專利名稱：：一種用于治療阿爾茨海默氏病的抗原蛋白及蛋白基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于免疫
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種用于預(yù)防與治療阿爾茨海默氏病(老年癡呆癥)的重組抗原蛋白及編碼這種重組抗原蛋白的融合基因。
背景技術(shù)：
：阿爾茨海默氏病(Alzheimerdisease,AD)，又稱為老年癡呆癥，是一種神經(jīng)退行性疾病，其臨床表現(xiàn)為精神癥狀的癡呆如記憶減退甚至喪失，認(rèn)知功能缺損和行為遲緩甚至能力喪失等。AD的主要病理學(xué)特征是患者的腦內(nèi)神經(jīng)元外出現(xiàn)由42個氨基酸構(gòu)成的、具有神經(jīng)毒性的p-淀粉樣肽((3-amyloidp印tide，Ap或Ap42,其氨基酸序列參見StrooperBD，etaLAninflammatorydrugprospect.Nature.2001,64(6860):159-160)的聚集體和由其進(jìn)一步形成的淀粉樣斑塊，引起神經(jīng)纖維纏結(jié)和腦神經(jīng)元凋亡，最終導(dǎo)致AD。目前認(rèn)為A|342的纖維化和沉積被認(rèn)為是AD發(fā)生和發(fā)展的一個主要因素，因此減輕腦內(nèi)AP42的負(fù)荷、阻止和逆轉(zhuǎn)A|342的纖維化和沉積已成為預(yù)防和治療AD的一種有效方法。臨床上有多種針對AD治療方法，但均未能取得令人滿意的效果，仍然存在著只是延緩某些癥狀卻無法阻止癡呆發(fā)展的問題。1999年SchenkSchenk等提出了用A(342疫苗清除AP42沉積來治療AD的策略，開創(chuàng)了免疫治療AD的新領(lǐng)域(SchenkD，"a丄Immunizationwithamyloid-betaattenuatesAlzheimer'sdisease-likepathologyinthePDAPPmouse.Tfet"re,1999，400(6740):173-177)。2000年Bard和Janus的研究先后證明，抗A(342的抗體能有效阻止或逆轉(zhuǎn)AI342聚集體和淀粉樣斑塊的形成，并能中和A(M2的細(xì)胞毒性，促進(jìn)AP42的代謝，從而起到了預(yù)防和治療AD的功效(BardF，etal.PeripherallyadministeredantibodiesagainstamyloidP-p印tideenterthecentralnervoussystemandreducepathologyinamousemodelofAlzheimerdisease.NatMed2000，6:916-919;JanusC，etal.AppeptideimmunizationreducesbehaviouralimpairmentandplaquesinamodelofAlzheimer，sdisease.Nature2000,408:979-982)。然而，在隨后的II期臨床試驗(yàn)中有5%的患者出現(xiàn)了免疫損傷(中樞無菌性腦炎和局部出血性腦血管病)，使得以A(M2為抗原的AD免疫治療的臨床試驗(yàn)被迫停止(SchenkD.Amyloid-betaimmunotherapyforAlzheimer'sdisease:theendofthebeginning.NatRevNeurosci.2002，3(10):824—8)。之后眾多的研究結(jié)果表明，臨床試驗(yàn)中出現(xiàn)的免疫損傷是由細(xì)胞免疫應(yīng)答引發(fā)的免疫炎性反應(yīng)所致(LeeM,etal.Abeta42immunizationinAlzheimer'sdiseasegeneratesAbetaN-terminalantibodies.AnnNeurol.2005Sep;58(3):430-5;LemereCA，etal.NovelAbetaimmunogens:isshorterbetterCurrAlzheimerRes.2007，4(4):427-36)。A(M2抗原肽上不同區(qū)域可能存在不同性質(zhì)的表位Ap42抗原肽的N端序列包含B細(xì)胞表位，能刺激B細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)性抗體以清除A(342;而C端序列包含T細(xì)胞表位，激活T細(xì)胞誘發(fā)細(xì)胞免疫應(yīng)答以至于產(chǎn)生了炎性反應(yīng)，這構(gòu)成了免疫損傷的潛在性基礎(chǔ)。此外使用全長的Ap42作為免疫原，還存在著潛在的危險，因?yàn)锳p42本身就是致病因素，同時AP42作為一個小肽，分子量小于10000，免疫原性也較差。AD免疫治療初期中出現(xiàn)的免疫炎性反應(yīng)恰好啟發(fā)性地提示了開發(fā)安全性AD疫苗的必要性，這在一定程度上促進(jìn)了新一代疫苗一A(342表位抗原疫苗的發(fā)展。應(yīng)用AP42表位抗原疫苗清除A(342的聚集體作為一種治療策略的意義不僅僅在于減輕和改善AD的病理特征和癥狀，而且還在于解除和逆轉(zhuǎn)神經(jīng)退行性變性的發(fā)生基礎(chǔ)和發(fā)展過程，更在于積極預(yù)防腦的神經(jīng)退行性病變。盡管對于AP42疫苗清除腦內(nèi)不溶性AP42沉積和促進(jìn)可溶性Ap42降解的確切機(jī)制目前仍存在爭議，但大量研究結(jié)果已經(jīng)肯定了AD免疫治療策略的科學(xué)性和有效性。因此，通過優(yōu)化AP42抗原肽的表位以降低不必要的免疫炎性反應(yīng)，AD的免疫治療仍能獲得理想的免疫效果。根據(jù)這一思路，本發(fā)明人進(jìn)行了深入、系統(tǒng)的研究，終于完成了本發(fā)明。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是為了克服全長Ap42作為免疫原用于預(yù)防與治療阿爾茨海默氏病(老年癡呆癥)的缺點(diǎn)，提供一種毒性小、免疫原性好的免疫增強(qiáng)序列與人(3-淀粉樣肽(Ap)N端9個、28個或35個氨基酸片段(分別用Ap9、A|328或A(535表示)的重組抗原蛋白，以及提供編碼這種重組抗原蛋白的融合基因。本發(fā)明的重組抗原蛋白既除去了全長人A(3的C端毒性片段，提高了A(3的安全性，又重組了免疫增強(qiáng)序列，增強(qiáng)了Ap的免疫原性。這種重組抗原蛋白和編碼這種抗原蛋白的融合基因兩者均在免疫預(yù)防與治療老年癡呆癥方面具有廣泛的應(yīng)用。本發(fā)明的另一個目的是提供所述融合基因與表達(dá)載體pGEX-4T-1、pGEX-4T-2、pGEX-4T-3重組構(gòu)建的重組表達(dá)載體。本發(fā)明涉及的重組抗原蛋白，其特征在于由1-20個免疫增強(qiáng)序列(immunoenhancingsequence,I)禾口1-20個人(5-淀粉樣肽((3-amyloidpeptide,Ap)序列組成，其中任意二個序列間(免疫增強(qiáng)序列和免疫增強(qiáng)序列、免疫增強(qiáng)序列和人(3-淀粉樣肽序列、人P-淀粉樣肽序列和人P-淀粉樣肽序列)通過至少一個共價鍵相偶聯(lián)形成重組蛋白，所述的人P-淀粉樣肽序列選自SEQIDN0:1、SEQIDNO:2或SEQIDN0:3所示的任一種氨基酸序列，所述的免疫增強(qiáng)序列選自下面所述的任一種氨基酸序列①SEQIDNO:4;②SEQIDNO:5;③SEQIDN0:6;④與上述①、②或③至少90%同源的序列。本發(fā)明所述的免疫增強(qiáng)序列通過至少一個共價鍵與所述A(3序列相偶聯(lián)形成重組蛋白，其中所述共價鍵優(yōu)選的是肽鍵，任意二個氨基酸序列按頭-N末端、尾-C末端相連的方式形成。對本發(fā)明的技術(shù)方案可作如下理解在重組抗原蛋白中，所包含的1-20個的人|3-淀粉樣肽序列可以是完全相同的氨基酸序列(選自SEQIDNO:l、SEQIDN0:2或SEQIDN0:3中的l種)，也可以是不完全相同的氨基酸序列(同時包含SEQIDNO:l、SEQIDN0:2和SEQIDN0:3中的2-3種)；1-20個的免疫增強(qiáng)序列可以是完全相同的氨基酸序列(選自①、②、③或④中的一種)，也可以是不完全相同的氨基酸序(同時包含①、②、③和④中的2-4種)；多個的免疫增強(qiáng)序列(或人P-淀粉樣肽序列)可以是(內(nèi)部)全部重組的，可以是(內(nèi)部)全部分立的，也可以是(內(nèi)部)部分重組、(內(nèi)部)部分分立的。分立或重組的免疫增強(qiáng)序列和分立或重組的人P-淀粉樣肽序列相偶聯(lián)形成重組蛋白；免疫增強(qiáng)序列和免疫增強(qiáng)序列的內(nèi)部重組、人P-淀粉樣肽序列和人P-淀粉樣肽序列的內(nèi)部重組，以及分立或重組的免疫增強(qiáng)序列(重組)和分立或重組的人P-淀粉樣肽序列(重組)間均是通過至少一個共價鍵相偶聯(lián)形成重組蛋白；如實(shí)施例l所述，包含2個免疫增強(qiáng)序列和l個人p-淀粉樣肽序列，2個免疫增強(qiáng)序列SEQIDN0:4和SEQIDN(h5序列是內(nèi)部全部重組的，重組后再與1個人p-淀粉樣肽序列SEQIDN0:2相偶聯(lián)形成重組蛋白；如實(shí)施例3所述，包含10個免疫增強(qiáng)序列(1個SEQIDN0:4序列和9個SEQIDNO:6序列)和10個人|3-淀粉樣肽序列(10個SEQIDNO:1序列)，免疫增強(qiáng)序列和人(3-淀粉樣肽序列各自均是全部分立的，重組方式為每2個SEQIDN0:1序列組間都插入了1個SEQIDNO:6序列組，而在第一個SEQIDNO:1序列的N末端又重組了SEQIDN0:4序列，即每1個免疫增強(qiáng)序列和每1個人p-淀粉樣肽序列一一相偶聯(lián)形成重組蛋白；如實(shí)施例4所述，16個SEQIDN0:1序列是部分重組、部分分立的，其中15個SEQIDN0:1序列是內(nèi)部重組的，另一個SEQIDN0:1序列是分立的，內(nèi)部重組的15個SEQIDN0:1序列再順次與分立的SEQIDN0:6序列、分立的另一個SEQIDNO:l序列、分立的SEQIDN0:4序列相偶聯(lián)形成重組蛋白；本發(fā)明實(shí)施例1中的重組抗原蛋白的氨基酸序列如SEQIDN0:7所示，它是1個SEQIDN0:4序列、1個SEQIDNO:5序列和1個SEQIDN0:2序列順序重組而成。實(shí)施例2中的重組抗原蛋白的氨基酸序列如SEQIDN0:8所示，它是1個SEQIDN0:4序列在1個SEQIDNO:3序列的N端與其重組而成。實(shí)施例3中的重組抗原蛋白的氨基酸序列如SEQIDN0:9所示，它包含了1個SEQIDN0:4序列、9個SEQIDNO:6序列和10個SEQIDNO:l序列，其重組方式為每2個SEQIDN0:1序列間都插入了1個SEQIDN0:6序列，而在第一個SEQIDNO:l序列的N末端又重組了SEQIDN0:4序列。實(shí)施例4中的重組抗原蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:IO所示，它包含了1個SEQIDN0:4序列、1個SEQIDN0:6序列和16個SEQIDN0:1序列，其重組方式為615個SEQIDN0:1序列首(N末端)尾(C末端)相連后(多個人p-淀粉樣肽序列內(nèi)部進(jìn)行重組，再與免疫增強(qiáng)序列重組)在第十五個SEQIDN(hl序列的C末段端又順序重組了1個SEQIDN0:6序列和第十六個SEQIDN0:1序列，而在第一個SEQIDN0:1序列的N末端又重組了1個SEQIDN0:4序列。本發(fā)明涉及的編碼用于治療阿爾茨海默氏病重組抗原蛋白的融合基因，其特征在于包含1-20個拷貝的編碼免疫增強(qiáng)序列(immunoenhancingsequence,I)的DNA序列和1-20個拷貝的編碼人(3-淀粉樣肽(p-amyloidp印tide,Ap)的DNA序列，其中任意二個DNA序列間是按相同密碼子閱讀框通過3'，5'磷酸二酯鍵融合連接的，其中所述的編碼人P-淀粉樣肽(P-amyloidp印tide，Ap)的DNA序列為編碼SEQIDNO:1、SEQIDNO:2或SEQIDNO:2的DNA序列，所述的編碼免疫增強(qiáng)序列(immunoenhancingsequence,I)的DNA序列選自選自下面所述的任一DNA序列①編碼SEQIDNO:4的DNA序列；②編碼SEQIDN0:5的DNA序列;③編碼SEQIDNO:6的DNA序列；④與上述①、②或③至少9(^同源的DNA序列；本發(fā)明的特點(diǎn)是不使用全長AP42而是使用Ap42N端9個、28個或35個氨基酸片段(分別用Ap9、A(328或A(335表示)為核心抗原，提高了抗原A(3的安全性，同時引入了由通用型輔助T細(xì)胞表位組成的免疫增強(qiáng)序列以補(bǔ)償核心抗原Ap9、A(328或A|335分子較小的弱點(diǎn)，使本發(fā)明的重組抗原蛋白成為安全而有效的抗原蛋白。圖1:pGEX4T1-I-Ap28重組表達(dá)載體的測序譜圖；圖2:重組表達(dá)載體pGEX4T1-I-Ap28構(gòu)建示意圖3:純化得到的重組抗原蛋白GST-I-A(328(A)、GST-A(535(B)和GST-(A(59-K6)9-Ap9(C)的SDS-PAGE圖譜；其中M:蛋白質(zhì)Marker;A:GST-1-Ap28;B:GST-Ap35(B);C:GST-(A(39-K6)9-Ap9;D:GST-(A(39)15-K6—Ap9;圖4:pGEX4T1-Ap35重組表達(dá)載體的測序譜圖5:重組表達(dá)載體pGEX4T卜Ap35構(gòu)建示意圖6:重組表達(dá)載體pGEX-4Tl-(Ap9-K6)9-Ap9構(gòu)建示意圖7:pGEX4T1-(A(39-K6)9-Ap9重組表達(dá)載體的測序譜圖8.重組載體pUCmT-(Ap9)15-K6_Ap9的測序譜圖9.重組表達(dá)載體pGEX-4Tl-(Ap9)15-K6-Ap9構(gòu)建示意圖10:GST-I-Ap28(I)、GST-A(J35(II)、GST-(A(39-K6)9-Ap9(III)和GST-(Ap9)15-K6-Ap9(IV)誘導(dǎo)抗體功效分析的PC12細(xì)胞圖，其中A:對照PC12細(xì)胞，B:PC12細(xì)胞中同時加入A(342和抗血清，C:PC12細(xì)胞中只加入Ap42。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實(shí)施例l:制備重組抗原蛋白GST-I-A(328，包括以下步驟(1)設(shè)計(jì)本發(fā)明的重組抗原蛋白本發(fā)明的重組抗原蛋白GST-I-Ap28的設(shè)計(jì)使得其完整氨基酸序列如SEQIDN0:7所示，它包含了1個SEQIDN0:4(GST)序列，1個SEQIDN0:5(I)序列和1個SEQIDNO:2(Ap28)序列，2個免疫增強(qiáng)序列SEQIDN0:4和SEQIDN0:5序列內(nèi)部重組后，再與1個人P-淀粉樣肽序列SEQIDNO:2相偶聯(lián)形成重組蛋白；重組的SEQIDN0:4(GST)序列既是重組抗原蛋白的一部分，又是表達(dá)的該蛋白的純化標(biāo)簽。(2)合成編碼GST-I-AP28的基因及構(gòu)建重組表達(dá)載體依據(jù)本發(fā)明所設(shè)計(jì)的重組抗原蛋白GST-I-A|328的氨基酸序列，設(shè)計(jì)并利用DNA合成儀人工合成了編碼I-Ap28的基因片段，其序列如下ctaatagcaaatttattggtattaccgaactggctgccgctgatgcagaattccgtcatgactceiggatEitgEiagttcatcatcaaaaattggtgttctttgcagaagatgtgggttcaaacaaatagitctcgagcgg其中5'端有下劃線的gg^^序列是內(nèi)切酶BamHI識別位點(diǎn)，3，端有下劃線的ctcgag序列是內(nèi)切酶Xhol識別位點(diǎn)，所設(shè)計(jì)的此二酶切位點(diǎn)與本發(fā)明所用的原核表達(dá)載體pGEX-4T-l[通用的大腸桿菌表達(dá)載體，含有tec強(qiáng)啟動子、N-末端谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)標(biāo)簽以及氨卞青霉素抗性基因等，Novagen、Invitrogen等公司有售]的BamHI和Xhol相匹配，適合于在大腸桿菌中高效表達(dá)。利用BamHI和Xhol切割位點(diǎn)將此合成的編碼I-Ap28的基因片段克隆進(jìn)表達(dá)載體pGEX-4T-1中BamHI和Xhol酶切位點(diǎn)之間，連接后便在5'端融合了載體上編碼GST的序列[其核苷酸序列記載于國際基因庫(GenBank)中，登錄號為XXU13853)，得到完整的編碼GST-I-Ap28的基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:ll所示。上述表達(dá)載體的構(gòu)建步驟具體如下雙酶切反應(yīng)將1.0pGEX-4T-l載體[或pGEX-4T-2、pGEX-4T-3，通用的大腸桿菌表達(dá)載體，含有tec強(qiáng)啟動子、N-末端谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)標(biāo)簽以及氨卞青霉素抗性基因等，Novagen、Invitrogen等公司有售]和上述用DNA合成儀人工合成的編碼IA(328的基因片段分別與適量去離子水混勻，使其總體積分別為18)al，各加入2單位限制性內(nèi)切酶BamHI和2單位XhoI及2pl相應(yīng)的IOXH緩沖液，混勻，置37'C水浴保溫2小時后，分別采用常規(guī)低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠回收法參照"分子克隆實(shí)驗(yàn)指南"(第二板，科學(xué)出版社)322頁回收目的DNA。編碼I-AP28的基因片段與載體pGEX-4T-1的連接取0.5pg上述步驟回收的pGEX-4T-1載體DNA，加入10倍摩爾量的編碼I-Ap28的基因片段DNA、2pi10XT4DNA連接酶緩沖液，加去離子水定容至20ul，最后加入1單位的的T4DNA連接酶，混勻并瞬間離心以使液滴聚集管底，置16。C水浴過夜或25。C水浴4小時后，得到連接好的重組DNApGEX4T1-I-A(328。重組表達(dá)載體pGEX4Tl-I-Ap28轉(zhuǎn)化￡co7iDH5a:取10pl連接好的重組表達(dá)載體pGEX4Tl-I-A(328加入100pi￡DH5a感受態(tài)細(xì)胞￡DH5a感受態(tài)細(xì)胞的制備方法參照"分子克隆實(shí)驗(yàn)指南"(第二板，科學(xué)出版社)49頁中，冰浴30分鐘后置入42'C水浴中保溫1分鐘，立即取出并置冰浴中冷卻2分鐘。加入200pl37。C預(yù)熱的S0C液體培養(yǎng)基，37°C150rpm振搖培養(yǎng)60分鐘后，取出100pl培養(yǎng)液涂布于含氨卞青霉素(Amp)的LB瓊脂培養(yǎng)平板上，37。C培養(yǎng)16小時后，出現(xiàn)轉(zhuǎn)化菌落。重組載體pGEX4Tl-I-A(528的克隆與基因序列分析挑取單菌落加入2ml含有氨卞青霉素的LB培養(yǎng)液中，37°C，200rpra培養(yǎng)過夜。提取擴(kuò)增的重組載體pGEX4Tl-I-Ap28，經(jīng)BamHI和Xhol雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳分析，選擇切割產(chǎn)物與理論值一致的克隆進(jìn)行核酸序列分析，結(jié)果如圖l(pGEX4Tl-I-AP28載體測序譜圖，其中編碼I-Ap28的基因?yàn)楹塑账?41829號)所示，證明獲得了編碼完整GST-I-A|328的基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:ll所示，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TM。重組表達(dá)載體pGEX4Tl-I-A(328的構(gòu)建過程如圖2所示，利用BamHI和Xhol切割位點(diǎn)將合成的編碼I-Ap28的基因片段克隆進(jìn)表達(dá)載體pGEX-4T-1中BamHI和Xhol酶切位點(diǎn)之間，成為重組載體pGEX4Tl-I-A(328。(3)重組抗原蛋白I-AP28的表達(dá)與制備重組表達(dá)載體pGEX4T1-I-A(328可轉(zhuǎn)化到￡co"'BL21(DE3)系列細(xì)胞中，如￡coh'BL21(DE3)、￡c。h'BL21(DE3)pLysS、coh'BL21(DE3)pLysE細(xì)胞等等，獲得高表達(dá)的GST-I-Ap28。在本實(shí)施例中使用EBL21(DE3)為宿主細(xì)胞，并使用氨卞青霉素篩選出能高效穩(wěn)定表達(dá)的單細(xì)胞株。具體操作將1.0表達(dá)載體pGEX4T1-1-A(328加入到100plf.coh'BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30分鐘，42'C水浴保溫90秒，冰浴冷卻2分鐘，加入800pl37'C預(yù)熱的LB液體培養(yǎng)基，37°C150rpm振搖培養(yǎng)60分鐘。取200pl培養(yǎng)液涂布于含氨卞青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)平板上，37'C培養(yǎng)16小時后，獲得轉(zhuǎn)化的單菌落。挑取轉(zhuǎn)化的單菌落，接種于2mlLB培養(yǎng)基中，37-C振搖培養(yǎng)過夜。以1:100的比接種10mlLB培養(yǎng)基(50jag/mlAmp),37°C200r/min振蕩培養(yǎng)至0D6。。=0.81.0(約23小時)，加異丙基-e-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度0.6mM，37°C200rpm振蕩誘導(dǎo)4小時后，4'C5000rpm離心5分鐘收集菌體。用1/10培養(yǎng)液體積的10mMTris*Cl(pH8.0)重懸菌體，置冰浴中超聲波處理破碎菌體。破碎菌體4。C，5000rpm離心15分鐘，獲得上清液。然后使用S印harose4B親和柱純化得到本發(fā)明的重組抗原蛋白GST-I-Ap28:將上清液緩慢流過S印harose4B柱，然后用5倍柱體積PBST洗柱3次，最后用洗脫緩沖液(20慮GSH，50函Tris-HCl，pH8.0)洗脫本發(fā)明的抗原蛋白GST-I-Ap28。圖3A示出了所得到的抗原蛋白GST-I-Ap28的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定結(jié)果，純化得到的重組抗原多肽GST-I-Ap28的分子量為32kDa。本發(fā)明設(shè)計(jì)了重組抗原蛋白GST-I-AP28的氨基酸序列，并獲得了編碼重組抗原蛋白GST-I-A|528的基因，使用該基因表達(dá)出重組抗原蛋白GST-I-Ap28。所述的重組抗原蛋白GST-I-Ap28以可溶性蛋白形式表達(dá)，使用S印harose4B親和層析法純化制備了本發(fā)明的抗原蛋白GST-I-A|328。實(shí)施例2:制備重組抗原蛋白GST-AP35，包括以下步驟(1)設(shè)計(jì)本發(fā)明的重組抗原蛋白本發(fā)明的重組抗原GST-AP35的設(shè)計(jì)使得其完整氨基酸序列如SEQIDN0:8所示，它包含了1個SEQIDN0:4(GST)序列和1個SEQIDN0:3(A|335)序列。重組的SEQ.IDN0:4(GST)序列既是重組抗原蛋白的一部分，又是表達(dá)的該蛋白的純化標(biāo)簽。(2)合成編碼GST-A(J35的基因及構(gòu)建重組表達(dá)載體依據(jù)本發(fā)明所設(shè)計(jì)的重組抗原蛋白GST-AP35的氨基酸序列，設(shè)計(jì)并利用DNA合成儀人工合成了編碼Ap35的基因片段，其序列如下C3ga_ag3tgtgggttC33aC3a3ggtgC33tC3ttgg3CtC3tgt3at￡^^gCgg其中5'端有下劃線的HS5^序列是內(nèi)切酶BaraHI識別位點(diǎn)，3，端有下劃線的ctcgag序列是內(nèi)切酶Xhol識別位點(diǎn)。上述所設(shè)計(jì)并合成的A(535基因片段的特性與實(shí)施例1中I-A|328基因片段的特性相同，利用BamHI和Xhol切割位點(diǎn)將此合成的編碼A(335的基因片段克隆進(jìn)表達(dá)載體pGEX-4T-l中BamHI和Xhol酶切位點(diǎn)之間，連接后便在5'端融合了載體上的編碼GST序列，得到完整的編碼GST-Ap35的基因，其核苷酸序列如SEQIDN0:12所示。上述重組表達(dá)載體pGEX4Tl-A(335的構(gòu)建歩驟同實(shí)施例1中的pGEX4T1-I-Afi28。提取擴(kuò)增的重組'載體pGEX4Tl-Ap35，進(jìn)行核酸序列分析，結(jié)果如圖4(pGEX4Tl-A|335載體測序譜圖，其中編碼Ap35的基因?yàn)楹塑账?67874號)所示，證明獲得了編碼完整GST-Ap35的基因，其核苷酸序列如SEQIDN0:12所示，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA。重組表達(dá)載體pGEX4T1-AP35的構(gòu)建過程如圖5所示，利用BamHI和XhoI切割位點(diǎn)將合成的編碼A(335的基因片段克隆進(jìn)表達(dá)載體pGEX-4T-1中BamHI和Xhol酶切位點(diǎn)之間，成為重組載體pGEX4T1-A(335。(3)重組抗原蛋白GST-Ap35的表達(dá)與制備重組表達(dá)載體pGEX4Tl-A(335轉(zhuǎn)化Ec^iBL21(DE3)宿主細(xì)胞的步驟以及GST-Ap35基因的表達(dá)步驟同實(shí)施例1中pGEX4Tl-I-Ap28的轉(zhuǎn)化以及GST-1-Ap28基因的表達(dá)。挑取pGEX4Tl-A|335轉(zhuǎn)化￡coh'BL21(DE3)宿主細(xì)胞的單菌落，按與實(shí)施例1中相同的方法誘導(dǎo)發(fā)酵后的菌體以及收集菌體和破碎菌體，獲得上清液，然后使用S印harose4B親和柱按與實(shí)施例1中相同的方法純化得到本發(fā)明的重組抗原蛋白GST-Ap35。圖3B示出了所得到的抗原蛋白GST-Ap35的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定結(jié)果，純化得到的重組抗原多肽GST-A(335的分子量為29kDa。本發(fā)明設(shè)計(jì)了重組抗原蛋白GST-AP35的氨基酸序列，并獲得了編碼重組抗原蛋白GST-Ap35的基因，使用該基因表達(dá)出重組抗原蛋白GST-AP35。所述的重組抗原蛋白GST-Ap35以可溶性蛋白形式表達(dá)，使用S印harose4B親和層析法純化制備了本發(fā)10明的抗原蛋白GST-A(335。實(shí)施例3:制備重組抗原蛋白GST-(Ap9-K6)9-Ap9，包括以下步驟(1)設(shè)計(jì)本發(fā)明的重組抗原蛋白本發(fā)明的重組抗原GST-(AP9-K6)9-A(39的設(shè)計(jì)使得其完整氨基酸序列如SEQIDN0:9所示，它包含了1個SEQIDN0:4(GST)序列，10個SEQIDN0:1(Ap9)序列和9個SEQIDN0:6(K6)序列。重組的SEQIDN0:4(GST)序列既是重組抗原蛋白的一部分，又是表達(dá)的該蛋白的純化標(biāo)簽。(2)合成編碼GST-(Aj39-K6)9-AP9的基因及構(gòu)建重組表達(dá)載體依據(jù)本發(fā)明所設(shè)計(jì)的重組抗原蛋白GST-(AP9-K6)9-A(39的氨基酸序列，設(shè)計(jì)并利用DNA合成儀人工合成了編碼(Ap9-K6)9-AP9的基因片段，其序列如下Cggga/tccg3tgcagaattccgtcatg3ctcaggaaag3agaag3aga3g3agg￡ttgc3g3gtttcgtc33g3ag33g33ga3gaagg3tgc3g3gtttcgtcatg3ctcaggaaa_gaag38gaagaaga_3gg3tgcagagttcaggataatctcgagcgg其中5'端有下劃線的g^lq^序列是內(nèi)切酶BaniHI識別位點(diǎn)，3'端有下劃線的ctcgag序列是內(nèi)切酶XhoI識別位點(diǎn)。上述所設(shè)計(jì)并合成的(A(39-K6)9-A(39基因片段的特性與實(shí)施例1中I-A(i28基因片段的特性相同，利用BamHI和Xhol切割位點(diǎn)將此合成的編碼(A(39-K6)9-A(39的基因片段克隆進(jìn)表達(dá)載體pGEX-4T-1中BaraHI和Xhol酶切位點(diǎn)之間，連接后便在5'端融合了載體上的編碼GST序列，得到完整的編碼GST-(AP9-K6)9-AP9的基因，其核苷酸序列如SEQIDN0:13所示。上述重組表達(dá)載體pGEX4T1-(A(39-K6)9-Ap9的構(gòu)建步驟同實(shí)施例1中的pGEX4T1-1-A|328。提取擴(kuò)增的重組載體PGEX4T1-(A[i9-K6)9-Afi9，進(jìn)行核酸序列分析，結(jié)果如圖7(pGEX4T1-(AP9-K6)9-A{39載體測序譜圖，其中編碼(Ap9-K6)9-Ap9的基因?yàn)楹塑账?8502號)所示，證明獲得了編碼完整GST-(Ap9-K6)9-Af39的基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:13所示，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TM。重組表達(dá)載體pGEX4T1-(Ap9-K6)9-A(J9的構(gòu)建過程如圖6所示，利用BaraHI和Xhol切割位點(diǎn)將合成的編碼(Ap9-K6)9-Ap9的基因片段克隆進(jìn)表達(dá)載體pGEX-4T-1中BamHI和Xhol酶切位點(diǎn)之間，成為重組載體pGEX4T1-(Ap9-K6)9-Ap9。(3)重組抗原蛋白GST-(Ap9-K6)9-A(39的表達(dá)與制備重組表達(dá)載體pGEX4Tl-(Ap9-K6)9-Ap9轉(zhuǎn)化Ec^iBL21(DE3)宿主細(xì)胞的步驟以及GST-(Ap9-K6)9-Ap9基因的表達(dá)步驟同實(shí)施例l中pGEX4T1-1-A|328的轉(zhuǎn)化以及GST-1-A(528基因的表達(dá)。挑取pGEX4T1-(A|39-K6)9-Ap9轉(zhuǎn)化Eco〃BL21(DE3)宿主細(xì)胞的單菌落，按與實(shí)施例l中相同的方法誘導(dǎo)發(fā)酵后的菌體以及收集菌體和破碎菌體，獲得上清液，然后使用S印harose4B親和柱按與實(shí)施例1中相同的方法純化得到本發(fā)明的重組抗原蛋白GST-(A(39-K6)9-A|39。圖3C示出了所得到的抗原蛋白GST-(A卩9-K6)9-Ap9的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定結(jié)果，純化得到的重組抗原多肽GST-(AP9-K6)9-Ap9的分子量為41kDa。本發(fā)明設(shè)計(jì)了重組抗原蛋白GST-(A|39-K6)9-AP9的氨基酸序列，并獲得了編碼重組抗原蛋白GST-(A|39-K6)9-A(9的基因，使用該基因表達(dá)出重組抗原蛋白GST-(AP9-K6)9-A(39。所述的重組抗原蛋白GST-(A(39-K6)9-Ap9以可溶性蛋白形式表達(dá)，使用S印harose4B親和層析法純化制備了本發(fā)明的抗原蛋白GST-(A|39-K6)9-A(39。實(shí)施例4:制備重組抗原蛋白GST-(A|39)15-K6-Ap9，包括以下步驟(1)設(shè)計(jì)本發(fā)明的重組抗原蛋白本發(fā)明的重組抗原GST-(A|39)15-K6-A&9的設(shè)計(jì)使得其完整氨基酸序列如SEQIDN0:10所示，它包含了1個SEQIDN0:4(GST)序列，16個SEQIDN0:1(Ap9)序列和1個SEQIDN0:6(K6)序列。重組的SEQIDN0:4(GST)序列既是重組抗原蛋白的一部分，又是表達(dá)的該蛋白的純化標(biāo)簽。(2)合成編碼GST-(Ap9)15-K6-Ap9的基因及構(gòu)建重組表達(dá)載體依據(jù)本發(fā)明所設(shè)計(jì)的重組抗原蛋白GST-(AP9)15-K6-A(i9的氨基酸序列，設(shè)計(jì)并利用DNA合成儀人工合成了編碼(AP9)15-K6-AP9的基因片段，其序列如下gatgcagaattccgtcatgactcaggagatgcagagtttcgtcatgactcaggagatgcagagtttcgtcatgactcaggag3tgcag3gtttcgtcatgactcaggagatgcagagtttcgtcatg3ctcaggagatgcagagtttcgtcatgactcaggag;atgcagagtttcgtcatgactcagg3gatgcagagtttcgtcatgactcagggactcagg卿tgc卿gtttcgtcatgactcagg卿tgc卿gtttcgtcatgactc鄉(xiāng)卿tgc卿gtttcgtcatgactcaggagatgcELgagtttcgtcatgactcagg犯Eig3agaagEiagaeigaaggatgcagagtttcgtcatgactC3ggat肪根據(jù)上述基因片段及表達(dá)載體pGEX-4T-l中BamHI和Xhol酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)如下一對引物(S和A)，委托上海生工生物技術(shù)有限公司合成。S:cgggatccgatgcagaattccgtcatg,劃線部分gg^L為內(nèi)切酶BamHI識別位點(diǎn)；A:ccgctcg卿ttatcctgagtcatgacgaaac戈機(jī)部分ctcgag為內(nèi)切酶Xhol識另U位點(diǎn)。以上述合成的編碼(AP9)15-K6-A(39的基因片段為模板，使用引物S和引物A進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，擴(kuò)增兩端帶有酶切位點(diǎn)的編碼(A(39)15-K6-A(39的基因片段。PCR反應(yīng)在5(^1反應(yīng)體系中含lplrTaqDNA聚合酶，5plrTaqDNA聚合酶緩沖液，2pldNTP混合物(每種核苷酸濃度25nmol/L)，模板，lpl弓l物S，1^1引物A，35.5^1超純水。每個循環(huán)中94。C變性0.5分鐘，55。C退火1分鐘，72'C延伸1分鐘，最后一次循環(huán)延至10分鐘，共30個循環(huán)。采用常規(guī)低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠回收法參照"分子克隆實(shí)驗(yàn)指南"(第二板，科學(xué)出版社)322頁回收PCR產(chǎn)物。將上述回收的PCR產(chǎn)物直接與載體pUCm-T連接，連接方法同實(shí)施例1中編碼I-A|528的基因片段與載體pGEX-4T-1的連接，形成重組載體PUCmT-(A|39)15-K6-Ap9。重組載體pUCmT-(A(39)15-K6-A(59轉(zhuǎn)化￡DH5a的步驟同實(shí)施例1中pGEX4Tl-I-A(328的轉(zhuǎn)化。提取擴(kuò)增的重組載體pUCmT-(Ap9)15-K6-A(39，進(jìn)行核酸序列分析，結(jié)果如圖8(pUCmT-(AP9)15-K6-A|39載體測序譜圖，其中編碼(A(39)15-K6-Ap9的基因?yàn)楹塑账?061058號)所示，證明由PCR擴(kuò)增獲得的編碼(A(39)15-K6-A(39的基因片段序列正確。重組載體pUCmT-(A|59)15-K6-Ap9中編碼(Ap9)15-K6-Ap9的基因片段的特性與實(shí)施例1中I-AP28基因片段的特性相同，利用BamHI和Xhol切割位點(diǎn)將編碼(Ap9)15-K6-AP9的基因片段從pUCmT-(A(39)15-K6-A|39載體上切下，再克隆進(jìn)表達(dá)載體pGEX-4T-1中BaraHI和Xhol酶切位點(diǎn)之間，連接后便在5'端融合了載體上的編碼GST序列，得到完整的編碼GST-(AP9)15-K6-A(39的基因，其核苷酸序列如SEQIDN0:14所示，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TM。重組表達(dá)載體pGEX4T1-(A(J9)15-K6-Ap9的構(gòu)建過程如圖9所示。上述重組表達(dá)載體pGEX4Tl-(Ap9)15-K6-AP9的構(gòu)建步驟同實(shí)施例1中的pGEX4T1-I-A(328。(3)重組抗原蛋白GST-(AP9)15-K6-A(39的表達(dá)與制備重組表達(dá)載體pGEX4Tl-(Af39)15-K6-Ap9轉(zhuǎn)化《BL21(DE3)宿主細(xì)胞的步驟以及GST-(Ap9)15-K6-Ap9基因的表達(dá)步驟同實(shí)施例l中pGEX4T1-I-Ap28的轉(zhuǎn)化以及GST-1-A(328基因的表達(dá)。挑取pGEX4T1-(AP9)15-K6-Ap9轉(zhuǎn)化Ec^i'BL21(DE3)宿主細(xì)胞的單菌落，按與實(shí)施例l中相同的方法誘導(dǎo)發(fā)酵后的菌體以及收集菌體和破碎菌體，獲得上清液，然后使用S印harose4B親和柱按與實(shí)施例1中相同的方法純化得到本發(fā)明的重組抗原蛋白GST-(A(39)15-K6-Ap9。圖3D示出了所得到的抗原蛋白GST-(A(39)15-K6-Ap9的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定結(jié)果，純化得到的重組抗原多肽GST-(AP9)15-K6-A(39的分子量為41.4kDa。本發(fā)明設(shè)計(jì)了重組抗原蛋白GST-(A|39)15-K6-Ap9的氨基酸序列，并獲得了編碼重組抗原蛋白GST-(AP9)15-K6-AP9的基因，使用該基因表達(dá)出重組抗原蛋白GST-(Ap9)15-K6-Ap9。所述的重組抗原蛋白GST-(A(39)15-K6-Ap9以可溶性蛋白形式表達(dá)，使用S印harose4B親和層析法純化制備了本發(fā)明的抗原蛋白GST-(A|39)15-K6-Ap9。實(shí)施例5:重組抗原蛋白GST-(Ap9-K6)9-A(39誘導(dǎo)抗體的功效分析(1)抗血清的制備分別以純化的重組抗原蛋白GST-I-A卩28、GST-A(335、GST-(Ap9-K6)9-Ap9或GST-(AP9)15-K6-AP9為免疫原，分別與弗氏佐劑按1:1(v/v)相混合，乳化混勻后13分別對810只BALB/c小鼠進(jìn)行腿部肌肉注射(15(Vg/次/只)，共免疫7次，初次免疫后間隔為21天，以后每次間隔14天。最后一次免疫結(jié)束后7天取血，4'C靜置3小時后4°C4000rpm離心15分鐘，獲得抗血清。(2)抗體的功效分析由于Ap42(即全長的A(5)的寡聚體形式具有較強(qiáng)的神經(jīng)毒性(BarghornSeta7.Globularamyloidbeta-peptideoligomer-ahomogenousandstableneuropathologicalproteininAlzheimer'sdisease.JNeurochem.2005，95(3):834-47，LeeEB，"s丄Targetingamyloid-betapeptide(Abet》)oligomersbypassiveimmunizationwithaconformation—selectivemonoclonalantibodyimproveslearningandmemoryinAbetaprecursorprotein(APP)transgenicmice./A'WC力柳，2006,281(7):4292-4299)，因此，在此以Ap42的寡聚體作為分析抗體功效的靶標(biāo)。使用常規(guī)間接ELISA方法測定獲得的抗血清的抗體滴度，具體操作如下使用96孔板，每孔加入AP42寡聚體抗原lOOpl(5ng/ml)，37'C包被4小時，用磷酸緩沖液(PBS)洗滌，每孔加入100pl封閉液(含1M牛血清白蛋白的PBS)，37。C封閉2小時，用PBS洗滌，分別加入不同稀釋度的抗血清(1:200、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800、1:25600)lOOpl,每個稀釋度設(shè)三個平行樣，37'C孵育1.5小時，用PBS洗滌，每孔加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG100pl(稀釋度1:20000)，于37。C輝育1小時，用PBS洗漆，最后每孔加50(ilTMB顯色液，10min后加入30^12M濃硫酸終止顯色。讀取450nm的0D值。以非免疫BALB/c小鼠血清為陰性對照，陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)為樣品的0D45。值^陰性對照0D頓值+0.20，且樣品0D必。值^2.1X陰性對照0D45。值。通過Execl軟件及SPSS軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果表明重組抗原蛋白GST-1-Ap28、GST-A(335、GST-(Ap9-K6)9-Ap9、GST-(Ap9)15-K6-A(39誘導(dǎo)的抗體的滴度分別為1:3200、1:200、1:12800、1:12800。以PC12細(xì)胞(大鼠腎上腺嗜硌細(xì)胞瘤)為模型細(xì)胞，在PC12細(xì)胞中同時加入10plA(342(400嗎/ml)和1.0pl抗血清，同時以只加入10nlAp42(400ng/ml)的PC12細(xì)胞和正常PC12細(xì)胞為對照，以檢測抗血清對Ap42的細(xì)胞毒性的抑制作用。結(jié)果表明(圖10):只加入A042的PC12細(xì)胞(圖10C)的存活率明顯低于正常PC12細(xì)胞(圖10A)，但同時還加入抗GST-I-Ap28、抗GST-(Ap9-K6)9-Ap9或抗GST-(A(39)15-K6-Ap9抗血清的PC12細(xì)胞[圖IO(I)B、(III)B和(IV)B]的存活率與正常PC12細(xì)胞相比卻無明顯的變化，而同時還加入抗GST-Ap35抗血清的PC12細(xì)胞[圖IO(II)B]的存活率也低于正常PC12細(xì)胞。這說明抗GST-I-A|328、抗GST-(A(59-K6)9-Afi9或抗GST-(A(39)15-K6-AP9的抗血清對AP42的細(xì)胞毒性具有很強(qiáng)的抑制作用，而抗GST-A(335的抗血清對AP42的細(xì)胞毒性的抑制作用較弱。以上結(jié)果表明，應(yīng)用本發(fā)明的重組抗原蛋白GST-I-Ap28、抗GST-(Ap9-K6)9-A(39或抗GST-(AP9)15-K6-AP9誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體體外檢測證明具有明顯的抑制AP42細(xì)胞毒性的功效。14附本發(fā)明所涉及的重組抗原蛋白氨基酸序列表和相應(yīng)基因核苷酸序列表〈110>吉林大學(xué)<120>—種用于治療阿爾茨海默氏病的抗原蛋白及蛋白基因<160>14<210〉1<211>9<212〉PRT<213〉人<400〉1AspAlaGluPheArgHisAspSerGly15<210〉2<211〉28<212〉PRT<213〉人<400〉2AspAlaGluPheArgHisAspSerGlyTyrGluValHisHisGinLys151015LeuValPhePheAlaGluAspValGlySerAsnLys2025〈210〉3〈211〉35<212〉PRT<213>人<400>3AspAlaGluPheArgHisAspSerGlyTyrGluValHisHisGinLys151015LeuValPhePheAlaGluAspValGlySerAsnLysGlyAlalielie202530GlyLeuMet35<210〉4<211>226<212〉PRT〈213〉人工序列〈220〉<221〉PROPEP<222>(l)...(226)<223〉根據(jù)結(jié)合性質(zhì)而設(shè)計(jì)，以用作抗原肽載體和親和純化標(biāo)簽<400>4MetSerProlieLeuGlyTyrTrpLyslieLysGlyLeuValGinPro151015ThrArgLeuLeu20LeuGluTyrLeuGlu25GluLysTyrGluGlu30HisLeuTyrGluArg35AspGluGlyAspLys40TrpArgAsnLysLys45PheGluLeuGlyLeu50GluPheProAsnLeu55ProTyrTyrlieAsp60GlyAspValLysLeuThrGinSerMetAlalielieArgTyrlieAlaAspLysHisAsn65707580MetLeuGlyGlyCys85ProLysGluArgAla90GlulieSerMetLeu95GluGlyAlaValLeuAsplieArgTyrGlyValSerArglieAlaTyrSer100105110LysAspPheGluThrLeuLysValAspPheLeuSerLysLeuProGlu115120125MetLeuLysMetPheGluAspArgLeuCysHisLysThrTyrLeuAsn130135140GlyAspHisValThrHisProAspPheMetLeuTyrAspAlaLeuAsp145150155160ValValCeuTyrMetAspProMetCysLeuAspAlaPheProLysLeu165170175ValCysPheLysLysArglieGluAlalieProGinlieAspLysTyr180185190LeuLysSerSerLysTyrlieAlaTrpProLeuGinGlyTrpGinAla195200205ThrPheGlyGlyGlyAspHisProProLysSerAspLeuValProArg210215220GlySer225〈210〉5<211〉34<212>PRT<213>人工序列<220><221>PROPEP〈222〉(l)...(34)<223>根據(jù)細(xì)胞定位和表位性質(zhì)而設(shè)計(jì)，以用作免疫增強(qiáng)肽<400〉5AlalysPheValAlaAlaTrpTheLeuLysAlaAlaAlaGlyGlyGly151015GinTyrlieLysAlaAsnSerLysPhelieGlylieThrGluLeuAla202530AlaAla<210>6<211〉6〈212〉PRT<213〉人工序列<220〉<221>PEPTIDE<222〉(1)…(6)<223>根據(jù)性質(zhì)和極性而設(shè)計(jì)，以用作免疫增強(qiáng)肽<400>6LysLysLysLysLysLys5〈210〉7<211〉288〈212〉PRT<213>人工序列<220〉<221〉CHAIN<222〉(l)...(288)〈223〉根據(jù)細(xì)胞表位性質(zhì)而設(shè)計(jì)，以用作重組抗原蛋白〈400〉7MetSerProlieLeuGlyTyrTrpLyslieLysGlyLeuValGinPro151015ThrArgLeuLeuLeuGluTyrLeuGluGluLysTyrGluGluHisLeu202530TyrGluArgAspGluGlyAspLysTrpArgAsnLysLysPheGluLeu35404516GlyLeuGluPheProAsnLeuProTyrTyrlieAspGlyAspValLys505560l>euThrGinSerMetAlalielieArgTyrlieAlaAspLysHisAsn65707580MetLeuGlyGlyCysProLysGluArgAlaGlulieSerMetLeuGlu859095GlyAlaValLeuAsplieArgTyrGlyValSerArglieAlaTyrSer100105110LysAspPheGluThrLeuLysValAspPheLeuSerLysLeuProGlu115120125MetLeuLysMetPheGluAspArgLeuCysHisLysThrTyrLeuAsn130135140GlyAspHisValThrHisProAspPheMetLeuTyrAspAlaLeuAsp145150155160ValValLeuTyrMetAspProMetCysLeuAspAlaPheProLysLeu165170175ValCysPheLysLysArglieGluAlalieProGinlieAspLysTyr180185190LeuLysSerSerLysTyrlieAlaTrpProleuGinGlyTrpGinAla195200205ThrPheGlyGlyGlyAspHisProProLysSerAspLeuValProArg210215220GlySerAlalysPheValAlaAlaTrpTheLeuLysAlaAI3AlaGly225230235240GlyGlyGinTyrlieLysAlaAsnSerLsyPhelieGlylieThrGlu245250255LeuAlaAlaAlaAspAlsGluPheArgHisAspSerGlyTyrGluVal260265270HisHisGinLysLeuValPhePheAlaGluAspVaJGlySerAsnLys275280285<210〉8<211>261<212〉PRT<213>人工序列<220>〈221〉CHAIN<222〉(l)...(261)<223〉根據(jù)細(xì)胞表位性質(zhì)而設(shè)計(jì)，以用作重組抗原蛋白<400〉8MetSerProlieLeuGlyTyrTrpLyslieLysGlyLeuValGinPro151015丁hrArgLeuLeuLeuGluTyrLeuGluGluLysTyrGluGluHisLeu202530TyrGluArgAspGluGlyAspLysTrpArgAsnLysLysPheGluLeu354045GlyLeuGluPheProAsnLeuProTyrTyrlieAspGlyAspValLys505560LeuThrGinSerMetAlalielieArgTyrlieAlaAspLysHisAsn65707580MetLeuGlyGlyCysProLysGluArgAlaGlulieSerMetLeuGlu859095GlyAlaValLeuAsplieArgTyrGlyValSerArglieAlaTyrSer100105110LysAsp'PheGluThrLeuLysValAspPheLeuSerLysLeuProGlu115120125MetLeuLysMetPheGluAspArgLeuCysHisLysThrTyrLeuAsn130135140<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>260AlaGluPheArgHisAspSerGly275280GluPheArgHisAspSerGlyLys290295PheArgHisAspSerGlyLysLys305310ArgHisAspSerGlyLysLysLys325HisAspSerGlyLysLysLysLys340AspSerGlyLysLysLysLysLys355360SerGly370265270LysLysLysLysLysLysAspAla285LysLysLysLysLysAspAlaGlu300LysLys匕ysLysAspAlaGluPhe315320LysLysLysAspAlsGluPheArg330335LysLysAspAlaGluPheArgHis345350LysAspAlaGluPheArgHisAsp365<210〉10<211>376<212〉PRT<213〉人工序列<220〉<221〉CHAIN<222〉(l)...(376)<223>根據(jù)細(xì)胞表位性質(zhì)而設(shè)計(jì)，以用作重組抗原蛋白<400>10MetSer1ThrArgTyrGluGlyLeu50LeuThr65MetLeuGlyAlaLysAspMetLeu130GlyAsp145ValValValCysLeuLysThrPhe210GlySer225HisAspPheArgProLeuArg35GluGinGlyValPhe115LysHisLeuPheSer195GlyAspSerHislieLeu20AspPheSerGlyLeu100GluMetValTyrLys180SerGlyAlaGlyAspLeu5LeuGluProMetCys85AspThrPheThrMet165LysLysGlyGluAsp245SerGlyGluGlyAsnAla70ProlieLeuGluHis150AspArgTyrAspPhe230AlaGlyTyrTyrAspLeu55lieLysArgLysAsp135ProProlielieHis215ArgGluAspTrpLeuLys40ProlieGluTyrVal120ArgAspMetGluAla200ProHisPheAlaLysGlu25TrpTyrArgArgGly105AspLeuPheCysAla185TrpProAspArgGlulie10GluArgTyrTyrAla90ValPheCysMetLeu170lieProLysSerHis250PheLysLysAsnlielie75GluSerLeuHisLeu155AspProLeuSerGly235AspArgGlyTyrLysAsp60AlalieArgSerLys140TyrAlaGinGinAsp220AspSerHisLeuValGinPro15GluGluHisLeu30LysPheGluLeu45GlyAspValLysAspLysHisAsn80SerMetLeuGlu95lieAlaTyrSer110LysLeuProGlu125ThrTyrLeuAsnAspAlaLeuAsp160PheProLysLeu175lieAspLysTyr190GlyTrpGinAla205LeuValProArgAlaGluPheArg240GlyAspAlaGlu255AspSerGlyAsp260265270AlaGluPheArgHisAspSerGlyAspAlaGluPheArgHisAspSer275280285GlyAspAlaGluPheArgHisAspSerGlyAspAlaGluPheArgHis290295300AspSerGlyAspAlaGluPheArgHisAspSerGlyAspAlaGluPhe305310315320八rgHisAspSerGlyAspAlaGluPheArgHisAspSerGlyAspAla325330335GluPheArgHisAspSerGlyAspAlaGluPheArgHisAspSerGly340345350AspAlaGluPheArgHisAspSerGlyLysLysLysLysLysLysAsp355360365AlaGluPheArgHisAspSerGly370375〈210〉〈211〉〈212〉〈213〉〈220〉<221〉〈222〉〈223〉〈400〉atgtec11867DNA人工序列CDS(1)…(867)fusiongene11Met1actThrtatTyrggtGlyttaLeu65a>tgMetggaGlyLysatgMetggtGly145gttValSercgaArggagGluttgLeu50ThrttgLeugcgAla印cAspctgLeu130gatAspgttValcctProcttLeucgcArg35gagGlucagGinggtGlygttValtttPhe115ataetalieLeu5cttttgLeuLeu20gatAspLyscatHisttaLeutttPhetctSerggtGlyttgLeu100g犯GluatgMetgtaValtacTyrg朋GlucccProatgMettgtCys85gatAspactThrttcPheThratgMet165ggttatGlyTyrgaatatGluTyrggtgstGlyAsp￡L￡ltCttAsnLeu55gccateAlalie70ccaaaaProLysattagalieArgetc3fia>LeuLysgaagatGluAsp135catcctHisPro150gax:cc3AspProtggTrpcttLeu犯3Lys40cctProaaaLysg朋Glu25tggTrptatTyrattlie10g肌GlucgaArgtatTyrGlutacTyrgttVal120cgtArgcgtArgggtGly105gstAspttaLeugcaAla90gttValtttPhetgtCysgacttcatgAspPheMet犯gLys犯aLysggcGlytatTyratacgttatlieArgTyrlieatalie75g￡tgGlutegSercttLeuatgMettgcctgCysLeu170HisLys140ttgtatLeuTyr155gatgcgAspAlacttgtgLeuVala_a_c犯3AsnLysgaitAsp60getAlaattlie兆3ArgageSergasGlu犯gLys45ggtGlygscAspteaSerattlie3￡LgLys125ThrgacAspttcPheg鄧Glu30UtPhegatAsp卿LysatgMetgcaAla110etaLeutatTyrgetn丄dcca_Proc犯Gin15catHisg朋GlugttValHiscttLeu95tatTyrcccProttgLeuttgLeuLys犯cAsn80g肌GluagtSercctgaatProGlutta犯tLeuAsncttLeuLys175gettAsp160ttaLeu<formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula>ggtGly145gttVal130gatAspgttValcatHisttaLeugtttgttttValCysPhettgLeuacgThrggaGly225c肌Gin犯aLystttPhe210tecSeraaaLystecSer195ggtGlygatAspttgLeuValtacTyraaaLys180ageSer3CCestThrHis150MetAsp165犯scgtLysArg幼gtatLysTyrggtggcgacGlyGlyAspateattggalielieGlygcaAlagtgValetcLeu260gaattcGluPhe230ttctttPhePhe245atgtaaMet氺135cctgacttcProAspPheccaatgtgcProMetCysattgaagetlieGluAla185atagcatgglieAlaTrp200catcctccaHisProPro215cgtcatgacArgHisAspgcagaagatAlaGluAspatgttgMetLeu155ctggatLeuAsp170ateccalieProcctttgProLeu￡1￡ieitegLysSerteaggaSerGly235gtgggtValGly250140tatgacTyrAspgcgttcAIelPhec幼3ttGinliecagggcGinGly205gatctgAspLeu220tatgaaTyrGlutcs朋cSerAsngetcttgatAlaLeuAsp160ccaaaatta_ProLysLeu175gataagtacAspLysTyr190tggcaagccTrpGinAlagttccgcgtValProArggttcatcatValHisHis240aaaggtgcaLysGlyAla255〈210〉〈211〉〈212〉〈213〉〈220〉〈221>〈222〉〈223〉〈400〉atgtecMetSer1actcgaThrArg131113DNA人工序列CDS(1113)fusiongene13cctataetaggtProlietatgagTyrGluggtttgGlyLeu50ttaacaLeuThr65atgttgMetLeuggagcgGlyAlaaaag￡lc!>ysAspcttLeucgcArg35gsgGlucagGinggtGlygttValtttPhecttLeu20gatAsptttPhetctSerggtGlyttgLeu100g犯GluLeuGly5ttgg犯LeuGlug幼ggtGluGlyccc犯tProAsnatggccMetAla70tgtccaCysPro85gatattAsplieactetcThrLeutattggTyrTrptatcttTyrLeugatAspcttLeu55atelie二ys卿Arga肌LysLys40cctProliegagGlutacTyrgttValLysg肌Glu25tggTrpattlie10GlucgaArgtattatTyrTyrcgttatArgTyrcgtArgggtGly105gatAspAla90gttValtttPhe犯gggcLysGlyaaatatLysTyraacaaaAsn!>ysattgatlieAsp60atagetlieAla75gagattGlulieteg卿SerArgcttageLeuSercttgtgLeuValgaagagGluGlu30a>agtttLysPhe45ggtgatGlyAspga_c犯gAspLysteaatgSerMetattgcalieAla110aagetaLysl>eucaacccGinPro15catttgHisLeugaattgGluLeugttaaaValLysca_caacHisAsn80cttg犯LeuGlu95tatagtTyrSercctgaaProGlu22115atgctga犯MetLeuLys130ggtg3testGlyAspHis145gttgttttaValVslLeugtttgttttValCysPhettgaaatecLeuLysSer195￡LCgtttggtThrPheGly210ggatecgatGlySerAsp225卿gatgcaLysAspAlagatgcag幼AspAlaGlugcagaattcAlaGluPhe275gaattccgtGluPheArg290ttccgtcatPheArgHis305cgtcatgacArgHisAspcatgacteaHisAspSergacteaggaAspSerGly355teaggataaSerGly本370a_tgttcMetPhegta3ccValThrtacatgTyrMet165aaaLysLys180ageaagSerLysggtggcGlyGlygcag犯AlaGlugaattcGluPhe245ttccgtPheArg260cgtcatArgHiscatgacHisAspgacteaAspSerteaggaSerGly325ggaaagGlyLys340卿卿LysLys120g犯gatcgtGluAspArg135catcctg3CHisProAsp150gax;cca_EitgAspProMetcgtattgaaArglieGlutatTyrgacAspttcPhe230cgtArgatagcalieAla200catcctHisPro215cgtcatArgHiscatgacHisAspcatgacteaHisAspSertC3ggsSerGly280gga卿GlyLys295肌gaagLysLysgacAspteaSerggaGly310aagaagaagCysLysLysaagaagaagLysLysLysa^g犯gaagLysLysLys360ttatgtLeuCysttcatgPheMettgcctgCysLeu170getateAlalie185tggcctTrpProccaaaaProLysgacteaAspSerteaggaSerGly250ggaaagGlyLys265aag朋gLysLys卿卿LysLysaag朋gLysLys卿aagLysLys330犯gaagLysLys345aaggatLysAspcata3^3HisLys140ttgtatLeuTyr155gatgcgAspAlaCC3c犯ProGinttgcagLeuGinteggatSerAsp220ggaaagGlyLys235幼g犯gLysLys幼g犯gLysLysa^gaagLysLys卿卿LysLys300犯g卿LysLys315犯ggatLysAspgatgcaAspAlagcagaaAlaGlu125acatatttaaatThrTyrLeuAsn卵cgetAspAlattcccaPheProattgatlieAsp190ggctggGlyTrp205ctggttLeuValcttgatLeuAsp1603犯tt￡lLysLeu175aagtacLysTyrcaagccGinAlaccgcgtProArg幼g朋gaagaagLysLysCysLys240aag幼gaagaagLysLysLysLys255犯g卿LysLys270aag犯gLysLys285鄉(xiāng)gatLysAspAspAhgcagaaAlaGlugaattcGluPhe350ttccgtPheArg365卿geitLysAspgstgC3AspAlagcagaaAlaGlugaattcGluPhe320ttccgtPheArg335cgtcatArgHiscatgacHisAsp〈210〉14<211〉1128〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉<221〉CDS〈222〉(1〉...(1128)〈223〉fusiongene23，<400〉14atgteccctMetSerPro1actcgacttThrArgLeutatgagcgcTyrGluArg35ggtttggagGlyLeuGlu50ttaacacagLeuThrGin653tgttgggtMetLeuGlyggagcggttGlyAlaValLysAspatgctgMetLeu130ggtgatGlyAsp145gttgtttttPhe1153犯LyscatHisttaLeugtttgttttValCysPhettg犯aLeuLysacgtttThrPhe210ggatecGlySer225catgacHisAsptecSer195ggtGlygatAspteaSerttccgtcatPheArgHisgC3g33AlaGluggag3tGlyAsp290gactca_ttcPhe275ataetalieLeu5cttttgLeuLeu20g3tg犯AspGlutttcccPheProtctatgSerMetggttgtGlyCys85ttggatLeuAsp100gaaactGluThratgttcMetPhegtaaccValThrtacatgTyrMet1653犯3犯LysLys180age卿SerLysggtggcGlyGlygcaAla_GluggagatGlyAsp245gacteaAspSer260cgtcatArgHisggttatGlyTyrg3atatGluTyrggtg￡itGlyAspaatcttAsnLeu55gccateAlalie70CC33犯ProLysattagalieArgetca^aaLeuLysg幼gatGluAsp135catcctHisPro150ga_cccaAspProcgtattArglietatataTyrliegaccatAspHis215ttccgtPheArg230AlaGluggagatGlyAspgacteaAspSerAlagaattccgtcatGluPheArgHis295ggagatgcagaattctgg犯aattTrpLyslie10cttgaag犯LeuGluGlu25犯atggcgaLysTrpArg40ccttattatProTyrTyratacgttatlieArgTyrgagcgtgcaGluArgAla90tacggtgttTyrGlyVal105gttgattttValAspPhe120cgtttatgtArgLeuCysgacttcatgAspPheMetatgtgcctgMetCysLeu170g幼getateGluAlalie185gcatggcctAlaTrpPro200cctcca_aaa_ProProLyscatgacteaHisAspSerttccgtcatPheArgHis250gcag朋ttcAlaGluPhe265ggagatgcaGlyAspAla280gacteaggaAspSerGlyaagggcLysGly朋atatLysTyr肌caaaAsnLysattgatlieAsp60atagetlieAla75g鄧attGlulieteg卿SerArgcttageLeuSercatHisttgLeu155gatAsp犯aLys140tatTyrgcgAlaccacaaProGinttgcagLeuGintegSerggaGly235gacAspcgtArgGlugatAspcgtcatgacteagatAsp220gatAspteaSercatHisttcPheAla300cttgtgLeuValgaagsgGluGlu30aagtttLysPhe45ggtgstGlyAspg3C鄉(xiāng)AspLysteaatgSerMet￡lttgeslieAla110犯getaLysLeu125ThrTyrgacgetAspAlattcccaPheProattgatlieAsp190ggctggGly丁rp205ctggttLeuValgC￡Lg犯AlaGluggagatGlyAspgacteaAspSer270cgtcatArgHis285gaattcGluPhecaacccGinPro15catttgHisLeugaattgGluLeugttaaaValLysC3C犯cHisAsn80cttgaaLeuGlu95tatagtTyrSercctgaaProGluttaaatLeuAsncttgatLeuAsp1603肌ttaLysLeu175aagtacLysTyrc朋gccGinAlaccgcgtProArgttccgtPheArg240gcagaaAlaGlu255ggsg￡ltGlyAspgacteaAspSercgtcatArgHisgatgcagaattcAspSerGlyAspAlaGluPheArgHisAspSerGlyAspAlaGluPhe305310315320cgtcatgacteaggagatgcagaattccgtcatgacteaggagatgceiArgHisAspSerGlyAspAlaGluPheArgHisAspSerGlyAspAla325330335gaattccgtcatgacteaggagatgcagaattccgtcatgacteaggaGluPheArgHisAspSerGlyAspAlaGluPheArgHisAspSerGly340345350gatgcag幼ttccgtcatgacteaggaaagasg肪g卿卿aaggatAspAlaGluPheArgHisAspSerGlyLysLysLysI>ysLysLysAsp355360365gcagaattccgtcatgacteaggataaAlaGluPheArgHisAspSerGly*37037權(quán)利要求1、一種用于治療阿爾茨海默氏病的重組抗原蛋白，其特征在于包含1-20個免疫增強(qiáng)序列和1-20個人β-淀粉樣肽序列，其中任意二個序列間通過至少一個共價鍵相偶聯(lián)形成重組蛋白，所述的人β-淀粉樣肽序列選自SEQIDNO1、SEQIDNO2或SEQIDNO3所示的任一種氨基酸序列，所述的免疫增強(qiáng)序列選自下面所述的任一種氨基酸序列①SEQIDNO4；②SEQIDNO5；③SEQIDNO6；④與上述①、②或③至少90％同源的序列。2、如權(quán)利要求1所述的一種用于治療阿爾茨海默氏病的重組抗原蛋白，其特征在于共價鍵是肽鍵，任意二個氨基酸序列按頭-N末端、尾-C末端相連的方式形成。3、如權(quán)利要求1所述的一種用于治療阿爾茨海默氏病的重組抗原蛋白，其特征在于重組抗原蛋白的氨基酸序列如SEQIDN0:7所示。4、如權(quán)利要求1所述的一種用于治療阿爾茨海默氏病的重組抗原蛋白，其特征在于重組抗原蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:8所示。5、如權(quán)利要求1所述的一種用于治療阿爾茨海默氏病的重組抗原蛋白，其特征在于重組抗原蛋白的氨基酸序列如SEQIDN0:9所示。6、如權(quán)利要求1所述的一種用于治療阿爾茨海默氏病的重組抗原蛋白，其特征在于重組抗原蛋白的氨基酸序列如SEQIDN0:10所示。7、權(quán)利要求1-6任何一項(xiàng)所述的一種用于治療阿爾茨海默氏病的重組抗原蛋白在預(yù)防與治療阿爾茨海默氏病方面的應(yīng)用。8、一種編碼用于治療阿爾茨海默氏病重組抗原蛋白的融合基因，其特征在于包含1-20個拷貝的編碼免疫增強(qiáng)序列的DNA序列和1-20個拷貝的編碼人p-淀粉樣肽的DNA序列，其中任意二個DNA序列間是按相同密碼子閱讀框通過3'，5'磷酸二酯鍵融合連接的，其中所述的編碼人P-淀粉樣肽的DNA序列為編碼SEQIDNO:l、SEQIDN0:2或SEQIDN0:2的DNA序列，所述的編碼免疫增強(qiáng)序列的DNA序列選自選自下面所述的任一DNA序列①編碼SEQIDNO:4的DNA序列；'②編碼SEQIDNO:5的DNA序列；③編碼SEQIDN0:6的DNA序列;與上述①、②或③至少9(^同源的DNA序列；9、權(quán)利要求8所述的一種編碼用于治療阿爾茨海默氏病重組抗原蛋白的融合基因與pGEX-4T-1、pGEX-4T-2或pGEX-4T-3用于構(gòu)建重組表達(dá)載體。10、權(quán)利要求8所述的一種編碼用于治療阿爾茨海默氏病重組抗原蛋白的融合基因在預(yù)防與治療阿爾茨海默氏病方面的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明屬于免疫
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種用于預(yù)防與治療阿爾茨海默氏病(老年性癡呆癥)的重組抗原蛋白及編碼這種重組抗原蛋白的基因。重組抗原蛋白包含1-20個免疫增強(qiáng)序列和1-20個人β-淀粉樣肽序列，其中所述人β-淀粉樣肽序列具有SEQIDNO1.SEQIDNO2.或SEQIDNO3.所示的氨基酸序列；免疫增強(qiáng)序列選自SEQIDNO4.SEQIDNO5.或SEQIDNO6.序列，或與它們至少90％同源的氨基酸序列。本發(fā)明的重組抗原蛋白既除去了全長人Aβ的C端毒性片段，提高了Aβ的安全性，又重組了免疫增強(qiáng)序列，增強(qiáng)了Aβ的免疫原性。文檔編號C07K19/00GK101486768SQ20091006656公開日2009年7月22日申請日期2009年2月25日優(yōu)先權(quán)日2009年2月25日發(fā)明者崔理立,張應(yīng)玖,黃雪媚申請人:吉林大學(xué)