專(zhuān)利名稱(chēng)：一種制備毛萼乙素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物學(xué)領(lǐng)域，具體地，涉及一種應(yīng)用高速逆流色譜(HSCCC)法從疏花 毛萼香茶菜粗提物中制備高純度的藥物化合物毛萼乙素的方法。
背景技術(shù)：
毛萼乙素是一種從分布于我國(guó)西南部特有的唇形科香茶菜屬植物毛萼香茶菜 (Isodon eriocalyx(Dunn)Hara)禾口(Isodori eriocalyx var. Iaxiflora C. Y. Wu et H. W. Li)中純化出的對(duì)映-貝殼杉烷類(lèi)化合物。在民間用于抗炎和抗菌。在中 國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)朇N02134163.X，從毛萼香茶菜中分離了化合物毛萼乙素用于制備預(yù)防或治療 癌癥的藥物。在中國(guó)申請(qǐng)?zhí)朇N200510110089.8，毛萼香茶菜還能用于治療急性白血病以及 伯基特淋巴瘤等疾病。以前報(bào)道的毛萼乙素的提取分離主要是采用柱色譜法，包括硅膠柱 和凝膠柱。但是所有的這些柱色譜都需要使用固體填料，易產(chǎn)生不可逆吸附，具有樣品易損 失、易污染、低效、速度慢和分離步驟煩瑣等缺點(diǎn)。高速逆流色譜技術(shù)不同于傳統(tǒng)的柱色譜， 不需使用固體填料，而是應(yīng)用兩相互不混溶的溶劑系統(tǒng)在支撐管內(nèi)高速行星運(yùn)動(dòng)的方式下 進(jìn)行天然產(chǎn)物的分離純化，因而沒(méi)有不可逆吸附，具有樣品無(wú)損失、無(wú)污染、高效、快速和大 制備量分離的優(yōu)點(diǎn)。迄今，現(xiàn)有技術(shù)中未有應(yīng)用高速逆流色譜(HSCCC)法制備高純度的藥 物化合物毛萼乙素的方法的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種應(yīng)用高速逆流色譜(HSCCC)法從疏花毛萼香茶菜粗提物中 制備高純度的毛萼乙素的方法。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案制備毛萼乙素的方 法，用高速逆流色譜HSCCC法從疏花毛萼香茶菜粗提物中制備。高速逆流色譜固定相、流動(dòng)相的溶劑體系由正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水組成，組成 比例為 4-6 4-6 4-6 4-6。制備溫度選擇在18-35°C。更具體地，本發(fā)明制備毛萼乙素的方法是在室溫18-35 °C下，首先以 4-6 4-6 4-6 4-6體積比將正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水溶劑體系配置于分液漏斗中， 搖均后靜置分層，待平衡一段時(shí)間后，將上相和下相分開(kāi)，取上相為固定相，下相為流動(dòng)相， 取疏花毛萼香茶菜粗提物溶解于5mL上相和5mL下相的混合溶液中作待分離樣品溶液用， 采用分析型TBE-20A高速逆流色譜儀(多層纏繞聚四氟乙烯柱容量約為16mL)，并配有柱塞 泵、進(jìn)樣閥、紫外檢測(cè)器和記錄儀。先用固定相充滿整個(gè)柱子，調(diào)整主機(jī)轉(zhuǎn)速到1600rpm，以 0. 5mL/min的流速將流動(dòng)相泵入柱內(nèi)；待整個(gè)體系建立動(dòng)態(tài)平衡后，由進(jìn)樣閥進(jìn)樣0. ImL ； 然后根據(jù)檢測(cè)器紫外譜圖接收目標(biāo)成分，經(jīng)HPLC檢測(cè)即可。疏花毛萼香茶菜粗提物的制備，參考中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)朇N02134163.X所載，即取 疏花毛萼香茶菜藥材地上部分，粉碎，藥粉用70%丙酮室溫浸泡提取三次，合并提取液，減壓濃縮至干。該發(fā)明方案如下采用分析型高速逆流色譜儀的小量制備及半制備型高速逆 流色譜儀較大量制備，選用的溶劑體系由正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水組成，組成比例為 4-6 4-6 4-6 4-6，一步分離即可以得到毛萼乙素。室溫對(duì)分離度有一定的影響，以 上分離條件適合溫度在18-35°C時(shí)使用。相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明應(yīng)用高速逆流色譜技術(shù)HSCCC從疏花毛萼香茶菜粗提物 中制備高純度的毛萼乙素的方法，不同于傳統(tǒng)的柱色譜，不需使用固體填料而是應(yīng)用兩相 互不混溶的溶劑系統(tǒng)在支撐管內(nèi)高速行星運(yùn)動(dòng)的方式下進(jìn)行天然產(chǎn)物的分離純化，因而沒(méi) 有不可逆吸附，具有樣品無(wú)損失、無(wú)污染、高效、快速和大制備量分離的優(yōu)點(diǎn)，獲得的毛萼乙 素純度可達(dá)98%以上，適用于用各種型號(hào)的逆流色譜儀分離制備毛萼乙素單體，如用分析 型高速逆流色譜儀的小量制備及半制備型高速逆流色譜儀的較大量制備均可。


圖1分析型高速逆流色譜儀TBE-20A對(duì)疏花毛萼香茶菜中毛萼乙素(eriocalyxin B)的分離效果圖。圖2半制備型高速逆流色譜儀TBE-300B對(duì)疏花毛萼香茶菜中毛萼乙素 (eriocalyxin B)的分離效果圖。圖3高速逆流色譜所得毛萼乙素的1H NMR圖(Bruker DRX500，500MHz，氘代吡 啶)。圖4高速逆流色譜所得毛萼乙素的13C和DEPT匪R圖(BrukerDRX500，125MHz，氘 代吡啶)。圖5高速逆流色譜所得毛萼乙素的ESI (a)和HRESI (b)MS圖(API QSTAR)。
具體實(shí)施例方式為了進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，下面結(jié)合附圖，給出本發(fā)明的具體實(shí)施例，但并不以此來(lái) 限定本發(fā)明。實(shí)施例1:1、毛萼乙素粗品的制備取疏花毛萼香茶菜地上部分1公斤，粉碎后置于10升的滲濾罐，用10升95%乙 醇室溫滲濾提取3次(3次共用20升)，合并滲濾提取液(約15升)，在球形濃縮罐中濃縮 得浸膏67.8克，加入120mL水?dāng)嚢杈鶆?，將該水相以相同體積的乙酸乙酯萃取(V V = 1 1，萃取三次)，得乙酸乙酯部位62.7克；將該浸膏溶于95%乙醇，過(guò)濾后，上MCI柱除 色素，以90%乙醇沖柱，待含有毛萼乙素的流分洗下后，用丙酮洗柱。含毛萼乙素的流分濃 縮后即得疏花毛萼香茶菜粗提物58. 8克。2、毛萼乙素的制備采用分析型高速逆流色譜儀溶劑選用正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水體系從疏花毛 萼香茶菜粗品中分離制備毛萼乙素單體。首先以4. 5 5 4.5 5體積比將正己烷/乙 酸乙酯/甲醇/水溶劑體系配置于分液漏斗中，搖均后靜置分層，待平衡一段時(shí)間后，將上 相和下相分開(kāi)，取上相為固定相，下相為流動(dòng)相，取步驟1所得500mg疏花毛萼香茶菜粗提物溶解于5mL上相和5mL下相的混合溶液中作待分離樣品溶液用，采用上海同田生物技術(shù) 有限公司生產(chǎn)的分析型TBE-20A高速逆流色譜儀，并配有柱塞泵、進(jìn)樣閥、紫外檢測(cè)器和記 錄儀、多層纏繞聚四氟乙烯的柱容量約為16mL。先用固定相充滿整個(gè)柱子；調(diào)整主機(jī)轉(zhuǎn)速 到1600rpm，以0. 5mL/min的流速將流動(dòng)相泵入柱內(nèi)；待整個(gè)體系建立動(dòng)態(tài)平衡后，由進(jìn)樣 閥進(jìn)樣0. ImL ；然后根據(jù)檢測(cè)器紫外譜圖接收目標(biāo)成分(見(jiàn)圖1)，經(jīng)HPLC檢測(cè)目標(biāo)化合物 毛萼乙素純度都在98%以上。毛萼乙素分子結(jié)構(gòu)式為
<formula>formula see original document page 5</formula>實(shí)施例2 采用半制備型TBE-300B高速逆流色譜儀，并配有柱塞泵、進(jìn)樣閥、紫外檢測(cè)器和 記錄儀、多層纏繞聚四氟乙烯的柱容量約為260mL。溶劑體系選用正己烷/乙酸乙酯/甲醇 /水5 5 5 5分離制備毛萼乙素單體。首先將上述溶劑體系配置于分液漏斗中，搖均 后靜置分層。待平衡一段時(shí)間后，將上相和下相分開(kāi)，取上相為固定相，下相為流動(dòng)相。取 500mg疏花毛萼香茶菜粗提物溶解于5mL上相和5mL下相的混合物中待用。先用固定相充 滿整個(gè)柱子；調(diào)整主機(jī)轉(zhuǎn)速到800rpm，以2. OmL/min的流速將流動(dòng)相泵入柱內(nèi)；待整個(gè)體系 建立動(dòng)態(tài)平衡后，由進(jìn)樣閥進(jìn)樣IOmL ；然后根據(jù)檢測(cè)器紫外譜圖接收目標(biāo)成分。減壓旋轉(zhuǎn) 蒸發(fā)至干。得到毛萼乙素單體95mg，經(jīng)HPLC檢測(cè)目標(biāo)化合物毛萼乙素純度都在98%以上 (見(jiàn)圖2)。對(duì)所得化合物利用NMR和MS (圖3，4和5)進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析，并與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)比對(duì)， 確定該化合物為毛萼乙素?zé)o疑。
權(quán)利要求
一種制備毛萼乙素的方法，用高速逆流色譜HSCCC法從疏花毛萼香茶菜粗提物中制備。
2.如權(quán)利要求1所述的制備毛萼乙素的方法，其特征在于高速逆流色譜固定相、流動(dòng) 相的溶劑體系由正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水組成，組成比例為4-6 4-6 4-6 4-6。
3.如權(quán)利要求1所述的制備毛萼乙素的方法，其特征在于制備溫度選擇在18-35°C。
4.如權(quán)利要求1所述的制備毛萼乙素的方法，其特征在于在室溫18-35°C下，首先以 4-6 4-6 4-6 4-6體積比將正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水溶劑體系配置于分液漏 斗中，搖均后靜置分層，待平衡一段時(shí)間后，將上相和下相分開(kāi)，取上相為固定相，下相為流 動(dòng)相，取疏花毛萼香茶菜粗提物溶解于5mL上相和5mL下相的混合溶液中作待分離樣品 溶液用，采用分析型TBE-20A高速逆流色譜儀，并配有柱塞泵、進(jìn)樣閥、紫外檢測(cè)器和記錄 儀，多層纏繞聚四氟乙烯柱容量為15mL-16mL，先用固定相充滿整個(gè)柱子，調(diào)整主機(jī)轉(zhuǎn)速到 1600rpm,以0. 5mL/min的流速將流動(dòng)相泵入柱內(nèi)；待整個(gè)體系建立動(dòng)態(tài)平衡后，由進(jìn)樣閥 進(jìn)樣0. ImL ；然后根據(jù)檢測(cè)器紫外譜圖接收目標(biāo)成分，經(jīng)HPLC檢測(cè)即可。
全文摘要
本發(fā)明涉及的是一種應(yīng)用高速逆流色譜法從唇形科香茶菜屬植物疏花毛萼香茶菜的粗提物中制備高純度的毛萼乙素(eriocalyxin B)的方法，其特點(diǎn)是應(yīng)用兩相互不混溶的溶劑系統(tǒng)在支撐管內(nèi)高速行星運(yùn)動(dòng)的方式下進(jìn)行天然產(chǎn)物的分離純化，因而沒(méi)有不可逆吸附，具有樣品無(wú)損失、無(wú)污染、高效、快速和大制量分離的優(yōu)點(diǎn)，獲得的毛萼乙素純度可達(dá)98％以上，適用于從由各種工藝條件制備的疏花毛萼香茶菜粗品中分離制備毛萼乙素單體，適用于用各種型號(hào)的逆流色譜儀分離制備毛萼乙素單體。本發(fā)明制備方法操作簡(jiǎn)單、分離步驟少、效率高、溶劑損耗低、產(chǎn)品純度高，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C07D493/10GK101805352SQ20091009518
公開(kāi)日2010年8月18日 申請(qǐng)日期2009年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月12日
發(fā)明者孫漢董, 普建新, 韓全斌 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所