專利名稱：：Bt蛋白Cry30Ga1、其編碼基因及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種新的Bt蛋白及其編碼基因和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：在人類生產(chǎn)過程中，蟲害是造成農(nóng)業(yè)生產(chǎn)損失及影響人類健康的重要因素，據(jù)FAO統(tǒng)計，全世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)每年因蟲害造成的經(jīng)濟損失高達14%，病害損失達12%，草害損失達11%。損失額高達1260億美元，相當(dāng)于中國農(nóng)業(yè)總產(chǎn)值的一半，英國的4倍多。另外，蚊媒病在預(yù)防醫(yī)學(xué)中占有重要位置，其中登革熱和黃熱病等蚊媒病傳播力強、流行面廣、發(fā)病率高、危害性大。據(jù)WHO統(tǒng)計，全世界每年感染登革熱人數(shù)多達8000萬，我國的海南省在1980和1986年曾經(jīng)暴發(fā)過兩次登革熱，發(fā)病分別達到437469例和113589例。登革熱和黃熱病主要由埃及伊蚊傳播。為了減少這些損失，多年來，對農(nóng)作物害蟲及蚊蟲普遍釆用化學(xué)防治手段進行防治，但由于化學(xué)農(nóng)藥的長期、大量使用，造成了對環(huán)境的污染，農(nóng)副產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留量增加，給人類的生存和健康帶來了危害。此外，化學(xué)農(nóng)藥在殺滅害蟲的同時，也殺傷了天敵及其它有益物，破壞了生態(tài)平衡。與化學(xué)防治相比，生物防治具有安全、有效、持久的特點。并且避免了化學(xué)防治帶來的一系列問題。因此，生物防治技術(shù)成了人們研究的熱點。在生物殺蟲劑中，蘇云金芽孢桿菌是目前世界上用途最廣、產(chǎn)量最大的一類微生物殺蟲劑。蘇云金芽孢桿菌(5a"'〃wf/zwr/wg/em^，簡禾爾Bt)是一種革蘭氏陽性細菌，它的分布極為廣泛，在芽孢形成的同時可形成具有殺蟲活性的由蛋白質(zhì)組成的伴胞晶體，又名殺蟲晶體蛋白(Insectididalcrystalproteins,簡稱ICPs),ICPs是由ctj基因編碼的，對敏感昆蟲有強烈毒性，而對高等動物和人無毒性。近幾十年來，Bt已廣泛應(yīng)用于控制多種鱗翅目、雙翅目、鞘翅目等害蟲。此外，Bt還對膜翅目、同翅目、直翅目、食毛目等多種害蟲及植物病原線蟲、螨類、原生動物有控害作用。目前在農(nóng)田害蟲、森林害蟲及衛(wèi)生害蟲的防治中Bt已成為化學(xué)合成農(nóng)藥的有力替代品，Bt還是轉(zhuǎn)基因抗蟲工程植物重要的基因來源。自1981年Schnepf從菌株HD-lDipel中克隆了第一個能表達殺蟲活性的基因以來(AdangMJea/,Characterizedfull-lengthandtruncatedplasmidclonesofthecrystalproteinofBa"7/附A,'"g/e服Ssubsp.HD-73andtheirtoxicitytoManducasexta,Gene，1985,36(3):289-300.)，人們已經(jīng)分離克隆了390多種編碼殺蟲晶體蛋白的基因，根據(jù)編碼的氨基酸序列同源性它們被分別確定為不同的群、亞群、類和亞類(CrickmoreN,ZeiglerDR，F(xiàn)eitelsonJ,wa/.RevisionofthenomenclaturefortheBac/〃ws//7,'"g7.e服'spesticidalcrystalproteins.MicrobiolMolBiolRev,1998,62:807-813;http:yVwww.biols.susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bl/)。一般而言,Cryl,Cry2和Cry9等毒蛋白對鱗翅目害蟲有效；其中研究的最多的是Cryl和Cry9類蛋白，它們編碼的殺蟲晶體蛋白分子量為130-140kD，許多基因目前已被廣泛應(yīng)用于植物的鱗翅目害蟲的防治(Kozie,M.G.，Beland,G.L.,Bowman,C.，a/.FieldperformanceofelitetransgenicmaizeplantsexpressinganinsecticidalproteinderivedfromSa"7/ws^z鵬,"g/e服^.Bio/Technology,1993，11:194-200;Perlak,F.J.,Deaton，R.W.,Armstrong,T.A.，a/.Insectresistantcottonplants,bio/technology，1990;8:939-943;VanFrankenhuyzen,K.,Gringorten,L.，andGauhier,D.1997.Cry9Caltoxin,a^3"7/ms^2訓(xùn)Vg/e服^insecticidalcrystalproteinwithhighactivityagainstthesprucebudworm(Choristoneurafnniferana).Appl.Environ,Microbviol.63:4132-4134;王飛，2001，蘇云金芽孢桿菌特異菌株生物學(xué)特性及co;9新基因的研究，碩士論文，南開大學(xué))。蘇云金芽胞桿菌以色列亞種(及^2Mr/"g7,era^subsp.bae/em&,簡稱Bti)產(chǎn)生的毒素蛋白對紋蟲具有很好殺蟲活性，被廣泛運用于紋蟲的防治(GoldbergLJ,andMargalitJ,1977.Abacterialsporedemonstratingrapidlarvicidalactivityagainst勘op/ze/esserge油7,t/rawotoew.a謂gM/cw/ato，CWexUesaegy-，andCw/exp—ms.MosqitoNews,37:355-358;)。同時，Cyt蛋白具有溶細胞性，對某些Cry蛋白具有增效作用及延緩昆蟲的抗性(Wu,D.,Johnson,J.J.,andFederici,B.A.1994.SynergismofmosquitocidaltoxicitybetweenCytAandCryIVDProteinsusinginclusionsproducedfromclonedgenesofSaCs^zMr/"gz'ew^.Mol.Microbiol.13:965-972;Wirth，M.C.:Georghiou，G.P.,andFedereci,B.A.1997.CytAenablesCrylVendotoxinsof5ac/〃船//zMn77g/e服^toovercomehighlevelsofCrylVresistanceinthemosquito,CWex《m—w咖:s"cz'a加.Proc.Natl.Acad.Sci.94:10536—10540)自本世紀初發(fā)現(xiàn)蘇云金芽胞桿菌至今己有100多年的歷史，在農(nóng)作物和園藝植物害蟲、森林害蟲以及衛(wèi)生害蟲的防治方面得到廣泛的應(yīng)用，也起到良好的效果。但是，由于大規(guī)模和反復(fù)使用蘇云金芽胞桿菌，許多昆蟲種群己相繼在不同程度上對殺蟲晶體蛋白產(chǎn)生了抗性。以Bt殺蟲晶體蛋白為基礎(chǔ)的殺蟲劑的使用已有50多年的歷史，最初一直沒有檢測到昆蟲對Bt的抗性，但是，上世紀80年中期開始，抗性問題不斷在實驗室及田間試驗中得到證實(McGanghey,W.H.1985.Insectresistancetothebiologicalinsecticide^/Cs/^鵬7g7em7、.Science.229:193-195),原因主要是持續(xù)使用單品種及亞致劑量的Bt以及Bt轉(zhuǎn)基因抗蟲植物的應(yīng)用造成昆蟲種群長期受到殺蟲劑的選擇壓力。1985年，McGaughey報道倉庫谷物害蟲印度谷螟(Plodiainterpunctella)在Dipel(Btsubsp.kurstaikHD-1的商品制劑)的選擇壓力下，繁殖155代后，抗性增加97倍；在高劑量選擇壓力下，抗性可增加250倍。1990年，在夏威夷首次證實大田中的小菜蛾對Bt殺蟲劑產(chǎn)生了明顯的抗性(Tabashnik,B.E.,Finson，N.，Groeters,F.R.,"a/.1994.Reversalofresistanceto5acz'〃ws^zi/〃.wg/e"s/w."戶/MZe〃flxj/o^e〃a.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.91:4120-4124)，上世紀90年代以來，在我國應(yīng)用Bt殺蟲劑時間較長的深圳、廣州、上海等地，發(fā)現(xiàn)Bt殺蟲劑對小菜蛾防治效果明顯下降，意味著抗性已經(jīng)形成(馮夏.1996.廣東小菜蛾對蘇云金桿菌的抗性研究.昆蟲學(xué)報,39(3):238-244;Hofte，H.,VanRie，J.，Jansens,S,，VanHoutven,A.,Vanderbruggen，H.,andVaeck,M.,1988.Monoclonalantibodyanalysisandinsecticidalspectrumofthreetypesoflepidopteran-specificinsecticidalcrystalproteinsofSa"'〃ws^z,'wg/em7.s.App1.Environ.Microbiol.54:2010-2017)。目前發(fā)現(xiàn)在實驗室及田間至少有十幾種昆蟲對Bt及其殺蟲晶體蛋白產(chǎn)生了抗性，用選擇壓力數(shù)學(xué)模型預(yù)測到，在Bt轉(zhuǎn)基因抗蟲植物選擇壓力的條件下，昆蟲將會產(chǎn)生抗性(Schnepf,E.,Crickmore，N.，VanPie,J"etal.1998.Sacz'/to^z鵬'Mgz-ms7ianditspesticidalCrystalproteins.Microbiol.Mol.Biol.Rev.65(3):775-806)。另外，有研究證明Bti在大田的使用中尚未發(fā)現(xiàn)抗性問題(RegisL,a/.,2000.TheuseofbacteriallarvicidesinmosquitoandblackflycontrolprogramsinBrazil.Mem./"W似toO^vra/t/oCVwz，95:207-210.),但是紋蟲對其抗性問題不斷在實驗室中得到證實，這種情況也可能會在大田中出現(xiàn)(GeorghiouGP,andWirthMC，1997.Influenceofexposuretosingleversusmultipletoxinsof5ac涯"http://wn'wg/em^subsp./srae/e願iondevelopmentofresistanceinthemosquitoCWex《m—w咖sc/aft"'(Diptera:Culicidae).￡""v/rawwewto/M;'cra6z'o/ogy,63:1095-1101.)。為避免抗性昆蟲所造成的損失，尋找新的高毒力基因資源是解決這個問題的有效途徑，這對我國的生物防治有著十分重要的意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的第一個目的在于針對上述不足提供一種新的BT毒力蛋白資源。本發(fā)明的第二個目的在于提供編碼所述蛋白的基因。本發(fā)明的目的還在于提供上述蛋白及基因的應(yīng)用。本發(fā)明從四川省成都平原土壤中分離得到的蘇云金芽孢桿菌(5acz'〃M^^zM"力gz'em^)新菌株HS18-1。通過對HS18-1的毒力測試表明，HS18-1對鱗翅目害蟲、雙翅目害蟲等等，均具有極高的毒力。根據(jù)C7;y30f基因保守序列設(shè)計1對特異引物，擴增其基因組DNA,結(jié)果表明該菌株存在co;Mf基因，進一步設(shè)計其全長基因引物，克隆得到cr少305a基因，其核苷酸序列如序列表SEQIDNo.l所示，序列SEQIDNOl的全長為1995bp,分析表明，GC含量為32.53%,編碼664個氨基酸組成的蛋白。經(jīng)測定，其氨基酸序列如SEQIDN02所示。在softberry網(wǎng)站釆用bacterialsigma7.0promoter禾呈序?qū)θ虼醮邕M行預(yù)測表明，在基因編碼區(qū)上游含有RNA聚合酶活化位點的序列,將其命名為c^30Ga/。本發(fā)明進一步分析了Cry30Gal蛋白的氨基酸組成(見表1)。表1Cry30Gal蛋白的氨基酸組成<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)本發(fā)明公開的氨基酸序列，在不影響其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一個或幾個氨基酸，得到所述蛋白的突變序列。例如在非活性區(qū)段，將第390位的Tyr替換為Pro。因此，本發(fā)明Bt蛋白還包括SEQIDNo.2所示氨基酸序列經(jīng)取代、替換和/或增加一個或幾個氨基酸，具有Cry30Gal蛋白同等活性的由Cry30Gal衍生得到的蛋白質(zhì)。本發(fā)明基因包括編碼所述蛋白的核酸序列。此外，應(yīng)理解，考慮到密碼子的簡并性以及不同物種密碼子的偏愛性，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要使用適合特定物種表達的密碼子。本發(fā)明的基因和蛋白質(zhì)可以從菌株HS18-1中克隆或分離得到，或者通過DNA或肽合成的方法得到?？蓪⒈景l(fā)明基因與表達載體可操作地連接，得到能夠表達本發(fā)明蛋白的重組表達載體，進而可以通過諸如農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法、花粉管通道法等轉(zhuǎn)基因方法，將所述表達載體導(dǎo)入宿主，得到轉(zhuǎn)co;MGa/基因的轉(zhuǎn)化體，例如農(nóng)作物或者果樹等植物，使其具備抗蟲活性。此外，還可以通過發(fā)酵本發(fā)明菌株HS18-1，得到含有Cry30Gal蛋白的發(fā)酵液，將其制備成殺蟲劑，用于農(nóng)作物害蟲的防治。本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以將上述基因轉(zhuǎn)化細菌或真菌，通過大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)本發(fā)明Bt蛋白。本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以根據(jù)本發(fā)明公開的基因，將其轉(zhuǎn)化棉花、玉米、水稻、蔬菜等農(nóng)作物，使其具備相應(yīng)的抗蟲活性。從而降低農(nóng)藥的使用量，減少環(huán)境污染，具有重要的經(jīng)濟價值和應(yīng)用前景。圖1顯示的是cryWGa/全長基因克隆，其中M,marker;1,cod(9Ga/基因。圖2顯示的是重組質(zhì)粒pET-30Ga的酶切鑒定圖譜，其中1重組質(zhì)粒pET-30Ga;2,用AWeI雙酶切pET-30a;3,7WfeI+￡coRI雙酶切pET-30Ga;4，插入的DNA;Ml、M2為Marker。圖3顯示的是在co//BL21(DE3)中表達Qy30Gal的SDS-PAGE檢測，其中M為蛋白marker;1.陰性對照(co/iBL21(DE3)(pET-30a));2.裂解上清；3.Cry30Gal包涵體。具體實施例方式以下實施例進一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實施例1c/j^GVi/基因的克隆本發(fā)明從四川省成都平原土壤中分離得到的蘇云金芽孢桿菌(5acz'〃M5Awn'"g/era^)新菌株，該菌株已于2008年10月21曰在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址北京巿朝陽區(qū)大屯路甲3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)保藏，分類命名為蘇云金芽孢桿菌(5acz'〃MS^2Mn'wg/era^)，保藏號為CGMCCNo.2817。本例通過如下方法克隆得到codOGa7基因的全長序列。釆用基因組DNA純化試劑盒(購自賽百盛公司)提取菌株HS18-1的總DNA。設(shè)計引物序列如下P1:5，ATGAATTTATATCAAAATGAAAATGA3，P2:5'TTAGTTCATTTTACAAGCTTCTACAC3'PCR反應(yīng)體系10xbuffer2.5(ilMgCl2(25mM)1.5(ilTaq酶0.2|ildNTPs(2.5mM)模板最終反應(yīng)體積2(il2|il5|il25|il熱循環(huán)反應(yīng)94。C預(yù)變性5min;94。C變性lmin,52。C退火，72。C延伸2min，30個循環(huán)；72'C延伸5min;4匸停止反應(yīng)。擴增反應(yīng)產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上電泳，置凝膠成像系統(tǒng)中觀察PCR擴增結(jié)果。結(jié)果如圖1所示，通過擴增得到了約為2000bp的序列，將該序列進行測序，其核苷酸序列如SEQIDNo.l所示，與目的序列一致。實施例2co^OGa/基因的表達及殺蟲活性測定根據(jù)0G"基因開放閱讀框兩端序列，設(shè)計并合成一對特異性引物cry30F:5'陽GCGCATATG(層I)ATGAAGCCGTATCAAAGTG-3';cry30R:5'-CGGAATTCCEcoRI)TTAGTTCATTTTACAAGCTTCTACAC-3'，分別在5，端引物M/el和&oRI酶切位點。以BtMC28質(zhì)粒為模板進行擴增，擴增的產(chǎn)物釆用M/el和五coRI進行雙酶切，酶切產(chǎn)物與同樣進行雙酶切后的載體pET-30a(+)連接，轉(zhuǎn)化￡.co/ZDH5a感受態(tài)細胞，提取其質(zhì)粒酶切電泳驗證了插入片斷大小符合預(yù)期目的后(圖2)，再轉(zhuǎn)入受體菌Eco/Z.BL21(DE3)。將重組質(zhì)粒命名為pET-30Ga,含重組質(zhì)粒的重組子命名為￡.co//.BL21(30Ga)。SDS-PAGE分析表明co;MGa基因的表達產(chǎn)物在菌體超聲破碎后的沉淀中(圖3)，分子量約為76kDa左右，與預(yù)測的蛋白分子量相符。c^30G"基因表達產(chǎn)物分別對甜菜夜蛾，棉鈴蟲及伊蚊的生測結(jié)果表明表達產(chǎn)物對這三種蟲都具有較好的殺蟲活性。對甜菜夜蛾殺蟲活性最高，ZG。為19.82昭/mL;對伊蚊的丄G為21.27嗎/mL;對棉鈴蟲殺蟲活性最低，丄C^為34.03嗎/mL。蛋白對鱗翅目殺蟲活性的的測定方法參見(SongFP,ZhangJ，GuAX,etal"2003.Identificationofcr_y//-typegenesfrom5acz7/ws^zMn'"g/em^strainsandcharacterizationofanovelcrj^-typegene.Appl.Environ.Microbiol69:5207-5211),蛋白對雙翅目殺蟲活性的的測定方法參見(IbarraJE，delRinc6nMC,SergioOrdiiz,etal.,2003.DiversityofSac/〃ws^z,'"g/em^StrainsfromLatinAmericawithInsecticidalActivityagainstDifferentMosquitoSpecies.ApplEnvironMicrobiol69:5269-5274)。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>859095teateaSerSerlielie100cctProtttPhecttLeutggTrpccaPro105gagGluAsna肌actThrattlie110atalietggTrp336gaagagGluGlutttPhe115acaThrcatHis卿ArggggGlyLeu120犯cAsncttLeulieArgPro125gaaGluctgLeuThr384ccagcaProAla130g朋GlulieGlulieal3lie135Leu肌cAsncctProetcs船140ggaGlytctSertacTyr犯tAsn4-32gcattaAlaLeu1,15cgtArgGluGinctgLeu150gtgValaatAsntttPhegagGlu卿Arg155g觀GlutttPhegcaAla工letggTrp160480gecggtAlaGlygC3AlaLysAsn165Ginget.AlaactThrThrgggGly170gatAspUaLeuLeu卿Arg兆3175lie528teagetSerAlaliegaaGlu180ggtGlygetAlalielieGin185cttLeuAsnc犯G]nLeu190ThrVal576agegaaSerGlugetAla195朋tAsn肌gLyscctProgcaAlaLeu200etcLeuagtSeretcLeutatTyrgcaAla205CMGin3CCThrAla624aatattAsnlie210AspLeuatalieLeuttcPhe215Gin卿ArgggcGlygecAlaLys220tatTyrggaGlygatAspg肌Glu672tgggC3TrpAla225LystacTyrgetAlacgcArg230Asnc犯GincccProaitsliecctPro235PheLysThrtca_SerArg240720gaatattatgcateattaatag肌aaaa肌acttatactaa_tgat768GluTyrTyrAlaSer乙eulieGluLyslieLysThrTyrThrAsnAsp245250255￡ittgcaggaseatst3g3ggtttaaat朋aate肌3sa^tata816lieAlaGlyThrTyrArgAsnGlyLeuAsnLyslieLysAsnlieGin260265270aatateteatgggatactttcaatgaatatcgtagagggatgacteta864-AsnlieSerTrpAspThrPheAsnGluTyrArgArgGlyMetThrLeu275280285agtgcattagatttagttgcattattcccaaattacgatatatgtatt9丄2SerAlaLeuAspLeuValAlaLeuPheProAsnTyrAsplieCyslie290295300tatcca_atacaaacaaaaa_cagaacttactagaaa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10〉5<211〉28<212〉DNA<213>人工序列<400〉520gcgcatatgatgaagccgtatcaaagtg<210>6〈211〉34〈212〉DNA<213〉人:[:序列<400〉6cggaattcttagttcattttacaagcttctacac權(quán)利要求1、一種Bt蛋白Cry30Ga1，其氨基酸序列是1)SEQIDNo.2所示的氨基酸序列；或2)SEQIDNo.2所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個或多個氨基酸且具有同等活性的蛋白。2、編碼權(quán)利要求l所述蛋白的基因。3、如權(quán)利要求2所述的基因，其核苷酸序列如SEQIDNo.l所示。4、含有權(quán)利要求2或3所述基因的表達載體。5、由權(quán)利要求4所述表達載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。6、如權(quán)利要求5所述的宿主細胞，其為植物宿主細胞。7、含有權(quán)利要求所述蛋白的殺蟲劑。8、權(quán)利要求2或3所述基因或權(quán)利要求4所述表達載體在制備轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。9、權(quán)利要求2或3所述基因或權(quán)利要求4所述表達載體在提高植物抗蟲性中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明提供了一種新的Bt蛋白Cry30Ga1及其編碼基因，所述蛋白具有SEQIDNo.2所示的氨基酸序列，或SEQIDNo.2所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個或多個氨基酸且具有同等活性的蛋白。本發(fā)明蛋白可以用于制備Bt殺蟲劑，所述基因可以轉(zhuǎn)化棉花、玉米、水稻、蔬菜等農(nóng)作物，使其具備相應(yīng)的抗蟲活性，從而降低農(nóng)藥的使用量，減少環(huán)境污染，具有重要的經(jīng)濟價值和應(yīng)用前景。文檔編號C07K14/325GK101531712SQ20091008159公開日2009年9月16日申請日期2009年4月13日優(yōu)先權(quán)日2009年4月13日發(fā)明者劉懷年,軍朱,平李,李雙成,王世全,王玲霞,鄧其明,鄭愛萍申請人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)