專利名稱：一種青楊天牛中腸總rna的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種昆蟲中腸RNA的提取方法。
背景技術(shù)：
核酸提取是分子生物學(xué)試驗(yàn)的基礎(chǔ)，高質(zhì)量的核酸是進(jìn)行分子標(biāo)記、基因 克隆及基因表達(dá)研究等下游技術(shù)的必要前提。但是目前，用于昆蟲中腸RNA 提取的方法主要有異硫氰酸胍法和Trizol法，而這些方法卻存在操作復(fù)雜、費(fèi) 時、成本高及提取RNA產(chǎn)量低、易降解的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是為了解決現(xiàn)有昆蟲中腸RNA的提取方法存在操作復(fù)雜、費(fèi) 時、成本高及提取RNA產(chǎn)量低、易降解的問題，而提供一種青楊天牛中腸總 RNA的提取方法。
青楊天牛中腸總RNA的提取方法按以下步驟實(shí)現(xiàn) 一、將500 700|iL 的2xCTAB緩沖液與0.5 1.0 mg的聚乙烯聚吡咯烷酮加入到1.5 mL的 Eppendorf離心管中混勻，在液氮環(huán)境中，將青楊天牛中腸研磨后加入到 Eppendorf離心管中，混勻；二、將Eppendorf離心管置于溫度為5S 65。C的 水浴10min;三、將500|iL 700nL的氯仿/異戊醇加入到Eppendorf離心管中， 在離心速度為10000 13000r/min的條件下，離心處理5min;四、取離心上清 液并放入新Eppendorf離心管后，重復(fù)步驟三；五、取步驟四離心后上清液并 放入另一個新Eppendorf離心管中，然后加入體積為500 700 pL、摩爾濃度 為5mol/L的LiCl溶液，在溫度為-4"C的條件下靜置沉淀15min，而后在離心 速度為10000 13000r/min的條件下，離心處理5 min;六、棄掉上清液再用 質(zhì)量濃度為75%的乙醇清洗沉淀，而后離心處理30s;七、棄掉步驟六的上清 液，然后將乙醇蒸發(fā)后加入40 jliL的無菌水，即可提取出青楊天牛中腸總RNA; 其中步驟三中氯仿/異戊醇中氯仿與異戊醇按體積比24:l的體積比混合；步驟 二水浴過程中震蕩2 3次/min。本發(fā)明青楊天牛中腸總RNA的提取方法具有操作快速簡便，省時省錢， 成功率高，適用范圍廣，不存在降解問題，對設(shè)備和試劑的要求不高，卻能夠 得到高純度、產(chǎn)量高且完整的昆蟲RNA。


圖1是采用具體實(shí)施方式
九提取方法與與采用異硫氰酸胍法和Trizol法提 取方法得到的青楊天牛中腸總RNA瓊脂糖凝膠電泳示意圖，圖1中"1"為采 用異硫氰酸胍法提取RNA產(chǎn)物，"2"為采用Trizol法提取RNA產(chǎn)物，"3" 為采用具體實(shí)施方式
十提取RNA產(chǎn)物；圖2以采用具體實(shí)施方式
九提取的青 楊天牛中腸總RNA為模板擴(kuò)增CYP4502個基因的片段示意圖，圖2中"1" 與"2"均為以青楊天牛中腸總RNA為模板擴(kuò)增的CYP450產(chǎn)物，M為DL2000。
具體實(shí)施例方式
具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式青楊天牛中腸總RNA的提取方法按以下步 驟實(shí)現(xiàn)——、將500 700iaL的2xCTAB緩沖液與0.5 1.0 mg的聚乙烯聚 吡咯垸酮加入到1.5mL的Eppendorf離心管中混勻，在液氮環(huán)境中，將青楊天 牛中腸研磨后加入到Eppendorf離心管中，混勻；二、將Eppendorf離心管置 于溫度為55 65。C的水浴10min;三、將500jiL 700|iL的氯仿/異戊醇加入 到Eppendorf離心管中，在離心速度為10000 13000r/min的條件下，離心處 理5min;四、取離心上清液并放入新Eppendorf離心管后，重復(fù)步驟三；五、 取步驟四離心后上清液并放入另一個新Eppendorf離心管中，然后加入體積為 500 700 pL、摩爾濃度為5mol/L的LiCl溶液，在溫度為-4"C的條件下靜置 沉淀15min，而后在離心速度為10000 13000 r/min的條件下，離心處理5 min; 六、棄掉上清液再用質(zhì)量濃度為75%的乙醇清洗沉淀，而后離心處理30s;七、 棄掉步驟六的上清液，然后將乙醇蒸發(fā)后加入40nL的無菌水，即可提取出青 楊天牛中腸總RNA;其中步驟三中氯仿/異戊醇中氯仿與異戊醇按體積比24:1 的體積比混合；步驟二水浴過程中震蕩2 3次/min。
本實(shí)施方式步驟一中青楊天牛中腸由采自哈爾濱市呼蘭地區(qū)青楊天牛解 剖得到的。
本實(shí)施方式中所用到的試劑均購自哈爾濱伊事達(dá)生物有限公司。本實(shí)施方式提取的青楊天牛中腸總RNA置于冰箱中在溫度為-4(TC的條 件下保存。
具體實(shí)施方式
二本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟一中 2xCTAB緩沖液中Tris-HCl的濃度為100 mmol/L、 EDTA的為20 mmol/L 、 NaCl的濃度為1.4mol/L、 CTAB的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2% 3% 、 P-巰基乙醇的體積 分?jǐn)?shù)為0.4%和聚乙烯聚吡咯烷酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí) 施方式一相同。
具體實(shí)施方式
三本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟一中 2xCTAB緩沖液中Tris-HCl的濃度為100 mmol/L、 EDTA的為20 mmol/L 、 NaC 1的濃度為1.4mol/L、 CTAB的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2% 、 p-巰基乙醇的體積分?jǐn)?shù) 為0.4%和聚乙烯聚吡咯烷酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方 式一相同。
具體實(shí)施方式
四本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟二水浴過程 中震蕩2次/min。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
五本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一至三不同的是步驟二中本 實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟一中步驟一中將600pL的2xCTAB 緩沖液與0.7 mg的聚乙烯聚吡咯垸酮加入到1.5 mL的Eppendorf離心管中混 勻。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一至三相同。
具體實(shí)施方式
六本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
五不同的是步驟二中將 Eppendorf離心管置于溫度為6(TC的水浴中。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
五相同。
具體實(shí)施方式
七本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一、二、三或六不同的是步 驟三中離心速度為12000 r/min。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一、二、三 或六相同。
具體實(shí)施方式
七本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟四中離心速 度為12000r/min。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
八本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟五中離心速 度為12000 r/min。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
九本實(shí)施方式青楊天牛中腸總RNA的提取方法按以下步 驟實(shí)現(xiàn) 一、將60(HiL的2xCTAB緩沖液與0.8mg的聚乙烯聚吡咯垸酮加入 到1.5 mL的Eppendorf離心管中混勻，在液氮環(huán)境中，將青楊天牛中腸研磨后 加入到Eppendorf離心管中，混勻；二、將Eppendorf離心管置于溫度為60°C 的水浴10min;三、將600)iL的氯仿異/戊醇加入到Eppendorf離心管中，在離 心速度為12000r/min的條件下，離心處理5min;四、取離心上清液并放入新 Eppendorf離心管后，重復(fù)步驟三；五、取步驟四離心后上清液并放入另一個 新Eppendorf離心管中，然后加入體積為600 pL、摩爾濃度為5mol/L的LiCl 溶液，在溫度為-4'C的條件下靜置沉淀15min，而后在離心速度為12000 r/min 的條件下，離心處理5min;六、棄掉上清液再用質(zhì)量濃度為75%的乙醇清洗 沉淀，而后離心處理30s;七、棄掉步驟六的上清液，然后將乙醇蒸發(fā)后加入 40 pL的無菌水，即可提取出青楊天牛中腸總RNA;其中步驟三中氯仿/異戊 醇中氯仿異與戊醇按體積比24:1的體積比混合；步驟二水浴過程中震蕩2次 /min。
采用本實(shí)施方式提取的方法提取的青楊天牛中腸總RNA與采用異硫氰酸 胍法和Trizol法提取的青楊天牛中腸總RNA瓊脂糖凝膠電泳(電泳圖為0.8% 瓊脂糖凝膠)示意圖，如圖1所示，從圖1中可以看出本實(shí)施方式提取的RNA 產(chǎn)物均比異硫氰酸胍法和Trizol法提取的RNA產(chǎn)物的得率高和產(chǎn)物的完整性 好。
以采用本實(shí)施方式提取的青楊天牛中腸總RNA為模板擴(kuò)增CYP4502個基 因的片段示意圖，如圖2 (電泳圖為1%瓊脂糖凝膠)所示，從圖2中可以看 出擴(kuò)增條帶均整齊、明亮、清晰。
DL2000購自上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。
權(quán)利要求
1、一種青楊天牛中腸總RNA的提取方法，其特征在于青楊天牛中腸總RNA的提取方法按以下步驟實(shí)現(xiàn)一、將500～700μL的2×CTAB緩沖液與0.5～1.0mg的聚乙烯聚吡咯烷酮加入到1.5mL的Eppendorf離心管中混勻，在液氮環(huán)境中，將青楊天牛中腸研磨后加入到Eppendorf離心管中，混勻；二、將Eppendorf離心管置于溫度為55～65℃的水浴10min；三、將500μL～700μL的氯仿/異戊醇加入到Eppendorf離心管中，在離心速度為10000～13000r/min的條件下，離心處理5min；四、取離心上清液并放入新Eppendorf離心管后，重復(fù)步驟三；五、取步驟四離心后上清液并放入另一個新Eppendorf離心管中，然后加入體積為500～700μL、摩爾濃度為5mol/L的LiCl溶液，在溫度為-4℃的條件下靜置沉淀15min，而后在離心速度為10000～13000r/min的條件下，離心處理5min；六、棄掉上清液再用質(zhì)量濃度為75％的乙醇清洗沉淀，而后離心處理30s；七、棄掉步驟六的上清液，然后將乙醇蒸發(fā)后加入40μL的無菌水，即可提取出青楊天牛中腸總RNA；其中步驟三中氯仿/異戊醇中氯仿與異戊醇按體積比24∶1的體積比混合；步驟二水浴過程中震蕩2～3次/min。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種青楊天牛中腸總RNA的提取方法，其特征 在于步驟一中2xCTAB緩沖液中Tris-HCl的濃度為100 mmol/L、 EDTA的為 20 mmol/L 、 NaCl的濃度為1.4mol/L、 CTAB的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2% 3% 、 |3-巰基乙醇的體積分?jǐn)?shù)為0.4%和聚乙烯聚吡咯烷酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1 —或2所述的一種青楊天牛中腸總RNA的提取方法，其 特征在于步驟一中將600pL的2xCTAB緩沖液與0.7 mg的聚乙烯聚吡咯烷酮 加入到1.5 mL的Eppendorf離心管中混勻。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種青楊天牛中腸總RNA的提取方法，其特征 在于步驟二中將Eppendorf離心管置于溫度為6(TC的水浴中。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1、 2或4所述的一種青楊天牛中腸總RNA的提取方法， 其特征在于步驟三中離心速度為12000 r/min。
全文摘要
一種青楊天牛中腸總RNA的提取方法，它涉及一種昆蟲中腸RNA的提取方法。它解決了現(xiàn)有昆蟲中腸RNA的提取方法存在操作復(fù)雜、費(fèi)時、成本高及提取RNA產(chǎn)量低、易降解的問題。方法一、先將2×CTAB緩沖液、聚乙烯聚吡咯烷酮加入離心管中，再加入經(jīng)液氮研磨后的青楊天牛中腸混勻；二、將離心管進(jìn)行熱水浴處理；三、將氯仿/異戊醇加入到離心管進(jìn)行離心處理；四、取上清液后重復(fù)步驟三；五、取步驟四離心后的上清液加LiCl溶液并冷卻、靜置后再離心；六、棄掉上清液并用乙醇清洗后進(jìn)行離心；七、棄掉步驟六的上清液后將乙醇蒸發(fā)然后加入無菌水。本發(fā)明方法操作簡潔，省時，成本低，成功率高并能夠得到較高純度、較高產(chǎn)量、不易降解的完整昆蟲RNA。
文檔編號C07H21/00GK101538301SQ200910071938
公開日2009年9月23日 申請日期2009年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月30日
發(fā)明者關(guān)樺楠, 姚大彬, 佳 宇, 李曉燦, 遲德富 申請人:東北林業(yè)大學(xué)