專利名稱：孔雀石綠膠體金檢測(cè)卡及其生產(chǎn)和使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種孔雀石綠膠體金檢測(cè)卡，屬于免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
孔雀石綠作為一種殺真菌劑在漁業(yè)中被大量使用，帶來了極大的危害?？兹甘G 是一種帶有金屬光澤的綠色結(jié)晶體，又名堿性綠、嚴(yán)基塊綠、孔雀綠，其既是殺真菌劑，又是 染料，易溶于水，溶液呈藍(lán)綠色；溶于甲醇、乙醇和戊醇。長期以來，漁民都用它來預(yù)防魚的 水霉病、鰓霉病、小瓜蟲病等，而且為了使鱗受損的魚延長生命，在運(yùn)輸過程中和存放池內(nèi)， 也常使用孔雀石綠?？蒲薪Y(jié)果表明，孔雀石綠在魚體內(nèi)殘留時(shí)間非常長，且其具有高毒素、 高殘留和致癌、致畸、致突變等副作用。鑒于此，許多國家均將孔雀石綠列為水產(chǎn)養(yǎng)殖禁用 藥物。我國于2002年5月也將孔雀石綠列入《食品動(dòng)物禁用的獸藥及其化合物清單》中。 但是，因?yàn)槠鋬r(jià)格便宜，而且其治療水霉病等的功效是其他藥物所“不能替代”的，由于利益 的驅(qū)動(dòng)使得孔雀石綠并沒有退出漁業(yè)市場(chǎng)。從上世紀(jì)90年代開始，國內(nèi)外學(xué)者陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，孔雀石綠及其代謝產(chǎn)物無色孔雀石 綠(隱性孔雀石綠)具有高毒素、高殘留、高致癌和高致畸變、致突變等副作用。2005年6 月，英國食品標(biāo)準(zhǔn)局向所有歐洲國家發(fā)布食品安全警報(bào)，在英國一家超市發(fā)現(xiàn)魚體內(nèi)含孔 雀石綠。英國食品標(biāo)準(zhǔn)局發(fā)布消息說，孔雀石綠是一種對(duì)人體有極大副作用的化學(xué)制劑，任 何魚類都不允許含有這一物質(zhì)，并且這種物質(zhì)不應(yīng)該出現(xiàn)在任何食品中。沒過多久，國內(nèi)就 有媒體報(bào)道，在國內(nèi)很多地方，尤其是河南、湖北等地的水產(chǎn)養(yǎng)殖和水產(chǎn)品運(yùn)輸過程中，孔 雀石綠仍在被普遍使用。重慶市執(zhí)法部門在某水產(chǎn)交易市場(chǎng)查獲600多只含有孔雀石綠的 甲魚。有些地區(qū)則在鰻魚制品中檢出孔雀石綠。記者從我國鰻業(yè)工業(yè)委員會(huì)了解到，從今 年7月1日起，日本政府開始對(duì)來自我國的鰻魚產(chǎn)品強(qiáng)制檢測(cè)孔雀石綠。所以，對(duì)于我國輸 日鰻魚制品來說，又面臨出口貿(mào)易壁壘的考驗(yàn)。農(nóng)業(yè)部辦公廳于2005年7月7日發(fā)布了關(guān) 于組織查處“孔雀石綠”等禁用獸藥的緊急通知，要求各地盡快組織開展孔雀石綠等禁用藥 物的專項(xiàng)整治工作?？兹甘G是小分子化合物，常用的檢測(cè)方法有高效液相色譜分析法(HPLC)和氣 相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用分析法(GC/MS)或液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用分析法(LC/MS)。這些方法普遍 存在著儀器昂貴，方法復(fù)雜，操作煩瑣，試劑消耗量大的局限性。20世紀(jì)80年代興起的膠體 金免疫層析檢測(cè)，基于免疫學(xué)檢測(cè)原理，操作簡單快捷、結(jié)果清晰易于判斷、無需復(fù)雜的實(shí) 驗(yàn)技能和設(shè)備，特別適于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。能夠在第一時(shí)間檢測(cè)水產(chǎn)品中孔雀石綠殘留，對(duì)遏制孔 雀石綠的非法使用具有重要意義。而國內(nèi)外尚無該技術(shù)監(jiān)控孔雀石綠的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上訴問題，本發(fā)明提供了一種孔雀石綠膠體金檢測(cè)卡，該快速診斷卡檢測(cè)快 速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供該膠體金檢測(cè)卡的應(yīng)用。
上述孔雀石綠膠體金檢測(cè)卡的制備包括以下步驟(1)孔雀石綠半抗原的合成(2)孔雀石綠免疫抗原的合成；(3)孔雀石綠單克隆抗體的制備；(4)膠體金顆粒的制備；(5)膠體金標(biāo)記孔雀石綠單克隆抗體；(6)樣品墊的制備，該墊附置一段膠體金標(biāo)記孔雀石綠單克隆抗體的膜；(7)孔雀石綠包被抗原的合成；(8)孔雀石綠固相硝酸纖維素膜的制備，該膜包被一條含孔雀石綠包被抗原的檢 測(cè)帶和一條包被羊抗鼠IgG的質(zhì)控帶；(9)樣品墊的處理選擇適當(dāng)?shù)姆忾]試劑、表面活性劑和(或)非離子型去污劑單 獨(dú)或以適當(dāng)比例組合后均勻浸于玻璃纖維素膜，室溫干燥備用；(10)組裝孔雀石綠膠體金檢測(cè)卡，該檢測(cè)卡用PVB作為背襯，在PVC襯板的中部疊 置硝酸纖維素膜，兩端分別疊置吸水墊和樣品墊，硝酸纖維素膜和吸水墊、樣品墊相搭連。
權(quán)利要求
1.孔雀石綠膠體金檢測(cè)卡，其特征在于其包括試紙條和外殼兩部分，試紙條置于外 殼內(nèi)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的孔雀石綠抗體膠體金檢測(cè)卡，其特征在于所述的試紙條用 PVB作為背襯，在PVC襯板的中部疊置硝酸纖維素膜，兩端分別疊置吸水墊和樣品墊，硝酸 纖維素膜和吸水墊、樣品墊相搭連，在樣品區(qū)附置一段含有孔雀石綠單克隆抗體的膜，在硝 酸纖維素膜上有一條含孔雀石綠抗原的檢測(cè)帶和一條含羊抗兔IgG的質(zhì)控帶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的孔雀石綠膠體金檢測(cè)卡，其特征在于所述的外殼殼體開有 加樣孔和觀察窗。加樣孔正對(duì)樣品墊，觀察窗正對(duì)硝酸纖維素膜。
4.孔雀石綠膠體金檢測(cè)卡的生產(chǎn)方法，其特征在于由下列過程與步驟組成(1)孔雀石綠半抗原的合成(2)孔雀石綠免疫抗原的合成；(3)孔雀石綠單克隆抗體的制備；(4)膠體金顆粒的制備；(5)膠體金標(biāo)記孔雀石綠單克隆抗體；(6)樣品墊的制備，該墊附置一段膠體金標(biāo)記孔雀石綠單克隆抗體的膜；(7)孔雀石綠包被抗原的合成；(8)孔雀石綠固相硝酸纖維素膜的制備，該膜包被一條含孔雀石綠包被抗原的檢測(cè)帶 和一條包被羊抗鼠IgG的質(zhì)控帶；(9)樣品墊的處理選擇適當(dāng)?shù)姆忾]試劑、表面活性劑和(或)非離子型去污劑單獨(dú)或 以適當(dāng)比例組合后均勻浸于玻璃纖維素膜，室溫干燥備用；(10)組裝孔雀石綠膠體金檢測(cè)卡，該檢測(cè)卡用PVB作為背襯，在PVC襯板的中部疊置硝 酸纖維素膜，兩端分別疊置吸水墊和樣品墊，硝酸纖維素膜和吸水墊、樣品墊相搭連。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的孔雀石綠膠體金檢測(cè)卡的生產(chǎn)方法，其特征在于所述的半抗 原具有式(I)所示結(jié)構(gòu)。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的孔雀石綠膠體金檢測(cè)卡的生產(chǎn)方法，其特征在于所述的免疫 抗原具有式(II)所示結(jié)構(gòu)。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的孔雀石綠膠體金檢測(cè)卡的生產(chǎn)方法，其特征在于所述的包被抗原具有式(III)所示結(jié)構(gòu).
8.孔雀石綠膠體金檢測(cè)卡的使用方法，其特征在于將30yl待檢液加入到微孔中，并 充分吹打混勻，將試紙條插入到微孔中，放置5-10分鐘內(nèi)觀察結(jié)果。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的孔雀石綠膠體金檢測(cè)卡的使用方法，其特征在于所述的待檢 液是由下列步驟處理得到(1)取待檢水產(chǎn)品可食部分用絞肉機(jī)絞碎后準(zhǔn)確稱取10.0g于50mL離心管中，加入提 取劑，混勻振搖5分鐘后取上清液4mL于50mL離心管中，加緩沖液3滴，然后稀釋至25mL ；(2)分次把上清液加入層析柱中，用抽提裝置從下口加壓，加快流速，待完全流干后加 4mL蒸餾水洗滌層析柱；(3)將lmL衍生化試劑加到層析柱中完全流干后，再加入2mL蒸餾水洗滌層析柱，再用 lmL洗脫液洗脫收集，加1滴緩沖液后振蕩混勻得到待檢液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種孔雀石綠膠體金檢測(cè)卡及其生產(chǎn)和使用方法，屬于免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。該快速診斷卡包括外殼和試紙條，其特征在于所述外殼殼體開有加樣孔和觀察窗，所述試紙條安放于外殼內(nèi)，在PVC襯板的中部疊置硝酸纖維素膜，兩端分別疊置吸水墊和樣品墊，硝酸纖維素膜和吸水墊、樣品墊相搭連，在樣品區(qū)附置一段含有孔雀石綠單克隆抗體免疫膠體金復(fù)合物的膜，在硝酸纖維素膜上有一條含孔雀石綠包被抗原的檢測(cè)帶和一條含羊抗鼠IgG的質(zhì)控帶。本發(fā)明是一種快速、準(zhǔn)確、靈敏的診斷卡，無需專門儀器，操作簡單，能滿足食品安全、漁業(yè)、檢測(cè)機(jī)構(gòu)的檢測(cè)要求。
文檔編號(hào)C07K14/765GK101995467SQ20091010948
公開日2011年3月30日 申請(qǐng)日期2009年8月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月21日
發(fā)明者張世偉, 李細(xì)清, 譚攀, 鐘松清 申請(qǐng)人:深圳市三方圓生物科技有限公司