可 以找到一種治療血小板減少癥的活性TPO類似物。幾年前，多肽類TPO類似物的發(fā)展被報(bào) 道。(W096/40750，W098/25965)這些多肽可以結(jié)合并活化TPO受體，但是不具備天然TPO 的序列同源性。最近幾年，一些小分子的活性TPO類似物被報(bào)導(dǎo)。包括1，4_苯并二氮雜 卓-2-酮類(JP11001477)，由希夫堿配體得到的金屬絡(luò)合物(W0 99/11262)，環(huán)多胺衍生 物(W000/28987)，噻唑-2-基-苯酰胺類(W001/07423, W001/53267)，偶氮-芳基衍生物(W000/35446,W01/17349) ,2-芳基-萘唑類(W001/39773，W001/53267)和縮氨基脲衍生物 (W001/34585)。在基于細(xì)胞的體系內(nèi)，所有這些分子都能活化細(xì)胞膜上的TPO受體的信號(hào) 轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，一些類型能直接作用于TPO受體本身。這一系列中一些最優(yōu)先的化合物被發(fā)現(xiàn) 可以刺激TPO-responsive人類細(xì)胞系和低于IOOnM的人類骨髓培養(yǎng)液中的TPO的增殖和 分化。GSK公司在專利(W0-2003098992/W0-01089457)中報(bào)道血小板生成素類似物 eltrombopag，并表現(xiàn)出了相當(dāng)?shù)幕钚?。本發(fā)明公開了一系列雙環(huán)取代吡唑酮偶氮類衍生物藥學(xué)上可接受的鹽形式，是更 有效TPO模擬物和TPO受體激動(dòng)劑。本申請(qǐng)的申請(qǐng)人于2009年1月4日提交的申請(qǐng)PCT/CN2009/000001保護(hù)了一類 新型的雙環(huán)取代吡唑酮偶氮類衍生物，以及其作為TPO模擬物和TPO受體激動(dòng)劑的用途，其 中公開的實(shí)施例1、實(shí)施例9、實(shí)施例15、實(shí)施例28、實(shí)施例43和實(shí)施例52，分別為2'-羥 基-3' -[N' -(1-茚滿-5-基-3-甲基-5-氧代-1，5-二氫吡唑-4-亞基)-胼基]-聯(lián)苯 基-3-羧酸、5- {2-羥基-3-[N' - (1-茚滿-5-基-3-甲基-5-氧代-1，5- 二氫吡唑_4_亞 基)-胼基]-苯基}-呋喃-2-羧酸、5-(2-羥基-3-{N' -[3-甲基-5-氧代(5，6，7， 8-四氫萘-2-基)-1，5_ 二氫吡唑-4-亞基]-胼基}_苯基)_呋喃-2-羧酸、4-(2_羥 基-3- {N' - [3-甲基-5-氧代-1- (5，6，7，8-四氫萘亞甲基_2_基)-I，5- 二氫吡唑_4_亞 基]-胼基}-苯基)-呋喃-2-羧酸、5-(3-{N' -[l-(3，3-二甲基茚滿-5-基)-3_甲 基-5-氧代-1，5- 二氫吡唑-4-亞基]-胼基}-2_羥基苯)_呋喃-2-羧酸和4-{2-羥 基-3-[N' - (1-茚滿-5-基-3-甲基-5-氧代-1，5- 二氫吡唑-4-亞基)-胼基]-苯}-噻 吩-2-羧酸以及六個(gè)化合物的羧酸酯，試驗(yàn)證明其對(duì)TPO受體激動(dòng)作用明顯，因此將其內(nèi)容 整個(gè)作為本發(fā)明的參考文獻(xiàn)。但是，國(guó)際申請(qǐng)PCT/CN2009/000001沒有具體描述任何一個(gè) 化合物的鹽的形式。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)雙環(huán)取代吡唑酮偶氮類衍生物的游離酸在常規(guī)溶劑中溶解性差，不 利于被制備成藥用劑型，并且降低了化合物的體內(nèi)生物利用度，因此迫切需要開發(fā)雙環(huán)取 代吡唑酮偶氮類衍生物的新形式，解決這類化合物溶解性差，藥代吸收差的問(wèn)題，以適合于 常規(guī)制劑工藝。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供新穎的通式(I)所示的雙環(huán)取代 吡唑酮偶氮類衍生物藥學(xué)上可接受的鹽、其制備方法、包含該藥學(xué)上可接受的鹽的藥物組 合物以及其作為治療劑特別是作為TPO模擬物和TPO受體激動(dòng)劑的用途。該成鹽形式具有 治療血小板減少癥的優(yōu)異活性，溶解度明顯改善，且在動(dòng)物體內(nèi)的活性及其生物利用度良 好，毒性低，適合于制備治療血小板減少癥的制劑?！氨景l(fā)明的化合物”和“本發(fā)明的鹽”可以互換使用，都是指通式(I)化合物所示的 雙環(huán)取代吡唑酮偶氮類衍生物藥學(xué)上可接受的鹽。 其中Het選自苯基、呋喃基或噻吩基；R1, R2, R3和R4各自獨(dú)立地選自氫原子或烷基；η 為 0、1 或 2;所述的鹽為堿加成鹽。所考慮的等價(jià)物——本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解為，化合物(I)還可存在互變異 構(gòu)體的形式?；衔?I)的互變形式可包括但不限于由下式(II)和(III)表示的結(jié)構(gòu) 所有這些互變形式包括在本發(fā)明范圍內(nèi)并固有地包括在化合物(I)定義中。本發(fā)明中，所述的“藥學(xué)上可接受的鹽”是指在藥學(xué)上無(wú)毒的堿加成鹽。所述的 鹽為通式(I)化合物與合適的堿金屬氫氧化物、堿性氨基酸、胺類或季銨類形成的鹽，包括 鈉鹽、鋰鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽、精氨酸鹽、賴氨酸鹽、甲胺鹽、二甲胺鹽、三甲胺鹽、乙胺鹽、二 乙胺鹽、三乙胺鹽、乙醇胺鹽、哌嗪鹽、二芐基乙二胺鹽、葡甲胺、氨基丁三醇鹽、四甲基季銨 鹽、四乙基季銨鹽或膽堿鹽，優(yōu)選為二乙胺鹽、乙醇胺鹽、膽堿鹽、哌嗪鹽、葡甲胺鹽或氨基 丁三醇鹽，更優(yōu)選為乙醇胺鹽、膽堿鹽、葡甲胺鹽或氨基丁三醇鹽。本發(fā)明通式(I)化合物的典型的藥學(xué)上可接受的鹽包括，但不限于 本發(fā)明涉及通式(I)化合物藥學(xué)上可接受的鹽的制備方法，該方法包括(a)將游離酸(通式(I)化合物)溶解于有機(jī)溶劑中，優(yōu)選為四氫呋喃；(b)攪拌下加入2 3當(dāng)量的堿金屬氫氧化物、堿性氨基酸、胺類或季銨類；(c)反應(yīng)2 24小時(shí)后，分離出制備的鹽；其中所述的無(wú)機(jī)堿包括堿金屬氫氧化物選自鈉、鋰、鉀、鈣、鎂氫氧化物，所述的堿 性氨基酸選自賴氨酸或精氨酸，所述的胺類選自甲胺、二甲胺、三甲胺、乙胺、二乙胺、三乙 胺、乙醇胺、哌嗪、二芐基乙二胺、葡甲胺或氨基丁三醇，所述的季銨類選自四甲基季銨、四 乙基季銨或氫氧化膽堿，優(yōu)選為二乙胺、乙醇胺、氫氧化膽堿、哌嗪、葡甲胺或氨基丁三醇， 更優(yōu)選為乙醇胺、氫氧化膽堿、葡甲胺或氨基丁三醇。優(yōu)選地，步驟(C)中，分離出制備的鹽，包括從反應(yīng)液中直接過(guò)濾出固體，將反應(yīng)液減壓濃縮得到固體產(chǎn)物粗品或用有機(jī)溶劑重結(jié)晶得到產(chǎn)物鹽，然后干燥，如真空干燥或 高溫空氣干燥。上述制備過(guò)程可以在冷卻、常溫或者加熱條件下進(jìn)行，值得注意的是反應(yīng)溫度的 選擇對(duì)不同的成鹽反應(yīng)有一定的影響，這也是本領(lǐng)域技術(shù)人員技術(shù)所熟知的，本發(fā)明成鹽 反應(yīng)溫度為常溫至所用溶劑的沸點(diǎn)，優(yōu)選0 40°C ；本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)本領(lǐng)域常規(guī)的技 術(shù)手段就能容易地確定具體成鹽反應(yīng)的最優(yōu)選反應(yīng)溫度。本發(fā)明涉及通式⑴化合物在制備TPO受體激動(dòng)劑中的用途。本發(fā)明涉及通式(I)化合物在制備治療血小板減少癥藥物中的用途。包括聯(lián)合使 用治療有效量的選自下列的藥物集落刺激因子、細(xì)胞因子、趨化因子、白細(xì)胞介素或細(xì)胞 因子受體激動(dòng)劑或拮抗劑、可溶的受體、受體激動(dòng)劑或拮抗劑抗體或與一個(gè)或多個(gè)所述的 藥物具有相同的機(jī)理而起作用的肽或小分子類。本發(fā)明涉及一種藥物組合物，其包括藥物有效量的通式(I)化合物藥學(xué)上可接受 的鹽和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。該組合物可以進(jìn)一步含有聯(lián)合使用的治療有效量的 選自下列的藥物集落刺激因子、細(xì)胞因子、趨化因子、白細(xì)胞介素或細(xì)胞因子受體激動(dòng)劑。 該藥物組合物在制備治療血小板減少癥藥物的用途。所述的聯(lián)合使用包括同時(shí)使用或者先 后依次使用本發(fā)明所述的化合物。本發(fā)明涉及一種制備含有有效量的通式(I)化合物及其藥學(xué)上可以接受的鹽和 藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑的藥物組合物的方法，該方法包括將通式(I)化合物與藥用 載體和稀釋劑相結(jié)合。在藥物組合物的配制過(guò)程中，重要的是藥物物質(zhì)是一種可方便操作和處理的形 式。不僅從獲得商業(yè)上可行的制備方法的角度來(lái)說(shuō)，而且從隨后制備含該活性化合物的藥 物制劑的角度來(lái)說(shuō)，這都是很重要的。此外，在制備藥物組合物的過(guò)程中，重要的是患者給藥后，提供一種可靠的、可再 現(xiàn)的和恒定的藥物血漿濃度曲線。活性成分的化學(xué)穩(wěn)定性、固態(tài)穩(wěn)定性和“儲(chǔ)存壽命”同樣是非常重要的因素。該藥 物物質(zhì)乙基包含它的組合物應(yīng)該優(yōu)選能夠有效地儲(chǔ)存相當(dāng)一段時(shí)間，而活性成分的物理化 學(xué)特性(例如它的化學(xué)組成、密度、吸濕性和溶解度)沒有表現(xiàn)出顯著的變化。此外，提供盡可能化學(xué)純形式的藥物同樣是非常重要的。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員可以理解，典型地，如果一種藥物可以很容易地以穩(wěn)定形式 獲得，例如穩(wěn)定的晶型，那么可以提供如下優(yōu)點(diǎn)易于處理、易于制備合適的藥物制劑以及 具有可靠的溶解特征?；钚猿煞钟行Я渴菫橛行o(wú)毒劑量，優(yōu)選0.001 100mg/kg總體重的范圍，更優(yōu) 選0.001 50mg/kg。當(dāng)治療需要TPO類似物治療的患者時(shí)，優(yōu)選口服或非腸胃給藥包括局 部、直腸、經(jīng)皮、注射或持續(xù)輸液。人類口服給藥劑量?jī)?yōu)選包括0. 05 3500mg活性成分，最 優(yōu)選0.5 IOOOmg活性成分。使用較低劑量的口服給藥形式為優(yōu)選。然而，在對(duì)患者安全 方便時(shí)，也可以施用高劑量非腸胃給藥。上述劑量涉及優(yōu)選的以游離酸表示的活性成分的 量。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)肯定，活性成分個(gè)體劑量的最佳給藥數(shù)量及間隔視治療疾病 的性質(zhì)及程度，給藥劑型、途徑及部位，治療的具體患者而定，并且該最佳方案可通過(guò)常用技術(shù)確定。本領(lǐng)域技術(shù)人員也應(yīng)當(dāng)明白，最佳療程，即既定時(shí)間內(nèi)每天給予活性成分的劑量 次數(shù)可經(jīng)本領(lǐng)域技術(shù)人員使用常用的確定療程的試驗(yàn)確定。本發(fā)明的化合物可口服或非腸胃給藥，可制成包括片劑、丸劑、粉劑及顆粒劑用于 各種給藥途徑。在這些固體制劑中，活性成分至少與一種惰性稀釋劑相混合。按照常規(guī)操 作，口服制劑也可包括初惰性稀釋劑以外的其他物質(zhì)，如潤(rùn)滑劑、助流劑及抗氧化劑。若制 成膠囊、片劑及丸劑，制劑中包括緩沖劑。片劑及丸劑還可制成持續(xù)釋放劑型。盡管也可采用乳劑的非水溶液，本發(fā)明的非腸胃給藥制劑包括無(wú)菌水溶液。這些 劑型也可包括佐劑，如防腐劑、潤(rùn)濕劑、滲透劑、緩沖劑、乳化劑及分散劑。其滅菌可采用細(xì) 菌截留濾器(bacteria retaining filter)過(guò)濾，向組合物中加入滅菌劑，照射組合物或加 熱組合物的方法滅菌。本發(fā)明的鹽與其游離酸相比，主要優(yōu)點(diǎn)如下(1)本發(fā)明的鹽在常規(guī)的溶劑，如水中、甲醇和0. 鹽酸中的溶解度明顯增加， 適用于常規(guī)制劑，其中乙醇胺鹽在0. 鹽酸中溶解度明顯改善。(2)本發(fā)明的鹽具有改善的穩(wěn)定性的特性。(3)本發(fā)明的鹽具有更好的體外篩選生物活性。(4)本發(fā)明的鹽在動(dòng)物體內(nèi)療效低毒、作用時(shí)間長(zhǎng)、副作用小，其藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì) 明顯改善，易吸收，生物利用度高，有較好的藥代動(dòng)力學(xué)曲線，其中乙醇胺鹽、膽堿鹽、哌嗪 鹽、葡甲胺鹽和氨基丁三醇鹽具有較好的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。(5)本發(fā)明的鹽以高收率、高純度、快速、方便和低成本進(jìn)行制備，其中乙醇胺鹽、 膽堿鹽、二乙胺鹽和哌嗪鹽在工藝路線中有優(yōu)勢(shì)，可以直接析出晶體。本發(fā)明的鹽與其游離酸相比，其溶解度、穩(wěn)定性、體外篩選活性和藥代動(dòng)力學(xué)等性 質(zhì)都明顯改善，優(yōu)選為二乙胺鹽、乙醇胺鹽、膽堿鹽、哌嗪鹽、葡甲胺鹽和氨基丁三醇鹽，更 優(yōu)選為乙醇胺鹽、膽堿鹽、葡甲胺鹽和氨基丁三醇鹽。發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明除非有相反陳述，下列用在說(shuō)明書和權(quán)利要求書中的術(shù)語(yǔ)具有下述含義。“乙醇胺”指“2-氨基乙醇”。“膽堿”指“(2-羥基乙基)三甲基銨”。“葡甲胺”指“N-甲基-D-葡萄糖胺”。“藥物組合物”表示一種或多種本文所述化合物藥學(xué)上可接受的鹽或前體藥物與 其他化學(xué)組分的混合物，其他組分例如生理學(xué)/藥學(xué)上可接受的載體。藥物組合物的目的 是促進(jìn)化合物對(duì)生物體的給藥?！胺€(wěn)定性”化學(xué)穩(wěn)定性和固態(tài)穩(wěn)定性?！盎瘜W(xué)穩(wěn)定性”包括標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)存條件下有可能以隔離形式或以摻合藥學(xué)上可接受的 載體或稀釋劑后獲得的制劑形式(例如以口服劑型，如片劑、膠囊等)儲(chǔ)存本發(fā)明的化合 物，具有微不足道程度的化學(xué)降解或分解。“固態(tài)穩(wěn)定性”包括標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)存條件下有可能以隔離固態(tài)形式或以摻合藥學(xué)上可接 受的載體或稀釋劑后獲得的固態(tài)劑型的形式(例如以口服劑型，如片劑、膠囊等)儲(chǔ)存本發(fā) 明的化合物，具有微不足道的固態(tài)轉(zhuǎn)變(例如結(jié)晶、重結(jié)晶、固態(tài)相變、水合、脫水、溶劑化 或脫溶劑化)。
“標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)存條件”的例子包括溫度在-80V至+50V之間(優(yōu)選在0°C至40°C之間， 更優(yōu)選在室溫下，例如15°C -30°C )，壓力在0. 1帕至2帕之間(優(yōu)選在大氣壓下)，相對(duì)濕 度在5%至95%之間(優(yōu)選10% -60% )和/或暴露于460勒克斯UV/可見光下，經(jīng)歷更 長(zhǎng)的時(shí)間(即大于或等于6個(gè)月)?！胺悄c胃給藥”包括靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、鼻腔內(nèi)、直腸內(nèi)、陰道內(nèi)或腹膜內(nèi)。通常 優(yōu)選口服給藥。本發(fā)明化合物的合成方法為了完成本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案按照本申請(qǐng)的申請(qǐng)人于2009年1月4日提交的申請(qǐng)PCT/CN2009/000001實(shí)施例 1、實(shí)施例9、實(shí)施例15、實(shí)施例28、實(shí)施例43和實(shí)施例52，所述的方法制備，因此將該內(nèi)容 作為參考文獻(xiàn)。通式(I)化合物藥學(xué)上可接受的鹽的制備方法，該方法包括(a)將游離酸(通式(I)化合物)溶解于有機(jī)溶劑中，優(yōu)選為四氫呋喃；(b)攪拌下加入2 3當(dāng)量的堿金屬氫氧化物、堿性氨基酸、胺類或季銨類；(c)反應(yīng)2 24小時(shí)后，分離出制備的鹽；其中所述的無(wú)機(jī)堿包括堿金屬氫氧化物選自鈉、鉀、鈣、鎂氫氧化物，所述的胺類 或季銨類化合物選自四甲基季銨、四乙基季銨、乙醇胺、膽堿、賴氨酸、精氨酸、甲胺、二甲 胺、三甲胺、乙胺、二乙胺、三乙胺、二芐基乙二胺、葡甲胺、哌嗪或氨基丁三醇。優(yōu)選地，步驟(C)中，包括從反應(yīng)液中直接過(guò)濾出固體，將反應(yīng)液減壓濃縮得到固 體產(chǎn)物粗品或用有機(jī)溶劑重結(jié)晶得到產(chǎn)物鹽，然后干燥，如真空干燥或高溫空氣干燥。上述制備過(guò)程可以在冷卻、常溫或者加熱條件下進(jìn)行，值得注意的是反應(yīng)溫度的 選擇對(duì)不同的成鹽反應(yīng)有一定的影響，這也是本領(lǐng)域技術(shù)人員技術(shù)所熟知的，本發(fā)明成鹽 反應(yīng)溫度為常溫至所用溶劑的沸點(diǎn)，優(yōu)選0 40°C ；本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)本領(lǐng)域常規(guī)的技 術(shù)手段就能容易地確定具體成鹽反應(yīng)的最優(yōu)選反應(yīng)溫度。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于進(jìn)一步描述本發(fā)明，但這些實(shí)施例并非限制著本發(fā)明的范圍和精 神實(shí)質(zhì)。實(shí)施例化合物的結(jié)構(gòu)是通過(guò)核磁共振(1HNMR)或質(zhì)譜(MS)來(lái)確定的。1HNMR的測(cè)定是用 Bruker AVANCE-400核磁儀，測(cè)定溶劑為氘代甲醇(⑶30D)，氘代氯仿(⑶Cl3),六氘代二甲 基亞砜(DMS0-d6)內(nèi)標(biāo)為四甲基硅烷(TMS)，化學(xué)位移是以l(T6(ppm)作為單位給出；MS 的測(cè)定用 FINNIGAN LCQAd (ESI)質(zhì)譜儀(生產(chǎn)商Therm，型號(hào)Finnigan LCQ advantage MAX)；IC50值的測(cè)定用NovoStar酶標(biāo)儀(德國(guó)BMG公司)；薄層硅膠使用煙臺(tái)黃海HSGF254或青島GF254硅膠板；硅膠柱層析一般使用煙臺(tái)黃海硅膠200 300目硅膠為載體；HPLC測(cè)試使用安捷倫1200DAD高壓液相色譜儀(Sunfire C18 150X4. 6mm色譜 柱)和Waters 2695_2"6高壓液相色譜儀(Gimini C18 I5O X 4. 6讓色譜柱)；
加壓氫化反應(yīng)使用Pau 3916EKX型氫化儀和清藍(lán)QL型氫氣發(fā)生器；微波反應(yīng)使用 CEM Discover-S 908860 型微波反應(yīng)器；實(shí)施例中無(wú)特殊說(shuō)明，反應(yīng)均在氮?dú)夥障逻M(jìn)行；氮?dú)夥帐侵阜磻?yīng)瓶連接一個(gè)約IL容積的氮?dú)鈿馇?；氫氣氛是指反?yīng)瓶連接一個(gè)約IL容積的氫氣氣球；實(shí)施例中無(wú)特殊說(shuō)明，反應(yīng)中的溶液是指水溶液；TLC是指薄層色譜；HPLC是指高效液相色譜；HPLC 測(cè)試條件運(yùn)行時(shí)間30min 柱溫30°C PDA :230nm流動(dòng)相乙腈水(0. 三氟醋酸)=25 75流速1. OmL/分色譜柱C18，150*4.6mm Gemini實(shí)施例1(Z)-2'-羥基-3' -「N' -(1-茚滿-5-基-3-甲基-5-氧代-1,5-二氫吡 P半-4-亞某)-肼某1-聯(lián)苯某-3-羧酸二乙醇胺鹽 第一步2-溴-6-硝基苯酚將60mL濃硫酸稀釋到186mL水中，冷卻至室溫后加入硝酸鈉(79. 2g，0. 93mol)， 保持25°C以下，滴加鄰溴苯酚la(60mL，0. 52mol)，室溫反應(yīng)2小時(shí)。TLC跟蹤至原料消失， 加入320mL乙酸乙酯溶解析出的固體，分別用水和飽和食鹽水洗滌，用無(wú)水硫酸鎂干燥，過(guò) 濾，濾液減壓濃縮，用硅膠柱色譜法純化所得殘余物，得到2-溴-6-硝基苯酚Ib (48. 2g，黃 色固體)。產(chǎn)率42. 8%。
15
MS m/z (ESI) :218[M+1]1HNMR(400M Hz, CDCl3) δ 11· 18 (s，1H)，8· 12—8. 15 (m，1H)，7· 89—7. 91 (d，J = 8Hz, 1H) ,6. 88-7. 02 (m, 1H)第二步1-溴-2-甲氧基-3-硝基苯將2-溴-6-硝基苯酚lb(46. 55g，0. 214mol)溶解于500mL丙酮中，加入碳酸鉀 (35. 36g，0. 26mol)和碘甲烷(20. ImL, 0. 32mol)，70°C加熱回流40小時(shí)。TLC跟蹤至原料消 失，減壓濃縮，加入1300mL乙酸乙酯和500mL水，水相用乙酸乙酯萃取(300mLX 2)，合并有 機(jī)相，分別用4N鹽酸和飽和碳酸氫鈉溶液洗滌，用無(wú)水硫酸鎂干燥，過(guò)濾，濾液減壓濃縮， 用硅膠柱色譜法純化所得殘余物，得到1-溴-2-甲氧基-3-硝基苯Ic (44. 59g，棕色固體)。 產(chǎn)率90. 0%。MS m/z (ESI) :234[M+1]第三步2'-甲氧基-3'-硝基聯(lián)苯基-3-羧酸將1-溴-2-甲氧基-3-硝基苯Ic (23. 25g,0. IOmol)、3_羧基苯基硼酸(19. 5g， 117mmol)和四(三苯基膦)鈀(8. 86g,7. 7mol)溶解于IOOmL 2N碳酸鈉溶液和500mLl， 4-二氧六環(huán)的混和溶劑中，105°C加熱回流43小時(shí)。TLC跟蹤至原料消失，減壓濃縮，加 入300mL 6N鹽酸溶液和400mL乙酸乙酯，水相用乙酸乙酯萃取(200mLX 2)，合并有機(jī)相， 用無(wú)水硫酸鎂干燥，過(guò)濾，濾液減壓濃縮，得到2'-甲氧基-3'-硝基聯(lián)苯基-3-羧酸 Id (53. 93g，淺黃色固體)。MS m/z (ESI) :272[M_1]1HNMR (400MHz, CDCl3) δ 8. 11 (s，1Η)，8· 01-8. 03 (d，J = 8Hz，1Η)，7· 90-7. 92 (m， 1Η)，7. 82-7. 84 (m, 1H)，7. 21-7. 75 (m, 1H)，7. 63-7. 67 (m, 1H)，7. 42-7. 46 (m, 1H)， 3. 44-3. 46 (d, J = 8Hz，3H)第四步2'-甲氧基-3'-氨基聯(lián)苯基-3-羧酸將2'-甲氧基-3'-硝基聯(lián)苯基_3-羧酸1(1(0.488，1.7411111101)溶解于601^乙 醇中，加入0.5g鈀-碳(10% )和甲酸銨(1. lg，17.4mmOl)，80°C加熱回流20分鐘。TLC 跟蹤至原料消失，過(guò)濾，濾液減壓濃縮，干燥，得到2'-甲氧基-3'-氨基聯(lián)苯基-3-羧酸 le(0. 42g，白色固體)。產(chǎn)率93.3%。MS m/z (ESI) :242[M_1]第五步3'-氨基-2'-羥基聯(lián)苯基-3-羧酸氫溴酸鹽采用公知的方法(專利W00189457)，將2'-甲氧基-氨基聯(lián)苯基_3_羧酸 Ie (2. 5g,10. 3mmol)溶解于IOOmL氫溴酸溶液(40% )中，120°C加熱回流過(guò)夜。TLC跟蹤 至原料消失，減壓濃縮，用硅膠柱色譜法純化所得殘余物，得到3'-氨基-2'-羥基聯(lián)苯 基-3-羧酸氫溴酸鹽If (2. 4g，土黃色固體)，產(chǎn)率88. 8 %。MS m/z (ESI) :230[M+1]第六步
5-胼基茚滿冰浴下將5-氨基茚滿Ig (3. 59g，27. Ommo 1)溶解于20mL濃鹽酸中，攪拌10分鐘。 滴加入IOmL亞硝酸鈉溶液(1. 86g，27. Ommol)，冰浴下繼續(xù)攪拌15分鐘備用。冰鹽浴下將二水合氯化亞錫(24. 4g，108. Ommol)溶解于IOmL濃鹽酸中，將備用 中間體溶液加入其中，升至室溫反應(yīng)1. 5小時(shí)。冰浴下用40%氫氧化鈉溶液調(diào)pH = 9，加 入400mL乙酸乙酯萃取，減壓濃縮，干燥，得到5-胼基茚滿Ih (2. 05g，紅棕色固體)。產(chǎn)率 51. 3%。MS m/z (ESI) 149[M+1]第七步2-茚滿-5-基-5-甲基-2，4-二氫吡唑-3-酮將5-胼基茚滿lh(2.05g，13.8mmol)溶解于50mL乙酸中，加入乙酰乙酸乙酯 (1. 76mL, 13. Smmol)，加熱至100°C過(guò)夜。TLC跟蹤至原料消失，減壓濃縮，用硅膠柱色譜法 純化所得殘余物，得到2-茚滿-5-基-5-甲基-2，4- 二氫吡唑-3-酮Ii (1. 84g，黃色固 體)。產(chǎn)率62. 3%0MS m/z (ESI) :215[M+1]1HNMR(400MHz, CDCl3) δ 7. 69 (s, 1H)，7· 60 (d, J = 8. OHz，1Η)，7· 24 (d, J = 8Hz, 1H)，3. 44 (s，2H)，2. 90-2. 97 (m, 4H)，3. 21 (s，3H)，2. 07-2. 14 (m, 2H)。第八步(Z)-2'-羥基-3' -[N' -(1-茚滿-5-基-3-甲基-5-氧代-1，5-二氫吡 唑-4-亞基)_胼基]_聯(lián)苯基-3-羧酸冰浴下將3'-氨基-2'-羥基聯(lián)苯基-3-羧酸氫溴酸鹽lf(267mg，l. 16mmol) 溶解于IOmLlN鹽酸中，滴加入IOmL亞硝酸鈉溶液(88mg，1. 28mmol)的，再加入2-茚 滿-5-基-5-甲基-2，4- 二氫吡唑-3-酮Ii (249mg, 1. 16mmol)，用飽和碳酸氫鈉溶液將反 應(yīng)液調(diào)節(jié)PH = 8，加入IOmL乙醇，升至室溫過(guò)夜。TLC跟蹤至原料消失，過(guò)濾，干燥，用甲醇 重結(jié)晶，得到標(biāo)題產(chǎn)物⑵-2'-羥基-3' -[N' -(1-茚滿-5-基-3-甲基-5-羰基-1， 5-二氫吡唑-4-亞基)-胼基]-聯(lián)苯基-3-羧酸lj(60mg，黃色固體)。產(chǎn)率11.4%。MS m/z (ESI) :453[M_1]1HNMR (400MHz, DMS0_d6) δ 13. 76 (br, 1Η)，13. 03 (br, 1Η)，9· 66 (br, 1Η)，8· 13 (s， 1Η) ,7. 96-7. 98 (d, J = 8. 1Hz，1Η)，7. 60—7. 82 (m，5Η)，7. 28—7. 30 (d，J = 8·1Ηζ，1Η)， 7. 13-7. 17 (m, 2Η)，2. 86-2. 93 (m, 4Η)，2. 34 (s, 3H)，2. 03-2. 10 (m, 2H)第九步(Z)-2'-羥基-3' -[N' -(1-茚滿-5-基-3-甲基-5-氧代-1，5-二氫吡 唑-4-亞基)_胼基]_聯(lián)苯基-3-羧酸二乙醇胺鹽將⑵-2'-羥基-3' -[N' -(1-茚滿-5-基-3-甲基-5-羰基-1，5-二氫吡 唑-4-亞基)_胼基]_聯(lián)苯基-3-羧酸Ij (454mg, 1. Ommol)溶解于16mL四氫呋喃中，攪拌 下加入乙醇胺(143mg，2.35mm0l)，反應(yīng)液在室溫?cái)嚢?小時(shí)。過(guò)濾，濾餅用四氫呋喃洗滌 (2mLX3)，真空下干燥，得到標(biāo)題產(chǎn)物2'-羥基-3' -[N' -(1-茚滿-5-基-3-甲基-5-羰 基-1，5- 二氫吡唑-4-亞基)_胼基]_聯(lián)苯基-3-羧酸二乙醇胺鹽1 (553mg，暗紅色固體)。 產(chǎn)率96. 0%。
MS m/z (ESI) :453[M_1]1HNMR(400MHz, CD3OD) δ 8. 13 (s, 1H), 7. 92 (d, J = 7· 6Hz，1Η)，7· 69 (m，3Η)，
7.61 (d, J = 8. OHz, 1Η)，7. 45 (t, J = 7. 6Hz, 1Η)，7. 25 (d, J = 8. OHz, 1Η)，7. 17 (d, J =
8.0Hz, 1Η) ,6. 98 (t, J = 8· ΟΗζ，1Η)，3· 65 (t，J = 5. 2Hz，4Η)，2. 95 (m，4Η)，2. 86 (t，J = 5. 2Hz，4H)，2.41(s，3H)，2. 12(m，2H)實(shí)施例2(Z)-2'-羥基-3' -「N' -(1-茚滿-5-基-3-甲基-5-氧代-1,5-二氫吡 啤-4-亞某)-肼某1-聯(lián)苯某-3-羧酸二(二乙胺)鹽 將⑵-2'-羥基-3' -[N' -(1-茚滿-5-基-3-甲基-5-氧代-1，5-二氫吡 唑-4-亞基)-胼基]-聯(lián)苯基-3-羧酸Ij (150mg, 0. 33mmol)溶于5mL四氫呋喃中，呈暗紅 色懸濁液，攪拌下滴加二乙胺(48mg，0. 66mmol)，呈紫紅色溶液，室溫下反應(yīng)2小時(shí)。反應(yīng)液 中有固體析出，過(guò)濾，濾餅用四氫呋喃洗滌(lmLX3)，得到的固體在真空下干燥，得到標(biāo)題 產(chǎn)物(Z)-2'-羥基-3' -[N' -(1-茚滿-5-基-3-甲基-5-氧代-1，5-二氫吡唑-4-亞 基)_胼基]_聯(lián)苯基-3-羧酸二(二乙胺)鹽2(132mg，紅色固體)，產(chǎn)率66.7%。HPLC 99. 23%MS m/z (ESI) :452. 9[M_1]1HNMR (400M Hz，CD3OD) δ 8. 083 (m, 4H) ,7. 94 (d, J = 7. 6Hz，1H)，7. 722 (m, 2H)， 7. 620 (m, 2H)，7. 549 (m, 1H)，7. 250 (d, J = 8. 4Hz, 1H)，7. 137 (d, J = 8Hz, 1H)，7. 069 (m, 1H)， 2. 930 (m, 8H)，2. 381 (s，3H)，1. 09 (m, 2H)，1. 335 (m, 12H)實(shí)施例3(Z)-2'-羥基-3' -「N' -(1-茚滿-5-基-3-甲基-5-氧代-15-二氫吡唑-4-亞
將⑵-2'-羥基-3' -[N' -(1-茚滿-5-基-3-甲基-5-氧代-1，5-二氫吡 唑-4-亞基)-胼基]-聯(lián)苯基-3-羧酸Ij (150mg, 0. 33mmol)溶于5mL四氫呋喃中，呈暗紅色 懸濁液，攪拌下加入哌嗪(57mg，0. 66mmol)，呈紫紅色溶液，室溫下攪拌2小時(shí)。反應(yīng)液中有固體析出，過(guò)濾，濾餅用四氫呋喃洗滌(lmLX3)，得到的固體在真空下干燥，得到標(biāo)題產(chǎn)物 (Z)-2'-羥基-3' -[N' -(1-茚滿-5-基-3-甲基-5-氧代-1，5-二氫吡唑-4-亞基)-胼 基]-聯(lián)苯基-3-羧酸二哌嗪鹽3 (130mg,暗紅色固體)，產(chǎn)率62. 8%0 HPLC 98. 51%MS m/z (ESI) :452. 8[M_1]1HNMR(400MHz, CD3OD) δ 8. 1 (s, 1Η) , 7. 92 (d, J = 7. 6Hz，1Η)，7. 678 (m，3Η)， 7. 61 (m, 1Η)，7. 432 (m, 1Η)，7. 239 (d, J = 8. OHz, 1Η)，7. 147 (m, 1Η)，7. 001 (m, 1H)，3. 728 (m, 2H)，2. 966 (m, 12H)，2. 388 (s, 3H)，2. 105 (m, 2H)，1. 889 (m, 2H)實(shí)施例4(Z)-5-(3-{N' -「I-(3, 3- 二甲基茚滿 ~5~ 基)_3_ 甲基 _5_ 氧代 _1,5_ 二氫吡 P半-4- 1-肼某丨-2-羥某苯)--2-羧酸二乙醇胺鹽 第一步1-(3，3_ 二甲基茚滿-5-基)胼基-1，2-二羧酸二叔丁酯將6-溴-1，1- 二甲基茚滿(采用公知的方法專利W02005066115制備而 得)4a(4. 32g，19. 27mmol)溶解于 40mL 四氫呋喃中，_78°C下滴加丁基鋰(15. 67mL, 1. 6mol/ L，25. 05mmol)，反應(yīng)40分鐘，加入偶氮二甲酸二叔丁酯(5. 32g，23. 12mmol)的30mL四氫呋 喃溶液，_78°C下繼續(xù)反應(yīng)3小時(shí)。TLC跟蹤至原料消失，加入5mL甲醇，反應(yīng)液升至室溫， 用硅膠過(guò)濾，濾液減壓濃縮，用硅膠柱層析分離純化所得殘留物，得到1-(3，3_ 二甲基茚 滿-5-基)胼基-1，2- 二羧酸二叔丁酯5b (2. 70g，黃色固體)。產(chǎn)率37. 2%。
第二步2-(3，3-二甲基茚滿-5-基)-5-甲基_2，4_ 二氫吡唑_3_酮將1-(3，3-二甲基茚滿-5-基)胼基-1，2-二羧酸二叔丁酯 4b (2. 70g，7. 18mmol) 溶解于IOOmL乙酸中，加入20mL三氟乙酸，室溫反應(yīng)2小時(shí)，加入乙酰乙酸乙酯(0. 98g， 7. 54mmol)，加熱至100°C反應(yīng)2小時(shí)。TLC跟蹤至原料消失，冷卻至室溫，減壓濃縮除去乙 酸，用飽和碳酸氫鈉溶液中和反應(yīng)液中的酸，用乙酸乙酯萃取，合并有機(jī)相，用飽和食鹽水 洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，減壓濃縮，用硅膠柱色譜法純化所得殘余物，得到2- (3，3- 二 甲基茚滿-5-基)-5-甲基-2，4- 二氫吡唑-3-酮5c (1. Og,淡褐色固體)。產(chǎn)率47. 7%。MS m/z (ESI) :243[M+1]第三步2-(2_甲氧基-3-硝基苯基)-4，4，5，5_四甲基_[1，3，2]硼酸乙二醇酯將1-溴-2-甲氧基-3-硝基苯 lc(67g，289mmol)、4，4，4，，4，，5，5，5，，5，-八 甲基-2，2，-聯(lián)-1，3，2-硼酸乙二醇酯(110g，433mmOl)、四(三苯基膦)鈀(11.80g， 14. 44mmol)和乙酸鉀(71g，724mmol)溶解于600mL乙二醇二甲醚中，加熱回流17小時(shí)。 TLC跟蹤至原料消失，減壓濃縮，用硅膠柱層析分離純化，得到2-(2_甲氧基-3-硝基苯 基)-4，4，5，5-四甲基-[1，3，2]硼酸乙二醇酯4d(50. 5g，黃色晶體)。產(chǎn)率61. 9%。第四步5- (2-甲氧基-3-硝基苯基)-呋喃-2-羧酸將2-(2_甲氧基-3-硝基苯基)-4，4，5，5_四甲基-[1，3，2]硼酸乙二醇酯 4d(10g，35.85mmol)、5-溴-呋喃-2-羧酸(5. 47g，28. 66mmol)、四(三苯基膦)鈀(2. 07g, 1. 79mmol)和碳酸鈉(7. 60g，71. 66mmol)溶解于200mL 1，4-二氧六環(huán)和30mL水的混合溶 劑中，加熱回流2. 5小時(shí)。TLC跟蹤至原料消失，過(guò)濾，濾液減壓濃縮，向殘余物中加入150mL 水，用IN鹽酸酸化至pH = 3，過(guò)濾，固體用50mL正己烷和乙酸乙酯的混合溶劑(V V = 1/1)洗滌，干燥，得到5- (2-甲氧基-3-硝基苯基)-呋喃-2-羧酸4e (4. 23g，灰白色固體)。 產(chǎn)率56. 1%。MS m/z (ESI) :262[M_1]第五步 5- (3-氨基-2-甲氧基-苯基)-呋喃-2-羧酸將5-(2_甲氧基-3-硝基苯基)_呋喃-2-羧酸4e(4. 23g，16.09mmol)溶解于 125mL乙酸乙酯中，再加入423mg鈀-碳(10% )和甲酸銨(4. 054g,64. 35mmol)，加熱回流 3. 5小時(shí)。TLC跟蹤至原料消失，減壓濃縮，用硅膠柱色譜法純化所得殘余物，得到5-(3_氨 基-2-甲氧基-苯基)_呋喃-2-羧酸4f (2. 79g，淡綠色固體)，產(chǎn)率74. 4%。MS m/z (ESI) :232[M_1]第六步5- (3-氨基-2-羥基苯基)-呋喃-2-羧酸氫溴酸鹽將5-(3-氨基-2-甲氧基-苯基)-呋喃-2-羧酸4f(2. 79g，11.97mm0l)溶解于 25mL 二氯甲烷中，滴加入三溴化硼(23. 9mL, 2. Omo 1/L)，室溫反應(yīng)1小時(shí)。TLC跟蹤至原料 消失，加入5mL甲醇，減壓濃縮，向殘余物中加入IOOmL乙酸乙酯，攪拌1小時(shí)，過(guò)濾，收集固 體，干燥，得到5- (3-氨基-2-羥基苯基)-呋喃-2-羧酸氫溴酸鹽4g (1. 24g，黃色固體)。產(chǎn)率47. 2%。MS m/z (ESI) :218[M_1]第七步(Z)-5-(3-{N' -[l-(3，3-二甲基茚滿-5-基)-3_ 甲基-5-氧代-1，5_ 二氫吡 唑-4-亞基]-胼基} -2-羥基苯)-呋喃-2-羧酸冰浴下將5-(3-氨基-2-羥基苯基)-呋喃-2-羧酸氫溴酸鹽48(33311^，1. Immol) 溶解于鹽酸(3. 7mL, lmol/L)中，滴加入1. 5mL亞硝酸鈉溶液(85mg, 1. 22mmol)，反應(yīng)20 分鐘，再加入2- (3，3- 二甲基茚滿-5-基)-5-甲基-2，4- 二氫吡唑-3-酮5c (242mg，
1.Ommo 1)，分批加入碳酸氫鈉(1. 4g，16. 67mmol)和3mL乙醇，室溫反應(yīng)過(guò)夜。TLC跟蹤至原 料消失，過(guò)濾，固體加入20mL水，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值至3 4，過(guò)濾出固體，固體干燥后經(jīng) 柱層析得到標(biāo)題產(chǎn)物(Z)-5-(3-{N' -[l-(3，3-二甲基茚滿-5-基)-3_甲基-5-氧代-1， 5- 二氫吡唑-4-亞基]-胼基}-2-羥基苯)_呋喃-2-羧酸4h(190mg，紅色固體)，產(chǎn)率 40. 3%。MS m/z (ESI) :470. 9[M_1]1HNMR (400MHz, DMS0_d6) δ 13. 74 (br, 1H), 13. 15 (br, 1H), 9. 99 (br, 1Η), 7. 71 (m, 3Η)，7. 55 (d, J = 6. 8Hz, 1Η)，7. 37 (d, J = 3. 6Hz, 1Η)，7. 20 (m, 2Η)，7. 15 (m, 1Η)，2. 86 (t, J =7. 2Ηζ，2Η)，2· 33(s，3H)，1. 92 (t, J = 7. 2Hz，2H)，1. 26(s，6H)第八步(Z)-5-(3-{N' -[l-(3，3-二甲基茚滿-5-基)-3_ 甲基-5-氧代-1，5_ 二氫吡 唑-4-亞基]-胼基}-2-羥基苯)_呋喃-2-羧酸二乙醇胺鹽將⑵-5-(3-{N'-[1-(3，3_ 二甲基茚滿-5-基)-3_ 甲基-5-氧代-1，5-二氫 吡唑-4-亞基]-胼基} -2-羥基苯)-呋喃-2-羧酸4h (2. 3g，4. 87mmol)溶解于20mL四 氫呋喃中，攪拌下加入乙醇胺(594mg，9. 75mmol)，反應(yīng)液在室溫?cái)嚢?小時(shí)。過(guò)濾，濾餅用 四氫呋喃洗滌(lmLX3)，真空下干燥，得到標(biāo)題產(chǎn)物(Z)-5-(3-{N' _[1_(3，3-二甲基茚 滿-5-基)-3-甲基-5-氧代-1，5- 二氫吡唑-4-亞基]-胼基} -2-羥基苯)-呋喃-2-羧 酸二乙醇胺鹽4(2. 5g，黑色固體)。產(chǎn)率86.4%。MS m/z (ESI) :470. 8[M_1]1HNMR (400MHz, CD3OD) : δ 7. 57 (m，4H)，7. 19 (m，1H)，7. 03 (d，J = 3·2Ηζ，1Η)， 6. 95 (d, J = 3. 6Ηζ，1Η)，6. 71(t，J = 8. 0Hz，1Η)，3. 73 (t，J = 5. 2Hz，4Η)，2. 98 (m，4Η)，
2.88 (t, J = 7. 2Hz，2H)，2. 36(s，3H)，1. 96 (t, J = 7. 2Hz，2H)，1. 29(s，6H)實(shí)施例5(Z)-5-(3-IN' -「I-(3，3- 二甲基茚滿 _5_ 基)_3_ 甲基 _5_ 氧代 _1，5_ 二氫吡 嗶-4-亞基1-肼基丨-2-羥基苯)-呋喃-2-羧酸二( 二乙胺)鹽 將⑵-5-(3-{N'-[l-(3，3-二甲基茚滿-5-基)-3_ 甲基-5-氧代-1，5_ 二 氫吡唑-4-亞基]-胼基} -2-羥基苯)-呋喃-2-羧酸4h (150mg, 0. 32mmol)溶于5mL 四氫呋喃中，呈暗紅色懸濁液，攪拌下加入哌嗪(55mg，0. 64mmol)，呈紫紅色溶液，室溫 下攪拌過(guò)夜。濾餅用四氫呋喃洗滌(lmLX3)，得到的固體在真空下干燥，得到標(biāo)題產(chǎn)物 (Z) -5-(3-{N' -[1-(3，3- 二 甲基茚滿-5-基)-3-甲基-5-氧代-1，5- 二氫吡唑-4-亞 基]-胼基} -2-羥基苯)-呋喃2-羧酸二哌嗪鹽6 (158mg,紅色固體)。產(chǎn)率77. 1 %。HPLC 99. 28%MS m/z (ESI) :471.8[M_1]1HNMR (400MHz, CD3OD) δ 7. 64(s，3H)，7· 55 (d, 1Η)，7· 21 (d, 1Η)，7· 04(m，2H)， 3. 01 (s，16Η)，2. 90 (t, 2Η)，2. 38 (s, 3H)，1. 97 (t, 2H)，1. 29 (s,6H)實(shí)施例7(Z)-5-(2-羥基-3-{N' _「3_ 甲基 氧代 (5,6, 7,8_ 四氫萘 基)_1， 5- 二氫吡唑-4-亞基1-肼基丨-苯基)-呋喃-2-羧酸二乙醇胺鹽 將(Z)-5-(3-{N'-[1-(3，3_ 二甲基茚滿-5-基)-3_ 甲基-5-氧代-1，5-二氧 口比唑-4-亞基]-胼基} -2-羥基苯)-呋喃-2-羧酸4h (150mg, 0. 32mmol)溶于5mL四氧 呋喃中，呈暗紅色懸濁液，攪拌下加入二乙胺(46mg，0. 63mmol)，呈紫紅色溶液，室溫下攪拌 過(guò)夜。將反應(yīng)液在減壓下濃縮，殘留物通過(guò)硅膠層析進(jìn)一步分離純化(正己烷乙酸乙酯 =10 1)，得到的固體在真空下干燥，得到標(biāo)題產(chǎn)物(Z)-5-(3-{N' -[l-(3，3-二甲基弗 滿-5-基)-3-甲基-5-氧代-1，5- 二氫吡唑-4-亞基]-胼基} -2-羥基苯)-呋喃-2-羧 酸二(二乙胺)鹽5(170mg，暗紅色固體)。產(chǎn)率86.7%。HPLC 94. 64%MS m/z (ESI) :471.9[M_1]1HNMR (400MHz，CD3OD) δ 7. 60 (m，4H)，7. 19 (m, 1H)，7· 04 (m，1H)，6. 87 (m, 2H)， 2. 98 (q, 8H)，2. 89 (t, 2H)，2. 36 (s, 3H)，1. 96 (t, 2H)，1. 27 (t, 12H)，1. 25 (s,6H)實(shí)施例6(Z)-5-(3-{N' -「I-(3, 3- 二甲基茚滿 ~5~ 基)_3_ 甲基 _5_ 氧代 _1,5_ 二氫批 第一步2-胼基-5，6，7，8-四氫萘冰浴下將2-氨基-5，6，7，8-四氫萘7a (3. 68g，25. Ommol)溶解于20mL濃鹽酸中， 攪拌10分鐘。滴加入IOmL亞硝酸鈉溶液(1. 72g，25. Ommol)，冰浴下繼續(xù)攪拌15分鐘備用。冰鹽浴下將二水合氯化亞錫(22. 6g，IOOmmol)溶解于IOmL濃鹽酸中，將備用中 間體溶液加入其中，升至室溫反應(yīng)1. 5小時(shí)。冰浴下用40%氫氧化鈉溶液調(diào)pH = 9，加入 400mL乙酸乙酯萃取，減壓濃縮，干燥，得到2-胼基-5，6，7，8-四氫萘7b (2. 19g，黃色油狀 液體)。產(chǎn)率53. 7%。MS m/z (ESI) :163[M+1]第二步5-甲基-2-(5，6，7，8-四氫萘 _2_ 基)_2，4_ 二氫吡唑 _3_ 酮將2-胼基-5，6，7，8-四氫萘7b (2. 0g，12. 3謹(jǐn)ol)溶解于50mL乙酸中，再加入乙 酰乙酸乙酯(1.57mL，12. 3mmol)，加熱至100°C過(guò)夜。TLC跟蹤至原料消失，減壓濃縮，用 硅膠柱色譜法純化所得殘余物，得到5-甲基-2-(5，6，7，8-四氫萘-2-基)-2，4_ 二氫吡 唑-3-酮7c(1.58g，無(wú)色油狀液體)。產(chǎn)率56. 2%0MS m/z (ESI) :457[2M+1]1HNMr(CDCI3) : δ 7. 54-7. 58(m，2H)，7. 08-7. 10(d，J = 8Hz，1H)，3. 43 (s，2H)， δ 2. 77-2. 81 (m, 4H)，2. 21 (s，3H)，1. 80-1. 83 (m, 4H).第三步(Z)-5-(2-羥基-3-{N' _[3_ 甲基 _5_ 氧代 (5，6，7，8_ 四氫萘 _2_ 基)_1， 5- 二氫吡唑-4-亞基]-胼基}-苯基)-呋喃-2-羧酸
冰浴下將5- (3-氨基-2-羥基苯基)-呋喃-2-羧酸氫溴酸鹽4g (292mg, 0. 98mmol) 溶解于3. 3mL IN鹽酸中，滴加入1. 3mL亞硝酸鈉溶液(74mg, 1. 07mmol)，攪拌20分鐘，再加 Λ 5-甲基-2- (5，6，7，8-四氫萘-2-基)_2，4- 二氫吡唑 _3_ 酮 7c (200mg, 0. 88mmol)，分批 加入飽和碳酸氫鈉溶液(1. 226g，14. 6mmol)調(diào)節(jié)pH = 8 9，用2mL乙醇淬滅氣泡，升至室 溫反應(yīng)過(guò)夜。TLC跟蹤至原料消失，過(guò)濾出固體，用20mL水溶解，攪拌均勻，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH =3 4，過(guò)濾，干燥，粗品用HPLC分離純化，得到標(biāo)題產(chǎn)物(Z)-5-(2-羥基-3-{N' -[3-甲 基-5-氧代-1- (5，6，7，8-四氫萘-2-基)-1，5- 二氫吡唑_4_亞基]-胼基}-苯基)-呋 喃-2-羧酸7d(160mg，紅色固體)。產(chǎn)率39. 8%0MS m/z (ESI) :457[M_1]1HNMR (400MHz, DMS0_d6) δ 7. 71 (d, J = 8. 4Hz，1H)，7· 63 (m，2H)，7· 56 (d，J = 7. 6Hz, 1H) ,7. 37 (d, J = 3. 2Hz，1H)，7. 22 (t，J = 8. 0Hz，1H)，7. 13 (m，2H)，2. 75 (m，4H)， 2. 33(s，3H)，1. 76 (m, 4H)第四步(Z)-5-(2-羥基-3-{N' _[3_ 甲基 _5_ 氧代 (5，6，7，8_ 四氫-萘 _2_ 基)_1， 5- 二氫吡唑-4-亞基]-胼基}-苯基)-呋喃-2-羧酸二乙醇胺鹽將(Z)-5-(2-羥基-3-{N'_[3_ 甲基 _5_ 氧代 (5，6，7，8_ 四氫萘 _2_ 基)_1， 5- 二氫吡唑-4-亞基]-胼基}-苯基)-呋喃-2-羧酸7d (2. 8g，6. 31mmol)溶于40mL四 氫呋喃中，呈暗紅色懸濁液，攪拌下加入乙醇胺(769mg，12. 61mmol)，呈紫紅色溶液，室溫 下攪拌2小時(shí)，有大量固體析出。在反應(yīng)液中加入20mL四氫呋喃，過(guò)濾，濾餅用四氫呋喃 洗滌(lmLX3)，得到的固體在真空下干燥，得到標(biāo)題產(chǎn)物(Z)-5-(2-羥基-3-{N' -[3-甲 基-5-氧代-1- (5，6，7，8-四氫萘-2-基)-1，5- 二氫吡唑_4_亞基]-胼基}-苯基)-呋 喃2-羧酸二乙醇胺鹽7 (1. 97g，暗紅色固體)，產(chǎn)率55. 2%。HPLC 99. 33%MS m/z (ESI) :457[M_1]1HNMR (400MHz，CD3OD) δ 7. 56 (d, J = 7. 6Hz，1H)，7. 49 (m, 3H)，6. 99 (m, 1H)， 6. 96 (d, J = 3.2Hz，lH)，6.91(d，J = 3. 2Hz, 1H) ,6. 75 (m, 1H), 3. 62 (t, J = 5. 2Hz，4H)， 2. 87 (t, J = 5. 2Hz，4H)，2· 70(t，4H)，2· 28(s，3H)，1. 74 (m, 4H)實(shí)施例8(Z)-5-(2-羥基-3-IN' _「3_ 甲基 _5_ 氧代 (5，6，7，8_ 四氫-萘 基)_1， 5- 二氫吡嗶-4-亞基]-肼基丨-苯基)-呋喃-2-羧酸二膽堿鹽 將(Z)-5-(2-羥基-3-{N' _[3_ 甲基 _5_ 氧代 (5，6，7，8_ 四氫萘 _2_ 基)_1，5- 二氫吡唑-4-亞基]-胼基}-苯基)-呋喃-2-羧酸7d (lOOmg，0. 22mmol)溶于5mL四氫 呋喃中，呈暗紅色懸濁液，攪拌下滴加45%氫氧化膽堿甲醇溶液(45mg，0. 44mmol)，呈紫紅 色溶液，室溫下攪拌1小時(shí)。反應(yīng)液中有固體析出，過(guò)濾，濾餅用四氫呋喃洗滌(ImLX 3)，得 到的固體在真空下干燥，得到標(biāo)題產(chǎn)物(Z)-5-(2-羥基-3-{N' -[3-甲基-5-氧代-1-(5， 6，7，8-四氫-萘-2-基)-1，5- 二氫吡唑-4-亞基]-胼基}-苯基)-呋喃-2-羧酸二膽堿 鹽8(140mg，暗紅色固體)，產(chǎn)率:96.6%0HPLC 98. 82%MS m/z (ESI) :457. 8[M_1]1HNMR(400MHz，CD3OD) δ 7. 74(d, J = 7. 6Hz，1H)，7. 60 (m, 3H)，7. 08 (m, 3H)， 6. 91 (t, J = 8. 0Ηζ，1Η)，3· 96(m，4H)，3. 45 (t, J = 4. 8Ηζ，4Η)，3· 18 (s, 18H) ,2. 80(t，4H)， 2. 38(s，3H)，1. 84(m，4H)實(shí)施例9(Z)-5-(2-羥基-3-{N' _「3_ 甲基 _5_ 氧代 (5,6, 7,8_ 四氫-萘 基)_1, 5- 二氫吡啤-4-亞某1-肼某丨-苯某)-呋喃-2-羧酸二( 二乙胺)鹽將(Z)-5-(2-羥基-3-{N'_[3_ 甲基 _5_ 氧代 (5，6，7，8_ 四氫萘 _2_ 基)_1， 5- 二氫吡唑-4-亞基]-胼基}-苯基)-呋喃-2-羧酸7d(100mg, 0. 22mmol)溶于5mL四 氫呋喃中，呈暗紅色懸濁液，攪拌下滴加二乙胺(32mg，0. 44mmol)，呈紫紅色溶液，室溫下 攪拌過(guò)夜。反應(yīng)液中有固體析出，過(guò)濾，濾餅用四氫呋喃洗滌(lmLX3)，得到的固體在真 空下干燥，得到標(biāo)題產(chǎn)物(Z)-5-(2-羥基-3-{N' -[3-甲基-5-氧代-l-(5，6，7，8-四 氫-萘-2-基)-1，5- 二氫吡唑-4-亞基]-胼基}-苯基)-呋喃-2-羧酸二(二乙胺)鹽 9(77mg，暗紅色固體)，產(chǎn)率58. 3%0HPLC -.99.12%MS m/z (ESI) :457. 9[M_1]1HNMR (400MHz，CD3OD) δ 7. 59 (m, 4H)，7· 08 (d，J = 8. OHz，1Η)，7· 04 (d，J = 3· 2Hz， 1H)，6· 94(d, J = 3. 6Hz, 1Η)，6· 82(t, J = 8. OHz, 1Η)，2. 99(q, J = 7. 2Ηζ，8Η)，2· 79(m，4H)， 2. 36(s，3H)，1. 82 (t, J = 3. 2Hz，4H)，1. 27 (t, J = 7. 2Hz, 12H)實(shí)施例10(Z)-5-(2-羥基-3-{N' _「3_ 甲基 _5_ 氧代 (5,6, 7,8_ 四氫-萘 基)_1， 5- 二氫吡啤-4-亞某1-肼某丨-苯某)-呋喃-2-羧酸二葡甲胺鹽 將(Z)-5-(2-羥基-3-{N'_[3_ 甲基 _5_ 氧代 (5，6，7，8_ 四氫萘 _2_ 基)_1， 5- 二氫吡唑-4-亞基]-胼基}-苯基)-呋喃-2-羧酸7d(100mg, 0. 22mmol)溶于5mL四 氫呋喃中，呈暗紅色懸濁液，攪拌下加入葡甲胺(85mg，0.44mmol)，室溫下攪拌過(guò)夜。在溶 液中加入4mL甲醇，減壓下濃縮，得到標(biāo)題產(chǎn)物(Z)-5-(2-羥基-3-{N' -[3-甲基_5_氧 代-1-(5，6，7，8-四氫-萘-2-基)-1，5-二氫吡唑-4-亞基]-胼基}-苯基)-呋喃-2-羧 酸二 N-甲基葡萄糖胺鹽10(168mg，暗紅色固體)，產(chǎn)率90.8%。HPLC 97. 65%MS m/z (ESI) :457. 8[M_1]1HNMR (400MHz, CD3OD) δ 7. 56(m,4H) ,7. 06(m,2H) ,6. 98 (d, J = 3·2Ηζ，1Η)， 6. 75 (t, J = 7.6Hz，lH)，4.08(m，2H)，3.81(m，2H)，3.77(m，2H)，3.63(m，6H)，3. ll(m，4H)， 2. 76(m，4H)，2· 64(s，6H)，2· 33(s，3H)，1. 82 (t, J = 3. 2Hz，4H)，1. 79 (m, 4H)實(shí)施例11(Z)-5-(2-羥基-3-IN' _「3_ 甲基 _5_ 氧代 (5，6，7，8_ 四氫-萘 基)_1， 5~ 二氫吡嗶-4-亞基]-肼基丨-苯基)-呋喃-2-羧酸二哌嗪鹽 將(Z)-5-(2-羥基-3-{N'_[3_ 甲基 _5_ 氧代 (5，6，7，8_ 四氫萘 _2_ 基)_1， 5- 二氫吡唑-4-亞基]-胼基}-苯基)-呋喃-2-羧酸7d(100mg, 0. 22mmol)溶于5mL四 氫呋喃中，呈暗紅色懸濁液，攪拌下加入哌嗪(37mg，0.44mmol)，呈紫紅色溶液，室溫下攪 拌2小時(shí)。反應(yīng)液中有固體析出，過(guò)濾，濾餅用四氫呋喃洗滌(lmLX3)，得到的固體在真 空下干燥，得到標(biāo)題產(chǎn)物(Z)-5-(2-羥基-3-{N' -[3-甲基-5-氧代-l-(5，6，7，8-四 氫-萘-2-基)-1，5_二氫吡唑-4-亞基]-胼基}-苯基)-呋喃-2-羧酸二哌嗪鹽ll(120mg， 暗紅色固體)，產(chǎn)率87. 6%。HPLC 98. 77%MS m/z (ESI) :457. 8[M_1] 1HNMR (400MHz，CD3OD) δ 7. 59 (m, 4H)，7· 08 (d，J = 8. 8Hz，1H)，7· 04 (d，J = 3. 6Hz，
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1H) ,6. 87 (d, J = 3. 2Hz, 1H)，6· 82 (t, J = 8. OHz, 1Η)，3. 00(s，8H)，2· 78(m，4H)，2· 36 (s, 3H)，1.81(m，4H)實(shí)施例12(Z)-5-(2-羥基-3-{N' _[3_ 甲基 _5_ 氧代 (5，6，7，8_ 四氫-萘 _2_ 基)_1， 5- 二氫吡唑-4-亞基]-胼基}-苯基)-呋喃-2-羧酸二氨基丁三醇鹽 將(Z)-5-(2-羥基-3-{N'_[3_ 甲基 _5_ 氧代 (5，6，7，8_ 四氫萘 _2_ 基)_1， 5- 二氫吡唑-4-亞基]-胼基}-苯基)-呋喃-2-羧酸7d(100mg, 0. 22mmol)溶于5mL四 氫呋喃中，呈暗紅色懸濁液，攪拌下加入氨基丁三醇(53mg，0. 44mmol)，呈褐色溶液，室溫 下攪拌過(guò)夜。反應(yīng)液中有固體析出，過(guò)濾，濾餅用四氫呋喃洗滌(lmLX3)，得到的固體在 真空下干燥，得到標(biāo)題產(chǎn)物(Z)-5-(2-羥基-3-{N' -[3-甲基-5-氧代-l-(5，6，7，8-四 氫-萘-2-基)-1，5- 二氫吡唑-4-亞基]-胼基}-苯基)-呋喃-2-羧酸二氨基丁三醇鹽 12(142mg，黑色固體)，產(chǎn)率:92.8%0HPLC 94. 0%MS m/z (ESI) :457·8[Μ_1]1HNMR (400MHz，CD3OD) δ 7. 58 (m，4Η)，7. 05 (m, 2H) ,6. 96 (d, J = 3. 6Hz，1H)， 6. 90 (t, J = 8. 0Hz, 1H)，3· 65 (s, 12H)，2· 76(m，4H)，2· 33(s，3H)，1. 80 (m, 4H)實(shí)施例13(Z)-5-(2-羥基-3-{N' -Γ3-甲基 _5_ 氧代 (5,6, 7,8_ 四氫-萘 基)_1， 5- 二氫吡啤-4-亞某1-肼某丨-苯某)-呋喃-2-羧酸二( 二芐某乙二胺)鹽將(Z)-5-(2-羥基-3-{N' _[3_ 甲基 _5_ 氧代 (5，6，7，8_ 四氫萘 _2_ 基)_1， 5- 二氫吡唑-4-亞基]-胼基}-苯基)-呋喃-2-羧酸7d (lOOmg，0. 22mmol)溶于5mL四 氫呋喃中，呈暗紅色懸濁液，攪拌下加入二芐基乙二胺(104mg，0. 44mmol)，呈褐色溶液， 室溫下攪拌2小時(shí)。在溶液中加入4mL甲醇，減壓下濃縮，得到標(biāo)題產(chǎn)物(Z)-5-(2-羥基-3-{N' -[3-甲基-5-氧代-l-(5，6，7，8-四氫-萘-2-基)-l，5-二氫吡唑-4-亞基]-胼 基}-苯基)-呋喃-2-羧酸二( 二芐基乙二胺)鹽13 (167mg,黑色固體)，產(chǎn)率81. 8%。HPLC 96. 81%MS m/z (ESI) :457. 8[M_1]1HNMR (400MHz，CD3OD) : δ 7. 52 (m，3H)，7. 39 (m，1H)，7. 02 (m，20H)，7. 01 (m，2H)， 6. 72 (m, 1H) ,6. 67 (t, J = 8. OHz, 1Η)，3. 89 (s,8H)，3· 01 (s，8H)，2. 73 (m, 4H)，2. 32 (s, 3H)， 1. 78(m，4H)實(shí)施例14(Z)-5-(2-羥基-3-{N' _「3_ 甲基 _5_ 氧代 (5,6, 7,8_ 四氫-萘 基)_1， 5- 二氫吡卩半-4-亞某1 -肼某丨-苯某)-nm -2-羧酸#1 將(Z)-5-(2-羥基-3-{N'_[3_ 甲基 _5_ 氧代 (5，6，7，8_ 四氫萘 _2_ 基)_1， 5- 二氫吡唑-4-亞基]-胼基}-苯基)-呋喃-2-羧酸7d(110mg, 0. 24mmol)溶于4mL四氫 呋喃中，呈暗紅色懸濁液，攪拌下滴加IN的氫氧化鈉溶液(0. 4mL, 0. 44mmol)，室溫下攪拌2 小時(shí)。過(guò)濾反應(yīng)液，濾液中加入4mL甲醇，減壓下濃縮反應(yīng)液，得到的固體用正己烷洗滌，得 到標(biāo)題產(chǎn)物(Z) -5- (2-羥基-3- {N ‘ - [3-甲基-5-氧代-1- (5，6，7，8-四氫-萘-2-基)-1， 5-二氫吡唑-4-亞基]-胼基}-苯基)-呋喃-2-羧酸鈉14(115mg，黑色固體)，產(chǎn)率 81. 8%。HPLC 96. 81%MS m/z (ESI) :457. 8[M_1]1HNMR (400MHz, CD3OD) δ 7. 79 (dd, Jl = 7. 6Hz, J2 = 1. 2Hz, 1Η)，7. 52 (m, 3Η)， 7. 18 (d, J = 3. 6Hz, 1Η)，7. 05 (m, 2Η)，6. 70 (m, 1Η)，2. 78 (m, 4H)，2. 41 (s, 3H)，1. 82 (m, 4H)實(shí)施例15(Z)-5-(2-羥基-3-{N' _「3_ 甲基 _5_ 氧代 (5,6, 7,8_ 四氫-萘 基)_1， 5- 二氡』吡卩半-4-亞某1 -肼某丨-苯某)--2-羧酸(L-精氡避)鹽 將(Z)-5-(2-羥基-3-{N'_[3_ 甲基 _5_ 氧代 (5，6，7，8_ 四氫萘 _2_ 基)_1， 5- 二氫吡唑-4-亞基]-胼基}-苯基)-呋喃-2-羧酸7d (lOOmg，0. 22mmol)溶于5mL 1四 氫呋喃中，呈暗紅色懸濁液，攪拌下加入L-精氨酸(76mg，0. 44mmol)和2mL水，室溫下攪拌 2小時(shí)。反應(yīng)液在減壓下濃縮，加入5mL乙酸乙酯，有固體析出，過(guò)濾，濾餅在真空下干燥，得 到標(biāo)題產(chǎn)物(Z) -5- (2-羥基-3- {N ‘ - [3-甲基-5-氧代-1- (5，6，7，8-四氫-萘-2-基)-1， 5- 二氫吡唑-4-亞基]-胼基}-苯基)-呋喃-2-羧酸(L-精氨酸)鹽15 (168mg,黑色固 體)，產(chǎn)率95. 5%。HPLC 97. 45%MS m/z (ESI) :457. 9[M_1]1HNMR (400MHz，CD3OD) : δ 7. 59 (m，4H)，7. 06 (m, 2H) ,6. 98 (d, J = 3. 6Hz，1H)， 6. 92 (t, J = 8. OHz, 1Η)，3· 57 (t, J = 6. 4Ηζ，2Η)，3· 19(m，4H)，2· 78(m，4H)，2· 36(s，3H)， 1. 83 (m, 8Η)，1. 73(m，4H)實(shí)施例16 (Z)-5-{2-羥基-3-「N‘ ~(1~茚滿~5~基甲基氧代-1,5-二氫吡唑亞 某)-肼某ι - as某丨--2-羧酸二乙醇胺鹽第一步(Z) -5- {2-羥基-3-[N' - (1_ 茚滿 _5_基 _3_ 甲基 _5_氧代 _1，5_ 二氫吡唑 _4_ 亞 基)-胼基]-苯基}-呋喃-2-羧酸冰浴下將5- (3-氨基-2-羥基苯基)-呋喃-2-羧酸氫溴酸鹽4g (300mg, 1. Ommol) 溶解于鹽酸(3. 4mL, lmol/L)中，滴加入1. 2mL亞硝酸鈉溶液(73mg, 1. 05mmol)，反應(yīng)10分 鐘，再加入2-茚滿-5-基-5-甲基-2,4- 二氫吡唑-3-酮Ii (193mg，0. 9mmol)，分批加入 碳酸氫鈉(1. 26g，15mmol)和4. 4mL乙醇，室溫反應(yīng)24小時(shí)。TLC跟蹤至原料消失，過(guò)濾， 固體用20mL水溶解，冰浴下用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH < 5，過(guò)濾，干燥，得到標(biāo)題產(chǎn)物(Z)-5-{2-羥 基-3-[N' -(1-茚滿-5-基-3-甲基-5-氧代-1，5-二氫吡唑-4-亞基)-胼基]-苯 基}-呋喃-2-羧酸16a(287mg,黃色固體)。產(chǎn)率71. 8%。MS m/z (ESI) :443[M_1]
1HNMR (400MHz, DMS0_d6) δ 13. 73 (br, 1H), 9. 97 (br, 1H), 7. 78 (br, 1Η), 7. 70 (m, 2Η)，7· 57 (m, 1Η)，7. 36(d, J = 3. 6Hz, 1Η)，7. 29(d, J = 8. OHz, 1Η)，7. 22(t, J = 8. OHz, 1Η)， 7. 15 (m, 1Η)，2. 89 (m, 4Η)，2. 32 (s, 3Η)，2. 03 (m, 2H)第二步(Z) -5- {2-羥基-3-[N' - (1_ 茚滿 _5_基 _3_ 甲基 _5_氧代 _1，5_ 二氫吡唑 _4_ 亞 基)-胼基]-苯基}-呋喃-2-羧酸二乙醇胺鹽將(Z)-5- {2-羥基-3- [N ‘ _ (1_ 茚滿 _5_ 基-3-甲基 _5_ 氧代 ，5_ 二氫吡 唑-4-亞基)-胼基]-苯基}-呋喃-2-羧酸16a(1.825g，4. llmmol)溶解于20mL四氫 呋喃中，攪拌下加入乙醇胺(501mg，8.22mmol)，反應(yīng)液在室溫?cái)嚢?小時(shí)。過(guò)濾，濾餅 用四氫呋喃洗滌(lmLX3)，真空下干燥，得到標(biāo)題產(chǎn)物(Z)-5-{2-羥基-3-[N' -(1-茚 滿-5-基-3-甲基-5-氧代-1，5- 二氫吡唑-4-亞基)-胼基]-苯基}-呋喃-2-羧酸二 乙醇胺鹽16(1.615g，暗紅色固體)。產(chǎn)率69.4%。MS m/z (ESI) :443[M_1]1HNMR(400MHz, CD3OD) δ 7. 67 (s, 1H), 7. 53 (m, 3Η), 7. 21 (d, J = 8·0Ηζ，1Η)， 7. 02 (m, 1Η)，6. 97 (d, J = 3. 2Hz, 1Η)，6. 70 (m, 1Η)，3. 70 (m, 4Η)，2. 92 (m, 4Η)，2. 88 (m, 4H)， 2. 35(s，3H)，2. 08 (m, 2H)實(shí)施例17(Z)-5-{2-羥基-3-「N‘ ~(1~茚滿~5~基甲基氧代-1,5-二氫吡唑亞 某)-肼某1-苯某丨-呋喃-2-羧酸二(二乙胺)鹽將5-{2-羥基-3-[N' _(1_茚滿_5_基_3_甲基_5_氧代_1，5_ 二氫吡唑_4_亞 基)-胼基]-苯基} _呋喃-2-羧酸16a (150mg，0. 38mmol)溶于5mL四氫呋喃中，呈暗紅色 懸濁液，攪拌下滴加二乙胺(49mg，0. 67mmol)，呈紫紅色溶液，室溫下反應(yīng)2小時(shí)。反應(yīng)液 中有固體析出，過(guò)濾，濾餅用四氫呋喃洗滌(lmLX3)，得到的固體在真空下干燥，得到標(biāo)題 產(chǎn)物(Z)-5-{2-羥基-3-[N' -(1-茚滿-5-基-3-甲基-5-氧代-1，5-二氫吡唑-4-亞 基)-胼基]-苯基}-呋喃-2-羧酸二(二乙胺)鹽17 (163mg,暗紅色固體)，產(chǎn)率81. 9%。HPLC 99. 18%MS m/z (ESI) :442. 7[M_1]1HNMR (400MHz, CD3OD) δ 7. 714 (s, 1Η), 7. 604(m,3H) ,7. 241 (d, J = 8Ηζ，1Η)， 7. 04 (d, J = 8Hz, 1Η)，6. 95 (d, J = 8. OHz, 1Η)，6. 818 (m，1Η)，3. 725 (m，2Η)，2. 95 (m, 8Η)， 2. 371 (s，3Η)，2. 128 (m, 2H)，1. 87 (m, 2H)，1. 283 (m, 12H)實(shí)施例18
30
(Z)-5-{2-羥基-3-「N‘ ~(1~茚滿~5~基甲基氧代-1,5-二氫吡唑亞
某)-肼某1-苯某丨-呋_ -2-羧酸二
將(Z)-5- {2-羥基-3- [N ‘ _ (1_ 茚滿 _5_ 基-3-甲基 _5_ 氧代 ，5_ 二氫批 唑-4-亞基)-胼基]-苯基}-呋喃-2-羧酸16a (150mg，0. 38mmol)溶于5mL四氫呋喃中，呈 暗紅色懸濁液，攪拌下加入哌嗪(58mg，0. 68mmol)，呈紫紅色溶液，室溫下攪拌3小時(shí)。反應(yīng) 液中有固體析出，過(guò)濾，濾餅用四氫呋喃洗滌(lmLX3)，得到的固體在真空下干燥，得到標(biāo) 題產(chǎn)物(Z)-5-{2-羥基-3-[N' - (1-茚滿-5-基-3-甲基-5-氧代-1，5-二氫吡唑-4-亞 基)_胼基]-苯基} _呋喃-2-羧酸二哌嗪鹽18 (185mg,暗紅色固體)，產(chǎn)率88. 9%。HPLC 96. 52%MS m/z (ESI) :443. 2[M_1]1HNMR (400MHz, CD3OD) : δ 7· 727 (s，1H)，7· 617 (m，2H)，7· 545 (d，J = 8·4Ηζ，1Η)， 7. 231 (d，J = 8. 4Ηζ，1Η)，7. 05 (d, J = 8. 8Hz，lH)，6. 787 (m，2H)，3. 081 (m，12H)，2. 923 (m， 4H), 2. 366(s，3H)，2. 14(m，4H)實(shí)施例19(Z)-4-{2-羥基-3-「N‘ ~(1~茚滿~5~基甲基氧代-1,5-二氫吡唑亞某)-肼某1-苯丨－噻吩-2-羧酸二乙醇胺鹽 第一步4-(3-硝基-2-甲氧基-苯基)-噻吩-2-羧酸將2-(2_甲氧基-3-硝基苯基)-4，4，5，5_四甲基-[1，3，2]硼酸乙二醇酯 4d(0.81g，2.9mmol)、4-溴-噻吩-2-羧酸(0. 3g，1. 45mmol)、四(三苯基膦)鈀(80mg， 0. 073mmol)和碳酸鈉(0. 31g,2. 9mmol)溶解于20mL 1，4-二氧六環(huán)和IOmL水的混合溶劑 中，加熱回流0.5小時(shí)。TLC跟蹤至原料消失，反應(yīng)液用IN鹽酸酸化至pH = 3，乙酸乙酯萃取 (20mLX3)，合并有機(jī)相，有機(jī)相減壓濃縮后柱層析得到4- (3-硝基-2-甲氧基-苯基)-噻 吩-2-羧酸19a (0. 54g，棕色油狀液體)，直接進(jìn)行下一步反應(yīng)。MS m/z (ESI) :277. 6[M_1]第二步4-(3-氨基-2-甲氧基-苯基)_噻吩-2-羧酸將4-(3-硝基-2-甲氧基-苯基)-噻吩-2_羧酸19￡1(4001^，1.4511111101)溶解于 30mL乙酸乙酯中，再加入IOOmg鈀-碳(10% )和甲酸銨(360mg，5. Smmol)，加熱回流3小 時(shí)。TLC跟蹤至原料消失，反應(yīng)液過(guò)濾除去鈀/碳，減壓濃縮得到4-(3_氨基-2-甲氧基-苯 基)-噻吩-2-羧酸19b (410mg,棕色油狀液體)，直接進(jìn)行下一步反應(yīng)。MS m/z (ESI) :247. 8[M_1]第三步4- (3-氨基-2-羥基苯基)-噻吩-2-羧酸氫溴酸鹽將4-(3-氨基-2-甲氧基-苯基)-噻吩-2_羧酸1913(3601^，1.45讓01)溶解于 5mL 二氯甲烷中，滴加入三溴化硼(2. 8mL, 5. 6mmol)，室溫反應(yīng)4. 5小時(shí)。TLC跟蹤至原料消 失，加入5mL甲醇，減壓濃縮，向殘余物中加入IOmL乙酸乙酯，攪拌0. 5小時(shí)，過(guò)濾，收集固 體，干燥，得到4- (3-氨基-2-羥基苯基)-噻吩-2-羧酸氫溴酸鹽19c (80mg,灰色固體)。 產(chǎn)率17. 5%。MS m/z (ESI) 236. 1[M+1]第四步(Z) -4- {2-羥基-3-[N' - (1_ 茚滿 _5_基 _3_ 甲基 _5_氧代 _1，5_ 二氫吡唑 _4_ 亞 基)-胼基]-苯}-噻吩-2-羧酸冰浴下將4- (3-氨基-2-羥基苯基)-噻吩-2-羧酸氫溴酸鹽19c (120mg, 0. 38mmol)溶解于2. 7mL IN鹽酸中，滴加入0. 45mL亞硝酸鈉溶液(29mg, 0. 42mmol)，反應(yīng) 20分鐘，再加入2-茚滿-5-基-5-甲基-2,4- 二氫吡唑-3-酮Ii (73mg, 0. 34mmol)，用飽和碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)PH至8，加入2mL乙醇，室溫反應(yīng)過(guò)夜。TLC跟蹤至原料消失，過(guò)濾，固 體加入到20mL水中，再用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH = 3 4，過(guò)濾，固體中加入5mL乙酸乙酯攪拌1小 時(shí)，過(guò)濾，所得固體干燥后得到標(biāo)題產(chǎn)物(Z)-4-{2-羥基-3-[N' -(1-茚滿-5-基-3-甲 基-5-氧代-1，5- 二氫吡唑-4-亞基)-胼基]-苯}-噻吩-2-羧酸19d (45mg,黃色固體)。 產(chǎn)率28. 7%。MS m/z (ESI) :458. 8[M_1]1HNMR (400MHz, DMS0_d6) : δ 2. 05 (m，2H)，2. 32 (s，3H)，2. 87 (m，4H)，7. 13 (t，J = 8. 0Hz, 1H) ,7. 32(m,2H) ,7. 67(m,2H) ,7. 78 (s, 1H) ,8. 05 (d, J = 1. 6Hz，1H)，8. 13 (d，J =
1.2Hz, 1H) ,9. 68 (s，1H)，13. 79 (s, 1H)第五步(Z) -4- {2-羥基-3- [N' - (1_ 茚滿 _5_ 基 _3_ 甲基 _5_ 氧代 _1，5_ 二氫吡唑 _4_ 亞 基)-胼基]-苯}-噻吩-2-羧酸二乙醇胺鹽將(Z)-4- {2-羥基-3- [N ‘ _ (1_ 茚滿 _5_ 基-3-甲基 _5_ 氧代 ，5_ 二氫吡 唑-4-亞基)-胼基]-苯}-噻吩-2-羧酸19d (1. 3g，2. 83mmol)溶于40mL四氫呋喃中，呈 暗紅色懸濁液，攪拌下加入乙醇胺(344mg，5. 65mmol)，呈紫紅色溶液，室溫下攪拌2小時(shí)， 有大量固體析出。過(guò)濾反應(yīng)液，濾餅用四氫呋喃洗滌(ImLX 3)，得到的固體在真空下干燥， 得到標(biāo)題產(chǎn)物(Z)-4-{2-羥基-3-[N' -(1-茚滿-5-基-3-甲基-5-氧代-1，5-二氫吡 唑-4-亞基)-胼基]-苯}-噻吩-2-羧酸二乙醇胺鹽19 (1. 513g，暗紅色固體)。產(chǎn)率 92. 0%。HPLC 98. 65%MS m/z (ESI) :458. 7[M_1]1HNMR (400MHz, CD3OD) δ 7. 94 (s，1H)，7· 88 (s，1Η)，7· 68 (s, 1Η)，7· 55(m，2H)， 7. 29 (d, 1H)，7· 22 (d, 1H)，6· 83(t，3H)，3· 67(t，4H)，2· 93(m，4H)，2· 91(t，4H)，2· 28(s，3H)，
2.10 (m, 2H)實(shí)施例20(Z) -4- {2-羥基-3-「N‘ _ (1 _ 茚滿 基 甲基 氧代-1，5_ 二氫吡嗶 亞 基)-肼基]-苯丨-噻吩-2-羧酸二(二乙胺)鹽將(Z) -4- {2-羥基-3- [N ‘ _ (1_ 茚滿 _5_ 基-3-甲基 _5_ 氧代 ，5_ 二氫吡 唑-4-亞基)-胼基]-苯}-噻吩-2-羧酸19d (150mg，0. 33mmol)溶于5mL四氫呋喃中，呈暗 紅色懸濁液，攪拌下滴加二乙胺(49mg，0. 66mmol)，呈紫紅色溶液，室溫下反應(yīng)2小時(shí)。反應(yīng) 液中有固體析出，過(guò)濾，濾餅用四氫呋喃洗滌(lmLX3)，得到的固體在真空下干燥，得到標(biāo) 將(Z)-4- {2-羥基-3- [N ‘ _ (1_ 茚滿 _5_ 基-3-甲基 _5_ 氧代 ，5_ 二氫 口比 唑-4-亞基)-胼基]-苯}-噻吩-2-羧酸19d (150mg，0. 33mmol)溶于5mL四氫呋喃中，呈 暗紅色懸濁液，攪拌下加入哌嗪(56mg，0. 65mmol)，呈紫紅色溶液，室溫下攪拌2小時(shí)。反應(yīng) 液中有固體析出，過(guò)濾，濾餅用四氫呋喃洗滌(lmLX3)，得到的固體在真空下干燥，得到標(biāo) 題產(chǎn)物(Z)-4-{2-羥基-3-[N' - (1-茚滿-5-基-3-甲基-5-氧代-1，5-二氫吡唑-4-亞 基)_胼基]-苯} _噻吩-2-羧酸哌嗪鹽21 (195mg,暗紅色固體)。產(chǎn)率94. 7%。HPLC 98. 17%MS m/z (ESI) :458. 8[M_1]1HNMR (400MHz, CD3OD) δ 7. 85 (s，1H)，7· 75 (s，1Η)，7· 71 (s, 1Η)，7· 62 (m, 2Η)， 7· 26 (m，2Η)，6· 95 (t，1Η)，2· 96 (m，8Η)，2· 91 (m，4Η)，2· 37 (s，3Η)，2· 11 (m，2Η)實(shí)施例22(Z)-4-(2-羥基-3-{Ν ‘ _「3_ 甲基 _5_ 氧代-1-(5,6,7,8_ 四氫-萘亞甲 基-2-基)-1, 5- 二氫-吡唑-4-亞基1 -肼基丨-苯基)-呋喃-3-羧酸二乙醇胺鹽
題產(chǎn)物(Z)-4-{2-羥基-3-[N' - (1-茚滿-5-基-3-甲基-5-氧代-1，5-二氫吡唑-4-亞 基)-胼基]-苯}-噻吩-2-羧酸二(二乙胺)鹽20(157mg，暗紅色固體)。產(chǎn)率79.3%。HPLC 98. 98%MS m/z (ESI) :458. 8[M_1]1HNMR (400MHz, CD3OD) δ 7. 81 (s, 1H)，7· 73 (s，1H)，7· 68(m，2H)，7· 62 (d，1H)， 7. 24 (m, 2H)，7. 06 (t, 1H)，3. 03 (q, 8H)，2. 93 (m, 4H) ,2. 371 (s,3H)，2. 13 (m, 2H)，1. 29 (t, 12H)實(shí)施例21(Z)-4-{2-羥基-3-「N‘ ~(1~茚滿~5~基甲基氧代-1,5-二氫吡唑亞
卩扉分-2-羧酸哌卩泰鹽 第一步4-溴-呋喃-2-羧酸室溫下，將4，5-二溴-呋喃-2-羧酸22a (5. 5g，20. 3mmol)和18mL氨水加入到 63mL水中，加入鋅粉(1.46g，22. 33mmol)，加畢室溫?cái)嚢?小時(shí)，TLC監(jiān)測(cè)至原料反應(yīng)完 全，停止反應(yīng)。用鹽酸(IN)調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH至3，有大量固體析出，過(guò)濾，濾餅用正己烷洗 滌(15mLX4)后干燥，得到標(biāo)題產(chǎn)物4-溴-呋喃-2-羧酸22b (3. 2g，白色固體)，產(chǎn)率 83. 1%。MS m/z (ESI) :188. 7[M_1]第二步4- (3-硝基-2-甲氧基-苯基)-呋喃-2-羧酸將2-(2-甲氧基-3-硝基苯基)-4，4，5，5-四甲基-[1，3，2]硼酸乙二醇酯4d(4g， 14. 34匪ol)、4-溴-呋喃-2-羧酸 22b (2. 18g, 11. 47mmol)、四(三苯基膦)鈀(829mg， 0. 717mmol)和碳酸鉀(3. 96g，28. 68mmol)溶解于80mL 1，4-二氧六環(huán)和30mL水的混合溶 劑中，加熱回流2.5小時(shí)。TLC跟蹤至原料消失，反應(yīng)液用IN鹽酸酸化至pH 3，乙酸乙酯 萃取(SOmLX 3)，合并有機(jī)相，有機(jī)相減壓濃縮后柱層析得到標(biāo)題產(chǎn)物4-(3-硝基-2-甲氧 基-苯基)-呋喃-2-羧酸22c (3. 42g，棕色油狀液體)。產(chǎn)率90. 7 %。MS m/z (ESI) :261.8[M_1]第三步 4- (3-氨基-2-甲氧基-苯基)_呋喃-2-羧酸將4-(3_硝基-2-甲氧基-苯基)_呋喃-2-羧酸22C(500mg，1.9mmOl)溶解于 15mL乙酸乙酯中，再加入IOOmg鈀-碳和甲酸銨(429mg，7. 6mmol)，加熱回流3小時(shí)。TLC跟 蹤至原料消失，反應(yīng)液過(guò)濾除去鈀/碳，減壓濃縮得到標(biāo)題產(chǎn)物4- (3-氨基-2-甲氧基-苯 基)“呋喃-2-羧酸22d (325mg,黃色油狀液體)，產(chǎn)率73. 4% 0MS m/z (ESI) :231.8[M_1]第四步4- (3-氨基-2-羥基苯基)-呋喃-2-羧酸氫溴酸鹽將4-(3_氨基-2-甲氧基-苯基)-呋喃-2-羧酸22d(325mg，1.4mm0l)溶解于 5mL 二氯甲烷中，滴加入三溴化硼(2. 8mL, 5. 6mmol)，室溫反應(yīng)4. 5小時(shí)。TLC跟蹤至原料消 失，加入5mL甲醇，減壓濃縮，向殘余物中加入IOmL乙酸乙酯，攪拌0. 5小時(shí)，過(guò)濾，收集固 體，干燥，得到標(biāo)題產(chǎn)物4- (3-氨基-2-羥基苯基)-呋喃-2-羧酸氫溴酸鹽22e (174mg,灰
35色固體)。產(chǎn)率=57. 1%0MS m/z (ESI) :217·7[Μ_1]第五步(Z)-4-(2-羥基-3-{N ‘ _[3_ 甲基 _5_ 氧代 (5，6，7，8-四氫萘亞甲 基-2-基)-1，5- 二氫吡唑-4-亞基]-胼基}-苯基)-呋喃-2-羧酸冰浴下將4- (3-氨基-2-羥基苯基)-呋喃-2-羧酸氫溴酸22e (170mg, 0. 57mmol) 溶解于鹽酸(1. 9mL, lmol/L)中，滴加入0. 7mL亞硝酸鈉溶液(43mg，0. 63mmol)，反應(yīng)20 分鐘，再加入5-甲基-2-(5，6，7，8-四氫萘-2-基)-2，4-二氫吡唑-3-酮7c(116mg， 0. 51mmol)，用飽和碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)pH至8 9，加入2mL乙醇，室溫反應(yīng)24小時(shí)。TLC 跟蹤至原料消失，過(guò)濾，固體中加入15mL水，冰浴下用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH = 2 3，過(guò)濾，濾餅 用乙酸乙酯洗滌，干燥，得到標(biāo)題產(chǎn)物(Z)-4-(2-羥基-3-{N' -[3-甲基-5-氧代-1-(5， 6,7,8-四氫萘亞甲基-2-基)-1，5- 二氫吡唑-4-亞基]-胼基}-苯基)-呋喃-2-羧酸 22f(13mg，紅色固體)。產(chǎn)率5.5%。MS m/z (ESI) :456. 7[M_1]1HNMR(400MHz, DMS0_d6) δ 13. 73 (br, 1H)，9· 68 (br, 1H)，8· 43 (s, 1Η)，7· 78 (s, 1Η)，7· 62(m，2H)，7· 43(d，J = 7·6Ηζ，1Η)，7· 13 (m，2Η)，3. 86 (s，3Η)，2. 78 (m，4Η)，2. 31 (s， 3H)，1. 75(m，4H)第六步(Z)-4-(2-羥基-3-{N ‘ _[3_ 甲基 _5_ 氧代 (5，6，7，8-四氫-萘亞甲 基-2-基)-1，5- 二氫-吡唑-4-亞基]-胼基}-苯基)-呋喃-3-羧酸二乙醇胺鹽將(Z)-4-(2-羥基-3-{N'_[3_ 甲基 _5_ 氧代 (5，6，7，8_ 四氫-萘亞甲 基-2-基)-1，5- 二氫-吡唑-4-亞基]-胼基}-苯基)-呋喃-3-羧酸22f (1. 2g，2. 6mmol) 溶于20mL四氫呋喃中，呈暗紅色懸濁液，攪拌下加入乙醇胺(399mg，6. 5mmol)，呈紫紅色溶 液，室溫下攪拌6小時(shí)，有大量固體析出。過(guò)濾反應(yīng)液，濾餅用四氫呋喃洗滌(ImLX 3)，得到 的固體在真空下干燥，得到標(biāo)題產(chǎn)物(Z)-4-(2-羥基-3-{N' -[3-甲基-5-氧代-1-(5，6， 7，8-四氫-萘亞甲基-2-基)-1，5- 二氫-吡唑-4-亞基]-胼基}-苯基)-呋喃-3-羧酸 二乙醇胺鹽22(1.51g，紅色固體)。產(chǎn)率72.8%。HPLC 97. 16%MS m/z (ESI) :456·7[Μ_1]1HNMR(400MHz, CD3OD) δ 8. 31 (s, 1H), 7. 53 (s，1Η)，7· 38 (s，1H)，7. 33(dd，2H)， 7. 07 (d, 1H)，6. 78 (d, 1H)，3. 69 (m, 4H)，2. 99 (m, 4H)，2. 77 (t,4H)，2. 39 (s, 3H)，1. 82 (m, 4H)實(shí)施例23片劑組合物將乳糖、微晶纖維素、羥基乙酸淀粉鈉、硬脂酸鎂和實(shí)施例8化合物按照下表1的 比例摻合。然后將混合物壓制成片劑。表 1 實(shí)施例24可注射的腸胃給藥組合物可注射給藥的實(shí)施例7制劑的制備方法為，將5. Omg化合物于1. OmL生理鹽水中 攪拌。測(cè)試?yán)芙舛葴y(cè)試按照常規(guī)溶解度測(cè)定方法，測(cè)試實(shí)施例化合物和其鹽在三種不同的系統(tǒng)中測(cè)定其 溶解度水，0. 鹽酸及甲醇中，結(jié)果如下所示
結(jié)果顯示實(shí)施例lj、4h、7d、16a和19d化合物的鹽與其相比溶解度明顯增力卩，特別 是在水中和甲醇中的溶解度明顯改善，其中實(shí)施例7化合物，其在0. 鹽酸中也有較好的 溶解度。生物學(xué)評(píng)價(jià)測(cè)試?yán)?本發(fā)明的化合物對(duì)BAF3-TP0R細(xì)胞的增殖作用1.材料和方法a. RPMl Medium 1640，Powder，10*1L，含 HEPES (Gibco Catalog no. 23400021)b. FBS 胎牛血清(Gibco Catalog no. 10099-141)c. PENICILLIN STREPTOMYCIN SOL(Gibco Catalog no. 15140-122)d. Geneticin(G418)(Gibco Catalog no. 11811-098)e. recombinant mouse IL-3(chemicon Catalog no.IL015)f. Human Thrombopoietin R Mab(TPO)(R&D Catalog no. MAB1016)g. DMSO(AppliChem Catalog no. A3672)h. QuikChange Multi Site Directed Mutagenesis Kit, 10 Runs (StratageneST200515)i, Cell Counting Kit_8 (同仁化學(xué)研究所 Catalog no. CK04-13)j, Ba/F3 細(xì)胞(協(xié)和細(xì)胞庫(kù) Catalog no. 0095)k. EX-EGFP-M02(FulenGen Catalog no. EX-EGFP-M02 Control)1. EX-B0010-M02(FulenGen Catalog no. ΕΧ-Β0010-M02)2.操作步驟(1)質(zhì)粒構(gòu)建根據(jù) Entrez Gene ID :4325，Refseq :NM_005373 提供的 TPOR 基因 序列，對(duì)購(gòu)買的 EX-B0010-M02 質(zhì)粒(FulenGen)利用QuikChange Multi Site Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)試劑盒進(jìn)行2點(diǎn)突變。多點(diǎn)突變引物序列分別為g491a :5 ‘-gggaacttcagatcagctgggaggagccg-3‘ ,g491a_antisense 5' —cggctcctcccagctgatct gaagttccc-3‘ ；c965t :5' _caggaccatgctagctcccaaggcttcttct_3‘ , c965t_antisense 5 ‘ -agaagaagccttgggagctagcatggtcctg-3，。突變后質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5 α，經(jīng) Amp 篩 選出陽(yáng)性克隆，測(cè)序鑒定突變結(jié)果正確。(2) BAF3-TP0R細(xì)胞株構(gòu)建構(gòu)建穩(wěn)定高表達(dá)功能性TPO受體的BaF3細(xì)胞株。將經(jīng) 2點(diǎn)突變后的表達(dá)人TPO受體和篩選基因neomycin的EX-B0010-M02質(zhì)粒25 μ g轉(zhuǎn)染野生 型BaF3 細(xì)胞(1X107)，轉(zhuǎn)染所用儀器為 Electro Square Porator ECM830 (BTX Division of Genetronic，Inc.US)，轉(zhuǎn)染條件為250V，18ms。通過(guò) G418 (Gibco，US)篩選獲得 BAF3-TP0R 穩(wěn)定細(xì)胞株。BAF3-TP0R 在 RPMI1640 (Gibco，US)培養(yǎng)基，10 % FB (Gibco，US) S, 800ng/ml G418，5ng/mL，rmIL-3 (Chemicon, US)中培養(yǎng)。3.化合物篩選(1)離心清洗細(xì)胞取適量細(xì)胞懸液lOOOrpm，離心5分鐘，棄去上清，再用IOmL不 含IL3的細(xì)胞培養(yǎng)液將細(xì)胞重新懸起，IOOOrpm，離心5分鐘，棄去上清；(2)加入Iml不含IL3的細(xì)胞培養(yǎng)液將細(xì)胞吹打均勻，取適量細(xì)胞懸液稀釋后計(jì) 數(shù)；(3)根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果制備密度為100000個(gè)/mL的細(xì)胞懸液；(4)于96-well平板中每孔加入100 μ L細(xì)胞懸液，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，并設(shè)置空白對(duì)照 組⑶，陰性對(duì)照組(N)，TPO陽(yáng)性對(duì)照組⑵和待測(cè)化合物組⑶；(5)用DMSO將待測(cè)化合物粉末配成IOmM的儲(chǔ)存液，再用RPMl 1640稀釋成不同濃 it 30 μ Μ, 10 μ Μ, 3 μ Μ, 1 μ Μ, 0. 3 μ Μ, 0. 1 μ Μ, 0. 03 μ Μ, 0. 01 μ Μ, 0. 003 μ Μ，0· 001 μ M ;(6)每孔加入10 μ L相應(yīng)濃度的藥液，陽(yáng)性對(duì)照孔中加入1 μ LrhTPO (10 μ g/mL)；(7)置于5% C02，37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)；(8)每孔加入10 μ LCCK-8，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時(shí)；(9)利用 VICT0R3 (Perkin Elmer 1420-120)儀器在 450nm 檢測(cè) OD 值。4.結(jié)果分析計(jì)算 (1)增值率定義[(S-B) / (P-B) ]*100%S 樣品；B 空白對(duì)照；P 陽(yáng)性對(duì)照(2)通過(guò) Origin 7. 0 計(jì)算 EC5005.結(jié)果化合物TPO活性EC5tl值
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結(jié)果表明本發(fā)明的鹽與其游離酸相比，對(duì)于BAF3-TP0R細(xì)胞有較好的增殖作用， 排序?yàn)楸景l(fā)明的鹽>游離酸> Eltrombopag，且本發(fā)明的鹽與Eltrombopag的活性相比有 顯著增加，其中實(shí)施例8化合物，即實(shí)施例7d化合物的膽堿鹽活性最好。藥代動(dòng)力學(xué)測(cè)試測(cè)試?yán)?本發(fā)明的化合物藥代動(dòng)力學(xué)測(cè)試1、試驗(yàn)?zāi)康囊源笫鬄槭茉噭?dòng)物，應(yīng)用HPLC-UV法測(cè)定了大鼠分別灌胃給予實(shí)施例7d、7 15 后不同時(shí)刻血漿中的藥物濃度。研究本發(fā)明的化合物在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)行為，評(píng)價(jià) 其藥動(dòng)學(xué)特征。2、試驗(yàn)方案2. 1、試驗(yàn)藥品實(shí)施例7d、7 15化合物2. 2、試驗(yàn)動(dòng)物健康成年SD大鼠24只，雌雄各半，購(gòu)自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng) 物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK (滬)2003-0002。2. 3、儀器設(shè)備TSQ Quantum Ultra AM 三重四極桿質(zhì)譜儀，美國(guó) Thermo Finnigan 公司；Agilent 1200高效液相色譜系統(tǒng)，美國(guó)Agilent公司。2. 4、藥物配制稱取適量樣品加羧甲基纖維素鈉制成5mg/mL(以原形計(jì))混懸液，臨用時(shí)配 制。2. 5、給藥健康成年SD大鼠24只，雌雄各半，平均分成5組，禁食過(guò)夜后分別灌胃給藥，給藥 劑量均為50. 0mg/kg(以原形計(jì))，給藥體積10mL/kg。2. 6、樣品采集
SD大鼠24只，雌雄各半，禁食一夜后灌胃給藥，劑量為5mg/kg。于給藥前及給藥后 0. 5，1. 0,2. 0,3. 0,4. 0,5. 0,6. 0,8. 0，11. 0，14. 0,24. 0,36. 0,48. 0 小時(shí)由眼眶采血 0. 2mL, 置于肝素化試管中，3500rpm離心10分鐘分離血漿，于_20°C保存給藥后2h進(jìn)食。2. 7、分析方法取給藥后各時(shí)刻的大鼠血漿50yL，加入內(nèi)標(biāo)溶液50yL，甲醇水(80 20， ν/ν) 20 μ L，甲醇100 μ L，渦旋混合3min,離心IOmin (13500r/min)，取上清液40 μ L進(jìn)行 HPLC-UV 分析。2. 8、標(biāo)準(zhǔn)曲線制備取大鼠空白血漿50yL，分別加入標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，使血藥濃度為1.0，5.0，25.0， 50. 0，100. 0，250. 0，500. Ong/mL,加入內(nèi)標(biāo)溶液20 μ L，按“血漿樣品預(yù)處理”項(xiàng)下進(jìn)行操作。 以血藥濃度為橫坐標(biāo)，樣品與內(nèi)標(biāo)色譜峰面積比為縱坐標(biāo)，以加權(quán)最小二乘法(w = 1/x2) 進(jìn)行線性回歸，獲得典型標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。2. 9、藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)計(jì)算對(duì)受試化合物的藥代動(dòng)力學(xué)行為進(jìn)行房室模型擬合，并計(jì)算主要藥代動(dòng)力學(xué)參 數(shù)，其中Cmax、tmax采用實(shí)測(cè)值。3、藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)結(jié)果本發(fā)明的化合物的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)如下
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試驗(yàn)結(jié)果表明，大鼠分別灌胃給予上述化合物后，實(shí)施例7d化合物的鹽與其相 比，藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)和生物利用度明顯改善，其中實(shí)施例7、8、10、11和12化合物，即實(shí)施例 7d化合物的乙醇胺鹽、膽堿鹽、葡甲胺鹽、哌嗪鹽和氨基丁三醇鹽的藥代數(shù)據(jù)較好，有較好 的藥代動(dòng)力學(xué)曲線。
I W >0.95±0.42^ 36.1±17.980·6干 SS.8 Ι'Ρ^ζ'Ρζβ'οηνζ14.9±12.1￡0.8 干W66Ζ/1 干 S9"￡^mm(Swi) J/1D0.089±0.052^·8τ 7Γ8 IfrOS'OTOO'Iε Ο Τ9Ζ6 SHO 干 Ι6￡ t^z/o干妒6鏟00.877±1.46569Γ0 干I ]2.40±2.41S66O 干 8SZ/0IiJ軸畕躲11.2±2.611.0±8.13 I12.1±8.2310.5±1.18ζ · ^ ·ιι10.0±3.9013.3±5.128.05±2.017.20±2.138.92±2.04(砍/μII eYLriYLινζη· 肌干9 干 S9.612.9±6.3212.1±7.19丄0'9刊.￡1乙87干乙乙卞mmmm說(shuō)刊89I ν ιη'9\8T乙干S.8SΓ69干卯I90 閑 8￡UmLZ干8.邙132±1898 Π 干891wm^w(qui/3ri)xBiu361.8士18.7- 6 ^9 νοιτπζ干 rt^廠 $ε.ετοι·8VO CN OO 卜’干Γ￡乙SBdoqxnoJiiaOOοNCO寸
日Odvs
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綜上所述，本發(fā)明的鹽制備簡(jiǎn)單、收率高，其中乙醇胺鹽、膽堿鹽、二乙胺鹽和哌嗪 鹽，在工藝路線中有優(yōu)勢(shì)，可以直接析出晶體；本發(fā)明的鹽與其游離酸相比，在常規(guī)溶劑中 的溶解度明顯增加，特別是乙醇胺鹽在0. 鹽酸中的溶解度好，適用于常規(guī)制劑；本發(fā)明 的鹽生物活性明顯增加，動(dòng)物體內(nèi)療效低毒、作用時(shí)間長(zhǎng)、副作用小、易吸收，藥代動(dòng)力學(xué)性 質(zhì)明顯改善，有較好的藥代動(dòng)力學(xué)曲線，特別是乙醇胺鹽、膽堿鹽、哌嗪鹽、葡甲胺鹽和氨基 丁三醇鹽。
權(quán)利要求
通式(I)所示化合物的藥學(xué)上可接受的鹽其中Het選自苯基、呋喃基或噻吩基；R1、R2、R3和R4各自獨(dú)立地選自氫原子或烷基；n為0、1或2；所述的鹽為堿加成鹽。F2009100529461C0000011.tif
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鹽，其中所述的鹽選自鈉鹽、鋰鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽、精氨酸 鹽、賴氨酸鹽、甲胺鹽、二甲胺鹽、三甲胺鹽、乙胺鹽、二乙胺鹽、三乙胺鹽、乙醇胺鹽、哌嗪 鹽、二芐基乙二胺鹽、葡甲胺鹽、氨基丁三醇鹽、四甲基季銨鹽、四乙基季銨鹽或膽堿鹽，優(yōu) 選為二乙胺鹽、乙醇胺鹽、膽堿鹽、哌嗪鹽、葡甲胺鹽或氨基丁三醇鹽，更優(yōu)選為乙醇胺鹽、 膽堿鹽、葡甲胺鹽或氨基丁三醇鹽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的鹽，其中所述的鹽選自
4.一種制備如權(quán)利要求1 3任一項(xiàng)所述的鹽的方法，該方法包括(a)將通式(I)化合物溶解于有機(jī)溶劑中，優(yōu)選為四氫呋喃；(b)攪拌下加入2 3當(dāng)量的堿金屬氫氧化物、堿性氨基酸、胺類或季銨類；(c)反應(yīng)2 24小時(shí)后，分離出鹽。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述的堿金屬氫氧化物選自鈉、鋰、鉀、鈣、鎂氫氧化物； 所述的堿性氨基酸選自賴氨酸或精氨酸；所述的胺類選自甲胺、二甲胺、三甲胺、乙胺、二乙胺、三乙胺、乙醇胺、哌嗪、二芐基乙二胺、葡甲胺或氨基丁三醇；所述的季銨類選自四甲基季銨、四乙基季銨或氫氧化膽堿。優(yōu)選為二乙胺、乙醇胺、氫氧化膽堿、哌嗪、氨基丁三醇或葡甲胺，更優(yōu)選為乙醇胺、氫 氧化膽堿、葡甲胺或氨基丁三醇。
6.根據(jù)權(quán)利要求1 3任一項(xiàng)所述的鹽在制備血小板生成素受體激動(dòng)劑中的用途。
7.根據(jù)權(quán)利要求1 3任一項(xiàng)所述的鹽在制備治療血小板減少癥藥物中的用途。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其中所述藥物進(jìn)一步與選自下列的藥物聯(lián)合使用集 落刺激因子、細(xì)胞因子、趨化因子、白細(xì)胞介素或細(xì)胞因子受體激動(dòng)劑或拮抗劑、可溶的受 體、受體激動(dòng)劑或拮抗劑抗體或與一個(gè)或多個(gè)與所述藥物具有相同的作用機(jī)理的肽或小分 子類物質(zhì)。
9.一種藥物組合物，其含有治療有效量的如權(quán)利要求1 3任一項(xiàng)所述的鹽及藥學(xué)上 可以接受的載體或稀釋劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的藥物組合物，其中所述組合物進(jìn)一步含有聯(lián)合使用的治療 有效量的選自下列的藥物集落刺激因子、細(xì)胞因子、趨化因子、白細(xì)胞介素或細(xì)胞因子受 體激動(dòng)劑。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的藥物組合物在制備治療血小板減少癥藥物中的用途。
全文摘要
通式(I)所示的雙環(huán)取代吡唑酮偶氮類衍生物藥學(xué)上可接受的鹽、其制備方法以及含有該藥學(xué)上可接受鹽的藥物組合物、以及其作為治療劑特別是作為血小板生成素(TPO)模擬物和血小板生成素受體激動(dòng)劑的用途。
文檔編號(hào)C07D405/12GK101921232SQ20091005294
公開日2010年12月22日 申請(qǐng)日期2009年6月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月11日
發(fā)明者呂賀軍, 費(fèi)洪博, 鄧炳初, 陳一千 申請(qǐng)人:上海恒瑞醫(yī)藥有限公司;江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司