專利名稱：大環(huán)內(nèi)酯類化合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種抗生素，具體地說是一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。本發(fā)明還涉及這種抗 生素的制備方法。
(二)
背景技術(shù)：
目前，國內(nèi)外應(yīng)用廣泛的大環(huán)內(nèi)酯類農(nóng)用抗生素多拉菌素屬雙糖類化合物，是以環(huán)己氨 羧酸(cyclohexanecarboxylic)為前體，通過基因重組的阿維鏈霉菌(Wreptowycey flw,'w/"7/s yVE^"/06P)新菌株發(fā)酵而成的一種阿維菌素類抗生素，最早發(fā)現(xiàn)它驅(qū)殺寄生蟲的能力是在驅(qū) 鼠繼代的蛇形毛圓線蟲和殺兔癢螨的動物模型中(參見Goudie, AC.等人，F(xiàn)efen'"a 7 i^raw'to/ogy.49(1993)5-15)。多拉菌素為內(nèi)外兼殺劑，對線蟲、節(jié)肢動物均有良好的驅(qū)殺效果， 與市售的伊維菌素類產(chǎn)品比較，其抗生寄蟲范圍更廣泛、血藥濃度高峰維持時間更長、半衰 期也相對較長。而且多拉菌素在動物體內(nèi)持效時間更長，是目前最具有開發(fā)潛力的獸用抗寄 生蟲藥物之一。
(三)

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種具有強的抗寄生蟲及其蟲卵的活性，可用以控制動物體內(nèi)外寄 生蟲及其蟲卵生存的大環(huán)內(nèi)酯類化合物。 本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的 它的分子結(jié)構(gòu)如下
! H
OH
當X-Y...R為CH二C...H時為新化合物1的結(jié)構(gòu)；新化合物2的結(jié)構(gòu)特征是X-Y...R為 CH2-CH...OH。本發(fā)明的另一個目的是提供這種大環(huán)內(nèi)酯化合物的制備方法。 本發(fā)明涉及的化合物是采用這樣的方法來制備的.-
1、 發(fā)酵
(1) 發(fā)酵菌種發(fā)酵菌種是阿維鏈霉菌突變株(5^e/ Awy^ey mww/"to Wra/'" vV￡^f/ 由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生物化工實驗室提供，是于2009年03月11日保藏于"中國生物菌種保藏管 理委員會普通微生物中心"，保藏登記號為CGMCC N0.2943，命名為NEAU 1069
(5^repf纖yce5: averm/"7!'s )的菌株。
(2) 斜面培養(yǎng)采用YMS培養(yǎng)基(可溶性淀粉10g，酵母抽提物2g， KN03lg，瓊脂 20 g，蒸餾水1000ml， pH值7.0)于121。C下滅菌20 min，接菌后在28 。C下培養(yǎng)6-8 d;
(3) 種子培養(yǎng)培養(yǎng)基(葡萄糖20g，大豆粉15g，酵母粉5.0g，蒸餾水1000 ml， pH 值7.0)，用250 ml的三角瓶每瓶分裝25 ml，然后用10 ml無菌水將斜面的冰城鏈霉菌孢子 洗下并制成孢子懸浮液，使其濃度為Ixl07 lxl08個/ml。每瓶加2ml孢子懸浮液，置于搖 床上，轉(zhuǎn)速250r/min, 28。C培養(yǎng)24h;
(4) 發(fā)酵采用液體搖瓶發(fā)酵，培養(yǎng)基(玉米粉10%,大豆粉1%，棉花籽粉1%， a-淀粉 酶0.02%， NaCl 0.1%, K2HP04 0.2%， MgS04'7H20 0.1%， CaC03 0.7%，環(huán)己烷羧酸鹽0.1%, pH 7.0，加蒸餾水1000ml。于121。C下滅菌20min，分裝于1000ml三角瓶，每瓶100ml。接種 量8% (V/V)，搖床轉(zhuǎn)速250 r/min， 28 。C振蕩培養(yǎng)12-13 d。
2、 發(fā)酵液處理
(1) 發(fā)酵液經(jīng)100 200目篩網(wǎng)過濾后，濾渣用甲醇提取。
(2) 將得到的浸提液濃縮至一定體積后進行溶劑萃取，硅膠柱層析和RP-18層析后，得 到兩種無色的粉末狀化合物。
本發(fā)明還涉及結(jié)構(gòu)表征如下化合物化合物1
<formula>formula see original document page 5</formula>化合物1的物理化學(xué)性質(zhì)如下 性狀(Appearance):白色粉末 溶解性(Soliibility):易溶于氯仿、丙酮、甲醇 比旋度(Specific rotation): [a]g +123.86 (c 0.088， EtOH); 分子式(Molecular formula): C35H46O6
ESIMS w/z: 563 [M+H]+， High-resolution ESIMS: 585.3102 [M+Na]+ (calcd for C35H4606Na， 585.3187);
UV absorption spectrum Amax (EtOH) nm 0): 249 (37318) 283 (17828) 200 (67032); IR absorption spectrum: vmaxcm-1 3417,2927,2854,1706，1610, 1504,1450,1365,1278,1157,994; !H NMR (CDC13,400 MHz) (5 7.36 (1H， s， H-3) ， 6.56 (1H， s， H-6) ， 6.45 (1H， d， /=15.1， H-8) ， 6.08 (1H， dd， J=10.4， 25.5， H-9) ， 6.03 (1H， dd， J40.4， 24.9， H-10) ， 5.62 (1H， dd， J二9.9， 14.5， H-ll) ， 2.58 (1H， m， H-12) ， 4.04 (IH， brs， H-13) ， 5.29 (1H， brd， 7=10.8， H-15) , 2.31 (2H， m， H-16) ， 3.99 (IH， m， H-17) ， 0.88 (1H， q， /=12.1， H-18a) ， 1.98 (1H， m， H-18b) ， 5.56 (1H， m， H-19) ， 1.50 (IH， t， 7=11.8， H-20a) ， 2.02 (1H， m， H-20b) ， 5.53 (1H， dd， 7=2.4， 10.0， H-22) ， 5.72 (1H， dd， J=1.2， 9.9， H-23) ， 2.29 (1H， m， H-24) ， 3.32 (IH， d， J40.0， H-25) ， 1.53 (1H， m， H-26) ， 1.63 (1H， m， H-26a) ， 1.19-1.37 (IH， m， H-26b) ， 1.19-1.37 (1H， m， H-27a) ， 1.79-1.89 (1H， m， H-27b) ， 1.65 (2H， m， H-29) ， 1.19-1.37 (1H， m， H-30a) ， 1.79-1.89 (1H， m, H-30b) ， 1.48-1.63 (2H， m， H-31) ， 2.21 GH， s， H-32) ，1.22 (3H， d， J=6.9， H-33) ， 1.58 (3H， brs， H-34) ， 0.92 (3H， d，凡1， H-35);
13C NMR (CDC13, 100 MHz) (5 169.6 (s， C-l), 123.6 (S， C-2), 132.5 (d, C-3), 122.7 (s， C-4), 155.6 (s， C-5)， 115.3 (d, C-6), 137.1 (S， C-7)， 128.7 (d， C-8)， 134.4 (d, C-9)， 130.4 (d, C-10), 135.7 (d， C-ll)， 40.6 (d, C-12), 78.5 (d, C-13), 138.1 (s, C-14), 117.7 (d, C-15), 33.8 (t, C-16), 68.6 (d, C-17), 36.5 (t, C-18), 68.1 (d， C-19), 40.8 (t, C-20), 95.9 (d, C-21)， 128.0 (d， C-22)， 136.0 (d， C-23), 30.1 (d， C-24), 77.3 (d， C-25), 38.7 (d， C-26), 25.6 (t, C-27), 26.7 (t, C-28), 26.5 (t, C-29), 27.0 (t, C-30)， 31.6(t，C-31)， 15.3 (q， C-32)， 18.4 (q, C-33)， 14.8 (q, C-34)，16.6 (q, C-35);
本發(fā)明還涉及結(jié)構(gòu)表征如下化合物化合物27頁
化合物2的物理化學(xué)性質(zhì)如下-性狀(Appearance):白色粉末 溶解性(Solubility):易溶于氯仿、丙酮、甲醇 比旋度(Specific rotation): [a]g +66.35 (c 0.104， EtOH); 分子式(Molecular formula): C35H4807
ESIMS w/z: 581 [M+H]+， High-resolution ESIMS: 603.3292 [M+Na〗+ (calcd for C35H4807Na, 603.3292);
UV absorption spectrum Amax (EtOH) nm (￡): 250 (42540) 282 (21403) 200 (105206); IR absorption spectrum: VmaxCm" 3445,2928,2855,1699,1615, 1452,1382,1278,1163,994; 'HNMR(CDCl3,400 MHz) <5 7.37 (1H， s， H陽3) ， 6.56 (1H， s， H-6) ， 6.45 (IH， d， /=14.9， H-8) ， 6,05 (1H， dd， J二10.4， 25.4， H-9) ， 6.02 (1H， dd， J二10.4, 25.2， H-10) ， 5.61 (IH， dd， J:9.8， 14.4， H-ll) ， 2.58 (1H， m， H-12) ， 4.04 (IH， brs， H-13) ， 5.28 (1H， m， H-15) ， 2.31 (2H， m， H-16) ， 3.79 (1H， m， H-17)， 0.88 (1H， q， >/=12.0， H-18a) ， 1.96 (1H， m， H-18b) ， 5.48 (1H， m， H-19) ， 1.44
(1H， t， >/=11.8， H-20a) ， 1.97 (1H， m， H-20b) ， 1.65 (2H， m， H-22) ， 3.76 (IH， brs， H-23) ， 1.65 (1H， m， H-24) ， 3.41 (1H， d, J:10.7， H-25) ， 1.49 (IH， m， H-26) ， 1.58 (1H， m， H-27a) ， 1.20-1.29 (1H， m， H國27b) ， 1.19-1.30 (1H， m， H-28a) ， 1.77-1.87 (IH， m， H-28b) ， 1.67 (2H， m， H-29) ， 1.19-1.30 (1H， m， H-30a) , 1.77-1.87 (1H， m， H-30b) ， 1.50 (1H， m， H-31a) ， 1.63 (1H， m， H-31b)， 2.21 (3H， s， H-32) ， 1.20 (3H， d，凡9， H-33) ， 1.58 (3H， brs， H-34) ， 0.92
(3H， d， 7=6.9， H-35);
13
C NMR (CDC13, 100 MHz) (5 169.6 (s, C陽l), 123.6 (S， C-2), 132.6 (d， C-3)， 122.9 (s， C-4), 155.9
7
三H陽7)， 128.8 (d， C-8), 134.3 (d, C-9), 130.4 (d, C-10), 135.7 (d, C-ll), 40.6 (d, C-12)， 78.3 (d, C陽13)， 138.6 (s， C-14), 117.0 (d， C-15), 33.6 (t， C-16), 68,6 (d, C-17), 36.2 (t, C-18), 67.3 (d， C-19), 41.1 (t， C-20), 99.9 (d, C-21)， 41.0 (d, C-22)， 70.3 (d, C-23), 35.1 (d, C-24), 72.5 (d, C-25), 38.1 (d， C-26) , 24.5 (t, C-27), 26.6 (t, C-28), 26.5 (t, C-29)， 26.9 (t, C-30), 31.2(t,C-31)，15.4(q, C-32)，18.5 (q, C-33)，14.8 (q, C-34)，13.6 (q, C-35);
采用本發(fā)明的方法得到的化合物具有強的殺螨活性，能殺滅，例如寄生在果樹、蔬菜和
花上的四爪螨屬、全爪螨屬和銹螨屬的成螨和卵。它們對于寄生于動物身上的硬蜱科、皮刺
螨科和疥螨科也有活性。它們還能殺滅動物體內(nèi)外寄生物，如對牛體內(nèi)的奧氏奧斯特線蟲、 琴形奧斯特線蟲、柏氏血矛線蟲捻轉(zhuǎn)血矛線蟲、似血矛線蟲、艾氏毛圓線蟲、蛇形毛圓線蟲、 腫空古柏線蟲、點狀古柏線蟲櫛狀古柏線蟲、匙形古柏線蟲、菇拉巴德古柏線蟲、牛仰口線 蟲、乳突類圓線蟲和輻射食道口線蟲等的成蟲及幼蟲均顯示驅(qū)蟲活性對豬蛔蟲、齒食道口
線蟲、長溝球首線蟲、豬毛首線蟲、蘭氏類圓線蟲、豬肺線蟲、豬腎蟲、鮑杰氏線蟲等具有 很好的驅(qū)除效果。對綿羊消化道線蟲包括毛圓線蟲、夏伯特線蟲、奧斯特線蟲、馬歇爾線蟲、
鈍刺細頸線蟲、毛首線蟲、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲驅(qū)凈率為95%。 具體實施例方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明
1、 化合物制備發(fā)酵
(1) 種子培養(yǎng)培養(yǎng)基(葡萄糖20g，大豆粉15g，酵母粉5.0g，蒸餾水1000ml， pH 值7.0)，用250 ml的三角瓶每瓶分裝25 ml，然后用10 ml無菌水將斜面的冰城鏈霉菌孢子 洗下并制成孢子懸浮液，使其濃度為Ixl07 lxl08個/ml。每瓶加2ml孢-了懸浮液，置于搖 床上，轉(zhuǎn)速250r/min, 28。C培養(yǎng)24h;
(2) 發(fā)酵采用液體搖瓶發(fā)酵，培養(yǎng)基(玉米粉10%，大旦粉1%，棉花籽粉1%， 《-淀粉酶0.02%， NaCl 0.1%， K2HP04 0.2%, MgS04'7H20 0.1%, CaC03 0.7%，環(huán)己垸羧酸鹽 0.1%, pH 7.0，加蒸餾水1000ml。于121。C下滅菌20 min，分裝于1000 ml三角瓶，每瓶100 ml。接種量8% (V/V)，搖床轉(zhuǎn)速250 r/min， 28 。C振蕩培養(yǎng)12-13 d。
2、 化合物的分離
30L發(fā)酵液經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾，并且用水清洗慮餅，發(fā)酵液和清洗用的水全都棄掉，用 10L甲醇浸提過濾后得到的濾渣，通過減壓蒸餾的方法最后將甲醇溶液濃縮到大約2L，再 將濃縮液用相同體積的EtOAc浸提3次，將得到的EtOAc相減壓蒸餾會產(chǎn)生20 g油狀物質(zhì)。
將所得油狀物上硅膠柱(粒徑200 300目)進行層析，分別用石油醚乙酸乙酯=9:1- 5:5 兩種洗脫液混合進行梯度洗脫，得到了五個組分，將組分二上RP-18硅膠柱進行層析，n用甲醇水=80:20-95:5 二種洗脫液混合進行梯度洗脫，會得到化合物1 (18mg);將組分三上 RP-18硅膠柱進行層析，用甲醇水=70:30-卯:10 二種洗脫液混合進行梯度洗脫,會得到化合 物2 (15mg)。
其中化合物l的結(jié)構(gòu)式為
OH
3、抗蟲活性測定
對豬體內(nèi)外寄生蟲及其蟲卵的觸殺作用
將100頭斷奶仔豬分為五組，分別進行如下處理。第一組為高劑量組，皮下注射劑量為400
嗎/kg;第二組為中劑量組，皮下注射劑量為300嗎/kg;第三組為低劑量組200嗎/kg;第四組 為對照組，不做任何處理。依試驗前后豬體內(nèi)外寄蟲(卵)罹患數(shù)量進行比較來確定新化合物 對驅(qū)殺豬休內(nèi)線蟲和體外血虱的效果。依據(jù)豬再感染寄生蟲的時間，確定藥物在豬體內(nèi)的殘 效期。
…三llu
ol三-:
.o
9化合物1和新化合物2在以300 ^g/kg的計量下能夠有效驅(qū)殺豬體內(nèi)線蟲和體外血虱。對 抑制線蟲感染長達25 d，對血虱抑制長達98 d。
權(quán)利要求
1、一種大環(huán)內(nèi)酯類化合物，其特征在于大環(huán)內(nèi)酯類化合物的結(jié)構(gòu)圖為當X-Y...R為CH＝C...H時為化合物1的結(jié)構(gòu)；當X-Y...R為CH2-CH...OH時為化合物2的結(jié)構(gòu)
2、 一種制備權(quán)利要求l所述的大環(huán)內(nèi)酯類化合物的制備方法，其特征是制備化合物l和化 合物2的方法為將來源于產(chǎn)多拉菌素的細胞株，即由阿維鏈霉菌基因工程變異株(5^戶towycM avmm力'fo Wra/w A^L4" ^69)，是于2009年03月11日保藏于"中國生物菌種 保藏管理委員會普通微生物中心"，保藏登記號為CGMCC N0.2943，命名為NEAU1069 (5^^tow;;c^ m^7m力'fo)的菌株，經(jīng)斜面培養(yǎng)、種子培養(yǎng)、搖瓶發(fā)酵、分離純化而得。
3、 根據(jù)權(quán)利要求書2所述的大環(huán)內(nèi)酯類化合物的制備方法，其特征是所述的斜面培養(yǎng)為-培養(yǎng)基的組成包括可溶性淀粉20 g、 KN03 1 g、 K2HPO40.5 g、 MgS04'7H20 0.5 g、 FeS04'7H20 0.01 g、瓊脂20 g和蒸餾水1000 ml， pH值7.2 7.4，于1><105 Pa下滅菌30 min，接菌后在 28 32'C下培養(yǎng)4d。
4、 根據(jù)權(quán)利要求書2所述的大環(huán)內(nèi)酯類化合物的制備方法，其特征是所述的種子培養(yǎng)為 培養(yǎng)基的組成包括葡萄糖5 10g、可溶性淀粉5 10g、牛肉膏5 10g、蛋白胨10 18g、 氯化鈉5 8 g和蒸餾水1000 ml， pH值7.2，用250 ml的三角瓶每瓶分裝100 ml，然后用1 ml 無菌水將斜面的冰城鏈霉菌孢子洗下并制成孢子懸浮液，使其濃度為1><106 1><107個/1111，每 瓶加1 ml孢子懸浮液，置于搖床上28 32t:培養(yǎng)24 36 h。
5、 根據(jù)權(quán)利要求書2所述的大環(huán)內(nèi)酯類化合物的制備方法，其特征是所述的搖瓶發(fā)酵為-采用液體搖瓶發(fā)酵，培養(yǎng)基組成為小米10 30 g加蒸餾水1000 ml煮沸15 min后濾去米粒， 加入葡萄糖15 30g、碳酸鈣2 15g、氯化鈉5 12g和蛋白胨5 15 g， pH值7.2 7.4， 于lx105 Pa下滅菌30 min，分裝于250 ml三角瓶，每瓶20 100ml，按體積比的接種量為 10%，搖床轉(zhuǎn)速150 240r/min， 28 32。C振蕩培養(yǎng)4 5 d。
6、 根據(jù)權(quán)利要求書2所述的大環(huán)內(nèi)酯類化合物的制備方法，其特征是所述的分離和提存的 方法為發(fā)酵液經(jīng)100 200目篩網(wǎng)過濾后，濾渣用甲醇提取，提取液濃縮至一定體積后用 EtOAc萃取，將萃取夜?jié)饪s后依次進行硅膠柱層析，RP-18柱層析所得到的化合物，得到兩 種無色的粉末狀化合物1和化合物2。
7、 根據(jù)權(quán)利要求書6所述的大環(huán)內(nèi)酯類化合物的制備方法，其特征是所述的硅膠層析用到 的填料是200-300目的硅膠，流動相為石油醚和乙酸乙酯按不同比例混合進行梯度洗脫。
8、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備權(quán)利要求1所述的大環(huán)內(nèi)酯類化合物的制備方法，其特征是 所述的RP-18是使用混合溶劑，即80:20-95:5和70:30-90:10的甲醇與水溶液進行梯度洗脫的。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種大環(huán)內(nèi)酯類化合物及其制備方法。本發(fā)明的化合物是由阿維鏈霉菌基因工程變異株(Streptomyces avermitilis strain NEAU 1069)加入環(huán)己烷基羧酸后生物合成獲得的一種十六元環(huán)內(nèi)酯類化合物，發(fā)酵液經(jīng)過濾后，濾渣用甲醇提取，提取液濃縮至一定體積后用EtOAc萃取，將萃取夜?jié)饪s后依次進行硅膠柱層析，RP-18柱層析所得到的化合物。本發(fā)明的化合物具有強的抗動物體內(nèi)外寄生蟲的活性，可用以控制動物體內(nèi)外寄生蟲及其蟲卵生存，對綿羊消化道線蟲包括毛圓線蟲、夏伯特線蟲、奧斯特線蟲、馬歇爾線蟲、鈍刺細頸線蟲、毛首線蟲、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲驅(qū)凈率為95％。
文檔編號C07D493/20GK101619067SQ200910071629
公開日2010年1月6日 申請日期2009年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月25日
發(fā)明者向文勝, 玲 姜, 明 王, 王相晶 申請人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)