專利名稱：一種高純達(dá)托霉素的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種達(dá)托霉素的制備方法，具體地說(shuō)，涉及一種采用膜分離和樹脂層 析技術(shù)制備高純達(dá)托霉素的方法。
背景技術(shù)：
病原菌對(duì)抗生素產(chǎn)生耐藥性是當(dāng)今全球面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)之一，尋找能有效抑制抗 藥菌的抗生素是解決這一問(wèn)題的根本途徑。萬(wàn)古霉素，曾被認(rèn)為是抗革蘭氏陽(yáng)性菌的最后 一道防線，然而全世界范圍內(nèi)臨床上發(fā)現(xiàn)了越來(lái)越多的耐此藥菌。達(dá)托霉素(Daptomycin)被公認(rèn)為在萬(wàn)古霉素之后的最佳備用抗生素，是美國(guó)禮 萊公司20世紀(jì)80年代發(fā)現(xiàn)的新型脂肽類抗生素，對(duì)MRSA(耐甲西林金黃葡萄球菌)有明 顯的抑制作用，除抗MRSA之外，達(dá)托霉素還對(duì)絕大多數(shù)的革蘭氏陽(yáng)性菌有抑制作用。據(jù)報(bào) 道，達(dá)托霉素對(duì)2002 2005年從美國(guó)和加拿大各醫(yī)院收集的19615株臨床革蘭氏陽(yáng)性菌 中的99%存在抑制作用。自從2003年9月FDA首次批準(zhǔn)Cubicin (Daptomycin注射劑)用 于治療復(fù)雜皮膚和皮膚結(jié)構(gòu)感染以來(lái)，達(dá)托霉素在臨床上應(yīng)用越來(lái)越多，市場(chǎng)上對(duì)達(dá)托霉 素的需求量越來(lái)越大。達(dá)托霉素雖然2003年在美國(guó)實(shí)現(xiàn)工業(yè)化，然而在中國(guó)未能實(shí)現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)，一是 因?yàn)闆]有好的工業(yè)化生產(chǎn)菌種，二是因?yàn)闆]有掌握工業(yè)化后提取技術(shù)。在提取技術(shù)方面，國(guó)內(nèi)基本還處于工藝技術(shù)的研究階段，除華北制藥發(fā)表過(guò)關(guān)于 大孔吸附樹脂分離純化達(dá)托霉素的論文外，無(wú)其他關(guān)于后提取方面的報(bào)道。采用大孔吸附 樹脂分離，得到的純化液含量只有80%左右，不能滿足制藥的需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種容易操作，成本低的制備高純度達(dá)托霉素方法。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種達(dá)托霉素的制備方法，包括如下步驟1)先將發(fā)酵產(chǎn)生的達(dá)托霉素菌液用截留分子量為10000 100000的一級(jí)膜分離 系統(tǒng)處理，得到達(dá)托霉素濾液；2)然后將所述達(dá)托霉素濾液經(jīng)過(guò)截留分子量為50 1500的二級(jí)膜分離系統(tǒng)處 理，得到達(dá)托霉素濃縮液；3)所述達(dá)托霉素濃縮液再經(jīng)過(guò)陽(yáng)離子樹脂吸附，酸梯度洗脫后，經(jīng)過(guò)陰離子樹脂 中和，得到達(dá)托霉素中和液；4)所述達(dá)托霉素中和液再經(jīng)截留分子量為500 800的三級(jí)膜系統(tǒng)進(jìn)行濃縮，得 到高濃度的達(dá)托霉素濃縮液；5)所述達(dá)托霉素濃縮液最后進(jìn)行濃縮和結(jié)晶，得到高純度的達(dá)托霉素結(jié)晶固體。其中，所述一級(jí)膜分離系統(tǒng)可去除菌絲體、可溶性蛋白、培養(yǎng)基及部分色素等，多 采用截留分子量為10000 100000的膜系統(tǒng)，最佳截留分子量為10000 50000，可以是各 種超濾膜系統(tǒng)。
所述一級(jí)膜分離系統(tǒng)，加水洗滌量為原料液量的1 2. 5倍，洗滌終止后收率達(dá) 95%以上。所述二級(jí)膜系統(tǒng)進(jìn)行濃縮分離，并脫鹽脫色，去除一些單糖、大量無(wú)機(jī)鹽等小分子 雜質(zhì)，采用截留分子量為50 1500的膜系統(tǒng)，最佳截留分子量為500 800，可以是各種納 濾膜系統(tǒng)。所述二級(jí)膜分離系統(tǒng)，加水洗滌量為原料液量的0. 5 1. 5倍，最終濃縮倍數(shù)達(dá) 8 10倍左右。最終濃縮液電導(dǎo)控制在2000uS/cm以下，最佳控制在lOOOus/cm以下。所述三級(jí)膜分離系統(tǒng)，采用納濾膜，最佳截留分子量為500 800。三級(jí)膜分離系統(tǒng)，納濾后電導(dǎo)值為lOOOus/cm以下，最佳電導(dǎo)值控制在500uS/cm 以下。所述陽(yáng)離子交換樹脂采用二乙烯苯交聯(lián)的聚苯乙烯為基質(zhì)的磺酸型的強(qiáng)酸性離 子交換樹脂；陰離子交換樹脂是凝膠型弱堿性陰離子交換樹脂。強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹脂層析柱內(nèi)徑和填裝高度之比為1 2以上，優(yōu)選1 4 1 6。本發(fā)明達(dá)托霉素發(fā)酵液，經(jīng)過(guò)一級(jí)、二級(jí)膜分離系統(tǒng)后，再經(jīng)過(guò)陽(yáng)離子交換樹脂吸 附，梯度酸洗，液相跟蹤檢測(cè)，收集達(dá)托霉素純度在90%以上的組分，用陰離子交換樹脂中 和，中和液進(jìn)入三級(jí)納濾膜系統(tǒng)進(jìn)行濃縮，得到澄清的高含量的達(dá)托霉素濃縮液，此濃縮液 中達(dá)托霉素純度可以達(dá)到95%以上。濃縮液再經(jīng)過(guò)常規(guī)減壓濃縮至濃度為50%左右，加等 量的乙醇，0 5°C靜置結(jié)晶，過(guò)濾干燥后，得到固體的達(dá)托霉素，純度在98%以上。本發(fā)明測(cè)定達(dá)托霉素含量的方法采用高效液相色譜法，其檢測(cè)條件與論文“達(dá)托 霉素發(fā)酵液大孔樹脂吸附分離的研究”(中國(guó)抗生素雜志2008年2月第33卷第2期)的 相同。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。實(shí)驗(yàn)材料為達(dá)托霉素發(fā)酵液，pH值為7. O左右，料液較為粘稠。實(shí)施例1先將達(dá)托霉素發(fā)酵液經(jīng)過(guò)截留分子量為100000的有機(jī)平板超濾膜過(guò)濾，平均膜 通量可以達(dá)到60LMH，加水量為原料液的1. 5倍，最終濃縮倍數(shù)為2倍。超濾膜過(guò)濾的平均 收率可以達(dá)99%。通過(guò)大分量超濾膜系統(tǒng)過(guò)濾，去除了菌絲體及大部分大分子物質(zhì)(如可 溶性蛋白、培養(yǎng)基及部分色素)，濾液澄清度高，質(zhì)量很好，能夠滿足生產(chǎn)工藝要求。濾液再經(jīng)納濾膜進(jìn)一步濃縮，并脫鹽脫色，納濾膜選用截留分子量為500的卷式 納濾膜，平均膜通量為25LMH，加水量控制在原超濾液的0. 5倍左右，最終濃縮倍數(shù)在8倍左 右，這樣最終濃縮液電導(dǎo)可控制在lOOOus/cm以下。透過(guò)液基本無(wú)損失，收率可達(dá)到98%。 通過(guò)納濾膜脫鹽脫色，去除一些單糖、大量無(wú)機(jī)鹽等小分子雜質(zhì)，得到澄清的達(dá)托霉素濃縮 液。濃縮液經(jīng)過(guò)一個(gè)填有陽(yáng)離子交換樹脂(優(yōu)選磺酸型的強(qiáng)酸性離子交換樹脂)的層 析柱，層析柱內(nèi)徑為100cm，填柱高度為450cm，控制流速為每小時(shí)0.3倍柱體積。流完后 改用洗脫劑洗脫，洗脫劑的流速為每小時(shí)0. 3倍柱體積，洗脫劑為鹽酸溶液，通過(guò)一個(gè)混合泵，將洗脫劑配成不同的濃度，進(jìn)入層析柱，最初進(jìn)入的濃度為0. OlN的鹽酸溶液，以后以 0. OlN的梯度變化，最后濃度為0. 05N。洗脫過(guò)程中，液相跟蹤檢測(cè)，收集純度在90%以上的 達(dá)托霉素洗脫液。濃縮液用弱堿性陰離子交換樹脂(優(yōu)選凝膠型弱堿性陰離子交換樹脂) 中和到pH7. 0左右。將上述中和液，用截留分子量為800的納濾膜濃縮，平均膜通量為25LMH，加水量 控制在原超濾液的1. 5倍左右，最終濃縮倍數(shù)在10倍左右，這樣最終濃縮液電導(dǎo)可控制在 500us/cm 以下。濃縮液常規(guī)真空濃縮到濃度為50% (w/w)，加等量的乙醇，冰箱放置10小時(shí)，過(guò) 濾，干燥，得到固體的高純度達(dá)托霉素，經(jīng)檢測(cè)，純度在98. 5%以上。實(shí)施例2先將達(dá)托霉素發(fā)酵液經(jīng)過(guò)截留分子量為50000的有機(jī)平板超濾膜過(guò)濾，平均膜通 量可以達(dá)到60LMH，加水量為原料液的2. 5倍，最終濃縮倍數(shù)為3倍。超濾膜過(guò)濾的平均收 率可以達(dá)99%。通過(guò)大分量超濾膜系統(tǒng)過(guò)濾，去除了菌絲體及大部分大分子物質(zhì)(如可溶 性蛋白、培養(yǎng)基及部分色素)，濾液澄清度高，質(zhì)量很好，能夠滿足生產(chǎn)工藝要求。濾液再經(jīng)納濾膜進(jìn)一步濃縮，并脫鹽脫色，納濾膜選用截留分子量為800的卷式 納濾膜，平均膜通量為25LMH，加水量控制在原超濾液的1. 5倍左右，最終濃縮倍數(shù)在10 倍左右，這樣最終濃縮液電導(dǎo)可控制在lOOOus/cm以下。透過(guò)液基本無(wú)損失，收率可達(dá)到 98%。通過(guò)納濾膜脫鹽脫色，去除一些單糖、大量無(wú)機(jī)鹽等小分子雜質(zhì)，得到澄清的達(dá)托霉 素濃縮液。濃縮液經(jīng)過(guò)一個(gè)填有陽(yáng)離子交換樹脂(優(yōu)選磺酸型的強(qiáng)酸性離子交換樹脂)的層 析柱，層析柱內(nèi)徑為100cm，填柱高度為600cm，控制流速為每小時(shí)0.3倍柱體積。流完后 改用洗脫劑洗脫，洗脫劑的流速為每小時(shí)0. 3倍柱體積，洗脫劑為鹽酸溶液，通過(guò)一個(gè)混合 泵，將洗脫劑配成不同的濃度，進(jìn)入層析柱，最初進(jìn)入的濃度為0. OlN的鹽酸溶液，以后以 0. OlN的梯度變化，最后濃度為0. 05N。洗脫過(guò)程中，液相跟蹤檢測(cè)，收集純度在90%以上的 達(dá)托霉素洗脫液。濃縮液用弱堿性陰離子交換樹脂(優(yōu)選凝膠型弱堿性陰離子交換樹脂) 中和到pH7. 0左右。將上述中和液，用截留分子量為500的納濾膜濃縮，平均膜通量為25LMH，加水量 控制在原超濾液的1.0倍左右，最終濃縮倍數(shù)在10倍左右，這樣最終濃縮液電導(dǎo)可控制在 500us/cm 以下。濃縮液常規(guī)真空濃縮到濃度為50% (w/w)，加等量的乙醇，冰箱放置10小時(shí)，過(guò) 濾，干燥，得到固體的高純度達(dá)托霉素，經(jīng)檢測(cè)，純度高達(dá)99%以上。本發(fā)明所用的各種過(guò)濾膜在使用一段時(shí)間后，可采用膜清洗劑進(jìn)行清洗，使膜通 量得以較好的恢復(fù)，保證重復(fù)使用，以獲得工業(yè)化正常生產(chǎn)的需求。本發(fā)明綜合運(yùn)用膜分離技術(shù)及樹脂層析技術(shù)，提供了一種生產(chǎn)上可行的容易操作 的制備高純度達(dá)托霉素的方法。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
權(quán)利要求
一種高純達(dá)托霉素的制備方法，其特征在于，其包括如下步驟1)先將發(fā)酵產(chǎn)生的達(dá)托霉素菌液用截留分子量為10000～100000的一級(jí)膜分離系統(tǒng)處理，得到達(dá)托霉素濾液；2)然后將所述達(dá)托霉素濾液經(jīng)過(guò)截留分子量為50～1500的二級(jí)膜分離系統(tǒng)處理，得到達(dá)托霉素濃縮液；3)所述達(dá)托霉素濃縮液再經(jīng)過(guò)陽(yáng)離子樹脂吸附，酸梯度洗脫后，經(jīng)過(guò)陰離子樹脂中和，得到達(dá)托霉素中和液；4)所述達(dá)托霉素中和液再經(jīng)截留分子量為500～800的三級(jí)膜系統(tǒng)進(jìn)行濃縮，得到高濃度的達(dá)托霉素濃縮液；5)所述達(dá)托霉素濃縮液最后進(jìn)行濃縮和結(jié)晶，得到高純度的達(dá)托霉素結(jié)晶固體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的達(dá)托霉素的制備方法，其特征在于，所述一級(jí)膜分離系統(tǒng)為 截留分子量為10000 50000的膜系統(tǒng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的達(dá)托霉素的制備方法，其特征在于，所述一級(jí)膜分離系統(tǒng)為 超濾膜。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)所述的達(dá)托霉素的制備方法，其特征在于，所述一級(jí)膜 分離系統(tǒng)的加水洗滌量為達(dá)托霉素菌液量的1 2. 5倍。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任意一項(xiàng)所述達(dá)托霉素的制備方法，其特征在于，所述二級(jí)膜分 離系統(tǒng)為截留分子量為500 800的膜系統(tǒng)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述達(dá)托霉素的制備方法，其特征在于，所述二級(jí)膜分離系統(tǒng)為納 濾膜。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任意一項(xiàng)所述達(dá)托霉素的制備方法，其特征在于，所述二級(jí)膜分 離系統(tǒng)的加水洗滌量為原料液量的0. 5 1. 5倍，最終濃縮倍數(shù)達(dá)8 10倍。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任意一項(xiàng)所述的達(dá)托霉素的制備方法，其特征在于，所述三級(jí)膜 分離系統(tǒng)采用納濾膜。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8任意一項(xiàng)所述的達(dá)托霉素的制備方法，其特征在于，所述陽(yáng)離子 交換樹脂采用二乙烯苯交聯(lián)的聚苯乙烯為基質(zhì)的磺酸型的強(qiáng)酸性離子交換樹脂；所述陰離 子交換樹脂是凝膠型弱堿性陰離子交換樹脂。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的達(dá)托霉素的制備方法，其特征在于，強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹脂 層析柱內(nèi)徑和填裝高度之比為1 2以上，優(yōu)選1 4 1 6。全文摘要
本發(fā)明提供了一種高純達(dá)托霉素的制備方法，其先采用一級(jí)膜濾的方法將發(fā)酵液中菌絲體、可溶性蛋白、培養(yǎng)基及部分色素等去除；再用二級(jí)膜濾系統(tǒng)，進(jìn)行濃縮，去除一些單糖、大量無(wú)機(jī)鹽等小分子雜質(zhì)，得到澄清的達(dá)托霉素濃縮液；然后經(jīng)過(guò)陽(yáng)離子交換樹脂層析，陰離子交換樹脂中和后，用納濾膜濃縮和常規(guī)減壓濃縮后，結(jié)晶得到高純度達(dá)托霉素。本發(fā)明綜合運(yùn)用膜分離技術(shù)及樹脂層析技術(shù)，提供了一種生產(chǎn)上可行的容易操作的制備高純度達(dá)托霉素的方法。
文檔編號(hào)C07K1/18GK101899094SQ20091008583
公開日2010年12月1日 申請(qǐng)日期2009年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月1日
發(fā)明者余永柱, 尚海濤, 張彥, 潘聲龍, 鄭珩 申請(qǐng)人:安徽豐原發(fā)酵技術(shù)工程研究有限公司