專利名稱：一種去除流感病毒原液中內(nèi)毒素的方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種去除內(nèi)毒素的方法，尤其是一種在流感病毒原液生產(chǎn)過 程中，從流感病毒原液中去除內(nèi)毒素的方法，屬于生物技術(shù)領域。
背景技術(shù)：
隨著對生物制品安全性的重視，對其熱原的控制越來越嚴格。在生物制 品的生產(chǎn)過程中，常會因原輔材料、生產(chǎn)環(huán)境以及個人操作等因素而造成 內(nèi)毒素污染，因此產(chǎn)生環(huán)節(jié)是內(nèi)毒素產(chǎn)生的一大來源，而要防止內(nèi)毒素污 染，必須在生產(chǎn)環(huán)節(jié)中采取有效的工藝控制及嚴格的預防措施。
現(xiàn)有的方法大多根據(jù)內(nèi)毒素分子的特性來破壞或去除內(nèi)毒素。具體包 括用常規(guī)的超濾膜、離子交換色譜或親和色譜等。其中
由于內(nèi)毒素分子通常以聚合狀態(tài)存在，具有較大的相對分子質(zhì)量，因 此可選用超濾膜去除內(nèi)毒素。Czermak P等人(Czermak P, Ebrahimi M， Catapano G. New generation ceramic membranes have the potential of removing endotoxins from dialysis water and dialysate [J]. Int J Artif Organs. 2005 Jul, 28 (7) :694-700.)發(fā)現(xiàn)疏水合成的超濾膜能有效地去除 內(nèi)毒素，但是反復的除菌會破壞膜的分離性，限制其使用，且在去除蛋白 制品中的內(nèi)毒素時，由于超濾過程中的壓力較高，會導致蛋白損壞，因此 超濾膜不適合于從蛋白中去除內(nèi)毒素。
內(nèi)毒素分子的pKl值約為1.3，在生理條件下帶有部分負電荷，根據(jù)內(nèi) 毒素的這一性質(zhì)，可用陰離子交換色譜去除蛋白制品中的內(nèi)毒素。歐洲專 利(EP0800862)采用含有磺酸基的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物，利用離子 交換的原理，來去除重組蛋白質(zhì)腫瘤壞死因子或白介素中的內(nèi)毒素的，它 主要是吸附重組蛋白質(zhì)。但在離子交換中，遇到堿性蛋白時，有可能與內(nèi) 毒素一起被洗脫而引起蛋白的損失，而遇到酸性蛋白時，則其能和內(nèi)毒素形成復合物將其從柱上脫離，從而不能達到蛋白質(zhì)與內(nèi)毒素的完全分離。
(Friedrich Birger Anspach and Oliver Hilbeck. Removal of endotoxins by affinity sorbents [J].Journal of Chromatography A， 1995 S印tember:81-92)。
另外，使用親和色譜體系來選擇性去除內(nèi)毒素，就載體費用而言，這 些體系中載體價格昂貴，且難于再生，造成載體的壽命短，同時色譜體系 中存在著容量小的問題。美國專利(US4885168)采用低分子量殼聚糖，利 用殼聚糖上帶正電荷的氨基來與帶負電荷的核酸與內(nèi)毒素作用，達到除去 核酸與內(nèi)毒素的目的，但殼聚糖的利用率低。D.Petsch， T.C.Beeskow等 (1997， Journal of Chromatography B. 693， 79-91)采用去氧膽酸鈉，或己 二胺作為親和配基，以微孔尼龍膜為介質(zhì)，制成親和膜；采用單張親和膜， 可以去除緩沖液或牛血清白蛋白中的內(nèi)毒素；但是流速低，阻力高，處理 量少，不易放大。
由于內(nèi)毒素固有的如帶電性與部分蛋白相同，雙性分子以及易形成微 囊結(jié)構(gòu)等特性，使得上述常用的從蛋白質(zhì)溶液中去除內(nèi)毒素的方法，很難 將其與蛋白質(zhì)徹底分離，且操作繁瑣，成本高。
流感裂解滅活病毒疫苗是通過雞胚培養(yǎng)法獲得病毒尿囊液，再經(jīng)過一系 列病毒裂解滅活和純化過程制得的一種用于預防流感的發(fā)生和傳播的生物 制品，其病毒原液由于雞胚帶有潛在的病原菌，而SPF雞胚的獲得較為困 難，以及后處理分離純化過程復雜，易造成內(nèi)毒素的污染。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種從流感病毒原液中去除內(nèi)毒素的方法，且該 方法既可去除內(nèi)毒素，又能最大限度地保持病毒原液質(zhì)量。
本發(fā)明通過下列技術(shù)方案完成 一種從流感病毒原液中去除內(nèi)毒素的方
法，包括萃取分離，其特征在于在流感病毒原液中加入終濃度為0.5 5%
(體積百分濃度)的介質(zhì)——聚乙二醇單辛基酚醚，用于萃取分離流感病 毒原液中的蛋白質(zhì)和內(nèi)毒素。所述聚乙二醇單辛基酚醚介質(zhì)是一種聚乙二醇單辛基酚醚表面活性劑
-Triton X-114。
所述流感病毒原液為流感病毒疫苗制備過程中的半成品，屬公知公用產(chǎn)
口
叩o
本發(fā)明提供的一種從流感病毒原液中去除內(nèi)毒素的方法，具體經(jīng)過下列
步驟
A、 在流感病毒原液中加入終濃度為0.5 5% (體積百分濃度)的聚乙 二醇單辛基酚醚表面活性劑一Triton X-114,混勻；
B、 置于溫度為37士0.5。C的水浴中孵育5-IO分鐘，使聚乙二醇單辛基 酚醚表面活性劑Triton X-114介質(zhì)與流感病毒原液形成一相，20 30分鐘 溶液明顯分層后取出；
C、 于室溫、10000rpm 15000rpm條件下離心分離3 8分鐘，吸取上 清液；
D、 在步驟C的上清液中，加入終濃度為1% (體積百分濃度)的聚乙二 醇單辛基酚醚表面活性劑Triton X-114介質(zhì)，并重復A步驟一C歩驟2 3 次，收集所得上清液，即為去除內(nèi)毒素的流感病毒原液。
本發(fā)明具有下列優(yōu)點和效果采用上述方案，可在不改變流感病毒原液 原有性質(zhì)的條件下，有效去除流感病毒原液中的內(nèi)毒素，使內(nèi)毒素含量降 低到< 0. 25EU/mL，并保留流感病毒原液中的有效成分，達到優(yōu)化質(zhì)量的效 果，本發(fā)明操作簡單，內(nèi)毒素去除率高，蛋白質(zhì)總量回收率高達85%以上， 血凝效價不變，血凝素含量回收率達99%以上，所得流感病毒原液安全、可
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步描述。 實施例1
A、在裝有50ml的流感病毒原液的離心管中加入終濃度為1%的聚乙二 醇單辛基酚醚表面活性劑Triton X-114介質(zhì)0.5ml，混勻；B、 置于溫度為37士0.5t:的水浴鍋內(nèi)孵育10分鐘，使聚乙二醇單辛基 酚醚表面活性劑Triton X-114介質(zhì)與流感病毒原液形成一相，30分鐘溶 液明顯分層后取出；
C、 于室溫、15000rpm條件下離心分離8分鐘，吸取上清液轉(zhuǎn)至另一離 心管中；
D、 再步驟C的離心管中，加入終濃度為1%的聚乙二醇單辛基酚醚表面 活性劑Triton X-114介質(zhì)，并重復A步驟一C步驟3次，收集所得上清液， 即為去除內(nèi)毒素的流感病毒原液。
采用現(xiàn)有技術(shù)的常規(guī)檢驗方法，即采用鱟試劑凝膠法檢測內(nèi)毒素含量， 采用Lowry法檢測蛋白質(zhì)含量，采用紅細胞凝集試驗法檢測血凝素效價， 采用單向免疫擴散法檢測血凝素含量，得到下列結(jié)果該流感病毒原液中 的內(nèi)毒素從200-400EU/mL降低到< 0. 25EU/mL，蛋白質(zhì)總量回收率為 85.02%，血凝效價不變，血凝素含量回收率為99.87%。
實施例2
A、 在裝有50ml的流感病毒原液的離心管中加入終濃度為2%的聚乙二 醇單辛基酚醚表面活性劑Triton X-114介質(zhì)lml，混勻；
B、 置于溫度為37士0.5。C的水浴鍋內(nèi)孵育5分鐘，使聚乙二醇單辛基 酚醚表面活性劑Triton X-114介質(zhì)與流感病毒原液形成一相，20分鐘溶液 明顯分層后取出；
C、 于室溫、12000rpm條件下離心分離3分鐘，吸取上清液轉(zhuǎn)至另一離 心管中；
D、 再步驟C的離心管中，加入終濃度為2%的聚乙二醇單辛基酚醚表面 活性劑Triton X-114介質(zhì)，并重復A步驟一C步驟2次，收集所得上清液， 即為去除內(nèi)毒素的流感病毒原液。
采用現(xiàn)有技術(shù)的常規(guī)檢驗方法，即采用鱟試劑凝膠法檢測內(nèi)毒素含量， 采用Lowry法檢測蛋白質(zhì)含量，采用紅細胞凝集試驗法檢測血凝素效價， 采用單向免疫擴散法檢測血凝素含量，得到下列結(jié)果該流感病毒原液中
6的內(nèi)毒素從200-400EU/mL降低到< 0. 25EU/mL，蛋白質(zhì)總量回收率為 85.22%，血凝效價不變，血凝素含量回收率為99. 57%。 實施例3
A、 在裝有50ml的流感病毒原液的離心管中加入終濃度為3%的聚乙二 醇單辛基酚醚表面活性劑Triton X-114介質(zhì)1. 5ml，混勻；
B、 置于溫度為37士0.5。C的水浴鍋內(nèi)孵育8分鐘，使聚乙二醇單辛基 酚醚表面活性劑Triton X-114介質(zhì)與流感病毒原液形成一相，25分鐘溶液 明顯分層后取出；
C、 于室溫、10000rpm條件下離心分離5分鐘，吸取上清液轉(zhuǎn)至另一離 心管中；
D、 再步驟C的離心管中，加入終濃度為3%的聚乙二醇單辛基酚醚表面 活性劑Triton X-114介質(zhì)，并重復A步驟一C步驟2次，收集所得上清液， 即為去除內(nèi)毒素的流感病毒原液。
采用現(xiàn)有技術(shù)的常規(guī)檢驗方法，即采用鱟試劑凝膠法檢測內(nèi)毒素含量， 采用Lowry法檢測蛋白質(zhì)含量，采用紅細胞凝集試驗法檢測血凝素效價， 采用單向免疫擴散法檢測血凝素含量，得到下列結(jié)果該流感病毒原液中 的內(nèi)毒素從200-400EU/mL降低到< 0. 25EU/mL，蛋白質(zhì)總量回收率為 85.08%，血凝效價不變，血凝素含量回收率為99.67%。
權(quán)利要求
1、一種從流感病毒原液中去除內(nèi)毒素的方法，包括萃取分離，其特征在于在流感病毒原液中加入終濃度為0.5-5％體積百分濃度的介質(zhì)——聚乙二醇單辛基酚醚，用于萃取分離流感病毒原液中的蛋白質(zhì)和內(nèi)毒素。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的從流感病毒原液中去除內(nèi)毒素的方法，其特 征在于所述聚乙二醇單辛基酚醚介質(zhì)是一種聚乙二醇單辛基酚醚表面活性 劑——Triton X-114。
3、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的從流感病毒原液中去除內(nèi)毒素的方法，其特 征在于經(jīng)過下列步驟A、 在流感病毒原液中加入終濃度為0. 5 5%體積百分濃度的聚乙二醇 單辛基酚醚表面活性劑一Triton X-114，混勻；B、 置于溫度為37士0. 5。C的水浴中孵育5 10分鐘，使聚乙二醇單辛 基酚醚表面活性劑Triton X-114介質(zhì)與流感病毒原液形成一相，20 30分 鐘溶液明顯分層后取出；C、 于室溫、10000rpm 15000rpm條件下離心分離3 8分鐘，吸取上 清液；D、 在步驟C的上清液中，加入終濃度為1%體積百分濃度的聚乙二醇 單辛基酚醚表面活性劑Triton X-114介質(zhì)，并重復A步驟一C步驟2 3次， 收集所得上清液，即為去除內(nèi)毒素的流感病毒原液。
全文摘要
本發(fā)明提供一種從流感病毒原液中去除內(nèi)毒素的方法，包括萃取分離，其特征在于在流感病毒原液中加入終濃度為0.5-5％(體積百分濃度)的介質(zhì)——聚乙二醇單辛基酚醚，用于萃取分離流感病毒原液中的蛋白質(zhì)和內(nèi)毒素?？稍诓桓淖兞鞲胁《驹涸行再|(zhì)的條件下，有效去除流感病毒原液中的內(nèi)毒素，使內(nèi)毒素含量降低到＜0.25EU/mL，并保留流感病毒原液中的有效成分，達到優(yōu)化質(zhì)量的效果，本發(fā)明操作簡單，內(nèi)毒素去除率高，蛋白質(zhì)總量回收率高達85％以上，血凝效價不變，血凝素含量回收率達99％以上，所得流感病毒原液安全、可靠。
文檔編號C07K14/11GK101503462SQ20091009419
公開日2009年8月12日 申請日期2009年3月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月11日
發(fā)明者澤 劉, 姚忠萍, 姜述德, 張新文, 李映波, 畢湖冰, 瑋 蔡, 高菁霞, 黃秋香 申請人:中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所