專利名稱：抗鱖魚彈狀病毒糖蛋白的單克隆抗體及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水產(chǎn)動物病毒單克隆抗體技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種抗鱖魚彈狀病毒糖蛋白 的單克隆玩體，同時還涉及抗鱖魚彈狀病毒糖蛋白的單克隆抗體的制備方法，分泌抗鱖魚彈 狀病毒糖蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞的融合、分離、鑒定與擴增培養(yǎng)，涉及抗鱖魚彈狀 病毒糖蛋白的單克隆抗體對鱖魚彈狀病毒感染的免疫檢測，還涉及抗鱖魚彈狀病毒糖蛋白的 單克隆抗體在鱖魚彈狀病毒糖蛋白在宿主的組織或細(xì)胞中的定量和定位分析中的用途。
背景技術(shù)：
魚類彈狀病毒是一類引起魚及其他水生動物致死性和流行性病害的重要病毒病原，呈世 界性分布，給淡、海水水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失和嚴(yán)重烕脅，現(xiàn)已報道的魚類彈狀病 毒達十幾種[Kurath和Winton, Fish Rhabdoviruses, F: 221-227 (Brian和Marc ， Encycl叩edia of Virology,第三版，2008)]。 20世紀(jì)90年代開始，本實驗室從患流行病 的鱖魚組織中分離鑒定出了鱖魚彈狀病毒(5Y/w> rcs c加stw' rhabdovirus， SCRV)[張奇 亞等，科學(xué)通報，1999, 44(2): 192-195; Tao等，Aquaculture, 2007， 262: 1-9 ]。進一步 對鱖魚彈狀病毒的全基因組進行測序，結(jié)果揭示鱖魚彈狀病毒的基因組為不分節(jié)段的單股 負(fù)鏈RNA'大小為11545 bp,編碼5種結(jié)構(gòu)蛋白，即核蛋白(Nucle叩rotein， N)、磷酸化 蛋白(Phosphoprotein， P)、基質(zhì)蛋白(Matrix protein, M)、糖蛋白(Glycoprotein, G)禾口 RNA聚合酶(Polymerase, L),序列比對顯示鱖魚彈狀病毒與彈狀病毒科的水皰性口炎病毒 屬的成員的親緣關(guān)系最近[Tao等，Virus Research, 2008, 132: 86-96 ]。
對于魚類彈狀病毒病，尚缺乏治療藥物和方法，早期檢測和診斷仍是預(yù)防該病毒病傳播 的主要途徑。魚類彈狀病毒病原的檢測可以通過細(xì)胞培養(yǎng)、電鏡觀察、RT-PCR及免疫學(xué)等方 法進行。其中，具有特異性強的單克隆抗體對魚類彈狀病毒病原進行檢測，不僅具有快速、靈 敏的優(yōu)點，而且適于大規(guī)?，F(xiàn)場檢測應(yīng)用。另外，在對魚類彈狀病毒的基礎(chǔ)研究中，單克隆 抗體還能用于相應(yīng)病毒多肽在宿主體內(nèi)或培養(yǎng)細(xì)胞中的表達、定位及病毒與宿主相互作用等 研究。國內(nèi)外雖有屈單克隆抗體檢測魚類彈狀病毒的報道(Dixon和Longshaw, Dis Aquat Org, 2005, 67: 25-29; Zhou等，Viral Immunol, 2006, 19: 637-645; Chen等，Vet Immunol I,unopathol， 2008, 123: 266-276 )，但至今尚未見鱖魚彈狀病毒單克隆抗體相關(guān)文獻與 專利。因此，抗鱖魚彈狀病毒的單克隆抗體亟待研發(fā)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供了一種抗鱖魚彈狀病毒糖蛋白的單克隆抗體，所述的單克隆抗體是由保藏編號為CCTCC No: C200918的小鼠雜交瘤細(xì)胞株SCRV-G-1B2分泌產(chǎn)生。 SCRV-G-1B2細(xì)胞增殖后可制備大量所需的特異抗體；SCRV-G-1B2細(xì)胞注射小鼠后，產(chǎn)生的 小鼠腹水單抗ELISA效價為1:105; SCRV-G-1B2細(xì)胞株細(xì)胞活性高，液氮中凍存6-8個月后，
仍能快速復(fù)蘇并保持良好活性。
本發(fā)明的另一個目的是在于提供了一種抗鱖魚彈狀病毒糖蛋白的單克隆抗體的制備方 法。在分離免疫鼠脾臟細(xì)胞之前，通過將純化鱖魚彈狀病毒直接注射小鼠脾臟進行強化免疫， 可獲得活性更高、特特異性更強、數(shù)量更多的鼠脾臟淋巴細(xì)胞，以保證所獲得的融合雜交瘤 細(xì)胞效果更好。在所述單克隆抗體制備中，使用小鼠脾臟強化免疫技術(shù)的融合率為96. 3%，陽 性率達到97%。
本發(fā)明的目的還提供了一種抗鱖魚彈狀病毒糖蛋白的單克隆抗體在鱖魚彈狀病毒感染的 免疫檢測中的應(yīng)用。
本發(fā)明又一個目的是在于提f共了一種抗鱖魚彈狀病毒糖蛋白的單克隆抗體在鱖魚彈狀病 毒糖蛋白在宿主的細(xì)胞中進行定量分析的應(yīng)用。
本發(fā)明再一個目的是在于提供了一種抗鱖魚彈狀病毒糖蛋白的單克隆抗體在鱖魚彈狀病 毒糖蛋白在宿主的組織中進行定位分析的應(yīng)用。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案
本發(fā)明的所述單克隆抗體制備方法，是以純化的鱖魚彈狀病毒為抗原，經(jīng)免疫BALB/c小 鼠后，應(yīng)用雜交瘤細(xì)胞融合技術(shù)，篩選鑒定出抗鱖魚彈狀病毒糖蛋白的單克隆抗體，產(chǎn)生該 單克隆抗體的小鼠雜交瘤細(xì)胞株SCRV-G-1B2，該雜交瘤細(xì)胞株已于2009年2月25日保藏 于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC，地址中國武漢市武漢大學(xué))，保藏編號為CCTCC No: C200918。
一種抗鱖魚彈狀病毒糖蛋白的單克隆抗體的制備方法，其步驟如下
1. 小鼠免疫 . '
免疫用小鼠為SPF級8周齡雌性BALB/c小鼠。每只小鼠以純化鱖魚彈狀病毒(蛋白量為 IOO昭)進行腹腔注射，每兩周一次共三次，第一次用弗氏完全佐劑乳化，第二、三次用弗氏 不完全佐劑乳化，第四次用不加佐劑的純化鱖魚彈狀病毒(蛋白量為75嗎)直接注射小鼠脾 臟進行強化免疫一次。3天后待融合，獲得免疫小鼠,。
2. 細(xì)胞融合
無菌條件下取免疫小鼠的脾細(xì)胞，按脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞5: l的比例用質(zhì)量百分比 為50W的PEG4000進行融合，融合后的細(xì)胞鋪于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于37'C，體積百分比為 5呢的C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。靜置培養(yǎng)3天后，用倒置顯微鏡逐日觀察。
3. 雜交瘤細(xì)胞的篩選與克隆
融合細(xì)胞培養(yǎng)10天后，收取細(xì)胞培養(yǎng)上清，以純化鱖魚彈狀病毒為抗原進行間接ELISA 檢測。用有限稀釋法對陽性株雜交瘤細(xì)胞進行單克隆化篩選，再經(jīng)間接ELISA進行檢測，經(jīng) 過3次克隆后獲得穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株(稱為SCRV-G-IB2)。經(jīng)倒置顯微鏡 觀察顯示，SCRV-G-1B2細(xì)胞渾圓透亮，形態(tài)均一，易于貼壁生長，通常按1:2傳代培養(yǎng)，次日則可長滿瓶；傳代培養(yǎng)2-3夭，培養(yǎng)基由粉紅色轉(zhuǎn)變?yōu)槌赛S或淺黃色，表明細(xì)胞生長旺盛; SCRV-G-1B2經(jīng)在液氮中反復(fù)凍存、復(fù)蘇或在體外連續(xù)傳代2個月以上，均能穩(wěn)定分泌單克隆 抗體。該雜交瘤細(xì)胞株已于2009年2月25日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱:CCTCC， 地址中國武漢市武漢大學(xué))，保藏編號為CCTCCNo: C200918。
4. 單克隆抗體的制備
取經(jīng)腹腔注射液體石蠟預(yù)處理的BALB/c小鼠，腹腔注入小鼠雜交瘤細(xì)胞SCRV-G-1B2，誘 生腹水，7-IO天后收取腹水，離心，收集上清，即為腹水單克隆抗體。
5. 單克隆抗體的特性鑒定
以純化鱖魚彈狀病毒為抗原用間接ELISA方法測定該單克隆抗體的腹水效價；用Sigma 公司的小鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒(Mouse mAb Isotyping Kit)鑒定該單克隆抗體Ig亞 型；以免疫印跡(Western blot)法鑒定該單克隆抗體與鱖魚彈狀病毒病毒蛋白的反應(yīng)性和特 異性。
所述的抗鱖魚彈狀病毒糖蛋白的單克隆抗體在鱖魚彈狀病毒感染的免疫檢測中的應(yīng)用， 可根據(jù)條件，利用不同的免疫方法，包括間接免疫熒光試驗、免疫點雜交、抗原捕獲ELISA 等，可對可疑病魚樣品或待檢魚進行早期檢測，也可研發(fā)試劑盒，到養(yǎng)殖場或疫區(qū)對魚群進 行測試。
所述的抗鱖魚彈狀病毒糖蛋白的單克隆抗體在鱖魚彈狀病毒糖蛋白在宿主的組織或細(xì)胞 中的定量和定位分析中的應(yīng)用，可通過流式細(xì)胞儀和免疫組化染色法來進行檢測。 本發(fā)明具有以下優(yōu)點和效果
1、 獲抗鱖魚彈狀病毒糖蛋白的單克隆抗體及分泌該單抗的雜交瘤細(xì)胞株SCRV-G-1B2。 SCRV-G-1B2細(xì)胞增殖后可制備大量所需的特異抗體；SCRV-G-1B2細(xì)胞注射小鼠后，產(chǎn)生 的小鼠腹水單抗ELISA效價為1:105; SCRV-G-1B2細(xì)胞株細(xì)胞活性高，液氮中凍存6-8個 月后，仍能快速復(fù)蘇并保持良好活性。
2、 在抗鱖魚彈狀病毒糖蛋白的單克隆抗體制備中，通過將純化鱖魚彈狀病毒直接注射 小鼠脾臟進行強化免疫，不僅能增強免疫效果，而且能獲得活性更高、特特異性更強、數(shù)量 更多的鼠脾臟淋巴細(xì)胞，以保證所獲得的融合雜交瘤細(xì)胞效果更好。
3、 抗鱖魚彈狀病毒糖蛋白的單克隆抗體，不僅可通過間接免疫熒光試驗、免疫點雜交、 抗原捕獲ELISA等方法，對鱖魚彈狀病毒感染進行檢測，具備用于生產(chǎn)商品化魚類彈狀病 毒檢測試劑盒的前景，還能通過流式細(xì)胞儀和免疫組化染色法對鱖魚彈狀病毒糖蛋白在宿主 的組織或細(xì)胞中進行定量和定位分析，對于研究鱖魚彈狀病毒的致病機制具有重要的作用。


圖1.抗鱖魚彈狀病毒糖蛋白單克隆抗體或抗鱖魚彈狀病毒多克隆抗體檢測抗原的免疫 印跡圖。該單克隆抗體與正常細(xì)胞裂解物無交叉反應(yīng)；該單克隆抗體能特異識別鱖魚彈狀病 毒的糖蛋白(分子量大小為65kDa);鱖魚彈狀病毒5個主要結(jié)構(gòu)蛋白都能被多克隆抗體所識 別。圖2.抗鱖魚彈狀病毒糖蛋白的單克隆抗體間接免疫熒光染色圖。A為正常細(xì)胞，無陽性 信號；B為鱖魚彈狀病毒感染的細(xì)胞，該單克隆抗體能識別并顯示強陽性熒光信號，且熒光 信號主要呈點狀分布于胞質(zhì)中。
圖3.'抗鱖魚彈狀病毒糖蛋白的單克隆抗體檢測不同純度抗原的點雜交圖。A為正常細(xì)胞 裂解物，無陽性信號；B為鱖魚彈狀病毒懸液，陽性信號較弱；C為純化鱖魚彈狀病毒，陽 性信號較強。
圖4.用抗鱖魚彈狀病毒糖蛋白單克隆抗體進行抗原捕獲ELISA檢測的曲線圖。該單克 隆抗體最低可以檢測3. 6ng/0. lml的純化鱖魚彈狀病毒蛋白。
圖5.用抗鱖魚彈狀病毒糖蛋白單克隆抗體標(biāo)記后，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測被鱖魚彈狀病毒感 染的細(xì)胞百分率與時序關(guān)系的曲線圖。結(jié)果顯示在鱖魚彈狀病毒感染不同時間分別取樣進 行測定，被感染的細(xì)胞百分比依次為0. 36°/。、 0.59%、 1.81%、 3.51°/。、 9.90%、 26.27%、 16.06%。
圖6.感染鱖魚彈狀病毒12d的鱖魚不同組織，通過免疫組化染色所顯示病毒在組織中的 分布圖。A為正常魚鰓組織，鰓小片細(xì)胞排列整齊，無陽性反應(yīng)，B為被鱖魚彈狀病毒感染 的魚鰓組織，鰓小片腫脹，鰓絲排列紊亂，組織邊緣不清晰，陽性信號主要分布于鰓部毛細(xì) 血管和鰓小片；C為正常的魚肝臟組織，肝細(xì)胞致密均勻，無陽性反應(yīng)，D為被鱖魚彈狀病 毒感染的魚肝臟組織，局部病變，陽性信號呈團塊狀分布；E為正常魚脾臟組織，脾髓清晰 可見，無陽性反應(yīng)，F(xiàn)為被鱖魚彈狀病毒感染的魚脾臟組織，陽性信號分布于整個脾臟組織； G為正常魚心臟組織，心肌致密，無陽性反應(yīng)，H為被鱖魚彈狀病毒感染的魚心臟組織，心 肌局部呈現(xiàn)陽性反應(yīng)；I為正常魚腎臟組織，腎小體結(jié)構(gòu)清晰，無陽性反應(yīng)，J為被鱖魚彈狀 病毒感染的魚腎臟組織，腎組織纖維化，局部壞死并形成空洞，陽性信號分布于整個腎臟組 織，有的聚集成團狀。
具體實施例方式
以下將參照附圖，結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的優(yōu)點和特點作進一步的詳細(xì)描述。 實施例l:
一種抗鱖魚彈狀病毒糖蛋白的單克隆抗體，其制備步驟是
1、 小鼠免疫
免疫用小鼠為8周齡雌性BALB/c小鼠，將l50nl的純化鱖魚彈狀病毒(蛋白量為10(^g)與相 同體積的弗氏完全佐劑混勻后，注射小鼠腹腔進行初次免疫；經(jīng)2周后，將相同劑量(15(Vl) 的純化鱖魚彈狀病毒與相同體積的弗氏不完全佐劑混勻后進行第二次免疫；再2周后，用相同 劑量(15(Vl)的純化病毒與相同體積的弗氏不完全佐劑混勻后進行第三次免疫；繼第三次免 疫1周后，于取免疫小鼠脾細(xì)胞前3天，用不加佐劑的純化鱖魚彈狀病毒(蛋白量為75jxg)直 接注射小鼠脾臟進行強化免疫。
2、 細(xì)胞融合
在無菌條件下取經(jīng)純化鱖魚彈狀病毒免疫后的小鼠脾臟，去除包膜使脾細(xì)胞游離，加入 無血清DMEM培養(yǎng)基并用12號針頭的10 ml注射器輕輕吸進排出2-3次，收集脾細(xì)胞懸液，
62000mp,離心5min，棄上清，重懸于IO ml無血清DMEM培養(yǎng)基中。經(jīng)計數(shù)后，將制備的脾細(xì)胞 與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞按5: l的比例混勻，2000r即,離心5min,棄上清，松弛細(xì)胞團，緩緩加入 質(zhì)量百分比為5(m的PEG4000溶液lmL進行細(xì)胞融合。融合細(xì)胞經(jīng)無血清DMEM培養(yǎng)基洗滌后，用 40ml HAT培養(yǎng)基進行重懸，混勻后鋪于96孔培養(yǎng)板中，每孔100一，置于37。C,體積百分比為 5%的0)2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。融合細(xì)胞培養(yǎng)后第3天用HAT培養(yǎng)基半量換液，至第7天，換用HT培 養(yǎng)基進行培養(yǎng)，用倒置顯微鏡逐日觀察。
所述的HAT培養(yǎng)基的配制將50倍濃縮的HAT (2ml， Sigma公司)及小牛血清(15ml，杭州四 季青生物工程材料有限公司)加入到DMEM培養(yǎng)基(83ml， HyClone公司)中混勻。 所述的HT培養(yǎng)基的配制將50倍沐縮的HT (2ml)及小牛血清(10ml)加入到DMEM培養(yǎng)基(88ml) 中混勻。
3、 雜交瘤細(xì)胞的篩選與克隆
融合細(xì)胞培養(yǎng)10天后，收取細(xì)胞培養(yǎng)上清，以純化鱖魚彈狀病毒為抗原進行間接ELISA 檢測。具體步驟如下
(1) 抗原包被以純化鱖魚彈狀病毒為抗原包被酶標(biāo)板，0.5昭/孔，4'C過夜；
(2) 棄包被液，用含質(zhì)量體積百分比為5M的脫脂奶粉的PBS溶液于37t:封閉lh，然后用PBST 溶液(含體積百分比為0.05。A的Tween-20的PBS溶液)洗滌3次；
(3) 加入待檢雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，同時設(shè)加入PBS為空白對照，正常培養(yǎng)液為陰性對照， 免疫小鼠血清(用PBS 1:1000稀釋)為陽性對照，10(Vl/孔，37。C孵育lh;
(4) 經(jīng)PBST洗滌3次后，加入l: 2000的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗小鼠IgG抗體， 10(Vl/孔，37。C孵育lh;
(5) 洗滌后，用顯色底物OPD-&02于室溫(20-25°C，以下相同)下避光顯色15min,然后 加入2MH2S04終止，測定0D49^值，以待測孔0D值大于或等于陰性對照孔2. l倍的判定為陽性。 用有限稀釋法對陽性株雜交瘤細(xì)胞進行單克隆化篩選，再經(jīng)間接ELISA進行檢測，3次克隆后 獲得穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，稱為SCRV-G-1B2。
4、 單克隆抗體的制備
取8-10周齡的BALB/c小鼠，腹腔注射O. 5ml液體石蠟，7天后腹腔注入^106個雜交瘤細(xì)胞 SCRV-G-1B2。 7-IO天后當(dāng)小鼠腹部明顯膨脹，抽取腹水，2000r卿離心5min,收集上清，即為 腹水單克隆抗體。
實施例2: 、
抗鱖魚彈狀病毒糖蛋白的單克隆抗體的性質(zhì)鑒定
1、 單克隆抗體的腹水效價鑒定
方法采用間接ELISA法對單克隆抗體的腹水效價進行鑒定.
結(jié)果本發(fā)明所述單克隆抗體的腹水效價為1: IO5，表明SCRV-G-1B2細(xì)胞株具有分泌高
滴度抗體的能力。
2、 單克隆抗體的亞型鑒定方法利用Sigma公司的小鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒(Mouse mAb Isotyping Kit), 依照其說明書對本發(fā)明所述單克隆抗體的Ig亞型進行鑒定。 結(jié)果本發(fā)明所述單克隆抗體的亞型為IgG2b。 3、單克隆抗體的特異性鑒定 免疫印跡法(Westernblot):
以純化鱖魚彈狀病毒為檢測組，設(shè)正常EPC細(xì)胞裂解物為陰性對照，免疫小鼠血清為陽 性對照，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，用電轉(zhuǎn)法將凝膠上的 蛋白分別轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜(PVDF, Millipore公司)上，經(jīng)含質(zhì)量體積百分比為5%的脫 脂奶粉的TBS溶液室溫封閉30min，然后分別加入小鼠腹水(單克隆抗體，1: 100稀釋于PBS) 及免疫小鼠血清(多克隆抗體，1: 1000稀釋于PBS)，室溫孵育2h，用TBST (含體積百分比 為0. 05°/。的Tween-20的TBS溶液)洗滌后，以堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG為二抗，室 溫孵育2h,用底物混合液NBT/BCIP顯色觀察。
結(jié)果見圖1,與免疫小鼠血清相比，該單克隆抗體能特異識別鱖魚彈狀病毒的糖蛋白 (分子量大小為65kDa)，且與正常細(xì)胞裂解物無交叉反應(yīng)。上述結(jié)果表明，本發(fā)明所述單克 隆抗體能特異性地識別鱖魚彈狀病毒的糖蛋白。
實施例3:
抗鱖魚彈狀病毒糖蛋白的單克隆抗體用于鱖魚彈狀病毒感染的免疫檢測
1、 間接免疫熒光試驗(IFA)檢測
方法:'將EPC細(xì)胞培養(yǎng)于鋪有玻璃飛片的6孔板中，使細(xì)胞附著于玻璃飛片上生長，24h 后接種鱖魚彈狀病毒，同時設(shè)正常細(xì)胞作為陰性對照。待出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變后，用質(zhì)量體積 百分比為4%的多聚甲醛于4'C固定lh,然后用體積百分比為100%的酒精于-20'C透化7min。 經(jīng)PBS洗滌后，加入實施例1中SCRV-G-1B2細(xì)胞的培養(yǎng)上清液，室溫下孵育2h。用PBS洗 滌后，以熒光素(FITC)標(biāo)記的羊抗小鼠IgG為第二抗體，室溫孵育2h。用含體積百分比為 5(W的甘油的PBS溶液封片，置于熒光顯微鏡(Leica公司)下進行觀察。
結(jié)果如圖2所示，該單克隆抗體與鱖魚彈狀病毒感染的細(xì)胞呈現(xiàn)強陽性熒光信號，且 熒光信號主要呈點狀分布于胞質(zhì)中，而與正常細(xì)胞無交叉反應(yīng)。上述結(jié)果表明，本發(fā)明所述 的單克隆抗體能用于檢測鱖魚彈狀病毒感染，且其識別的鱖魚彈狀病毒糖蛋白在感染細(xì)胞中 分布于胞質(zhì)。 -
2、 免疫點雜交法(Dot blot)檢測
方法:'分別取lnl的純化鱖魚彈狀病毒和鱖魚彈狀病毒懸液，點在PVDF膜上，晾干，同 時設(shè)正常EPC細(xì)胞裂解物作為陰性對照。用質(zhì)量體積百分比為2%的牛血清蛋白(BSA)溶液 室溫下封閉30min,經(jīng)PBST洗滌后，將膜置于SCRV-G-1B2細(xì)胞培養(yǎng)上清液中，室溫下孵育 2h。 PBST洗滌后，以堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG為第二抗體，室溫孵育lh，用底物混合 液NBT/BCIP顯色觀察。
結(jié)果如圖3所示，該單克隆抗體不僅與純化鱖魚彈狀病毒呈現(xiàn)強陽性信號，且與鱖魚
8彈狀病毒懸液呈現(xiàn)弱陽性信號，而與正常細(xì)胞裂解物則無反應(yīng)。上述結(jié)果表明，本發(fā)明所述 單克隆抗體能用于免疫點雜交法檢測鱖魚彈狀病毒感染，且操作簡便。 3、抗原捕獲ELISA法檢測.
采用飽和硫酸銨鹽析法對腹水單克隆抗體進行純化，獲得初步提純的單克隆抗體，以提 純的單克隆抗體和兔抗鱖魚彈狀病毒的多克隆抗體為基礎(chǔ)，經(jīng)反復(fù)實驗，建立了高靈敏度抗 原捕獲ELISA法，可用于對鱖魚彈狀病毒的檢測。具體步驟如下
(1) 將提純的單克隆抗體包被酶標(biāo)板，0. 125ug/孔，4'C過夜；
(2) 棄包被液，用含質(zhì)量體積百分比為5"/。的脫脂奶粉的PBS溶液于37'C封閉30min，然后 用PBST溶液洗滌3次；
(3) 將純化鱖魚彈狀病毒用PBS稀釋成2000、 400、 80、 16、 3.2、 0.64、 0.128、 0.026 ng/O. lml的稀釋液，設(shè)正常細(xì)胞裂解物作為陰性對照，分別加入到上述酶標(biāo)板中，100^1/孔， 每個梯度設(shè)3個復(fù)孔，37'C孵育2h;
(4) PBST洗滌后，加入用PBS稀釋的兔抗鱖魚彈狀病毒多克隆抗體，0.4貼/孔，37'C孵 育lh;
(5) PBST洗滌3次后，加入1: 2000的HRP標(biāo)記羊抗兔IgG抗體，10(^/孔，37。C孵育
(6) 洗滌后，用顯色底物OPD-H202于室溫下避光顯色15min，然后加入2M H2SO終止反 應(yīng)，測定肌^值，以待測孔OD值大于或等于陰性對照孔2. 1倍的判定為陽性。
結(jié)果如圖5所示，通過抗原捕獲ELISA法，該單克隆抗體最低可以檢測3.6ng/0.1ral 的純化鱖魚彈狀病毒蛋白。上述結(jié)果表明，利用本發(fā)明所述的單克隆抗體建立的抗原捕獲 ELISA法能較靈敏地用于對鱖魚彈狀病毒抗原的檢測，具有用于生產(chǎn)商品化魚類彈狀病毒檢 測試劑盒的前景。
實施例4:
抗鱖魚彈狀病毒糖蛋白的單克隆抗體用于鱖魚彈狀病毒糖蛋白在宿主的組織或細(xì)胞中的定量 和定位分析中的應(yīng)用
1、流式細(xì)胞儀檢測
方法取EPC細(xì)胞進行培養(yǎng)，24h后接種MOI為0. 01的鱖魚彈狀病毒懸液進行感染，分 別收取感染后8h 、 16 h 、 24 h、 36 h、 48 h、 72 h、 96 h的細(xì)胞，經(jīng)PBS洗滌后，用 質(zhì)量體積百分比為1%的多聚甲醛溶液(內(nèi)含體積百分比為0. 2%的TVeen-20)于4'C固定過夜， 設(shè)未感染病毒的EPC細(xì)胞作為陰性對照，然后用質(zhì)量體積百分比1%的BSA溶液室溫下封閉 30min。 PBS洗滌后，加入SCRV-G-1B2細(xì)胞培養(yǎng)上清液于37。C下孵育lh，經(jīng)PBS洗滌后，以 熒光素(F.ITC)標(biāo)記的羊抗小鼠IgG為第二抗體，于37X:下孵育lh。用PBS洗滌后，免疫染 色的細(xì)胞重懸于800^1的含質(zhì)量體積百分比為0. 5%的BSA的PBS溶液中，使用流式細(xì)胞儀檢 測帶有熒光的細(xì)胞比例，每次至少檢測1X1()5個細(xì)胞。 一
結(jié)果如圖6所示，與陰性對照相比，在鱖魚彈狀病毒感染不同時間分別取樣進行測定，被感染的細(xì)胞百分比依次為0.36%、 0.59%、 1.81°/。、 3.51%、 9.90°/。、 26.27%、 16.06%。上述 結(jié)果表明，本發(fā)明所述單克隆抗體能特異性識別鱖魚彈狀病毒糖蛋白抗原，可對被鱖魚彈狀 病毒感染的細(xì)胞進行定量分析，且在鱖魚彈狀病毒感染細(xì)胞8h后即可檢測到病毒抗原的存 在。
2、免疫組織化學(xué)染色法 方法
(1) 取健康的鱖魚(體重約10g)，腹腔注射0.4ml鱖魚彈狀病毒懸液(10fi TCID5。/ml) 進行感染，于感染后第12天取病魚的鰓、肝臟、脾臟、心臟、腎臟組織，PBS清洗后，用質(zhì) 量體積百分比為鄉(xiāng)的多聚甲醛于4'C固定過夜，取出用PBS洗滌后，用質(zhì)量體積百分比為30% 的蔗糖溶液浸泡過夜，設(shè)正常鱖魚的相應(yīng)組織為陰性對照。
(2) 取出組織用濾紙吸千水，用冷凍包埋劑包埋，-2CTC下放置30min，冷凍切片機(Leica 公司)-2(TC下切片，切片厚度為6ym，粘附于經(jīng)多聚賴氨酸處理的載玻片上；
(3) 將附有樣品的載玻片置于37。C烘干30min后，取出用PBS腹水30min;
(4) 用含質(zhì)量體積百分比為5%的脫脂奶粉的PBS溶液于室溫下封閉lh;
(5) PBS洗滌3次后，加入SCRV-G-lB2細(xì)胞培養(yǎng)上清液于室溫下孵育2h;
(6) PBS洗滌3次后，加入l: 2000的冊P標(biāo)記羊抗小鼠IgG抗體于室溫下孵育lh;
(7) 經(jīng)PBS洗滌后，使用底物顯色試劑盒AEC Kit (北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司) 進行顯色；
(8) 用含體積百分比為5(^的甘油的PBS溶液封片，光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果。
結(jié)果如圖5所示，正常魚鰓組織中，鰓小片細(xì)胞排列整齊，無陽性反應(yīng)，被鱖魚彈狀 病毒感染的魚鰓組織中，鰓小片腫脹，鰓排列紊亂，組織邊緣不清晰，陽性信號主要分布 于鰓部毛細(xì)血管和鰓小片；正常的魚肝臟組織中，肝細(xì)胞致密均勻，無陽性反應(yīng)，被鱖魚彈
狀病毒感染的魚肝臟組織中，局部病變，陽性信號呈團塊狀分布；正常魚脾臟組織中，脾髓
清晰可見，無陽性反應(yīng)，被鱖魚彈狀病毒感染的魚脾臟組織中，陽性信號分布于整個脾臟組 織；正常魚心臟組織中，心肌致密，無陽性反應(yīng)，被鱖魚彈狀病毒感染的魚心臟組織中r心
肌局部呈現(xiàn)陽性反應(yīng)；正常魚腎臟組織中，腎小體結(jié)構(gòu)清晰，無陽性反應(yīng)，被鱖魚彈狀病毒 感染的魚腎臟組織中，腎組織纖維化，局部壞死并形成空洞，陽性信號分布于整個腎臟組織， 有的聚集成團狀。上述結(jié)果表明，本發(fā)明所述單克隆抗體能用于對鱖魚彈狀病毒在感染組織 中的分布進行定位分析。
總之，以上所述的實施例，旨在對本發(fā)明進行具體闡述，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何 限制。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，對本發(fā)明從形式和細(xì)節(jié)上作出的任何改變，均應(yīng)認(rèn) 為是本發(fā)明的保護范圍。 —
權(quán)利要求
1、一種抗鱖魚彈狀病毒糖蛋白的單克隆抗體，其特征在于雜交瘤細(xì)胞株SCRV-G-1B2，CCTCC NoC200918。
2、 一種實現(xiàn)權(quán)利要求1所述的抗鱖魚彈狀病毒糖蛋白的單克隆抗體的制備方法，其步驟是(1) 小鼠免疫免疫用小鼠為SPF級8周齡雌'性BALB/c小鼠，每只小鼠以純化鱖魚彈狀病毒進行腹腔注射,每兩周一次共三次，第一次用弗氏完全佐劑乳化，第二、三次用弗氏不完全佐劑乳化，第四次用不加佐劑的純化鱖魚彈狀病毒直接注射小鼠脾臟進行強化免疫一次，3天后待融合，獲得免疫小鼠；(2) 細(xì)胞融合無菌條件下取免疫小鼠的脾細(xì)胞，按脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞5: l的比例用質(zhì)量百分比為5(^的PEG4000進行融合，融合后的細(xì)胞鋪于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于37'C，含體積百分比為5免的C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，靜置培養(yǎng)3天后，用倒置顯微鏡逐日觀察；(3) 雜交瘤細(xì)胞的篩選與克隆融合細(xì)胞培養(yǎng)10天后，收取細(xì)胞培養(yǎng)上清，以純化鱖魚彈狀病毒為抗原進行間接ELISA檢測，用有限稀釋法對陽性株雜交瘤細(xì)胞進行單克隆化篩選，再經(jīng)間接ELISA進行檢測，經(jīng)過3次克隆后獲得穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；(4) 單克隆抗體的制備取經(jīng)腹腔注射液體石蠟預(yù)處理的BALB/c小鼠，腹腔注入小鼠雜交瘤細(xì)SCRV-G-1B2，誘生腹水，7-IO天后收取腹水，離心，收集上清，即為腹水單克隆抗體。，
3、 權(quán)利要求1所述的一種抗鱖魚彈狀病毒糖蛋白的單克隆抗體在鱖魚彈狀病毒感染的免疫檢測中的應(yīng)用。
4、 權(quán)利要求1所述的一種抗鱖魚彈狀病毒糖蛋白的單克隆抗體在鱖魚彈狀病毒糖蛋白在宿主的細(xì)胞中進行定量分析的應(yīng)用。
5、 權(quán)利要求1所述的一種抗鱖魚彈狀病毒糖蛋白的單克隆抗體在鱖魚彈狀病毒糖蛋白在宿主的組織中進行定位分析的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗鱖魚彈狀病毒糖蛋白的單克隆抗體及其制備方法和應(yīng)用，以及產(chǎn)生該單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株SCRV-G-1B2，CCTCC NoC200918。其制備步驟是以純化的鱖魚彈狀病毒為抗原，免疫BALB/c小鼠，經(jīng)細(xì)胞融合，產(chǎn)生融合的雜交瘤細(xì)胞，再經(jīng)間接ELISA篩選和有限稀釋法單克隆化，獲得穩(wěn)定分泌抗鱖魚彈狀病毒糖蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。本發(fā)明能獲得活性更高、特異性更強、數(shù)量更多的鼠脾臟淋巴細(xì)胞，以保證所獲得的融合雜交瘤細(xì)胞效果更好。使用小鼠脾臟強化免疫技術(shù)的融合率為96.3％，陽性率達到97％。本發(fā)明單克隆抗體可用于對鱖魚彈狀病毒感染的免疫檢測，也可用于對鱖魚彈狀病毒糖蛋白在宿主的組織或細(xì)胞中的定量和定位分析。
文檔編號C07K16/10GK101503471SQ20091006119
公開日2009年8月12日 申請日期2009年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月20日
發(fā)明者張奇亞, 陳中元 申請人:中國科學(xué)院水生生物研究所