專利名稱：一種蛋白質(zhì)工程長效多聚體藥物技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物、醫(yī)藥一蛋白質(zhì)工程藥物領(lǐng)域，涉及一種通過基因工程改造的 長效多聚體蛋白多肽類藥物的研制技術(shù)。
背景技術(shù)：
世界上第一家生物技術(shù)制藥公司成立于1971年。20世紀80年代初，以干擾素、人 生長激素為代表的一大批通過重組DNA技術(shù)開發(fā)的蛋白多肽類生物工程藥品給人類的一 些難治性疾病提供了有效的治療手段。經(jīng)過30多年的長足發(fā)展，蛋白多肽類藥物已成為國 際醫(yī)藥市場上最重要的藥物種類之一。蛋白多肽類藥物與化學合成藥物相比，具有毒副作 用小、用量少、療效好等特點。據(jù)來自國外的報道，2005年以來，全球蛋白質(zhì)類藥物市場總銷 售額均占當年全球醫(yī)藥市場10%的份額。目前已經(jīng)上市的生物技術(shù)藥物主要含3大類，即重組治療蛋白質(zhì)、重組疫苗和診 斷或治療用的單克隆抗體。蛋白質(zhì)類藥物以抗腫瘤藥物的數(shù)量最多(約占已上市蛋白質(zhì)類 藥物總數(shù)量的1/3)，而單克隆抗體類藥物銷售額則占抗腫瘤蛋白質(zhì)類藥物的50%。由美國 安進公司生產(chǎn)的AraneSp(促紅素的第二代產(chǎn)品)則高居全球蛋白質(zhì)類藥品銷售排行榜的 首位。隨著現(xiàn)代生物藥學的發(fā)展，人們對藥物安全及毒副作用的關(guān)注，蛋白多肽類藥物 的研究也越來越受到重視。但是蛋白多肽類藥物存在的問題也日益突出，如給藥系統(tǒng)的 不完善，物理化學穩(wěn)定性差，在體內(nèi)半衰期短，生物利用率低，生物活性低，藥代動力學性質(zhì) 差，需要頻繁給藥等，從而給患者帶來了不便和經(jīng)濟上的巨大負擔。因此長效基因工程蛋白 多肽類藥物的開發(fā)已成為生物醫(yī)藥領(lǐng)域的開發(fā)熱點。長效制劑采用適當?shù)霓k法延緩藥物在機體內(nèi)吸收、分布、代謝和排泄的過程，從而 使藥效延長。蛋白多肽類藥物的長效性的研究通過重組融合、重組改構(gòu)、化學修飾等途徑使 現(xiàn)有產(chǎn)品在安全性(副作用更小)、有效性、長效性(半衰期延長，減小劑量和使用次數(shù))等 方面優(yōu)于原有制品，不但解決以上問題，而且能推動新的蛋白多肽類藥物的應(yīng)用開發(fā)，使一 些由于半衰期短、副作用大而無法進入實際應(yīng)用的藥物獲得理想的臨床效果(如抗腫瘤藥
寸J o蛋白多肽類藥物的長效性的研究基本遵循下列三種解決途徑1尋找一條蛋白多肽類藥物高生物利用率的給藥途徑；(李近等，長效載藥微粒研 究進展，精細化工，2006 ；蔡波濤等，靶向長效納米粒的研究現(xiàn)狀及展望，數(shù)理醫(yī)藥學雜志， 2009 年)藥物微粒指直徑在微米或納米級的載藥粒子，包括微球、微囊、納米粒、脂質(zhì)體、微 乳等微型載體。長效微粒可使藥物在幾周或幾個月內(nèi)以一定速率釋放，以維持有效血藥濃 度，減少給藥次數(shù)，提高療效，減少不良反應(yīng)。而且可以通過微粒表面和粒徑的設(shè)計，實現(xiàn)口 服、黏膜給藥、吸入等新劑型。長效微粒采用乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)、聚乳酸(PLA)等 被美國FDA批準的可用于人體的新型生物降解高分子材料為緩釋輔料，其中又以PLGA更常用。此類人生長素長效制劑已進入臨床，只需每月使用一次。2通過化學修飾來優(yōu)化蛋白質(zhì)的代謝動力學特性；(傅一鳴等，蛋白質(zhì)和多肽藥物 長效性研究進展，生命科學，2008年)治療用蛋白質(zhì)的長效性可以通過多種方式的化學修飾來實現(xiàn)。例如，通過突變一 個或者多個氨基酸(就是創(chuàng)造一個蛋白質(zhì)類似物)或者通過糖基化、酰基化或PEG化修飾。聚乙二醇(PEG)化技術(shù)早在20世紀70年代由Frank等學者提出，即將PEG分子附 于蛋白質(zhì)，既盡可能地優(yōu)化了藥代動力學性質(zhì)，又保持了原藥物活性。PEG修飾通過減少代 謝和體循環(huán)中受體介導的對蛋白質(zhì)的吸收，達到降低血漿清除率，故能大大延長蛋白質(zhì)類 藥物在體內(nèi)的作用時間。例如PEG化干擾素在體內(nèi)的半衰期可延長至40小時，從而大大增 加了干擾素與體內(nèi)肝炎病毒的接觸時間，這樣就能更有效地殺死肝炎病毒。單克隆抗體經(jīng) PEG化后，也能大大延長其與癌細胞表面接觸時間，這樣就能加強其殺滅癌細胞的作用力。目前世界上只有少數(shù)幾家制藥公司解決了 PEG修飾劑和修飾工藝中的關(guān)鍵技 術(shù)，先靈葆雅公司首先開發(fā)上市了世界第一只聚乙二醇包埋的新型長效蛋白質(zhì)類藥物制 劑“聚乙二醇化干擾素”(PEG干擾素，商品名為“佩樂能”)，已上市的此類長效型制劑還有 Neulasta(rhG-CSF)和Aranesp (EP0)等，國外正在研制開發(fā)中的新型PEG化蛋白質(zhì)類新藥 至少有上百種之多。我國也開展了 IFN，G-CSF等蛋白質(zhì)的PEG修飾研究，但目前還沒有一 家上市。國內(nèi)已獲得專利的PEG化藥物有聚乳酸-PEG化乙肝疫苗、PEG化蒿甲醚(長效 抗瘧疾新藥)、長效口服避孕藥(內(nèi)含PEG化孕酮)、長效甘露醇注射劑(即PEG化甘露醇， 可治療中風等引起的腦水腫)、PEG化槲皮素和PEG化緩瀉藥等等。3應(yīng)用蛋白質(zhì)工程技術(shù)構(gòu)建融合蛋白。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，很多蛋白多肽類藥物能夠通過基因重組技術(shù)得到 其融合蛋白，如與人血清白蛋白(HSA)(中國專利CN1405181、CN1405182、CN1405183、 CN1207131、CN101172091、CN101200503、CN1597965、CN1626554、CN1515591、CN1807646、 CN1727488、CN1831123、CN1831124、CN1884520、CN1896104、CN1896106、CN1916173、 CN101012281、CN101037477, CN101062952、CN101063123、CN101063124, CN101063125、 CN101121753、CN101280017、CN101280018、CN101280019、CN101280020)、人免疫球蛋白 Fc 片段(中國專利 CN1403483、CN1410450, CN1361793、CN1684704、CN1500811、CN1521192、 CN1760209、CN1786032、CN187288U CN1902222、CN1926237、CN1942481、CN101321870、 CN101323643)、鏈親和素(中國專利 CN101148477、CN101148478、CN1651464)、轉(zhuǎn)導肽(中 國專利CN101074266、CN101074267、CN101074268)等蛋白或多肽融合，或者兩種蛋白多肽 類藥物之間融合(中國專利 CN1144845、CN1074243、CN1076729、CN1221754、CN1225368、 CN1311332、CN1361181、CN1375500、CN1506377、CN101003812)，或者是蛋白多肽類藥物的二 聯(lián)體/三聯(lián)體(中國專利CN1305003、CN1995064)，融合蛋白的構(gòu)建可以是直接融合，也可以 使用連接肽，通常是一個或多個(Gly4-Ser)。美國馬里蘭州人類基因組科學(HumanGenome Sciences)公司已經(jīng)進行一系列融合HSA以延長蛋白質(zhì)藥物半衰期的研究，其中HSA/ IFN-a融合蛋白(Albuferon-a )已進入III期臨床試驗，國內(nèi)也有同類產(chǎn)品進入臨床試 驗。在自然界，由于億萬年進化的結(jié)果，生命中35%以上的蛋白多肽是由多個重復(fù) 性單體聚合組成的寡聚體形式存在(Goodsell, D. S. ；et al. Annu. Rev. Biophys. Biomol.Struct. 2000, 29，105-153)，寡聚體較單體發(fā)展出更長的半衰期，更大的結(jié)合表面，更高的局部生物活性，以及構(gòu)象-功能變構(gòu)調(diào)節(jié)等優(yōu)勢。同種單體或異種單體通過多種不同機 理聚合組成重復(fù)二聚體、立方四聚體及少量奇數(shù)多聚體等。寡聚體單體聚合主要利用單 體表面的局部結(jié)構(gòu)域(domain)之間的范德華力、疏水鍵、離子鍵、氫鍵及二硫共價鍵和 結(jié)構(gòu)域交換(domain swapping)等機理聚合組成。例如p53抑癌基因首先利用其羧基 端(residUes326-355)寡聚化結(jié)構(gòu)域形成二聚體，再通過其廣泛的疏水表面聚成四聚體 (Mateu, M. G.，et al. 1999，Nature Struct. Biol. 6，191-198)。目前這種寡聚化結(jié)構(gòu)域 (oligomerization domain)被發(fā)現(xiàn)越來越多(Liu, Y. ；et al. , Protein Sci. 2002，11， 1285-1299)。而現(xiàn)在開發(fā)研制的蛋白多肽類藥物幾乎都為天然單體蛋白多肽，單體直接改 造或單體與其它大分子共價交聯(lián)。學習模仿天然寡聚化結(jié)構(gòu)域，經(jīng)蛋白質(zhì)工程改造的長效 多聚體蛋白多肽類藥物將是新一代的人造重組蛋白長效高活性制劑。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服天然蛋白多肽類藥物半衰期短、藥代動力學差、需要頻繁給藥等缺點，一 般通過基因工程技術(shù)改造蛋白多肽類藥物的氨基酸序列、空間結(jié)構(gòu)、表面性狀或者與大分 子共價交聯(lián)重組，最后表達、生產(chǎn)長效活性重組蛋白多肽類藥物。由于蛋白多肽序列結(jié)構(gòu)的 改變更常發(fā)生的是降低或破壞其生物學活性，要發(fā)現(xiàn)找出增強活性的突變是一項極其繁瑣 的小概率事件。蛋白多肽直接相互交聯(lián)的多聚體或與其它大部分大分子交聯(lián)，更是明顯降 低其生物學活性。如此常規(guī)蛋白質(zhì)工程改造限制了蛋白多肽類藥物的長效高活性劑型的發(fā) 展。“一種蛋白質(zhì)工程長效多聚體藥物技術(shù)”，其特征在于某種活性蛋白多肽天然氨 基酸序列通過柔性(Gly4Ser)HLinker或連接短肽連接一種寡聚化結(jié)構(gòu)(domain)或模體 (motif)氨基酸序列的重組蛋白質(zhì)，異位表達的重組蛋白質(zhì)通過寡聚化結(jié)構(gòu)域的聚合形成 二聚體或四聚體結(jié)構(gòu)的長效活性蛋白藥物。所述活性蛋白多肽為基因工程重組蛋白多肽活 性藥物，如干擾素、促紅細胞生成素、集落細胞刺激因子等。所述寡聚化結(jié)構(gòu)域(domain)指 天然寡聚化蛋白質(zhì)單體之間相互交聯(lián)的一大類短氨基酸結(jié)構(gòu)域(domain)，包括單體間形成 的范德華力、疏水鍵、離子鍵、氫鍵及二硫共價鍵和結(jié)構(gòu)域交換(domain swapping)等的結(jié) 構(gòu)域(domain)。所述連接短肽是指從天然蛋白質(zhì)內(nèi)部大的功能區(qū)之間的短連接部份經(jīng)突變 改造后適于更多種蛋白多肽相互柔性連接的約十至三十個氨基酸長度的人造短肽。所述蛋 白質(zhì)工程是通過基因工程重組及重組拼接PCR技術(shù)來實現(xiàn)人為預(yù)先設(shè)計的重組蛋白質(zhì)構(gòu) 建表達的生物工程技術(shù)。所述異位表達指預(yù)構(gòu)建的重組蛋白質(zhì)基因表達載體于原核表達系 統(tǒng)、昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)及真核表達系統(tǒng)表達，提取生產(chǎn)長效重組藥物；也可以重組蛋白 質(zhì)基因腺病毒載體或痘苗載體基因槍注射，人體內(nèi)直接表達長效重組藥物。本發(fā)明“一種蛋白質(zhì)工程長效多聚體藥物技術(shù)”提供一種不改變蛋白多肽類藥物 天然有效結(jié)構(gòu)，而通過其柔性短肽連接的寡聚化結(jié)構(gòu)域(domain)或模體(motif)的寡聚化 來實現(xiàn)長效多聚體藥物的技術(shù)途徑，即生物活性部分氨基酸序列+(Gly4Ser)Mlinker+寡 聚化結(jié)構(gòu)域(domain/motif)序列。原理示意圖見附圖。采用基因工程重組技術(shù)完成這一人 工設(shè)計的重組藥物序列。首先分別設(shè)計合成蛋白多肽活性部分基因擴增引物，寡聚化結(jié)構(gòu) 域(domain/motif)基因擴增引物，將柔性(Gly4Ser) "Linker等連接肽序列的反義鏈加在蛋白多肽下游引物的5’端/前端；將Linker連接肽有意義鏈加在寡聚化結(jié)構(gòu)域(domain/ motif)上游引物的5’端/前端，分別擴增的兩條基因片段通過重組PCR技術(shù)生成一人工重 組的活性蛋白多肽+寡聚化結(jié)構(gòu)域(domain/motif)完整序列，再克隆至載體質(zhì)粒并異位表 達。本發(fā)明的基本原理公式如下
NH2-活性蛋白多肽+柔性Linker+寡聚化結(jié)構(gòu)域(domain/motif)-C00H ；或NH2-寡聚化結(jié)構(gòu)域(domain/motif) +柔性Linker+活性蛋白多肽-C00H。本發(fā)明至少包括以下步驟1長效藥物融合基因的構(gòu)建即按上述基本公式，以寡聚化結(jié)構(gòu)域位于羧基端為例。以活性多肽藥物降鈣素作 為活性蛋白多肽藥物代表，以柔性(Gly4Ser)MLinker作為連接短肽的代表，長效藥物融合 寡聚化結(jié)構(gòu)域的基因構(gòu)建實例。實例一降鈣素融合P53寡聚化結(jié)構(gòu)域其氨基酸序列如下CGNLSTCVLSATffRNLNNFH- (Gly4Ser) ^3-P PGSTKRALSN NTSSSPQP KKKPLDGEYFTL QIRGRERFEM FRELNEALEL KDAQAGKEPG GSRAHSSH LKSKKGQSTSRH KKLMFKTEGP DSD實例二 降鈣素融合鏈親和素(Core Streptavidin)寡聚化結(jié)構(gòu)域CGNLSTCVLSATWRNLNNFH-(Gly4SerUATDGSGTAL GffTVAffKN NYRNAHSATTffS GQYVGGAEAR INTQffLLTSG TTEANAffKST LVGHDTF T KV KPSAAS實例三降鈣素融合人IgG1重鏈絞鏈區(qū)(Hinge Region)的寡聚化結(jié)構(gòu)域CGNLSTCVLSATWRNLNNFH-(Gly4Ser) h-AALGCLVKDYF PEPVTVS WNSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSVVTV PSSSLGTQTY ICNVNHKPSN TKVDKRVEPKSCDKTHTCPP CPAPELLGGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAK TKPREEQYNS TYRVVSVLT V LHQDffLNGKE YKCKVSNKAL PA各片段基因的擴增融合，首先分別設(shè)計合成蛋白多肽活性部分基因擴增引物 (短片段基因可采用化學合成)，寡聚化結(jié)構(gòu)域(domain/motif)基因擴增引物時，將柔 性(Gly4Ser)HLinker等連接肽序列的反義鏈加在蛋白多肽下游引物的5’端/前端；將 Linker連接肽有意義鏈加在寡聚化結(jié)構(gòu)域(domain/motif)上游引物的5’端/前端，分別 擴增蛋白多肽活性部分基因和寡聚化結(jié)構(gòu)域基因片段并經(jīng)凝膠電泳回收純化片段。一端部 份重疊的兩片段之間可以互為引物退火、延伸幾個循環(huán)，再以此融合片段為模板，以蛋白多 肽上游引物和寡聚化結(jié)構(gòu)域下游引物作為最終融合片段的擴增引物，PCR擴增生成一人工 重組的活性蛋白多肽+柔性Linker+寡聚化結(jié)構(gòu)域(domain/motif)的完整序列。2長效藥物表達質(zhì)粒及相應(yīng)的工程菌的構(gòu)建經(jīng)重組PCR制備的融合基因產(chǎn)物純化后用適當?shù)南拗菩詢?nèi)切酶處理，再與用同樣 限制性內(nèi)切酶處理的質(zhì)粒PET等載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化(或轉(zhuǎn)染)感受態(tài)細胞如BL21等， 涂布(spread) LB培養(yǎng)皿，經(jīng)過夜培養(yǎng)后，挑選單菌落PCR篩選陽性克隆及核酸測序分析，選 擇序列正確者。含正確重組質(zhì)粒的菌種小規(guī)模培養(yǎng)，IPTG誘導表達后進行SDS PAGE電泳分析，挑 選表達目的條帶的菌種作為工程菌菌種。3長效藥物的發(fā)酵生產(chǎn)、分離純化
通過發(fā)酵、IPTG誘導培養(yǎng)，離心收獲菌體，經(jīng)超聲破碎、溶菌酶裂解。先采用鹽析、 透析、超濾等方法粗提，進一步采用離子交換層析、疏水作用層析、親和層析(包括生物親 和層析，金屬離子親和層析，免疫親和層析等)、凝膠過濾等方法制備純品，或聚丙烯酰胺凝 膠制備電泳精制。4長效藥物生物學活性的測定制備的純品經(jīng)初步的純度、含量、pH值、熱原等一般理化性能指標鑒定后，根據(jù)中 國藥典的質(zhì)量標準規(guī)定，采用適當?shù)姆椒y定相應(yīng)效價等長效藥物的生物學活性。本發(fā)明“一種蛋白質(zhì)工程長效多聚體藥物技術(shù)”的優(yōu)點主要集中表現(xiàn)在(1).模擬了天然蛋白進化的優(yōu)勢，從而具備了寡聚化蛋白多肽的半衰期長，結(jié)合 表面積大及局部生物活性高等優(yōu)點；(2).沒有改變天然蛋白多肽藥物的結(jié)構(gòu)，所以既不會破壞或降低藥物活性，增加 的天然短寡聚化結(jié)構(gòu)域也不會增加新的不良反應(yīng)等的毒副作用；(3).活性蛋白多肽僅與小分子短寡聚化結(jié)構(gòu)域交聯(lián)，基因工程構(gòu)建的是單基因鏈 及表達的是蛋白多肽單體，寡聚化后再成為大分子多聚體。易于基因工程構(gòu)建及規(guī)模化生 產(chǎn)、純化精制。


以人a干擾素交聯(lián)Igh寡聚化結(jié)構(gòu)域為例附圖是本發(fā)明的基本原理示意圖，以實施例干擾素IFN a _lb+源自黃病毒柔性連 接短肽+人IgGjA寡聚化結(jié)構(gòu)域為例。其中附圖A為兩個單體的人a干擾素分子，附圖B 短方條代表柔性連接短肽，附圖C示意Igh絞鏈區(qū)的寡聚化結(jié)構(gòu)域通過兩對共價二硫鍵形 成二聚體。
具體實施例方式以下實施例進一步說明本發(fā)明“一種蛋白質(zhì)工程長效多聚體藥物技術(shù)”的內(nèi)容，但 不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、條件、 步驟及應(yīng)用所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。實施例長效人干擾素a -lb融合二聚體干擾素是一類重要的細胞因子，它是機體受到病毒感染時，免疫細胞通過抗病毒 應(yīng)答反應(yīng)，而產(chǎn)生的一組結(jié)構(gòu)類似、功能相近的低分子糖蛋白。干擾素在同種細胞上具有廣 譜的抗病毒、抗細胞分裂、免疫調(diào)節(jié)等多種生物學活性，目前在臨床上廣泛用于抗病毒、抗 腫瘤治療。根據(jù)人干擾素的分子結(jié)構(gòu)和抗原性不同分為a、0、Y等幾類，0干擾素活性 分子為二聚體，Y干擾素活性分子為四聚體，而天然a干擾素活性分子仍為單體，a干擾 素又依其結(jié)構(gòu)的不同再分為a-lb、a _2a、a _2b等亞型。干擾素是我國第一個實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的基因工程藥物。干擾素a是治療慢性乙型肝 炎或慢性丙型肝炎的首選治療，可以有效地抑制或清除病毒，療效持久，阻止肝硬化或肝癌 的發(fā)生。但普通干擾素治療具有自身不可克服的缺點，半衰期短，只有4個小時，所以，干擾 素不得不每隔一天就注射一次，使用很不方便。美國安進公司(Amgen Inc.)開發(fā)并于1997年在美國上市的復(fù)合干擾素是一種非 天然的新型干擾素，是以生物工程DNA技術(shù)，把十多種a干擾素亞型蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中，每一位 點最常見的氨基酸序列排列成一復(fù)合序列而產(chǎn)生，故名復(fù)合a干擾素，商品名為干復(fù)津。
將IFN進行PEG化的研究，經(jīng)歷了從線性PEG到支鏈PEG對IFN進行修飾，先后研 發(fā)了 PEG IFN a-2b和PEG IFN a-2a。PEG IFN a-2b為小分子直鏈PEG IFN，半衰期約為 40小時，可以在體內(nèi)持續(xù)作用168小時，剛好滿足一周一次給藥。同時保留了 30%的腎臟 清除率，這樣，當干擾素治療期間發(fā)生嚴重不良反應(yīng)時，撤藥快速，便于對干擾素不易耐受 的病人調(diào)整劑量，大大提高了干擾素治療的安全性。PEG IFN a _2a為大分子支鏈PEG IFN, 半衰期約為80小時。 另一種途徑是干擾素的融合蛋白，如干擾素與人血清白蛋白(HSA)、人免疫球蛋白 Fc片段、腦啡肽、胸腺肽等蛋白或多肽融合，可以是直接融合或使用連接肽，通常是一個或 多個(Gly4-Ser)，或干擾素的糖基化、?；?，也能夠改善普通干擾素半衰期短的特性。 美國馬里蘭州人類基因組科學(Human Genome Sciences)公司已經(jīng)進行一系列融合HSA以 延長蛋白質(zhì)藥物半衰期的研究，其中HSA/IFN-a融合蛋白(Albuferon-a )已進入III期 臨床試驗。本發(fā)明“一種蛋白質(zhì)工程長效多聚體藥物技術(shù)”，其具體實施例是以天然a干擾 素加一柔性連接短肽與人Igh絞鏈區(qū)的寡聚化結(jié)構(gòu)域融合，通過寡聚化結(jié)構(gòu)域的鏈間二硫 鍵共價形成二聚體。一、長效人干擾素a -lb融合二聚體融合基因的構(gòu)建其基本構(gòu)建公式為干擾素IFN a -lb+源自黃病毒柔性連接短肽+人Igh的寡聚化結(jié)構(gòu)域(1)中國人特有的IFN a-lb的氨基酸序列是(genebank AF439447)CDLPETHSLD NRRTLMLLAQ MSRISPSSCL MDRHDFGFPQ EEFDGNQFQKAPAISVLHEL IQQIFNLFTT KDSSAAWDED LLDKFCTELY QQPNDLEACVMQEERVGETP LMNADSILAV KKYFRRITLY LTEKKYSPCA WEVVRAEIVRSLSLSTNLQE RLRRKE相對應(yīng)的核酸序列(有意義鏈)為5， -tgt gat ctc cct gag acc cac age ctg--------gaa aga tta agg agg aag
gaa-3，(2)源自黃病毒柔性連接短肽，其氨基酸序列為GAGARLVVLATATPPGSVTGG相對應(yīng)的核酸序列(有意義鏈)為+ggc get gga gcg cgt ctc gtc gtg ctc gcc acc get act cct ccg gga teg gtc acc ggc ggc+(3)人Igh重鏈絞鏈區(qū)包括部份CH「CH2的寡聚化結(jié)構(gòu)域TAALGCLVKD YFPEPVTVSff NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSVV TVPSSSLGTQTY ICNVNHKPSN TKVDKRVEPK SCDKTHTCPP CPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNSTYRVVSVLT V LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PA相對應(yīng)的核酸序列(有意義鏈)為5，-aca gcg gcc ctg ggc tgc ctg---------gtc tcc aac aaa gcc ctc cca
gcc_3， 引物設(shè)計根據(jù)融合基因序列和pET32a質(zhì)粒多克隆位點，選擇BamH I和EcoR I酶切位點，并在BamH I酶切位點后加入rTEV蛋白酶特異性識別序列 (Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly)以方便下游生產(chǎn)目的蛋白的純化。HjIFNF :5，-eg ggatcc RaR aat ctR tac ttt caR rrc tgt gat ctc_3，IFNF1 :5，_c ttt caR rrc tgt gat ctc cct gag acc cac age ctg_3，IFNR1 :5，-gag acg cgc tcc age gcc ttc ctt cct cct taa tct ttc_3，IFNR :5，-agt age ggt ggc gag cac gac gag acg cgc tcc age gcc_3，IgGF :5，-g ctc gcc acc get act cct ccg ggatcg gtc acc ggc gg+_3，IgGFl :5，-gga teg gtc acc ggc ggc+aca gcg gcc ctg ggc tgc ctg_3，RjIgGR :5，-eg gaattc tta ggc tgg gag ggc ttt gtt gga gac_3，融合基因的構(gòu)建首先分別從含有ifna -lb和人igg:重鏈基因的重組質(zhì)粒中pcr 擴增出相應(yīng)的基因片段，反應(yīng)體系為重組質(zhì)粒0. 5u 1
上游引物1 u 1
下游引物1 u 1
10mM dNTP1 u 1
10Xpfu buffer5u 1
Pfu酶0. 5u 1
ddH2041 u 1_50 u 1其中擴增IFNa -lb基因的上游引物為HJFNF(lOuM)和IFNF1 (10uM)9 1的混 合物，下游引物為IFNR(lOuM)和IFNRl(10uM)9 1的混合物；擴增人IgG:重鏈基因的上 游引物為IgGF(lOuM)和IgGFl (10uM)9 1的混合物，下游引物為RJgGRdOuM)。PCR 擴增條件為94°C 4min ；94°C 30S、55°C 40S、72°C lmin，25 個循環(huán)，最后 72°C 延伸9min。PCR產(chǎn)物進行1. 5%瓊脂糖凝膠電泳后用QI AGEN試劑盒回收。再進行兩個基因片段的融合，反應(yīng)體系為上述pcr反應(yīng)的回收產(chǎn)物43. 5 ill10mM dNTP1 u 1lOXpfu buffer5 u 1Pfu 酶0. 5u 1_50 u 1PCR 擴增條件為94°C 2min ；94°C 30S、52°C 40S、72°C lmin, 10 個循環(huán)，最后 72°C 延伸9min。最后進行融合基因的pcr擴增，反應(yīng)體系為上述融合反應(yīng)產(chǎn)物5 ill上游引物HJFNFdOuM)lu 1下游引物隊1801 (10碰)lu 110mM dNTP1 u 1
IOXpfu buffer5μ 1Pfu 酶0. 5μ 1ddH2036. 5 μ 1_ 50 μ 1PCR 擴增條件為94°C 4min -MV 30S、54°C 40S、72°C 2min，25 個循環(huán)，最后 72°C 延伸9min。PCR產(chǎn)物進行1. 2%瓊脂糖凝膠電泳后用QIAGEN試劑盒回收。二、表達質(zhì)粒及相應(yīng)的工程菌的構(gòu)建重組PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳回收純化后，常規(guī)用BamH I和EcoR I雙酶切處理、滅活， 再與用BamH I和EcoR I雙酶切處理并膠回收純化的pET32a質(zhì)粒經(jīng)T4連接酶連接，連接 產(chǎn)物常規(guī)轉(zhuǎn)化(CaCl2法)感受態(tài)細胞BL21，于含氨芐青霉素(50mg/L)的LB平板中37°C 培養(yǎng)過夜，PCR篩選陽性克隆及核酸序列分析，將測序正確者命名為pET32a/IFNa -lb。含重組質(zhì)粒pET32a/IFNa-lb的BL21菌種接種于LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過夜，次 日清晨按1 100的比例接種于上述同樣條件的LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)至慫㈨》=。.‘ 0. 6時加入IPTG至終濃度為0. 2-lmmol/L誘導表達，37°C振蕩培養(yǎng)6hr，離心收集菌體，行 12% SDSPAGE鑒定，挑選表達目的條帶的菌種作為工程菌菌種。三、新型長效人干擾素a -Ib的發(fā)酵生產(chǎn)、分離純化通過常規(guī)方法發(fā)酵培養(yǎng)工程菌，離心收集菌體。1.粗提重組蛋白是以半包涵體的形式存在，取5g表達濕菌，加微量的溶菌酶，將 其懸浮于 35mL STE(1 OOmmo 1/L NaCl, 50mmol/L Tris. Cl, PH 8. 0, lmmol/L EDTA)中，在冰 浴中300W超聲裂菌，超聲5s，間歇10s，全程20min，4°C，IOOOOg離心20min，并分別輔以脫 氧膽酸(DOC 4mg/g濕菌)和低濃度尿素(l-2mol/L)超聲漂洗，再IOOOOg離心20min。沉 淀用較高濃度的尿素(4-6mol/L)融解，4°C，IOOOOg離心20min，取上清初步透析后，再在冰 浴中進行硫酸銨沉淀，硫酸銨的終濃度為400g/L，4°C，IOOOOg離心20min，沉淀重溶于STE 中，即為粗提液。2.長效INFa-Ib的純化粗提液過Ni-NTA親和層析柱結(jié)合后，洗脫收集蛋白主 峰，收集液經(jīng)rTEV蛋白酶4°C處理過夜，酶切產(chǎn)物再過分子篩葡聚糖凝膠S-300層析柱，收 集干擾素洗脫峰的液體，即為長效INFa-Ib半成品，過濾除菌后分裝，-20°C保存。3.長效INF α -Ib的理化鑒定3. 1蛋白濃度測定采用BCA法，按照試劑盒的說明書進行操作；3. 2電泳純度用非還原型SDS PAGE法，加樣量不低于1 μ g，經(jīng)掃描儀掃描，純度 應(yīng)在95%以上；3. 3分子量測定用還原型SDS PAGE法，加樣量不低于1 μ g，制品的分子量與理論 值比較，誤差不超過10%。四、抗病毒活性測定WISH細胞法將WISH細胞在含抗生素、谷氨酰胺和10% FCS(pH 7.4)的Eagle，s培養(yǎng)液中 37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。待細胞呈單層生長后棄培養(yǎng)液，并用胰酶消化細胞。將 消化的WISH細胞按1000個細胞/孔接種于96孔板，37°C,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。換 為含5% FCS的Eagle’ s液稀釋的不同濃度的待測樣品，100 μ L/孔，每個稀釋度做3個孔，繼續(xù)培養(yǎng)，次日換用含5% FCS的Eagle's培養(yǎng)液按1 10 30稀釋的VSV病毒培養(yǎng)液， 37°C培養(yǎng)24hr，觀察結(jié)果，以50%細胞保護的待測樣品稀釋度為其效價。五、體內(nèi)藥代動力學初步檢測給3只SD大鼠以lOOii g/kg單次皮下注射樣品，于給藥后的0. 5hr、2hr、4hr、8hr、 24hr、48hr尾靜脈采血，分離血漿，夾心ELISA檢測血漿中樣品的含量，采用3p97軟件進行 數(shù)據(jù)處理，計算相關(guān)藥代動力學參數(shù)。初步結(jié)果表明樣品純度可達95%以上，比活達到1.2X108IU/mg以上，大鼠體內(nèi)半 衰期達到10hr以上。
權(quán)利要求
“一種蛋白質(zhì)工程長效多聚體藥物技術(shù)”，其特征在于某種活性蛋白多肽天然氨基酸序列通過柔性連接短肽連接一種寡聚化結(jié)構(gòu)域(Oligomerization domain)氨基酸序列的重組蛋白質(zhì)，異位表達的重組蛋白質(zhì)通過寡聚化結(jié)構(gòu)域的聚合形成二聚體、四聚體結(jié)構(gòu)的長效活性蛋白藥物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1“一種蛋白質(zhì)工程長效多聚體藥物技術(shù)”，其特征在于所述活性蛋 白多肽為天然結(jié)構(gòu)的、具有生物學活性并基因工程重組表達的蛋白多肽類活性藥物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1“一種蛋白質(zhì)工程長效多聚體藥物技術(shù)”，其特征在于所述寡聚化 結(jié)構(gòu)域(Oligomerization domain)是指形成天然寡聚化蛋白質(zhì)單體之間相互交聯(lián)的一大 類短氨基酸結(jié)構(gòu)域(domain)，包括單體間形成的范德華力、疏水鍵、離子鍵、氫鍵及二硫共 價鍵和結(jié)構(gòu)域交換(domain swapping)等的結(jié)構(gòu)域(domain)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1“一種蛋白質(zhì)工程長效多聚體藥物技術(shù)”，其特征在于所述連接短 肽是指柔性的小分子中性氨基酸組成的短肽(Glyjer)"。也包括從天然蛋白質(zhì)內(nèi)部大的 功能區(qū)之間的短連接部份經(jīng)突變改造后適于更多種蛋白多肽相互柔性連接的約十至三十 個氨基酸長度的人造短肽。
5.根據(jù)權(quán)利要求1“一種蛋白質(zhì)工程長效多聚體藥物技術(shù)”，其特征在于所述蛋白質(zhì) 工程是通過基因工程重組及重組拼接PCR技術(shù)來實現(xiàn)人為預(yù)先設(shè)計的重組蛋白質(zhì)構(gòu)建表 達的生物工程技術(shù)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1“一種蛋白質(zhì)工程長效多聚體藥物技術(shù)”，其特征在于所述異位表 達指預(yù)構(gòu)建的重組蛋白質(zhì)基因表達載體于原核表達系統(tǒng)、昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)及真核表 達系統(tǒng)表達，提取生產(chǎn)長效重組藥物；也可以重組蛋白質(zhì)基因腺病毒載體或痘苗載體基因 槍注射，人體內(nèi)直接表達單體重組藥物，再在體內(nèi)自動進行寡聚合。
全文摘要
本發(fā)明“一種蛋白質(zhì)工程長效多聚體藥物技術(shù)”涉及活性蛋白多肽藥物寡聚化，藥物單體形成寡聚體大分子進而提高藥效的技術(shù)。其特征在于活性蛋白多肽天然氨基酸序列通過柔性連接短肽連接寡聚化結(jié)構(gòu)域(Oligomerization domain)氨基酸序列的重組蛋白質(zhì)，異位表達的重組蛋白質(zhì)通過寡聚化結(jié)構(gòu)域的聚合形成二聚體或四聚體結(jié)構(gòu)的長效蛋白藥物。所述寡聚化結(jié)構(gòu)域是指在天然寡聚化蛋白質(zhì)單體之間相互交聯(lián)的一大類短氨基酸結(jié)構(gòu)域(domain)，包括單體間形成的范德華力、疏水鍵、離子鍵、氫鍵及二硫共價鍵和結(jié)構(gòu)域交換(domainswapping)等的寡聚化結(jié)構(gòu)域。使用拼接重組PCR技術(shù)構(gòu)建蛋白多肽與寡聚化結(jié)構(gòu)域聯(lián)接的重組基因，原核或真核表達蛋白多肽單體再通過其寡聚化結(jié)構(gòu)域交聯(lián)成寡聚體；腺病毒或痘苗載體系統(tǒng)體內(nèi)直接表達長效重組藥物。
文檔編號C07K1/10GK101875698SQ20091008326
公開日2010年11月3日 申請日期2009年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月30日
發(fā)明者江洪 申請人:北京萬達因生物醫(yī)學技術(shù)有限責任公司