專(zhuān)利名稱(chēng)：1,6-二磷酸果糖和氧化型維生素c的抗癲癇作用及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及1， 6- 二磷酸果糖(fructose-1， 6-bisphosphate ， Fl, 6BP)和氧化型維生素 C (dehy droas corbat e， DHA)的抗癲癇作用和作用機(jī)制以及它們?cè)诜乐魏椭委煱d癇疾病方面的新 應(yīng)用。Fl， 6BP和DHA不僅能有效地控制或抑制多種急性和慢性癲癇動(dòng)物的癲癇發(fā)作，而且能有效 地防止癲癇的發(fā)生與發(fā)展，甚至根治癲癇。F1，6BP和DHA的抗癲癇作用均是通過(guò)調(diào)節(jié)糖的代謝而 發(fā)揮其作用，即抑制2，6-二磷酸果糖調(diào)控的過(guò)多糖酵解和/或刺激葡萄糖利用通過(guò)戊糖磷酸化代 謝途徑而增加腦內(nèi)還原型谷胱甘肽(GSH)水平。F1，6BP和DHA獨(dú)特的抗癲癇作用和作用機(jī)制支持 了它們?cè)诜乐魏椭委煱d癇病疾方面的新應(yīng)用。
背景技術(shù)：
癲癇是—種常見(jiàn)反復(fù)發(fā)作的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常的慢性疾病。據(jù)世界衛(wèi)生組織最新統(tǒng)計(jì)， 全世界范圍內(nèi)大約有五千萬(wàn)人為癲癇病患者?，F(xiàn)有的抗癲癇藥物主要是控制或抑制癲癇的發(fā)作， 但不能根治引發(fā)癲癇的病因，具體表現(xiàn)在一旦停止使用藥物，多數(shù)癲癇患 者病情再發(fā)作。而且，現(xiàn)有的抗癲癇藥物多有嚴(yán)重的不良反應(yīng)和副作用，比如認(rèn)識(shí)損害，情緒變 化和神經(jīng)內(nèi)分泌紊亂等。因此，尋找和開(kāi)發(fā)既能控制或抑制癲癇的發(fā)作，又能根治引發(fā)癍癇病 因而且毒副作用少的新藥，對(duì)于癲癇病的治療具有重要意義。
盡管多種因素和復(fù)雜的基因交互作用被證明與癲癇的病因有關(guān)，但癲癇病患者的大腦最終 出現(xiàn)能量代謝異常，特別是葡萄糖的代謝異常。葡萄糖是大腦最主要的能量物質(zhì)。葡萄糖代謝 的兩條重要途徑是糖酵解途徑(glycolysis pathway)和戊糖磷酸化途徑(pentose phosphate pathway, PPP)。
糖酵解主要由磷酸果糖酶-1 (phosphofructokinase-1, PFK1)調(diào)控。在正常情況下，糖酵解 的最終產(chǎn)物是丙酮酸。但是在祌經(jīng)高度興奮和癲癇狀態(tài)下，糖酵解顯著增加，大量的丙酮酸被 轉(zhuǎn)化為乳酸而導(dǎo)致腦內(nèi)乳酸累積。最新研究表明，這種產(chǎn)生大量乳酸的糖酵解(叫過(guò)多糖酵 解，excessive glycolysis)主要由2、 6-二磷酸果糖(fructose-2、 6-bisphosphate， F2, 6BP)調(diào) 控。F2, 6BP由磷酸果糖酶-2 (phosphofructokinase-1， PFK2)產(chǎn)生并且是PFK1強(qiáng)有力的激動(dòng)劑。 由于PFK2僅存在腦內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞(astrocytes)中，因此這種過(guò)多糖酵解僅限于膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)。眾多
3的研究表明過(guò)多糖酵解與癲癇的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)(l)過(guò)多的糖酵解是癲癇病人和癲癇動(dòng)物 的普遍現(xiàn)象；(2)糖酵解隨著神經(jīng)活性的增加而增加；(3)高血糖與癲癇活性有關(guān)，而低血糖具 抗癲癇作用，(4)Ketogenic diet(90。/。脂肪、3%碳水化合物、7%蛋白質(zhì))的抗癲癇作用取決于維 持低血糖水平。
葡萄糖的另一個(gè)代謝途徑PPP通過(guò)釋放還原型輔酶II(NDAPH)將氧化型的谷胱甘肽(GSsG)還 原成還原型的谷胱甘肽(GSH) 。 GSH是哺乳動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)中最重要的自由基清除劑，并且具有很 強(qiáng)的抗癲癇作用。眾多的研究表明腦內(nèi)GSH與癲癇活動(dòng)有密切關(guān)系(1) GSH和它的前體物乙酰半 胱氨酸均有很強(qiáng)的直接的抗癲癇作用；(2)GSH損耗或低下的動(dòng)物很容易產(chǎn)生自發(fā)性癲癇；(3)GSH 損耗或低下與細(xì)胞外的高水平興奮性氨基酸(谷氨酸)密切相關(guān)，而谷氨酸與癲癇密切相關(guān)； (4)GSH損耗或低下是引發(fā)氧化應(yīng)激、線粒體功能紊亂和炎癥的重要因素。
總之，過(guò)多糖酵解與癲癇產(chǎn)生密切相關(guān)，而腦內(nèi)GSH損耗或低下以及引發(fā)的氧化應(yīng)激、炎 癥、線粒體功能紊亂和腦內(nèi)細(xì)胞外高水平興奮性氨基酸谷氨酸是癲癇發(fā)生的重要病因。因此抑 制膠質(zhì)細(xì)胞中F2， 6BP調(diào)控的過(guò)多糖酵解和刺激葡萄糖PPP代謝而增加腦內(nèi)GSH水平的化合物可 以有效地預(yù)防癲癇的發(fā)生與發(fā)展。鑒于此，我們嘗試研究和開(kāi)發(fā)選擇性抑制過(guò)多糖酵解和增加 腦內(nèi)GSH水平的新型抗癲癇藥物。在本發(fā)明中我們具體公開(kāi)的是1， 6-二磷酸果糖(F1， 6BP)和氧 化型維生C(DHA)的抗癲癇作用和作用機(jī)制。Fl， 6BP和DHA對(duì)多種急性和慢性癲癇動(dòng)物均能有效 地控制或抑制癲癇的發(fā)作，而且能防止癲癇的發(fā)生與發(fā)展。更重要的是在慢性大鼠癲癇模型中， 在停止Fl， 6BP和DHA給藥后所有動(dòng)物均未出現(xiàn)癲癇再次發(fā)作，提示兩者能有效地治療并可能根 治癲癇。Fl, 6BP和DHA是通過(guò)調(diào)節(jié)糖代謝(抑制過(guò)多糖酵解和/或刺激葡萄糖的PPP而增加腦內(nèi) GSH水平)而產(chǎn)生其抗癲癇作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開(kāi)的是Fl， 6BP和DHA的抗癲癇作用和作用機(jī)制以及它們?cè)诜乐魏椭委煱d癇疾病方 面的應(yīng)用。其發(fā)明內(nèi)容主要包括
1、 F1,6BP和DHA對(duì)海藻酸、毛果蕓香堿和戊四氮誘發(fā)的大白鼠急性癲癇有明顯的抗癲癇作用。
2、 Fl, 6BP和DHA對(duì)毛果蕓香堿和戊四氮誘發(fā)的大白鼠慢性癲癇有預(yù)防和治療作用。在停止 Fl， 6BP和DHA給藥后所有動(dòng)物均未出現(xiàn)癲癇再次發(fā)作，提示兩者能有效地治療并可能根治癲癇。3、 F1，6BP和DHA對(duì)毛果蕓香堿和海藻酸誘發(fā)急性癲癇動(dòng)物的神經(jīng)損傷具有明顯的保護(hù)作用。
Fl, 6BP還對(duì)腦缺血神經(jīng)損傷具有顯著的保護(hù)作用。
4、 Fl， 6BP的抗癲癇作用機(jī)制是通過(guò)抑制2， 6-二磷酸果糖調(diào)控的過(guò)多糖酵解并將葡萄 糖從糖酵解轉(zhuǎn)變成戊糖磷酸化代謝從而增加腦內(nèi)還原型谷胱甘肽(GSH)水平。
5、 DHA是通過(guò)刺激磷酸戊糖代謝途徑酶的活性而增加腦內(nèi)GSH水平而發(fā)揮其抗癲癇作用。
6、 抑制F2， 6BP調(diào)控的過(guò)多糖酵解的化合物具有抗癲癇作用。
7、 抑制磷酸果糖酶-2 (PFK2)的化合物具有抗癲癇作用。
8、 抑制乳酸脫氫酶5亞型(LDH5)的化合物具有抗癲癇作用。
9、 刺激葡萄糖PPP代謝途徑增加腦內(nèi)的還原型谷胱甘肽(GSH)水平的化合物具有抗癲癇作用。
10、 增加6-磷酸葡萄糖脫氫酶(6-GTO)和轉(zhuǎn)二羥丙酮基酶(transaldolase)活性的 化合物具有抗癲癇作用和抗氧化作用。
11、 與現(xiàn)有的抗癲癇藥物比較，比如丙戊酸(一種世界范圍內(nèi)廣泛用于治療癲癇的藥物， 也是研究抗癲癇新藥常用的陽(yáng)性對(duì)照藥)、Ketogenic diet和2-去氧葡萄糖 (2-deoxyglucose， 2DG, —種糖酵解抑制劑并具有抗癲癇作用)，F(xiàn)l, 6BP和DHA防治和治療癲癇疾 病具有以下特點(diǎn)(1)具有廣譜抗癲癇作用。Fl， 6BP和DHA對(duì)多種急性和慢性癲癇動(dòng)物均有作用， 而且比現(xiàn)有的抗癲癇藥物的作用更強(qiáng)。(2) F1,6BP和DHA能有效治療并可能根治癲癇疾病?，F(xiàn) 有的抗癲癇藥物主耍是控制或抑制癲癇的發(fā)作，對(duì)癲癇所引起的神經(jīng)損傷無(wú)保護(hù)作用，而且不 能根治引發(fā)癲癇的病因。Fl， 6BP和DHA不僅能有效控制或抑制癲癇的發(fā)作，防止癲癇的發(fā)生與 發(fā)展，而且對(duì)癲癇所引起的神經(jīng)損傷有非常明顯的保護(hù)作用。更重要的是在慢性大鼠癲癇模型 中，在停止F1，6BP和DHA給藥后所有動(dòng)物均未出現(xiàn)癲癇再次發(fā)作，提示兩者能有效地治療并可 能根治癲癇。(3)F1,6BP和DHA有比較少的毒副作用?，F(xiàn)有的抗癲癇藥物多有嚴(yán)重的不良反應(yīng)， 比如認(rèn)識(shí)損害，情緒變化和神經(jīng)內(nèi)分泌紊亂。抑制整個(gè)葡萄糖的利用是Ketogenic diet和2-去氧葡萄糖產(chǎn)生認(rèn)識(shí)損害等不良反應(yīng)的原因。而且抑制整個(gè)葡萄糖的利用將導(dǎo)致腦內(nèi)GSH和y-基丁酸(GABA)水平低下或缺損并加重癲癇或產(chǎn)生其他不良反應(yīng)。而Fl， 6BP和DHA的抗癲癇作用 機(jī)制是選擇性抑制F2， 6BP調(diào)控的過(guò)多糖酵解和剌激葡萄糖戊糖磷酸化代謝途徑增加腦內(nèi)GSH水 平，并不對(duì)整個(gè)葡萄糖的利用產(chǎn)生影響。(4) F1，6BP臨床上用于心臟病的治療未見(jiàn)有毒副作用 的報(bào)道。
12、 Fl， 6BP和DHA在預(yù)防和治療癲癇疾病方面具有前景由于它們獨(dú)特的抗癲癇作用和作用機(jī)理。


圖l (Figl)是本發(fā)明兩種抗癲癇藥1,6-二磷酸果糖(F1，6BP)和氧化型維生C(DHA)分子結(jié)
構(gòu)示意圖； '
圖2 (Fig2)是本發(fā)明1，6-二磷酸果糖(F1,6BP)對(duì)毛果蕓香堿所致大鼠急性癲癇的抗癲癇
作用；
圖3 (Fig 3)是本發(fā)明1， 6-二磷酸果糖(Fl, 6BP)對(duì)海藻酸所致大鼠急性癲癇的抗癲癇作用； 圖4 (Fig 4)是本發(fā)明1，6-二磷酸果糖(F1，6BP)對(duì)戊四氮所致大鼠急性癲癇的抗癲癇作用； 圖5(Fig 5)是本發(fā)明1,6-二磷酸果糖(F1，6BP)對(duì)戊四氮所致大鼠慢性癲癇的抗癲癇作用； 圖6 (Fig 6)是本發(fā)明1,6-二磷酸果糖(F1,6BP)對(duì)毛果蕓香堿所致大鼠慢性癲癇的抗癲癇 作用；
圖7(Fig 7)是禁食對(duì)毛果蕓香堿所致癲癇動(dòng)物的血糖水平影響
圖8(Fig 8)是乳酸和丙酮酸對(duì)1， 6-二磷酸果糖(Fl, 6BP)和2 —去氧葡萄糖的抗癲癇作用； 圖9(Fig 9)是1, 6-二磷酸果糖(Fl， 6BP)對(duì)還原型谷光甘肽的影響。 具體實(shí)施范例
下面給出實(shí)施范例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但不對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制。
(一)1、 6-二磷酸果糖抗癲癇作用的具體實(shí)施范例 1.1、急性癲癇模型
三種不同的急性癲癇模型包括毛果蕓香堿(Pilocarpine, Pilo)、海藻酸(Kainic acid, KA) 和戊四氮(Pentylenetetrazole,PTZ)被用來(lái)測(cè)試1、 6-二磷酸果糖(Fi, 6BP〉的抗癲癇作用。丙戊 酸(VPA， 一種廣泛用于治療癲癇的藥物，也是研究抗癲癇新藥常用的陽(yáng)性對(duì)照藥)、2-去氧葡萄 糖(2-deoxyglucose, 2-DG, —種糖酵解抑制劑并具有抗癲癇作用)和ketogenic diet(治療癲癇 的一種營(yíng)養(yǎng)品)用來(lái)作為對(duì)照。成年雄性Sprague Dawley大鼠(200-230克)在腹腔注射 (ip)Fl，6BP或VPA或2-DG或生理鹽水(癲癇組),或喂養(yǎng)ketogenic diet 1小吋后，再腹腔注 射毛果蕓香堿(300mg/kg)，或戊四氮(5Gmg/kg)，或海藻酸(10mg/kg)。然后連續(xù)觀察6小時(shí)(Pilo 和KA模型〉或20分鐘(PTZ模型)動(dòng)物的癲癇行為包括癲癇發(fā)作時(shí)間、癲癇等級(jí)、癲癇持續(xù)時(shí)間、 動(dòng)物體重變化和死亡等。1. 1A 毛果蕓香堿模型
癲癇組10只動(dòng)物均產(chǎn)生癲癇，癲癇發(fā)作時(shí)間(latency to the first forelimb clonus after pilocarpine)為14±1分鐘，并持續(xù)至少5小時(shí)，癲癇等級(jí)為5. 5±0. 4級(jí)(圖2A) ， 4只動(dòng)物在 24小時(shí)內(nèi)死亡。1、 6-二磷酸果糖抗癲癇作用與劑量有關(guān)。低劑量組(0.25g/kg， n-5)沒(méi)有作用。 中劑量(O. 5g/kg) 10只動(dòng)物中僅有3只有等級(jí)大于或等于3的癲癇。高劑量(l. 0gZkg) 10只動(dòng)物 中僅有2只有等級(jí)大于或等于3的癲癇。1、 6-二磷酸果糖中高劑量組中動(dòng)物癲癇發(fā)作時(shí)間明顯 延長(zhǎng)，癲癇等級(jí)和癲癇持續(xù)時(shí)間均顯著降低并沒(méi)有動(dòng)物死亡。與癲癇組動(dòng)物腦電圖(EEG)比較， 1, 6-二磷酸果糖高劑量組5只沒(méi)有癲癇行的動(dòng)物的腦電圖也未顯示癲癇活性(圖2B) 。 2-去氧葡 萄糖(O、 25g/kg)對(duì)毛果蕓香堿導(dǎo)的急性癲癇也有效。2-去氧葡萄糖組6只動(dòng)物僅有一只有癲癇 (等級(jí)為3)，癲癇等級(jí)和癲癇持續(xù)時(shí)間均顯著降低。丙戊酸(0.3g/kg,『9)也能降低癲癇等級(jí)和 癲癇持續(xù)時(shí)間，但其作用沒(méi)有1， 6-二磷酸果糖和2-去氧葡萄糖強(qiáng)。丙戊酸組9只動(dòng)物中有6只 有癲癇并有l(wèi)只動(dòng)物死亡。Ketogenic diet對(duì)毛果蕓香堿誘導(dǎo)的急性癲癇沒(méi)有作用。 1. 1B 海藻酸模型
海藻酸誘導(dǎo)的癲癇組i0只動(dòng)物中有9只有嚴(yán)重癲癇(等級(jí)大于或等于3) ， 1只動(dòng)物有輕微 的癲癇(節(jié)律性點(diǎn)頭)，其癲癇發(fā)作時(shí)間(latency to the first wet dog shake after kainic acid) 為38士4分鐘，癲癇等級(jí)和癲癇持續(xù)時(shí)間分別為3.7 ±0.3和3.7±0.2小時(shí)(圖3)。沒(méi)有動(dòng) 物死亡。1、 6二磷酸果糖對(duì)海藻酸誘導(dǎo)的癲癇的作用也與劑量有關(guān)。低劑量組(0.25g/kg， n=6) 沒(méi)有作用。中劑量(0. 5g/kg)和高劑量(1. 0g/kg)能明顯延長(zhǎng)癲癇發(fā)作時(shí)間并明顯降低癲癇等級(jí) 和癲癇持續(xù)時(shí)間。中劑量組8只動(dòng)物中2只沒(méi)有癲癇，3只有輕微的癲癇(節(jié)律性點(diǎn)頭)，剩下的 3只有較嚴(yán)重癲癇，其癲癇的平均等級(jí)為2. 5±0. 5。高劑量組8只動(dòng)物中3只沒(méi)有癲癇，3只有 輕微癲癇，剩下的2只有較嚴(yán)重癲癇，其癲癇的平均等級(jí)為1. 4±0. 5。 2-去氧葡萄糖(O. 25g/kg， n=6; 0.5g/kg， F3)僅能延長(zhǎng)癲癇發(fā)作時(shí)間，其它癲癇行為與癲癇組比較沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)的區(qū)別。 盡管丙戊酸(O. 3g/kg，『6)組動(dòng)物有嚴(yán)重的癲癇，但丙戊酸明顯延長(zhǎng)癲癇發(fā)作時(shí)間和降低癲癇 等級(jí)和癲癇持續(xù)時(shí)間。Ketogenic diet對(duì)海藻酸誘導(dǎo)的急性癲癇沒(méi)有作用。 1. 1C 戊四氮模型
由戊四氮誘導(dǎo)的癲癇組所有9只動(dòng)物均有陣攣性癲癇(tonic-clonic seizures)，癲癇發(fā)作
7時(shí)間(latency to the first forelimb clonus after pentylenetetrazols)為76±6秒，癲癇 持續(xù)時(shí)間為170土54秒(圖4)。 1、 6-二磷酸果糖低中高三個(gè)劑量均能延長(zhǎng)癲癇發(fā)作時(shí)間并降低 癲癇持續(xù)時(shí)間。高劑量組8只動(dòng)物有3只沒(méi)有癲癇。2-去氧葡萄糖(O. 25g/kg， n=5; 0. 5g/kg， 『5)組所有動(dòng)物均有癲癇2-去氧葡萄糖不能延長(zhǎng)癲癇發(fā)作時(shí)間。丙戊酸組(O. 3g/kg)8只動(dòng)物中 有2只沒(méi)有癲癇，6只動(dòng)物的癲癇發(fā)作時(shí)間明顯延長(zhǎng)而癲癇持續(xù)時(shí)間縮短。此外，另設(shè)一組動(dòng)物 (9只)每天飲用30mL 0. 5%1, 6-二磷酸果糖(這個(gè)劑量相當(dāng)于0. 25克/公斤/每天)，連續(xù)給藥7天。 在第7天，所有動(dòng)物腹腔注射戊四氮(50mg/kg)。結(jié)果表明9只動(dòng)物屮6只沒(méi)有癲癇。這個(gè)結(jié) 果不僅說(shuō)明1，6-一磷酸果糖能有效抑制戊四氮誘導(dǎo)的急性癲癇，而且表明1,6-二磷酸果糖能 通過(guò)飲用的方式給藥。這樣在慢性癲癇動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，1,6-二磷酸果糖將采用這種給藥途徑。 1.2、慢性癲癇模型
1.2A戊四氮點(diǎn)燃法模型(PTZ kindling model)
成年雄性Sprague Dawley大鼠(180-200g)連續(xù)6天每天腹腔注射戊四氮(40mg/kg)，然后 改為每天戊四氮的劑量為35mg/kg直到動(dòng)物在連續(xù)3天內(nèi)至少有一癲癇發(fā)作期。在最后一次注 射戊四氮24小時(shí)后再腹腔注射戊四氮(30mg/kg)并記錄動(dòng)物的癲癇等級(jí)。癲癇動(dòng)物給予生理鹽 水(『6)或1,6-二磷酸果糖(0.5g/kg,n-6; 1. 0g/kg， n=6)。分別記錄動(dòng)物的癲癇等級(jí)作為治療 前的對(duì)照。在第二天，所有動(dòng)物腹腔注射戊四氮(30mg/kg)—小時(shí)后再給予生理鹽水或i,6-二磷 酸果糖。在60分鐘內(nèi)觀察動(dòng)物的癲癇行為并記錄癲癇等級(jí)。結(jié)果顯示與治療前的對(duì)照比較， 生理鹽水組的所有動(dòng)物有更高的的癲癇等級(jí)，而1,6-二磷酸果糖兩個(gè)劑量組的所有動(dòng)物的癲癇 等級(jí)明顯降低(圖5A)。
為了證明1， 6 二-磷酸果糖是或能抑制戊四氮點(diǎn)燃法誘導(dǎo)的癲癇的發(fā)展，另外14只動(dòng)物在 第 一天腹腔注射戊四氮(50mg/kg)后讓它們正常生活七天時(shí)間。在第七天，所有癲癇動(dòng)物在腹腔 注射戊四氮(40mg/kg)—小時(shí)后分別腹腔注射生理鹽水(『6)或1, 6-二磷酸果糖(O. 5g/kg， n=8)。 這種給藥方法重復(fù)五天。每次給藥后觀察動(dòng)物的癲癇行為并記錄癲癇等級(jí)。結(jié)果顯示在第六 次注射戊四氮后，生理鹽水組所有動(dòng)物均出現(xiàn)generalized tonic-clonic seizures,而1，6-二磷 酸果糖組的動(dòng)物未見(jiàn)generalized tonic-clonic seizures (圖5B)。 1. 2B、 毛果蕓香堿模型(The pilocarpine rat model of temporal lobe epilepsy)
8成年雄性SpragueDawley大鼠(180-200g)腹腔注射毛果蕓香堿(300mg/kg)。出現(xiàn)前肢陣攣 (3級(jí)癲癇)或站立和跌倒(4級(jí)癲癇)并維持2小時(shí)的動(dòng)物定義為該動(dòng)物有SE (status 印il印tJcus)。 2小時(shí)后，SE動(dòng)物腹腔注射安定(5mg/kg)以提高動(dòng)物存活率。動(dòng)物出現(xiàn)SE七 天后，每天從早上8點(diǎn)到下午6點(diǎn)觀察動(dòng)物的癲癇行為。所有動(dòng)物在10到40天內(nèi)出現(xiàn)幾種癲 癇行為包括面部陣攣、肌肉抽搐、前肢陣攣或站立和跌倒。出現(xiàn)第一次前肢陣攣定義為第一次 自發(fā)性癲癇。出現(xiàn)第一次自發(fā)性癲癇的時(shí)問(wèn)為21 ±2. 7天。具有自發(fā)性癲癇的動(dòng)物分為癲癇組(生 理鹽水，n-6)和藥物組(0. 5%1、 6 二-磷酸果糖，『6)并分別連續(xù)兩周飲用生理鹽水和0. 5%1， 6-二磷酸果糖(每只動(dòng)物每天30mL)。癲癇組所有動(dòng)物繼續(xù)出現(xiàn)癲癇行為。1, 6-二磷酸果糖在7天 內(nèi)完全阻止癲癇行為并且在停止用藥后所有動(dòng)物在兩周內(nèi)癲癇不在發(fā)作(圖6， F1，6BP/1)。這 些動(dòng)物大腦皮層的腦電圖記錄沒(méi)有出現(xiàn)癲癇活性。有文獻(xiàn)報(bào)道，自發(fā)性癲癇發(fā)作60天后，這個(gè) 動(dòng)物模型的癲癇對(duì)藥物具有依賴(lài)型。
為了證明1, 6-二磷酸果糖是或?qū)@種賴(lài)藥性的癲癇有效，另外6只癲癇動(dòng)物在自發(fā)性癲癇 發(fā)作60天后連續(xù)兩周飲用0.5%1,6-二磷酸果糖(每只動(dòng)物每天30mL)。結(jié)果顯示1,6-二磷酸果 糖在9天內(nèi)完全阻止癲癇行為并且在停止用藥后所有動(dòng)物在10天內(nèi)癲癇不再發(fā)作(圖6， F1，6BP/2)。這些結(jié)果表明1,6-二磷酸果糖能有效抑制慢性癲癇并可能根治癲癇疾病。 1.3、抑制糖代謝具有抗癲癇作用
1.3A:禁食對(duì)癲癇動(dòng)物的影響
飲用正常食物的十六只成年雄性動(dòng)物分別測(cè)定其血糖濃度，其平均值為123.9±4.1 mg/DL。 然后動(dòng)物分為兩組， 一組動(dòng)物喂正常食物作為癲癇控制組，另一組動(dòng)物禁食48小時(shí)。禁食動(dòng)物 體重減輕15.1±0.4%，血糖濃度降低到79.3±7.7 mg/DL。兩組動(dòng)物均腹腔注射毛果蕓香堿 (300mg/kg)然后連續(xù)觀察六小時(shí)動(dòng)物癲癇行為。癲癇組所有動(dòng)物均出現(xiàn)嚴(yán)重癲癇(等級(jí)大于3)。 禁食組七只動(dòng)物中有六只在注射毛果蕓香堿后三十分鐘內(nèi)出現(xiàn)呆滯行為，三十分鐘后動(dòng)物行為 趨于正常。另一只動(dòng)物出現(xiàn)陣攣(圖7)，其血糖濃度為97mg/DL，是禁食組七只動(dòng)物中最高的。 以上結(jié)果表明降低血糖濃度具有抗癲癇作用。已知，限制飲食對(duì)基丙動(dòng)物的抗癲癇作用和 ketogenic diet對(duì)癲癇患者的治療作用與降低血糖濃度有關(guān)。 1.3B:磷酸果糖酶-2 (PFK2)抑制劑的抗癲癇作用最新研究表明產(chǎn)生大量乳酸的過(guò)多糖酵解主要由2,6-二磷酸果糖(F2，6BP)調(diào)控，而F2,6BP是由 膠質(zhì)細(xì)胞中磷酸果糖酶-2(PFK2)產(chǎn)生。因此，我們推測(cè)PFK2的抑制劑可降低PFK2活性而減少 F2，6BP的產(chǎn)生從而抑制過(guò)多糖酵解而發(fā)揮其抗癲癇作用。為此三種不同的PFK2化學(xué)抑制劑磷 酸烯醇丙酮酸鹽(phosphoenolpymvate,PEP),衣康酸鹽(itaconatey)和檸檬酸鹽(citrate)被用來(lái)抑制 PFK2活性并評(píng)價(jià)它們的抗癲癇作用(圖7)。三組不同的動(dòng)物分別腹腔注射衣康酸鈉(250mg/kg， n=7)、檸檬酸鈉(500mg/kg， ！^5)和生理鹽水一小時(shí)后再腹腔注射毛果蕓香堿(300mg/kg)。另設(shè) 兩組不問(wèn)的動(dòng)物分別腦側(cè)室注射PEP(n-5)或PBS(對(duì)照組)。生理鹽水和PBS對(duì)照組的所有動(dòng)物 均出現(xiàn)前肢陣攣和站立或跌倒。衣康酸鈉具有抗癲癇作用，七只動(dòng)物中有四只沒(méi)有癲癇。同樣 檸檬酸和PEP也有抗癲癇作用。檸檬酸鈉組五只動(dòng)物中三只沒(méi)有癲癇，而PEP組五只動(dòng)物中四 只沒(méi)有癲癇。這三個(gè)給藥組所有動(dòng)物在24小時(shí)內(nèi)無(wú)動(dòng)物死亡。這三種PFK2抑制劑在海藻酸和 戊四氮的動(dòng)物模型中也得到相似的結(jié)果。以上結(jié)果表明抑制PFK2活性的化合物具有抗癲癇作 用，也就是抑制由PFK2產(chǎn)生的2， 6-一磷酸果糖調(diào)控的過(guò)多糖酵解具有抗癲癇作用。
已知膠質(zhì)細(xì)胞中有四種PFK2異構(gòu)酶PFK2. 1、 PFK2. 1、 PFK2. 3、 PFK2. 3和PFK2. 4。其中以 PFK2. 3產(chǎn)生2, 6-二磷酸果糖(F2， 6BP)的能力最強(qiáng)。因此，我們推測(cè)抑制PPFK2. 3活性能更有效 阻斷或降低引發(fā)癲癇的過(guò)多糖酵解。在毛果蕓香堿急性癲癇動(dòng)物模型中，我們已經(jīng)成功使用了 siRNA(small intering RNA)技術(shù)來(lái)抑制PFK2. 3的活性，其結(jié)果導(dǎo)致PFK2. 3蛋白質(zhì)水平降低和 產(chǎn)生2,6-二磷酸果糖的能力喪失從而抑制過(guò)多糖酵解并產(chǎn)生PFK2抑制劑更強(qiáng)的抗癲癇活性。 以上結(jié)果表明PFK2. 3對(duì)引發(fā)癲癇的過(guò)多糖酵解就有重要作用，以PFK2. 3為作用耙點(diǎn)可能是丌 發(fā)治療癲癇新藥的新方法。
1. 3C:乳酸脫氫酶5亞型(LDH5)抑制劑的抗癲癇作用
如前所述，過(guò)多糖酵解以大量丙酮酸被轉(zhuǎn)化為乳酸為特征。這種轉(zhuǎn)化需要乳酸脫氫酶5亞 型(LDH5)的參與。抑制LDH5活性即可抑制過(guò)多糖酵解。因此LDH5酶的抑制劑可能具有抗癲癇 作用。兩種不同的LDH5酶的抑制劑脫氫膽酸(deoxycholate)和棉酚(gossypol)被用來(lái)評(píng)估其抗癲 癇作用。三組不同的動(dòng)物分別腦側(cè)室注射脫氫膽酸鈉(0. 5mg inlO^L PBS, n=10)、棉酚(1 mg inlO pL PBS,『6)和PBS —小時(shí)后再腹腔注射毛果蕓香堿(300mg/kg)。 PBS對(duì)照組的所有動(dòng)物均出 現(xiàn)前肢陣攣和站立或跌倒。脫氫膽酸鈉具有顯著的抗癲癇作用，10只動(dòng)物中有6只沒(méi)有癲癇，4 只動(dòng)物有輕微癲癇。同樣棉酚也有抗癲癇作用。6只動(dòng)物中有3只沒(méi)有癲癇，2只動(dòng)物出現(xiàn)節(jié)律
10性點(diǎn)頭，2只動(dòng)物出現(xiàn)前肢陣攣。這些結(jié)果表明抑制乳酸脫氫酶5亞型(LDH5)的化合物具有抗 癲癇作用，以LDH5酶為作用靶點(diǎn)也可能是丌發(fā)治療癲癇新藥的一種新方法。
1. 4、乳酸和丙酮酸對(duì)1， 6-二磷酸果糖和2-去氧葡萄糖抗癲癇作用的影響
我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明1, 6-二磷酸果糖(Fl， 6BP)的抗癲癇作用強(qiáng)于2-去氧葡萄糖。這可能是 由于Fl, 6BP不僅抑制過(guò)多糖酵解(即減少乳酸累積)并刺激葡萄糖戊糖磷酸化代解而增加腦內(nèi) GSH水平。GSH具有抗癲癇作用。而2-去氧葡萄糖抗癲癇作用僅是通過(guò)抑制葡萄糖糖酵解而發(fā)揮 其作用。因此，我們推測(cè)外源性的乳酸將廢除2-去氧葡萄糖的抗癲癇作用，但僅降低l，6-二磷 酸果糖的抗癲癇活性。為了證實(shí)這個(gè)假設(shè)，動(dòng)物在腹腔注射乳酸鈉(0. 5g/kg) 30分鐘后分別腹腔 注射2-去氧葡萄糖(0. 25 g/kg)或1， 6-二磷酸果糖(1. 0g/kg)。再過(guò)30分鐘后再腹腔注射毛果 蕓香堿(300mg/kg)。另一組動(dòng)物禁食四十八小時(shí)后腹腔注射乳酸鈉(0.5g/kg)再過(guò)30分鐘后腹 腔注射毛果蕓香堿(300mg/kg)。結(jié)果顯示2-去氧葡萄糖加乳酸組和禁食加乳酸組與毛果蕓香 堿組比較，兩組動(dòng)物的癲癇行為沒(méi)有明顯區(qū)別。這個(gè)結(jié)果說(shuō)明外源性的乳酸能廢除2-去氧葡萄 糖和禁食的抗癲癇作用。但是乳酸僅僅降低1，6-二磷酸果糖的抗癲癇活性(圖8)。丙酮酸是乳 酸的前體物，在IH常情況下直接進(jìn)入Krebs循環(huán)。如果產(chǎn)生人量乳酸的過(guò)多糖酵解與癲癇有關(guān)， 那么外源性的丙酮酸和外源性乳酸對(duì)癲癇活性有不同的影響。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明外源性的丙 酮酸(500mg/kg)并不廢除2-去氧葡萄糖和禁食的抗癲癇作用。這些結(jié)果支持了以上假設(shè)并說(shuō)明 過(guò)多糖酵解引起的乳酸累積與癲癇密切相關(guān)。 1. 5、 1， 6-二磷酸果糖對(duì)還原型谷胱甘肽(GSH)的影響
已知外源性的l， 6-二磷酸果糖(F1, 6BP)不能作為糖代謝物質(zhì)，但是能刺激葡萄糖戊糖磷酸 化代謝而提高NADra的生產(chǎn)并可提高GSH水平。GSI1本身具抗癲癇作用。因此Fl, 6BP可能通過(guò)糾IH 癲癇腦內(nèi)GSH損耗或低下而發(fā)揮其抗癲癇作用。為此，我們研究了F1，6BP對(duì)TH常動(dòng)物和毛果蕓香 堿誘導(dǎo)的慢性癲癇動(dòng)物三個(gè)不同吋間點(diǎn)腦內(nèi)GSH含量的變化(圖9)。動(dòng)物分為正常動(dòng)物組(生理鹽 水組)，癲癇動(dòng)物組和F1,6BP治療組。Fl，6BP治療組動(dòng)物每天飲用30mL0.5y。l,6-二磷酸果糖，連 續(xù)給藥7天。這三個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)分別為注射毛果蕓香堿后兩小時(shí)(Pilo2h)，發(fā)生SE10天后(還未 出現(xiàn)癲癇，10d)，癲癇初期(出現(xiàn)癲癇10-15天)和癲癇后期(出現(xiàn)癲癇50-60天)。GSH水平由高效 液相色譜方法測(cè)定。其結(jié)果顯示注射毛果蕓香堿后兩小時(shí)的動(dòng)物G S H水平與IE常動(dòng)物組(Normal)動(dòng)物無(wú)明顯差異。IO天后當(dāng)癲癇還未出現(xiàn)時(shí)GSH水平顯著升高，然后在癲癇初期GSH水
平降到正常水平，最后在癲癇后期GSH水平繼續(xù)降到大約IH常水平一本正經(jīng)。而Fl, 6BP治療組的
動(dòng)物的癲癇完全停止并且在停止用藥后所有動(dòng)物在10天內(nèi)癲癇不再發(fā)作(圖6)，這些動(dòng)物的GSH
水平正常動(dòng)物組動(dòng)物無(wú)明顯差異。以上結(jié)果表明F1,6BP能糾正癲癇腦內(nèi)GSH損耗或低下而發(fā)揮其
抗癲癇作用。前面己經(jīng)證明F1， 6BP抗癲癇作用強(qiáng)于2-去氧葡萄糖?？赡苁且?yàn)镕l, 6BP不僅能抑
制糖酵解而且能通過(guò)刺激葡萄糖戊糖磷酸化代謝而提高GSH水平。而2-去氧葡萄糖的抗癲癇作用
僅僅是通過(guò)抑制糖酵解而發(fā)揮的。
GSH水平由高效液相色譜(HPLC)方法測(cè)定。儀器HP-1100型高效相色譜儀。色譜條
件色譜柱Eclipse MA 150 x 4. 6 mm, 3.5戶(hù)；檢測(cè)波長(zhǎng)338 nm，參比波長(zhǎng)390隱；溫 度40。C;流速1.5 mL/min;流動(dòng)相-A 40 mM Na2HP04， pH 7.8，流動(dòng)相-B乙
腈/甲醇/水45/45/10。對(duì)照品還原型的谷胱甘肽(GSH，純度大于98%，購(gòu)于SIGMA 公司)，參照氨基酸衍生物的標(biāo)準(zhǔn)制備方法，將GSH與OPA試劑反應(yīng)制成0. 5mgZmL的對(duì)照品標(biāo) 準(zhǔn)液。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備取濃度為0. 5mg/mL的對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)液分別以 0. 1, 0. 2, 0. 5, 5. 0, 10. 0， 20. 0， 30. (VL進(jìn)樣，在上述色譜條件下分析。以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)和 樣品濃度(X， pg)為橫坐標(biāo)作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算回歸方程為Y=1378.9397X + 4.5802，其樣 品濃度在0.2到6.0叫之間呈良好線型關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.9999。精密度試驗(yàn)取濃度為
0. 5mg/mL的GSH對(duì)照品液連續(xù)進(jìn)樣6次，每次5pL，在甜述色譜條件下測(cè)定GSH的峰面積，其 峰面積的RSD為2. 14%。穩(wěn)定性試驗(yàn)取濃度為0.5mg/mL的GSH對(duì)照品液分別在0、 1、 6、 8、 12小吋進(jìn)樣，每次5pL，在前述色譜條件下測(cè)定迷迭香酸的峰面積，其峰面積的RSD為 4. 56%(n=5)。樣品的制備及分析將樣品采用對(duì)照品相同方法制備成樣品供試液在上述色譜條 件下測(cè)定其吸收度并從回歸方程為中計(jì)算樣品中GSH含量。
1.6、 1, 6-二磷酸果糖的神經(jīng)保護(hù)作用
1. 6A 1， 6-二磷酸果糖對(duì)毛果蕓香堿誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷的保護(hù)作用
在實(shí)驗(yàn)1.1A中，癲癇組6只動(dòng)物(在注射毛果蕓香堿24小時(shí)后未死亡，其癲癇等級(jí)大于5)的 腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)嚴(yán)重?fù)p傷(Nissl染色)，損傷程度為2.8士0.2級(jí)。這些動(dòng)物的海馬CA4和齒狀 腦回區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞也有嚴(yán)重?fù)p傷(Fluoro-JadeB染色)，其平均損傷細(xì)胞數(shù)為282士33。 1,6-二磷 酸果糖藥物組中5只動(dòng)物(包括中和高劑量組動(dòng)物其癲癇等級(jí)大于或等于3)的腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞損傷程度大大降低，損傷程度為0.9土0.2級(jí)。這些動(dòng)物的海馬CA4和齒狀腦區(qū)回的神經(jīng)細(xì)胞損傷 也大大降低，其平均損傷細(xì)胞數(shù)為78士23。 1, 6-二磷酸果糖屮高劑量組5只沒(méi)有癲癇行為的動(dòng)物 未見(jiàn)腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞損傷。這些動(dòng)物的海馬CA4和齒狀腦區(qū)回的祌經(jīng)細(xì)胞也未出現(xiàn)損傷。以上結(jié) 果表明1, 6-二磷酸果糖對(duì)毛果蕓香堿誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷具有明顯的保護(hù)作用。 1， 6B 1, 6-二磷酸果糖對(duì)海藻酸誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷的保護(hù)作ffl
在實(shí)驗(yàn)1. 1B中，癲癇組9只動(dòng)物(有嚴(yán)重癲癇，等級(jí)大于或等于3)的海馬神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)嚴(yán) 重?fù)p傷(50%動(dòng)物出現(xiàn)在CA1/2區(qū)，100%動(dòng)物出現(xiàn)在CA3/4區(qū)，F(xiàn)luoro-Jade B染色)。其平均損 傷細(xì)胞數(shù)為61 ±13。通過(guò)Nissl染色，CA3/4區(qū)的細(xì)胞丟失清晰可見(jiàn)。1， 6-二磷酸果糖對(duì)海 藻酸誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷具有顯著的的保護(hù)作用。1,6-二磷酸果糖中高劑量組中沒(méi)有癲癇的5 只動(dòng)物未出現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞損傷。而5只具有嚴(yán)重癲癇的動(dòng)物雖然也出現(xiàn)出現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞損傷，但其 損傷程度大大降低，其平均損傷細(xì)胞數(shù)為15±3。
1. 6C 1, 6-二磷酸果糖對(duì)腦缺血神經(jīng)損傷的保護(hù)作用
用興奮性毒性物質(zhì)NMDA造成原代培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞損傷，1， 6-二磷酸果糖(3. 5mM)對(duì)這種興奮性 神經(jīng)細(xì)胞損傷具有明顯保護(hù)作用。
(二)氧化型維生素C抗癲癇作用的具體實(shí)施范例 2.1、急性癲癇模型
三種不同的急性癲癇模型包括毛果蕓香堿(Pilo)、海藻酸(KA)和戊四氮(PTZ)被用來(lái)評(píng)估氧 化型維生素C(dehydroasxorbate,DHA)的抗癲癇作用。丙戊酸用來(lái)作為陽(yáng)性對(duì)照。成年雄性 Sprague Dawley大鼠(200-230克)從腦室注射DHA 10/zl (10mM) (ip)，或腹腔注射丙戊酸(0.3g/kg) 或生理鹽水(癲癇組),再腹腔注射毛果蕓香堿(300mg/kg)，或戊四氮(50mg/kg),或海藻酸(10mgZkg)。 然后連續(xù)觀察六小時(shí)(Pilo和KA模型)或20分鐘(PTZ模型)動(dòng)物的癲癇行為包括癲癇發(fā)作時(shí)間、 癲癇等級(jí)、癲癇持續(xù)時(shí)間、動(dòng)物體重變化和死亡等。
2. 1A毛果蕓香堿模型
癲癇組IO只動(dòng)物均產(chǎn)生癲癇，癲癇發(fā)作時(shí)間為14±1分鐘，并持續(xù)至少5小時(shí)，癲癇等級(jí)為 5.5±0.4級(jí)，4只動(dòng)物在24小時(shí)內(nèi)死亡。DHA組9只動(dòng)物8只在48小時(shí)內(nèi)沒(méi)有出現(xiàn)癲癇，一 只動(dòng)物在54分鐘出現(xiàn)前肢陣攣，無(wú)動(dòng)物死亡。DHA組4只沒(méi)有癲癇行為的動(dòng)物的腦電圖記錄
13未顯示癜癇活性。丙戊酸能明顯降低癲癇等級(jí)和癲癇持續(xù)時(shí)間。9只動(dòng)物中3只沒(méi)有癲癇6只有 癲癇并有1只動(dòng)物在24小時(shí)內(nèi)死亡。 2. 1B、海藻酸模型
海藻酸誘導(dǎo)的癲癇組10只動(dòng)物中有9只有嚴(yán)重癲癇(等級(jí)大于或等于3) ， 1只動(dòng)物有輕微 的癲癇(節(jié)律性點(diǎn)頭)，其癲癇發(fā)作時(shí)間為38±4分鐘，癲癇等級(jí)和癲癇持續(xù)時(shí)間分別為3. 7±0. 3 和3. 7土0. 2小時(shí)。DHA能防止癲癇發(fā)作。8只動(dòng)物6只沒(méi)有癲癇，其它2只僅出現(xiàn)輕度癲癇。 盡管丙戊酸組6只動(dòng)物均有嚴(yán)重的癲癇，但丙戊酸明顯延長(zhǎng)癲癇發(fā)作時(shí)間和降低癲癇等級(jí)和癲 癇持續(xù)時(shí)間。 2. 1C 戊四氮模型
由戊四氮誘導(dǎo)的癲癇組所有9只動(dòng)物均有陣攣性癲癇，癲癇發(fā)作時(shí)間為76±6秒，癲癇持 續(xù)時(shí)間為170±54秒。DHA能預(yù)防癲癇發(fā)作。8只動(dòng)物有6只沒(méi)有癲癇。丙戊酸組(0. 3g/kg)8 只動(dòng)物中有4只沒(méi)有癲癇。 2.2、慢性癲癇模型
毛果蕓香堿模型實(shí)驗(yàn)方法和癲癇組(生理鹽水)以及癲癇行為及指標(biāo)觀察與前述實(shí)驗(yàn)1.2B 相同。但藥物組每天從腦室注射10/il氧化型維生素C(DHA， 10mM)。癲癇組所有動(dòng)物繼續(xù)出現(xiàn) 癲癇行為。氧化型維生素C在5天內(nèi)完全阻止癲癇行為并且在停止用藥后所有動(dòng)物在兩周內(nèi)癲 癇不再發(fā)作。這些動(dòng)物大腦皮層的腦電圖記錄沒(méi)有出現(xiàn)癲癇活性。為了證明氧化型維生素C對(duì) 毛果蕓香堿誘導(dǎo)的慢性癲癇是否具有藥物依賴(lài)性，另外6只癲癇動(dòng)物在自發(fā)性癲癇發(fā)作60天后 連續(xù)兩周腦室注射10//1氧化型維生素C。結(jié)果顯示氧化型維生素C在8天內(nèi)完全阻止癲癇行為 并且在停止用藥后所有動(dòng)物在15天內(nèi)癲癇不再發(fā)作。這些結(jié)果證明氧化型維生素C能有效抑制 慢性癲癇并可能根治癲癇疾病。
2. 3、氧化型維生素C的神經(jīng)保護(hù)作用
2.3A 氧化型維生素C對(duì)毛果蕓香堿誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷的保護(hù)作用
在實(shí)驗(yàn)2. 1A中，癲癇組6只動(dòng)物(在注射毛果蕓香堿24小時(shí)后未死亡，其癲癇等級(jí)大于5)的 腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)嚴(yán)重?fù)p傷(Nissl染色)，損傷程度為2.8士0.2級(jí)。這些動(dòng)物的海馬CA4和齒狀 腦回區(qū)的祌經(jīng)細(xì)胞也有嚴(yán)重?fù)p傷(Fluoro-JadeB染色)，其平均損傷細(xì)胞數(shù)為282士33。氧化型維 生素C藥物組8只動(dòng)物的腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞未見(jiàn)明顯損傷。這些動(dòng)物的海馬CA4和齒狀腦區(qū)回的神經(jīng)
14細(xì)胞也為出現(xiàn)明顯損傷。以上結(jié)果表明氧化型維生素C對(duì)毛果蕓香堿誘導(dǎo)的祌經(jīng)細(xì)胞損傷具有 顯著的保護(hù)作用。
2.3B 氧化型維生素C對(duì)海藻酸誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷的保護(hù)作用在實(shí)驗(yàn)
2. IB中，癲癇組9只動(dòng)物(有嚴(yán)重癲癇，等級(jí)大于或等于3)的海馬神經(jīng)細(xì)胞,屮,現(xiàn)嚴(yán)重?fù)p傷 (50。/。動(dòng)物出現(xiàn)在CAl/2區(qū)，100y。動(dòng)物出現(xiàn)在CA3/4區(qū)，F(xiàn)luoro-Jade B染色)。其平均損傷細(xì)胞數(shù) 為61 ±13。通過(guò)Nissl染色，CA3/4區(qū)的細(xì)胞丟失清晰可見(jiàn)。氧化型維生素C對(duì)海藻酸誘導(dǎo)的 神經(jīng)細(xì)胞損傷具有顯著的的保護(hù)作用。氧化型維生素C藥物組中沒(méi)有癲癇的6只動(dòng)物未見(jiàn)神經(jīng)細(xì) 胞損傷。而另外2只有輕度癲癇的動(dòng)物僅出現(xiàn)輕微的神經(jīng)細(xì)胞損傷。 2. 4、氧化型維生素C對(duì)還原型谷胱甘肽(GSH)的影響
實(shí)驗(yàn)證明在原代細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，氧化型維生素C能通過(guò)刺激磷酸戊糖代謝途徑酶包括
6-磷酸葡萄糖脫氫酶(6-phosphogluconate dehydrogenase ， 6-PDG)和轉(zhuǎn)二羥丙酮基酶 (transaldolase)的活性而顯著提高GSH水平。如甜所述腦內(nèi)GSH損耗或低下是引發(fā)癲癇的重要 病因之一，而增加腦內(nèi)GSH水平的化合物可以有效地預(yù)防癲癇的發(fā)生與發(fā)展。我們推測(cè)氧化型 維生素C的抗癲癇作用與提高GSH水平有關(guān)。為此，我們研究了氧化型維牛:素C對(duì)毛果蕓香堿 誘導(dǎo)的慢性癲癇動(dòng)物三個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)腦內(nèi)GSH含量的變化。動(dòng)物分為:i卜:常動(dòng)物組(生理鹽水組)， 癲癇動(dòng)物組和氧化型維生素C治療組。氧化型維生素C治療組動(dòng)物每天從腦室注射氧化型 維生素C(10mM)，連續(xù)給藥7天。這三個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)分別為注射毛果蕓香堿后兩小時(shí)(Pilo 2h)， 發(fā)生SE10天后(還未出現(xiàn)癲癇，10d)，癲癇初期(出現(xiàn)癲癇10-15天)和癲癇后期(出現(xiàn)癲癇50-60 天)。GSH水平由高效液相色譜方法測(cè)定。其結(jié)果顯示注射毛果蕓香堿后兩小時(shí)的動(dòng)物GSH水 平與JH常動(dòng)物組(Normal)動(dòng)物無(wú)明顯差異。10天后當(dāng)癲癇還未出現(xiàn)時(shí)GSH水平顯著升高，然后 在癲癇初期GSH水平降到正常水平，最后在癲癇后期GSH水平繼續(xù)降到大約正常水平一半。而 氧化型維生素C治療組的動(dòng)物的癲癇完全停止并且在停止用藥后所有動(dòng)物在15天內(nèi)癲癇不再發(fā) 作，這些動(dòng)物的GSH水平與正常動(dòng)物組動(dòng)物的GSH水平無(wú)明顯差異。以上結(jié)果表明氧化型維 生素C可能通過(guò)糾『.癲癇動(dòng)物GSH水平低下而發(fā)揮其抗癲癇作用。
權(quán)利要求
1、1，6-二磷酸果糖(fructose-1，6-bisphosphate，F(xiàn)1，6BP)和氧化型維生素C(dehydroascorbate，DHA)抗癲癇作用和作用機(jī)制以及它們?cè)诜乐魏椭委煱d癇疾病方面的應(yīng)用。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的F1,6BP和DHA的抗癲癇作用，其特征是Fl, 6BP和DHA不僅能有效地 控制或抑制多種急性和慢性癲癇動(dòng)物癲癇的發(fā)作，而且能有效地防止癲癇的發(fā)生與發(fā)展， 甚至根治癲癇。多種急性癲癇動(dòng)物包括由毛果蕓香堿(Piloacarpine， Pilo)、海藻酸 (Kainic acid' KA)和戊四氮(Pentylenetetrazole, PTZ)誘發(fā)的大白鼠急性癲癇動(dòng)物。慢 性癲癇動(dòng)物包括由毛果蕓香堿和戊四氮誘發(fā)的大白鼠慢性癲癇動(dòng)物。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的F1,6BP和DHA的抗癲癇作用，其特征是Fl， 6BP和DHA對(duì)毛果蕓香堿 和海藻酸誘發(fā)的急性癲癇動(dòng)物的神經(jīng)損傷具有明顯的保護(hù)作用。Fl, 6BP還對(duì)腦缺血神經(jīng)損 傷具有顯著的保護(hù)作用。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的F1,6BP和DHA的抗癲癇作用機(jī)制，其特征是Fl, 6BP通過(guò)抑制2， 6-二磷酸果糖調(diào)控的過(guò)多糖酵解并將葡萄糖從糖酵解轉(zhuǎn)變成戊糖磷酸化代謝從而增加腦內(nèi) 還原型的谷胱甘肽(GSH)水平而發(fā)揮其抗癲癇作用；而DHA抗癲癇作用機(jī)制是通過(guò)刺激磷酸 戊糖代謝途徑酶的活性而增加腦內(nèi)GSH水平。
5、 抑制磷酸果糖酶-2(phosphofructokinase-2， PFK2)活性的化合物和它們的抗癲癇作用。
6、 抑制乳酸脫氫酶5亞型(LDH5)活性的化合物和它們的抗癲癇作用。
7、 刺激葡萄糖戊糖磷酸化代謝途徑(PPP)活性而增加腦內(nèi)GSH水平的化合物和它們的抗癲癇作用。
8、 1、 6-二磷酸果糖和氧化型維生素C分別單獨(dú)或聯(lián)合，以及合并其他藥物或合并制劑用于 防治癲癇疾病的應(yīng)用。
9、 根據(jù)權(quán)利要求1和權(quán)利要求8所述的F1,6BP和DHA用于防治和治療癲癇疾病可作為藥品或 功能保健品使用。藥品或功能保健品，其制劑包括經(jīng)口服給藥途徑制劑和非口服給藥途徑制劑。所述的口服給藥制劑包括片劑、口服液、丸劑、滴丸、膠囊、軟膠囊、泡騰劑、緩釋劑、控釋劑、靶向制劑；所述的非口服給藥途徑制劑包括注射劑、粉針、大輸液、栓 齊U。
全文摘要
本發(fā)明涉及1，6-二磷酸果糖(fructose-1，6-bisphosphate，F(xiàn)1，6BP)和氧化型維生素C(dehydroascorbate，DHA)的抗癲癇作用和作用機(jī)制以及它們?cè)诜乐魏椭委煱d癇疾病方面的新應(yīng)用。F1，6BP和DHA不僅能有效地控制或抑制多種急性和慢性癲癇動(dòng)物的癲癇發(fā)作，而且能有效地防止癲癇的發(fā)生與發(fā)展，甚至根治癲癇。F1，6BP抗癲癇的作用機(jī)制是抑制2，6-二磷酸果糖調(diào)控的過(guò)多糖酵解并將葡萄糖從糖酵解轉(zhuǎn)變成戊糖磷酸化代謝從而增加腦內(nèi)還原型谷胱甘肽(GSH)水平。DHA是通過(guò)刺激磷酸戊糖代謝途徑酶的活性而增加腦內(nèi)GSH水平發(fā)揮其抗癲癇作用。F1，6BP和DHA獨(dú)特的抗癲癇作用和作用機(jī)制支持了它們?cè)诜乐魏椭委煱d癇病疾方面的新應(yīng)用。
文檔編號(hào)C07D493/00GK101513425SQ20091012762
公開(kāi)日2009年8月26日 申請(qǐng)日期2009年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月13日
發(fā)明者張治針, 肖兵華, 連曉嬡, 奇 陳 申請(qǐng)人:連曉嬡