專利名稱：飽和脂肪鏈醇Glu-Asp-Gly三肽酯及其合成方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及飽和脂肪鏈醇三肽酯，尤其涉及一系列具有免疫抑制活性的飽和脂肪 鏈醇GlU-Asp-Gly三肽酯，還涉及這些飽和脂肪鏈醇三肽酯的制備方法以及它們作為免疫 抑制劑的應(yīng)用，屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
據(jù)統(tǒng)計，截至2002年底，全球共進(jìn)行各種器官移植935792例次，其中腎移植 585877例次、肝臟移植112153例次、心臟移植66559例次。此外，胰、肺、小腸等器官移植 及心_肺、胰-腎、肝-腎、肝-腸等多臟器聯(lián)合移植也都獲得成功并應(yīng)用于臨床。目前，腎 移植1年人/腎存活率達(dá)90 % 95 %，5年存活率超過70 %。臟器移植要形成移植耐受， 這就要求患者終身服用免疫抑制劑。器官移植的進(jìn)展在很大程度上取決于免疫抑制劑的進(jìn) 展。近幾十年，雖然新免疫抑制藥物使得器官移植在臨床取突飛猛進(jìn)發(fā)展，但它們的毒副作 用，例如腎毒性和骨髓抑制作用仍然是器官移植造必須面對的嚴(yán)重問題。環(huán)孢菌素A是目前臨床常用的免疫抑制劑。由于環(huán)孢菌素A的水溶性極差以及腎 毒性很強(qiáng)，所以無論是劑型還是療效都不盡人意。提高環(huán)孢菌素A制劑的水溶性，降低環(huán)孢 菌素A的腎毒性，一直是環(huán)孢菌素A研究的熱點。尿毒素肽具有免疫抑制活性。發(fā)明人認(rèn) 識到，把尿毒素肽與脂肪鏈醇綴合生成的酯具有自組裝性能，因而可以用作具有免疫抑制 活性的載藥材料。例如可以用來包裹環(huán)孢菌素A，達(dá)到提高環(huán)孢菌素A的水溶性和降低環(huán)孢 菌素A腎毒性的雙重目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是，將尿毒素三肽與脂肪鏈醇綴合，得到具有免疫抑制活性的 飽和脂肪鏈醇三肽酯綴合物。本發(fā)明的目的之一是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的通式I的6種具有免疫抑制活性的飽和脂肪鏈醇Glu-Asp-Gly三肽酯Glu-Asp-Gly-O-CH2- (CH2) nCH3 I其中，通式I 中的 η = 6、8、10、12、14 或 16。本發(fā)明的目的之二是，提供一種制備上述具有免疫抑制活性的飽和脂肪鏈醇 Glu-Asp-Gly三肽酯的方法。本發(fā)明的目的之二是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的一種制備通式I的6種具有免疫抑制活性的飽和脂肪鏈醇Glu-Asp-Gly三肽酯的 方法，該方法包括(1)將N端保護(hù)基保護(hù)的甘氨酸與飽和脂肪醇縮合，所述飽和脂肪醇為CH3(CH2) nCH20H, η = 6、8、10、12、14 或 16 ；(2)脫去N端保護(hù)基得到飽和脂肪醇甘氨酸酯；(3)按照現(xiàn)有液相合成技術(shù)，將飽和脂肪醇甘氨酸酯與天冬氨酸的保護(hù)中間體、谷氨酸的保護(hù)中間體逐步接肽合成保護(hù)基保護(hù)的飽和脂肪醇三肽綴合物；(4)依次脫去保護(hù)基保護(hù)的飽和脂肪醇三肽綴合物的N端保護(hù)基和C端保護(hù)基得 到目標(biāo)化合物。其中所述N端保護(hù)基是對多肽的N端進(jìn)行保護(hù)時常用的保護(hù)基團(tuán)，例如可以是叔 丁氧羰基(Boc)；所述C端保護(hù)基是對多肽的C端進(jìn)行保護(hù)時常用的保護(hù)基團(tuán)，例如可以是 芐氧基(OBzl)；所述液相合成技術(shù)及所述保護(hù)、縮合、脫保護(hù)的過程是本領(lǐng)域的常規(guī)并公 知的技術(shù)。該制備方法可以用圖1的路線概括，具體的，所述方法包括(1)在(Boc)2O和NaOH存在下將甘氨酸轉(zhuǎn)化為N-叔丁氧羰基甘氨酸；(2)在DCC、HOBt、無水THF存在下將N-叔丁氧羰基甘氨酸與飽和脂肪醇縮合，生 成飽和脂肪醇N-叔丁氧羰基甘氨酸酯；(3)在氯化氫-乙酸乙酯中將飽和脂肪醇N-叔丁氧羰基甘氨酸酯脫除叔丁氧羰保 護(hù)基，生成飽和脂肪醇甘氨酸酯；(4)在無水THF中，在DCC和HOBt存在下將飽和脂肪醇甘氨酸酯與N-叔丁氧羰 基-β -芐酯天冬氨酸縮合，生成飽和脂肪醇N-叔丁氧羰基_ β _芐酯天冬氨酰甘氨酸酯；(5)在氯化氫_乙酸乙酯存在下將飽和脂肪醇N-叔丁氧羰基_ β _芐酯天冬氨酰 甘氨酸酯脫除叔丁氧羰基生成飽和脂肪醇芐酯天冬氨酰甘氨酸酯；(6)在無水THF中，在DCC和HOBt存在下將飽和脂肪醇β _芐酯-天冬氨酰甘氨 酸酯與N-叔丁氧羰基_ Y _芐酯-谷氨酸縮合，生成飽和脂肪醇N-叔丁氧羰基-Y -芐酯 谷氨酰β-芐酯天冬氨酰甘氨酸酯；(7)在氯化氫_乙酸乙酯中將飽和脂肪醇N-叔丁氧羰基_ Y _芐酯谷氨酰β _芐 酯天冬氨酰甘氨酸酯脫除叔丁氧羰基，生成飽和脂肪醇Y-芐酯谷氨酰芐酯天冬氨酰 甘氨酸酯；(8)在無水乙醇中，在Pd/C存在下將飽和脂肪醇Y-芐酯谷氨酰β-芐酯天冬氨 酰甘氨酸酯氫解，生成飽和脂肪醇谷氨酰天冬氨酰甘氨酸酯。實驗結(jié)果表明本發(fā)明的6種具有免疫抑制活性的飽和脂肪鏈醇Glu-Asp-Gly三肽 酯具有優(yōu)秀的免疫抑制作用，臨床上可作為免疫抑制劑應(yīng)用。并且本發(fā)明的飽和脂肪鏈醇 Glu-Asp-Gly三肽酯水溶液中均能自組裝成粒經(jīng)穩(wěn)定在117-2290nm的納米球，可作為制備 微乳或脂質(zhì)體藥物載體的制劑材料，另外可作為制備微乳、脂質(zhì)體藥物載體的靶向制劑材 料。


圖1為通式I的6種具有免疫抑制活性的飽和脂肪鏈醇Glu-Asp-Gly三肽酯的合 成路線。i)無水THF、DCC、H0Bt和NMM;ii)4N氯化氫-乙酸乙酯溶液；iii)無水乙醇、Pd/ C 和 H2 ；7a η = 6,7b η = 8,7c η = 10，7d η = 12，7e η = 14，7f η = 16。為了進(jìn)一步闡述本發(fā)明，下面給出一系列實施例。這些實施例完全是例證性的，它 們僅用來對本發(fā)明進(jìn)行具體描述，不應(yīng)當(dāng)理解為對本發(fā)明的限制。
具體實施例方式實施例IBoc-Gly-OCH2 (CH2) 6CH3 的制備將1. OOg (5. 71mmol) Boc-Gly溶于20ml無水THF，冰浴下往得到的溶液中 加入0. 77g(5. 71mmol)N-羥基苯并三氮唑(HOBt)，并使完全溶解。10分鐘后加入 1. 41g(6. 85mmol) 二環(huán)己基羰二亞胺(DCC)，得到反應(yīng)液(I)。冰浴下把0. 74g(5. 71mmol)脂 肪醇CH3 (CH2) 6CH20H懸浮于20ml無水THF中，然后加入Iml N-甲基嗎啉(NMM)，調(diào)pH 8-9。 攪拌35分鐘，得到反應(yīng)液(II)。冰浴下把反應(yīng)液(I)加入反應(yīng)液(II)中，先冰浴下攪拌 lh，再室溫攪拌12h，TLC(氯仿/甲醇，10 1)顯示Boc-Lys(Z)消失。濾除二環(huán)己基脲 (D⑶)，減壓除去THF。殘留物用50ml乙酸乙酯溶解。得到的溶液依次用飽和NaHCO3水溶 液洗、飽和NaCl水溶液洗、5% KHSO4水溶液洗和飽和NaCl水溶液洗。有機(jī)相用無水Na2SO4 干燥、過濾、濾液減壓濃縮至干，得到1. 57g(96% )標(biāo)題化合物，為無色油狀物。ESI-MS(m/ ζ) :288[M+H] +。實施例 2Boc-Gly_0CH2 (CH2) 8CH3 的制備按照實施例1 的方法由 1. OOg (5. 71mmol) Boc-Gly 和 0. 90g (5. 71mmol) CH3 (CH2)8CH2OH 制得 1.64g(91% )標(biāo)題化合物，為無色油狀物 ESI-MS (m/z) :316[M+H] +。實施例3Boc-Gly-OCH2 (CH2) 10CH3 的制備按照實施例1 的方法由 1. OOg(5. 71mmol)Boc-Gly 禾Π 1. 06g(5. 71mmol) CH3(CH2)ltlCH2OH 制得 1. 77g(90% )標(biāo)題化合物，為無色油狀物。ESI-MS(m/z) :344[M+H] +。實施例4Boc-Gly_0CH2 (CH2) 12CH3 的制備按照實施例1 的方法由 1. OOg(5. 71mmol)Boc-Gly 禾Π 1. 22g(5. 71mmol) CH3(CH2)12CH2OH 制得 1. 88g(89% )標(biāo)題化合物，為無色油狀物。ESI-MS(m/z) :372[M+H] +。實施例5Boc-Gly-OCH2 (CH2) 14CH3 的制備按照實施例1 的方法由 1. OOg(5. 71mmol)Boc-Gly 禾Π 1. 38g(5. 71mmol) CH3(CH2)14CH2OH 制得 1. 96g(86% )標(biāo)題化合物，為無色油狀物。ESI_MS(m/z) :400[M+H] +。實施例6Boc-Gly-OCH2 (CH2) 16CH3 的制備按照實施例1 的方法由 1. 00g(5. 71mmol)Boc-Gly 禾Π 1. 54g(5. 71mmol) CH3(CH2)16CH2OH 制得 1. 97g(81% )標(biāo)題化合物，為無色油狀物。ESI_MS(m/z) :428[M+H] +。
實施例 7HC1 · Gly-OCH2 (CH2) 6CH3 的制備將1. 57g(5. 47mmol) Boc-Gly-OCH2 (CH2)6CH3 溶解在 50ml 4N 氯化氫-乙酸乙酯溶 液中，室溫攪拌2小時，TLC (氯仿甲醇，5 1)顯示Boc-Gly-OCH2 (CH2) 6CH3消失，減壓濃 縮除去乙酸乙酯，殘留物反復(fù)加少量乙醚進(jìn)行減壓濃縮以除去氯化氫。最后加少量乙醚將 殘留物研磨成1. 14g(93% )標(biāo)題化合物，為米黃色油狀物。ESI-MS(m/z) :188[M+H] +。實施例8HC1 · Gly-OCH2 (CH2) 8CH3 的制備按照實施例7 的方法，從 1. 64g (5. 21mmol) Boc-Gly-OCH2 (CH2)8CH3 制得 1. 23g(94% )標(biāo)題化合物，為米黃色油狀物。ESI-MS(m/z) :216[M+H] +。實施例9HC1 · Gly-OCH2 (CH2) 10CH3 的制備按照實施例7 的方法，從 1. 77g(5. 16mmol) Boc-Gly-OCH2 (CH2) 10CH3 制得 1. 30g(90% )標(biāo)題化合物，為米黃色油狀物。ESI-MS(m/z) :244[M+H] +。實施例IOHCl · Gly-OCH2 (CH2) 12CH3 的制備
按照實施例7 的方法，從 1. 88g (5. 07mmol) Boc-Gly-OCH2 (CH2)12CH3 制得 1. 37g(88% )標(biāo)題化合物，為米黃色油狀物。ESI-MS(m/z) :272[M+H] +。實施例1 IHCl · Gly-OCH2 (CH2) 14CH3 的制備按照實施例7 的方法，從 1.96g (4. 91mmol) Boc-Gly-OCH2 (CH2)14CH3 制得 1.49g(91% )標(biāo)題化合物，為米黃色油狀物。ESI-MS(m/z) :300[M+H] +。實施例 12HC1 · Gly-OCH2 (CH2) 16CH3 的制備按照實施例7 的方法，從 1.97g (4. 61mmol) Boc-Gly-OCH2 (CH2)16CH3 制得 1. 59g(95% )標(biāo)題化合物，為米黃色油狀物。ESI-MS(m/z) :328[M+H] +。實施例13Boc_Asp (OBzl) -Gly-OCH2 (CH2) 6CH3 的制備按照實施例1 的方法由 1. 65g(5. IOmmol) Boc-Asp (OBzl)和 1. 14g(5. IOmmol) HCl .Gly-OCH2(CH2)6CH3 制得 2. 03g(81% )標(biāo)題化合物，為淡黃色油狀物。ESI-MS(m/z) 493 [M+H]+，[a J20d = -11. O (c = 1. 0，CH3OH)。實施例14Boc-Asp (OBzl) -Gly-OCH2 (CH2) 8CH3 的制備按照實施例1 的方法由 1. 58g (4. 89mmol) Boc-Asp (OBzl)和 1. 23g(4. 89mmol) HCl · Gly-OCH2(CH2)8CH3 制得 2. 03g(80% )標(biāo)題化合物，為淡黃色油狀物。ESI-MS(m/z) 521 [M+H]+，[a J20d = -10. O (c = 1. 0，CH3OH)。實施例15Boc_Asp (OBzl) -Gly-OCH2 (CH2) 10CH3 的制備按照實施例1 的方法由 1. 50g(4. 65mmol) Boc-Asp (OBzl)和 1. 30g(4. 65mmol) HCl · Gly-OCH2(CH2)10CH3 制得 2. 06g(81 % )標(biāo)題化合物，為無色油狀物。ESI-MS (m/z) 549 [Μ+Η]+, [α ]20d = -5. O (c = 1. O, CH3OH)。實施例16Boc_Asp (OBzl) -Gly-OCH2 (CH2) 12CH3 的制備按照實施例1 的方法由 1. 44g (4. 46mmol) Boc-Asp (OBzl)和 1. 37g(4. 46mmol) HCl · Gly-OCH2(CH2)12CH3 制得 2. 18g(85% )標(biāo)題化合物，為淡黃色油狀物。ESI-MS(m/z) 577 [M+H]+，[a J20d = -5. 8 (c = 1. O, CH3OH)。實施例17Boc_Asp (OBzl) -Gly-OCH2 (CH2) 14CH3 的制備按照實施例1 的方法由 1. 43g (4. 44mmol) Boc-Asp (OBzl)禾 Π 1. 49g(4. 44mmol) HCl · Gly-OCH2(CH2)14CH3 制得 2. 20g(82% )標(biāo)題化合物，為淡黃色固體。ESI-MS(m/z) 605 [M+H]+，[a J20d = -4. 5 (c = 1. O, CH3OH)。實施例18Boc_Asp (OBzl) -Gly-OCH2 (CH2) 16CH3 的制備按照實施例1 的方法由 1. 41g(4. 37mmol) Boc-Asp (OBzl)和 1. 59g(4. 37mmol) HCl · Gly-OCH2(CH2)16CH3 制得 2. 19g(79% )標(biāo)題化合物，為淡黃色固體。ESI_MS(m/z) 633 [M+H]+，[a J20d = -4. 2 (c = 1. O, CH3OH)。實施例19HC1 · Asp (OBzl) -Gly-OCH2 (CH2) 6CH3 的制備按照實施例7 的方法，從 2. 03g (4. 12mmol) Boc-Asp (OBzl) -Gly-OCH2 (CH2) 6CH3 制得 1.61g(91% )標(biāo)題化合物，為米黃色油狀物。ESI-MS(m/z) 393[Μ+Η]+, [ α J20d =-5. 7 (c = 1. O, CH3OH)。實施例20HC1 · Asp (OBzl) -Gly-OCH2 (CH2) 8CH3 的制備按照實施例7 的方法，從 2. 03g (3. 90mmol) Boc-Asp (OBzl) -Gly-OCH2 (CH2) 8CH3 制得 1. 64g(92% )標(biāo)題化合物，為米黃色油狀物。ESI-MS(m/z) 421 [Μ+Η]+, [ α J20d = -9. 5 (c =
61. 0，CH3OH)。實施例2IHCl · Asp (OBzl) -Gly-OCH2 (CH2) 10CH3 的制備按照實施例7 的方法，從 2. 06g(3. 65匪ol) Boc-Asp (OBzl)-Gly-OCH2 (CH2) 1(1CH3 制 得 1. 69g(96% )標(biāo)題化合物，為米黃色油狀物。ESI-MS (m/z) :449[M+H]+，[a]20D = 9. 3 (c =1. 0，CH3OH)。實施例22HC1 · Asp (OBzl) -Gly-OCH2 (CH2) 12CH3 的制備按照實施例7 的方法，從 2. 18g(3. 78mmol) Boc-Asp (OBzl) -Gly-OCH2 (CH2) 12CH3 制 得 1. 76g(91%)標(biāo)題化合物，為米黃色油狀物。ESI-MS (m/z) :477[M+H]+，[a J20d = -10. 5 (c =1. 0，CH3OH)。實施例23HC1 · Asp (OBzl) -Gly-OCH2 (CH2) 14CH3 的制備按照實施例7 的方法，從 2. 20g(3. 64mmol) Boc-Asp (OBzl) -Gly-OCH2 (CH2) 14CH3 制 得 1. 87g(95% )標(biāo)題化合物，為米黃色固體。ESI-MS (m/z) 505 [M+H]+, [ a J20d = 5. 5 (c = 1· 0，CH3OH)。實施例24HC1 · Asp (OBzl) -Gly-OCH2 (CH2) 16CH3 的制備按照實施例7 的方法，從 2. 19g(3. 47匪ol) Boc-Asp (OBzl)-Gly-OCH2 (CH2) 16CH3 制 得1.89g(96% )標(biāo)題化合物，為米黃色固體。ESI-MS(m/z) :533[M+H]+，[a ]20d = 5. 3(c = 1. 0，CH3OH)。實施例25Boc-Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -Gly-OCH2 (CH2) 6CH3 的制備按照實施例1 的方法由 1. 27g(3. 76mmol)Boc-Glu(OBzl)和 1. 61g(3. 76mmol) HCl · Asp (OBzl) -Gly-OCH2 (CH2) 6CH3制得，所得化合物經(jīng)硅膠柱層析純化得無色透明油狀物 1.76g，純化條件石油醚丙酮=3 1，收率為 66%。ESI-MS(m/z) :712[M+H]+，[a]20D =-29. 3 (c = 1. 0，CH3OH)。實施例26Boc-Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -Gly-OCH2 (CH2) 8CH3 的制備按照實施例1 的方法由 1. 21g(3. 59mmol)Boc-Glu(OBzl)禾Π 1. 64g(3. 59mmol) HCl · Asp (OBzl) -Gly-OCH2 (CH2) 8CH3制得，所得化合物經(jīng)硅膠柱層析純化得無色透明油狀物 1.88g，純化條件石油醚丙酮=3 1，收率為 71%。ESI-MS(m/z) :740[M+H]+，[a ]20D =-27. 4 (c = 1. 0，CH3OH)。實施例27Boc-Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -Gly-OCH2 (CH2) 10CH3 的制備按照實施例1 的方法由 1. 18g(3. 49mmol)Boc-Glu(OBzl)和 1. 69g(3. 49mmol) HCl · Asp(OBzl)-Gly-OCH2(CH2)10CH3制得，所得化合物經(jīng)硅膠柱層析純化得無色透明油狀 物 1.45g，純化條件石油醚丙酮=3 1，收率為 54%。ESI-MS (m/z) 768 [M+H]+, [ a J20d =-24. 2 (c = 1. 0，CH3OH)。實施例28Boc-Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -Gly-OCH2 (CH2) 12CH3 的制備按照實施例1 的方法由 1. 16g(3. 43mmol)Boc-Glu(OBzl)和 1. 76g(3. 43mmol) HCl · Asp(OBzl)-Gly-OCH2(CH2)12CH3制得，所得化合物經(jīng)硅膠柱層析純化得無色透明油狀 物 1.91g，純化條件石油醚丙酮=3 1，收率為 70%。ESI-MS (m/z) 796 [M+H]+, [ a J20d =-18. 6 (c = 1. 0，CH3OH)。實施例29Boc-Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -Gly-OCH2 (CH2) 14CH3 的制備按照實施例1 的方法由 1. 17g(3. 46mmol)Boc-Glu(OBzl)和 1. 87g(3. 46mmol)HCl · Asp(OBzl)-Gly-OCH2(CH2)14CH3制得，所得化合物經(jīng)硅膠柱層析純化得無色透明油狀 物 1.91g，純化條件石油醚丙酮=3 1，收率為 67%。ESI-MS (m/z) :824[Μ+Η]+，[ α ]2°D =-26. 2 (c = 1. 0，CH3OH)。實施例3OBoc-Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -Gly-OCH2 (CH2) 16CH3 的制備按照實施例1 的方法由 1. 12g(3. 32mmol)Boc-Glu(OBzl)和 1. 89g(3. 32mmol) HCl · Asp(OBzl)-Gly-OCH2(CH2)l6CH3制得，所得化合物經(jīng)硅膠柱層析純化得無色透明油狀 物 1.61g，純化條件石油醚丙酮=3 1，收率為 57%。ESI-MS (m/z) 852 [Μ+Η]+, [ α J20d =-19. 4 (c = 1. 0，CH3OH)。實施例31HC1 · Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -Gly-OCH2 (CH2) 6CH3 的制備按照實施例7 的方法，從 1. 20g(l. 69mmol)Boc-Glu (OBzl)-Asp (OBzl)-Gly-OCH2 ( CH2)6CH3 制得 0. 98g(90% )標(biāo)題化合物，為無色固體。ESI-MS(m/z) :612[M+H] +。實施例32HC1 · Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -Gly-OCH2 (CH2) 8CH3 的制備按照實施例7 的方法，從 1. 30mg(l. 76mmol) Boc-Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -Gly-OCH2 (CH2)8CH3 制得 1.08g(91% )標(biāo)題化合物，為無色固體。ESI-MS(m/z) :640[M+H] +。實施例33HC1 · Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -Gly-OCH2 (CH2) 10CH3 的制備按照實施例7 的方法，從 1. 20mg(l. 56mmol) Boc-Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -Gly-OCH2 (CH2)ltlCH3 制得 1.0Ig(92% )標(biāo)題化合物，為無色固體。ESI-MS(m/z) :668[M+H]+。實施例34HC1 · Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -Gly-OCH2 (CH2) 12CH3 的制備按照實施例7 的方法，從 1. 50mg(l. 89mmol) Boc-Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -Gly-OCH2 (CH2)12CH3 制得 1. 30g(94% )標(biāo)題化合物，為無色固體。ESI-MS(m/z) :696[M+H]+。實施例35HC1 · Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -Gly-OCH2 (CH2) 14CH3 的制備按照實施例7 的方法，從 1. 50g(l. 82謹(jǐn)ol)Boc-Glu (OBzl)-Asp (OBzl)-Gly-OCH2 ( CH2)14CH3 制得 1. 26g(91% )標(biāo)題化合物，為無色固體。ESI-MS(m/z) :724[M+H]+。實施例36HC1 · Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -Gly-OCH2 (CH2) 16CH3 的制備按照實施例7 的方法，從 1. 41g(l. 66mmol)Boc-Glu (OBzl)-Asp (OBzl)-Gly-OCH2 ( CH2)16CH3 制得 1. 17g(89% )標(biāo)題化合物，為無色固體。ESI-MS(m/z) :752[M+H]+。實施例37Glu-Asp-Gly-OCH2 (CH2) 6CH3 (7a)的制備將980mg(l. 52mmol)HCl · Glu (OBzl)-Asp (OBzl)-Gly-OCH2 (CH2) 6CH3 用乙醇溶解、 加入適量Pd/C(約5% )、通H2 (0. 02Mba)，室溫攪拌至原料點消失。濾除Pd/C、濾液減壓濃 縮至干。制得554mg(84% )標(biāo)題化合物，為無色油狀物。ESI_MS(m/Z) :430[Μ_ΗΓ，[a]20D =-15. 9 (c = 1. 0，CH3OH)。實施例38Glu-Asp-Gly_0CH2 (CH2) 8CH3 (7b)的制備將1. 08g(l. 60mmol)HCl · Glu (OBzl)-Asp (OBzl)-Gly-OCH2 (CH2)8CH3 用乙醇溶解、 加入適量Pd/C(約5% )、通H2 (0. 02Mba)，室溫攪拌至原料點消失。濾除Pd/C、濾液減壓濃 縮至干。制得646mg(88% )標(biāo)題化合物，為無色油狀物。ESI_MS(m/Z) :458[Μ_ΗΓ，[a]20D =-17. 8 (c = 1. 0，CH3OH)。實施例39Glu-Asp-Gly_0CH2 (CH2) 10CH3 (7c)的制備將1. OOmg (1. 44mmol)HCl · Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -Gly-OCH2 (CH2) 10CH3 用乙醇溶 解、加入適量Pd/C(約5% )、通H2(0. 02Mba)，室溫攪拌至原料點消失。濾除Pd/C、濾液減壓濃縮至干。制得632mg(90% )標(biāo)題化合物，為無色油狀物。ESI-MS (m/z) :486 [Μ_Η]_，[ α ]2°D =-17. 0 (c = 1. 0，CH3OH)。實施例40Glu-Asp-Gly_0CH2 (CH2) 12CH3 (7d)的制備將1. 30g(l. 78mmol)HCl ·Glu (OBzl)-Asp (OBzl)-Gly-OCH2 (CH2) 12CH3 用乙醇溶解、 加入適量Pd/C(約5% )、通H2(0. 02Mba)，室溫攪拌至原料點消失。濾除Pd/C、濾液減壓 濃縮至干。制得806mg(88% )標(biāo)題化合物，為無色固體。ESI_MS(m/Z) :514[Μ_ΗΓ，[a]20D =-6· 8 (c = 1· 0，CH3OH)，Μ. ρ. :88· 0-89. 0°C。實施例41Glu-Asp-Gly_0CH2 (CH2) 14CH3(7e)的制備將1. 26g(l. 66mmol)HCl .Glu (OBzl)-Asp (OBzl)-Gly-OCH2 (CH2) 14CH3 用乙醇溶解、 加入適量Pd/C(約5% )、通H2 (0. 02Mba)，室溫攪拌至原料點消失。濾除Pd/C、濾液減壓濃 縮至干。制得869mg(95%)標(biāo)題化合物，為無色固體。ESI_MS(m/Z) :542[Μ_ΗΓ;，[α J20d =-11. l(c = 1. 0，CH3OH)，Μ. ρ. :78· 8-79. 2°C。實施例42Glu-Asp-Gly-0CH2 (CH2) 16CH3 (7f)的制備將1. 17g(l. 48mmol)HCl ·Glu (OBzl)-Asp (OBzl)-Gly-OCH2 (CH2) 16CH3 用乙醇溶解、 加入適量Pd/C(約5% )、通H2(0. 02Mba)，室溫攪拌至原料點消失。濾除Pd/C、濾液減壓 濃縮至干。制得823mg(97% )標(biāo)題化合物，為無色固體。ESI_MS(m/Z) :570[Μ_ΗΓ，[a]20D =-5· 5 (c = 1· 0，CH3OH)，Μ. ρ. :80· 8-82. 2°C。試驗例1飽和脂肪鏈醇Glu-Asp-Gly三肽酯對小鼠脾淋巴細(xì)胞絲裂原增殖的抑制 作用脫頸處死小鼠，無菌取脾，用200目鋼網(wǎng)和注射器芯研磨，用HANK’ S液洗兩次， 1500轉(zhuǎn)/分條件下離心10分鐘，計數(shù)后用完全RPMI-1640培養(yǎng)液配成5X106/ml個脾淋 巴細(xì)胞，加100 μ 1細(xì)胞懸液于96孔培養(yǎng)板中(每孔含5Χ106個細(xì)胞)。每孔加20 μ 1 ConA (ConA終濃度為5 μ g/ml)，該96孔培養(yǎng)板置于體積分?jǐn)?shù)為0. 05的CO2飽和濕度的培養(yǎng) 箱內(nèi)37°C培養(yǎng)4h。4h后分別加入不同濃度飽和脂肪鏈醇Glu-Asp-Gly三肽酯(1 X 10_4M、 8X 1(Γ5Μ、5Χ 1(Γ5Μ、3Χ 1(Γ5Μ、1Χ 1(Γ5Μ、8Χ 1(Γ6Μ、5Χ ICT6M 和 IX I(T6M)，每個濃度 3 個復(fù)孔。 同時設(shè)不含化合物對照孔和只含同量培養(yǎng)液無ConA的細(xì)胞空白孔。各個孔均重復(fù)3次(η =3)。培養(yǎng)48h后用MTT法檢測化合物對脾淋巴細(xì)胞的抑制作用。按照公式“抑制率=(D對照-D含藥)/D對照X 100%”計算不同濃度飽和脂肪鏈 醇Glu-Asp-Gly三肽酯對脾淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用，根據(jù)細(xì)胞相對生存率和化合物的濃 度繪制細(xì)胞生長曲線，利用該生長曲線求得半數(shù)抑制率(dxIC5ci)。結(jié)果列入表1。結(jié)果表明 本發(fā)明的飽和脂肪鏈醇Glu-Asp-Gly三肽酯對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖有明確的抑制作用。表1飽和脂肪鏈醇Glu-Asp-Gly三肽酯對小鼠脾淋巴細(xì)胞絲裂原增殖的抑制作用
試驗例2飽和脂肪鏈醇Glu-Asp-Gly三肽酯對巨噬細(xì)胞吞噬的抑制作用將生長狀態(tài)良好、處于對數(shù)生長期的Ana-I小鼠巨噬細(xì)胞以IXlO5個/mL的密度 接種于96孔板，每孔100μ 1，37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時，按預(yù)設(shè)的濃度梯度加入 經(jīng)滅菌處理的飽和脂肪鏈醇Glu-Asp-Gly三肽酯(1 X 10_4M、8X 10_5M、5X 10_5M、3X 10_5M、 1 X 10_5M、8X 10_6M、5X ΙΟ—Μ和1 X I(T6M)，每個濃度3個復(fù)孔，對照組加入等體積的溶解樣 品的溶媒。繼續(xù)培養(yǎng)24小時后，吸棄上清液，每孔加入100 μ 10. 的中性紅溶液，置于 37°C孵育30分鐘。吸棄中性紅溶液，并用PBS緩沖溶液洗滌2-3次(除去未被巨噬細(xì)胞吞 噬的中性紅)，加入細(xì)胞溶解液(乙醇乙酸=1 1)100 μ 1，4°C過夜，酶標(biāo)儀檢測吸光度 值，波長540nm。各個孔均重復(fù)3次(η = 3)。按照公式“抑制率=(D對照-D含藥)/D對照Χ100%”計算不同濃度的化合物 對巨噬細(xì)胞的吞噬能力的抑制作用，根據(jù)細(xì)胞相對生存率和化合物的濃度繪制細(xì)胞生長曲 線，利用該生長曲線求得半數(shù)抑制率(dxIC5ci)。結(jié)果列入表2。結(jié)果表明本發(fā)明的飽和脂肪 鏈醇Glu-Asp-Gly三肽酯對Ana-I小鼠巨噬細(xì)胞吞噬有明確的抑制作用。表2飽和脂肪鏈醇Glu-Asp-Gly三肽酯對Ana-I小鼠巨噬細(xì)胞吞噬的抑制作用 試驗例3飽和脂肪鏈醇Glu-Asp-Gly三肽酯在納米水平的自組裝將飽和脂肪鏈醇Glu-Asp-Gly三肽酯配置成1 μ mol/ml的水溶液，在激光納米粒 度儀上25°C測定粒徑。連續(xù)測定8天，記錄其粒徑。結(jié)果列入表3。數(shù)據(jù)表明，本發(fā)明的飽 和脂肪鏈醇Glu-Asp-Gly三肽酯水溶液中均能自組裝成粒經(jīng)穩(wěn)定在117-2290nm的納米球。表3飽和脂肪鏈醇Glu-Asp-Gly三肽酯在水中自組裝的納米球粒徑
權(quán)利要求
通式I的6種具有免疫抑制活性的飽和脂肪鏈醇Glu Asp Gly三肽酯Glu Asp Gly O CH2 (CH2)nCH3I通式I中的n＝6、8、10、12、14或16。
2.一種制備權(quán)利要求1的飽和脂肪鏈醇Glu-Asp-Gly三肽酯的方法，包括⑴將N端保護(hù)基保護(hù)的甘氨酸與飽和脂肪醇縮合，所述飽和脂肪醇為CH3 (CH2) nCH20H， η = 6、8、10、12、14 或 16 ；(2)脫去N端保護(hù)基得到飽和脂肪醇甘氨酸酯；(3)按照現(xiàn)有液相合成技術(shù)，將飽和脂肪醇甘氨酸酯與天冬氨酸的保護(hù)中間體、谷氨酸 的保護(hù)中間體逐步接肽合成保護(hù)基保護(hù)的飽和脂肪醇三肽綴合物；(4)依次脫去保護(hù)基保護(hù)的飽和脂肪醇三肽綴合物的N端保護(hù)基和C端保護(hù)基得到目 標(biāo)化合物。
3.權(quán)利要求1的6種飽和脂肪鏈醇Glu-Asp-Gly三肽酯在制備免疫抑制劑類藥物中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求1的6種飽和脂肪鏈醇Glu-Asp-Gly三肽酯作為制備微乳或脂質(zhì)體藥物載 體的制劑材料的用途。
5.權(quán)利要求1的6種飽和脂肪鏈醇Glu-Asp-Gly三肽酯作為制備微乳、脂質(zhì)體藥物載 體的靶向制劑材料中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及通式I的6種具有免疫抑制活性的飽和脂肪鏈醇Glu-Asp-Gly三肽酯綴合物，在飽和脂肪鏈醇中n＝6、8、10、12、14或16，涉及它們的制備方法以及作為免疫抑制劑的應(yīng)用。這些飽和脂肪鏈醇Glu-Asp-Gly三肽酯對脾淋巴細(xì)胞絲裂原增殖反應(yīng)的抑制作用，以及對巨噬細(xì)胞吞噬活性的抑制作用的實驗結(jié)果表明，本發(fā)明的化合物具有優(yōu)秀的免疫抑制作用，臨床上可作為免疫抑制劑應(yīng)用。Glu-Asp-Gly-O-CH2-(CH2)nCH3 I
文檔編號C07K1/02GK101899085SQ200910085319
公開日2010年12月1日 申請日期2009年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月26日
發(fā)明者彭師奇, 趙明, 趙淑銳 申請人:首都醫(yī)科大學(xué)