專利名稱：一種純化普蘭林肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于HPLC技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種規(guī)模化純化普蘭林肽(Pramlintide )的方 去。
背景技術(shù)：
普蘭林肽(Pramlintide )中文制劑名稱為醋酸普蘭林肽，英文名為
Pramlintide acetate，分子式CmH267N51053S2x(C2H402)x(H20)，分子量3949.39，
CAS登錄號196078-30-5。
普蘭林肽是一種治療糖尿病的多肽藥物，其效果較好且副作用小，具有很好的市場前景。在已發(fā)表的文獻(xiàn)和專利中，未有大規(guī)模生產(chǎn)、并且具有較高收率的純化工藝報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一條適于產(chǎn)業(yè)化純化普蘭林肽的工藝方法，使用反相高效液相色譜法純化普蘭林肽，純度高且收率好，達(dá)到產(chǎn)業(yè)化要求，解決現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案
一種純化普蘭林肽的方法，包括以下步驟
1) 將合成所得粗肽溶解后，用固定相為反向硅膠柱，流動相為三氟乙酸水溶液為A相、色譜純乙腈為B相，進(jìn)行梯度洗脫純化，收集目的峰值的肽溶
液；
2) 將步驟1)純化所得目的肽溶液濃縮后用固定相為反向硅膠柱，流動相為磷酸鹽水溶液為A相、色譜純乙腈為B相，進(jìn)行梯度洗脫純化收集目的峰值的肽溶液；3)將磷酸鹽采用陰離子交換轉(zhuǎn)鹽法轉(zhuǎn)成醋酸鹽。 優(yōu)選的方案是所述的反向硅膠柱為十八垸基硅烷鍵合硅膠。 更為優(yōu)選的方案是所述步驟1)三氟乙酸水溶液濃度為0.1% (V:V);檢
測波長為230 nm。
更為優(yōu)選的方案是所述步驟2)磷酸鹽水溶液pH值為7.0 8.0。
更為優(yōu)選的方案是所述的陰離子交換轉(zhuǎn)鹽法為通過采用能夠提供醋酸根
的陰離子交換樹脂進(jìn)行離子交換實現(xiàn)，所述的陰離子交換樹脂是
AmberlitelRA-93。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，有如下優(yōu)點和有益效果
本發(fā)明使用反相高效液相色譜法與陰離子交換法純化普蘭林肽，純度高且 收率好，提供了一條適于規(guī)?；兓帘鹆值墓に嚪椒?，達(dá)到產(chǎn)業(yè)化要求。
具體實施方式
實施例l
1. 樣品處理粗肽用超純水溶解成10mg/mL，使樣品完全溶解后用 0i.45pm濾膜過濾，收集濾液備用。
2. 第一次純化純化條件色譜柱以十八烷基硅垸鍵合硅膠為固定相的 色譜柱,柱子直徑和長度為5 cm x 25 cm。流動相A相0.1%三氟乙酸水 溶液；B相乙腈。流速70-80ml/min。檢測波長230nm。梯度B%: 25% 45% (45min)。進(jìn)樣量為1.5-2.0 g。
純化過程將色譜柱用50%以上的乙腈沖洗干凈后平衡上樣，上樣量為
1.5-2.0g。線性梯度洗脫45min，收集目的峰，將收集的目的肽溶液于水溫不超 過32 t下減壓旋蒸濃縮至約50-60 mg/mL后備用。
3. 第二次純化純化條件色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的 色譜柱，柱子直徑和長度為5cmx25cm。流動相A相20mmol/L磷酸二 氫鈉水溶液用氫氧化鈉調(diào)pH至7.0; B相乙腈。流速55-60 ml/min。檢測波 長230 nm。梯度B%: 25% 45% (45min)。進(jìn)樣量為1.5-2.0 g。純化過程將色譜柱用50%以上的乙腈沖洗干凈后平衡上樣，上樣量為
30-40ml樣品溶液。線性梯度洗脫45min，收集目的峰，將收集的目的肽溶液于水溫不超過32 °C下減壓旋蒸濃縮至約50-60 mg/mL后備用。
4、轉(zhuǎn)鹽色譜柱填料為陰離子交換樹脂AmberliteIRA-93，柱子直徑和長度為5 cm x 25 cm 。流動相0.1-0.3%醋酸水溶液。流速55-60 ml/min。檢測波長280 nm。進(jìn)樣量為1.5-2.0g 。
轉(zhuǎn)鹽過程將色譜柱用去離子水平衡后上樣，上樣量為30-40ml樣品溶液。0.1-0.3。/。醋酸水溶液洗脫60min,收集目的峰，將收集的目的肽溶液合并于水溫不超過32'C下減壓旋蒸濃縮至約80-100 mg/mL后轉(zhuǎn)至合適大小西林瓶。冷凍干燥后即可得到純度大于98%的符合標(biāo)準(zhǔn)的普蘭林肽，純化收率41.2%。
實施例2
1. 樣品處理粗肽用超純水溶解成10mg/mL，使樣品完全溶解后用0:O.45^im濾膜過濾，收集濾液備用。
2. 第一次純化純化條件色譜柱以十八垸基硅垸鍵合硅膠為固定相的色譜柱,柱子直徑和長度為15cmx25cm。流動相A相0.1%三氟乙酸水溶液；B相:乙腈。流速500-550 ml/min。檢測波長230 nm。梯度B%: 25% 45% (45min)。進(jìn)樣量為15-20 g。
純化過程將色譜柱用50%以上的乙腈沖洗干凈后平衡上樣，上樣量為15-20g。線性梯度洗脫45min，收集目的峰，將收集的目的肽溶液于水溫不超過32 "下減壓旋蒸濃縮至約50-60 mg/mL后備用。
3. 第二次純化純化條件色譜柱以十八垸基硅烷鍵合硅膠為固定相的色譜柱，柱子直徑和長度為15cmx25cm。流動相A相20mmol/L磷酸二氫鈉水溶液用氫氧化鈉調(diào)pH至7.0; B相乙腈。流速500-550 ml/min。檢測波長230 nm。梯度B%: 25% 45% (45min)。進(jìn)樣量為15-20 g。
純化過程將色譜柱用50%以上的乙腈沖洗干凈后平衡上樣，上樣量為300-400ml樣品溶液。線性梯度洗脫45min，收集目的峰，將收集的目的肽溶液于水溫不超過32 'C下減壓旋蒸濃縮至約50-60 mg/mL后備用。
4、轉(zhuǎn)鹽純化條件色譜柱填料為陰離子交換樹脂Amberlite IRA-93，柱 子直徑和長度為15cmx45cm。流動相0.1-0.3°/。醋酸水溶液。流速150-170 ml/min。檢測波長280 nm。進(jìn)樣量為10-15g。
轉(zhuǎn)鹽過程將色譜柱用去離子水平衡后上樣，上樣量為300-400 ml樣品溶 液。0.1-0.3%醋酸水溶液洗脫75 min，收集目的峰，將收集的目的肽溶液于水溫 不超過32'C下減壓旋蒸濃縮至約80-100 mg/mL。后轉(zhuǎn)至合適大小西林瓶。冷凍 干燥后即可得到純度大于98%的符合標(biāo)準(zhǔn)的普蘭林肽，純化收率達(dá)43.3%。
實施例3
1. 樣品處理粗肽用超純水溶解成10mg/mL，使樣品完全溶解后用 04.45pim濾膜過濾，收集濾液備用。
2. 第一次純化純化條件色譜柱以十八烷基硅垸鍵合硅膠為固定相的
色譜柱，柱子直徑和長度為30cmx25cm。流動相A相0.1%三氟乙酸水溶 液；B相:乙腈。流速2000-2200 ml/min。檢測波長230 nm。梯度B%: 25% 45% (45min)。進(jìn)樣量為65-75 g。
純化過程將色譜柱用50%以上的乙腈沖洗干凈后平衡上樣，上樣量為 65-75g。線性梯度洗脫45min，收集目的峰，將收集的目的肽溶液于水溫不超過 32 。C下減壓旋蒸濃縮至約50-60 mg/mL后備用。
3、 第二次純化純化條件色譜柱以十八垸基硅垸鍵合硅膠為固定相的 色譜柱，柱子直徑和長度為30cmx25cm。流動相A相20mmol/L磷酸 二氫鈉水溶液用氫氧化鈉調(diào)pH至7.0; B相乙腈。流速2000-2200 ml/min。 檢測波長230 nm。梯度B%: 25% 45°/。 (45min)。進(jìn)樣量為65-75 g。
純化過程將色譜柱用50%以上的乙腈沖洗干凈后平衡上樣，上樣量為 1.3-1.5L樣品溶液。線性梯度洗脫45min，收集目的峰，將收集的目的肽溶液于 水溫不超過32 'C下減壓旋蒸濃縮至約50-60 mg/mL后備用。
4、 轉(zhuǎn)鹽純化條件色譜柱填料為陰離子交換樹脂Amberlite IRA-93，柱子直徑和長度為30 cm x 70 cm。流動相0.1-0.3%醋酸水溶液。流速 2000-2200 ml/min。檢測波長280 nm。進(jìn)樣量為65-75 g。
轉(zhuǎn)鹽過程將色譜柱用去離子水平衡后上樣，上樣量為1300-1500ml樣品溶 液。0.1-0.3%醋酸水溶液洗脫160min，收集目的峰，將收集的目的肽溶液于水 溫不超過32'C下減壓旋蒸濃縮至約80-100 mg/mL后轉(zhuǎn)至合適大小西林瓶，冷 凍干燥后即可得到純度大于98%的符合標(biāo)準(zhǔn)的普蘭林肽，純化收率達(dá)40.3%。
以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實施方式對本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說明，不 能認(rèn)定本發(fā)明的具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通 技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替 換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1、一種純化普蘭林肽的方法，包括以下步驟1)將合成所得粗肽溶解后，用固定相為反向硅膠柱，流動相為三氟乙酸水溶液為A相、色譜純乙腈為B相，進(jìn)行梯度洗脫純化，收集目的峰值的肽溶液；2)將步驟1)純化所得目的肽溶液濃縮后用固定相為反向硅膠柱，流動相為磷酸鹽水溶液為A相、色譜純乙腈為B相，進(jìn)行梯度洗脫純化收集目的峰值的肽溶液；3)將磷酸鹽采用陰離子交換轉(zhuǎn)鹽法轉(zhuǎn)成醋酸鹽。
2、 如權(quán)利要求1所述純化普蘭林肽的方法，其特征是所述的反向硅膠柱 為十八垸基硅垸鍵合硅膠。
3、 如權(quán)利要求1或者2所述純化普蘭林肽的方法，其特征是所述步驟l) 三氟乙酸水溶液濃度為0.1% (V:V);檢測波長為230nm。
4、 如權(quán)利要求1或者2所述純化普蘭林肽的方法，其特征是所述步驟2) 磷酸鹽水溶液pH值為7.0 8.0。
5、 如權(quán)利要求1或者2所述純化普蘭林肽的方法，其特征是所述的陰離子交換轉(zhuǎn)鹽法為通過采用能夠提供醋酸根的陰離子交換樹脂進(jìn)行離子交換實 現(xiàn)，所述的陰離子交換樹脂是AmberlitelRA-93。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種純化普蘭林肽的方法，屬于HPLC技術(shù)領(lǐng)域，包括以下步驟1)將合成所得粗肽溶解后，用固定相為反向硅膠柱，流動相為三氟乙酸水溶液為A相、色譜純乙腈為B相，進(jìn)行梯度洗脫純化，收集目的峰值的肽溶液；2)將步驟1)純化所得目的肽溶液濃縮后用固定相為反向硅膠柱，流動相為磷酸鹽水溶液為A相、色譜純乙腈為B相，進(jìn)行梯度洗脫純化收集目的峰值的肽溶液；3)將磷酸鹽采用陰離子交換轉(zhuǎn)鹽法轉(zhuǎn)成醋酸鹽。本發(fā)明使用反相高效液相色譜法與陰離子交換法純化普蘭林肽，純度高且收率好，提供了一條適于規(guī)?；兓帘鹆值墓に嚪椒ǎ_(dá)到產(chǎn)業(yè)化要求。
文檔編號C07K14/435GK101525382SQ20091010675
公開日2009年9月9日 申請日期2009年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月21日
發(fā)明者旭 康, 袁建成, 覃亮政, 馬亞平 申請人:深圳市翰宇藥業(yè)有限公司