專利名稱：：抗菌肽lfb-me及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種抗菌肽及其制備方法。
背景技術(shù)：
：抗菌肽是動物體內(nèi)抵御外界微生物侵害、清除體內(nèi)突變細(xì)胞的一類小分子多肽。抗菌肽具有廣譜抗菌、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫與消炎等多種生物學(xué)功能，同時具有無毒性、無耐藥性、無殘留與污染等優(yōu)點(diǎn)，而且其熱穩(wěn)定性好，有希望成為新一代的抗菌劑，這些肽類抗菌物質(zhì)顯示了在醫(yī)學(xué)、畜牧、獸醫(yī)及其食品行業(yè)上潛在的研究和應(yīng)用價值，近年來對抗菌肽的研究與開發(fā)成為研究熱點(diǎn)。然而，與抗生素相比，抗菌肽的活性，尤其是抗菌活性不夠理想，尋求功能理想、活性更強(qiáng)的抗菌肽是抗菌肽研究的熱點(diǎn)問題。目前，在眾多抗菌肽中，陽離子型的牛乳鐵蛋白素(LfcinB)和天蠶素A(CecropinA，CA)是常見的兩種抗菌肽，但是依然存在抗菌活性不高的問題。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是為了解決現(xiàn)有抗菌肽的抗菌活性不高的問題，而提供抗菌肽LFB-ME及其制備方法?？咕腖FB-ME的氨基酸序列為PheLysCysArgArgTrpGlnTrpArgTrpLysLysLeuGlyAl化ysTrpLysLeuPheLysLysIle。制備抗菌肽LFB-ME的方法按以下步驟進(jìn)行一、將牛乳鐵蛋白素的活性中心氨基酸序列中第10位氨基酸Met替換為Trp，然后與天蠶素A的活性中心氨基酸序列進(jìn)行雜合，再采用多肽合成儀進(jìn)行固相化學(xué)法合成，得肽樹脂；二、肽樹脂經(jīng)TFA切割后，得多肽，然后采用反相高效液相色譜進(jìn)行純化，即完成抗菌肽的制備；其中步驟一中牛乳鐵蛋白素的活性中心氨基酸序列為PheLysCysArgArgTrpGlnTrpArgMetLysLysLeuGlyAla;步驟一中天蠶素A的活性中心氨基酸序列為LysTrpLysLeuPheLysLysIle步驟一固相化學(xué)法合成中所用固相載體為Wang樹脂(王樹脂)，單體為Fmoc-氨基酸(9-芴甲氧羰基-氨基酸)，縮合劑為DCC(N，N'-二環(huán)己基碳二亞胺)，活化劑為H0Bt(N-羥基苯并三氮唑)，F(xiàn)moc脫除劑為體積濃度20%的六氫吡啶二氯甲烷溶液。本發(fā)明中制備抗菌肽的操作方法簡單，所得抗菌肽LFB-ME對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌和鼠傷寒沙門氏菌具有抑制作用，與牛乳鐵蛋白素和天蠶素A相比，抗菌活性有了明顯提高，且無溶血毒性和動物毒性，是一種健康安全、具有更好抗菌活性的抗菌肽。圖1為具體實(shí)施方式二中抗菌肽的質(zhì)譜圖。具體實(shí)施例方式具體實(shí)施方式一本實(shí)施方式抗菌肽LFB-ME的氨基酸序列為PheLysCysArgArgTrpGlnTrpArgTrpLysLysLeuGlyAlaLysTrpLysLeuPheLysLysIle。具體實(shí)施方式二本實(shí)施方式制備抗菌肽LFB-ME的方法按以下步驟進(jìn)行一、將牛乳鐵蛋白素的活性中心氨基酸序列中第10位氨基酸Met替換為Trp，然后與天蠶素A的活性中心氨基酸序列進(jìn)行雜合，再采用多肽合成儀進(jìn)行固相化學(xué)法合成，得肽樹脂；二、肽樹脂經(jīng)TFA切割后，得多肽，然后采用反相高效液相色譜進(jìn)行純化，即完成抗菌肽的制備；其中步驟一中牛乳鐵蛋白素的活性中心氨基酸序列為PheLysCysArgArgTrpGlnTrpArgMetLysLysLeuGlyAla;步驟一中天蠶素A的活性中心氨基酸序列為LysTrpLysLeuPheLysLysIle;步驟一固相化學(xué)法合成中所用固相載體為Wang樹脂，單體為Fmoc-氨基酸，縮合劑為DCC，活化劑為H0Bt，F(xiàn)moc脫除劑為體積濃度20%的六氫吡啶二氯甲烷溶液。本實(shí)施方式中Wang樹脂、Fmoc-氨基酸、DCC和HOBt按體積比1:3:4:l混合。本實(shí)施方式具體操作步驟如下抗菌肽LFB-ME的氨基酸序列為N-PheLysCysArgArgTrpGlnTrpArgTrpLysLysLeuGlyAlaLysTrpLysLeuPheLysLysIle-C。1、制備從C端到N端逐個進(jìn)行，由多肽合成儀自動控制。首先將Fmoc-Ile接入Wang樹脂，脫去Fmoc基團(tuán)得lie-Wang樹脂；在lie-Wang樹脂上再鏈接FmOC-LyS-Trt-0H(9-芴甲氧羰基-三苯基-賴氨酸)，再脫去Fmoc基團(tuán)；依次從C端到N端逐個進(jìn)行，至反應(yīng)結(jié)束，得脫去Fmoc基團(tuán)的側(cè)鏈保護(hù)的肽樹脂(具體操作步驟見多肽合成儀操作指南)。2、在肽樹脂中，加入切割試劑，在2(TC避光條件下攪拌反應(yīng)2h，過濾，濾液保留待用；沉淀用TFA(三氟乙酸)洗滌2次，然后將洗液與濾液混合，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，再加入510倍體積的預(yù)冷無水乙醚，-2(TC下沉淀3h，析出白色粉末狀物，以4000r/min離心10min，收集沉淀，然后用無水乙醚洗滌沉淀，真空干燥，得多肽；其中切割試劑由TFA、水和TIS(三異丙基氯硅烷)按質(zhì)量比95:2.5:2.5混合而成。3、用0.2mol/L硫酸鈉(磷酸調(diào)pH5.0)平衡柱30min，用90%乙腈水溶液溶解多肽，過濾，C18反相常壓柱，采用梯度洗脫(洗脫劑為甲醇和硫酸鈉水溶液按體積比30:7070:30混合而成)，流速lml/min，檢測波220nm，收集主峰，凍干；再利用高壓反相C18柱進(jìn)一步純化，洗脫液A為0.1%TFA/水溶液；洗脫液B為0.1%TFA/乙腈溶液，洗脫梯度為25%B40%B，洗脫時間為12min，流速為lmL/min，其余條件同上，收集主峰，凍干，得抗菌肽。4、鑒定制備的抗菌肽LFB-ME經(jīng)質(zhì)譜分析，抗菌肽LFB-ME在質(zhì)譜圖(圖1)中顯示的分子量為3121.91D，與理論分子量3121.8D基本一致，抗菌肽LFB-ME的純度大于98%;色譜條件PhenomenexC18(250mmX4.6mm)柱，洗脫劑為10%40%甲醇(0.1%)，流速lml/min，檢測波長220nm，應(yīng)用電噴霧質(zhì)譜法測定肽的分子量。本實(shí)施方式中所用試劑均為購買得到?？咕腖FB-ME的體外抗菌活性檢測，用LfcinB和CecropinA作為對照體外抗菌活性檢測分別采用金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌和鼠傷寒沙門氏菌；5mlMH液體培養(yǎng)基37°C、180r/min下培養(yǎng)過夜，得培養(yǎng)物，然后用無菌的MHB培養(yǎng)基將培養(yǎng)物稀釋至2X105CFU/ml7X1()5CFU/ml，得菌液；用0.01%乙酸(0.2%BSA)稀釋得到系列10倍測試濃度的抗菌肽LFB-ME溶解液；將菌液分別加到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每行的1號孔至11號？L每孔100iU;12號孔不加菌液，而是加入100iU的新鮮MHB培養(yǎng)基作為參比對照。1號孔至10號孔對應(yīng)添加11iU的抗菌肽LFB-ME溶解液(11號孔不加抗菌肽LFB-ME溶解液，作為對照)；將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于37。C恒溫培養(yǎng)18_24h，調(diào)整轉(zhuǎn)速100-200r/min，然后用酶標(biāo)儀在490nm波長下進(jìn)行吸光度檢測，比11號孔低的吸光度低50%以上的孔內(nèi)的抗菌肽LFB-ME溶解液的濃度即定義為抗菌肽LFB-ME溶解液對該菌的最小抑菌濃度(MIC)。LfcinB和CecropinA的體外抗菌活性檢測方法同上。檢測結(jié)果如表1所示，抗菌肽LFB-ME的抗菌活性明顯提高。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>抗菌肽LFB-ME的體外溶血活性檢測，檢測用血液樣品取自正常人血液，檢測步驟如下新鮮血液900Xg離心10min，棄上清。加入5倍PBS，懸浮，900Xg離心lOmin，重復(fù)洗滌三次。加入11.5倍PBS懸浮，制成8X(v/v)血細(xì)胞懸浮液。取100iU血細(xì)胞懸浮液，加入lOOiU含有一定濃度抗菌肽的PBS，37。C培養(yǎng)lh。加入空白PBS和O.1%TritonX100處理組作為陰性和陽性對照。lOOOXg離心lOmin，將上清轉(zhuǎn)移制96孔培養(yǎng)板，414nm測定吸光值。檢測結(jié)果為，在256g/ml濃度下沒有溶血活性?？咕腖FB-ME的動物體內(nèi)急性毒性試驗(yàn)采用昆明白小鼠40只，雌雄各半，體重25士0.28g，按照lmg/kg劑量肌肉注射抗菌肽LFB-ME，每日一次，連續(xù)7天，觀察小鼠毒性反應(yīng)，結(jié)果表明，肌注抗菌肽LFB-ME7天后，小鼠無異常反應(yīng)，活動正常，60只小鼠全部存活，證明抗菌肽LFB-ME無毒副作用。序列表〈110〉東北農(nóng)業(yè)大學(xué)〈120〉抗菌肽LFB-ME及其制備方法〈160>3〈210>1〈211>15〈212>PRT〈213〉人工序列〈220〉〈223〉牛乳鐵蛋白素的活性中心氨基酸序列。〈400〉1PheLysCysArgArgTrpGinTrpArgMetLysLysLeuGlyAla151015〈210>2〈211>8〈212>PRT〈213〉惜古比天蠶(Hyalophora)〈220〉〈223〉天蠶素A的活性中心氨基酸序列。<400>2LysTrpLysLeuPheLysLyslie15〈210>3〈211>23〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉抗菌肽LFB-ME氨基酸序列?！?00>3PheLysCysArgArgTrpGinTrpArgTrpLysLysLeuGlyAlaLys151015TrpLysLeuPheLysLyslie20權(quán)利要求抗菌肽LFB-ME，其特征在于抗菌肽LFB-ME氨基酸序列為PheLysCysArgArgTrpGlnTrpArgTrpLysLysLeuGlyAlaLysTrpLysLeuPheLysLysIle。2.制備如權(quán)利要求1所述的抗菌肽LFB-ME的方法，其特征在于制備抗菌肽LFB-ME的方法按以下步驟進(jìn)行一、將牛乳鐵蛋白素的活性中心氨基酸序列中第lO位氨基酸Met替換為Trp，然后與天蠶素A的活性中心氨基酸序列進(jìn)行雜合，再采用多肽合成儀進(jìn)行固相化學(xué)法合成，得肽樹脂；二、肽樹脂經(jīng)TFA切割后，得多肽，然后采用反相高效液相色譜進(jìn)行純化，即完成抗菌肽的制備；其中步驟一中牛乳鐵蛋白素的活性中心氨基酸序列為PheLysCysArgArgTrpGlnTrpArgMetLysLysLeuGlyAla;步驟一中天蠶素A的活性中心氨基酸序列為LysTrpLysLeuPheLysLysIle;步驟一固相化學(xué)法合成中所用固相載體為Wang樹脂，單體為Fmoc-氨基酸，縮合劑為DCC，活化劑為H0Bt，F(xiàn)moc脫除劑為體積濃度20%的六氫吡啶二氯甲烷溶液。全文摘要抗菌肽LFB-ME及其制備方法，它涉及一種抗菌肽及其制備方法。它解決了現(xiàn)有抗菌肽的抗菌活性不高的問題。抗菌肽LFB-ME的氨基酸序列為PheLysCysArgArgTrpGlnTrpArgTrpLysLysLeuGlyAlaLysTrpLysLeuPheLysLysIle。方法一、將牛乳鐵蛋白素的活性中心氨基酸序列中第10位氨基酸Met替換為Trp，然后與天蠶素A的活性中心氨基酸序列進(jìn)行雜合，用多肽合成儀進(jìn)行固相化學(xué)法合成得肽樹脂；二、經(jīng)TFA切割后得多肽，反相高效液相色譜進(jìn)行純化。本發(fā)明所得抗菌肽LFB-ME的抗菌活性有明顯提高，且無溶血毒性和動物毒性。文檔編號C07K1/00GK101717450SQ20091007325公開日2010年6月2日申請日期2009年11月24日優(yōu)先權(quán)日2009年11月24日發(fā)明者馮興軍,宋雪瑩,李靜,趙曉宇,郭佳音申請人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)